Western Blot

Western Blotting
Nach der Auftrennung der Proteinextrakte über Polyacrylamidgele in SDS
PAGE-Puffer, erfolgt die Übertragung der aufgetrennten Proteine auf eine
Nitrocellulosemembran.
Als Membran entweder:
• Westran Clear Signal, Schleicher & Schuell
(Membran zuerst in Methanol ca. 10 Sekunden befeuchten, dann
mindestens 10 Minuten in Anoden-Lösung I inkubieren)
• Whatman Protran Nitrocellulose Transfer Membran
(Membran ca. 10 Sekunden in ddH 2 O befeuchten, dann mindestens 10
Minuten in Anoden-Lösung I inkubieren)
Als blotting Papier:
• Whatman 3MM-Chromatographie Papier
1. Inkubiere 6 Lagen Papier je Blot in Kathodenlösung
2. Inkubiere 3 Lagen Papier je Blot in Anodenlösung I
3. Inkubiere 6 Lagen Papier je Blot in Anodenlösung II
• Für mindestens 10 Minuten
Größe für die Membran und das 3MM-Papier: 5.5 x 9 cm
Die Graphit-Elektroden (Anode, Kathode) mindestens eine Stunde vor der
Benutzung in deionisiertem Wasser wässern (in einer Plastikwanne mit Wasser
überschichten). Vor dem Gebrauch, Elektroden abtrocknen (mit
Zellstofftüchern).

Aufbau der Blots nach folgendem Schema
Den elektrophoretischen Transfer 1. 30 Stunden bei 100 mA/Blot durchführen.
• Nach elektrophoretischem Transfer, Membran mindestens 1 Stunde bei
RT (oder auch über Nacht bei 4°C) in Blockierungspuffer (6 %
Magermilchpulver in TBS/Tween, soweit nicht anders verordnet)
inkubieren
• Membran mit dem primären Antikörper verdünnt im Blockierungspuffer
inkubieren (ca 10 ml pro Blot). Mindestens 1 Stunde bei RT, oder über
Nacht bei 4 °C inkubieren
• Membran anschließend 3 x 5 Minuten mit TBS/Tween (ca 50 ml/Blot)
waschen
• Inkubation mit sekundären Antikörper (meist 1 : 10.000) in
Blockierungspuffer für 1 Stunde bei RT (darauf achten, den richtigen
Antikörper zu verwenden, z.B. anti RAT, RABBIT, MOUSE usw. IgG,
Peroxidase oder Alkalische Phosphatase-Konjugat)
• Membran anschließend 3 x 5 Minuten mit TBS/Tween (ca 50 ml/Blot)
waschen
• Entwicklung des Blots mittels enhanced chemiluminescence (ECL)

1. Membran mit 200 µl/Blot frisch angesetzter ECL-Lösung (Super Signal
West Dura Kit) für 5 Minuten inkubieren ( ECL-Lösung mit einem Spatel
vorsichtig, ohne die Membran zu verletzen gleichmäßig über die Membran
verteilen)
ODER
2. Membran in 20 ml “ Homemade” ECL-Lösung für 2 Minuten inkubieren
Nach der Inkubation, ECL-Lösung von der Membran abtropfen lassen, Blot in
Folie legen, in der Dunkelkammer auf Röntgenfilm exponieren, Film entwickeln,
und das herrliche Resultat genießen.

Lösungen und Puffer:
Kathodenlösung
40 mM 6-Aminohexansäure
20 % (v/v) Methanol
Anodenlösung I
0,3 M Tris/HCl pH 10,4
20 % (v/v) Methanol
Anodenlösung II
25 mM Tris/HCl pH 10,4
20 % (v/v) Methanol
TBS (Tris-Buffered Saline, 25 mM Tris)
8 g NaCl
0,2 g KCl
3 g Tris
in 800 ml H2O lösen, pH auf 7,4 einstellen, mit H2O auf 1 l auffüllen
(20x konzentriert herstellen)
TBS/Tween
0,1 % (v/v) Tween 20 in TBS
Blockierungslösung
6 % (w/v) Magermilchpulver in TBS Tween
ECL
Super Signal® West Dura Trial Kit (Pierce) (Komponente 1 : 1 mischen)
Homemade ECL
p-Coumarsäure (90 mM in DMSO)
3-aminophtalhydrazide (Luminol) (250 mM in DMSO)
1 M Tris/HCL ph 8,5
30 % H 2 O 2
• 5 ml Tris/HCL pH 8,5
• 45 ml ddH 2 O
• 110 µl Coumarsäure
• 250 µl Luminol
Ca 2-3 Wochen im Kühlschrank
haltbar. (im dunkeln lagern)
• 30 µl H 2 O 2 je 10 ml Mix hinzugeben. (H 2 O 2 erst zugeben, wenn man die Reaktion
starten möchte)