IR â Infrarotspektroskopie RAMAN - Spektroskopie ESR ...
IR â Infrarotspektroskopie RAMAN - Spektroskopie ESR ...
IR â Infrarotspektroskopie RAMAN - Spektroskopie ESR ...
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Spektroskopische Methoden<br />
<strong>IR</strong> – <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
<strong>RAMAN</strong> - <strong>Spektroskopie</strong><br />
<strong>ESR</strong> – Elektronenspinresonanzspektroskopie<br />
Literatur :<br />
Lottspeich F., Zorbas H. (Hrsg.), Bioanalytik, Spektrum Verlag<br />
Winter R., Noll F. Methoden der Biophysikalischen Chemie, Teubner Studienbücher<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
1
Spektroskopische Methoden<br />
Grundlagen<br />
Elektromagnetische Strahlung : Licht als elektromagnetische Welle<br />
Charakterisiert durch Frequenz ν,Wellenlängeλ und<br />
Amplitude E 0 des elektrischen Wechselfeldes.<br />
ν = c / λ<br />
Elektromagnetische Wellen treten als Pakete, den Lichtquanten auf<br />
Einstein : E = h ν h = 6.6 10 -34 Js, Planksches Wirkungsquant<br />
Wechselwirkung mit Materie - Absorption und Beugung<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
2
Elektromagnetische Strahlung<br />
Spektralbereiche und Messmethoden<br />
E = hν<br />
ν = c / λ<br />
E = hc / λ<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
3
Elektromagnetische Strahlung<br />
Spektralbereiche und Messmethoden<br />
E = hν<br />
ν = c / λ<br />
E = hc / λ<br />
Radiowellen<br />
Mikrowellen<br />
Infrarot<br />
sichtbares<br />
Licht<br />
nahesUV<br />
fernes UV<br />
Röntgen<br />
strahlung<br />
γ-Strahlung<br />
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 kJ /mol<br />
1m 1cm 1mm 100µm 1µm 10nm 1nm 1Å<br />
NMR<br />
Fluoreszenz<br />
<strong>ESR</strong><br />
UV-VIS<br />
<strong>IR</strong>-<strong>RAMAN</strong><br />
LS<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
EM<br />
Röntgenbeugung<br />
1pm<br />
λ<br />
Mößbauer<br />
4
Zeitskalen und Messmethoden<br />
Dynamische Messungen<br />
Orbitalfrequenz<br />
10 -16 10 -14 10 -12<br />
Molekülschwingung<br />
Enzym-Konformation<br />
Diffusion in Membranen<br />
Proteinfaltung<br />
Zellteilung<br />
Menschenalter<br />
s<br />
10 -10 10 -8 10 -6 10 -4 10 -2 10 0 10 2 10 4 10 6<br />
fs-Laser<br />
Fluoreszenz<br />
Synchrotron<br />
Röntgenbeugung<br />
<strong>ESR</strong><br />
NMR<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
5
Spektroskopische Messmethode – Anregung - Information<br />
Meßmethode<br />
NMR<br />
<strong>ESR</strong><br />
<strong>IR</strong>- Raman<br />
Fluoreszenz<br />
UV/VIS<br />
Lichtstreuung<br />
Röntgenbeugung<br />
Röntgenabsorption<br />
Mößbauer<br />
Anregung<br />
magnetische Übergänge im<br />
Atomkern<br />
Spinumkehr ungepaarter Elekronen<br />
Rotation und Schwingung von<br />
Molekülen<br />
Fluorophore, elektronische<br />
Übergänge<br />
Elektronische Übergänge<br />
Elektronische Übergänge<br />
Entfernung von Elekronen aus<br />
innerem Niveau<br />
Reflexion an periodischen Systemen,<br />
Elekronenbeugung<br />
Resonanzabsorption der Atomkerne<br />
Information<br />
Art der Nachbarkerne<br />
elektronische Umgebung<br />
Konformation, Dynamik<br />
elektronische Umgebung<br />
Konformation, Dynamik<br />
Atomabstände, Stärke chemischer<br />
Bindungen, Konformation<br />
Umgebung, Dynamik, Konformation<br />
Dynamik, Konformation, Dissoziation<br />
Molmasse, Größe, Gestalt<br />
Ionisierungsenergien<br />
Raumstruktur von Kristallen,<br />
Makromolekülen, Lösungen<br />
Anordnung der Nachbaratome<br />
elektronische Kernumgebung<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
6
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Geschichte<br />
Um 1800 Entdeckung der infraroten Strahlung durch F.W. Herschel<br />
Um 1900 Entwicklung des Michelson-Interferometers.<br />
Lord Rayleigh erkannte, dass man mit Hilfe der<br />
Fouriertransformation aus einem Interferogramm<br />
das Spektrum berechnen kann.<br />
Albert Abraham Michelson<br />
John William Strutt,<br />
Lord Rayleigh<br />
Um 1960 FFT-Algorithmen, bessere Computer ...<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
7
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
sichtbares Licht<br />
nahes <strong>IR</strong> (N<strong>IR</strong>)<br />
mittleres <strong>IR</strong> (M<strong>IR</strong>)<br />
Messbereiche<br />
Schwingungsspektroskopie<br />
λ nm µm cm<br />
fernes <strong>IR</strong> (F<strong>IR</strong>)<br />
25000-12500 12500-4000 4000-600 600-10<br />
niederenergetische<br />
d-d Übergänge<br />
Streck- und Winkeldeformationsschwingungen<br />
C-H,<br />
C-C, C-X<br />
ν [cm-1 ]<br />
Streck- und Winkeldeformation<br />
Schweratome, Gerüst-<br />
Torsion- und Ringe<br />
ν = Wellenzahl (Anzahl der Wellenzüge/cm) = 1/λ<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
8
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Molekulare Wechselwirkung<br />
E = hν<br />
Aus der Quantenmechanik ergibt sich, dass nur<br />
diskrete Energiebeträge aufgenommen werden<br />
Anregende Strahlung muß mit der Resonanzenergie der Schwingung bzw. Rotation<br />
übereinstimmen - Anregung ins höhere Energieniveau.<br />
Rotationsübergänge:<br />
ΔE zwischen 2 Rotationsniveaus ist klein : λ groß – fernes Infrarot (30-150 µm)<br />
Schwingungsübergänge:<br />
Schwingungen der Molekülbausteine gegeneinander : λ kleiner– nahes Infrarot (1-5 µm)<br />
Rotationsschwingungsspektren :<br />
Schwingungsspektren mit überlagertem Rotationsspektrum (nahes <strong>IR</strong>)<br />
Absorption abhängig von Molekülgeometrie und Masse<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
9
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Anharmonischer Oszillator<br />
Bei Absorption eines Lichtquants, geht das Molekül in ein höheres Energieniveau.<br />
Abstand der Schwingungsniveaus nimmt mit wachsender Quantenzahl ab !<br />
(geringere Energieaufnahme notwendig).<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
10
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Molekulare Wechselwirkung<br />
Moleküle, die einen Dipol besitzen lassen sich mit <strong>IR</strong> zur Schwingung<br />
anregen – Dipol ändert sich.<br />
H 2 O<br />
Mögliche Anregungen mit <strong>IR</strong> :<br />
H<br />
O<br />
H<br />
H<br />
O<br />
H<br />
H<br />
O<br />
H<br />
symmetrische und asymmetrische<br />
Streckschwingung<br />
Biegeschwingung<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
11
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Molekulare Wechselwirkung<br />
Symmetrische Moleküle – kein statischer Dipol vorhanden.<br />
CO 2<br />
Mögliche Anregungen mit <strong>IR</strong> :<br />
Asymmetrische Streckschwingung (dynamischer Dipol)<br />
Deformationsschwingung (Schwingung im O-C-O Winkel)<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
12
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Molekulare Wechselwirkung<br />
Das dynamische Dipolmoment muß sich während der<br />
Schwingungsanregung ändern<br />
Beispiel:<br />
Methylen<br />
symmetrische<br />
Streckschwingung<br />
Methylen<br />
asymmetrische<br />
Streckschwingung<br />
Methyl<br />
symmetrische<br />
Streckschwingung<br />
http://www.ir-spektroskopie.de/basics/<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
13
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Messprinzip<br />
<strong>IR</strong>-Quelle Monochromator Probe Detektor<br />
<strong>IR</strong>-Küvetten : <strong>IR</strong>-transparent, meist CaF 2<br />
geringe Schichtdicke (Absorption H 2 O)<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
14
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Lichtquellen<br />
Für <strong>IR</strong> werden thermische Lichtquellen verwendet<br />
Planksche Strahler<br />
(breitbandiges spektrales Verhalten).<br />
Nahes <strong>IR</strong> : Halogenlampen<br />
Fernes <strong>IR</strong> : Globars oder Nernst Stift<br />
Globar : SiC Keramik.<br />
Betriebstemperatur 1500K<br />
Nernst Stift :<br />
seltene Erden<br />
(Zirkonoxid+ Ytriumoxid)<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
15
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Monochromator<br />
Zerlegung in Spektralbereiche - Wellenlängenseparation<br />
Prismengeräte : Prismen und oberflächenbeschichtete Spiegel<br />
(NaCl, KBr, KCl – <strong>IR</strong>-durchläßig)<br />
Gittergeräte : Beugung an Gitter<br />
FT-<strong>IR</strong>-Geräte: (Michelson Interferometer)<br />
Alle Wellenlängen simultan und während der Spektrenaufnahme<br />
detektiert. Interferogramm eines HeNe-Lasers (rotes Licht, 15803 cm -1 )<br />
als Referenz. - Zweistrahlprinzip.<br />
Aus den Interferogrammen werden durch Fourier Transformation die<br />
<strong>IR</strong>-Spektren berechnet.<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
16
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Messmethoden<br />
FT-<strong>IR</strong> Spektrometer<br />
Strahlung – Strahlteiler<br />
Referenz + <strong>IR</strong> Strahl<br />
Strahl getrennt,<br />
räumlich verschoben,<br />
reflektiert und<br />
wieder überlagert.<br />
Weg- und Zeitdifferenz<br />
Reflektion an fixem und beweglichem Spiegel<br />
http://www.ir-spektroskopie.de/spec/ftir-prinzip/index.html<br />
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17
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Messmethoden<br />
monochromatische Interferenz<br />
1 Wellenlänge, fixe Zeit, Unterschied im Ort<br />
Verstärkung wenn optischen Weglängendifferenz null<br />
Auslöschung wenn optische Weglängendifferenz = λ/2<br />
polychromatische<br />
Interferenz<br />
viele Wellenlängen überlagern<br />
unterschiedliche Phasendiff.<br />
unterschiedliche Interferenz<br />
- Interferenz je nach Wellenlänge und Phase<br />
– Detektor : Intensität am Detektor als Funktion des Ortes des<br />
beweglichen Spiegels<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
18
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Detektoren<br />
Thermische <strong>IR</strong>-Detektoren : Strahlungsenergie in Wärme<br />
Pyroelektrische Detektoren : Ferroelektrika, unterschiedliche<br />
Polarisation<br />
Quantendetektoren : Fotodioden<br />
Im Prinzip : Spannungsänderung - der Intensität proportional<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
19
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Absorptionsbanden<br />
Charakteristische <strong>IR</strong>-Banden :<br />
http://www.chem.ucla.edu/~webspectra/irtable.html<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
20
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Anwendungsbeispiele<br />
‣Substanzidentifikation<br />
http://www-cgi.uni-regensburg.de/Studentisches/FS_Pharmazie/files/Seminare/Arzneistoffe/pohl-ass.pdf<br />
Acetylsalicylsäure<br />
‣Strukturaufklärung<br />
nicht kristalliner Festkörper<br />
(Kunststoffe, Polymere, Elastomere)<br />
‣ Strukturänderungen durch Temperatur<br />
‣ Zeitaufgelöste Messungen - Reaktionskinetik<br />
‣Proteinstrukturen<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
21
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Proteinstrukturen<br />
Gruppenschwingungen :<br />
Schwingungsmoden des Polypeptidrückgrads - Amidbindungen<br />
Schwingungsmoden der AS-Seitenketten<br />
Schwingungen von Co-Faktoren<br />
Schwingungen von H2O, Detergentien, Lipiden ....<br />
Amidbanden<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
22
<strong>IR</strong>- <strong>Infrarotspektroskopie</strong><br />
Proteinstrukturen<br />
Informationen über die Sekundärstruktur :<br />
Proteinspektrum minus Pufferbeitrag ....<br />
Vergleich zu Standard-Datensätzen<br />
α – helix<br />
Lysozyme denaturiert<br />
β- sheet<br />
Reaktionsmodulierte Differenztechniken :<br />
lichtinduzierte Differenztechnik<br />
redoxreduzierte Differenztechnik<br />
photochemisch induzierte Differenztechnik<br />
thermisch induzierte Differenztechnik<br />
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23
Raman <strong>Spektroskopie</strong><br />
Geschichte und Grundlagen<br />
1928 Raman und Krishnan<br />
Zusätzlich zur “klassischen” Lichtstreuung auch Streuung mit verschobener<br />
Frequenz : Raman- Effekt<br />
Raman-Streuung : Inelastische Streuung eines Photons an einem Molekül.<br />
Molekül geht in den höheren Energiezustand, das gestreute Photon verliert einen Teil<br />
seiner Energie.<br />
Eingestrahltes Licht induziert ein oszillierendes Dipolmoment, das eine<br />
neue elektromagnetische Wellen erzeugt.<br />
Beitrag zur elastischen Streuung (Rayleigh Streuung) und zur unelastischen Streuung<br />
(Raman Streuung).<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
24
Raman <strong>Spektroskopie</strong><br />
Grundlagen<br />
Bestrahlung mit monochromatischer elektromagnetischer Strahlung (Laser) –<br />
Wechselwirkung – Licht mit Materie -<br />
Stossprozesse mit Molekülen der Probe. Streulicht beobachtet.<br />
geringere Frequenz<br />
rotverschoben<br />
höhere Frequenz<br />
blau verschoben<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
25
Raman <strong>Spektroskopie</strong><br />
Messprinzip<br />
Ar-Ionen-Laser: 488.0 und 514.5 nm<br />
YAG, Yttrium-Aluminium Garnet<br />
Streustrahlung senkrecht zur<br />
Einstrahlrichtung untersucht<br />
Mit Monochromator spektral<br />
zerlegt.<br />
Detektor<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
www-public.tu-bs.de<br />
26
Raman <strong>Spektroskopie</strong><br />
Anwendung<br />
Inter- und Intramolekulare Wechselwirkungen<br />
Proteinstruktur – konformationssensitive Bindungen S-S und C-S,<br />
aromatische Seitenketten<br />
Proteinkonformationsänderungen – Ligandenbindung<br />
Zeitaufgelöste Messungen -<br />
Reaktionskinetiken<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
27
Raman <strong>Spektroskopie</strong><br />
Anwendung<br />
Lipide – trans-, gauche-Isomerie<br />
Raman-Mikroskopie : Medizin Gewebeuntersuchungen<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
28
Raman <strong>Spektroskopie</strong><br />
Anwendung<br />
Resonanz-Ramanspektroskopie :<br />
intrinsische Chromophore, wie Chlorophyll, Carotinoide, Coenzyme<br />
Metalloproteine<br />
Häm-Gruppe, elektronische Umgebung vom z.B. Porphyrinring<br />
(anregen bei der SORET-Bande, 410nm, Intensitätszunahme im Schwingungsspektrum<br />
von Häm-Gruppe).<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
29
Elektromagnetische Strahlung<br />
Spektralbereiche und Messmethoden<br />
E = hν<br />
ν = c / λ<br />
Radiowellen<br />
Mikrowellen<br />
Infrarot<br />
sichtbares<br />
Licht<br />
nahesUV<br />
fernes UV<br />
Röntgen<br />
strahlung<br />
γ-Strahlung<br />
10 -4 10 -3 10 -2 10 -1 1 10 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 kJ /mol<br />
1m 1cm 1mm 100µm 1µm 10nm 1nm 1Å<br />
NMR<br />
Fluoreszenz<br />
<strong>ESR</strong><br />
UV-VIS<br />
<strong>IR</strong>-<strong>RAMAN</strong><br />
LS<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
EM<br />
Röntgenbeugung<br />
1pm<br />
λ<br />
Mößbauer<br />
30
Zeitskalen und Messmethoden<br />
Dynamische Messungen<br />
Orbitalfrequenz<br />
10 -16 10 -14 10 -12<br />
Molekülschwingung<br />
Enzym-Konformation<br />
Diffusion in Membranen<br />
Proteinfaltung<br />
Zellteilung<br />
Menschenalter<br />
s<br />
10 -10 10 -8 10 -6 10 -4 10 -2 10 0 10 2 10 4 10 6<br />
fs-Laser<br />
Fluoreszenz<br />
Synchrotron<br />
Röntgenbeugung<br />
<strong>ESR</strong><br />
NMR<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
31
Spektroskopische Messmethode – Anregung - Information<br />
Meßmethode<br />
NMR<br />
<strong>ESR</strong><br />
<strong>IR</strong>- Raman<br />
Fluoreszenz<br />
UV/VIS<br />
Lichtstreuung<br />
Röntgenbeugung<br />
Röntgenabsorption<br />
Mößbauer<br />
Anregung<br />
magnetische Übergänge im<br />
Atomkern<br />
Spinumkehr ungepaarter Elekronen<br />
Rotation und Schwingung von<br />
Molekülen<br />
Fluorophore, elektonische Übergänge<br />
Elektronische Übergänge<br />
Elektronische Übergänge<br />
Entfernung von Elekronen aus<br />
innerem Niveau<br />
Reflexion an periodischen Systemen,<br />
Elekronenbeugung<br />
Resonanzabsorption der Atomkerne<br />
Information<br />
Art der Nachbarkerne<br />
elektronische Umgebung<br />
Konformation, Dynamik<br />
elektronische Umgebung<br />
Konformation, Dynamik<br />
Atomabstände, Stärke chemischer<br />
Bindungen, Konformation<br />
Umgebung, Dynamik, Konformation<br />
Dynamik, Konformation, Dissoziation<br />
Molmasse, Größe, Gestalt<br />
Ionisierungsenergien<br />
Raumstruktur von Kristallen,<br />
Makromolekülen, Lösungen<br />
Anordnung der Nachbaratome<br />
elektronische Kernumgebung<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
32
Elektronenspinresonanz<br />
(<strong>ESR</strong>) <strong>Spektroskopie</strong><br />
oder<br />
Electron paramagnetic<br />
resonance (EPR)<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
33
<strong>ESR</strong> <strong>Spektroskopie</strong><br />
Geschichte<br />
Entdeckung durch E.Zavoisky<br />
(Russland) im Jahre 1945<br />
‣ Technische Entwicklung durch Fortschritte in der Nachrichtentechnik<br />
hnik<br />
‣Radio und Mikrowellentechnik entscheidend beeinflußt, , parallel zum NMR<br />
‣Erste Anwendungen in der Festkörperphysik, anorganischen Chemie<br />
bereits Anfang der 50-er Jahre in der Biologie (Photosynthese)<br />
‣Labortechnik seit Mitte der 60-er Jahre<br />
‣Wesentliche Impulse (ab etwa 1970) durch Sonden-Technik (Spin-labels<br />
labels)<br />
zur Erforschung von biologischen Substanzen.<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
34
<strong>ESR</strong> <strong>Spektroskopie</strong><br />
Was kann man detektieren ?<br />
Paramagnetische Substanzen - ungepaarte Elektronen<br />
‣ Freie Radikale (z.B. organische Moleküle)<br />
- direkte Detektion von stabilen freien Radikalen<br />
‣ Übergangsmetallkomplexe ( z.B. Cu 2+ , Fe 3+ , Mn 2+ )<br />
‣Spinsonden (Spin-label)<br />
- stabile Radikale werden eingebaut, da Biomoleküle meist kein<br />
intrinsisches <strong>ESR</strong>-Signal haben<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
35
<strong>ESR</strong> <strong>Spektroskopie</strong><br />
Prinzip der Methode<br />
Absorptionsspektroskopie<br />
High Energy<br />
Spin State<br />
Energy<br />
Microwave Radiation<br />
Energy hν<br />
Low Energy<br />
Spin State<br />
Magnetic Field Strength (H)<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
36
<strong>ESR</strong> <strong>Spektroskopie</strong><br />
Bedingungen<br />
ΔE E = hν h = g.µ B .B 0<br />
g-Faktor Laude Faktor für das freie Elektron ist 2.0023<br />
µB magnetisches Moment des Elektrons,<br />
Bohrsches Magneton e.h /4πm e<br />
e = Elementarladung 1.6x10 -19 C (As)<br />
h = Planksches Wirkungsquant 6.6 x 10 -34 Js<br />
m e = Masse des Elektrons<br />
ν= = 9.5 GHz (X-Band) B 0 = 0.34T (3400G)<br />
24 GHz (K-Band) 0.78T<br />
36 GHz (Q-Band) Biophysikalische Techniken SS09<br />
1.3 T<br />
37
<strong>ESR</strong>-Spektrometer<br />
Spektrometer<br />
Bruker ECS 106<br />
Fixer Frequenzbereich : X-Band X<br />
9.5 GHz<br />
Magnetfeld : 0.34 T (3400 G)<br />
Substanz in einem homogenen Magnetfeld<br />
wird mit Mikrowellen<br />
konstanter Frequenz bestrahlt.<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
Klystron<br />
38
<strong>ESR</strong> <strong>Spektroskopie</strong><br />
Elektron – Kern -Hyperfeinkopplung<br />
Wechselwirkung des ungepaarten Elektrons<br />
mit dem Kernspin umgebender Atome führt f<br />
zu<br />
einer Hyperfeinaufspaltung des Spektrums<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
39
Nitroso-Verbindungen<br />
z<br />
Hyperfeinwechselwirkung des ungepaarten<br />
Elektrons (S=1/2, M s = +1/2, -1/2) mit dem<br />
N-Kern (I=1,M I = +1,0,-1)<br />
H 3<br />
C<br />
H 3<br />
C<br />
R<br />
C<br />
N<br />
.<br />
R'<br />
C<br />
CH 3<br />
CH 3<br />
N<br />
O<br />
x<br />
O<br />
y<br />
z.B. TEMPO 2,2,6,6 -Tetramethylpiperidin-1-oxyl<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
40
Typische <strong>ESR</strong>- aktive NO Gruppen für f r Spin-label<br />
TEMPO<br />
Doxyl<br />
Proxyl<br />
Stearinsäure Spinlabel<br />
Phospholipid Spinlabel : Lyso-Phospolipid + gelabelter Stearinsäure<br />
Cholesterinester<br />
Triglyceride<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
41
<strong>ESR</strong> <strong>Spektroskopie</strong><br />
SPEKTRALE ANISOTROPIE<br />
OPIE<br />
Immobilisiert in einem polykristallinen System<br />
Pulverspktrum<br />
Schnelle anisotrope Bewegung in Flüssigkristallen<br />
2A z<br />
2A<br />
2A<br />
Schnelle isotrope Bewegung in Flüssigkeiten<br />
order parameter: S=(A ║ -A ⊥ )/[A z -0.5(A x +A y )]<br />
Messparameter :<br />
‣ Order parameter<br />
‣ Outer hyperfine splitting<br />
A iso<br />
‣ Hyperfine coupling constant<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
‣ Rotational correlation times<br />
42
<strong>ESR</strong> <strong>Spektroskopie</strong><br />
SPIN LABEL -<br />
SPIN SONDEN<br />
Markermoleküle<br />
in biologischen Membranen<br />
Welche Information erhält man ?<br />
‣ Molekulare Beweglichkeit<br />
‣ Intramolekulare dynamische Prozesse<br />
z.B. Diffusion,<br />
‣ Polarität der Umgebung<br />
‣ Änderungen in der biologischen Membran<br />
z.B. Phasenübergänge<br />
‣ Lipid-Protein Wechselwirkungen<br />
‣ Segmentbewegung der Proteine<br />
‣ Membranaktivität von Proteinen<br />
z.B. lytische Aktivität<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
43
EINBAU von SPIN LABEL MARKERMOLEKÜLEN<br />
in<br />
BIOLOGISCHE MEMBRANEN<br />
Geringe Konzentration<br />
Ortsspezifisch<br />
Nicht pertubierend<br />
Thin–film method:<br />
Spin label in organischem Lösungsmittel, L<br />
abgedampft mit N 2<br />
dünner Film mit Probe (Liposomen(<br />
Liposomen, , Zellen, Lipoproteinen, , Proteinen)<br />
inkubieren.<br />
Empfindlichkeit:<br />
ca. 10 - 5 Mol/l, bei tiefen Temperaturen bis zu 10 -15<br />
Mol/l<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
44
Fettsäure<br />
ure-Spinlabel<br />
in einer Lipidmembran<br />
OH<br />
O<br />
long chain<br />
axis<br />
z<br />
Stearinsäure Derivate in Bilayer<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
45
Spin gelabelte Phospholipide<br />
PC<br />
Modellmembrane mit verschiedenen Kopfgruppen<br />
z.B. repräsentativ für Säugetier- oder Bakterien<br />
zellen<br />
PC, SM, PS, PA,<br />
PG, PE, CL<br />
2A<br />
⊥<br />
2A<br />
Typisches <strong>ESR</strong>-Signal für ein<br />
spin gelabeltes Phospholipid<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
46
Nitroxyl-Spinlabel in biologischen Membranen<br />
H<br />
Bestimmungsparameter<br />
Äußere Hyperfeinaufspaltung :<br />
(2A max )<br />
Maß für die Beweglichkeit<br />
Stearinsäure<br />
Spinlabel<br />
entsprechende<br />
<strong>ESR</strong>-Spektren<br />
Ordnungparameter S :<br />
(von A ⊥ und A II)<br />
Maß für die Beweglichkeeit<br />
14<br />
N-Hyperfineaufspaltungsparameter<br />
a N<br />
:<br />
Maß für die Polarität der Umgebung des<br />
Spinlabels<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
47
Temperaturabhängige Prozesse : Phasenübergänge<br />
2A max<br />
Kettenschmelzen<br />
Beweglichkeit der Fettsäureketten nimmt zu<br />
with protein<br />
‣ Das reine Lipidsystem zeigt einen<br />
definierten<br />
gel-flüßig<br />
Übergang<br />
Tm<br />
5-PCSL in DMPC membrane –<br />
5-PCSL in DMPC membrane + plasma protein -<br />
without protein<br />
Ramakrishnan et al., Biophysical J. (2001)<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
48
Abhängigkeit von der Position der Markergruppe entlang der Fettsäurekette<br />
2A max<br />
Reines Lipidsystem<br />
+Protein<br />
+ protein<br />
lipid<br />
Mobilität<br />
steigt<br />
hängt davon ab, wie tief das<br />
Protein in die Membrane<br />
eintaucht<br />
PCSL in DMPC membrane –<br />
PCSL in DMPC membrane + protein -<br />
Ramakrishnan et al., Biophysical Biophysikalische J. (2001) Techniken SS09<br />
49
Abhängigkeit der Spektren von der Kopfgruppe der Phospholipide<br />
Selektivität t von Proteinen für f r Lipide<br />
‣ Anteil der in ihrer Beweglichkeit<br />
eingeschränkten Phospholipiden<br />
1 mol% spin label<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
Ramakrishnan et al., Biophysical J. (2001)<br />
50
Löschung<br />
des <strong>ESR</strong>-Signals<br />
Signals durch Quencher - Moleküle<br />
Polare (wasserlösliche) bzw. unpolare (lipidlösliche)<br />
Ascorbinsäure Sauerstoff<br />
Nickelchlorid<br />
Chromoxalat<br />
Intensitätsabnahme bzw. Verbreiterung des <strong>ESR</strong>-Signals<br />
Anwendungen<br />
Lokalisation des spin labels, transversale Diffusion, Membranpermeabilität<br />
Spinsonden<br />
Ascorbat-quenching<br />
<strong>ESR</strong>-Intensitätsabnahme<br />
Zeit<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
51
Parameter :<br />
Rotationsdiffusionszeit τ [sec ]<br />
Rotationsdiffusion<br />
Membranprotein<br />
τ = 10 -6 sec<br />
Lipide in der Membrane<br />
τ = 10 -9 sec<br />
Lipide am Protein<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
τ = 10 -7 sec<br />
52
τ rot<br />
/ ns<br />
Rotationskorrelationszeit: Zeitfenster 10 -9 bis 10 -7 s<br />
NMR: 10 -6 bis 10 -4 s<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
53
Proteine - Peptide<br />
Selektives Spinlabelling von Aminosäureresten<br />
(Cys, Lys, , Met)<br />
-Packungsdichte in der Spinlabel- Umgebung<br />
„bulky“ Aminosäurereste – geringere Mobilität<br />
-Sekundärstruktur<br />
α- Helix geringere Mobilität als β-Sheet<br />
-Polarität der Spinlabel- Umgebung<br />
Kopfgruppennähe oder Proteinassoziate<br />
Spin label<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
54
Membranproteine<br />
Selektiv gelabelte Proteine in Membranen<br />
-Änderungen der Protein-<br />
Konformation<br />
-Änderungen der Protein-<br />
Proteinassoziationen<br />
durch Ligandenbindung –<br />
Rezeptoroligomerisierung<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
55
Anwendungsmöglichkeiten glichkeiten :<br />
Effekt von Cholesterin auf Membranen und Lipoproteine<br />
Klinische Studien, Einfluß von Diät, Medikamenten ....<br />
Oxidation und oxidativer Streß<br />
Detektion von Radikalen und radikalischen Produkten<br />
Nahrungsmittelindustrie, Atherosklerose...<br />
Drug delivery - Liposomale Formulierung<br />
Influence of liposome composition (PL, cholesterol) ) on bilayer<br />
fluidity, effects on adsorption and penetration<br />
Coderch L. et al., J Control Release,2000<br />
Aktivierungs- und Aggregationsprozesse - z.B. Blutplättchen<br />
ttchen<br />
Changes in the fluidity of the outer membrane layer<br />
Vlasova I, Platelets 2000<br />
Biophysikalische Techniken SS09<br />
56
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