Zytogenetische Methoden in der Pränataldiagnostik - Zentrum für ...

medizinischegenetikGegründet 1989 durch Jan MurkenElektronischer Sonderdruck fürR.-D. WegnerEin Service von Springer Medizinmedgen 2011 · 23:457–462 · DOI 10.1007/s11825-011-0298-4© Springer-Verlag 2011zur nichtkommerziellen Nutzung auf derprivaten Homepage und Institutssite des AutorsR.-D. Wegner · M. StummZytogenetische Methoden in derPränataldiagnostikwww.medgenetik.springer.de

Schwerpunktthema: PränataldiagnostikDie Wahl der Eingriffstechnik und desZeitpunkts sowie die Gewinnung der pränatalenProben erfolgt durch spezialisierteGynäkologen. In . Abb. 1 sind die üblichenZeiträume zur Durchführung dereinzelnen Techniken aufgeführt. Der optimaleZeitpunkt für die Amniozentese(AC) liegt um die16 +0. Schwangerschaftsmedgen2011 · 23:457–462DOI 10.1007/s11825-011-0298-4Online publiziert: 12. Dezember 2011© Springer-Verlag 2011R.-D. Wegner 1, 2 · M. Stumm 2, 31Zentrum für Pränataldiagnostik und Humangenetik Kudamm 199, Berlin2Institut für Medizinische Genetik und Humangenetik,Charité - Universitätsmedizin Berlin, Campus Virchow-Klinikum3Institut für Humangenetik, Otto-von-Guericke-Universität, MagdeburgZytogenetische Methodenin der PränataldiagnostikDie invasive humangenetische Pränataldiagnostik(PD) umfasst die Entnahme undAnalyse von Fruchtwasserzellen, Chorionzotten,Fetalblut oder anderen fetalenGeweben zur Erkennung von genetischenStörungen des Embryos/Fetus. Es könnenzytogenetische, molekular-zytogenetische,molekulargenetische oder biochemischeAnalysen durchgeführt werden.Im Gegensatz zu den pränatalen nichtinvasivenScreeningverfahren, die zu Wahrscheinlichkeitsangabenführen, erlaubendie humangenetischen Untersuchungensehr sichere Aussagen. Der vorliegendeBeitrag ist auf die zytogenetische PD fokussiert.Zusätzlich wird die nichtinvasivePränataldiagnostik aus zellfreier fetalerDNA aus dem mütterlichen Blut kurzvorgestellt.Invasive PränataldiagnostikPräanalytikPatientenaufklärung– GendiagnostikgesetzDas seit dem 01.02.2010 geltende Gendiagnostikgesetz(GenDG, [4]) fordert voreiner pränatalen Diagnostik und nachVorliegen des Untersuchungsergebnissesdas Angebot einer genetischen Beratung.Die Beratung muss eine umfassendeAufklärung zur Untersuchung sowie zumUmgang mit dem Untersuchungsmaterialund den Untersuchungsergebnissen enthaltenund dokumentiert werden. Die Beratungunterliegt dem Arztvorbehalt, d. h.nur Fachärzte für Humangenetik, Fachärztemit der Zusatzbezeichnung „medizinischeGenetik“, und laut GenDG abdem 01.02.2012 auch Ärzte, die den Nachweiseiner „Qualifikation zur fachgebundenengenetischen Beratung nach den Erfordernissender Richtlinie der Gendiagnostik-Kommission(GEKO)“ haben, sindberechtigt, diese durchzuführen.Probengewinnung und VersandDie Anzahl invasiver pränataler Diagnostikist für Deutschland nur zu schätzen,der Nationale Ethikrat geht von etwa70.000 Eingriffen im Jahr 2003 aus[8]. Die Inanspruchnahme einer invasivenPD dürfte aufgrund des Einsatzes vonErsttrimesterscreening und früher Fehlbildungsdiagnostikin den letzten Jahrenrückläufig sein. Zumindest in unseremZentrum liegt die Zahl der invasiven Diagnostikmaßnahmenim Jahr 2010 bei nur29,3% verglichen mit der Anzahl im Jahr2000. Die Indikation „mütterliches Alter“wird jetzt deutlich seltener gestellt, währenddie Indikationen „auffällige Serumdiagnostik“und insbesondere „auffälligerfetaler Ultraschallbefund“ zunahmen.CVSPLSACEACFBSFBPSSW 11 + 0 –13 + 6 14 + 0 –16 + 6 17 + 0 –20 + 6 GeburtAbb. 1 8 Diagramm mit Angabe der üblichen Zeiten für die Durchführunginvasiver Techniken zur Gewebegewinnung. Die Balkenstärke ist ein Maß fürdie Präferenz der Technik. SSW Schwangerschaftswoche, CVS Chorionzottenbiopsie,PLS Plazentabiopsie, AC Amniozentese, EAC frühe Amniozentese,FBS Fetalblutentnahme, FBP fetale BlasenpunktionMedizinische Genetik 4 · 2011 |457

Schwerpunktthema: PränataldiagnostikTab. 1Methoden der invasiven Diagnostik aInvasives diagnostischesVerfahrenDiagnostischesVorgehenEingriffszeit(SSW)Abortrisiko(%)woche post menstruationem (SSW). Dasmethodisch bedingte Eingriffsrisiko beträgtetwa 0,5% (. Tab. 1). Eine AC zwischender 11+0. und 13 +6. SSW wird alsfrühe Amniozentese (EAC, „early amniocentesis“)bezeichnet. Aufgrund des erhöhtenRisikos eines Blasensprungs sindstrenge Indikationskriterien anzulegen.Das entnommene Fruchtwasser (10–20 ml) kann direkt in der Entnahmespritzeoder in sterilen, für Zellen getestetenTransportröhrchen – Zytotoxizitätausschließen! – verschickt werden.Wenn durch entsprechend ausgestatteteTransportbehälter eine Temperaturzwischen +4 und 37°C gewährleistetwird, kann ein Transport auch bei extremenAußenbedingungen problemlos über2–3 Tage erfolgen, ohne dass dabei die Vitalitätder Zellen merklich reduziert wird.Als optimaler Zeitraum für eine Chorionzottenbiopsie(CVS, „chorionic villisampling“) wird die 11 +0. – 13 +6. SSW angesehen.Die CVS wird i. Allg. transabdominalunter Ultraschallkontrolle durchgeführt.Das eingriffsbedingte Fehlgeburtsrisikoliegt bei der CVS bei etwa 0,5%(. Tab. 1), also in der Größenordnungder AC. Bei einer Entnahme vor der 10.SSW besteht ein Risiko für embryonaleExtremitätenfehlbildungen. Eine Gewebeentnahmeab 14 +0. SSW wird als Plazentese(PLB, „placenta biopsy“) bezeichnet.In Hinblick auf die zytogenetischeAnalyse ist zu berücksichtigen, dass fürdas Gewebe nach PLB eine umgekehrteKorrelation zwischen Schwangerschaftsalterund dem spontanen Mitoseindex imZytotrophoblasten charakteristisch ist.Das heißt, dass nach einer PLB ein schnellerChromosomenbefund nach Kurzzeitkulturnicht immer zu erstellen ist.Die entnommenen Chorionzotten (10–20 mg) sollten in einem speziellen Transportmediummit einem Puffer, der einenstabilen pH-Wert gewährleistet, sowie mitHeparin zur Verhinderung der Agglutinationder Erythrozyten versandt werden[11]. Chorionzotten können unter den fürdie Fruchtwasserzellen genannten Transportbedingungenverschickt werden. Vorder Chromosomenpräparation der Kurzzeitkulturist allerdings eine mehrstündigeTemperatureinstellung im CO 2 -Inkubatorerforderlich.Analyse von FruchtwasserzellenZytogenetische DiagnostikBearbeitung(Tage)AC Konventionell ≥ 14 +0 ~ 0,5 8–14Schnelltest 1EAC Konventionell 11 +0 bis 13 +6 > > 1 ≥ 12Schnelltest 1CVS KZK 11 +0 bis 13 +6 ~0,5 1LZK 5–14PLB KZK ≥ 14 +0 ~0,5 1LZK 7–14FBS > 18 +0 1–3 4FUS > 18 +0 ? 10–18aMit Angabe des üblichen Zeitraums des Eingriffs, des Risikos einer eingriffsbedingten Fehlgeburt sowie der Bearbeitungszeitbis zur Befunderstellung. SSW Schwangerschaftswochen, AC Amniozentese, EAC frühe Amniozentese,CVS Chorionzottenbiopsie, PLB Plazentese, FBS fetale Blutentnahme, FUS fetale Blasenpunktion, KZKKurzzeitkultur, LZK Langzeitkultur.Eine pränatale Chromosomendiagnostikan Fruchtwasserzellen wird seit Ende der1960er-Jahre durchgeführt. Die gewonnenenZellen liegen anfangs in der Ruhephasedes Zellzyklus (G 0 -Phase) vor.Nur wenige Zellen sind vital und könnenin den Zellzyklus eintreten, um dannzu Kolonien auszuwachsen. Da Chromosomenanalysennur an Zellen in Teilungdurchgeführt werden können, wird biszur möglichen Chromosomenpräparationeine Zellkultivierung von 8–14 Tagenerforderlich. Speziell im Hinblick auf dieInterpretation von Chromosomenbefunden(Mosaike!) muss immer bedacht werden,dass diese nur auf wenigen teilungsfähigenZellen beruhen.Detaillierte Angaben zur Technik vonZellzüchtung und Chromosomenpräparationsind bei Wegner zu finden [11]. DieGrößenordnung von Kulturversagen sollte0,2% nicht überschreiten. Die Chromosomenanalyseerfolgt an gebändertenChromosomen meist nach Trypsinbehandlungund Giemsafärbung (GTG-Banden). Nach der S2-Leitlinie „HumangenetischeDiagnostik“ der Gesellschaftfür Humangenetik (GfH) und des BerufsverbandesDeutscher Humangenetiker(BVDH; [9]) werden für die Pränataldiagnostikmindestens 400 Banden/haploidemChromosomensatz gefordert. BeiVorliegen von Aneuploidien ist z. B. auchein geringeres Bandenniveau ausreichend.Es müssen mindestens zwei unabhängigeKulturen angelegt werden, die ggf. für eineAnalyse herangezogen werden. Das Anlegeneiner dritten Kultur kann speziell beiMosaikkonstellationen sehr hilfreich fürdie Bewertung von Ergebnissen sein.Chromosomale MosaikeMosaikbefunde in der PD sind eine besonderediagnostische Herausforderung.Unter einem zytogenetischen Mosaik verstehtman das Vorliegen von mindestens2 Zelllinien mit unterschiedlicher Chromosomenkonstitution,wobei eine Zelllinieaus der anderen hervorgegangen seinmuss. Zur Klassifizierung von Mosaikenin Fruchtwasserzellen und zu weitergehendendiagnostischen Maßnahmen sinddie Vorschläge von Hsu u. Benn [6] zuempfehlen.Chromosomenaberrationen in nur einerZelle einer Kultur werden als Level-1-Mosaike bezeichnet. Diese sind nach internationalerNomenklatur (ISCN) keineMosaike, denn hierfür wird das Auftretenvon mindestens 2 Zellen mit identischemchromosomalem Zugewinn oder identischerchromosomaler Strukturveränderungbzw. von 3 Zellen mit einem Chromosomenverlustgefordert. Level-1-Mosaikewerden in den Befunden nicht mitgeteilt.Zellmosaike nach ISCN werden in2 Kategorien aufgeteilt: Level-2- und Level-3-Mosaike.Ein Level-2-Mosaik bedeutetdas Auftreten von mindestens458 | Medizinische Genetik 4 · 2011

Zusammenfassung · Abstract2 Zellen mit identischer Chromosomenabweichungneben der (meist normalen)zweiten Zelllinie in nur einer der untersuchtenZellkulturflaschen. Die andere(n)Kulturflasche(n) weist (weisen) nur Zellenmit dem primären Chromosomensatzauf. Level-2-Mosaike sind i. d. R. kulturbedingteArtefakte. Der dafür auch verwendeteBegriff „Pseudomosaik“ ist irreführend,da das Mosaik einen realen Befundaus der Kultur darstellt, eine weitergehendeDiagnostik erfordert und, wennauch sehr selten, ein fetales Mosaik darstellenkann. Level-2-Mosaike treten miteiner Häufigkeit von 0,7–1,1% nach ACauf [3].Ein Level-3-Mosaik liegt vor, wenn diebeobachteten Zelllinien in mindestenszwei der untersuchten Kulturflaschen auftreten.Die Frequenz dieser Mosaike liegtzwischen 0,1 und 0,3% aller AC [3]. DasRisiko für phänotypische Auffälligkeitenvor oder nach der Geburt ist chromosomenspezifisch.Ein sehr hohes Risiko(> 60%) liegt bei Trisomie-Mosaiken derChromosomen 2, 4, 9, 16 und 22, ein hohesRisiko (40–49%) bei den Chromosomen5, 13, 14, 15, 18 und 21, ein moderatesRisiko (20–39%) bei den Chromosomen6, 7, 12 und 17 und ein niedriges bei allenanderen Chromosomen vor [1]. Wird einMosaik bei Nachuntersuchungen an fetalemGewebe (z. B. Fetalblut) der betroffenenSchwangerschaft nicht bestätigt,kann es sich um ein extraembryonales/extrafetales Mosaik aus der Amnionhülle(. Abb. 2) handeln oder um ein gewebespezifischesMosaik, das z. B. im Fetalblutnicht nachweisbar ist (s. Fetalblutanalysen).Mütterliche ZellkontaminationEine durch die Punktion bedingte Beimengungmütterlicher Zellen (MCC,„maternal cell contamination“) führt nachden Daten mehrerer größerer Studien bei~0,5% aller Untersuchungen zum Auftretenweiblicher Metaphasen [1].Daten aus eigenen Untersuchungenmittels Interphase-FISH (Fluoreszenz-insitu-Hybridisierung)an nativen Fruchtwasserzellenvon männlichen Feten ergabeneine MCC in 27% der 100 analysiertenFälle. In keinem dieser 27 Fälle mit MCCnach FISH-Analyse, selbst in dem einenFall einer MCC von 27%, waren jedochMetaphasen mit weiblichem Chromosomensatznach der konventionellen Chromosomenanalyseder kultivierten Fruchtwasserzellenzu finden. Aller Wahrscheinlichkeitnach sind die Zellkerne mit XX-Konstellation auf mütterliche Leukozytenzurückzuführen, die kein Wachstumspotenzialaufweisen.Molekular-zytogenetischeDiagnostik – pränataler SchnelltestDer pränatale Schnelltest nutzt die Technikder FISH zur Diagnostik der häufigstenfetalen Aneuploidien (Trisomie 13, 18und 21) und der Konstellation der Geschlechtschromosomen.Hierzu erfolgteine FISH-Analyse an Zellkernen von nativenFruchtwasserzellen mit chromosomenspezifischenDNA-Sonden, die mitFluorochromen markiert sind. Der Untersuchungsbefundkann innerhalb von24 h nach Probeneingang erstellt werden.Eine ausführliche Darstellung der molekular-zytogenetischenPränataldiagnostikist in dem Artikel von Westrich und Liehrin diesem Heft enthalten.Molekulargenetische undbiochemische DiagnostikMolekulargenetische und biochemischeAnalysen werden bevorzugt an Chorionzottendurchgeführt und unter diesemKapitel besprochen.Analyse von ChorionzottenZytogenetische DiagnostikDie Chorionzottenanalyse wurde inDeutschland Mitte der 1980er-Jahre etabliert.Der Vorteil im Vergleich zur ACliegt in einer Verlagerung der Diagnostikvom zweiten in das erste Trimester derSchwangerschaft (. Abb. 1).Die gewonnenen Chorionzotten sindextraembryonalen Ursprungs und setzensich aus 3 Zellschichten zusammen(. Abb. 2), wovon zwei für die zytogenetischeDiagnostik von Bedeutung sind.Der Zytotrophoblast weist eine spontaneMitoseaktivität zum üblichen Zeitpunktder Biopsie auf, wodurch eine Chromosomenanalysebereits wenige Stundennach dem Eingriff möglich ist. Aus prak-medgen 2011 · 23:457–462DOI 10.1007/s11825-011-0298-4© Springer-Verlag 2011R.-D. Wegner · M. StummZytogenetische Methodenin der PränataldiagnostikZusammenfassungDie zytogenetischen Analysen an Fruchtwasserzellenoder an Chorionzotten sind dieStandardmethoden der invasiven Pränataldiagnostik.In besonderen Fällen stellen dieFetalblutanalyse oder die Untersuchung fetalerZellen anderen Ursprungs eine guteErgänzung dar, um den tatsächlichen fetalenChromosomensatz zu ermitteln. DieChromosomenanalyse erlaubt die Beurteilungdes gesamten Genoms auf lichtmikroskopischerEbene. Bei molekulargenetischenAnalysen monogener Erkrankungen werdennative Chorionzotten für eine derartige,gezielte Untersuchung bevorzugt verwendet.Die schnelle Entwicklung der nichtinvasivengenetischen Pränataldiagnostik kanndie Optionen werdender Eltern, bestimmtegenetisch bedingte Störungen auszuschließen,erweitern und auf den Einsatz der invasivenpränatalen Diagnostik maßgeblich Einflussnehmen.SchlüsselwörterPränataldiagnostik · Amniozentese ·Chorionzottenbiopsie · Zytogenetik · MosaikeCytogenetic methodsin prenatal diagnosisAbstractCytogenetic analysis of amniotic fluid cells orchorionic villi are standard methods in invasiveprenatal diagnosis. In certain cases, analyzingfetal blood cells or fetal cells of otherorigin represents an excellent supplementaryinvestigation to disclose a fetal chromosomalaberration. At the microscopic level, chromosomeanalysis allows an examination of thecomplete genome. In the case of molecularanalysis of monogenic disorders, native chorionicvilli are the preferred tissue for targetedexamination. Rapid advances in molecularnon-invasive prenatal diagnosis will broadenparents’ options to exclude certain relevantgenetic changes and will have an importantimpact on the field of invasive prenataldiagnosis.KeywordsPrenatal diagnosis · Amniocentesis ·Chorionic villi sampling · Cytogenetics ·MosaicismMedizinische Genetik 4 · 2011 |459

Schwerpunktthema: PränataldiagnostikEXTRAEMBRYONAL / EXTRAFETALSynzytiotrophoblastZygoteBlastomereBlastozyste TrophoblastZytotrophoblastMesenchymaler KernPlazentaCVS (DP/KZK)CVS (LZK)Innere ZellmasseExtraembryonalesMesodermAmniotischesEktodermChorionAmnionEmbryonalesEktodermAmniozenteseEmbryoanlageZentrum fürPränataldiagnostik und HumangenetikKudamm-199www.kudamm-199.deGrafik: © Prof. Dr. Rolf WegnerErstellt: September 2011EmbryonalesEntodermEmbryonalesMesodermBindegewebeBlutzellenEMBRYONAL / FETALFetaleBlasenpunktionCordozenteseAbb. 2 9 SchematischeDarstellung der Embryonalentwicklung/Fetalentwicklungmit Angabe der Gewebe,die bei einer invasivenDiagnostik untersucht werden.(Mod. nach[10])460 | Medizinische Genetik 4 · 2011tischen Gründen wird das Gewebe häufigüber Nacht inkubiert und erst am folgendenTag präpariert. Die Bearbeitungvon Chorionzotten bis hin zur Chromosomenanalyseder Zellen des Zytotrophoblastenwird als Kurzzeitkultur bezeichnet.Demgegenüber steht die Langzeitkultur,eine Analyse der Zellen des mesenchymalenKerns. Diese zeigen keinespontane Mitoseaktivität und müssendaher in Kultur genommen werden, umeine Chromosomenanalyse durchführenzu können. Die Kulturdauer liegt i. d. R.zwischen 4 und 14 Tagen. Eine vollständigdurchgeführte Chromosomendiagnostikerfordert die Analyse von Kurzzeitkulturund Langzeitkultur.Die Anforderungen an die Chromosomenqualitätzur Befundung ist in derS2-Leitlinie „Humangenetische Diagnostik“aufgeführt [9]. Die Chromosomenqualitätaus präparierten Zellen derKurzzeitkultur ist gewebespezifisch sowiemethodisch bedingt erheblich begrenztund liegt häufig bei ≤ 300 Banden/haploidemChromosomensatz. Damitsind nur grobe strukturelle Aberrationenerkennbar. Erst die Metaphasechromosomender Langzeitkultur, miteiner i. d. R. erreichbaren Auflösungvon ≥ 400 Banden/haploidem Chromosomensatz,weisen eine ausreichendeQualität für eine strukturelle Chromosomenanalyseauf. Im Durchschnitt liegtdie Bandenqualität der Metaphasen auseiner Chorionzotten-Langzeitkultur jedochum 50–100 Banden unterhalb deraus Fruchtwasserzellen.Chromosomale MosaikeChromosomale Mosaike oder fetoplazentareDiskrepanzen treten bei der Untersuchungvon Chorionzotten mit einerFrequenz von etwa 1–2% relativ häufigauf. Die europäische EUCROMIC-Studie(„European collaborative research on mosaicismin CVS“) zu Mosaiken nach CVS[5] weist dabei einen Anteil von 1,5% fürplazentabegrenzte Mosaike nach.Entsprechend dem Auftreten einesMosaiks oder einer reinen pathologischenZelllinie im Zytotrophoblasten (Kurzzeitkultur)und/oder mesenchymalen Kern(Langzeitkultur; . Abb. 2) variieren dieWahrscheinlichkeiten für ein echtes Mosaikim Fetus beträchtlich (. Tab. 2, 3).Zusätzlich ist die Prognose für den Fetusauch abhängig von den involviertenChromosomen. So sind in der EUCRO-MIC-Studie bei einem Trisomie-7-Mosaikin Kurzzeit- und/oder Langzeitkultur(n = 32) in keinem Fall Zellen mit Trisomie7 im Fetus nachgewiesen worden. BeiMosaiken mit Trisomie-21-Zellen (n = 31)sind dagegen 9 von 22 Feten tatsächlichbetroffen.Auf die zusätzliche Problematik einererhöhten Wahrscheinlichkeit für dasAuftreten einer uniparentalen Disomie(UPD) bei Vorliegen von Mosaiken wirdspäter eingegangen.Grundsätzlich geht aus den publiziertenDaten hervor, dass der Befund derLangzeitkultur eher den fetalen Karyotyprepräsentiert als der der Kurzzeitkultur.Diese Erkenntnis erklärt sich auch durchdie unterschiedliche Differenzierung vonZytotrophoblast und mesenchymalemKern im Verlauf der Embryonalentwicklung(. Abb. 2).Die Sicherheit der zytogenetischenDiagnostik an Chorionzotten ist etwavergleichbar mit der aus Fruchtwasserzellen,wenn sowohl die Kurzzeit- als auchdie Langzeitkultur untersucht werden.Demzufolge fordert die S2-Leitlinie „HumangenetischeDiagnostik“ bei Durchführungeiner Chorionzottendiagnostikauch die Analyse beider Kulturen für dieErstellung des endgültigen Ergebnisses,es sei denn, dass die bei einer fetalen Ultraschalluntersuchungfestgestellten Auffälligkeitenmit dem Ergebnis der Kurzzeitkulturkorrespondieren. Falsch-positiveoder falsch-negative Ergebnisse sind

ei Vorliegen durchgängig pathologischerZelllinien sehr selten (jeweils < 0,01%).Mütterliche ZellkontaminationHinsichtlich einer niemals sicher auszuschließendenBeimengung mütterlichenGewebes (MCC), auch nach genauestermikroskopischer Dissektion des Chorionbiopsats,weist die Kurzzeitkultur gegenüberder Langzeitkultur einen Vorteil auf.Da die mütterlichen Zellen keine spontaneTeilungsaktivität besitzen und innerhalbder kurzen Kulturdauer nicht in dieMitose eintreten, spielt die MCC bei derzytogenetischen Diagnostik der Kurzzeitkulturkeine Rolle. Eine MCC wird jedochin bis zu 1,5% aller Langzeitkulturen beschrieben.Molekulargenetische undbiochemische DiagnostikMolekulargenetische Analysen werdenbevorzugt nach CVS durchgeführt, dadas Gewebe früh in der Schwangerschaftgewonnen werden kann und eine sofortigeDNA-Extraktion aus den Chorionzottenmöglich ist. Eine eindeutige Identifizierungvon Chorionzotten und eine Entfernungmütterlicher Gewebestücke sindvon hoher Bedeutung, um Fehlbefundezu vermeiden. Der Ausschluss einerMCC (EDTA-Blut der Schwangeren erforderlich)ist eine auch in der S2-Leitlinie„Humangenetische Diagnostik“ verankerteVoraussetzung für die korrekteErstellung des Befundes.Eine biochemische Analyse an nativenChorionzotten wird heutzutage seltenereingesetzt. Sie erfolgt z. B., wenn einemolekulargenetische Diagnostik für eineStoffwechselerkrankung nicht zur Verfügungsteht.Analyse fetaler Lymphozytenund anderer fetaler GewebeDie Chromosomenanalyse an fetalenLymphozyten erfordert eine Chordozentese,die Punktion einer Nabelvene (FBS,„fetal blood sampling“). Beim FBS wirddie Nabelschnurvene vorzugsweise ander Plazentaansatzstelle punktiert. DasFBS kann ab der 18 +0. SSW durchgeführtwerden, dabei werden 1–2 ml Fetalblut gewonnen.Das Abortrisiko wird mit 1–3%Tab. 2 Verschiedene Konstellationen plazentabegrenzter Zellmosaike bzw. fetoplazentarerDiskrepanzen mit Angabe der prozentualen Häufigkeit unter allen Mosaiken. (Mod.nach [5])CPM-TypHäufigkeit KZK LZK Fetus(%)I 43,2 + − −II 25,0 − + −III 16,1 + + −FPD-Typ1 0 + − +2 3,6 − + +6,8 + + +Nur Trisomien einzelner Autosomen sind berücksichtigt (n = 192). CPM „confined placental mosaicism“, plazentabegrenzteZellmosaike; FPD fetoplazentare Diskrepanzen; KZK Kurzzeitkultur, LZK Langzeitkultur, + Mosaiktrisomieoder durchgängige Trisomie, − normaler Chromosomensatz.Tab. 3 Häufigkeit von Feten mit Chromosomenaberrationin Abhängigkeitvon der zytogenetischen Konstellationder Chorionzotten. (Mod. nach [5])KZK LZK Feten mit Aberration(%)M N 0T N 0N M 4,1N T 83,3M M 23,5T M 18,2M T 100Nur Trisomien einzelner Autosomen sind berücksichtigt(n = 192). KZK Kurzzeitkultur, LZKLangzeitkultur, M Mosaiktrisomie, T durchgängigeTrisomie, N normaler Chromosomensatz.angegeben, wobei allerdings zu berücksichtigenist, dass die FBS meist bei Hochrisikoschwangerschafteneingesetzt wird.Hauptindikationen sind die zytogenetischeund/oder molekulargenetische Diagnostiknach auffälligem Ultraschallbefundin hohen Schwangerschaftswochenoder nach unklarem zytogenetischem Befundeiner CVS und/oder AC.Die Bearbeitung der fetalen Lymphozytenzur Chromosomenanalyse folgtweitgehend den Protokollen der postnatalenLymphozytenanalysen [11]. Ein Befundkann innerhalb von 3–4 Tagen erstelltwerden. Analog zum pränatalenSchnelltest an nativen Fruchtwasserzellenkann auch eine molekular-zytogenetischeUntersuchung an nicht kultivierten fetalenLymphozyten erfolgen.Die diagnostische Sicherheit des zytogenetischeBefundes aus fetalen Lymphozytenist jedoch eingeschränkt, da falschnegativeBefunde beim Auftreten von spezifischenMosaiken relativ häufig sind. Sosind nach einer konventionellen Chromosomenananlysedas für das Pallister-Killian-Syndromtypische Isochromosom i(12p) fast nie und die Triploidie nur seltenim Fetalblut nachweisbar. Eine Kontaminationmit mütterlichen Lymphozytensollte immer ausgeschlossen werden(Kleihauer-Test).Die zytogenetische Analyse fetalerUrinzellen oder, bei pathologischer Vermehrungvon fetalen Körperflüssigkeiten,z. B. die Analyse von Asziteszellenwird unter strengen Kautelen in unseremZentrum erfolgreich eingesetzt. So zeigtenUntersuchungen bei Schwangerschaftenmit auffälligem Ultraschallbefundfalsch-negative Befunde im Fetalblut, daim fetalen Urin (Trisomie 6) bzw. im fetalenAszites (Trisomie 16) eindeutig Mosaikevorlagen.Weitere AspekteUniparentale DisomieEine uniparentale Disomie (UPD) ist dasAuftreten eines Chromosomenpaares, beidem beide homologe Chromosomen nurvon einem Elternteil stammen. Bei denChromosomen, die eine elterliche genomischePrägung bestimmter Gene aufweisen,kommt es hierdurch zu klinischrelevanten Krankheitsbildern. Zu dieserGruppe gehören die Chromosomen 6, 7,11, 14 und 15 [9]. Für das Chromosom 16 istdie Situation nicht zweifelsfrei geklärt, daMedizinische Genetik 4 · 2011 |461

Schwerpunktthema: Pränataldiagnostikein Trisomie-16-Mosaik und eine maternaleUPD (mit vielleicht kryptischem Mosaik)identische fetale Auffälligkeiten wieWachstumsrestriktion, Herzfehler undAnalatresie hervorrufen. Ebenso führt eineUPD 20 nicht ausnahmslos zu Pseudohypoparathyroidismus.Das Auftreten eines Zellmosaiks, einerRobertson-Translokation, eines Markerchromosomsbzw. das Vorliegen einer –auch parentalen – balancierten Translokation,sind generell mit einem erhöhten Risikofür die Entstehung einer UPD der beteiligtenChromosomen assoziiert. Demzufolgesollte die Problematik einer möglichenUPD und die Handlungsoptionenmit der Patientin im Rahmen einer genetischenBeratung besprochen werden.BefundmitteilungFür die Erstellung eines Befundes gibt esdetaillierte Forderungen, die in der S2-Leitlinie „Humangenetische Diagnostik“[9] aufgeführt sind. Nach dem GenDGdarf der Patientin der Befund nur durchdie verantwortliche ärztliche Person oderdie ärztliche Person, die die genetische Beratungdurchgeführt hat, mitgeteilt werden.ZuverlässigkeitDie Ergebnisse zytogenetischer Untersuchungensind sehr zuverlässig, wenngewebeinhärente Eigenschaften bei derAnalyse mit berücksichtigt werden. DieChromosomenanalyse aus Fruchtwasserzellenist nach wie vor der Goldstandardder invasiven Pränataldiagnostik, an demsich neue diagnostische Methoden messenlassen müssen.Nichtinvasive pränataleDiagnostik aus maternalem BlutDas Vorkommen zellfreier fetaler/plazentarerDNA im Blut von Schwangerenwurde erstmalig 1997 beschrieben und ermöglichtheute bereits die genetische Diagnostikbestimmter fetaler Merkmale,ohne dass ein invasives Vorgehen erfolgenmuss [7].Die pränatale Bestimmung qualitativergenetischer Merkmale wie Rhesusstatusund, wenn medizinisch indiziert, dasfetale Geschlecht bei X-gebundener Erkrankungen,wird bereits in einigen Ländernerfolgreich eingesetzt [2]. Auch seltenepaternale Genmutationen wurden bereitserfolgreich diagnostiziert.Die Analyse von quantitativen Merkmalen,wie z. B. der Nachweis von fetalenAneuploidien, ist technisch weitausschwieriger und aufwendiger. Verschiedenemethodische Ansätze wie die „massiveparallele Sequenzierung“ oder das „MAL-DI-TOF“ („matrix-assisted laser desorption/ionization– time-of-flight mass spectrometry“,matrixunterstützte Laserdesorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie)wurden aber bereits in erstenStudien zur nichtinvasiven humangenetischenPränataldiagnostik (NIPD) vonfetalen Aneuploidien (Trisomie 13, 18 und21) erfolgreich eingesetzt. Ein diagnostischerTest wird in den USA seit Oktober2011 angeboten.Fazit für die PraxisF Eine zytogenetische Pränataldiagnostikmittels gängiger invasiver Methodenwie AC bzw. CVS erlaubt eine genaueVorhersage von fetalen Chromosomenstörungenauf lichtmikroskopischerEbene.F Obwohl pränatale Ultraschalluntersuchungenund die biochemische Serumdiagnostikfür einige AneuploidienVorhersagewahrscheinlichkeitenvon 90–95% erreichen, bleibt füreine präzise und umfassende Erkennungeiner Chromosomenstörung dieFruchtwasserzell- und Chorionzottenanalysenotwendig.F Einen zukünftigen Wandel könnte derEinsatz der NIPD aus zellfreier fetalerDNA bringen.F Ein verantwortungsvoller Umgangmit diesen neuen Technologien ist dabeijedoch unerlässlich und erfordertauch weiterhin die individuelle Indikationsstellungim Rahmen einerkompetenten genetischen Beratung.KorrespondenzadresseProf. Dr. rer. nat. R.-D. WegnerZentrum für Pränataldiagnostik undHumangenetik Kudamm 199Kurfürstendamm 199, 10719 Berlinwegner@kudamm-199.deInteressenkonflikt. Der korrespondierende Autorgibt an, dass kein Interessenkonflikt besteht.Literatur1. Benn PA (2010) Prenatal diagnosis of chromosomalabnormalities through amniocentesis. In: Milunsky(Hrsg) Genetic disorders and the fetus. Wiley& Blackwell, London, S 194–2722. Chitty LS, Schoot CE van der, Hahn S, Avent ND(2008) SAFE – The Special Non-invasive Advancesin Fetal and Neonatal Evaluation Network: aimsand achievements. Prenat Diagn 28:83–883. Gardner RJM, Sutherland GR (2004) Chromosomeabnormalities and genetic counseling. Oxford UniversityPress, Oxford4. (o A) (2009) Gesetz über genetische Untersuchungenbeim Menschen (Gendiagnostikgesetz –GenDG). Bundesgesetzblatt Teil I 2009 Nr. 50, ausgegebenzu Bonn am 4. August 2009. BGBl 1 2009:2529–25385. Hahnemann JM, Vejerslev LO (1997) European collaborativeresearch on mosaicism in CVS (EUC-ROMIC) – fetal and extrafetal cell lineages in 192gestations with CVS mosaicism involving singleautosomal trisomy. Am J Med Genet 70:179–1876. Hsu LYF, Benn PA (1999) Revised guidelines for thediagnosis of mosaicism in amniocytes. Prenat Diagn19:1081–10907. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF et al (1997)Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum.Lancet 350:485–4878. Nationaler Ethikrat (2003) Genetische Diagnostikvor und während der Schwangerschaft. NationalerEthikrat, Berlin9. Gesellschaft für Humangenetik (GfH), BerufsverbandDeutscher Humangenetiker (BVDH) (2011)S2-Leitlinie „Humangenetische Diagnostik“. MedGenet 23:281–32210. Sperling K, Wegner RD (1995) Ätiologie und Pathogenesechromosomal bedingter embryofetalerFehlbildungen und Spontanaborte. In: Becker R,Fuhrmann W, Holzgreve W, Sperling K (Hrsg) PränataleDiagnostik und Therapie. WissenschaftlicheVerlagsgesellschaft, Stuttgart, S 45–8611. Wegner RD (Hrsg) (1999) Diagnostic cytogenetics.Lab manual. Springer, Berlin462 | Medizinische Genetik 4 · 2011