Molekularbiologie Gruppenleiter Prof. Dr. rer. nat. Roland Lauster ...

DRFZ
Jahresbericht 02/03
Molekularbiologie
Gruppenleiter
Prof. Dr. rer. nat. Roland Lauster
Studenten
Techn. Assistentin
externe Kooperationspartner:
Mark Rosowski
Miriam Tschirschmann
Hendrik Nogai
Daniel Schaumann
Nicole Ngo Pouhe
Anika Rietz
Stefan Meyer
Timo Gaber
Sandra Naundorf
Luzia Reiners Schramm
Prof. Dr. Frank Buttgereit
Universitätsklinikum Charite´ Campus Mitte, Klinik für Rheumatologie
Prof. Dr. Jochen Sieper
Universitätsklinikum Charité, Campus Benjamin Franklin,
Rheumatologie
Prof. Dr. Ralf Paus
Universitätsklinikum Hamburg Eppendorf
Dermatologie
Dr. Andrea Vortkamp, Dr. Michal Janitz
Max Planck Institut für molekulare Genetik
Prof. Dr. Veit Krenn, Sebastian Pillai
Universitätsklinikum Charité, Campus Mitte, Institut für Pathologie
Olfert Landt, Ute Böttcher
GenExpress GmbH, Berlin
Prof. Rainer Buchholz, Dr. Holger Hübner
Universität Erlangen
Dr. Gül Schmidt, Dr. Carola Lauster
Universitätsklinikum Charité Campus Virchow Klinikum, Klinik
für MKG-Chirurgie
Prof. Dr. Frauke Zipp
Universitätsklinikum Charité Camus Mitte, Institut für Neurologie
Dr. Arif Malik, Dr. Johannes Schuchhardt
Microdiscovery GmbH, Berlin
Dr. Hans Mollenkopf
Max Planck Institut für Infektionsbiologie
Dr. Stefan Scheding
Universitätsklinikum Charité Campus Virchow Klinikum, Klinik
für allg. Pädiatrie
Alle Erkrankungen aus dem rheumatischen Formenkreis zeichnen
sich dadurch aus, dass dauerhafte Gewebeschädigungen
auftreten. Dies betrifft in erster Linie Gelenke, bei systemischen
Erkrankungen wie dem Lupus erythematodes aber auch viele
andere Organe wie die Haut oder die Nieren. Im Bereich der
Regenerativen Medizin zeichnen sich unterschiedliche Strategien
zur Heilung von Gewebedefekten ab, was in besonderem
Maße für die rheumatischen Gelenkerkrankungen neue Perspektiven
eröffnet. Diese untergliedern sich in
- „Tissue Engineering“, bei dem körpereigene Zellen entnommen,
im Labor vermehrt, modelliert und schließlich dem
Patienten zurückübertragen werden und
- „Geweberegeneration“, bei der man versucht, die körpereigene
Gewebeheilung zu verstehen und im Körper gezielt zu
unterstützen. Hierbei können auch adulte Stammzellen eingesetzt
werden.
Die molekularbiologische Arbeitsgruppe hat sich zum Ziel
gesetzt, an verschiedenen Modellsystemen, die „Umgebung“
zu analysieren, in der Stammzellen oder Vorläuferzellen zu
funktionstüchtigen Zellen eines Gewebes ausdifferenzieren
können. Im Mittelpunkt stehen hierbei spezielle Proteine, welche
als Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren bezeichnet
werden, sowie mechanische Belastungen, welche gerade bei
Knorpelzellen eine besondere Rolle spielen.
Die im Folgenden genauer beschriebenen Projekte beziehen
sich
1) Auf die Herstellung eines auf die Geweberegeneration ausgerichteten
Genexpressionssystems (DNA Chip) und die Analyse
von definierten Mikro-umgebungen auf die Differenzierung
von Mesenchymalen Stammzellen und Knorpelzellen;
2) auf die vergleichende Analyse von osteoarthrotischen und
gesunden Knorpelzellen, mit dem Ziel, Faktoren zu identifizieren,
welche für die anhaltende Zerstörung des Knorpels
verantwortlich sind.
3) auf die Identifizierung von Faktoren, welche die Mikroumgebung
ausbilden, die für die Differenzierung von B-Zellen im
Knochenmark notwendig ist.
4) auf das Studium von Wachstumsfaktoren bei der Transdifferenzierung
von Epithel- zu Bindebewebszellen während der
Ausbildung des Gaumens.
Neben diesen im Detail dargestellten Forschungsprojekten ist
die Molekularbiologische Arbeitsgruppe in eine Reihe weiterer
Kooperatiosprojekte eingebunden. Da wir hierbei im wesentlichen
einen technischen Beitrag leisten (Real Time PCR, in situ-
Hybridisierung, Klonierung von Genen, Herstellung von cDNA,
Produktion und Reinigung rekombinanter Proteine), sind diese
Projekte hier nicht eingehend beschrieben.
31

Molekularbiologie Jahresbericht 02/03
DRFZ
EINFLUSS DER KULTURBEDINGUNGEN AUF DIE DIF-
FERENZIERUNG VON MESENCHYMALEN VORLÄUFER-
ZELLEN UND DIE REDIFFERENZIERUNG VON PRIMÄREN
CHONDROCYTEN
1 Bioverfahrenstechnik, Universität Erlangen
2 Universitätsklinikum Charite´, Berlin
Mark Rosowski
Luzie Rainers Schramm
Melanie Falb 1
Rainer Buchholz 1
Stefan Scheding 2
Roland Lauster
Der Gelenkknorpel ist ein komplexes Gewebe, welches aus
Knorpelzellen besteht, die in eine extrazelluläre Matrix (ECM)
eingebettet sind. Die extrazelluläre Matrix besteht aus ca. 40
verschiedenen Proteinen, die von den Knorpelzellen selbst
gebildet werden. Degenerative Veränderungen, wie sie bei
rheumatischen Erkrankungen insbesondere bei der Arthrose
auftreten, führen zu Funktionseinschränkungen der betroffenen
Gelenke, welche mit starken Schmerzen verbunden sind.
Die Regeneration des geschädigten Gewebes durch Differenzierung
von Knorpelzellen aus pluripotenten Stammzellen
und die damit verbundene Erneuerung der ECM könnte eine
wichtige therapeutische Maßnahme darstellen. Bei der Knorpelzelldifferenzierung
spielen sowohl exogene Signale wie
z.B. Wachstumsfaktoren als auch mechanische Stimulation
eine entscheidende Rolle.
Ziel des Projektes ist es, eine geeignete Umgebung für Vorläuferzellen
und primäre Chondrocyten in Bezug auf Wachstumsfaktoren
und Kulturbedingungen zu schaffen, um eine
Knorpeldifferenzierung und damit Regeneration zerstörten
Gewebes zu ermöglichen.
PRIMÄRE CHONDROCYTENKULTUR
Bei der autologen Zelltransplantation werden körpereigene
Zellen aus einem Gewebe isoliert, in Zellkultur vermehrt und
anschließend zur Regeration des geschädigten Gewebes rücktransplantiert.
Diese Methode findet in der Regeneration von
kleineren Gelenkknorpelschäden bereits klinische Anwendung.
Bei der Vermehrung der primären Chondrocyten in Monolayer
dedifferenzieren die Zellen, was sowohl mit einer Änderung des
Genexpressionsmusters als auch des Phänotypes einhergeht.
In ihrer natürlichen Umgebung, der extrazellulären Matrix des
Gelenknorpels haben die Chondrocyten eine runde Form. Nach
Isolation und Kultivierung adhärieren die Zellen und nehmen
eine langgestreckte, fibroblastenähnliche Konformation an (Abb.
1 A,B) Markante Änderungen im Expressionsprofil sind durch
eine erhöhte Expression von Kollagen III und MMP-3 sowie die
verminderte Expression von Kollagen II.
Die Dedifferenzierung ist ein reversibler Prozess, der beispeilsweise
durch 3-D Kultursysteme umgekehrt werden kann. Um
die genauen Vorgänge bei der Redifferenzierung zu untersuchen,
wurden sowohl die Verkapselung der Chondrocyten
in Alginatbeads als auch das „micromass culture system“
etabliert. Bei den Alginatbeads handelt es sich um eine polymere
Struktur, in welche die Chondrocyten dreidimensional
eingebettet sind (Abb 1C). Auf diese Weise erlangen die Zellen
ihre runde Gestalt zurück was den Redifferenzierungsprozess
positiv beeinflußt. Im Falle der „micromass“- Kultur werden die
Zellen in sehr hoher Dichte (3-6 x 10 6 Zellen) kultiviert, was zu
einem mehrschichtigen und damit dreidimensionalen System
führt. Auch hier ändert sich der Phänotyp der Zellen zu einer
eher kugeligen Form (Abb. 1D)
Abb. 1 Chondrocytenkultur (A Chondrocyten nach zweiwöchiger und
B nach sechsmonatiger Kultur; C Chondrocyten Alginatebeads und D
micromass culture)
STIMULATION PRIMÄRER CHONDROCYTENKULTUREN MIT
REKOMBINANTEN WACHSTUMSFAKTOREN
Eine weitere Möglichkeit Differenzierungsprozesse in Chondrocyten
zu beeinflussen, stellt die Stimulation mit Wachstumsfaktoren
dar. Sowohl Mitglieder der TGF-ß Superfamilie
als auch Vertreter der FGF-Familie und die Hedgehog-Proteine
spielen eine wichtige Rolle bei der Knorpelentwicklung.
Daher wurden einige Vertreter dieser Wachstumsfaktoren
rekombinant im prokaryontischen oder eukaryontischen
System hergestellt und primäre Chondrocyten als auch eine
Chondrocytenzellinie stimuliert. Änderungen im Expressionsmuster
wurden auf unterschiedliche Weise untersucht.
Zum einen wurden Unterschiede im mRNA Level durch
real-time PCR bestimmt zum anderen sind Änderungen in
der Sekretion von Zytokinen als Botenstoffe für Differenzierungs-
prozesse gemessen worden. Es zeigte sich, dass
durch die Stimulation mit FGF-2, die Expression von IL-6
und IL-8 stark erhöht werden konnte (Abb. 2a,b). Diese
Änderungen in der Expressionsstärke sind sowohl zeit- als
auch konzentrationsabhängig. So zeigte sich in den ersten
12 h der Stimulation der stärkste Anstieg der IL-6 und IL-8
Expression. Weiterhin konnte beobachtet werden, dass mit
32

DRFZ
Jahresbericht 02/03
Molekularbiologie
mesenchymaler Vorläuferzellen dar. Solche pluripotenten
Stammzellen können aus dem Knochenmark isoliert und im
undifferenziertem Entwicklungsstadium kultiviert werden. Unter
geeigneten Kultivierungs-bedingungen differenzieren diese
Zellen zu Adipocyten, Osteoblasten, Myoblasten oder Chondrozyten.
Die Chondrozytendifferenzierung verläuft über mehrer
Stadien, an deren Regulation sich gegenseitig beeinflussende
Wachstums-faktoren unterschiedlicher Familien beteiligt sind.
Abb. 2 Regulation der Expression von Il-6 und IL-8 nach FGF-2 stimulation
oben Messung der Proteinsekretion mit dem Bio-Plex System
unten mRNA Quantifizierung
durch Real-Time PCR
einer steigenden Konzentration des Wachstumsfaktors bei
der Stimulation auch ein stärkerer Anstieg der Zytokinexpression
einhergeht.
Mit der DNA-Chip Technologie können Änderungen von
Expressionsstärken mehrer tausend Gene nach Stimulation
bestimmt werden. In unserer Arbeitsgruppe wurde ein Chip
etabliert, mit dem speziell Fragestellungen der Chondrocytendifferenzierung
und den damit verbundenen Signal- transduktionswegen
untersucht werden kann. Ein Bild eines solchen
Chipexperiments ist in Abb.3C dargestellt. Hier zeigte sich nach
FGF-2 stimulation mehrer Gene signifikant hoch oder runterreguliert
sind.
Der erste Schritt ist eine Kondensation der Vorläuferzellen, was
durch eine Änderung der Expression von Adhäsionsmolekülen
erreicht wird. In vitro wurde dieser Prozess durch Pelletierung
der Stammzellen bei gleichzeitiger Stimulation mit dem Wachstumsfaktor
TGF-ß3 simuliert. Die erfolgreiche Induktion der
Chondrozytendifferenzierung kann an der Expression von Markergenen
wie Kollagen II und Aggrecan nachgewiesen werden,
welche für essentielle Bestandteile der Knorpelmatrix kodieren.
PERSPEKTIVEN
Mit Hilfe der oben genannten Techniken sollen die genauen
molekularen Mechanismen der Chondrozytende- und –redifferenzierung
sowie die Chondrogenese von mesenchymalen
Stammzellen untersucht werden. Dabei sollen Wachstums-faktoren
in unterschiedlichen Konzentrationen und Kombinationen
auf ihren Einfluß in diesen Prozessen bestimmt werden.
Weiterhin sollen in diesem Projekt die Auswirkungen der induzierten
IL-6 und IL-8 Expression nach FGF-2 Stimulation auf
den Chondrozytenphänotyp analysiert werden.
Abb. 3 Chipbildausschnitt und quantitative Auswertung
33
33
DIFFERENZIERUNG MESENCHYMALER STAMMZELLEN
Ein weiterer Schwerpunkt stellt die Untersuchung des Einflusses
rekombinanter Wachstumsfaktoren auf die Differenzierung

Molekularbiologie Jahresbericht 02/03
DRFZ
GENEXPRESSIONSPROFILE VON CHONDROZYTEN AUS
HUMANEM KNORPELGEWEBE
1 GenExpress
2 Max Planck Institut für Infektionsbiologie
3 Pathologie Charité Virchow
4 Pathologie Charité Mitte
Miriam Tschirschmann
Nicole Ngo Pouhe
Mark Rosowski
Luzie Reiners Schramm
Daniel Schaumann
Ute Böttcher 1
Hans Mollenkopf 2
E. Sebastian Pillai 3
Veit Krenn 4
Roland Lauster
VERGLEICH DER EXPRESSIONSPROFILE VON CHONDRO-ZYTEN
AUS HUMANEM OSTEOARTHROTISCHEN UND GESUNDEN KNOR-
PELGEWEBE
Bei der Betrachtung degenerativer Erkrankungen stehen
zunehmend rheumatische Beschwerden der großen Gelenke,
allen voran die Osteoarthrose (OA) im Mittelpunkt.
Unter Osteoarthrose (OA) versteht man den irreversiblen Abbau
der Gelenkknorpelschicht infolge permanenter Fehl- oder Überbelastung
der Synovialgelenke.
Die für eine schmerzfreie Beweglichkeit der Gelenke entscheidenden
Eigenschaften des Gelenkknorpels werden im intakten
Gelenk durch die spezifische biochemische Beschaffenheit der
Extrazellulären Matrix (ECM) sichergestellt und durch die Knorpelzellen
aufrecht erhalten.
Ein wesentlicher Vorteil des Knorpelgewebes gegenüber
anderen Gewebestrukturen ist die Gegenwart eines einzigen
Zelltyps, so dass
detektierte Genexpressionsmuster automatisch den Chondrozyten
zugeschrieben werden können.
Das Verstehen der biochemischen Eigenschaften, dem strukturellen
Aufbau des Knorpels, sowie das Aufdecken des kompletten
Expressionsmusters der Knorpelzellen ist Voraussetzung
dafür, therapeutisch bei der Entstehung der OA intervenieren
zu können.
Ziel ist es daher, nach Möglichkeit das gesamte Expressionsmuster
der Chondrozyten anhand eines Mikroarrays aufzudecken.
Der in den folgenden Versuchen verwendete Array enthält
ausschliesslich cDNA Fragmente, die in der Arbeitsgruppe
kloniert wurden. Diese Gene spielen alle eine Rolle bei der
Zellproliferation– oder der Differenzierung zu Chondrozyten.
Mittlerweile wurde die Auswahl an Genfragmenten auf Fragestellungen
der B-Zellentwicklung sowie für die Charakterisierung
eines vollständigen Expressionsmusters mesenchymaler
Stammzellen ausgeweitet. Der Array findet damit zukünftig
ebenfalls Anwendung in den Projekten der anderen Gruppenmitglieder
(s.o.).
Die dargestellten Daten der Hybridisierungen wurden durch
semiquantitative PCR Untersuchungen überprüft und bestätigt.
Zudem wurden die morphologischen Eigenschaften der
verwendeten intakten und arthrotischen Gewebeproben histologisch
unterlegt.
34
Abb. 1 Dargestellt sind die Schritte einer vergleichenden Hybridisierung auf einen cDNA Array am Beispiel einer gleichzeitigen Hybridisierung
von Proben aus gesundem und osteoarthrotischen Knorpelgewebe, HE Gewebeschnitte:(20x Vergrößerung, links: gesund,
rechts: arthrotisch), Arrayabb.: customized cDNA Array mit Cy3 und Cy5 markierten Proben

DRFZ
Jahresbericht 02/03
Molekularbiologie
VERGLEICHENDE GENEXPRESSIONSANALYSE
In Abb.1 ist der Ablauf eines Arrayexperimentes dargestellt.
In Kooperation mit der Pathologie Charite Berlin wurden uns
Gewebeproben von gesunden und osteoarthrotischen Synovialgelenken
zur Verfügung gestellt. Da die ECM des Knorpelgewebes
nur zu lediglich 5% aus Zellen besteht, ist die Isolierung
einer ausreichenden Menge an totalRNA für die Expressionsanalyse
bereits ein kritischer Parameter. Die RNA muss jedoch
aus Zellen isoliert werden, die direkt aus dem Gewebe stammen,
da die Zellen unter in vitro Bedingungen in Monolayerkulturen
ihren Phänotyp wechseln und daher nicht problemlos auf
diese Weise angereichert werden können.
QUANTIFIZIERUNG DER ARRAYDATEN AM BEISPIEL VON CLUS-
TERIN
Die stärkste Überexpression konnte bei den osteoarthrotischen
Proben für das Gen Clusterin festgestellt werden. Bislang
können noch keine Aussagen über die genaue Funktion von
Clusterin getroffen werden. Es wird zu einer neuen Klasse der
sekretorischen „Heat shock“ Proteine (HSP) gezählt. Bekannt
ist, dass dieses Protein verstärkt in geschädigtem Gewebe
auftritt.
Im Knorpelgewebe kommt Clusterin gehäuft in der Oberflächenschicht
vor und wird dort von Zellen nahe der Gewebe-
Flüssigkeitsgrenzschicht exprimiert. Dies ist auch der Ort mit
der höchsten Zellsterberate.
Clusterin wird daher eng in Zusammenhang mit dem Ereignis
der Apoptose gebracht [3,4]. Zusammen mit einigen anderen
als differentiell exprimiert ermittelten Genfragmenten wurde
eine Semiquantifizierung mittels PCR durchgeführt. In Abb.2
ist gezeigt, dass die Arraydaten in einer quantitativen Analyse
für Clusterin bestätigt werden können. In Analysen mit weiteren
Genen konnten die Ergebnisse der Arrayexperimente ebenfalls
bestätigt werden. (Daten nicht gezeigt).
Mit einer geeigneten Methode zur definierten Trennung der Zellen
aus den unterschiedlichen Schichten des Knorpels sollen
zukünftige Analysen Aufschluss über weitere zonenspezifische
Gene sowie die unterschiedliche Expression bestimmter Gene
bringen. Eine Möglichkeit bietet hierbei die Microdissection, mit
der gezielt einzelne Zellen aus dem Gewebe isoliert werden
können.
Die Technik der in situ Hybrisdisierung kann für Kandidatengene
angewandt werden, bei denen bereits durch Vorversuche
eine schichtenspezifische Expression vermutet wird. In
unserer Arbeitsgruppe wird die Methode der nicht-radioaktiven
Sondenmarkierung mit Digoxigenin bereits zur Analyse von
Wachstumsfaktoren in Gewebeproben von humanem juvenilen
Knorpel angewandt. Das Prinzip der Technik beruht auf dem
Einsatz einer sequenzspezifischer RNA Sonden. Diese RNA
Moleküle bilden mit komplementären Strängen im
Testgewebe stabile Komplexe, die dann nach Konjugation mit
einem Enzym gekoppelten Sekundärantikörper bei Substratumsatz
durch ein farbiges Präzipitat detektiert werden können.
LITERATUR
1. Anatomy of a comparative gene expression study ;
http://www.cs.wustl.edu,
2. Heller R. SM, et al. 1997. Discovery and analysis of inflammatory
disease-related genes using cDNA microarray. Proc Natl
Acad Sci USA. 94: 2150-2155
3. Michel D. CG, et al. 1997. Stress-induced transkription of the
clusterin/apoJ gene. Biochem. J . 328: 45-50
4. Khan TB, et al. 2001. Expression of clusterin in the superficial
zone articular cartilage. Arthritis Rheum. 44:
Abb. 2 semiquantitative PCR mit Clusterin Primern, Verdünnungsreihe
der cDNA Proben v.links: 1:16,1:8,1:4,1:2, unverdünnt
PERSPEKTIVEN
Im Weiteren soll der Entdeckung einer differentiellen Expression
von Clusterin durch die folgenden Versuchsansätze nachgegangen
werden.
Es gilt zunächst eine differentielle Expression von Clusterin
auf Proteinebene nachzuweisen. Durch Anwendung der in
situ Hybridisierung konnte mittlerweile eine verstärkte Clusterin
Expression von Zellen der stark geschädigten Oberschicht
gezeigt werden.
35
35

Molekularbiologie Jahresbericht 02/03
DRFZ
DEFINITION DES MICROENVIRONMENTS FÜR DIE
HUMANE B-ZELLDIFFERENZIERUNG
Daniel Schaumann
Daniela Melzer 1
Stefan Scheding 1
Roland Lauster
1 Labor für zelluläre Therapie, Klinik für allgemeine Pädiatrie der
Charité, Campus Virchow Klinikum, Berlin
B-Lymphozyten stellen mit der Bereitstellung von hochspezifischen
Antikörpern einen sehr wichtigen Ast der adaptiven
Immunantwort dar. Die Entwicklung der B-Zellen findet im Knochenmark
ausgehend von der hämatopoetischen Stammzelle
statt. Dabei handelt es sich auf molekularer Ebene um einen
bereits sehr gut verstandenen Prozess. Lediglich die in der
Mikroumgebung („microenvironment“) befindlichen Faktoren,
die das Schicksal der sich differenzieren B-Zelle beeinflussen
sind im Menschen noch weitgehend unbekannt. Die Identifizierung
dieser Faktoren ist das Ziel dieses Forschungsprojektes.
Es werden primäre B-Vorläuferzellen und Stromazellen aus
humanem Knochenmark isoliert und mit Hilfe der DNA-Chip
Technologie getrennt auf die Synthese von Zytokinen, Adhäsionsmolekülen
und extrazellulärer Matrix untersucht. Die dabei
entdeckten Faktoren werden in einem in vitro-Modell auf ihren
Einfluß auf den Differenzierungsprozess charakterisiert.
B-LYMPHOZYTEN
Sowohl die B- als auch die T-Lymphozyten (wie auch alle anderen
zellulären Bestandteile des Blutes) entstehen im Knochenmark
ausgehend von den hämatopoietischen Stammzellen
(HSZ). Während die B-Zellen auch dort ausreifen, wandern
die Vorläufer der T-Zellen zum Thymus und entwickeln sich
dort weiter. Nach ihrer vollständigen Reifung gelangen beide
Zelltypen ins Blut, von wo aus sie zu den
sekundären lymphatischen Organen wandern (Lymphknoten,
Milz, usw.) und dort auf die in den Körper eingedrungenen
Fremdantigene treffen.
HUMANE B ZELL-DIFFERENZIERUNG
Bei der frühen B-Zellentwicklung im Knochenmark handelt es
sich mittlerweile um einen auf molekularer Ebene sehr genau
definierten Differenzierungsprozess (1). Man kann über den
Nachweis von Oberflächenmolekülen, durch die Analyse
der involvierten Transkriptionsfaktoren und anhand der nach
einem festgelegten Programm stattfindenden Umlagerung
der Immunglobulin-Gene den Verlauf der Entwicklung von der
hämatopoetischen Stammzelle über die pro- und pre-B-Zelle
bis zur unreifen B-Zelle verfolgen, die aus dem Knochenmark
auswandert (Abb. 1).
MICROENVIRONMENT FÜR DIE HUMANE B ZELL-ENTWICKLUNG
Während dieser Differenzierungsprozess in der Maus und im
Menschen vergleichbar ablaufen, ergeben sich die prägnanten
Unterschiede zwischen beiden Spezies u.a. darin, welche
Faktoren aus der unmittelbaren Umgebung der sich differenzierenden
Zelle (Mikroumgebung oder „microenvironment“) in
welchem Umfang Einfluß auf das Schicksal dieser Zelle nehmen
(1). Auf zellulärer Ebene gestalten andere nicht-hämatopoetische
Zellen diese Umgebung. Gut charakterisiert ist z.B. die
Nische der HSZ, die sich am Endosteum assoziiert mit Osteoblastenzellen
befinden (2). Diese Osteoblastenzellen regulieren
ob eine HSZ nach einer Teilung eine Stammzelle bleibt oder
in die verschiedenen Blutzellinien ausdifferenziert (Abb.2) (2).
Darunter im Subendosteum befinden sich die aus der Stamzellnische
entlassenen Vorläuferzellen für die verschiedenen
Blutzellinien, so auch B-Zellvorläufer (Abb. 2B) (3), die ihrerseits
mit den bindegewebsartigen Stromazellen des Knochenmarks
(KMSZ) in Kontakt treten (Abb. 2C) (4).
Auf molekularer Ebene besteht die Mikroumgebung der Zelle
aus Zytokinen (löslichen Faktoren), Adhä-sionsmolekülen und
extrazellulärer Matrix (EZM).
36
Abb. 1 Überblick über die frühe humane B-Zelldifferenzierung. Die für den einzelnen Entwicklungsstadien charakteristischen Oberflächenmarker sind
gezeigt; ausserdem sind im Zellkern die stattfindenden (grau) bzw. vollendeten (schwarz) Umlagerungen der Immunglobulin-Gene angezeigt. Darunter
bezeichnen die Balken die Differenzierungsschritte, die in den jeweiligen Transkriptionsfaktor KO-Mäusen inhibiert sind; modifiziert nach (1).

DRFZ
Jahresbericht 02/03
Molekularbiologie
Abb. 2 Das hämatopoetische Microenvironment im Knochenmark. A Die hämatopoetische Stammzellnische. Hämatopoetische Stammzellen sind im
Endosteum mit Osteoblasten assoziiert, die die Prozesse der Selbsterneuerung und Ausdifferenzierung der Stammzellen steuern; (2). B TdT+ positive
B-Vorläuferzellen (Pfeile) im Subendosteum der Ratte. Die gestrichelte Linie bezeichnet die Grenze zum Knochen; (3). C Autoradiographie von B220-
positiven B-Vorläuferzellen (PB), die mit bindegewebsartigen Stromazellen (RC) im murinen Knochenmark assoziiert sind; (4).
In diesem Punkt ist die murine B-Zelldifferenzierung weit besser
charakterisiert als die humane. Während z.B. Interleukin-7
(IL-7) ein für die murine B-Zellentwicklung essentielles Zytokin
ist, ohne dass dieser Entwicklungsprozess nicht ablaufen kann,
hat es in der humanen B-Zellentwicklung nicht derartigen Stellenwert.
So wurde bei Patienten mit nicht funktionsfähigem IL-7
Rezeptor trotzdem eine normale Frequenz an B-Zellen in der
Peripherie festgestellt (1). Ein Faktor, der in der humanen B-
Zellentwicklung ähnliche Bedeutung hat wie IL-7 in der Maus
ist bisher noch nicht identifiziert (1).
etablierenden in vitro-Modell für die humane B-Zelldifferenzierung
angewendet. In dem bereits beschriebenen in vitro-Modell
werden humane HSZ mit KMSZ zusammen kultiviert. Innerhalb
von wenigen Wochen entwickeln sich aus den HSZ ohne Zugabe
von Zytokinen zu einem bestimmten Anteil unreife B-Zellen.
In diesem und ähnlichen Systemen konnte in der Vergangenheit
z.B. schon die inhibierende Wirkung des Faktors Delta-like-1 für
die humane B-Zellentwicklung bzw. dessen positiver Effekt auf
die T-Zellentwicklung nachgewiesen werden (5).
IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON FAKTOREN
DER B-ZELLENTWICKLUNG
Das Ziel dieses Forschunsgvorhabens ist es Faktoren zu
identifizieren, die aus der Mikroumgebung der B-Vorläuferzelle
(parakrine Faktoren) oder der B-Vorläuferzelle selbst (autokrine
Faktoren) stammen, und den Einfluß dieser Faktoren auf die
B-Zellentwicklung zu charakterisieren. Dazu werden aus humanem
Knochenmark HSZ und B-Vorläuferzellen anhand der
bekannten Oberflächenmarker CD34 und CD19 sowie anhand
der Oberflächen-Immunglobuline mit magnetischen und fluoreszenten
Trennverfahren sortiert. Aus den übrigen Zellen werden,
anhand ihrer Eigenschaft in vitro adhärent zu wachsen, die
KMSZ angereichert. Die so erhaltenen Zellpopulationen werden
dann mit Hilfe der DNA-Chip Technologie auf die Synthese von
Zytokinen, Adhäsionsmolekülen und EZM untersucht.
Um diese Faktoren hinsichtlich ihrer Wirkung auf den Differenzierungsprozess
zu untersuchen, wer-den sie in einem zu
ZITATE
(1) Bertrand FE, Eckfeldt CE, Fink JR, Lysholm AS, Pribyl JAR,
Shah N, LeBien TW (2000) Microenvironmental influences on
human B-cell development. Immunol Rev 175, 175-186
(2) Zhang J, Niu C, Ye L, Huang H, He X, Tong WG, Wiedemann
LM, Mishina Y, Li L (2003) Identification of the haematopoietic
stem cell niche and control of the niche size. Nature 425, 836-
841
(3) Hermans MHA, Hartsuiker H, Opstelten D (1989) An in situ
study of B-lymphocytopoiesis in rat bone marrow. J Immunol
142, 67-73
(4) Osmond DG, Jacobsen K, Park YH, Lamontagne L (1988) In
vivo localization of B-lymphocyte progenitor cells in mouse bone
marrow. Adv Exp Med Biol 237, 45-51
(5) Schmitt TM, Zúniga-Pflücker JC (2002) Induction of T-cell
development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1
in vitro. Immunity 17, 749-756
37
37

Molekularbiologie Jahresbericht 02/03
DRFZ
FOLLISTATIN INHIBIERT DIE EPITHELIALE-MESENCHY-
MALE TRANSITION IN VITRO
Hendrik Nogai
Anika Rietz
Gül Schmidt 1
Carola Lauster 1
Andrea Vortkamp 2
Nils Debus 3
Luzia Reiners-Schramm
Roland Lauster
1 Universitätsklinikum Charité, Klinik für Mund-, Kiefer- und
Gesichtschirurgie
2 Max-Planck-Institut für molekulare Genetik
3 Schering AG
Im Laufe der Embryogenese entsteht aus einer einzigen
befruchteten Eizelle ein komplexer Organismus, aufgebaut
aus einer Vielzahl spezialisierten Zell-Typen, welche einer
strengen Regulation unterliegen: Jeder Zelle wird signalisiert,
in welcher Umgebung sie sich befindet und welche Form
der Differenzierung sie damit zu durchlaufen hat. Die dafür
notwendige innergewebliche Kommunikation wird wesentlich
durch Wachstumsfaktoren vermittelt.
Am Beispiel der Gaumenentwicklung ist es möglich, das
Zusammenspiel und die funktionelle Rolle dieser Wachstumsfaktoren
beispielhaft zu untersuchen.
EMBRYOLOGIE DES GAUMENS
Der Gaumen bildet das Dach der Mundhöhle und trennt diese
von den Luftwegen der Nase. In frühen Stadien der Embryonalentwicklung
existiert diese Trennung noch nicht. Erst später
entspringen von dem Oberkieferknochen jeder Seite Gewebe-fortsätze,
die stetig größer werden und sich schließlich in
der Mitte treffen (Abb.1). Um eine feste Verbindung zwischen
beiden Seiten zu erreichen, müssen sich die Deckzellen dieser
Fortsätze, die Epithelien, in Bindegewebszellen, Mesenchym,
umwandeln. Wird die Entwicklung in diesem Schritt gestört,
kommt das Neugeborene mit einer Gaumenspalte auf die Welt.
Die Frequenz für diese Fehlbildung liegt in Mitteleuropa bei ca.
1:1000.
Die Umwandlung der Epithelien ist ein interessantes Phänomen
und wurde intensiv auf die Beteiligung von Wachstumsfaktoren
untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TGFβ3, ein Mitglied
der TGFβ-Superfamilie, eine entscheidende Rolle dabei spielt.
So wiesen Mäuse, in denen dieses Protein funktionsunfähig
gemacht wurde, nach der Geburt eine Gaumenspalte auf (1).
Außerdem konnte bei der Behandlung von Hühnerembryos mit
TGFβ3 ein Verschluß des Gaumens erreicht werden, obwohl
bei Hühnern physiologischerweise eine Gaumen-spalte persistiert.
REGULATION DER EPITHELIALEN-MESENCHYMALEN TRANSITION
(EMT)
Der Vorgang der EMT findet in der Maus in einem Zeitfenster
von nur wenigen Stunden statt. TGFβ3, das von den Epithelzellen
produziert wird, ist allerdings mehrere Tage lang nachzuweisen.
Dies legt eine zeitliche Regulation durch funktionelle
Gegenspieler nahe.
Für die Familie der TGFβ-Wachtumsfaktoren gibt es eine Gruppe
von Antagonisten, welche die Bindung an die Rezeptoren
blockieren können. Um die Anwesenheit von Antagonisten
in der Embryonalphase nachzuweisen, präparierten wir die
Gaumenfortsätze von Mäuseföten. Die in diesem Gewebe
vorhandene mRNA kann mittels PCR spezifisch nachgewiesen
werden. Diese Untersuchungen zeigten, dass die präparierten
Zellen eine Reihe von Antagonisten bilden. Besondere Aufmerksamkeit
brachten wir dem sog. Follistatin entgegen. Es ist
in dem von uns untersuchten Stadium der Gaumenentwicklung
durch die radioaktive Markierung der mRNA in mikroskopischen
Schnitten (in situ Hybridisierung) nachweisbar: Follistatin wird
in den gleichen Zellen synthetisiert, die auch für die TGFβ3-
Produktion verantwortlich sind (Abb.1). Die markierten Zellen
repräsentieren die Epithelzellpopulation, die in der weiteren
Entwicklung in Mesenchymzellen umdifferenziert.
Das Expressionsprofil der beiden Proteine legt eine direkte
Interaktion nahe. Sollte Follistatin eine hemmende Wirkung
ausüben können, muss es allerdings eine Bindung mit TGFβ3
eingehen. Diese Möglichkeit überprüften wir mit dem BIACore-
System, das eine in vitro Analyse dieser Frage-stellung erlaubt.
Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Bindung von Follistatin an
den mit TGFβ3 beschichteten Chip .
38
Abb. 1 Identifizierung von Follistatin- und Activin ßA produzierenden
Zellen im Gewebe (in situ-Hybridisierung) durch radioaktive Markierung
der spezifischen mRNA. Oben: Die Epithelzellen der Gaumenfortsätze
bilden Follistatin (leuchtende Zellen). Unten: ActvinßA findet man im
darunterliegenden Bindegewebe.
TRANSDIFFERENZIERUNG EINER MURINEN EPITHELZELLINIE
Die Rolle von Follistatin scheint also in der zeitlichen Regulation
des Gaumenverschlusses zu liegen. Fällt diese Hemmung
weg, kann das bereits synthetisierte TGFβ3 den Epithelien
das Signal zur Umwandlung übermitteln. Um dieses weiter
zu untersuchen, haben wir als Modell für die EMT die murine
Epithelzellinie NmuMG verwendet. Durch einmalige Zugabe der
Wachstumsfaktors TGFβ 3 wandeln sich diese Zellen in einen
bindegewebsähnlichen Zelltyp um. Diese Effekt konnte duch
parallele Zugabe von Follistatin komplett unterbunden werden,
was die direkte Hemmung von TGFß 3 belegt (siehe Abb. 2)

DRFZ
Jahresbericht 02/03
Molekularbiologie
ist, durch die Differenzierung induziert.
Es wird deutlich, dass ein komplexes Netzwerk und Zusammenspiel
von verschiedenen Wachstums-faktoren der Entwicklung
des Gaumens zugrunde liegt. Unsere Ergebnisse helfen,
die molekularen Vorgänge besser zu verstehen und auf andere
Systeme zu übertragen.
PERSPEKTIVEN
In unserer weiteren Arbeit werden wir versuchen, weitere beteiligte
Faktoren zu finden. Wir bedienen uns dafür der DNA-Chip-
Technik, die bereits an anderer Stelle eingehender beschrieben
ist.
Das Modell der schrittweisen Differenzierung, welches in Abb.
3 dargestellt ist, kann nun durch spezifische Intervention (Überexpression
der Faktoren oder Ausschalten durch RNAi-Technologie)
überprüft werden.
Abb. 2 Transdifferenzierung muriner NMuMG Zellen in vitro. Durch
einmalig Zugabe von TGFß3 wandeln sich die Epithelzellen zu bindebegewsähnlichen
Zellen um. Der Prozess lässt sich durch Zugabe von
Follistatin komplett inhibieren.
GENOMWEITE EXPRESSIONS-ANALYSEN
Um den Prozess der Transdifferenzierung auf molekularer
Ebene nachzuvollziehen und Anhaltspunkte für das Aufrechterhalten
des mesenchymalen Phänotyps zu bekommen, wurde
das Genexpressionsprofil der Zellen vor und nach EMT gemessen.
Hierbei konnte ein kompletter Wechsel von Markergenen
für Epithelzellen zu Markergenen für Fibroblasen beobachtet
werden. So wird auch der Wachstumsfaktor ActivinβA, welcher
in dem subepithelialen Bindegewebe des Gaumens exprimiert
Abb. 3 Modell zu den molekularen Interaktionen der Transdifferenzierung
während der Gaumenetwicklung. In kleiner Schriftgrösse
sind Transkriptionsfaktoren dargestellt, welche für die Expression von
Wachstumsfaktoren, dem Antagonisten Follistatin oder von Kollagen
(grosser Schrifttyp) verantwortlich sind. Die erste Phase ist identisch
mit dem Gewebeschnitt in Abb. 1, die zweite Phase stellt das Aufeinandertreffen
der Gaumenfortsätze dar, die dritte Phase das Verschmelzen
des Gaumens. Alle dargestellten Gene verursachen in KO-Mäusen
eine Gaumenspalte.
39
39

Molekularbiologie Jahresbericht 02/03
DRFZ
PROTEKTIVE T-ZELLTRANSPLANTATE DURCH
MIKROVERKAPSELUNG
Stefan Scheding 2
Wolfram Ebell 2
Stefanie Siegert 1
Alexander Scheffold 1
Andreas Thiel 1
Barbara Chmielewicz 3
Heinz Ellerbrok 3
Peter Fischer 4
Ulrike Rescher 5 ,
Alexandra Dickopp 5
Stephan Meier 6
Holger Hübner 6
Carola Fleischer 7
Roland Lauster 1
1 DRFZ
2 Klinik für Allgemeine Pädiatrie der Charité
3 Rober Koch Institut Berlin
4 Euroferm GmbH Erlangen
5 Fresenius BioTech, Bad Homburg
6 Lehrstuhl Biovertfahrenstechnik Universität Erlangen
7 GenExpress GmbH Berlin
Die Transplantation spezifischer T-Lymphozyten mit definierter
protektiver Funktion bietet attraktive Perspektiven für die
Therapie von Immundefizienzen, Tumoren, Autoimmunität und
Allergie. Für standardisierte Therapiekonzepte fehlen derzeit
jedoch zuverlässige und effiziente Verfahren für die klinische
Zellsortierung ex vivo, die Zellproliferation in vitro, die Induktion
bestimmter Effektorfunktionen und die Qualitätskontrolle des
Transplantats, insbesondere im Hinblick auf die Stablität der
Effektorfunktionen. Ziel des hier vorgestellten Verbund-Projektes
ist es, verschiedene von den Antragstellern entwickelte
Verfahren zur Herstellung protektiver T-Zelltransplantate für
den klinischen Einsatz zu kombinieren. Die Affinitätsmatrix-
Technologie erlaubt die effiziente magnetische Isolierung
Antigen-spezifischer lebender T-Lymphozyten mit definierter
Effektorfunktion aus peripherem Blut. Durch Mikroverkapselung
soll die T-Lymphozytenproliferation und -differenzierung
in vitro effizienter und kontrollierbarer gemacht werden (virtuelle
Lymphknoten). Um in immundefizienten Patienten, z.B.
nach Knochenmark- (KMT) oder Stammzelltransplantation,
gezielten Immunschutz gegen klinisch relevante Erreger, wie
Zytomegalievirus (CMV) oder Adenovirus herzustellen, wird
der Transfer von in vitro generierten Virus-spezifischen T-Lymphozyten
angestrebt.
SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER VORGEHENSWEISE
ENTWICKLUNG EINER QUANTITATIVEN PCR ZUR GENERISCHEN
DETEKTION HUMANER ADENOVIREN
Eine an der Charité durchgeführte Surveillance Studie zeigte,
dass nach KMT bei Kindern Infektionen durch Adenoviren
besonders kritisch sind. Für den frühen Nachweis einer Infektion
von KMT-Patienten mit Adenoviren erlangt die PCR, insbesondere
die quantitative Real Time-PCR, eine immer größere
Bedeutung. Allerdings ist der spezifische und sensitive Nachweis
aller heute bekannten 51 Serotypen mit einem einzigen,
für alle Viren passenden PCR-Assay aufgrund der geringen
Sequenzhomologie ein schwieriges Ziel. Es ist aber gelungen,
eine Real Time-PCR zu entwickeln, die stellvertretende Serotypen
erkennt und effizient amplifiziert. Gezeigt ist die Amplifikation
einer Plasmid Verdünnungsreihe des Adenovirus Serotypen
3 (10 6 bis 10 1 Kopien/Ansatz, Doppelansatz).
REKOMBINANTE HERSTELLUNG VIRALER ANTIGENE
40
Zur routinemäßigen und reproduzierbaren Generierung von
Virus-spezifischen T-Zellen sollen definierte, rekombinant hergestellte
Antigene verwendet werden. In der Abbildung gezeigt
ist ein SDS-Gel mit dem Adenoviralen Hexon-Protein, zur
Überexpression induziert in E.coli. Stabil exprimierbar ist nicht
nur das gesamte Protein (2), sondern auch gezielt ausgewählte
Subfragmente (8), wodurch die Identifizierung der immundominanten
Epitope möglich wird. Neben dem Größenmarker (M)
sind vier Klone vor (Spur 1,3,5,7 und nach Induktion (Spur
2,4,6,8) gezeigt. Die Proteine (Pfeile) werden nun über eine
Affinitätsmatrix gereinigt und zur T-Zell Stimulation eingesetzt.

DRFZ
Jahresbericht 02/03
Molekularbiologie
ISOLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG ANTIGEN-SPEZIFISCHER
T-LYMPHOZYTEN
Isolierte mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC)
werden für 12 Stunden mit Antigen (CMV-Lysat) stimuliert und
anschließend mittels „IFN-γ Secretion Assay“ isoliert und angereichert.
Dargestellt sind die Antigen-spezifischen T-Lymphozyten
vor und nach zwei magnetischen Zellsortierungen (MACS).
Es werden die Lymphozyten analysiert und Makrophagen und
tote Zellen ausgeschlossen (Fig. 1 und 2). Nach zwei Sortierungsschritten
konnten die IFN-γ positiven Zellen (0,53 % vor
MACS; Fig. 3) auf 86,57 % angereichert werden (Fig. 4). Diese
spezifischen Zellen werden kultiviert und expandiert. Dabei
wird der Einfluss verschiedener Kulturbedingungen (Medium,
Wachstumsfaktoren) auf die Proliferation und Funktion dieser
Zellen untersucht.
ZUSAMMENFASSUNG
Zur Vermeidung viraler Komplikationen und Erkrankungen
nach Knochenmarktransplantation wird die Ko-Transplantation
Virus-spezifischer T-Lymphozyten in Zukunft eine zentrale Rolle
spielen. Für einen individuellen klinischen Einsatz dieser zellulären
Therapie ist es uns gelungen, für humane Adenoviren
ein diagnostisches Verfahren zu entwickeln. CMV-spezifische
T-Lymphozyten konnten aus peripherem Blut isoliert werden. In
weiteren Experimenten sollen nun die Kultur- und Expansionsbedingungen
für diese Zellen optimiert werden. Erste Versuche
zeigten bereits eine erfolgreiche Verkapselung einer T-Zelllinie
(Jurkat). Diese Methode soll nun auf die Kultivierung von primären
Zellen übertragen werden.
Abb. 1 Abb. 2 Abb. 3 Abb. 4
VERKAPSELUNG VON T-LYMPHOZYTEN
Generell bietet die Verkapselungstechnologie Zellen einen
hohen mechanischen Schutz und eine für die Proliferation optimale
Mikroumgebung. Die hier verwendeten Hohlkugeln aus
Zellulosesulfat erlauben den Zellen die Ausbildung von Zellkontakten.
Ziel der Verkapselung von T-Lymphozyten ist eine
deutliche Beschleunigung der Proliferationsraten, um eine ausreichende
Zellzahl für die Transplantation zu erhalten. Gezeigt
ist eine in einer Hohlkugel verkapselte T-Zelllinie (Jurkat). Das
Verfahren soll an diesen Zellen etabliert werden, um es dann
auf Virus-spezifische T-Lymphozyten zu übertragen.
41