Betreuer - in der Biochemie

BIOCHEMISCHES 

GRUNDPRAKTIKUM 

für Chemiker, Biologen und BMC 

INSTITUT FÜR PHARMAZIE UND BIOCHEMIE 

JOHANNES GUTENBERG-UNIVERSITÄT 

Johann-Joachim Becherweg 30 

55128 Mainz 

Tel.: 06131-39 2 58 33 

Fax: 06131-39 2 53 48 

Biochemie@uni-mainz.de 

http://www.bio.chemie.uni-mainz.de/ 

Letzte Änderung: 

17.04.2013 (EK)

Bitte beachten Sie folgende 

Versuchsreihenfolge 

1 

2 

Versuch 

Nukleinsäuren I 

Nukleinsäuren II 

Betreuer 

Baiersdörfer/Weindel 

Baiersdörfer/Weindel 

3 

Nukleinsäuren III Baiersdörfer/Weindel 

4 

5 

6 

7 

8 

9 

10 

11 

Proteine I 

Proteine II 

Kohlenhydrate 

Enzymkinetik 

Leitenzyme 

Proteasen 

Zellen 

Lipide 

Endres/Genswein 



Postina/Mondani 

Kojro/Mondani 

Kojro/Kanarek 

Gimpl/Wolpert 

Gimpl/Wolpert 

Achtung: 

Falls die Versuchsreihenfolge sich ändert, werden die Betreuer Sie darüber rechtzeitig 

informieren!

Richtlinien für das Biochemie-Grundpraktikum 

Vorbereitung auf das Praktikum 

Vor jedem Versuch ist die Versuchsbeschreibung im Skript durchzulesen. 

Vor Versuchsbeginn werden wir eventuell durch einen kurzen Test prüfen, ob Sie sich auf den 

Versuch vorbereitet haben. 

Bei unzureichender Vorbereitung erfolgt der Ausschluß vom Versuchstag. 

Durchführung der Versuche 

Bei Unklarheiten die Betreuer fragen! 

Protokolle 

Die Protokolle werden von den Betreuern des jeweiligen Versuchs korrigiert. 

Die Protokolle müssen alle Informationen enthalten, damit ein Leser auch ohne Kenntnis des Skripts 

die Ziele des Versuchs und die Versuchsdurchführung nachvollziehen kann. Zur Beschreibung von 

Details (Pufferzusammensetzung etc.) sollte auf das Skript verwiesen werden. 

Gliedern Sie stets nach folgenden Punkten: 

• Einleitung: kurz und prägnant das wesentliche auf ca. 1 Seite 

• Versuchsdurchführung: Verweis auf das Skript. Abweichungen/Fehler bei der Durchführung 

müssen beschrieben werden! 

• Ergebnis: enthält je nach Versuch Tabellen, Abbildungen, Berechnungen (Rechenwege immer 

nachvollziehbar und vollständig darstellen!) 

Standard für Abbildungen und Tabellen in biochemischen Zeitschriften ist: 

Abbildungen mit selbsterklärender Legende unterhalb des Bildes! 

Tabellen mit Überschrift (evtl erklärender Text oberhalb der Tabelle)! 

• Diskussion: Ergebnisse werden diskutiert unter Verwendung evtl. angegebener Literatur. Es ist 

bei einigen Versuchen auch möglich Ergebnis + Diskussion zusammenzufassen. 

• Verwenden Sie die Deckblätter im Skript! 

• Sie haben eine Möglichkeit zur Korrektur Ihres Protokolls. Wurden die von den Betreuern 

geforderten Korrekturen nicht oder nur mangelhaft durchgeführt, so wird der betreffende 

Versuch nicht gewertet! 

• Jede/r Student/in muss ein Protokoll pro Versuch abgeben. 

Abgabe und Rückgabe der Protokolle 

Abgabe- / Rückgabeort: im Dokumentenfach des Praktikumsraums 

Abgabetermin: spätestens 1 Woche nach dem jeweiligen Versuch. 

Rückgabe durch Betreuer: 1 Woche nach Abgabetermin 

Korrigierte Protokolle: Abgabe spätestens 1 Woche nach Rückgabe des fehlerhaften Protokolls 

beim jeweiligen Betreuer des Versuchs. Rückgabe des korrigierten Protokolls erfolgt spätestens 

1 Woche nach Abgabe. 

Bei Nichteinhaltung der Abgabetermine wird der Versuchstag als ungültig gewertet.

Inhaltsverzeichnis 

Infos zum Praktikum ..................................................................................................... 6 

Allgemeines ............................................................................................................................... 6 

Sicherheitsmaßnahmen und Arbeitsschutz ................................................................................. 7 

Nukleinsäuren I ........................................................................................................... 17 

Deckblatt: Nukleinsäuren I .................................................................................................... 17 

Genetischer Fingerprint: .......................................................................................................... 18 

DNA Isolierung aus Mundschleimhautzellen und anschließende Multiplex-PCR; Prinzip des 

Vaterschaftstests/DNA-Fingerprinting ...................................................................................... 18 

Theorie zu DNA und PCR ..................................................................................................... 18 

1. Isolierung der DNA ........................................................................................................... 20 

2. Multiplex-Polymerase Ketten Reaktion .............................................................................. 23 

1.Analytisches Agarose-Gel zur Überprüfung der PCR ......................................................... 24 

Nukleinsäuren II .......................................................................................................... 26 

Deckblatt: Nukleinsäuren II ................................................................................................... 26 

RNA-Isolierung und Nachweis einer spezifischen mRNA mittels RT-PCR ................................. 27 

Theoretischer Teil................................................................................................................. 27 

1. Isolierung von Gesamt-RNA aus Säugerzellen .................................................................. 29 

2. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der RNA ......................................................... 31 

3. Reverse Transkription der RNA (Erststrangsynthese) ....................................................... 31 

4. Denaturierende Agarosegelelektrophorese von Gesamt-RNA ........................................... 32 

5. DNA-Amplifikation der mRNA-Varianten CLU35 bzw. CLU36 mittels PCR ......................... 34 

6. Anlagen ............................................................................................................................ 35 

Nukleinsäuren III ......................................................................................................... 39 

Deckblatt: Nukleinsäuren III .................................................................................................. 39 

Isolierung eines rekombinanten Plasmids aus E. coli und dessen............................................. 40 

Charakterisierung mittels Restriktionsanalyse .......................................................................... 40 

Theorie zu Plasmiden und Restriktion ................................................................................... 40 

1. Plasmid-DNA-Minipräparation ........................................................................................... 41 

1. Plasmidisolierung: .......................................................................................................... 42 

2. Konzentrationsbestimmung der Plasmidlösung ................................................................. 43 

3. Restriktion des isolierten Plasmids pUC19-gp80-cDNA mit PvuII ...................................... 44 

4. Agarosegelelektrophorese ................................................................................................ 44 

5. Auswertung und Protokoll ................................................................................................. 45 

6. Anlagen ............................................................................................................................ 46 

Proteine I ...................................................................................................................... 52 

Deckblatt: Proteine I ............................................................................................................. 52 

Auftrennung von Milchproteinfraktionen und Kristallisation von Laktose ................................ 54 

Theorie zu Milchproteinen .................................................................................................... 54 

Bestimmung des pH-Werts von Milch.................................................................................... 55 

Fällung von Casein und Molke Proteinen .............................................................................. 55 

Proteine II ..................................................................................................................... 57 

Deckblatt: Proteine II ............................................................................................................ 57 

SDS-PAGE der Milchproteine und Auswiegen der Laktose ....................................................... 58 

SDS-PAGE der Milchproteine ............................................................................................... 58 

Theorie zu SDS-PAGE ......................................................................................................... 58 

Herstellung der Proben ......................................................................................................... 60 

Trocknen und Auswiegen der Laktose .................................................................................. 62 

Kohlenhydrate I ........................................................................................................... 63 

Deckblatt: Kohlehydrate........................................................................................................ 63 

Analyse des Milchzuckers und Färben der SDS-PAGEs ........................................................... 64 

Färben von Phospho- und Gesamt-Proteinen der Milch ........................................................ 64 

Theorie zu Proteinphosphorylierung ..................................................................................... 64 

Analyse des Milchzuckers..................................................................................................... 65 

Enzymkinetik ............................................................................................................... 68 

Deckblatt : Enzymkinetik....................................................................................................... 68 

4

Michaelis-Menten-Kinetik der Alkalischen Phosphatase ........................................................... 69 

Grundlagen zur Michaelis-Menten-Kinetik: ............................................................................ 69 

Enzymatische Reaktion ohne Inhibitor .................................................................................. 71 

Enzymatische Reaktion mit Inhibitor ..................................................................................... 72 

Leitenzyme .................................................................................................................. 78 

Deckblatt: Leitenzyme .......................................................................................................... 78 

Leitenzyme .............................................................................................................................. 79 

a) Aufschluss von Lebergewebe / Fraktionierte Zentrifugation / Aufschluss von Mitochondrien / 

Nachweis von Leitenzymen im Cytosol und Mitochondrien-Plasma ....................................... 79 

b) Glutamat-Dehydrogenase-Test ......................................................................................... 79 

c) Isocitrat-Dehydrogenase-Test ........................................................................................... 80 

d) Lactat-Dehydrogenase-Test ............................................................................................. 80 

Proteasen ..................................................................................................................... 82 

Deckblatt: Protease .............................................................................................................. 82 

Einführung: Proteasen ............................................................................................................. 83 

Experiment: Protease-Verdau von Albumin .............................................................................. 84 

Zellen ............................................................................................................................ 88 

Deckblatt: Zellen .................................................................................................................. 88 

Grundlagen der Zellbiologie ..................................................................................................... 89 

Der Vitalitätsfarbstoff MTT .................................................................................................... 89 

Versuch 1: Herstellung einer Zellsuspension ........................................................................ 91 

Versuch 2: Ermittlung der Zellkonzentration mittels Zählkammer ........................................... 92 

Versuch 3: MTT-Assay zur Bestimmung der Zellvitalität ........................................................ 93 

Versuch 4: Immuncytochemie von Zellen .............................................................................. 94 

Auswertung und Protokoll ..................................................................................................... 95 

Lipide ........................................................................................................................... 96 

Deckblatt: Lipide ................................................................................................................... 96 

Nachweis von Lipiden und Bestimmung des Cholesteringehalts ............................................... 97 

Versuch 1: Lipid-Extraktion (nach 'Bligh and Dyer') ............................................................... 99 

Versuch 2: Bestimmung des Cholesterin-Gehalts in den Lipidextrakten .............................. 101 

Versuch 3: Dünnschicht-Chromatographie der Lipid-Extrakte .............................................. 102 

Die Abbildungen des Deckblattes entstammen folgenden Internet-Seiten: 

www.foodpoisonblog.com; www.theory-of-evolution.net/chap8/dna-1.GIF; 

school.discoveryeducation.com; www.metrohealthresearch.org 

5

Infos zum Praktikum 

Beginn des Praktikums 

13:00, andere Zeiten je nach Absprache 

Allgemeines 

Vorbereitung auf das Praktikum 

Zu jedem Versuchsteil wird ein kurzes Seminar durchgeführt, bei dem wir für Fragen 

zur Verfügung stehen aber gegebenenfalls auch selbst Fragen stellen! 

Wir weisen darauf hin, die Genlaborsicherheitsregeln und die Sicherheitsregeln für 

Chemische Stoff durchzulesen und sich daran zu halten. 

Das Praktikum findet nicht unbedingt in der Reihenfolge der Versuchsnummerierung 

statt! Beachten Sie dazu bitte eventuelle Informationen auf der Homepage! 

Die Teilnahmegebühr ist bis spätestens 2 Wochen nach Praktikumsbeginn mit der 

Studicard (Mensakarte) zu zahlen in der: 

Chemikalienausgabe der Pharmazie (Staudingerweg 5, 1. OG, Raum 01 231). 

Mitzubringen: 

Jeder Teilnehmer bringt seine eigene Packung Handschuhe (Nitril) in passender Größe mit. 

Ausgabeort: Chemikalienlager, Duisbergweg 10-14 (Nebengebäude Neubau Chemie, am 

Tank, dort die Treppe heruntergehen). Ausgabezeiten: Mo-Do 11-12 Uhr und 14-15 Uhr, Fr 

11-12 Uhr. Bezahlung mit der Mensakarte. 

Kittel, Schutzbrille, Edding dick und dünn, USB-Stick 

Bitte denken Sie daran ein kleines Vorhängeschloss für die Spinde mitzubringen! 

Denn: Es gibt viele Diebstähle an der Uni, Wertsachen also einschließen. 

Während des Praktikums 

Führen Sie die Versuche nacheinander und in Ruhe durch. Versuchen Sie nicht, 

mehrere Versuche gleichzeitig zu bearbeiten. 

Halten Sie das Labor sauber, d.h. abends Arbeitsplatz mit vergälltem Ethanol säubern! 

Essen, Trinken und Rucksäcke/Taschen sind im Praktikumsraum nicht erlaubt (Vorschrift 

Gentechnik-Gesetz), deshalb bitte alles in Spinde einschließen. 

Lange Haare bitte nicht offen tragen 

Materialen und Geräte sind z. T. sehr teuer (z.B. Enzyme, Pipetten, PCR-Cycler) bitte 

gehen Sie sorgfältig damit um. 

Korrekte Abfallentsorgung: aller Arten von Abfällen (organisch, ethidiumbromidhaltig, 

biologisch) werden getrennt gesammelt und in die dafür vorgesehenen Abfallbehälter 

gegeben 

Die Arbeitsplatzpipetten nicht an Ethidiumbromid- und Acrylamidarbeitsplatz benutzen, 

es gibt dort extra Etidiumbromid- bzw. Acrylamidpipetten 

Protokolle 

Alle notwendigen Informationen zu Protokollführung und –abgabe finden Sie in den 

Richtlinien zum Praktikum! 

6

Copyright Dienstelle Arbeitsschutz 

____________________________________________________________________________________ 

Sicherheitsmaßnahmen und Arbeitsschutz 

Der Praktikumsraum ist ein Genlabor (gemäß § 9 und § 12 GenTSV, Stand April 2006) 

der Sicherheitsstufe 1 (S1). 

Folgende Sicherheitshinweise sind deshalb zu beachten: 

1. Nach Anweisung des Projektleiters oder dessen Bevollmächtigten sind je nach dem 

Gefährdungspotential geeignete Schutzausrüstung zu tragen und/oder zu benutzen. Je nach 

der gegebenen Gefährdung können dies Schutzkittel, Einmalhandschuhe oder sonstige 

Maßnahmen sein. 

2. Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen dürfen nur in den als gentechnisch 

gekennzeichneten Räumen durchgeführt werden. 

3. Türen und Fenster sollen während der Arbeiten geschlossen sein. 

4. Mundpipettieren ist untersagt, Pipettierhilfen sind zu benutzen. 

5. Spritzen und Kanülen sollen nur wenn unbedingt notwendig benutzt werden. Sie sind 

gesichert (in hierfür bereitgestellten Behältern) zu entsorgen. 

6. Bei allen Arbeiten muss darauf geachtet werden, dass keine vermeidbaren Aerosole 

auftreten. Arbeiten mit verstärkter Aerosolbildung sollten in einer Sicherheitswerkbank oder 

unter einem Abzug, bei denen ein Luftstrom vom Experimentator zur Arbeitsöffnung hin 

gerichtet ist, durchgeführt werden. Die Luft aus diesen Geräten muss durch einen 

Hochleistungsschwebstoff-Filter geführt werden, oder durch ein anderes Verfahren keimfrei 

gemacht werden. 

7. Nach Beendigung der Arbeiten müssen die Hände gewaschen bzw. desinfiziert werden. 

8. Laborräume sollen aufgeräumt und saubergehalten werden. Auf den Arbeitstischen sollen 

nur die tatsächlich benötigten Materialien stehen. Vorräte sollen nur in dafür bereitgestellten 

Räumen oder Schränken gelagert werden. 

9. Nach Beendigung der Arbeiten sind die Organismen sachgerecht aufzubewahren oder in 

geeigneter Weise nach dem Stand der Wissenschaft zu beseitigen. 

10. Die vorschriftsmäßige Ausführung gentechnischer Arbeiten ist zu überwachen. 

11. Verletzungen sind sofort dem zuständigen Vorgesetzten zu melden. 

12. Lebensmittel und Tabakerzeugnisse dürfen nur so aufbewahrt werden, dass sie nicht mit 

gentechnisch veränderten Organismen in Berührung kommen. 

13. In den Arbeitsräumen darf nicht gegessen, getrunken, geraucht oder geschnupft 

werden. 

14. Schutzkleidung ist zu tragen. Getrennte Aufbewahrungsmöglichkeiten für die Schutz- und 

Straßenkleidung sind zu beachten. Die Schutzkleidung ist bei Verlassen des Gen- 

Arbeitsbereiches abzulegen (darf also auch nicht in Toiletten getragen werden). 

Umgang mit chemischen Stoffen nach der Gefahrstoffverordnung 

Im Rahmen dieses Praktikums werden Sie mit Chemikalien unterschiedlicher Gefährlichkeit zu tun 

haben.


_____________________________________________________________________________________ 

Gemäß der Gefahrstoffverordnung werden die einzelnen Arbeitsstoffe mit folgender 

Gefahrenbezeichnung gekennzeichnet: 

E Explosionsgefährlich T+ Sehr giftig 

O Brandfördernd T Giftig 

F+ Hochentzündlich Xn Gesundheitsschädlich 

F Leichtentzündlich Xi Reizend 

C Ätzend 

Zusätzlich gibt die Gefahrstoffverordnung für die einzelnen Arbeitsstoffe Gefahrenhinweise (R-Sätze) 

und Sicherheitsratschläge (S-Sätze). Die Bedeutung dieser Sätze wird auf den folgenden Seiten 

erläutert. 

Im Anhang finden Sie außerdem die Angaben zu den relevanten Gefahrstoffen und die 

Betriebsanweisungen. 

Liste der Gefahrstoffe 

Stoff 

Gefahrenbezeichnung 

R-Sätze 

S-Sätze 

2-Mercaptoethanol T, N 22-23/24-34-51/53 26-36/37/39-45-61 

Aceton F, Xi 11-36-66-67 9-16-23-33 

Acrylamid 

T 

45-46-48-23/24/25- 

20/21 

53-45 

Ameisensäure C 10-35 23-26-45 

Ampicillin Xn 36/37/38-42/43 22-26-36/37 

Chloroform Xn 22-38-40-48/20/22 36/37 

Dimethylformamid Xn 20-21/36 26-28-36 

Essigsäure C 10-35 23-26-45 

Ethanol F 11 7-16 

Ethidiumbromid T + 22-26-36/37/38-40 26-28-36/37-45 

Formaldehyd T 

23/24/25-34- 

39/23/24/25-40-43 

26-36/37/39-45-51 

Formamid T 61 53-45 

HCl, rauchend, 37% C 34-37 26-36/37/39-45 

Isoamylalkohol Xn 10-20 24/25 

Isopropanol F 11 7-16 

Methanol T, F 11-23/25 7-16-24-45 

NaOH C 35 26-37/39-45 

Phenol T, C 24/25-34 28-45 

TEMED F,C 11-20/22-34 16-26-36/37/39-45 

Tris Xi 36/38 

8


____________________________________________________________________________ 

i. R- und S-Sätze 

Hinweise auf die besonderen Gefahren (R- 

Sätze) 

Sicherheitsratschläge (S-Sätze) 

R 9 

Explosionsgefahr bei Mischung mit 

brennbaren Stoffen 

S 2 Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen 

R 10 Entzündlich S 7 Behälter dicht geschlossen halten 

R 11 Leichtentzündlich S 9 

Behälter an einem gut gelüfteten Ort 

aufbewahren 

R 12 Hochentzündlich S 13 

Von Nahrungsmitteln, Getränken und 

Futtermitteln fernhalten 

R 19 Kann explosionsfähige Peroxide bilden S 16 

Von Zündquellen fernhalten 

Nicht rauchen 

R 20 Gesundheitsschädlich beim Einatmen S 22 Staub nicht einatmen 

R 22 

Gesundheitsschädlich beim 

Verschlucken 

S 23 Gas/Rauch/Aerosol nicht einatmen 

R 23 Giftig beim Einatmen S 24 Berührung mit der Haut vermeiden 

R 26 Sehr giftig beim Einatmen S 25 Berührung mit den Augen vermeiden 

R 29 

Entwickelt bei Berührung mit Wasser 

Bei Berührung mit den Augen gründlich mit 

S 26 

giftige Gase 

Wasser abspülen und Arzt konsultieren 

R 34 Verursacht Verätzungen S 27 

Beschmutzte, getränkte Kleidung sofort 

ausziehen 

R 35 Verursacht schwere Verätzungen S 28 

Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel 

Roticlean E und anschließend mit viel Wasser 

abwaschen. Hautschutzsalbe. 

R 36 Reizt die Augen S 29 Nicht in die Kanalisation gelangen lassen 

R 37 Reizt die Atmungsorgane S 33 

Maßnahmen gegen elektrostatische 

Aufladungen treffen 

R 38 Reizt die Haut S 36 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen 

R 40 Verdacht auf krebserzeugende Wirkung S 39 Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen 

Sensibilisierung durch Hautkontakt 

R 43 

möglich 

S 44 Bei Unwohlsein ärztliche Rat einholen 

R 45 Kann Krebs erzeugen S 45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen 

R 47 Kann Mißbildungen verursachen S 53 

Exposition vermeiden 

Vor Gebrauch besondere Anweisung einholen 

R 48 

Freisetzung in die Umwelt vermeiden. 

Gefahr ernster Gesundheitsschäden bei 

S 61 Besondere Anweisungen einholen / 

längerer Exposition 

Sicherheitsdatenblatt zu Rate ziehen 

R 50 Sehr giftig für Wasserorganismen 

R 61 Kann das Kind im Mutterleib schädigen


_________________________________________________________________________________________ 

Kombination der R-Sätze 

Gesundheitsschädlich beim Einatmen 

R 20/22 

und Verschlucken 

Gesundheitsschädlich beim 

R 20/21/22 Einatmen, Verschlucken und bei 

Berührung mit der Haut 

Gesundheitsschädlich bei Berührung 

R 21/36 

der Haut und der Augen 

Giftig beim Einatmen und bei 

R 23/24 

Berührung mit der Haut 

Giftig beim Einatmen und 

R 23/25 

Verschlucken 

Giftig beim Einatmen, Verschlucken 

R 23/24/25 

und bei Berührung mit der Haut 

Giftig bei Berührung mit der Haut und 

R 24/25 

beim Verschlucken 

Sehr giftig beim Einatmen, 

R 26/27/28 Verschlucken und bei Berührung mit 

der Haut 

R 36/38 Reizt die Augen und die Haut 

Reizt die Augen, die Atmungsorgane 

R 36/37/38 

und die Haut 

Sensibilisierung durch Einatmen und 

R 42/43 

Hautkontakt möglich 

Gesundheitsschädlich: Gefahr ernster 

Gesundheitsschäden bei längerer 

R 48/20/22 

Exposition durch Einatmen und 

Verschlucken. 

Kombination der S-Sätze 

Berührung mit den Augen und der 

S 24/25 

Haut vermeiden 

Bei der Arbeit geeignete 

S 36/37 Schutzhandschuhe und 

Schutzkleidung tragen 


Schutzkleidung, Schutzhandschuhe 

S 36/37/39 

und Schutz-brille/Gesichtsschutz 

tragen 


S 37/39 Schutzhandschuhe und 

Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen 

10


_________________________________________________________________________________________ 

Ethididiumbromid 

Nummer 

C 023 

BETRIEBSANWEISUNG 

gemäß GefStoffV 

Stand: 

20.09.2006 

GEFAHRSTOFFBEZEICHNUNG 

Ethidiumbromid Lösungen 

Homidiumbromid, CAS: 1239-45-8 

GEFAHREN FÜR MENSCH UND UMWELT 

Gesundheitsschädlich beim Verschlucken. Sehr giftig beim 

Einatmen. Reizt die Augen, Atmungsorgane und die Haut. 

T+ Sehr giftig Irreversibler Schaden möglich. Im Brandfall Enststehung 

gefährlicher Brandgase (NO x , Br 2 , HBr) oder Dämpfe möglich. 

SCHUTZMASSNAHMEN UND VERHALTENSREGELN 

Handhabung: Nur mit gebrauchsfertiger Ethidiumbromidlösung 

arbeiten. Unter Abzug arbeiten. Nicht mit Ethidiumbromid in 

Pulverform hantieren. Auf größte Sauberkeit am Arbeitsplatz 

achten. Kontaminationen sofort beseitigen. 

Von Oxidationsmitteln fernhalten und vor starker Erhitzung 

schützen. Bei Nichtbeachtung ist die Entstehung gefährlicher Gase 

möglich. 

Lagerung: Dicht verschlossen, an gut belüftetem Ort. Nur für 

Fachkundige zugänglich. Trocken. Bei + 5°C bis + 30°C. 

Schutzhandschuhe: Während des Arbeitsvorganges Dermatril 

Einmalschutzhandschuhe (Schutzlevel 6) tragen. Keinesfalls 

Latexhandschuhe tragen! Durch Latexhandschuhe diffundiert 

Ethidiumbromid hindurch. 

VERHALTEN IM GEFAHRFALL 

Gefährdete Personen warnen, gefährdeten Bereich gegebenenfalls räumen und absperren. Der 

Zutritt Unbefugter ist zu verhindern. Kontaminationen auf Gegenständen oder auf der Haut lassen 

sich unter der UV-Handlampe ( 366 nm) gut sichtbar machen (fluoreszieren rosa 

orange).Kontaminationen: Bei der Beseitigung des gefährlichen Zustandes sind mindestens 

Schutzbrille, Schutzhandschuhe aus Dermatril zu tragen. Lösungen mit Flüssigkeitsbinder 

Chemizorb aufnehmen. Verwendete Reinigungsgeräte und benetzte Flächen danach mit viel 

Wasser spülen. Feuerwehr: 0-112 Rettungsleitstelle: 0-19222 Polizei: 0-110 Giftinfo: 0-19240 

ERSTE HILFE 

Allgemein: Bei ärztlicher Behandlung: Betriebsanweisung oder 

Sicherheitsdatenblatt mitgeben. 

Nach Hautkontakt: Mit reichlich Wasser und Seife abwaschen. Kontaminierte 

Kleidung entfernen. 

Nach Augenkontakt: Mit reichlich Wasser bei geöffnetem Lidspalt ausspülen. 

Augenarzt hinzuziehen. 

Nach Einatmen: Frischluft. Sofort Arzt hinzuziehen – Giftinformation. 

11


_________________________________________________________________________________________ 

Bei Atemstillstand: Sofort Gerätebeatmung, ggf. Sauerstoffzufuhr. Sofort Arzt 

hinzuziehen. 

Nach Verschlucken: Sofort viel Wasser trinken lassen. Arzt hinzuziehen. 

SACHGERECHTE ENTSORGUNG 

Flüssigkeit: Benutzte Ethidiumbromidlösung in einem Vorratsgefäß vorlegen 

und über den Ethidiumbromid-Adsorber laufen lassen. Das dekontaminierte 

Filtrat kann gefahrlos weggegossen werden. Die verbrauchte Kartusche in 30- 

Liter Weithalsfässer verpacken. Abfallschlüsselnummer: 150202, UN 3243, 

6.1/T9 ADR. 

Achtung : Bei Nutzung des Ethdiumbromid-Adsorbers muss sichergestellt sein, 

dass die Beladung der Aktivkohle nicht über die Sättigung hinaus geht. Bitte auf 

Herstellerangaben achten und ggf. über die Konzentration der 

Ethidiumbromidlösung die Beladung der Aktivkohle berechnen. Falls keine 

Adsorptionsmöglichkeit vorhanden ist, Ethidiumbromidlösung in fest 

schließbare Behältnisse (z.B. 2 Liter Braunglasflaschen) abfüllen und in 30 

Liter- oder 60 Liter-Fässer verpacken. 

Abfallschlüssennummer: 160508; UN 2810, 6.1/T1 ADR. 

Gel: In verschnürten Plastiktüten in 30 Liter- oder 60 Liter-Fässer verpacken. 

Abfallschlüssel: 160508, UN 2811, 6.1/T2 ADR 

Weitere Informationen 

Beschäftigungsbeschränkungen für werdende und stillende Mütter 

nach §§ 4 und 5 MuSchRiV beachten. 


Für feste Stoffe, Gele oder Lösungen gilt: Verpackung der Abfälle in dichten 

Kleinbehältern, die dann anschließend in 30 Liter Weithalsfässer gestellt bzw. gepackt 

werden. UN 2074 ADR 6.1/T 2 Abfallschlüssel: 160508 


Sicherheitsdatenblatt der Fa. Merck. Merkblatt BG Chemie: M 004 Reizende Stoffe/Ätzende Stoffe. 

M050 Umgang mit gesundheitsgefährlichen Stofffen.Beschäftigungsbeschränkungen für werdende 

und stillende Mütter nach §§ 4 und 5 MuSchRiV beachten. Nach der Gefahrstoffverordnung 

können Sie bei Tätigkeiten mit Arcylamid (krebserzeugend, Cat.2 ) eine arbeitsmedizinische 

Vorsorgeuntersuchung in Anspruch nehmen. Weitere Informationen: Betriebsarzt, Telefon 17-2233. 

12


_________________________________________________________________________________________ 

Ethanol 

Nummer BETRIEBSANWEISUNG 

C 008 gemäß GefStoffV 


Ethanol 

Ethylalkohol, CAS 64-17-5 


F Leicht 

entzündlic 

h 

Stand: 

22.06.2005 

Leichtentzündlich. Nach Einatmen von Dämpfen: leichte Schleimhautreizungen. Gefahr 

der Resorption. Nach Hautkontakt: Exposition über längere Zeit: Dermatitis. Brennbar. 

Dämpfe schwerer als Luft. Mit Luft Bildung explosionsfähiger Gemische bei 

Normaltemperatur möglich. Im Brandfall: Entstehung gefährlicher Brandgase oder 

Dämpfe möglich. Bei sachgemäßer Handhabung und Verwendung sind keine 

ökologischen Probleme zu erwarten. 


Handhabung: Von Zündquellen fernhalten. Nicht rauchen. Maßnahmen 

gegen elektrostatische Aufladungen treffen. Dämpfe/Aerosole nicht 

einatmen. In geschlossenen Räumen für Frischluft sorgen. 

Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. 

Lagerung: Dicht verschlossen. An gut belüftetem Ort. Von Zünd- und 

Wärmequellen entfernt. Nicht in der Nähe von brennbaren Stoffen. 

Lagertemperatur: ohne Einschränkungen. 

Schutzhandschuhe: Bei Vollkontakt: Butylkautschuk (bspw. Butoject®) bei 

Spritzkontakt: Nitrilkautschuk (bspw. Camapren 720). 


Bei Auslaufen: Mit flüssigkeitsbindendem Material aufnehmen (zum Beispiel Vermicullit). Nicht in 

die Kanalisation/Oberflächenwasser/Grundwasser gelangen lassen. Explosionsgefahr. Im 

Brandfall: Behälter aus sicherer Entfernung mit Sprühwasser kühlen. Entweichende Dämpfe mit 

Wasser niederschlagen. Eindringen von Löschwasser in Oberflächengewässer oder Grundwasser 

vermeiden. Von Zündquellen fernhalten. 

Geeignete Löschmittel: Schaum.CO 2 . Löschpulver. 

Feuerwehr: 0-112 Rettungsleitstelle: 0-19222 Polizei: 0-110 Giftinformation 0-19240 

ERSTE HILFE 

Allgemein: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich dieses Etikett vorzeigen). 

Nach Hautkontakt: Mit reichlich Wasser abwaschen. 

Nach Kleidungskontakt: Beschmutzte, getränkte Kleidung sofort ausziehen. 

Nach Augenkontakt: Mit reichlich Wasser bei geöffnetem Lidspalt ausspülen (mindestens 10 Minuten). 

Nach Einatmen: Verunglückten aus der Gefahrenzone bringen. Frischluft. 

Nach Verschlucken: Viel Wasser trinken lassen. Arzt hinzuziehen. 


Abfüllen in 10 Liter Stapelkanister. 

UN 2929 ADR 6.1/26b EAK: 070703 


Merkblatt BG Chemie: M017 „Lösemittel“, M051 „Gefährliche chemische Stoffe“. 

Sicherheitsdatenblatt der Firma: Merck. Artikelnummer: 100983. 

13


_________________________________________________________________________________________ 

Formaldehydlösung 


C 106 gemäß §14 GefStoffV 


Formaldehydlösung, 37 % 

Formalin, (stabilisiert mit ca. 10% Methanol) 


Giftig beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut. 

Verursacht Verätzungen. Giftig: ernste Gefahr irreversiblen Schadens durch 

Einatmen, Berührung mit der Haut und durch Verschlucken. Verdacht auf 

T Giftig krebserzeugende Wirkung. Sensibilisierung durch Hautkontakt möglich. 

Explosionsfähige Gemische mit Luft schon bei Normaltemperaturen 

möglich. 


Handhabung: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe 

und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen. Nur in gut gelüfteten Bereichen 

verwenden. Dämpfe/Aerosole nicht einatmen. Arbeiten unter Abzug 

vornehmen. 

Lagerung: Dicht verschlossen, an gut belüftetem Ort. Nur für Fachkundige 

zugänglich. Bei +15 °C bis +25 °C. 

Schutzhandschuhe: bspw. Camatril oder Butoject (beide Fa. KCL). 

Stand: 

01.12.2004 


Bei unbeabsichtigter Freisetzung: Nicht einatmen. Für Frischluft sorgen. Mit 

flüssigkeitsbindendem Material aufnehmen. Nachreinigen. 

Unschädlichmachen: Behandelung mit überschüssiger Natriumhydrogensulfitlösung. 

Im Brandfall: Formaldehyd Dämpfe sind brennbar. 

Geeignete Löschmittel: Pulver. Schaum. 

Feuerwehr: 0-112 Rettungsleitstelle: 0-19222 Polizei: 0-110 Giftinfo: 0-19240 

ERSTE HILFE 

Allgemein: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich dieses 

Dokument vorzeigen). 

Nach Hautkontakt: Mit reichlich Wasser abwaschen. Kontaminierte Kleidung entfernen. 



Nach Einatmen: Frischluft. 

Nach Verschlucken: Viel Wasser trinken lassen. Nachgabe von Aktivkohle (20 -40 g in 

10% iger Aufschwemmung). Sofort Arzt hinzuziehen. Giftinformation anrufen. 


Abfüllen in 25-Liter Vierkantbehälter. 

UN 2209 ADR 8/C9 EAK: 060106 


Sicherheitsdatenblatt der Fa. Merck. Artikelnummer: 818708. 

14


_________________________________________________________________________________________ 

Formamid 


C 072 gemäß §14 GefStoffV 


Formamid 

Ameisensäureamid, CAS 75-12-7 


Giftig. Kann das Kind im Mutterleib schädigen. Gefahr der Hautresorption. In 

dampf-/gasförmigen Zustand mit Luft explosionsfähig. Dämpfe schwerer als 

T Giftig Luft. Hygroskopisch. Wassergefährdungsklasse -schwach 

wassergefährdend. 


Handhabung: In Laboratorien unter Abzug arbeiten. Substanzkontakt und 

Exposition vermeiden. Dämpfe/Aerosole nicht einatmen.. 

Lagerung: Dicht verschlossen. Trocken. An gut belüftetem Ort. Unter 

Lichtschutz. Vor Feuchtigkeit schützen. Bei +15 °C bis +25 °C. Nur für 

Sachkundige zugänglich. 

Schutzhandschuhe: Bei gelegentlichem Kontakt (Spritzer): Dermatril, 

Hersteller KCL. 

Stand: 

18.05.2005 


Brennbar. Dämpfe schwerer als Luft. Bei starker Erhitzung sind explosionsfähige Gemische mit Luft 

möglich. Im Brandfall: Entstehung gefährlicher Brandgase oder Dämpfe möglich. Im Brandfall 

können entstehen: Stickstoffoxide, Cyanwasserstoff. 

Geeignete Löschmittel: Wasser. Schaum. Löschpulver. 

Feuerwehr: 0-112 Rettungsleitstelle: 0-19222 Polizei: 0-110 Giftinfo: 0-19240 

ERSTE HILFE 

Allgemein: Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich dieses 

Etikett vorzeigen). 

Nach Hautkontakt: Mit reichlich Wasser abwaschen. 

Nach Kleidungskontakt: Kontaminierte Kleidung entfernen. 

Nach Augenkontakt: Mit reichlich Wasser bei geöffnetem Lidspalt ausspülen 

(mindestens 10 Minuten). Augenarzt hinzuziehen. 

Nach Einatmen: Frischluft. Bei Unwohlsein: Arzt hinzuziehen. 

Nach Verschlucken: Viel Wasser trinken lassen. Kein Erbrechen auslösen. 

Giftinformation anrufen. 


Originalgebinde in 30-Liter Weithalsbehälter verpacken. Bei Rückfragen: Dienststelle 

Umweltschutz, Telefon 39-24142. Kein Gefahrgut. Abfallschlüssel: 160508 


Sicherheitsdatenblatt der Firma Merck; Artikelnummer 822279. Merkblätter der BG-Chemie: M017 

"Lösemittel, M039 "Fruchtschädigung - Schutz am Arbeitsplatz" , M053 "Allgemeine 

Arbeitsschutzmaßnahmen für den Umgang mit Gefahrstoffen" Beschäftigungsbeschränkungen für 

werdende und stillende Mütter beachten. 

15


_________________________________________________________________________________________ 

Propanol 


C 011 gemäß GefStoffV 


2-Propanol 

Isopropylalkohol, Isopropanol, CAS-Nummer: 67-63-0 


Xi 

Reizend 

Leichtentzündlich. Reizt die Augen. Dämpfe können Schläfrigkeit und 

Benommenheit verursachen. Brennbar. Dämpfe schwerer als Luft. Mit Luft 

Bildung explosionsfähiger Gemische bei Normaltemperatur möglich. Im 

Brandfall Entstehung gefährlicher Brandgase oder Dämpfe möglich. 

Stand: 

16.03.2006 

F Leicht 

enzündlic 

h 


Handhabung: Maßnahmen gegen elektrostatische Aufladung treffen. Von 

Zündquellen fernhalten. Entwicklung von Dämpfen und Aerosolen 

vermeiden. Arbeiten unter dem Abzug vornehmen. Stoff nicht einatmen. 

Substanzkontakt vermeiden. 

Lagerung: Dicht verschlossen, an gut belüftetem Ort, entfernt von Zündund 

Wärmequellen. Bei + 5 °C bis +30 °C. 

Lagerbehälter: keine Leichtmetallbehälter benutzen. 

Schutzhandschuh: bei Vollkontakt Nitrilkautschuk (bspw. Camatril der 

Fa. KCL). 


Bei Auslaufen mit flüssigkeitsbindendem Material aufnehmen und der Entsorgung zuführen. Nicht 

in Kanalisation gelangen lassen. Explosionsgefahr. 

Im Brandfall Behälter aus brandgefährdetem Bereich entfernen oder durch Besprühen mit Wasser 

kühlen. Maßnahmen gegen elektrostatische Aufladung treffen. 

Geeignete Löschmittel: Pulver, Schaum. 

Feuerwehr: 0-112 Rettungsleitstelle: 0-19222 Polizei: 0-110 Giftinformation 0-19240 

ERSTE HILFE 

Nach Hautkontakt: Mit reichlich Wasser abwaschen. Kontaminierte Kleidung entfernen. 



Nach Einatmen: Frischluft. Bei Unwohlsein Arzt hinzuziehen. 

Nach Verschlucken: Viel Wasser trinken lassen. Erbrechen vermeiden 

(Aspirationsgefahr!). Bei spontanem Erbrechen: Gefahr der Aspiration. Lungenversagen 

möglich. Arzt hinzuziehen. 


Abfüllen in 10 Liter Stapelkanister. Rücksprache mit Dienststelle Umweltschutz, Telefon 

39-24142 halten. UN 2929 ADR 6.1/26b Abfallschlüssel: 070703 


Merkblatt BG Chemie: M017 „Lösemittel“, M 004 „Reizende Stoffe/Ätzende Stoffe“, M050 „Umgang 

mit gesundheitsgefährlichen Stoffen“. Sicherheitsdatenblatt der Fa. Merck, Artikelnummer 818766, 

vom 13.02.2004. In der TRGS 900 genannt mit 200 ml/m 3 . 

16

Versuch: Nukleinsäuren I- Genetischer Fingerprint - 

____________________________________________________________________________ 

Nukleinsäuren I 

Deckblatt: Nukleinsäuren I 

Versuch GP Nukleinsäuren I 

Genetischer Fingerprint 

Protokollant/in: ................................................. 

E-mail: ................................................. 

Gruppenmitglieder: ................................................. 

Gruppen-Nr.: 

... Semester(WS/SS):……Jahr:… 

Studiengang: ................................................. 

Betreuer: 

Dr. M. Baiersdörfer, C. Weindel 

Nur vom Betreuer auszufüllen: 

Bemerkung: .......................................... 

Unterschrift des Betreuers: ..........................................


_________________________________________________________________________________________ 

Versuch: Nukleinsäuren I 

1. Versuch Nukleinsäuren I 

Genetischer Fingerprint: 

DNA Isolierung aus Mundschleimhautzellen und anschließende Multiplex-PCR; Prinzip 

des Vaterschaftstests/DNA-Fingerprinting 

Betreuung: Dr. Markus Baiersdörfer, Christina Weindel 

Literatur: Knippers 

Theorie zu DNA und PCR 

Das Erbgut jedes Menschen ist einzigartig. Es ist eine immer wieder neue Mischung aus 

Erbinformationen, die zur Hälfte vom biologischen Vater und zur Hälfte von der 

biologischen Mutter stammen. In Form von DNA werden diese Informationen im Kern einer 

jeden Körperzelle gespeichert. Aus einigen Blut- oder Mundschleimhautzellen kann diese 

DNA isoliert werden, und mit Hilfe eines biochemischen Verfahrens, der 

Polymerasekettenreaktion (PCR), können bestimmte, sehr variationsreiche Bereiche 

(STR, short tandem Repeats) der DNA vermehrt und sichtbar gemacht werden. 

Das DNA-Muster, das man so erhält, bezeichnet man als „genetischen Fingerabdruck“. 

Dieser ist, da das Erbgut eines jeden Menschen unterschiedlich ist, auch bei jedem 

Menschen somit unterschiedlich. Vergleicht man die genetischen Fingerabdrücke von 

Vater, Mutter und Kind, so findet man beim Kind exakt die Hälfte der väterlichen DNA- 

Merkmale, während die andere Hälfte mit den mütterlichen Merkmalen übereinstimmt. So 

lässt sich im Allgemeinen mit einer Sicherheit von mehr als 99,99% sagen, ob ein Kind 

das Kind bestimmter Eltern ist. 

Der Nachweis oder Ausschluss einer genetischen Verwandtschaft erfolgt in der Praxis 

durch die Analyse von zehn verschiedenen genetischen Merkmalen in einer so genannten 

Multiplex-PCR, einem Verfahren, bei dem mehrere verschiedene hypervariable DNA- 

Abschnitte gleichzeitig in einem Reaktionsgefäß durch die PCR vervielfältigt werden. Die 

elektrophoretische Auftrennung dieser Reaktion findet in einer speziellen, an einen 

Computer gekoppelten, Kapillar-Elektrophorese statt. 

Aufgrund der hohen Variabilität der untersuchten Merkmalsysteme findet man bei 

Menschen unterschiedlich lange DNA-Abschnitte eines Merkmalsystems, eines von der 

Mutter und eines vom Vater. Erbt man von beiden Eltern einen gleichlangen 

hypervariablen DNA-Abschnitt, wird die betreffende Person als homozygot für dieses 

Merkmal bezeichnet. Das individuelle Muster der verschiedenen Allele in den 

verschiedenen Merkmalsystemen wird auch als genetischer Fingerabdruck bezeichnet. 

Der genetische Fingerabdruck eines Kindes stimmt in jedem Merkmalsystem in einem 

Allel mit dem des Vaters und in dem anderen Allel mit der Mutter überein. In Abhängigkeit 

von der Häufigkeit eines bestimmten Allels in der Bevölkerung lässt sich mittels 

biostatistischer Methoden die Wahrscheinlichkeit einer Vaterschaft berechnen. In unserem 

Versuch werden drei DNA-Bereiche auf Homo- oder Heterozygotie und Größe untersucht. 

Polymerase Ketten Reaktion 

In den letzten Jahren ist die unter dem Namen Polymerase Ketten Reaktion (PCR) zu 

einer Standard Labormethode geworden. Die PCR ist eine enzymatische Kettenreaktion, 

die Nukleinsäuren in theoretisch unbegrenzter Menge amplifizieren kann. Darüber hinaus 

besitzt die PCR eine sehr hohe Empfindlichkeit zum Nachweis für spezifische DNA- 

Sequenzen. Das Revolutionierende an der PCR sind die große Zeitersparnis und die 

relativ einfache Handhabung der Technik gegenüber herkömmlichen 

molekularbiologischen Methoden. 

Das Prinzip der PCR beruht auf der exponentiellen Vermehrung eines oder mehrerer 

DNA-Stücke. So werden aus einem Ausgangsstück erst 2 Stücke, dann 4, dann 8, 16, 32, 

18


_________________________________________________________________________________________ 

64 usw. Allgemein ausgedrückt steigt die Zahl der Moleküle nach der Formel 2 n , wobei n 

die Anzahl der Reaktionszyklen darstellt. Nach 30 Zyklen erhält man demnach theoretisch 

eine Vermehrung um den Faktor 10 9 . Eine PCR-Reaktion enthält eine kleine Menge DNA, 

DNA-Startermoleküle (Primer = chemisch synthetisiertes Oligonukleotid), die 

Desoxyribonucleosid-triphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP, eine DNA-abhängige 

DNA-Polymerase sowie den Reaktionspuffer. Jeder Reaktionszyklus besteht aus drei 

Teilschritten: a) Denaturierung der DNA (94°C), b)Anlagerung der Startermoleküle 

(Annealing, 50°C-6O°C) und c) Synthese eines DNA-Doppelstranges (72°C). Während 

dieser Reaktionsfolge lagern sich die Starter an der zu ihrer Sequenz komplementären 

Basenfolge der Matrize (DNA) an, und der DNA-Abschnitt zwischen den Startern wird 

gezielt aus der Gesamtheit aller vorhandenen DNA-Moleküle amplifiziert. Die folgende 

Abbildung veranschaulicht dies. 

19


_________________________________________________________________________________________ 

1. Isolierung der DNA 

1. Versuchstag 

Material: 

Wattestäbchen mit Mundschleimhautabstrich 

Puffer LPT mit Protease (Lysepuffer) 

Ethanol (96-100%) 

Puffer BP (Bindepuffer) 

Puffer WP (Waschpuffer, auswaschen von Proteinen und unspezifisch gebundenen 

Stoffen) 

Peqlab Spin Säule zur DNA-Aufreinigung und Auffangröhrchen 

Wasserbad (50°C) 

Wasserbad (70°C) 

Sterile gelbe und blaue Spitzen (bitte immer eine neue sterile Spitze verwenden) 

sterile 1,5 und 2,0 ml Eppis 

Schere (mit Ethanol säubern) 

ACHTUNG! BEI GENTECHNISCHEN ARBEITEN MÜSSEN ALLE ABFÄLLE GESAMMELT 

(PLASTIKBEUTEL) UND VERNICHTET WERDEN! 

Durchführung: 

BITTE ZUERST LESEN UND DANN ARBEITEN ODER FRAGEN 

BITTE ALLE DURCHGEFÜHRTEN SCHRITTE ABHAKEN! 

‣ Ihr bekommt ein Eppi ausgeteilt, in dem sich 400µl LPT-Puffer und 20µl Protease 

befinden, bitte zuerst mit eurem Namen beschriften (auf Deckel) 

‣ Ethanol (aus der grünen Spritzflasche) auf Kleenex geben und damit die Klingen 

der Schere abwischen 

‣ Anschließend mit Handschuhen das Wattestäbchen aus dem sterilen 

Greinerröhrchen nehmen und ca. 5-10x rechts und links im Mund über die Backe 

rubbeln 

‣ Das Wattestäbchen mit dem Mundschleimhautabstrich in das im Eppiständer 

stehende Eppi mit dem LP-Puffer halten und der Stiel ca. 1cm über dem Watteteil 

mit der Schere abschneiden, und zwar so, dass der Wattebausch in die Flüssigkeit 

fällt und man das Eppi zumachen kann 

‣ 15 min. bei 50°C (Temperaturoptimum der Proteinase) im Wasserbad inkubieren, 

alle 5min kurz vortexen 

‣ Mit der Hand (Handschuhe anziehen!)) eine sterile gelbe Pipettenspitze (ohne 

Pipette) aus dem Pipettenspitzenkästchen nehmen, die Pipettenspitze in den 

hohlen Stiel des Wattestäbchens stecken (bitte fest reindrücken), Pipettenspitze 

mit dem Wattestächen vorsichtig an der Seite des Eppis ausdrücken und 

abstreichen, so dass möglichst viel Flüssigkeit, die eure DNA enthält, im Eppi 

bleibt! 

(Man kann die Wattestäbchen am besten handhaben, indem man eine sterile 

gelbe Pipettenspitze in den Rest des hohlen Plastikstäbchens steckt. (Achtung 

Sterilität) 

‣ danach Spitze mit Wattestäbchen wegwerfen 

‣ 200 µl BP-Puffer (Binde-Puffer) zu eurer DNA-Lösung zugeben, vortexen zum 

Mischen, 

20


_________________________________________________________________________________________ 

‣ Peqlab-Spinsäule bereitstellen und beschriften mit Namen (Achtung: sie besteht 

aus 2 Teilen, der Säule und dem Auffanggefäß, in dem die Säule drinsitzt). 

‣ DNA-Bindung: die gesamte DNA-Lösung (650µl) vorsichtig (ohne den oberen 

Rand zu benetzen und ohne das Säulenmaterial zu beschädigen) in die Spin-Säule 

pipettieren (Pipette auf 700µl stellen und alles aufziehen). 

‣ Deckel verschließen und 1 min bei 10.000 rpm zentrifugieren. 

‣ Säule vorsichtig herausnehmen und das Filtrat oder Durchfluss (also das was 

unten aus der Säule rauskommt) im Auffanggefäß in den Abfallbehälter schütten 

und die Säule erneut in das entleerte Auffanggefäß einsetzen. 

‣ DNA-Waschen: 650 µl WP (Waschpuffer) vorsichtig auf die Säule geben, für 1 min 

bei 10.000rpm zentrifugieren 

‣ das Filtrat verwerfen und die Säule wieder in das Eppi setzen 

‣ Waschschritt noch einmal wiederholen. 

‣ Trocken zentrifugieren: Auffanggefäß wieder entleeren und noch mal 2 min bei 

13.000 rpm zentrifugieren (damit die Säule ganz trocken ist). In dieser Zeit ein 

neues, steriles 1,5ml Eppi holen, den Deckel abschneiden und auf ein Kleenex 

Tuch legen (Deckel wird später wieder gebraucht). 

‣ altes Auffanggefäß verwerfen und die Säule in das neue sterile 1,5 ml Eppi (ohne 

Deckel) setzen, und vorsichtig 60µl steriles, auf ca. 70°C vorgewärmtes ddH 2 O 

zugeben (das Wasser steht im 70°C Wasserbad) und dann für 3 min bei 

Raumtemperatur inkubieren (Während der 3 Minuten bitte Eis holen im 

Styroporbehälter) 

‣ Anschließend für 1 min bei 10.000 rpm zentrifugieren. 

‣ ACHTUNG: DAS FILTRAT ENTHÄLLT JETZT DIE DNA ! 

‣ Säule rausnehmen und verwerfen und den Deckel drauf machen; das 1,5ml Eppi 

enthält jetzt das Eluat (= saubere DNA) 

‣ Bitte beschriften und auf Eis stellen 

‣ Damit die PCR-Reaktion ansetzen (siehe Punkt 2. Multiplex-PCR) 

21


_________________________________________________________________________________________ 

DNA-Isolierung aus Mundschleimhaut-Zellen 

(Schema) 

400µl TL-Puffer 

20µl Proteinase K 

1. 

Wattestäbchen im Eppi 

abschneiden, Eppi 

schließen 

2. Zelllyse 

Eppi in 50°C Wasserbad 

15 min inkubieren (Zelllyse), 

alle 5 min kurz vortexen 

3. 

Gelbe Pipettenspitze sehr fest in 

Wattestäbchenröhre stecken und 

DNA-Flüssigkeit in Eppi abstreifen 

10000rpm 

+ 200µl BL- 

Puffer 

4. DNA-Bindung 5. Beladen der 

Säule 

Zugabe von 200µl Binde- 

Puffer, vortexen. Verändert 

pH, Salz-konzentrationen 

zur DNA-Bindung an Säule 

Die ca. 650µl der DNA –Lösung auf die 

Säule geben, 1min bei 10.000 rpm 

zentrifugieren. 

10000rpm 

10000rpm 

13000rpm 

+ 650µl Waschpuffer + 650µl Waschpuffer 

Essentieller Schritt! 

6. DNA waschen 7. DNA waschen 8. Trocknen 

650µl Waschpuffer auf die 

Säule geben, 1min 10.000rpm 

zentrifugieren, Durchfluss 

verwerfen 

Nochmals 650µl Waschpuffer auf 

die Säule geben, 1min 10.000rpm 

zentrifugieren, Durchfluss verwerfen 

zentrifug. 

Wichtig: Leere Säule in geleertes 

Auffanggefäß stecken und 2 min bei 13000 

rpm trocken zentrifugieren, Danach 

Auffanggefäß verwerfen, Säule mit DNA 

behalten. 

10000rpm 

Achtung: Im 

Durchfluss ist 

die DNA, 

Durchfluss 

nicht 

verwerfen! 

9. DNA-Elution 10. 11. PCR 

Neues 1,5ml Eppi nehmen und die 

Säule mit der DNA einstecken.60µl 

Wasser (70°C warm) auf die Säule 

pipettieren. 3 min bei Raum- 

Temperatur inkubieren. 1min bei 

10.000rpm zentrifugieren 

Anschließend Säule verwerfen 

(nicht Eppi) und den Deckel des 

Eppis mit DNA-Eluat schließen, auf 

Eis lagern. 

2µl DNA- 

Lösung 

Anschließend 2µl des DNA-Eluats 

zu den 12,5µl Hot Start Mix im 

PCR-Eppi pipettieren. 

PCR-Tube 

22


_________________________________________________________________________________________ 

2. Multiplex-Polymerase Ketten Reaktion 

Material: 

12,5µl Maxima HotStart Green Mix (2fach konzentriert, enthält: [Puffer (+ Mg 2+ ), 

dNTPs, Polymerase, Sucrose, cyan + gelber Farbstoff], (wird vom Betreuer 

aliquotiert ausgeteilt), liegt schon im PCR Eppi vor 

Eure isolierte DNA Probe 

steriles ddH 2 O 

Primer-mix F: D1S80-F (10pmol/µl), SE 33 F (10pmol/µl), D10S1248 F (10pmol/µl) 

Primer-mix F: D1S80-R (10pmol/µl), SE 33 R (10pmol/µl) D10S1248 R (10pmol/µl) 

sterile gelbe Spitzen (bitte immer neue sterile Spitzen verwenden) 

Multiplex-PCR: Genloci 


‣ Primer auf Eis stellen 

‣ Multiplexansatz in das PCR-Eppi mit Hotstartmix pipettieren (s. Pipettierschema) 

‣ Jeden Pippetierschritt abhaken und immer eine neue Spitze nehmen, 

Endvolumen 25 µl. 

Multiplex-PCR-Ansatz: 

12,5 µl Hot Start Green Mix (ist schon im PCR-Eppi vorgelegt) 

2 µl DNA Lösung 

5,25 µl Primer-mix F 

5,25 µl Primer-mix R 

25µl Endvolumen 

WICHTIG: ES DARF NICHTS VERGESSEN WERDEN! SONST PASSIERT NIX 

‣ Alle Komponenten nacheinander pipettieren (nach jedem Pipettierschritt Zutat abhaken). 

‣ Eppi gut verschließen, in den Thermocycler stellen und das Programm starten. Die 

Amplifikation dauert ca. 1,5h. 

‣ Der praktische Teil des Kurstags ist mit dem Start der PCR beendet. Die Betreuer nehmen die 

Proben aus der Maschine und lagen sie bei -20°C bis nächste Woche. 

‣ Das Analytische Gel der PCR wird am nächsten Kurstag (bei dem Versuch Nukleinsäuren II) 

gefahren und besprochen (bitte dann schon um 12.45Uhr da sein um die Gelproben 

aufzutragen, Danke). 

23


_________________________________________________________________________________________ 

Programm PCR-Maschine: 

1) 98°C 5 min (Denaturieren und Aktivieren der Polymerase) 

2) 98°C 5 sec (Trennen der Stränge) 

59°C 10sec (Anlagern der Primer) 2 Wiederholungen 

72°C 5sec (Strangverlängerung) 

3) 98°C 5 sec (Trennen der Stränge) 

59°C 10sec (Anlagern der Primer) 35 Wiederholungen 

72°C 10sec (Strangverlängerung) 

4) 72°C 5 min (Auffüllreaktion) 

5) 15°C Pause (Lagerung) 

Eine Woche später, vor Beginn des Plasmid Versuches: 

1.Analytisches Agarose-Gel zur Überprüfung der PCR 

Die PCR-Probe wird auf das präparative Agarosegel aufgetragen und aufgetrennt. Wir 

schauen uns das Gel die aufgetragene und aufgetrennte DNA unter UV-Licht an. 

Ethidiumbromid interkaliert in den DNA-Doppelstrang und macht somit die DNA unter UV- 

Licht sichtbar. 

Material: 

Agarose (MoSieve Agarose MS 1000, Peqlab ) 

Mikrowelle 

Erlenmeyerkolben 

1x TAE-Elektrophorese Puffer 

steriles Wasser 

Standard: GeneRuler 100bp Ladder plus von Fermentas) 

Ethidiumbromidstammlösung in Tropfflasche(0,07%)) 

Gelapparatur 


‣ Agarose (3 %) in einen Erlenmeyerkolben abwiegen 

‣ 1x TAE-Elektrophorese Puffer zugeben (50ml für mittlere Gelgröße) 

‣ Alles wiegen, Gesamtgewicht aufschreiben 

ACHTUNG! AGAROSE FÜR DIE ELEKTROPHORESE NIEMALS IN WASSER LÖSEN, IMMER PUFFER 

NEHMEN! 

‣ zum Schmelzen die Agarose in der Mikrowelle kochen, bis eine klare Lösung entsteht 

ACHTUNG! BEIM KOCHEN IN DER MIKROWELLE KANN EIN SIEDEVERZUG ENTSTEHEN, DESHALB 

BEIM SCHÜTTELN DER LÖSUNG SCHUTZBRILLE TRAGEN! 

‣ Fehlendes Gewicht mit Wasser auffüllen 

‣ Lösung unter Schütteln etwas abkühlen lassen 

‣ Unter dem laufenden Abzug Ethidiumbromid zugeben, kurz mischen 

ACHTUNG ETHIDIUMBROMID BZW. E.-DAMPF IST KREBSERREGEND! 

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_________________________________________________________________________________________ 

‣ Agarose unter dem Abzug in die abgedichtete Gelkammer gießen, dabei Kamm nicht 

vergessen 

‣ nach Erkalten und Erstarren der Agarose den Kamm entfernen (vorsichtig) und Gel in 

der Gelkammer mit 1x TAE-Puffer Überschichten (das Gel muss mit circa 3mm Puffer 

bedeckt sein) 

‣ dann die aufgetaute PCR-Probe (25µl) in die Taschen des Gels pipettieren (Standard 

nicht vergessen) 

‣ die Elektrophorese erfolgt bei 130 V für etwa 45 min 

‣ nach der Elektrophorese wird das Gel kurz im UV-Durchlicht betrachtet und fotografiert 

(Bildausdruck) 

‣ das Bild kann elektronisch per USB Stick vom PC kopiert werden 

‣ Besprechung des Ergebnisses des PCR 

Verwendete Größenstandarts: 

Figure 2. 1X reaction mixture 

containing Maxima® Hot Start Green 

PCR Master Mix. 

A – unseparated in a well 

B – blue and yellow dyes after separation. 

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Versuch Nukleinsäuren II- RNA - 

____________________________________________________________________________ 

Nukleinsäuren II 

Deckblatt: Nukleinsäuren II 

Versuch GP Nukleinsäuren II 

RNA-Isolierung und Nachweis einer 

spezifischen mRNA mittels RT-PCR 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

....... Semester(WS/SS, Jahr): 

Studiengang: ................................................. 




Bemerkung: .......................................... 


Versuch Nukleinsäuren II - RNA - 

_________________________________________________________________________________________ 

1. Versuch : Nukleinsäuren II - RNA 

RNA-Isolierung und Nachweis einer spezifischen mRNA mittels RT-PCR 


Wichtig: Bitte schon 12.45 Uhr da sein zum Auftragen der PCR von letzter Woche 

Theoretischer Teil 

Als Ausgangsmaterial für den spezifischen Nachweis verschiedener Clusterin(CLU)-mRNA- 

Varianten werden humane embryonale Nierenfibroblasten der Zelllinie HEK293 (human 

embryonic kidney) verwendet, die entweder die mRNA-Variant CLU35 (CLU35-HEK293) 

oder die mRNA-Variante CLU36 (CLU36-HEK293) exprimieren. Beide mRNA-Varianten 

setzten sich aus insgesamt 9 Exons zusammen, unterscheiden sich jedoch lediglich im 1. 

Exon, welches nicht proteinkodierend ist. Aus diesen HEK293-Zellen wird zuerst die 

Gesamt-RNA mit Hilfe des innuPREP-RNA-Mini-Kits (Analytik Jena) über zwei 

chromatographische Schritte isoliert. Hierzu wird nach Lyse der Zellen zunächst die 

genomische DNA durch Bindung an die Silika-Matrix eines 1. Zentrifugensäulchens D (blau) 

entfernt. Der Durchfluss, welcher die RNA enthält wird mit Ethanol versetzt und 

anschließend auf das 2. Säulchen R (violett) gegeben und zentrifugiert. Hierbei kommt es 

zur selektiven Bindung der RNA an das Silika-Säulenmaterial. Nach einigen Waschschritten 

zur Entfernung restlicher Proteinverunreinigungen kann die gebundene RNA schließlich mit 

RNAse-freiem Wasser in reiner Form von der Säule eluiert werden. Die Konzentration der 

RNA wird anschließend spektrophotometrisch bestimmt und zur Überprüfung der 

Präparationsqualität ein Teil der RNA-Lösung zusätzlich durch eine denaturierende 

Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung analysiert. Ist die 

RNA-Qualität in Ordnung, d.h. es kam bei der Präparation zu keiner RNA-Degradation, so 

sollten die 28S- und 18S-ribosomalen RNAs (rRNA), die etwa 80% der Gesamt-RNA 

ausmachen, als zwei deutliche Banden zu erkennen sein, wobei die 28S-rRNA-Bande im 

Vergleich zur 18S-rRNA-Bande etwa doppelt so intensiv sein sollte. 

Alle in der Gesamt-RNA enthaltenen einzelsträngigen und polyadenylierten mRNA-Moleküle 

werden in einem weiteren Schritt mit Hilfe einer reversen Transkriptase in komplementäre 

einzelsträngige DNA (cDNA) umgeschrieben (Erststrangsynthese). Das retrovirale Enzym 

reverse Transkriptase besitzt die Eigenschaft, einzelsträngige RNA als Matrize für die 

Synthese eines komplementären DNA-Stranges zu verwenden. Das für den Start der DNA- 

Synthese notwendige freie 3’-OH Ende wird hierbei durch Oligo-dT-Oligonukleotide (Primer) 

zur Verfügung gestellt, die der Enzymreaktion zugegeben werden. Diese kurzen 

27


_________________________________________________________________________________________ 

einzelsträngige DNA-Oligonukleotide hybridisieren an das 3’-Ende von polyadenylierten 

mRNA-Molekülen und ermöglichen deren reverse Transkription. 

Der Erststrang wird dann als Matrize (Template) für die Polymerasekettenreaktion (PCR) mit 

cDNA-spezifischen Oligonukleotid-Primernkombinationen (CLU35-Ex1b-F2 + CLU34-36-R2, 

CLU36-Ex1c-F2 + CLU34-36-R2) eingesetzt. Mit Hilfe dieser PCRs wird aus dem Gemisch 

vieler unterschiedlicher einzelsträngiger cDNA-Moleküle gezielt ein Teil der CLU35-cDNA 

bzw. CLU36-cDNA und ein Teil aller CLU-cDNA-Varianten amplifiziert. Nach 

Agarosegelelektrophorese der verschiedenen PCR-Ansätze zeigt eine spezifische Bande in 

den einzelnen Proben also an, ob in der präparierten Gesamt-RNA die entsprechende 

mRNA vorhanden ist, also ob die verwendeten HEK293-Zellen die CLU35- oder CLU36- 

mRNA-Variante exprimieren. 

Abb. 1 Prinzip der RT-PCR 

28


_________________________________________________________________________________________ 

Abb. 2: Struktur der CLU35 und CLU36-mRNA 

Praktischer Teil 

1. Isolierung von Gesamt-RNA aus Säugerzellen 

Jede 2er-Gruppe führt eine RNA-Präparation durch. 

Beim Arbeiten mit RNA ist besondere Vorsicht geboten, da RNA sehr anfällig für eine 

Degradierung durch RNAsen ist. Hauptquelle dieser RNAsen sind z. B. die menschliche 

Haut oder bakterielle Kontaminationen. Deshalb beim Umgang mit RNA stets mit 

Handschuhen arbeiten. Zudem werden ausschließlich Puffer benutzt, die mit Wasser 

angesetzt wurden, welches zuvor mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt wurde, um 

etwaige kontaminierende RNAsen irreversibel zu inaktivieren. 

Material: 

konfluente humane Nierenfibroblasten, welche entweder die mRNA-Variante CLU35 

oder CLU36 stabil exprimieren (CLU35-HEK293 bzw. CLU36-HEK293) 

innuPREP RNA-Mini-Kit (Analytik Jena): enthält die Zentrifugensäulchen und alle 

notwendigen Puffer 

PBS-Puffer (PBS -/- Dulbecco): 

o 8% NaCl 

o 0.2% KCl 

o 1,15% NaH 2 PO 4 

o 0.2% KH 2 PO 4 

70% Ethanol-DEPC (angesetzt mit DEPC-ddH2O)l 

DEPC-ddH 2 O (RNAse-frei) 

29


_________________________________________________________________________________________ 


‣ 

‣ Kulturmedium aus einer mit konfluenten HEK293-Zellen bewachsenen Schale in 

Abfallflasche überführen (abkippen des Mediums in die Flüssig-Abfallflasche, 

Petrischale schräghalten und Rest mit blauer Pipettenspitze abziehen) 

‣ 1ml PBS-Puffer in die Zellkulturschale geben, dann Zellen mit 1ml Pipette durch 

aufziehen des PBS und auspipettieren über den Gefäßboden ablösen und sammeln 

(Schale dabei schräg halten und mehrmals über den Gefäßboden auspipettieren!) 

‣ Zellsuspension noch in der Schale durch vorsichtiges auf und abziehen etwas 

vereinzeln und dann vollständig mit blauer Pipettenspitze in ein 1,5 ml Eppi 

überführen 

‣ Zentrifugation (2min, 300×g) 

‣ Überstand vorsichtig und vollständig abziehen (erst blaue, dann gelbe Pipettenspitze 

verwenden) und in den Abfallbehälter verwerfen. 

‣ Zellpellet in 400 µl Lysis-Puffer RL, durch auf und ab pipettieren, resuspendieren, 

2min Raumtemperatur inkubieren 

‣ Zellpellet noch einmal durch auf und ab Pipettieren vollständig resuspendieren (es 

sollen keine Zellklumpen mehr zu erkennen sein) und weitere 3 min bei 

Raumtemperatur inkubieren 

‣ dann das komplettes Zelllysat auf das Zentrifugen Säulchen D (blau) geben 

‣ Zentrifugation (2 min, 12.000rpm) 

‣ Säulchen verwerfen (enthält gebundene genomische DNA) Durchfluss 

weiterverwenden, enthält RNA! 

‣ Durchfluss=RNA + 400 µl (ca. 1 Vol.) 70%-DEPC-Ethanol, mischen 

‣ Durchfluss komplett in das Zentrifugensäulchen R (violett) geben 


‣ Durchfluss verwerfen, Säulchen mit gebundener RNA in frisches Auffanggefäß 

stellen 

‣ 750 µl Waschpuffer HS auf Säulchen geben 


‣ Durchfluss verwerfen, 

‣ 500 µl Waschpuffer LS auf Säulchen geben 


‣ Durchfluss verwerfen, Säulchen mit gebundener RNA in frisches Auffanggefäß 

stellen 

‣ Trocken-Zentrifugation (3 min, 12.000rpm), Säulchen muss trocken sein 

‣ Säulchen mit gebundener RNA in ein frisches steriles 1,5 ml Eppi stellen (vorher 

Deckel abschneiden auf Kleenex und aufheben) 

‣ 60 µl DEPC-ddH 2 O auf das Säulchen Material geben, 1 min bei Raumtemperatur 

inkubieren 


‣ Durchfluss enthält eluierte RNA (bitte beschriften: Name, Gruppennummer) 

‣ RNA dann immer auf Eis lagern! 

30


_________________________________________________________________________________________ 

2. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der RNA 

Konzentration und Reinheit der präparierten Gesamt-RNA werden photometrisch bei den 

Wellenlängen 260nm (Nukleinsäuren) und 280nm (Proteine) im UV-Spektralphotometer 

bestimmt. Der Quotient der Absorptionen bei 260nm und 280nm erlaubt eine Aussage über 

die Reinheit der RNA-Lösung (der Quotient einer reinen RNA-Lösung beträgt 1.8-2.0). Die 

Konzentration der RNA wird anschließend nach folgender Formel berechnet: 

c(RNA) = Abs 260nm × 40µg/ml × Verdünnungsfaktor 


‣ 990µl DEPC-ddH 2 O + 10µl RNA-Lösung in ein neues 1,5ml Eppi pipettieren, 

invertieren zum mischen 

‣ 1ml DEPC-ddH 2 O in neues 1,5ml Eppi geben, für Nullabgleich 

‣ Den 1ml DEPC-ddH 2 O in die Quarzküvette pipettieren (Achtung bei Luftbläschen), in 

Photometer stellen, Nullabgleich machen 

‣ Das Wasser aus Küvette verwerfen und die 1ml 1:100-verdünnte RNA-Lösung mit 

der Pipette in die Quarzküvette pipettieren (in das Eck der Küvette auspipettieren) 

‣ die Absorption bei 260nm und 280nm messen 

‣ Küvette spülen für nächste Messung 

‣ Als erstes Berechnung der Konzentration der unverdünnten RNA-Lösung (in 

µg/µl!!!!!!)! Konzentration auf Eppi mit RNA-Stammlösung schreiben und 

Bestimmung der Reinheit (Quotient OD 260nm/280nm)! 

‣ Rechnung und Werte sollen auch im Protokoll vermerkt werden. 

3. Reverse Transkription der RNA (Erststrangsynthese) 

Material: 

RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase, 200U/µl, Fermentas, EP0441 

5× Reaktionspuffer für Reverse Transkriptase 

10mM dNTP-Mix (jeweils 2.5mM dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 

500ng/ml Oligo-dT-Primer (100pmol/µl, 72,4µl) 

MP-H2O 


‣ bitte alles in der folgenden Reihenfolge pipettieren 

‣ 2x 2,5µg Gesamt-RNA in zwei 0,5ml PCR-Eppis pipettieren 

31


_________________________________________________________________________________________ 

1. Probe 2. Kontrolle ohne RT (-RT) 

?.µl RNA (entspricht 2,5µg) 

? µl RNA (entspricht 2,5µg) 

1 µl Oligo dT-Primer 

? µl MP H2O 

? µl MP H2O 

ergibt 13 µl, Zugabe von 

4µl 5x Reaktionspuffer 

2µl dNTP Mix 10mM 

1µl RevertAid Reverse Transkriptase 

ergibt 20µl Endvolumen 

ergibt 20µl Endvolumen 

‣ Reaktion für 60min bei 42°C (im PCR-Cycler) 

‣ Inaktivierung des Enzyms 10min 70°C (im PCR-Cycler) 

‣ kurz abzentrifugieren und Ansatz mit 180µl MP-H 2 O auf 200µl auffüllen und mischen 

‣ auf Eis lagern oder -20°C 

4. Denaturierende Agarosegelelektrophorese von Gesamt-RNA 

Die denaturierende Agarosegelelektrophorese dient zur Überprüfung der Qualität der 

präparierten Gesamt-RNA. Hiermit soll sichergestellt werden, dass für die 

Erststrangsynthese ausschließlich nicht-degradierte RNA-Proben verwendet werden. 

Material: 

MOPS/EDTA, pH 7.0: 40mM MOPS (3-(N-Morpholino-)-propansulfonsäure 

o 10mM Natriumacetat 

o 1mM EDTA 

RNA-Probenpuffer: 

50% Gylcerin 

o 0.25% Bromophenolblau 

o 1mM EDTA 

RNA-Marker RiboRuler High Range RNA-Ladder, SM 1821/3 Fermentas 

Formaldehyd (37%) (immer neu aliquotieren 15µl) 

Formamid (immer neu aliquotieren 50µl) 

Ethidiumbromid-Färbelösung (0.5µg/ml) 

Agarose (Universal Gold von Peqlab) 

Speed Vac (Zentrifuge die unter Vakuum arbeitet) 


Gelgießen 

‣ Das Gießen des Gels wird von den Betreuern gemacht 

‣ 2.5g Agarose in einen 300ml-Erlenmeyerkolben abwiegen 

‣ 184ml DEPC-behandeltem Wasser zugeben, wiegen, Waage austarieren 

‣ in der Mikrowelle aufkochen, bis sich die Agarose vollständig gelöst hat. 

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_________________________________________________________________________________________ 

VORSICHT: BEIM KOCHEN IN DER MIKROWELLE KANN EIN SIEDEVERZUG ENTSTEHEN, 

DESHALB DIE LÖSUNG ÖFTERS LEICHT SCHÜTTELN, DABEI SCHUTZBRILLE TRAGEN! 

‣ Wiegen, Wasser nachfüllen 

‣ Unter Abzug: Zugabe von25ml 10× MOPS-Puffer und 41ml Formaldehyd, mischen 

‣ die 200ml komplett in die vorgesehene Flachbettgelapparatur gießen 

WICHTIG: DIE ZUGABE VON FORMALDEHYD UND DAS GIESSEN DES AGAROSEGELS FINDET 

IM ABZUG STATT!!!!!!! 

‣ Agarosegel für mindestens 30min aushärten lassen 

Vorbereitung der RNA-Proben 

‣ 15µg Gesamt-RNA in ein 0.5ml PCR-Eppi pipettieren 

‣ Lyophilisieren der RNA unter Vakuum in der Speed Vac 

‣ Anschließend lösen der RNA in: 

o 7µl DEPC-ddH 2 O 

o 3µl 10× MOPS-Puffer 

o 5µl Formaldehyd 

o 15µl Formamid 

Ergibt 30µl für das Gel 

‣ Probe kurz vortexen und abzentrifugieren (Minizentrifuge) 

‣ Probe für 15 min bei 65°C im PCR-Cycler denaturieren, anschließend kurz 

runterzentrifugieren 

‣ 6µl RNA-Probenpuffer zugeben und durch Auf- und Abpipettieren mischen 

‣ Probe komplett auf das RNA-Gel auftragen 

‣ RiboRuler High Range RNA Ladder: 5µl/Gel, 10min. 70°C, schnell abkühlen und aufs 

Gel laden 

Denaturierende Agarosegelelektrophorese 

‣ Kämme und Spacer aus Kammer mit dem ausgehärteten Gel vorsichtig 

herausziehen 

‣ Kammer mit 1× MOPS-Puffer (Elektrophoresepuffer für RNA-Gele) füllen, bis das Gel 

vollständig überschichtet ist 

‣ Probe (36µl) möglichst vollständig in eine Geltasche pipettieren 

‣ Elektrophorese bei 150V für ca. 1.5h 

‣ Ab hier übernehmen die Betreuer die Gelbehandlung 

‣ Gel 2×10min in ddH 2 O einlegen 

‣ Unter Ethidiumbromid-Abzug: Gel 15min in Ethidiumbromid-Färbelösung einlegen 

ACHTUNG: ETHIDIUMBROMID IST STARK KREBSERREGEND! BEIM ARBEITEN MIT 

ETHIDIUMBROMID IMMER BLAUE NITRILHANDSCHUHE TRAGEN !!!!!!!!! 

‣ Unter Abzug: Gel 15min in ddH 2 O entfärben 

‣ Analyse und Dokumentation des Gels auf UV-Transilluminator 

Protokoll: 

- Warum lässt sich einzelsträngige RNA mit Ethidiumbromid anfärben? 

- Zuordnung der sichtbaren Banden zu den verschiedenen RNA-Typen 

-Ist die Qualität der RNA in Ordnung oder ist eine Degradierung zu erkennen? 

33


_________________________________________________________________________________________ 

5. DNA-Amplifikation der mRNA-Varianten CLU35 bzw. CLU36 mittels 

PCR 

Material: 

Erststrang (revers-transkribierte Gesamt-RNA CLU35-HEK293 Zellen oder CLU36- 

HEK293 Zellen) und die –RT-Kontrolle 

Taq-Polymerase Maxima Hot Start Green Mix Fermentas (2fach konzentriert, enthält: 

Puffer für PCR, dNTP-Mix, MgCl 2 , Hot Start Taq-DNA-Polymerase, Auftragspuffer) 

Primer: a) CLU35-Ex1b-F2 (Nr.562) und CLU-34-36-R2 (Nr.485) (jeweils 10pmol/µl) 

b) CLU36-Ex1c-F2 (Nr.563) und CLU-34-36-R2 (Nr.485) (jeweils 10pmol/µl) 

c) GAPDH-Rat-F2(Nr.453) und GAPDH-Rat-R2 (Nr.454) (jeweils 10pmol/µl) 


‣ Jede Gruppe setzt 3 PCR´s mit ihrem Erststrang und 1 PCR mit der –RT-Kontrolle 

an 

1. CLU35 2. CLU36 3. GAPDH 4. GAPDH –RT- 

KONTROLLE 

10µl Hot Start Mix 2x 10µl Hot Start Mix 2x 10µl Hot Start Mix 2x 10µl Hot Start Mix 2x 

8µl 1. Strang 8µl 1. Strang 8µl 1. Strang 8µl -RT-Kontrolle 

1µl CLU35-Ex1b-F2 1µl CLU36-Ex1c-F2 1µl GAPDH-Rat-F2 1µl GAPDH-Rat-F2 

1µl CLU-34-36-R2 1µl CLU-34-36-R2 1µl GAPDH-Rat-R2 1µl GAPDH-Rat-R2 

µl dd-H 2O µl dd-H 2O µl dd-H 2O µl dd-H 2O 

20µl Gesamtvolumen 20µl Gesamtvolumen 20µl Gesamtvolumen 20µ Gesamtvolumen 

PCR-Programm: 

Initiale Denaturierung, Taq-Aktivierung: 15min 95°C 

Denaturierung: 30sec 95°C 

Annealing: 30sec 56°C 23 Zyklen 

Elongation: 30sec 72°C 

Final Extension: 10min 72°C 

‣ Nach Abschluss der PCR werden die 20µl auf ein Agarosegel (2% MoSieve Agarose 

MS 1000, Peqlab) aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. 

‣ Wichtig: Dies geschieht eine Woche später. Deshalb bitte die nächste Woche 

schon um 12.45 Uhr kommen zum PCR-Auftrag. 

Protokoll: 

1. Ist die PCR erfolgreich verlaufen? 

2. Bestimmung der Größe des amplifizierten PCR-Fragments und Vergleich mit der zu 

erwartenden (theoretischen) Größe der spezifischen cDNA. 

3. Welche CLU-mRNA-Variante wird in den von Ihnen untersuchten HEK293-Zellen 

exprimiert? 

4. Ist die Erststrangsynthese erfolgreich verlaufen? Woran ist dies zu erkennen? 

5. Sind in der –RT-Kontroll-PCR DNA-Banden zu erkennen? Falls ja, wie sind diese 

Banden entstanden? 

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_________________________________________________________________________________________ 

6. Anlagen 

a) Clusterin Clu35 

Homo sapiens clusterin (CLU), transcript variant 2, mRNA 

CLU35 

(NCBI Reference Sequence: NM_203339.1) 

atg Startcodon 

Anlagerung Forward-Primer: CLU35-Ex1b-F2 

tga 

Stoppcodo 

Anlagerung Revers-Primer: CLU34-36-R2 

35


_________________________________________________________________________________________ 

b) Clusterin Clu36 

Homo sapiens clusterin (CLU), transcript variant 3, mRNA 

CLU36 



Anlagerung Forward-Primer: CLU36-Ex1c-F2 

tga 

Stoppcodon 

Anlagerung Revers-Primer: CLU34-36-R2 

36


_________________________________________________________________________________________ 

c) GAPDH 

Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 

(GAPDH), mRNA 



Anlagerung Forward-Primer: GAPDH-rat-F2 

tga 

Stoppcodon 

Anlagerung Revers-Primer: GAPDH-rat-R2 

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_________________________________________________________________________________________ 

a) Sequenzen der Primer 

Clu35 

CLU35-Ex1b-F2 5` CAC TGC GAA CCC TCT CTA CTC TC 3` 

CLU-34-36-R2 5` TTC AGG CAG GGC TTA CAC TCT 3´ 

CLU36 

CLU36-Ex1c-F2 5` TCG TCC TGT TGG TTC TGT GAT G 3` 

CLU-34-36-R2 5` TTC AGG CAG GGC TTA CAC TCT 3´ 

GAPDH 

GAPDH-rat-F2 5´ GCC AAA AGG GTC ATC ATC TC 3´ 

GAPDH-rat-R2 5´ GCT TCA CCA CCT TCT TGATGT C 3 

b) DNA-Größenstandards 

100bp-Leiter (Fermentas): 

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Versuch Nukleinsäuren III - Plasmidrestriktion - 

____________________________________________________________________________ 

Nukleinsäuren III 

Deckblatt: Nukleinsäuren III 

Versuch GP Nukleinsäuren III 

Plasmid-DNA-Isolierung und Restriktionsanalyse 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

....... Semester(WS/SS,Jahr):.... 

Studiengang: ................................................. 




Bemerkung: .......................................... 


Versuch Nukleinsäuren III – Plasmidrestriktion - 

_________________________________________________________________________________________ 

Isolierung eines rekombinanten Plasmids aus E. coli und dessen 

Charakterisierung mittels Restriktionsanalyse 


Wichtig: Bitte schon 12.45 Uhr da sein zum Auftragen der PCR von letzter Woche 

Theorie zu Plasmiden und Restriktion 

Bakterien können neben ihrer als Nucleoid (= Kernäquivalent, „Bakterienchromosom“) 

bezeichneten, genomischen DNA auch kleine, ringförmige DNA-Moleküle, sog. Plasmide 

besitzen. Diese tragen Gene, die im Normalfall für das Überleben des Organismus nicht 

entscheidend sind, jedoch unter gewissen äußeren Bedingungen diesem einen immensen 

Vorteil verschaffen können (z.B. Antibiotikaresistenz). Aufgrund ihrer geringen Größe und 

autonomen Replikation können sie in der Gentechnik als Vektoren benutzt werden, also 

zum Einbringen von Fremd-DNA in Bakterien (Transformation) oder Säugerzellen 

(Transfektion) genutzt werden. Bei diesen Plasmidvektoren handelt sich nicht um natürlich 

vorkommende Plasmide, sondern um gentechnisch hergestellte künstliche Plasmide. Um 

diese Plasmidvektoren effizient nutzen zu können, sollten sie folgende Eigenschaften 

besitzen: 

Der Vektor muss ein sogenanntes Replikon (ori) tragen, das seine Vermehrung im Wirt 

(meist Bakterien) gewährleistet. Ein Vektor sollte einen als MCS (multiple cloning site) 

oder auch Polylinker bezeichneten Abschnitt besitzen, der möglichst viele 

Erkennungssequenzen für verschiedene Restriktionsendonukleasen besitzt, in den Fremd- 

DNA einkloniert werden kann (Polylinker). Die in der MCS vorhandenen 

Erkennungssequenzen sollten einzigartig sein, d.h. an keiner anderen Stelle des Plasmids 

ein weiteres Mal vorkommen, um ein gezieltes „Öffnen“ des Plasmidrings zu ermöglichen, 

nicht jedoch ein „Zerschneiden“ des Plasmids in mehrere DNA-Fragmente zur Folge 

haben. 

Er sollte Informationen tragen, die eine Selektion von Bakterien, welche das unveränderte 

Plasmid bzw. das neu rekombinierte Plasmid (Plasmid mit integrierter Fremd-DNA) tragen, 

ermöglichen. Häufig verwendete Selektiongene für plasmidtragende Zellen sind 

Antibiotikaresistenzgene. Ein zweites Selektionsgen sollte sich in dem Bereich des 

Plasmides befinden, in den die Fremd-DNA eingebracht wird. Die Inaktivierung dieses 

Selektionsgens durch die Integration von Fremd-DNA zeigt dann an, dass sich Fremd- 

DNA im Plasmid befindet. Das im Praktikum benutzte Plasmid pUC19 enthält ein 

Ampicillinresistenzgen (kodiert für das Enzym -Lactamase), so dass Bakterien mit 

diesem Plasmid auf einem ampicillinhaltigem Nährboden wachsen können. Als zweiten 

Marker besitzt pUC19 das LacZ‘-Gen, welches für die -Untereinheit der ß-Galactosidase 

kodiert. Dieses Gen befindet sich in dem Bereich des Vektors, in den die Fremd-DNA 

integriert wird (MCS: multiple cloning site oder auch Polylinker genannt) und was eine 

Inaktivierung des LacZ‘-Gens bewirkt (Stichwort: Blau-Weiß-Selektion, - 

Komplementation, Lac-Operon). 

Soll nach der Insertion die Fremd-DNA zur Expression eines Proteins verwendet werden, 

so müssen sich auf dem Plasmid in korrekten Positionen entsprechende Kontrollelemente 

(Promotor, Polyadenylierungssignal) befinden. 

Die Nukleotidsequenz des Plasmides sollte bekannt sein. 

Methoden zum Zerschneiden von DNA in diskrete Fragmente waren bis gegen Ende der 

60er Jahre unbekannt. Die Lösung dieser Frage ergab sich aus langjährigen Arbeiten zur 

40


_________________________________________________________________________________________ 

Untersuchung des Phänomens wirtskontrollierter Restriktion und Modifikation bei der 

Vermehrung des Bakteriophagen Lambda in E. coli. Man beschreibt mit diesem Ausdruck 

das Phänomen, dass ein und derselbe Bakteriophage in verschiedenen Wirtstämmen 

unterschiedlich gut vermehrt. Es stellte sich heraus, dass Bakterien die Fähigkeit besitzen, 

spezifisch die DNA der Bakteriophagen mit Hilfe sogenannter Restriktionsendonuklease 

zu hydrolysieren und sich so vor dem Bakteriophagen zu schützen. Restriktionsenzyme 

werden nach dem Bakterium benannt, aus dem sie isoliert wurden. Beispiel: Die 

Restriktionsendonuklease HaeIII ist das dritte Restriktionsenzym, das aus Haemophilus 

aegypticus isoliert wurde, EcoRI stammt aus E.coli Stamm R. 

In der Molekulargenetik sind Restriktionsendonukleasen von Typ II am gebräuchlichsten. 

Sie erkennen meist palindromische Tetra-, Penta- oder Hexanukleotidsequenzen und 

hydrolysieren die Ziel-DNA direkt innerhalb dieser Erkennungssequenz. Dabei können 

entweder glatte Enden (blunt ends) oder, bei versetzter Spaltung, einzelsträngige 3' oder 

5' überhängende Enden (sticky ends) entstehen. Die nachfolgende Tabelle listet einige 

gängige Restriktionsendonukleasen, ihre Erkennungssequenz, und die nach Hydrolyse 

entstehenden Enden auf. 

5'-überhängende Enden 3'-überhängende Enden glatte Enden 

Enzym 

Enzym 

Enzym 

Erkennungssequenz 

s 



BamHI G/GATCC PstI CTGCA/G PvuII CAG/CTG 

Hindlll A/AGCTT Apal GGGCC/G Haelll GG/CC 

EcoRI G/AATTC Smal CCC/GGG 

Sall G/TCGAC EcoRV GAT/ATC 

Im Rahmen dieses Versuchs sollen Plasmide (hier rekombinante Formen des high copy 

Plasmids pUC19, in das bereits ein Teil der gp80-cDNA integriert wurde) mittels 

alkalischer Lyse und anschließender Säulenchromatographie aus dem Escherichia coli 

Stamm Xl1-blue isoliert werden. Im Folgenden werden eine photometrische 

Konzentrationsbestimmung sowie eine Gelelektrophorese der präparierten Plasmid-DNA 

durchgeführt. Letztere dient zum Auftrennen und Visualisieren der verschiedenen 

Konformationen der Plasmid-DNA (supercoiled und open circle). Durch Restriktion der 

isolierten Plasmid-DNA mit der Restriktionsendonuklease PvuII sollen zudem lineare DNA- 

Fragmente der rekombinanten pUC19-gp80-cDNA generiert werden, deren Länge 

gelelektrophoretisch bestimmt werden soll. Mit Hilfe dieser Fragmentlängen soll 

anschließend die Orientierung, in der die gp80-cDNA in das pUC19-Plasmid integriert 

wurde, bestimmt werden (siehe Abbildung). 

1. Plasmid-DNA-Minipräparation 

41


_________________________________________________________________________________________ 

1. Plasmidisolierung: 

Es wird aus der Über-Nacht-Kulturen transformierter E. coli Xl1-blue (2x 100ml +Amp) das 

Plasmid präpariert. Dies erfolgt chromatographisch mit Hilfe von Silika-Zentrifugensäulchen. 

Material: 

5ml LB-Flüssigkulturen (E. coli Xl1-blue mit pUC19-gp80-cDNA, sense oder 

antisense, Rack 7/2) in Greinerröhrchen 

GeneJet Plamid Minipräp-Kit Fermentas, dieser Kit beinhaltet alle unten zu 

verwendenden Puffer. 

10 mM Tris, pH 8.5 


ACHTUNG! BEI GENTECHNISCHEN ARBEITEN MÜSSEN ALLE ABFÄLLE IN AUTOKLAVIERBEUTELN 

GESAMMELT UND SPÄTER FÜR 20 MIN BEI 121°C AUTOKLAVIERT WERDEN! 

‣ 5 ml XL1blue-Bakterien (transformiert mit dem rekombinanten Plasmid pUC19-gp80) 

im 15 ml-Greineröhrchen für 5 min bei 5000 rpm abzentrifugieren (zusammen in 

Zentrifuge Raum Nr. 215) 

‣ Überstand verwerfen in Flüssigabfall und Reste an LB-Medium vollständig mit 

gelber Pipettenspitze abziehen 

‣ Bakterien sorgfältig in 250 l Resuspension Solution (RS) resuspendieren 

(langsam auf- und abpipettieren, evtl. vortexen) und in ein 1,5 ml Eppendorf- 

Reaktionsgefäß (im folgenden Eppi genannt) überführen (das vollständige 

Resuspendieren der pelletierten Bakterien ist für gute Plasmiderträge von entscheidender 

Bedeutung!) 

‣ 250 l Lysis Solution (LS) zugeben und durch vier- bis sechsmaliges Invertieren 

des Eppis mischen, bis ein klares Lysat entsteht. 

‣ 350 l Neutralisation Solution (NS) zugeben und 4-6mal invertieren. 

‣ 5 Minuten bei 12.000 x g (11.000rpm) und Raumtemperatur zentrifugieren. 

‣ Den klaren Überstand auf die GeneJet Spin Säule (blau) pipettieren (Säule steckt in 

einem 2 ml Eppi, kein flockiges Präzipitat auf die Säule bringen; Betreuer fragen) 

‣ 1 Minute bei 12.000g zentrifugieren, bis das Lysat vollständig die Silikamembran 

passiert hat. Den Säulendurchfluss verwerfen und die Säule und das Eppi 

weiterverwenden. 

‣ 500 l Wasch-Puffer (WP) auf die Säule pipettieren, für 1 Minute bei 12.000 x g 

zentrifugieren, den Säulendurchfluss verwerfen und die Säule und das Eppi im 

nächsten Schritt weiterverwenden. 

‣ Waschschritt wiederholen: 500 l Wash-Puffer (WP) auf die Säule pipettieren, für 1 

Minute bei 12.000 x g zentrifugieren, den Säulendurchfluss verwerfen und die 

Säule und das Eppi im nächsten Schritt weiterverwenden. 

‣ Säulchen wieder in das Eppi setzen und Trocknen zentrifugieren (1 min, 12000g, 

essentieller Schritt! Zeit nicht verkürzen!) 

‣ Säulchen in ein neues steriles 1,5 ml Eppi stellen (Deckel vorher abscheiden) und 

die Plasmid-DNA eluieren. Hierzu 50 µl Elutionspuffer (EP) direkt auf die 

Säulenmatrix pipettieren, 2 Minuten einwirken lassen und anschließend für 2 

Minuten bei 12000 x g zentrifugieren. 

‣ Säule in Abfall werfen und mit dem abgeschnittenen Deckel das Eppi verschließen 

‣ Die eluierte Plasmid-Lösung, ca. 50µl, werden wie folgt verwendet: 

42


_________________________________________________________________________________________ 

1. 10 µl für die Konzentrationsbestimmung (siehe Seite 43, Konzentrationsbestimmung der 

Plasmidlösung) 

(Bitte diese Konzentrationsbestimmung als erstes durchführen, sofort die Konzentration 

berechnen und nach der Berechnung der Konzentration sofort den Verdau mit PvuII 

ansetzen) 

2. 2 µg werden mit PvuII restringiert (siehe Seite 44, Restriktion des isolierten Plasmids 

pUC19-gp80-cDNA mit PvuII ); anschließend 

3. 0,5 µg des Plasmids bei der späteren Agarosegelelektrophorese als ungeschnittenes 

Kontroll-Plasmid einsetzen 

2. Konzentrationsbestimmung der Plasmidlösung 

Die Konzentration der Plasmidlösung wird mit Hilfe der Absorption am Spektralphotometer 

bestimmt. 

Material: 

steriles MP-H 2 O 

sterile gelbe und blaue Spitzen 

Quarzküvetten 


‣ 990 µl MP-H 2 O in ein weiteres 1,5 ml Eppi vorlegen 

‣ 10 µl des präparierten Plasmid-Stammlösung zu den 990 µl dazugeben; Mischen durch 

invertieren 

‣ Die hergestellte Lösung ist somit um den Faktor 100 verdünnt 

‣ 1ml MP-H 2 O in Küvette pipettieren, in Photometer stellen, Nullableich durchführen 

‣ Wasser verwerfen und den 1ml verdünnte Plasmidlösung in die Küvette pipettieren 

‣ Optische Dichte bei 260 nm (OD 260nm ) und OD 280nm im Photometer bestimmen 

‣ Küvette spülen für nächste Messung 

‣ Berechnung der DNA-Konzentration in [µg/µl]: 

o OD 260nm = 1 entspricht einer DNA-Konzentration von 50 µg/ml 

o Über den Dreisatz ergibt sich folgender Zusammenhang: 

(DNA-Lösung) = OD 260nm × 50 

 

Die Menge an DNA in der Plasmid-Stammlösung ist um den Faktor 100 höher als in der 

gemessenen Verdünnung, daher: 

(DNA-Lösung) = OD 260nm × 50 

× 100 

Bitte sofort nach Messung die Konzentration der Lösung in µg/µl ausrechnen, um dann 

sofort die Restriktion ansetzen zu können. 

Die Lösung hat die Konzentration: µg/µl 

‣ Bestimmung des Reinheitsgehalts der Plasmid-Stammlösung: 

Proteine, vorwiegend darin enthaltene aromatische Aminosäuren, besitzen ein 

Absorptionsmaximum bei 280 nm, Nukleinsäuren absorbieren bei 260 nm im Maximum, 

43


_________________________________________________________________________________________ 

bei 280 nm nur noch halb so viel Strahlung; das Verhältnis OD 260nm /OD 280nm reiner 

Nukleinsäurelösung beträgt 1,8-2,0. 

Ist eine DNA-Lösung noch mit Proteinen verunreinigt, so steigt die OD 280nm und der 

Quotient OD 260nm /OD 280nm wird kleiner 

Auswertung: Bestimmung der Konzentration des präparierten Plasmids (in µg/µl) und 

dessen Reinheitsgehalts 

Das Eppi mit der Plasmidlösung mit Namen (eigener Name), Datum, Plasmid- 

Bezeichnung und der Konzentration in µg/µl beschriften. Sofort die Restriktion mit 

PvuII ansetzen! 

3. Restriktion des isolierten Plasmids pUC19-gp80-cDNA mit PvuII 

Zur Überprüfung der Orientierung der einklonierten gp80-Sequenz wird die isolierte 

Plasmid-DNA mit PvuII restringiert. 

Restriktionsansatz: 

? µl Plasmid DNA (soll ca. 1-2µg entsprechen) 

2.5 µl 10fach Puffer PvuII (Fast Digest, incl. Auftragspuffer!) 

? µl H 2 O 

1 µl PvuII (Fast Digest) 

25 µl Endvolumen 

‣ 30 Minuten bei 37 °C in Brutschrank 

‣ anschließend komplette Restriktion aufs Gel auftragen 

4. Agarosegelelektrophorese 

Je nach Anwendung werden unterschiedlich prozentige Agarosegele gegossen. Zur 

Auftrennung kleiner Fragmente hochprozentig, zur Auftrennung großer Fragmente 

niedrigprozentig. 

Material: 

Agarose MoSieve MS1000 von Peqlab 

Erlenmeyerkolben 

5x TAE-Elektrophoresepuffer (Tris-Acetat-EDTA-Puffer) 

6x Auftragspuffer DNA (6x AP) für Gelproben 

Massruler bzw. Generuler 100bp-ladder von Fermentas 

Ethidiumbromidlösung 0,07% aus Tropfflasche 

Gelapparatur 


‣ 1,5 % (w/v) MoSieve Agarose in einen Erlenmeyerkolben abwiegen 

‣ 1x TAE-Elektrophoresepuffer zugeben (80ml für mittlere Gelgröße), Kolben wiegen 

ACHTUNG! AGAROSE FÜR DIE ELEKTROPHORESE NIEMALS IN WASSER LÖSEN! 

44


_________________________________________________________________________________________ 

‣ zum Schmelzen die Agarose in der Mikrowelle kochen, bis eine komplett klare Lösung 

entsteht 

ACHTUNG! BEIM KOCHEN IN DER MIKROWELLE KANN EIN SIEDEVERZUG ENTSTEHEN, 

DESHALB DIE LÖSUNG ÖFTER LEICHT SCHÜTTELN, DABEI SCHUTZBRIILE TRAGEN! 

‣ Wasser nachfüllen 

‣ Lösung unter Schütteln etwas abkühlen lassen 

‣ Ethidiumbromidlösung zugeben (1 Tropfen pro 50ml Gel) 

ACHTUNG! ETHIDIUMBROMID IST POTENTIELL KREBSERREGEND! 

‣ Agarose möglichst dünn in die Gelkammer gießen, dabei Kamm nicht vergessen, nicht 

höher als die Slots gießen 

HANDSCHUHE IN FESTEN ETIDIUMBROMIDABFALL WERFEN! 

‣ nach Erkalten und Erstarren der Agarose den Kamm vorsichtig nach oben herausziehen 

und Gel in der Gelkammer mit 1x TAE-Puffer überschichten (das gesamte Gel muss ca. 

1-2 mm hoch mit Puffer bedeckt sein, siehe Fillline)) 

‣ Proben auftragen (nicht restringiertes Plasmid, Restriktion und DNA-Standard) 

1. Plasmid nicht-restringiert 1µg pUC19-gp80-cDNA in 10 µl Wasser, + 2 µl 6x AP, 

Ansatz komplett auftragen 

2. Restriktion: 25 µl Restriktionsansatz komplett auftragen; dieser Ansatz wird direkt neben 

der entsprechenden Probe des unrestringierten Plasmides aufgetragen. 

3. DNA-Standard (wird nur 1x pro Gel benötigt): 10µ Fertigmix 

4. pUC19-gp80cDNA-Dimer mit PvuII restringiert (wird 1 x pro Gel benötigt): 2µl des 

Restriktionsansatzes (wird von Betreuern ausgeteilt) + 8µl MP H 2 O+ 2µl 6x AP 

‣ 30 min, 130V 

‣ unter UV-Licht dokumentieren, 

Auswertung: Bild in Protokoll (eigene Probe markieren), beschriften und diskutieren 

5. Auswertung und Protokoll 

o Bestimmung der Konzentration und des Reinheitsgehalts der Plasmidlösung; sind 

Kontaminationen mit Protein vorhanden? 

o Die Spuren des Gebildes sind oberhalb der Taschen zu beschriften; DNA-Standard an der Seite 

des Gebildes beschriften (Größe der DNA-Banden in bp, für die Interpretation von DNA-Banden 

der eigenen Probe relevante Markerbanden korrekt zuordnen!!!!!!) 

o Hat die Plasmidpräparation funktioniert? Sind in der Spur des unrestingierten Plasmids alle 

Plasmidkonformationen als eigene Banden zu sehen (supercoiled, open circle)? Banden im 

Gelbild markieren; Warum wandern sie unterschiedlich weit? Sind noch weitere Banden zu 

erkennen? Woher stammen diese bzw. welche Nukleinsäuren sind in diesen Banden enthalten? 

o Wurde die Plasmid-DNA durch PvuII restringiert? Woran ist dies zu erkennen? Berechnen Sie, 

welche linearen DNA-Fragmente (Größe in bp) bei vollständiger Restriktion von pUC19-gp80- 

cDNA-sense und pUC19-gp80-cDNA-antisense entstehen? Welche Fragmente sind in der Spur 

der restringierten Probe zu erkennen? Ist die Restriktion des Plasmids vollständig verlaufen? 

Begründen Sie dies! Welches der beiden Plasmide wurde demnach präpariert und restringiert, 

45


_________________________________________________________________________________________ 

pUC19-gp80-cDNA-sense oder- antisense? Wichtig: Restriktionskarte zeichnen (zusammen 

mit Orientierungsbestimmungsergebniss). Diskussion der Ergebnisse. 

o Wie viele verschiedene Formen eines rekombinanten puc19-Plasmids können entstehen, wenn 

die gp80-cDNA über die PstI-Schnittstelle 2-mal, also als sog. Dimer, in das Plasmid integriert? 

Berechnen Sie für diese verschiedenen Formen die Größe (in bp) der entstehenden linearen 

DNA-Fragmente bei vollständigem Verdau! Welche Fragmente sind in der Spur des PvuIIrestringierten 

pUC19-gp80cDNA-Dimer-Plasmids zu erkennen? Welche der möglichen Formen 

des pUC19-gp80cDNA-Dimer-Plasmids wurde demnach restringiert? 

6. Anlagen 

gp80 cDNA-Sequenz 

pUC19 Restriktionskarte 

DNA-Molekulargewicht-Standards 

46


____________________________________________________________________________ 

gp80-cDNA-Sequenz


_________________________________________________________________________________________ 

-Standard VII Roche 

atg 

tga 

ctgcag 

cagctg 

Startcodon 

Stoppcodon 

PstI Erkennungssequenz 

PvuII Erkennungsseque nz 

48


_________________________________________________________________________________________ 

Restriktionskarte pUC 18/19 

PvuII 309 

PstI 439 

PvuII 631 

49


_________________________________________________________________________________________ 

Molekulargewichtsstandards 

50


_________________________________________________________________________________________ 

51

Versuch Proteine I 

_________________________________________________________________________________________ 

Proteine I 

Deckblatt: Proteine I 

Versuch GP Proteine I 

Analyse von Proteinen aus der Milch 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

........... Semester: ………… 

Studiengang: ................................................. 


Dr. K. Endres, R. Genswein 

Achtung: Für Proteine I, II und Kohlenhydrate I (Versuche 4-6) wird ein gemeinsames 

Protokoll erstellt, welches sie bitte nach dem letzten Versuch abgeben. 


Bemerkung: .......................................... 

Unterschrift des Betreuers: .......................................... 

52


_________________________________________________________________________________________ 

VERSUCH: Proteine I 

Milch ist ein komplexes Gemisch, das über den sekretorischen Pathway epithelialer 

Brust-Drüsen-Zellen gebildet wird. Es enthält Membran-umhüllte Fett Tröpfchen, Casein- 

Micellen und eine wässrige Phase. Der wässrige Anteil beinhaltet Laktose, komplexe 

Kohlenhydrate, Mineralien und weitere lösliche Komponenten. 

Sekretorische Alveolar-Zellen 

Linzell and Peaker [1971] 

Der Versuch soll Ihnen zeigen, wie die enthaltenen biochemischen Substanzklassen aus 

einem natürlich vorkommenden biologischen Sekret angereichert, quantifiziert und 

nachgewiesen werden können. Sie erhalten dazu vom Betreuer pro Gruppe eine 

Milchprobe, die Sie über insgesamt drei Versuchstage analysieren und deren Isolate Sie 

bis zum nachfolgenden Versuchstag sorgfältig aufzubewahren haben. 

Dabei sollen Sie ihre Proben immer wie folgt kennzeichnen: 

Gruppen-Nr., Praktikumstag (Di, Mi), Probenbezeichnung (z.B. Casein) 

Zeitplan: 

Versuchstag Proteine Lipide Zucker 

1 Bestimmung pH-Wert 

Fällung Casein und Molkeproteine 

Kristallisation der 

Laktose 

2 Trennung der Proteine auf der SDS- 

Auswiegen der Laktose 

PAGE 

Färben der phosphorylierten Proteine 

3 Beendigung der Phospho- 

Proteinfärbung 

Coomassie-Färbung der Proteine 

Lactase-Verdau der 

Laktose und DC 

53


_________________________________________________________________________________________ 

pH-Wert 

Proteine 

Quantitative und 

qualitative Analyse 

Zucker 

Gehalt 

Nachweis von 

Laktose 

Lipide 

Lipidspezies 

Cholesteringehalt 

Ihre Ergebnisse fassen Sie in einem alle drei Versuchstage umfassenden 

Praktikumsprotokoll zusammen. 

Auftrennung von Milchproteinfraktionen und Kristallisation von Laktose 

Theorie zu Milchproteinen 

Am ersten Versuchstag trennen Sie zwei Proteinfraktionen der Milch (Caseine und Molke 

Proteine) ab und kristallisieren aus der verbleibenden wässrigen Lösung (Sirte) die 

Laktose aus. 

Milchproteine: 

Milch enthält ca. 3,3% Proteinanteil und weist darin alle 

essentiellen Aminosäuren des Menschen auf. Der 

absolute Proteingehalt der Milch und die genaue 

Aminosäurezusammensetzung variiert mit dem Futter 

der Kühe und dem genetischen Hintergrund der Tiere. 

Es gibt zwei Hauptklassen von Milchproteinen, die sich 

durch ihre Zusammensetzung und ihre physikalischen 

Eigenschaften voneinander unterscheiden: 

Caseine bilden die Hauptproteinkomponente der Milch 

(82%) und liegen in sogenannten Casein-Micellen vor. 

Sie sind hochgradig phosphoryliert und präzipitieren bei 

pH-Werten unterhalb von 4,6. 

Die runden Casein-Micellen haben einen Durchmesser 

www.milkfacts.info/Milk%20 

Composition/protein.htm 

von 0,04 bis 0,3 µm und setzen sich aus verschiedenen Proteinen (-s1, -s2 und - 

Casein mit 24, 27 und 25 kDa) zusammen, die über Calcium-Phosphat-Brücken stabilisiert 

sind. Eine Lage -Casein (21 kDa) stabilisiert die Micellen auf der Oberfläche. 

54


_________________________________________________________________________________________ 

Ziegenmilch bildet insofern eine Ausnahme als kein -s2-Casein enthalten ist und diese 

Milch daher von Milch-Protein-Allergikern getrunken werden kann. 

Die Molke Proteine (18% der Milchproteine) hingegen liegen einzeln in der wässrigen 

Lösung vor. Sie enthalten keine Phosphat-Reste dafür finden sich viele Cysteinreste in der 

Aminosäure-Zusammensetzung. 50% der Molke Proteine sind -Lactoglobulin (VitaminA- 

Carrier, 18 kDa), 20% -Laktalbumin (Funktion bei der Laktose-Synthese, 16 kDa), zudem 

finden sich weiterhin Immunoglobuline, Lactoferrin, Transferrin (Eisenabsorption) und viele 

weitere Proteine und Enzyme in kleineren Mengen. 

Material: 

• pH-Papier 

• Essigsäure-Lösung 10% 

• Eiskaltes Aceton 

• Natriumcarbonat-Lösung 1M 

• Ethanol 95% 


Bestimmung des pH-Werts von Milch 

• Bestimmen Sie mittels pH-Papier den pH-Wert Ihrer Milchprobe. 

Fällung von Casein und Molke Proteinen 

• Erwärmen Sie 1,5 ml Milch in einem Eppendorf-Gefäße 10 min auf 40°C 

(Heizblock). 

• Wiegen Sie während der Inkubationszeit ein Eppendorf-Gefäß (2 ml) und ein 

Uhrglas aus und notieren Sie die Leergewichte. 

• Geben Sie zu der warmen Milch tropfenweise 55 µl 10%iger Essigsäure-Lsg. und 

invertieren Sie die Probe dabei mehrmals. 

• Bestimmen Sie erneut den pH-Wert Ihrer Probe. 

Wieso fallen die Caseine bei diesem pH-Wert aus? 

• Lassen Sie die Probe 5min bei RT abkühlen. 

• Zentrifugieren Sie nun 5min bei 13200 rpm. 

• Der Überstand enthält Molke Proteine und Zucker, das Pellet die Casein-Proteine. 

Überlegen Sie, wo Sie die Fette/ Lipide der Milch vermuten! 

• Überführen Sie den Überstand in das ausgewogene Eppendorf-Gefäß (2 ml). 

• Waschen Sie das Casein-Pellet mit 500 µl Aceton (eiskalt) und zentrifugieren Sie 

für 2 min bei 13200 rpm. 

55


_________________________________________________________________________________________ 

• Nehmen Sie nun das Aceton ab, überführen Sie das Pellet auf ein Uhrglas und 

trocknen Sie es bei 60°C ca. 1h (Trockenschrank). Nach dem Auswiegen des 

abgekühlten Uhrglases, wird das Casein in ein 2 ml-Eppendorf-Gefäß überführt und 

bei -20°C gelagert. 

• Versetzen Sie den Überstand (Molke Proteine und Zucker) mit 18 µl 

Natriumcarbonat-Lösung, es ergibt sich ein pH-Wert von 6. 

• Der Molke haltige Überstand wird für 10 min bei 75°C im Heizblock erwärmt (Molke 

Proteine fallen aus) und warm abzentrifugiert (1 min 13200 rpm, arbeiten Sie 

dabei möglichst zügig!). 

• Der Überstand enthält nun den Zucker, das Pellet die Molke-Proteine. 

• Pipettieren Sie den Überstand in ein 15 ml-Röhrchen. 

• Waschen Sie das Pellet mit den Molke Proteine mit 500 µl Aceton (eiskalt) und 

zentrifugieren Sie für 2 min bei 13200 rpm. 

• Nehmen Sie nun das Aceton ab und trocknen Sie das Pellet bei 60°C ca. 1h 

(Trockenschrank). 

• Nach dem Auswiegen des abgekühlten Eppendorf-Gefäßes, wird es bei -20°C 

gelagert. 

• Versetzen Sie den zuckerhaltigen Überstand (ca. 1,2 ml) mit dem 7,5 fachen 

Volumen an Ethanol (9 ml, 95%). 

• Lassen Sie das deutlich beschriftete Röhrchen im Kühlschrank (4°C) bis zum 

nächsten Versuchstag stehen. 

Pipettieren Sie 5 µl Ihrer Milchprobe in ein 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß. 

Dieses Aliquot Ihrer Proben benötigen Sie am zweiten Versuchstag für die SDS-PAGE. 

Sie sollten am Ende dieses Versuchstages pro Gruppe je ein Eppendorf-Gefäß mit den 

Caseinen bzw. den Molke Proteinen, ein Eppendorf-Gefäß mit 5 µl Milch und ein 

Röhrchen mit dem auskristallisierenden Milchzucker haben. Alle Proben werden bei -20°C 

bzw.4°C gelagert und an den folgenden Versuchstagen wieder ausgegeben. 

Wie sind die Ausbeuten ihrer Gruppe an Molke- und an Casein Proteinen? 

Vorbereitung des Trenngels für den nächsten Versuchstag! 

Das Trenngel wird wie auf S.58 und S. 59 beschrieben gegossen. Nach dem 

Auspolymerisieren wird es in eine Plastiktüte verpackt und bis zum folgenden 

Praktikumstag im Kühlschrank gelagert. 

56

Versuch Proteine II 

_________________________________________________________________________________________ 

Proteine II 

Deckblatt: Proteine II 

Versuch GP Proteine II 

Analyse von Proteinen aus der Milch 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

........... Semester: ………… 

Studiengang: ................................................. 




Bemerkung: .......................................... 


57


_________________________________________________________________________________________ 

VERSUCH Proteine II 

SDS-PAGE der Milchproteine und Auswiegen der Laktose 

SDS-PAGE der Milchproteine 

Theorie zu SDS-PAGE 

Eine einfache Methode zur Trennung von Biomolekülen ist die Elektrophorese. Für DNAund 

RNA-Fragmente werden hauptsächlich Agarosegele verwendet; für Proteine setzt 

man zumeist die SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamid gel electrophoresis) 

ein. 

SDS Acrylamid DTT 

Zunächst wird das Acrylamid durch radikalische Copolymerisation mit einem vernetzenden 

Bisacrylamid zu einem feinmaschigen polymeren Gitternetz verknüpft. Der Gehalt an 

Acrylamid bzw. Bisacrylamid bestimmt den Vernetzungsgrad des Gels und damit die 

Porengröße. Es sind 6 – 16 %ige Gele gebräuchlich, die je nach Größe der zu trennenden 

Proteine ausgewählt werden. 

Bei nativen Gelen (ohne SDS) wandern die Proteine in 

Abhängigkeit von ihrer Form und ihrer eigenen Ladung im 

elektrischen Feld. Die Wanderung kann dabei sowohl zur 

Anode als auch zur Kathode erfolgen. SDS denaturiert 

Proteine durch Bildung von Protein-SDS-Komplexen mit 

annähernd konstantem Ladung/Masse-Verhältnis und 

annähernd gleicher Form. Die Nettoladung aller mit SDS 

beladenen Proteine ist negativ, so dass sie sich zur Anode 

hinbewegen. Das Polymernetzwerk des Polyacrylamids bildet 

auf ihrem Weg - wie ein Molekularsieb - einen Widerstand, 

den die Proteine entsprechend ihrer Größe mehr oder minder 

leicht überwinden: Je kleiner ein Protein (mit seiner SDS- 

„Wolke“) ist, desto schneller wandert es im elektrischen Feld. 

Das Trennungsprinzip ist also die Größe der Proteine, 

genauer: der Stokes-Radius, der proportional ist zum 

Molekulargewicht der Proteine. 

Zusätzlich können Proteinproben mit Reduktionsmitteln (DTT: 

Dithiothreitol; -Mercaptoethanol) behandelt werden. Die 

58


_________________________________________________________________________________________ 

Behandlung führt zur Auftrennung von Disulfidbrücken (intra- und intermolekular), so dass 

eine weitere Denaturierung bzw. Aufspaltung von oligomeren Proteinkomplexen erfolgt. 

BSA 

Für eine größenmäßige Zuordnung der aufgetrennten Proteine 

bzw. Proteinuntereinheiten wird als Standard eine Mischung 

von Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht eingesetzt: 

Lysozym 

Roti-Mark (Roth) 

Unter Umständen sind nicht alle Proteine des 

Molekulargewichtsstandards zu sehen, da die kleinsten 

Proteine in der Lauffront migrieren oder auslaufen können 

(manchmal erwünscht, weil dann die Auftrennung größerer 

Proteine besser wird). Man beginnt daher bei der Bestimmung 

immer von der hochmolekularen Seite her. 

Material: 

• CIP-Puffer (B) 0,1M TrisHCl pH 7,5, 0,1M MgCl 2 

• CIP-Puffer mit CIP (A) (Calf intestine phosphatase, MBI,10 U/µl ) 

• Lämmlipuffer 2x 125 mM Tris•HCl, pH 6,8 

• DTT 1M 

0,01 % Bromphenolblau 

3 % SDS 

• Roti-Mark Proteinstandard 

• Acrylamid-/Bisacrylamid-Lösung 30 % Acrylamid / 0,8 % Bisacrylamid 

• Trenngelpuffer 3 M Tris•HCl, pH 8,8 

• Sammelgelpuffer 1 M Tris•HCl, pH 6,8 

• 10 % SDS 

• TEMED 

• 10 % APS 

• 10 x Elektrophoresepuffer 

• Fixierungs-Lösung 

• 0,01M NaOH 

250 mM Tris,1,9 M Glycin, 1 % SDS 

50% Methanol, 10% Essigsäure in Wasser 


Gießen der Gele: 

Je zwei Gruppen teilen sich ein Gel (Bitte miteinander absprechen!) 

Für die Gele werden die folgenden Volumina zusammenpipettiert (pro Gel): 

Wichtig: Zum Schluss werden TEMED und APS (Ammoniumperoxo- 

disulfat, Radikalstarter) zugegeben, invertiert und sofort das Gel gegossen. 

59


_________________________________________________________________________________________ 

Lösung 12%iges Trenngel 3%iges Sammelgel 

VE-Wasser 2095 µl 2295 µl 

Acrylamid/Bisacrylamid- 

Lösung 

1800 µl 300 µl 

Trenngelpuffer 560 µl / 

Sammelgelpuffer / 375 µl 

SDS (10%ig) 45 µl 30 µl 

APS 22,5 µl 15 µl 

TEMED 4,5 µl 3 µl 

• Die fertig angesetzte Trenngel-Lösung wird komplett zwischen die Glasplatten 

gegossen und mit etwas Wasser vorsichtig überschichtet. Dies soll eine ebene 

Geloberfläche gewährleisten. 

• Nach erfolgter Polymerisation (Bildung einer deutlichen Trennschicht) wird das 

Wasser abgegossen, restliches Wasser vorsichtig mit Filterpapier entfernt (ohne 

die Geloberfläche zu verletzen) und die Sammelgel-Lösung in den 

Plattenzwischenraum gegossen. 

• Nun wird schnell der Kamm eingesetzt (das Sammelgel polymerisiert schneller als 

das Trenngel!). 

Herstellung der Proben 

Während das Sammelgel polymerisiert, können Sie Ihre Proben vorbereiten: 

• Auftragspuffer 

Der Auftragspuffer besteht aus DTT (0,1M bzw.10% Volumenanteil) und einfach 

konzentriertem Lämmli-Puffer. Berechnen Sie, wieviel Auftragspuffer Sie für alle 

Proben benötigen, rechen Sie 50 µl hinzu und setzen Sie den Auftragspuffer für alle 

Proben gemeinsam an. 

• Casein 

Wiegen Sie ca. 1 mg Casein in ein Eppendorf-Gefäß ab und lösen Sie es in 0,01 M 

NaOH. Es lösen sich 1,2 mg in 1 ml NaOH, rechnen Sie entsprechend um. Für ein 

vollständiges Lösen des Proteins wird so lange bei 80°C im Heizblock inkubiert und 

zusätzlich gevortext bis die Proteine gelöst sind. 

Wenn das Casein gelöst ist erfolgt eine Dephosphorylierung: 

Ansatz A 

Ansatz B 

10 µl Casein-Lösung 10 µl Casein-Lösung 

10 µl CIP-Puffer+CIP 10 µl CIP-Puffer 

___________ 

_____________ 

20 µl 20 µl 

Mischen Sie die Proben z.B. durch Vortexen und zentrifugieren Sie sie kurz an. 

Inkubieren Sie nun 1h bei 37°C im Wasserbad. 

60


_________________________________________________________________________________________ 

Nach der Inkubation werden beide Ansätze mit 20 µl Auftragspuffer versetzt. 

• Milch-Probe: 5 µl + 95 µl Auftragspuffer 

• Molkeproteine: gesamte Ausbeute + 200 µl Auftragspuffer 

Alle Proben werden nach zugabe des Auftragspuffers 15 min bei 95°C inkubiert (alle 2- 

3 min Vortexen) und dann anzentrifugiert, um das Kondensat aus dem Deckel in die 

Probe zurückzuführen. 

• Die auspolymerisierten Mini-Gele werden in die Gelelektrophorese-Apparatur 

eingehängt. 

• Die Elektrodenräume werden mit Elektrophorese-Puffer aufgefüllt. 

• Der Deckel wird so aufgesetzt, dass die Pole der Kammer mit den Polen des 

Anschlusskabels farblich übereinstimmen. 

Dann werden die Proben bzw. der Marker mit einer 100µl-Pipette aufgetragen. 

Auftragsschema: 

Spur Probe 

Ziegenmilch-Vergleichsprobe wird Ihnen ausgegeben 

Auftragsvolumen 

1 Ziegenmilch Vergleich 10 µl 

2 Casein A GruppeX 15 µl 

3 Casein B GruppeX 15 µl 

4 Milch GruppeX 10 µl 

5 Molke GruppeX 2 µl 

6 Marker 5 µl 

7 Casein A GruppeY 15 µl 

8 Casein B GruppeY 15 µl 

9 Milch GruppeY 10 µl 

10 Molke GruppeY 2 µl 

• Die Elektrophorese der Gele erfolgt mit 1x Elektrophoresepuffer bei 140 bis 170 Volt 

etwa 60 Minuten. 

• Nachdem der Bromphenol-Farbstoff das untere Ende des Gels erreicht hat, werden die 

Gele aus der Apparatur genommen. 

• Die Gele werden in Glasschalen überführt und 1x5min mit Wasser auf dem 

Kippschüttler gewaschen. 

• 2X5 min mit Fixierungs-Lösung waschen 

61


_________________________________________________________________________________________ 

• Die Gele werden in 20 ml Fixierungslösung gelegt, über Nacht auf dem Kippschüttler 

inkubiert und dann bis zum nächsten Praktikumstag darin im Kühlschrank aufbewahrt. 

Trocknen und Auswiegen der Laktose 

Während die SDS-Gele laufen, wird die kristallisierte Laktose weiter aufbereitet. 

Wiegen Sie dazu eine Kristallisierschale aus und notieren Sie das Leergewicht. 

Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit Ihrer Laktose 2 min bei 2000rpm und RT. 

Nehmen Sie den Überstand bis ca. 0,5 cm über dem Pellet ab und geben Sie 1 ml frischen 

Ethanol hinzu. Überführen Sie nun die pelletierte Laktose in das ausgewogene 

Kristallisierschälchen und spülen Sie das Röhrchen mit 1 ml Ethanol nach. Geben Sie die 

Kristallisierschale für ca. 45 min bei 75°C in den Trockenschrank und wiegen Sie diese 

nach vollständigem Trocknen aus. 

Geben Sie pro mg Laktose 15 µl Wasser hinzu und lösen Sie die Laktose damit. 

Überführen Sie die Zucker-Lösung in ein 1,5 ml-Eppendorf-Gefäß und bewahren Sie 

dieses bei -20°C auf. 

Sie sollten am Ende dieses Versuchstages pro Gruppe ein Eppendorf-Gefäß mit Laktose 

und ein Gel in der Färbeschale haben. 

Wie ist die Ausbeute ihrer Gruppe an Laktose? 

Welche Proteine erwarten Sie auf dem gefärbten Gel zu sehen? Wie sind die 

Molekulargewichte? 

62

Versuch Kohlenhydrate 

____________________________________________________________________________ 

Kohlenhydrate I 

Deckblatt: Kohlehydrate 

Versuch GP Kohlenhydrate I 

Analyse von Laktose aus der Milch 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

........... Semester: ………… 

Studiengang: ................................................. 




Bemerkung: .......................................... 



_________________________________________________________________________________________ 

Analyse des Milchzuckers und Färben der SDS-PAGEs 

Färben von Phospho- und Gesamt-Proteinen der Milch 

Theorie zu Proteinphosphorylierung 

Die Phosphorylierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen, die in vielen 

Signalwegen der Zelle aber auch beim Transport von Proteinen eine Rolle spielt. Dabei 

können verschiedene Seitenketten von Aminosäuren als Akzeptor der Phosphatreste 

dienen wie z.B. Serin-, Threonin- oder Tyrosin-Reste. Im Falle der Caseine werden 

mehrere Serinreste im - und -Casein und ein einzelner Serinrest im -Casein durch 

Casein-Kinasen phosphoryliert. 

Die verwendete Färbelösung detektiert Phosphatreste unter UV-Licht mit einer Sensitivität 

von weniger als 1 ng -Casein (5 Phospho-Seryl-Reste). 

Nach der In-Gel-Färbung phosphorylierter Proteine kann die Gesamtheit aller Proteine mit 

einem unspezifischeren Farbstoff wie Coomassie-Brilliant-Blau angefärbt werden. 

CoomassieBrilliantBlauG250 

Der Farbstoff ist schwarz-blau bei pH7 und bildet eine farblose Leukoform bei 

Ansäuerung. Bindet der Farbstoff durch ionische Wechselwirkungen seiner 

Sulfonsäuregruppen mit positiv geladenen Amingruppen von Proteinen an 

Proteinmoleküle im Gel, so führt die eher neutrale Umgebung der Proteinmoleküle zu 

einer erneuten Blaufärbung. 

64


_________________________________________________________________________________________ 

Material: 

• Wasser 

• Pro-Q Diamond (Invitrogen) 

• Entfärbelösung: 0,05M Na-Acetat pH4, 20% Acetonitril 

• EzBlue-Färbelösung (Sigma) 


• Die Gele vom 2. Versuchstag werden 3x10 min mit Wasser gewaschen. 

• Dann wird das Wasser abgegossen, pro Gel 20 ml Phosdecor-Lösung in die 

Färbeschale pipettiert und 40 min auf dem Kippschüttler inkubiert. 

Sammeln Sie die verwendete Phosdecor-Lösung in dem dafür bereitgestellten 

Gefäß! 

• Nach der Phosdecor-Färbung werden die Gele für 40 min in Entfärbelösung 

gegeben (in dieser Zeit setzen Sie den Laktose-Verdau an!). 

• Die phosphorylierten Proteine werden mittels UV-Licht detektiert. 

• Anschließend werden die Gele 3x10 min mit Wasser gewaschen und für 40 min mit 

EzBlue (15 ml pro Gel) alle Proteine angefärbt (nach ca. 2 min werden Sie die 

ersten Proteine sehen!). 

(Während die Gele angefärbt werden, wird die Dünnschicht-Chromatographie der Zucker 

durchgeführt.) 

Sammeln Sie die verwendete EzBlueLösung in dem dafür bereitgestellten Gefäß! 

• Nach einer Entfärbung von 3x5min mit Wasser können die Gele eingescannt 

werden. 

Analyse des Milchzuckers 

Theorie zu Milchzucker 

Milch enthält durchschnittlich 4,9% Kohlenhydrate. Der Hauptanteil davon ist Laktose, 

während Monosaccharide und Oligosaccharide nur in Spuren vorhanden sind. Die Laktose 

ist ein Disaccharid aus Galaktose und Glukose, das durch das Enzym Lactase in die 

Monosaccharide aufgespalten werden kann. 

In wässriger Lösung kommen zwei Anomere der 

Laktose ( und ) vor, die permanent ineinander 

überführt werden. Laktose kristallisiert bei 

Überschreiten der Löslichkeit in Abhängigkeit der 

Temperatur: Temperaturen unter 20°C führen 

überwiegend zu -Monohydrat-Laktose-Kristallen. 

Diese Kristalle sind sehr hart und treten z.B. beim 

65


_________________________________________________________________________________________ 

wiederholten Auftauen und Einfrieren von Eiscreme auf. 

Zucker können z.B. durch ihre unterschiedliche Polarität mittels 

Dünnschicht-Chromatographie aufgetrennt werden. Als Nachweisreagenz 

dient in diesem Praktikum eine schwefelsäurehaltige ethanolische 

Anisaldehyd-Lösung, die die Zucker in einer charakteristischen Färbung 

nachweist: 

Glukose: hellblau 

Galaktose: grün 

Laktose: türkisgrün 

Anisaldehyd 

Material: 

• Lactase-Lösung: 100mg/ml Wasser entspricht 1,12 U/µl 

• Laktose-Lösung: kristallisierte Laktose von Versuchstag 2 in Wasser 

• Zucker-Lösungen (kommerzielle Laktose, Glukose, Galaktose): 5 mg/ml 

• Kieselgel-DC-Platten 

• Anisaldehyd-Färbelösung (90ml 99,5%iges p.a. Ethanol + 5ml konz. Schwefelsäure 

+ 1ml Eisessig + 5ml Anisaldehyd) 

• DTT (1M) 

• DC-Laufmittel : Ethylacetat / iso-Propanol / H 2 O 

• 50 / 40 / 10 

d.h. 1000µl / 800µl / 200µl = 2 ml 


Für den Laktose-Nachweis durch Verdau mit Laktase werden pro Gruppe zwei Ansätze 

benötigt: 

Ansatz 1 Ansatz 2 

5 µl Laktose-Lösung 5 µl Laktose-Lösung 

20 µl Wasser 20 µl Wasser 

2 µl DTT (1M) 2 µl DTT (1M) 

2 µl Lactase - 

Mischen Sie die Proben z.B. durch Vortexen und 

zentrifugieren Sie sie kurz an. 

Beide Ansätze werden 30 min bei 37°C inkubiert. 

Dann werden 2 µl der Ansätze 1 und 2 und je 1 µl 

der Vergleichszuckerlösungen auf einer 

X X X X X 

Ansatz1 Ansatz2 Glukose Galaktose Laktose 

66


_________________________________________________________________________________________ 

Kieselgel-DC (3*10 cm) aufgetrennt. Aufgetragen werden die Proben mit Glaskapillaren 

auf einer Startlinie ca. 1 cm über dem unteren Rand. Markieren Sie die Auftragsorte 

vorsichtig mit Bleistift. 

• Laufmittel in der trockenen Glaskammer ansetzen (Boden darf nicht mehr als 0.5 

cm bedeckt sein!), mit Deckel verschließen, kurz schwenken 

• DC-Platte vorsichtig mit der Pinzette in Kammer stellen. Deckel auflegen. 

Lösungsmittelfront soll bis kurz vor das Ende der Platte laufen (dauert ca. 60 min). 

• Markieren Sie sofort bei Entnahme der Platten die Lauffront mit Bleistift. 

• Trocknen Sie die Platte 5 min unter dem Abzug und besprühen Sie sie dann mit 

wenig (!) Anisaldehyd-Lösung. 

• Die Platten werden ca. 10 min auf der Heizplatte (100°C) entwickelt. 

• Markieren Sie die aufgetretenen Substanzflecken mit Bleistift, notieren Sie 

eventuelle Farbunterschiede und Scannen Sie die DCs ein. 

Sie sollten am Ende dieses Versuchstages eine Datei mit Ihrer eingescannten DC und 

Dateien mit Ihren Gelbildern haben. 

Auswertung: 

Sie fassen nun Ihre während der 3 Versuchstage gesammelten Ergebnisse in einem 

Protokoll zusammen: 

Milchprobe Nr. 

pH-Wert 

vor Zugabe Essigsäure 

nach Zugabe Essigsäure 

Caseinanteil in mg/l 

Molkeproteinanteil mg/l 

Laktose-Konzentration 

mg/l 

• Vergleichen Sie die erhaltenen Ergebnisse mit Literaturwerten. 

• Bestimmen Sie den „Milchtyp“, den Sie als Probe hatten, anhand Ihrer Ergebnisse. 

• Diskussion zu SDS-PAGE: beobachtete MW, Phosphorylierung von Proteinen etc. 

• Diskussion zu DC Lactose 

Literatur: 

• http://www.milkfacts.info/Milk%20Composition/Milk%20Composition%20Page.htm 

• Mechanism of milk secretion, Linzell and Peaker Physiol. Rev..1971; 51: 564-597 

67

Versuch Leitenzyme 

____________________________________________________________________________ 

Enzymkinetik 

Deckblatt : Enzymkinetik 

Versuch GP Enzymkinetik 

Alkalische Phosphatase 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

........... Semester: ………… 

Studiengang: ................................................. 


Dr. R. Postina, J. Mondani 


Bemerkung: .......................................... 


Versuch Enzymkinetik 

_________________________________________________________________________________________ 

Michaelis-Menten-Kinetik der Alkalischen Phosphatase 

Aufgabenstellung: 

Ermittlung der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (V max ), der Michaelis-Menten-Konstante (K M ) und 

der Wechselzahl (k +2 ) einer enzymatischen Reaktion in Ab- und Anwesenheit eines Inhibitors. 

Lerninhalt: 

Enzym, Gleichgewichtskonstante, Aktivierungsenergie, Enzym-Substrat-Komplex, Michaelis-Menten- 

Gleichung, Lineweaver-Burk-Auftragung, Maximalgeschwindigkeit, Wechselzahl, Michaelis-Menten- 

Konstante, kompetitive und nichtkompetivite Hemmung 

Grundlagen zur Michaelis-Menten-Kinetik: 

Ein einfaches Modell zur Beschreibung der kinetischen Eigenschaften enzymkatalysierter 

Reaktionen wurde von L. Michaelis und M. Menten vorgeschlagen. Sie gingen von der 

Annahme aus, dass ein Enzym-Substrat-Komplex (ES) ein notwendiges Zwischenprodukt 

darstellt und der Zerfall dieses Komplexes in freies Enzym (E) und Produkt (P) der 

geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist. Die erste Voraussetzung ist bei 

enzymkatalysierten Reaktionen immer gegeben, die zweite meistens auch. 

k +1 k +2 

E + S ES E + P 

k -1 k -2 

Normalerweise ist die Rückreaktion E + P ES so unwahrscheinlich, dass man k -2 

vernachlässigen kann. Wenn alle Enzymmoleküle in Form von ES vorliegen, ist die 

maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht: 

V max = k +2 * [ES] =k +2 * [E total ] 

Wenn man die Anzahl der aktiven Zentren eines Enzyms kennt, lässt sich aus der 

Maximalgeschwindigkeit die Wechselzahl berechnen: dies ist die Anzahl der maximal 

umgesetzten Substratmoleküle pro Enzymmolekül und Minute. Bei Enzymen, die der 

Michaelis-Menten-Kinetik folgen, ist die Wechselzahl mit k +2 identisch. 

Unter Berücksichtigung der genannten Voraussetzungen lässt sich die Michaelis-Menten- 

Gleichung herleiten (die exakte Herleitung ist z.B. in den Lehrbüchern der Biochemie, hier 

z.B Stryer durchgeführt). Sie beschreibt die Reaktionsgeschwindigkeit (v) folgendermaßen: 

V max * [S] 

v = ---------------- 

K M + [S] 

69


_________________________________________________________________________________________ 

Dabei ist die Michaelis-Menten-Konstante K M definiert als: 

k -1 + k +2 

K M = ---------- 

k +1 

K M ist die Substratkonzentration, bei der die Reaktion mit halbmaximaler Reaktionsgeschwindigkeit 

abläuft. Damit ist K M ein Maß für die Bindungsstärke (oder Affinität) eines 

Substrates für ein Enzym. Der K M -Wert ist eine Materialkonstate des Enzyms und hängt 

nicht von den Konzentrationen der Substrate oder des Enzyms ab. 

Bei einer Auftragung von V und [S] im Michaelis-Menten-Diagramm ergibt sich eine 

Hyperbel. V max und K M lassen sich in diesem Diagramm nur ungenau bestimmen. 

Am einfachsten lassen sich K M und V max bestimmen, indem man 1/v und 1/[S] in einer 

doppeltreziproken Auftragung nach Lineweaver-Burk aufträgt. Die Werte für –1/K M und 

1/V max lassen sich dabei aus den Achsenabschnitten ablesen. Der Abszissenwert muss 

dabei, da im Experiment keine negativen Substratkonzentrationen eingesetzt werden 

können, durch Extrapolation ermittelt werden. K M und V max gelten nur für ein definiertes 

Enzym-Substrat-Paar unter genau definierten Reaktionsbedingungen (pH-Wert, 

Temperatur etc.). 

Kompetitive bzw. nichtkompetetive Hemmung: 

Eine Substanz mit struktureller Ähnlichkeit zum Substrat kann an das aktive Zentrum des 

Enzyms binden. Da nun weniger aktive Zentren zur Verfügung stehen, wird die 

Geschwindigkeit für die Substratumsetzung verlangsamt. Hierdurch ändert sich K M . V ma , 

bleibt unverändert, da durch Zugabe von mehr Substrat der Inhibitor vollständig vom 

aktiven Zentrum verdrängt werden kann. Diese Form der Hemmung bezeichnet man als 

kompetitive Hemmung. 

Nichtkompetitive Hemmung liegt vor, wenn der Inhibitor sich nicht an der Substratbindungsstelle 

des Enzyms anlagert, aber dennoch das Enzym in seiner Effektivität stört. 

Bei nichtkompetitiver Hemmung eines Enzyms ändert sich V max aber K M bleibt 

unverändert. 

70


_________________________________________________________________________________________ 

Alkalische Phosphatase: 

Die Alkalische Phosphatase ist ein Enzym das Proteine dephosphoryliert. Als 

nichtphysiologisches Testsubstrat für Alkalische Phosphatase verwendet man 

üblicherweise p-Nitrophenylphosphat. Die Abspaltung des Phosphatrests führt zur Bildung 

eines p-Nitrophenolates, das sich im alkalischen Milieu aufgrund seiner gelben Farbe 

photometrisch gut quantifizieren lässt. 

Die jeweils verwendete Substratkonzentration ist Tabelle 1 zu entnehmen, die 

Konzentration des entstehenden Produktes wird photometrisch bestimmt. Mit Hilfe dieser 

Daten werden V max , K M und die Wechselzahl des Enzyms bestimmt. 

Material: 

Enzym: Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm EC 3.1.3.1, molare Masse ca. 

100.000 g/mol, die Konzentration der Enzymstammlösung ist: Eo=0,29 µg/µl. 

Puffer: 0.1M Glycinpuffer pH 10; 1mM Magnesiumchlorid und 0.1 mM Zinkchlorid. 

Substratstammlösungen: p-Nitrophenylphosphat 

Tabelle 1: p-Nitrophenylphosphat-Stammlösungen 

Bezeichnung A B C D E F G 

Konzentration 

[M] 

3,3*10 -4 1,0*10 -3 3,3*10 -3 1,0*10 -2 3,3*10 -2 1,0*10 -1 2,0*10 -1 

Inhibitorstammlösung: 0,06M Na 2 HPO 4 in Wasser gelöst (Inhibitor A) 

bzw. 0,06M ATP in Wasser gelöst (Inhibitor B) 

Die Verwendung des nichtphysiologischen Substrats p-Nitrophenylphosphat erlaubt die 

einfache photometrische Registrierung des Umsatzes (Extinktionsmessung bei 436 nm). 


Aufnahme der Umsatzgeraden 

Enzymatische Reaktion ohne Inhibitor 

• In die Küvette (Schichtdicke: d = 1cm) werden 3ml Puffer (s.o.) gefüllt. 

• Dazu werden 100l der jeweiligen Substratstammlösung (Tabelle 1) gegeben. 

Die Reaktion wird durch Zugabe von 50l Enzymlösung in Gang gesetzt. Der gesamte Ansatz 

in der Küvette muss unbedingt intensiv durchmischt werden. Dazu verschließt man 

die Küvette mir Parafilm und mischt durch Invertieren. Sofort danach wird die Extinktion 

bei = 436nm ( 436 = 6300 [L x mol -1 x cm -1 ]) im Eppendorfphotometer gemessen. Der 

erste Messwert nach dem Einbringen der Probe ist der T 0 -Wert, danach wird die Extinktion 

im zeitlichen Abstand von 30 Sekunden abgelesen. Nach 3 Minuten kann die Messung 

abgebrochen werden (insg. 7 Messwerte, 0.050.5). Die bei T 0 gemessene 

Grundextinktion wird von den im Folgenden gemessenen Extinktionen abgezogen. Bitte 

jedoch auch die Grundextinktion im Versuchsprotokoll angeben. 

71


_________________________________________________________________________________________ 

Enzymatische Reaktion mit Inhibitor 

• In die Küvette (Schichtdicke: d = 1cm) werden 2,95 ml Puffer (s.o.) gefüllt. 

• Dazu werden 50µl der Inhibitorstammlösung und 100l der jeweiligen 

Substratstammlösung (Tabelle 1) gegeben. 

Im Weiteren wird wie oben beschrieben verfahren. 

Aufnahmen der Messwerte und durchzuführende Berechnungen: 

Als Messparameter wird die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit der Reaktionszeit 

aufgenommen. 

Die Reaktionsgeschwindigkeit einer chemischen bzw. enzymatischen Reaktion (V) ist über 

die Änderung der Konzentration eines Reaktanden in Abhängigkeit der Zeit definiert. 

V=dC/dt 

Ändert sich während der enzymatischen Reaktion aufgrund einer Farbänderung das 

Extinktionsvermögen der Lösung, dann gilt das Lambert-Beersche-Gesetz: 

C=E/*d 

(C: Konzentration des Produktes; : molarer dekadischer Extinktionskoeffizient; d: 

Schichtdicke des Strahlenganges) 

Für den durchgeführten Versuch gilt: 

Das Produkt ist p-Nitrophenolat, dessen Extinktionskoeffizient ist 6300 l/(mol*cm), die 

Schichtdicke beträgt 1 cm, das Testgesamtvolumen sind 3150 µl wobei von den Substrat- 

Stammlösungen jeweils 100µl eingesetzt wurden. 

In der folgenden Tabelle sind zunächst die Extinktionsmesswerte einzutragen, dann 

müssen die entsprechenden Konzentrationen berechnet und eingetragen werden. 

Weiterhin ist die tatsächlich im Test vorhandene Substratkonzentration zu berechnen. 

Diese wird bei allen folgenden Berechnungen benötigt. 

72


_________________________________________________________________________________________ 

Ohne Inhibitor 

Tabelle 2 

Zeit 

[min] 

Substratkonzentration der Stammlösung [M] 

3,3*10 -4 1,0*10 -3 3,3*10 -3 1,0*10 -2 3,3*10 -2 1,0*10 -1 2,0*10 -1 

Substratkonzentration in der Test-Küvette [M] 

0 Extinktion 0 0 0 0 0 0 0 

0 Konzentration des 

p-Nitrophenolats 

[M] 

0 0 0 0 0 0 0 

0,5 Extinktion 

0,5 Konzentration des 


[M] 

1 Extinktion 



[M] 




[M] 




[M] 




[M] 




[M] 

Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit: 

Die Geschwindigkeit der Produktentstehung ist, da stets die gleiche Menge an Enzym 

vorhanden war, alleine abhängig von der verwendeten Substratkonzentration. Für jeder 

der eingesetzten Substratkonzentrationen (Tabelle 2, Zeile 4) ist die entsprechende 

Reaktionsgeschwindigkeit durch Auftragung der Konzentration des gebildeten p- 

Nitrophenolats [M] gegen die Reaktionszeit [min] zu ermitteln. Die Zeitpunkte und die 

Zahlenwerte für die Konzentration des entstandenen p-Nitrophenolats sind der 

ausgefüllten Tabelle 2 zu entnehmen. Die Reaktionsgeschwindigkeit (v) entspricht dabei 

der jeweiligen Steigung der Geraden im entsprechenden Diagramm C [M] gegen t [min]. 

Die Reaktionsgeschwindigkeit hat demnach folgende Einheit: [M/min] bzw. [mol/(l*min)]. 

73


_________________________________________________________________________________________ 

Die in den Diagrammen ermittelten Werte für v sind in Tabelle 3 einzutragen, weiterhin ist 

Tabelle 3 zu vervollständigen. Bei der Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit die 

Ergebnisse keinesfalls runden! 

Tabelle 3 

S: 

Substratkonzentration im 

Test 

[M] 

1/S V 

[M/min] 

1/V 

[min/M] 

74


_________________________________________________________________________________________ 

Mit Inhibitor 

Tabelle 4 

Substratkonzentration der Stammlösung [M] 

3,3*10 -4 1,0*10 -3 3,3*10 -3 1,0*10 -2 3,3*10 -2 1,0*10 -1 2,0*10 -1 

Zeit 

[min] 

Substratkonzentration in der Test-Küvette [M] 

0 Extinktion 0 0 0 0 0 0 



0 0 0 0 0 0 0 

[M] 




[M] 




[M] 




[M] 




[M] 




[M] 




[M] 

Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit: 

Die Geschwindigkeit der Produktentstehung ist, da stets die gleiche Menge an Enzym und 

Inhibitor vorhanden war, alleine abhängig von der verwendeten Substratkonzentration. Für 

jede der eingesetzten Substratkonzentrationen (Tabelle 4, Zeile 4) ist die entsprechende 

Reaktionsgeschwindigkeit durch eine Auftragung der Konzentration des gebildeten p- 

Nitrophenolat [M] gegen die Reaktionszeit [min] zu ermitteln. Die Zeitpunkte und die 

Zahlenwerte für die Konzentration des entstandenen p-Nitrophenolats sind der 

ausgefüllten Tabelle 4 zu entnehmen. Die Zeitpunkte und die Zahlenwerte für die 

Konzentration des entstandenen p-Nitrophenolats sind der ausgefüllten Tabelle 2 zu 

75


_________________________________________________________________________________________ 

entnehmen. Die Reaktionsgeschwindigkeit (v) entspricht dabei der jeweiligen Steigung der 

Geraden im entsprechenden Diagramm C [M] gegen t [min]. 

Die Reaktionsgeschwindigkeit hat demnach folgende Einheit: [M/min] bzw. [mol/(l*min)] 

Die in den Diagrammen ermittelten Werte für v sind in Tabelle 5 einzutragen, weiterhin ist 

Tabelle 5 zu vervollständigen. Bei der Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit die 

Ergebnisse keinesfalls runden! 

Tabelle 5 

S: 

Substratkonzentration im 

Test 

[M] 

1/S V 

[M/min] 

1/V 

[min/M] 

76


_________________________________________________________________________________________ 

Ergebnisse: 

V max und K M sollen anhand der Lineweaver-Burk-Auftragung ermittelt werden (nicht 

anhand des Michaelis-Menten-Diagramms). 

ohne Inhibitor 

bei der linearen Regression der Auftragung 1/S gegen 1/V ergibt sich: 

1/V=1/S *...... + ......... 

bei 1/S = 0 ist 1/V max = .............. [min/M] 

daher ist V max = ................ [M/min] 

bei 1/V = 0 ist 1/S = -1/K M = .............. [M -1 ] 

daher ist K M = ................. M 

[ 

E total 

[ Eo] 

Volumen der eingesetzten Enzymstammlösung [ µl] 

] 

Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes 

[ µl] 

Molmasse des Enzyms[ 

µg / µmol] 

=..................M 

Wechselzahl = V max / [E total ] 

Die Wechselzahl (k +2 ) ist: ..............sec -1 

mit Inhibitor 

bei der linearen Regression der Auftragung 1/S gegen 1/V ergibt sich: 

1/V=1/S *....... + .......... 

bei 1/S = 0 ist 1/V max = ............ [min/M] 

daher ist V max = .......... [M/min] 

bei 1/V = 0 ist 1/S = -1/K M = ........... [M -1 ] 

daher ist K M = ........... M 

[E total ] = ............M 

Die Wechselzahl (k +2 ) ist: ..............sec -1 

Diskussion: 

Kann man den Reaktionsverlauf der Alkalischen Phophatase mit der Michaelis-Menten- 

Kinetik beschreiben? 

Um welche Art der Inhibition handelt es sich im durchgeführten Experiment? 

Wie wirkt sich der Inhibitor auf V max , K M und die Wechselzahl aus? 

77


_________________________________________________________________________________________ 

Leitenzyme 

Deckblatt: Leitenzyme 

Versuch GP Leitenzyme 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

........... Semester: ………… 

Studiengang: ................................................. 

Betreuerin: 

Dr. E. Kojro, J. Mondani 


Bemerkung: .......................................... 


78


_________________________________________________________________________________________ 

Leitenzyme 

a) Aufschluss von Lebergewebe / Fraktionierte Zentrifugation / Aufschluss von 

Mitochondrien / Nachweis von Leitenzymen im Cytosol und Mitochondrien- 

Plasma 

Etwa 5 g Schweineleber werden als Brei in 35 ml Sucroselösung (0,25 M) gegeben und 

anschließend unter Kühlung ca. 1 min im Homogenisator nach POTTER bei 1000 U/min 

homogenisiert. Alle nachfolgenden Schritte der Präparation werden unter Kühlung 

durchgeführt. 

Das Homogenat wird in einer Kühlzentrifuge 15 min bei 750 g (2500 U/min) zentrifugiert. 

Der Überstand wird vorsichtig vom Sediment (Gewebereste, Zellen und Zellkerne) 

abdekantiert und 15 min bei 20.000 g (13000 U/min) zentrifugiert. 

Nach dem Abdekantieren wird der Überstand (Ü 2) im Eisbad aufbewahrt. Das Sediment 

enthält die Mitochondrien, die in 8 ml Sucroselösung resuspendiert und wieder 10 min bei 

20.000 g zentrifugiert werden. Dieser Waschvorgang wird einmal wiederholt. 

Anschließend werden die Mitochondrien in 3 ml Trispuffer (0,05 M; pH 7,4) aufgenommen 

und mit einem Ultra-Turrax-Homogenisator 2 min desintegriert. (Die Desintegration sollte 

nicht zusammenhängend erfolgen, sondern von kurzen Pausen unterbrochen werden, z.B. 

30 sec Desintegration, 30 sec Pause usw.) 

Dieses Homogenat wird 15 min bei 38.000 g (18.000 U/min) zentrifugiert und dabei in 

Mitochondrienmembranen (Sediment) und Mitochondrienplasma (Überstand) getrennt. 

Der Überstand (Ü2) der Mitochondrienfraktion wird in der Ultrazentrifuge 45 min bei 

100.000 g (40.000 U/min) zentrifugiert. Dabei sedimentieren die Mikrosomen, der Überstand 

ist das Cytoplasma. 

In den folgenden Versuchen werden Mitochondrienplasma und Cytoplasma mit dem 

optischen Test auf die Anwesenheit von Glutamat-Dehydrogenase, Isocitrat-Dehydrogenase 

(NADP + -spezifisch) und Lactat-Dehydrogenase geprüft. 

Die für die Reaktionen benötigten Reagenzien: Puffer, Substratlösung, Coenzymlösung 

usw. werden direkt in eine Küvette (d = 1 cm) pipettiert. Die Extinktion wird bei = 340nm 

gemessen. 

b) Glutamat-Dehydrogenase-Test 

Reaktionsansatz 1): 

2,60 ml Imidazolpuffer (0,05 M; pH 7,3) 

0,20 ml 2-Oxoglutaratlösung (0,2 M) 

0,05 ml Ammoniumacetatlösung (3,2 M) 

0,04 ml NADH-Lösung (0,014 M) 

0,03 ml EDTA-Lösung (0,03 M) 

Start der Reaktion durch Zugabe von 0,02 ml Mitochondrienplasma 

Die Extinktion wird alle 20 Sekunden abgelesen bis das Gleichgewicht erreicht ist. 

Diagramm : E vs. t 

Der Start der Reaktion erfolgt durch Zugabe von 0,02 ml Cytoplasma. Die Extinktion wird 

alle 30 Sekunden über den gleichen Zeitraum wie bei "1" abgelesen und in das gleiche 

Diagramm eingetragen. 

79


_________________________________________________________________________________________ 

c) Isocitrat-Dehydrogenase-Test 


2,6 ml Trispuffer (0,05 M, pH 7,4) 

0,1 ml Isocitrat (0,04 M) 

0,3 ml NADP + -Lösung (0,0015 M) 

0,1 ml Mangansulfatlösung (0,02 M) 

Start der Reaktion durch Zugabe von 0,08 ml Mitochondrienplasma 

Extinktion alle 30 Sekunden über 8-10 Minuten ablesen 

Diagramm : E vs. t 

In einem weiteren Reaktionsansatz "4" analog "3" wird die Reaktion durch Zugabe von 

0,08 ml Cytoplasma gestartet, die Extinktion in der gleichen Weise wie bei "c" abgelesen 

und in das Diagramm eingetragen. 

d) Lactat-Dehydrogenase-Test 


• 2,80 ml Phosphatpuffer (0,1 M; pH 7,0) 

• 0,10 ml Na-Pyruvatlösung (0,023 M) 

• 0,05 ml NADH-Lösung (0,014 M) 

Reaktion durch Zugabe von 0,05 ml Mitochondrienplasma starten. 

Die Extinktion alle 30 Sekunden über 6-8 Minuten ablesen 

Diagramm E vs. t eingetragen. 

In einem weiteren Reaktionsansatz "6" analog "5" wird die Reaktion durch Zugabe von 

0,05 ml Cytoplasma gestartet, die Extinktion in der gleichen Weise wie bei "5" abgelesen 

und in das Diagramm eingetragen. 

80


_________________________________________________________________________________________ 

Fraktionierte Zentrifugation subzellulärer Organellen 

Bestimmung der Leitenzyme 

Leber 

Fleischwolf Homogenisator 750 g 

(2500 rpm) 

15 min 

Ü1 

P1 

Zellkern 

Zellen 

20 000 g 

(13 000 rpm) 


2 x 

Suspendieren 

Sucrose 

P2 

Ultraturrax 

38 000 g 

(18 000 rpm) 


Ü4 

GDH 

ICDH (NADP ) 

LDH 

Mitochondrienplasma 

Mitochondrienmembran 

20 000 g 

(13 000 rpm) 


Ü2 

P2 

Mitochondrien 

Lysosomen 

Peroxisomen 

(Microbodies) 

100 000 g 

(40 000 rpm) 


Ü3 

Cytosol 

Ribosomen 

ER-Bruchstücke 

Plasmamembran 

GDH 

ICDH(NADP ) 

LDH 

+ 

+ 

81

Versuch Proteasen 

_________________________________________________________________________________________ 

Proteasen 

Deckblatt: Protease 

Versuch GP Protease 

Protease-Verdau von Albumin 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

........... Semester: ………… 

Studiengang: ................................................. 


Dr. E. Kojro, A. Kanarek 


Bemerkung: .......................................... 


82


_________________________________________________________________________________________ 

Einführung: Proteasen 

Als Proteasen bezeichnet man Enzyme, die eine spezifische Spaltung von 

Peptidbindungen durch Hydrolyse katalysieren. 

Proteasen arbeiten bei Verdauungsvorgängen (z. B. Pepsin im Magen; Trypsin, 

Chymotrypsin und Carboxypeptidase A im Dünndarm); sie spielen aber auch bei vielen 

anderen biochemischen Vorgängen eine wichtige Rolle. So werden viele Enzyme durch 

proteolytische Spaltung erst aktiviert (Trypsin etwa wird vom Pankreas als eine inaktive 

Vorstufe sezerniert und erst im Duodenum durch Abspaltung eines sechs Aminosäuren 

langen Peptides vom Aminoterminus in die aktive Form überführt), während andere durch 

proteolytischen Abbau ausgeschaltet werden. Auch bei so komplexen Vorgängen wie der 

Blutgerinnung oder der Aktivierung des Komplementsystems sind Proteasen entscheidend 

beteiligt. Proteolytische Enzyme variieren in ihrer Spezifität, d. h. sie können nur 

bestimmte Peptidbindungen in Proteinen spalten. Subtilisin, eine bakterielle Protease, 

unterscheidet fast nicht zwischen den Aminosäureseitenketten, neben denen es spaltet. 

Anders das Trypsin, das nur Peptidbindungen auf der Carboxyseite von Lysin oder Arginin 

spaltet. Thrombin, das eine wichtige Rolle bei der Aktivierung der Blutgerinnung spielt, ist 

sehr spezifisch: es spaltet nur Arginin-Glycin-Bindungen in ganz bestimmten 

Peptidsequenzen. 

Für viele Proteasen konnte der Mechanismus ihrer enzymatischen Wirkung aufgeklärt 

werden. Man unterscheidet vier große Gruppen: 

(1) Serin-Proteasen 

Eine Triade aus Serin, Histidin und Aspartat bildet bei allen Serin-Proteasen das 

katalytische Zentrum. Zu dieser Familie gehören Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin und 

Elastase. 

(2) Metallo-Proteasen 

Die Enzyme dieser Gruppe haben ein Metall-Kation (Zn2+, Ca2+ oder Mn2+) im aktiven 

Zentrum eingebaut, das an der Spaltung der Peptidbindung beteiligt ist. Carboxypeptidase 

A ist ein Vertreter dieser Gruppe. 

(3) Cystein-Proteasen 

Im aktiven Zentrum befindet sich ein Cystein, das ähnlich dem Serin der Serin-Proteasen 

wirkt. Papain (wird aus der Frucht Papaya isoliert) fällt in diese Klasse. 

(4) Aspartat-Proteasen 

Das aktive Zentrum dieser Enzyme enthält zwei Aspartat-Reste, und ihr pH-Optimum liegt 

bei pH 2-3. Daher werden diese Enzyme auch als "saure Proteasen" bezeichnet. Ein 

Vertreter dieser Gruppe ist das Pepsin, die wichtigste Protease im Magensaft. 

83


_________________________________________________________________________________________ 

Für viele Proteasen existieren spezifische Inhibitoren. In den meisten Fällen binden diese 

an das aktive Zentrum der Enzyme. Beispiele sind das Hexapeptid Pepstatin, das alle 

sauren Proteasen hemmt, oder Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) als spezifischer 

Hemmstoff für Serin-Proteasen. Im Blut von Wirbeltieren befinden sich eine Reihe von 

Proteasen, die an den physiologischen Prozessen der Blutgerinnung und der Fibrinolyse 

beteiligt sind. Außerdem werden bei Entzündungen Proteasen (z. B. Elastase) von Zellen 

des Immunsystems freigesetzt. Zusätzlich zu diesen körpereigenen Enzymen können im 

Blut Proteasen von eingedrungenen Mikroorganismen auftreten. 

Es ist offensichtlich, dass jede proteolytische Reaktion, sofern sie unkontrolliert abläuft, 

eine Gefahr für die Zelle oder den Organismus darstellt. Die Aktivität der Proteasen muss 

daher sorgfältig reguliert werden. Im Blut schützen spezialisierte Proteine, sog. Protease- 

Inhibitoren, den Organismus vor proteolytischen Angriffen. Nach Albumin und den 

Immunglobulinen stellen Protease-Inhibitoren mengenmäßig die drittgrößte Gruppe der 

Plasmaproteine dar. Unter diesen wiederum sind die bedeutendsten der 1-Protease- 

Inhibitor (=1-antitrypsin Inhibitor), der ein spezifischer Inhibitor für Elastase ist, sowie das 

2-Makroglobulin, das verschiedene Typen von Proteasen inaktivieren kann. 

Experiment: Protease-Verdau von Albumin 

In diesem Experiment wird das Protein Albumin mit zwei verschiedenen Proteasen 

gespalten. Aufgrund der unterschiedlichen Spezifitäten entstehen hierbei verschiedene 

Fragmente. Anhand der SDS-PAGE soll die Proteaseaktivität sowie die Wirkung des 

alpha1-Antitrypsin-Inhibitor (a1) beurteilt werden. Die Gelelektrophorese wird mit einem 

10%-igen Gel nach Laemmli durchgeführt. 

Protease-Verdau von Albumin 

Materialien/Lösungen: 

Natriumphosphatpuffer (50mM, pH= 7,4) 

Rinderserumalbumin = BSA (0,4mg/ml) 

Trypsin = Try (1mg/ml) 

Elastase = Ela (2mg/ml) 

alpha1-Antitrypsin-Inhibitor = a1 (2mg/ml) 

4x Probenpuffer 

Dithiothreitol = DTT (1M) 

Molekulargewichtstandard von Fermentas 

MP- H 2 O 

InstantBlue 

84


_________________________________________________________________________________________ 

Vorgehensweise: 

In der Woche vor dem eigentlichen Versuchstag wird das Trenngel gegossen: 

Trenngel 10% (4,5ml) 

MP-Wasser 2367µl 

3M Tris pH= 8,9 563µl 

10%SDS 45µl 

Acrylamid 1503µl 

10%APS 27µl 

TEMED 

3,5µl 

Tube mehrmals 

invertieren! 

Die Lösung mehrmals invertieren und die gesamte Lösung zwischen die 

Glasplatten gießen 

Gel mit MP-H 2 O überschichten 

Nach der Polymerisation das H 2 O auf dem Gel belassen, das Gel in eine Plastiktüte 

packen und in den Kühlschrank stellen 

Am Versuchstag zuerst das Sammelgel auf das schon aus der letzten Woche vorhandene 

Trenngel gießen. Wir benötigen einen Kamm mit 15 Spuren. 

Sammelgel 5% (4ml) 

MP-Wasser 2720µl 

0,5M Tris pH=6,8 500µl 

10%SDS 40µl 

Acrylamid 680µl 

10%APS 40µl 

TEMED 3µl 

Tube mehrmals 

invertieren! 

Die Lösung mehrmals invertieren, zwischen die Glasplatten gießen und sofort den 

15er-Kamm einsetzen. 

Danach werden die Proben angesetzt: 

Eppis beschriften und zuerst Natriumphosphatpuffer vorlegen 

Proben 1 + 2 müssen vorinkubiert werden 

Pipettierschema 

Natriumphosphatp. Probe 

Gesamtvolumen 

Probe 1 8µl 

4µl a1 + 4µl Try (10min Vorinkubation), dann 10µl 

BSA 26µl 

Probe 2 \ 

8µl a1 + 8µl Ela (10min Vorinkubation), dann 10µl 

BSA 26µl 

Probe 3 16µl 10µl BSA 26µl 

Probe 4 22µl 4µl Try 26µl 

Probe 5 18µl 8µl Ela 26µl 

Probe 6 22µl 4µl a1 26µl 

Probe 7 12µl 10µl BSA + 4µl Try 26µl 

Probe 8 18µl 4µl a1 + 4µl Try 26µl 

Probe 9 8µl 10µl BSA+ 8µl Ela 26µl 

Probe 10 10µl 8µl a1 + 8µl Ela 26µl 

85


_________________________________________________________________________________________ 

Proben in einem Abstand von 30Sek. pipettieren (Timer nach der ersten Probe starten) 

Proben direkt nach dem Pipettieren vortexen (vor der 5min-Inkubation) 

Inkubation der Proben für 5min bei Raumtemperatur 

Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 10µl 4x Probenpuffer + 4µl DTT wieder im 

Abstand von 30Sek. 

Proben vortexen 

Proben für 5min bei 95°C erhitzen 

Proben vortexen 

Proben wegen der Kondenswasserbildung kurz abzentrifugieren 

Proben kurz vortexen 

von der gesamten Probe 20µl auf das Gel auftragen 

Probe 11: 4µl Standard mit 16µl 1x Probenpuffer versetzen 

100µl 1x Probenpuffer für die leeren Taschen vorbereiten (pro Tasche 20µl) 

Proben wie folgt auftragen: 

Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 

Proben- 

Nr. 

3 4 5 6 7 8 1 9 10 2 11 

BSA Try Ela a1 

a1 

a1 

BSA a1 BSA a1 

Try 

Ela 

Try Try Ela Ela 

BSA 

BSA 

Std 

Gellauf bei einer Spannung von 160V, ca. 1h 

Gel in eine Glasschale mit H 2 O überführen 

Färbung: 

25min mit InstantBlue 

1x 30Sek. mit H 2 O waschen 

1x 5min mit Entfärber waschen 

1x 30Sek. in H 2 O waschen 

Gel zwischen 2 Folien legen und einscannen 

86


_________________________________________________________________________________________ 

Standard Fermentas: 

Auswertung / Protokoll 

Die Ergebnisse der Protease-Reaktionen werden anhand der SDS-PAGE diskutiert. 

Identifizieren Sie die Banden des Gels so präzise wie möglich. 

Angaben nach der Gefahrstoffverordnung 

In diesem Versuchsteil werden keine neuen „gefährlichen“ Stoffe verwendet. 

87

Versuch Zellen 

____________________________________________________________________________ 

Zellen 

Deckblatt: Zellen 

Versuch GP Zellen 

Grundlagen der Zellbiologie 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

........... Semester: ………… 

Studiengang: ................................................. 


Prof. Dr. G. Gimpl, C. Wolpert 


Bemerkung: .......................................... 



_________________________________________________________________________________________ 

Grundlagen der Zellbiologie 

Zu den Grundlagen im Umgang mit eukaryotischen Zellen gehören folgende Techniken: 

- Beschichten von Plastikmaterial (z.B. mit Poly-Lysin), auf denen Zellen anwachsen 

- Trypsinieren zur Ablösung der Zellen von der Unterlage sowie deren Vereinzelung 

- Passagieren der Zellen, d.h. erneutes Ausplattieren der trypsinierten Zellen 

- Ermittlung der Zellzahl durch Auszählen in speziellen Zählkammern 

- Prüfung der Vitalität der Zellen (z.B. mittels Vitalitätsfarbstoffen) 

- Ermittlung der Zellzyklus-Stadien 

- Immuncytochemie zur Anfärbung von Organellen, bestimmten Strukturen oder 

definierten Proteinen (Antikörper, GFP-Varianten etc) 

Zellkultur 

Für die Fluoreszenzfärbung werden die Zellen auf sterilen Deckgläschen kultiviert. Dazu 

werden die Deckgläschen zunächst in einer mit Filterpapier ausgelegten Schale 

autoklaviert (= sterilisiert). Anschließend überführt man die Deckgläschen mit einer 

sterilen Pinzette in 24-well Zellkulturschalen und beschichtet sie mit Poly-L-Lysin, das den 

Zellen als künstliche extrazelluläre Matrix dient. Etwa 24 Stunden vor dem Experiment 

werden die Zellen einer konfluenten 10 cm-Zellkulturschale durch Trypsinierung abgelöst 

und auf die Deckgläschen ausgesät. Die Zellen wurden im CO 2 -Inkubator inkubiert (37°C, 

100% Luftfeuchtigkeit, 5% CO 2 ). 

Immuncytochemie und Fluoreszenzmikroskopie 

Mittels immuncytochemischer Methoden lässt sich die Lokalisation eines bestimmten 

Proteins oder anderer Moleküle in der Zelle bestimmen (Zellorganell?), die oft schon 

Hinweise auf dessen mögliche Funktion gibt. 

Klassischerweise werden Proteine unter Verwendung spezifischer Antikörper 

nachgewiesen. So kann zum Beispiel zum Nachweis der Mikrotubuli ein Antikörper gegen 

-Tubulin verwendet werden (1. Antikörper), der wiederum mit einem 

fluoreszenzmarkierten 2. Antikörper detektiert wird („indirekte Immunfluoreszenz“). Tubulin 

liegt zu je ca. 50% als Heterodimer (aus - und -Tubulin) oder in polymerisierter Form 

(=Mikrotubuli) im Zytosol vor. Eine Fibroblastenzelle enthält ca. 20 µM Tubulin (2 mg/ml!). 

Mikrotubuli sind u.a. an Transportprozessen (Vesikel, Organellen) und der Mitose beteiligt. 

Mikrotubuli können sehr schnell polymerisieren bzw. depolymerisieren. Diese Vorgänge 

können durch bestimmte Substanzen wie z. B. das Spindelgift Colchizin (depolymerisiert 

Mikrotubuli) bzw. das Krebsmittel Taxol (stabilisiert Mikrotubuli) induziert werden. 

Unter Verwendung rekombinanter DNA-Methoden können Proteine auch mit 

Fluoreszierenden Proteinen (GFP und Varianten) verknüpft (tagging) und als cDNA in 

Zellen transfiziert werden. Die so exprimierten Proteine können dann direkt 

fluoreszenzmikroskopisch untersucht werden. Diese fluoreszierenden Fusionsproteine 

können auch in lebenden Zellen und Organismen (z.B. transgene Mäuse) analysiert 

werden. 

Der Vitalitätsfarbstoff MTT 

Das wasserlösliche gelbliche Tetrazoliumsalz MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5- 

diphenyl-Tetrazoliumbromid) wird nur von lebenden Zellen aufgenommen und in den 

Mitochondrien mit NADH zu blauvioletten, wasserunlöslichen Formazan-Kristallen 

reduziert. Die Intensität der Blaufärbung kann photometrisch quantifiziert werden und ist 

direkt proportional zum Anteil lebender Zellen. Die Übertragung der Elektronen findet 

89


_________________________________________________________________________________________ 

mittels zelleigener Dehydrogenasen in den Mitochondrien statt, in denen sich der Farbstoff 

anreichert. Dabei dienen die Reduktionsäquivalente der Zelle (NADH+H + ) als 

Elektronendonor. Je stoffwechselaktiver eine Zelle ist bzw. je mehr Zellen vorhanden sind, 

desto mehr Formazan wird gebildet. Das im Zellinneren kristallin abgelagerte Formazan 

kann in saurem Isopropanol in Lösung gebracht und photometrisch quantifiziert werden. 

Damit gibt der MTT-Assay zum Beispiel Auskunft über die Menge lebender Zellen, der 

Teilungsrate von Zellen (Proliferation) oder über den toxischen Einfluss von Substanzen 

auf den Zellmetabolismus. 

NADH+H + 

Abb. 1: Reduktion von MTT (4,5-Dimethylthiazplyl-2-)-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid) 

zu Formazan mittels zelleigener Reduktionsäquivalente in Mitochondrien 

Material und fertige Lösungen: 

Diverse Zelllinien, die routinemäßig in unseren Zelllabors kultiviert werden. Dies sind 

u.a. COS Zellen, HEK293 Fibroblasten, CHO Zellen, VSMC (vascular smooth muscle 

cells (Ratte), 3T3 Zellen (Maus), HepG2 (Mensch) auf speziell beschichteten 

Petrischalen, 24-well Platten (Greiner) oder Deckgläschen. 

Mikroskop 

Neubauer-Zählkammer 

Trypanblau-Lösung 

PBS (Phosphate Buffered Saline, isotonische Salzlösung) 

PBS + 5% Fötales Kälberserum (FCS, Antikörper wurde damit verdünnt) 

PBS + 0,05% Triton X-100 

HBS (Hepes Buffered Saline) 

Zellkulturmedium 

Medium für MTT-Assay 

MTT-Stammlösung (5 mg/ml) 

Lysispuffer (10% Triton-X100, 0,1N HCl in Isopropanol) 

3.7% Paraformaldehyd in PBS 

Mowiol (Einbettungsmedium) 

Antikörper: 1. Antikörper: monoklonaler anti--Tubulin-Antikörper aus der Maus 

(Sigma) 1:2000 in PBS/5% FCS 

2. Antikörper: polyklonaler anti-Maus-Antikörper aus dem Esel, CY3-konjugiert 

(Dianova) 1:500 in PBS/5%FCS 

DAPI (= 4,6 diamidino-2-phenylindol): 0,2 µg/ml in PBS. DAPI ist krebserregend! 

90


_________________________________________________________________________________________ 

Versuch 1: Herstellung einer Zellsuspension 

(1) Die Ihnen zur Verfügung stehenden Zellen (HEK-293) wurden von uns am Vortag auf 

eine 10 cm-Kulturschale ausgesät. Die Zellen werden zunächst unter dem 

Lichtmikroskop betrachtet: Zelltyp? Morphologie der Zellen? 

(2) Den alten Kulturüberstand mit der Pipette abnehmen (Autoklavierabfall!) 

(3) Auf den Zellrasen vorsichtig (vom Rand aus) 5 ml PBS geben („Waschen“ der Zellen) 

(4) PBS abpipettieren (Autoklavierabfall!) 

(5) 4 ml PBS zu den Zellen geben und die Zellen mit einer Pipette von der Kulturschale 

lösen (dabei möglichst wenig Schaum bilden!) (*) 

(6) Zellen gut, aber vorsichtig resuspendieren (~ 5 ml Zellsuspension) und in ein 15 ml- 

Zentrifugiergefäß überführen. 

(7) Mit 2 ml PBS Reste des Zellrasens resuspendieren und diese ins Zentrifugiergefäß 

überführen. 

(8) Für 5 min bei 2000 rpm und Raumtemperatur zentrifugieren 

(9) Überstand vorsichtig (!) abnehmen (Zellpellet löst sich leicht ab) und verwerfen und 

Zellpellet in 2 ml HBS vorsichtig resuspendieren (nicht vortexen!). 

Diese Zellen werden für die Versuche 2 und 3 benötigt! Zellsuspension bis zur 

Benutzung im Kühlschrank aubewahren! 

(*) Zellen, die fester an der Plastikoberfläche haften, müssen trypsiniert werden. Dazu werden die 

Adhäsionspunkte, die die Zellen mit der Beschichtung der Kulturschale und untereinander 

ausgebildet haben, durch Zugabe der Serinprotease Trypsin abgedaut. Zusätzlich chelatiert EDTA 

bivalente Kationen wie z.B. Calcium und mindert dadurch ebenfalls die Anheftung der Zellen. 

Abb. 2: Zell-Zell-Kontakte (Bildquelle: anatomy.iupui.edu/.../cell.f04/cellf04.html) 

91


_________________________________________________________________________________________ 

Versuch 2: Ermittlung der Zellkonzentration mittels Zählkammer 

Die Anzahl von Zellen kann in einer Zählkammer (hier Neubauer, improved) (Abb. 3) 

bestimmt werden. Durch Zugabe von Trypanblau zu den Zellen lässt sich auch der 

Prozentsatz vitaler Zellen quantifizieren. Trypanblau färbt nur tote Zellen an. Bei lebenden 

Zellen kann der Farbstoff aufgrund der intakten Membran nicht eindringen. 

(1) 100 µl Zellsuspension aus Versuch 1 (siehe Schritt 9) verdünnen. 

Beispiel: Verdünnungsfaktor 5 (Zellen unmittelbar vor Entnahme vorsichtig 

durchmischen, nicht vortexen!): 

100 l Zellsuspension + 175 l PBS = 275 µl 

Davon 55 µl entnehmen + 45 l Trypanblau zugeben (= Trypanblau-haltige 

Zellsuspension) 

(2) Deckglas anhauchen und auf die seitlichen Stege der Neubauer-Zählkammer legen. 

Deckglas mit Daumen im Stegbereich andrücken und etwas nach oben schieben bis 

(meist) regenbogenfarbige Newtonsche Ringe sichtbar sind. 

(3) Zählkammer mit der Trypanblau-haltigen Zellsuspension vorsichtig befüllen (~10 µl!) 

(4) Zellen unter dem Mikroskop (10x Objektiv) zählen. Es werden die ungefärbten 

(lebenden) Zellen der 4x4 Quadrate („L“ in Abb. 3B) gezählt. Die gleiche Prozedur 

wiederholen, um die Anzahl der blauen (toten) Zellen zu ermitteln. 

(5) Nach folgender Formel wird die Gesamtzahl der Zellen in der Neubauer-Kammer 

bestimmt: 

(Gezählte Zellen / ausgezählte Quadrate) x Verdünnung x 10 4 = Zellen/ml 

Zellzahl in L1 + L2 + L3 + L4 = L Total 

L Total / 4 = L Mittelwert 

L Mittelwert * Verdünnungsfaktor * 10 4 = Zellen / ml 

(Konstanter Faktor = 10 4 ergibt sich aus der Größe der Zellkammer!) 

Abb. 3: Neubauer-Zählkammer 

(A) Gesamtansicht (Bildquelle: de.wikipedia.org/wiki/Neubauer-Zählkammer) 

Pfeile markieren Position für das Einpipettieren der Zellen 

(B) Zählfeld mit Planquadraten (Bildquelle: www.carlroth.com/media/_dede/Graphics/00001906_0.jpg) 

(C) Querschnitt mit zentralem Zählfeld und seitlichen Stegen (Bildquelle: e- 

learning.studmed.unibe.ch/hemosurf_demo/Lab-Images/chambre_side.jpg) 

92


_________________________________________________________________________________________ 

Versuch 3: MTT-Assay zur Bestimmung der Zellvitalität 

Von der Zellsuspension aus Versuch 1 (Schritt 9) werden folgende Ansätze mit Medium in 

2 ml-Eppendorfgefäßen hergestellt (vor Entnahme vorsichtig durchmischen): 

Ansatz 

Volumen 

Zellsuspension 

Volumen 

Medium 

Volumen 

Gesamt 

V3-A 100 µl 1900 µl 2000 µl 

V3-B 200 µl 1800 µl 2000 µl 

V3-C 500 µl 1500 µl 2000 µl 

V3-D 1000 µl 1000 µl 2000 µl 

(1) In die für den MTT-Assay vorgesehenen Wells der 24-well Platte (siehe Abb. 4) 

werden zunächst 400 µl Medium vorgelegt. 

(2) Je 400 µl der Ansätze V3-A bis V3-D als Dreifachbestimmungen in die vorgesehenen 

Wells der 24-well Platte (Abb. 4) hinzupipettiert. 

(3) In jedes dieser Wells 80 µl MTT-Stammlösung (5 mg/ml) pipettieren. 

(4) Mischen durch vorsichtiges Schwenken des Mediums. 

(5) Die Platte für 90 min in den Brutschrank (37°C und unter CO 2 -Begasung) stellen. 

(6) Je 400 µl sauren Lysispuffer hinzupipettieren unter mehrmaligem Auf- und 

Abpipettieren der Lösung. Achten Sie dabei darauf, dass keine Schaumbildung eintritt 

(keine Luft durch die Pipette hochziehen!): Diese verfälscht die Messergebnisse! 

(7) Die photometrische Auswertung erfolgt direkt in den 24-well-Platten im ELISA-Reader 

bei zwei Wellenlängen: bei 560 nm wird die Absorption des Formazans gemessen und 

bei 650 nm die mögliche Absorption durch Zelltrümmer. 

Abb. 4: 24-well Platte für Versuch 3. Jeweils 2 Gruppen teilen sich eine Platte! 

93


_________________________________________________________________________________________ 

Versuch 4: Immuncytochemie von Zellen 

Im folgenden lernen Sie eine klassische Methode der Immuncytochemie. Die Zellen 

befinden sich auf kleinen Deckgläschen (coverslips) in einer 3 cm Petrischale. Jeder 

Waschschritt erfolgt mit 1 ml der entsprechenden Lösung. Mit Ausnahme der Einbettung 

befinden sich bei allen Schritten die Deckgläschen in den Zellkulturschalen mit den Zellen 

nach oben! 

(A) Fixierung der Zellen mit Paraformaldehyd (PFA) 

(1) Medium abnehmen und Zellen 2x kurz mit PBS waschen 

(2) 15 min bei Raumtemperatur in 3,7% PFA-Lösung (1 ml) fixieren 

(3) 1 x kurz mit PBS waschen 

(B) Permeabilisieren der Zellen 

(1) 10 min (nicht länger!) mit 1 ml PBS/TX (= PBS+0,05% Triton X-100) inkubieren 

(2) 1x kurz, dann 1 x 10 min mit PBS waschen 

(3) Die letzte PBS-Lösung in den Schalen lassen, um die Deckgläser für die 

folgende Antikörper-Inkubation leichter entnehmen zu können 

(4) sofort mit Antikörper-Inkubation weitermachen! 

(C) 1. Antikörper-Behandlung der permeabilisierten Zellen 

(1) Hierzu wird eine Petrischale mit feuchtem Filterpapier ausgelegt und mit einem 

Stück Parafilm bedeckt. 

(2) Erst-Antikörperlösung (mAb anti--Tubulin, mouse, 1:2000 in PBS/5% FCS) (15 

µl) luftblasenfrei als Tropfen auf den Parafilm setzen 

(3) Deckgläschen mit den Zellen nach unten auf Tropfen in der Glas-Petrischale 

legen. 

(4) Für 30 min mit geschlossenem Deckel bei RT inkubieren. 

(5) Deckgläschen zum Waschen mit der Pinzette wieder in die Zellkulturschälchen 

(frisches PBS in Schälchen vorlegen!) überführen (Zellen nach oben) 

(6) 1 x kurz, dann 1 x 5 min mit PBS waschen 

(D) 2. Antikörper-Behandlung (lichtempfindlich!) 

(1) Die Zellen wie oben in der Petrischale mit 15 µl fluoreszenzmarkiertem Zweit- 

Antikörper (pAb anti-mouse-Cy3, 1:500 in PBS/5% FCS) für 30 min bei RT 

inkubieren. 

(2) Deckgläschen wieder in die Zellkulturschale überführen (PBS vorlegen), Zellen 

oben. 

(3) 1 x kurz, dann 1 x 5 min mit PBS waschen. 

(4) Das letzte PBS so lange in Schälchen stehen lassen bis die DNA-Färbung 

gemacht werden kann 

(E) Kern-(DNA-)Färbung mit DAPI und Einbetten des Präparats mit Mowiol 

Beachten Sie: Der Farbstoff DAPI ist lichtempfindlich und krebserregend 

(Handschuhe; Kleidung/Pipetten etc. nicht kontaminieren). 

(1) 500 µl der DAPI-Lösung in neues Well vorlegen 

(2) Deckgläschen für 2 min zugeben, Zellen oben 

(3) Jetzt erst (also in diesen 2 Minuten Inkubation, nicht früher) 5 µl Mowiol 

luftblasenfrei auf einem Objektträger vorlegen. 

94


_________________________________________________________________________________________ 

(4) Das Deckgläschen aus der DAPI-Lösung nehmen, kurz in ddH 2 O eintauchen 

und schwenken (zum Abwaschen der DAPI-Lösung). Den Überschuss an 

Wasser an einem Kleenex-Tuch entfernen (nachfragen wie!) und dann das 

Deckgläschen mit den Zellen nach unten auf die 5 µl Mowiol fallen lassen zum 

Einbetten. 

(5) Objektträger bei RT im Dunkeln trocknen lassen. 

(6) In der darauffolgenden Woche können Sie Ihre eigenen Präparate mit einem 

Fluoreszenzmikroskop betrachten. 

Auswertung und Protokoll 

Zellzählung: Wieviele Zellen waren auf der konfluent bewachsenen Petrischale? 

Zur Auswertung des photometrischen MTT-Assays werden zuerst die ODs gebildet 

aus OD (560 nm) - OD (650 nm). Bei 560 nm wird die spezifische Absorption (incl. 

Zelltrümmer), bei 650 nm nur Absorption durch Zelltrümmer gemessen! 

Für den „Zelldichte-Versuch“ werden die Mittelwerte der ODs (mit Standardabweichung) 

über der Zellmenge aufgetragen und die Trendlinie für die lineare 

Regression eingetragen. Wieviele Zellen waren in den Ansätzen V3-A bis V3-D? 

Fluoreszenzmikroskopie: Einige der Präparate werden fotografiert und zur Diskussion 

ins Netz gestellt. 

Das Protokoll zu diesem Versuch sollte zusammen mit dem Protokoll des folgenden 

Kurstags (aber als Einzelprotokoll) abgegeben werden. 

95

Versuch Lipide 

_________________________________________________________________________________________ 

Lipide 

Deckblatt: Lipide 

Versuch GP Lipide 

Analyse von Lipiden 


E-mail: ................................................. 


Gruppen-Nr.: 

........... Semester: ………… 

Studiengang: ................................................. 


Prof. Dr. G. Gimpl, C. Wolpert 


Bemerkung: .......................................... 


96


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VERSUCH Lipide I 

Nachweis von Lipiden und Bestimmung des Cholesteringehalts 

Lipide (griech.: lipos, Fett) sind Substanzen biologischen Ursprungs, die in organischen 

Solventien wie Chloroform und Methanol löslich sind. 

Nach der chemischen Struktur unterscheiden wir verschiedene Lipidklassen: Fettsäuren, 

Triacylglycerine (Fette), Glycerophospholipide, Sphingolipide und Sterine (Cholesterin). 

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Lipide werden durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln gewonnen und können 

zum Beispiel durch Adsorptions-, Dünnschichtchromatographie und reverse-phase HPLC 

fraktioniert werden. 

Wir stellen Ihnen für diese Versuchsreihe folgende Materialien zur Verfügung: 

Serum, Lebermembranen und Membranen von Escherichia coli-Bakterien. 

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Fötales Kälberserum: 

Fötales Kälberserum (fetal calf serum, fetal bovine serum, FCS, FBS) wird aus dem Blut 

von Kuhföten gewonnen und ist ein wichtiger Bestandteil der meisten Nährmedien, die zur 

Kultivierung von Zellen benötigt werden. Blut besteht aus zellulären Bestandteilen und 

Plasma, einer wässrigen Lösung aus Salzen, Proteinen und niedrig-molekularen 

Verbindungen wie Glucose. Plasma ohne Gerinnungsfaktoren wird als Blutserum 

bezeichnet. Das Serum enthält auch Wachstumsfaktoren. Durch gelöstes Bilirubin ist 

Serum gelblich gefärbt. 

Leberzellen: 

Leberzellen zeichnen sich durch ihre hohe Stoffwechselaktivität aus. Sie enthalten viele 

Mitochondrien (ca. 2000 pro Zelle) und ein reich verzweigtes Endoplasmatisches 

Retikulum. 

Escherichia coli-Zellen: 

E. coli ist ein Bakterium, das unter anderem im Darm des Menschen vorkommt. E. coli 

sind problemlos auch in großen Fermenter-Anlagen kultivierbar und können mit Plasmid- 

DNA einfach transformiert werden. Es lassen sich dadurch u.a. große Mengen von Fremd- 

Protein exprimieren. 

Versuch 1: Lipid-Extraktion (nach 'Bligh and Dyer') 

Theorie zur Lipidextraktion nach Bligh, E.D. and Dyer, W.J. (1959) A rapid method of total 

lipid extraction and purification, Canad. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917. 

Eine quantitative Extraktion des Gesamtlipids aus biologischem Probenmaterial kann erreicht 

werden durch Homogenisierung der Probe in einem Einphasen-System aus 

Chloroform-Methanol-Wasser (1:2:0.8, v/v/v). Die Wassermenge beinhaltet dabei den 

Wassergehalt der Probe. Weiterer Zusatz von Chloroform und Wasser führt zu einem 

Zweiphasen-System mit der Zusammensetzung Chloroform-Methanol-Wasser (2:2:1,8, 

v/v). Nicht-Lipide gehen in die obere Methanol-Wasser-Phase, Lipide in die untere 

Chloroform-Phase. 

Material: 

• 4x Serum 

• 2x Lebermembranen 

• 2x E. coli - Zellen 

• Chloroform 

• Methanol 

• Millipore-Wasser 

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(alle Schritte bei Raumtemperatur) 

Organische Lösungsmittel tropfen leicht aus der Pipette! Pipettieren Sie so, dass 

dies nicht passiert (vorher einmal mit Chloroform ausprobieren)! 

Insgesamt werden 8 Extraktionen (4x Serum, 2x Leber, 2x E.coli) durchgeführt: . 

• 300 µl Probe + 375 µl Chloroform + 750 µl Methanol gut vortexen 

• 10 min inkubieren bei Raumtemperatur 

• Zentrifugieren für 10 min bei 14000 rpm 

• Überstand vorsichtig in ein 2 ml-Gefäß überführen (Pellet verwerfen) 

• 375 µl Chloroform + 375 µl H 2 O dazugeben gut vortexen 

• Zentrifugieren: 10 min bei ~ 14000 rpm (vorsichtig aus Zentrifuge nehmen!) 

• Obere Phase (sowie Zwischenphase) vorsichtig abnehmen und verwerfen 

• Jeweils 2 Extrakte des Serums werden nun vereint, die übrigen Proben bleiben als 

Einzelproben. 

• Die Lipid-Extrakte ca. 20 min im Heizblock trocknen (dabei unbedingt im Abzug 

arbeiten!!). 

Nach Trocknung werden die Lipide auf Eis gelagert. 

Lipidextraktion mit 

- E. coli: 2 X 300 µl Protein (= je 3 mg) 

- Serum: 4 X 300 µl (= 2 Aliquots) 

- Lebermembranen: 2 X 300 µl Protein (= je 3 mg) 

Cholesterin-Bestimmung 

Dünnschicht-Chromatographie 

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Versuch 2: Bestimmung des Cholesterin-Gehalts in den Lipidextrakten 

Theorie zur Cholesterinbestimmung 

Bei der enzymatischen Cholesterin-Bestimmung wird Cholesterin (engl.: cholesterol) von 

einer Cholesterin-Oxidase zu Cholestenon oxidiert (1). Beachte: Cholesterylester wird hier 

nicht berücksichtigt, könnte aber im Prinzip durch Zusatz einer Cholesterylesterase mitbestimmt 

werden. 

Das bei dieser Reaktion entstehende Wasserstoffperoxid oxidiert Methanol in Gegenwart 

von Katalase zu Formaldehyd (2). Formaldehyd bildet mit Acetylaceton in Gegenwart von 

NH + 4 -Ionen einen gelben Lutidin-Farbstoff (3). 

Cholesterin-Oxidase 

(1) Cholesterol + O 2 4-Cholestenon + H 2 O 2 

Katalase 

(2) Methanol + H 2 O 2 Formaldehyd + 2 H 2 O 

(3) Formaldehyd + NH 4 + + 2 Acetylaceton Lutidin-Farbstoff + 3 H 2 O 

Die Konzentration des entstehenden Lutidin-Farbstoffes (3,5-Diacetyl-1,4-dihydrolutidin) 

ist der Menge an Cholesterin äquivalent und wird aufgrund seiner Absorption im 

sichtbaren Bereich bei = 405 nm gemessen. 

Material: 

• Assay von BioPharm (Darmstadt) mit Reaktionslösung und Enzym 

• Extrahierte Proben 

• Positivkontrolle für den Enzymassay (10 µg/40µl Cholesterin in Isopropanol) 

(= Standard) 


Sowohl die Proben als auch das Enzym werden immer auf Eis gehandhabt! 

• Lipidprobe in 80 µl Isopropanol lösen, davon 40 µl verwenden (restliche 40 µl als 

Reserve aufbewahren!). In ein weiteres Eppi 40 µl der Positivkontrolle geben. 

• 500 µl Reaktionslösung (auf RT bringen und erst verwenden, wenn Lösung klar ist!) 

zu 40 µl Probe (bzw. der Positivkontrolle) geben und vortexen. 

• Hiervon wird die Hälfte (270 µl) abgenommen und in einem zweiten Eppi mit 3 µl 

Cholesterinoxidase vermischt (= Enzymansatz). Der Ansatz ohne Enzym dient als 

Kontrolle. 

• Alle Eppis werden gut verschlossen bei 37°C im Wasserbad für 1 h inkubiert. 

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[Während der Inkubationszeit kann die Analyse der Lipide mittels DC begonnen werden] 

Danach werden die Ansätze auf RT für 5-10 min abgekühlt (Lichtschutz!). 

• Photometrie der Proben in UV-Mikroküvetten bei = 405 nm 

• Messung der Absorption des Enzymansatzes gegen die jeweilige Kontrolle 

(hinterer Strahlengang) bei = 405 nm (warten, bis der Absorptionswert stabil ist!). 

Berechnung der Cholesterin-Konzentration: 

c = 

E 

x d 

d = Schichtdicke [cm] (hier: 1cm) 

= Extinktionskoeffizient des Lutidinfarbstoffes 

bei 405 nm = 7,4 [l x mmol -1 x cm -1 ] 

Berechnen Sie die Cholesterin-Menge in Ihren einzelnen Proben (in µg) mit Hilfe 

folgender Angaben: 

Testvolumen = 500 µl Reaktionslösung + 40 µl Isopropanol 

Molekulargewicht von Cholesterin: 386,64 g/mol 

Versuch 3: Dünnschicht-Chromatographie der Lipid-Extrakte 

Theorie zur DC 

Dünnschichtchromatographie (DC) ist eine seit den 50er Jahren etablierte Methode (Standardwerk: 

Egon Stahl (Hrsg.), Dünnschicht-Chromatographie, Springer-Verlag Berlin, 

1967, 2. Auflage) zur Analyse und Quantifizierung von Lipiden, die auch heute noch häufig 

verwendet wird. Insbesondere die Vielfalt der Detektions-Reagentien und Laufmittel 

ermöglicht es, optimale Trennbedingungen und Nachweise für nahezu alle Lipide auch in 

komplexen Mischungen zu finden. In Kombination mit dem zellulären Einbau radioaktiv 

markierter Lipid-Vorläufer (z.B. 14 C-Acetat) ist die DC eine moderne hochempfindliche 

Methode der Lipidanalyse in der Zellbiologie. 

Kieselgel G wird meist zur Fraktionierung von Lipiden verwandt. Die Wahl des Fließmittels 

richtet sich nach der Polarität der Komponenten des Lipidgemisches und dem gewünschten 

Trenneffekt. 

Da wir eine sehr komplexe Mischung von Lipiden (Totalextrakt aus biologischen Proben) 

analysieren wollen, verwenden wir ein Fließmittelsystem. Das Ergebnis wird ein Muster 

der dominanten Lipidspecies sein, die charakteristisch für die entsprechenden Proben 

sind. 

Material: 

• DC-Fertigplatten, beschichtet mit Kieselgel (Silika Gel 60, Merck) 

• Laufmittel = Chloroform : Methanol : Wasser = 6,5 : 2,5 : 0,3 ml 

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• Wichtig: Die Zusammensetzung des Laufmittels ändert sich rasch wegen der 

unterschiedlichen Flüchtigkeit der Komponenten. Daher sollen die Gefäße immer 

sofort wieder verschlossen werden. 

• Proben gelöst in 20 µl Chloroform (auf Eis, da sich sonst zuviel verflüchtigt!) 

• Lipid-Standards (in je 10 µl Chloroform aufnehmen) bestehend aus: 

o Standard 1 (S1): Sphingomyelin, Phosphatidylethanolamin, Cholesterol, 

Cholesterolpalmitat (= läuft nahe der Frontlinie) 

o Standard 2 (S2): Phosphatidylcholin, Cholesterol 

• Sprühreagens Schwefelsäure : Methanol = 1 : 1 

• Heizplatte mind. 120°C zum Veraschen 


Proben (Serum, Leber, E. coli) in 20 µl Chloroform aufnehmen und auf Eis lagern. 

X X X X X 

S1 Serum Leber E.coli S2 

• DC-Platte: 5 Auftragungspunkte ca. 1 cm 

vom unteren Plattenrand entfernt mit weichem 

Bleistift markieren. Lipid-Extrakte (je 10 µl) mit 

Pipette sehr vorsichtig über den markierten 

Punkten auftragen (die Trennleistung ist umso 

besser je feiner der Auftragungspunkt gelungen 

ist!). 

• Laufmittel in die trockene Glaskammer 

füllen (10-15 ml, Boden darf nicht mehr als 0.5 

cm bedeckt sein!), mit Deckel verschließen, kurz 

schwenken 

• DC-Platte vorsichtig in Kammer stellen. 

Deckel auflegen. Lösungsmittelfront soll bis kurz vor das Ende der Platte laufen 

(dauert ca. 20 min). 

• DC-Platte herausnehmen und sofort (!) mit Bleistift 'Lösungsmittelfront' markieren. 

DC-Platte kurz trocknen lassen. 

• Besprühen der DC-Platte mit Schwefelsäure:Methanol in feinem Sprühnebel 

(Betreuer fragen!). Für 1-2 min trocknen lassen (bei RT). 

• Besprühte DC-Platte auf Heizplatte legen (Veraschung bei 120°C). Beobachten Sie 

die rasche Entwicklung und Farbveränderung einiger Lipide. 

• Einscannen oder Fotografie des Ergebnisses! 

PROTOKOLL: Diskutieren Sie die Ergebnisse anhand des Begleitmaterials zum Versuch! 

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Betreuer - in der Biochemie

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