Protocol

Polymerase Chain Reaction = PCR = Polymerase-KettenreaktionGrundlagenDie Polymerase-Kettenreaktion, PCR (engl.: polymerase chain reaction), ist eine Methodezur in-vitro-Amplifikation (Vermehrung) eines definierten DNS-Fragments. Man kann PCRals „Genkopier-Maschine“ bezeichnen. Mit Hilfe der PCR kann aus sehr geringen Mengenheterogener DNS innerhalb weniger Stunden ein spezifisches DNS-Fragment millionenfachangereichert werden. Ihr Erfinder Kary Mullis bekam dafür den Nobelpreis.Voraussetzung für eine PCR-Amplifikation ist, dass kurze Sequenzabschnitte stromaufwärtsund stromabwärts von der gewünschten Region bekannt sind. Dies können beispielsweiseAbschnitte sein, von denen durch Vergleich verwandter Arten bekannt ist, dass sie nurlangsam evolvieren und daher in nah verwandten Arten identisch oder fast identisch sind.Diese Sequenzinformationen werden dann benutzt, um zwei kurze Oligonukleotide (genauerOligodesoxyribonukleotide), sogenannte Primer, chemisch zu synthetisieren, die in der Lagesind, sich so mit den beiden komplementären DNS-Strängen zu paaren, dass sie in 5‘ -> 3‘-Orientierung aufeinander ausgerichtet sind und den zu amplifizierenden Bereich flankieren.(Primer lässt man sich von Firmen herstellen und per Post schicken.)Der PCR-Reaktion liegt folgendes Prinzip zugrunde:(1.) DNS, welche die zu vermehrende Sequenz enthält, wird durch Temperaturerhöhung (ca.95°C) in ihre Einzelstränge zerlegt (denaturiert), d. h. dasdoppelsträngige DNS-Molekül wird „aufgeschmolzen“.(2.) Durch Temperaturabsenkung auf ca. 40 bis 50°C werden diebeiden vorher zugegebenen chemisch synthetisiertenOligonukleotide (= Primer) an die denaturierte DNShybridisiert, d. h. es werden Basenpaarungen ausgebildet,die die Primer mit der DNS verbinden. Die Sequenz derPrimers ist, wie bereits erwähnt, so gewählt, dass siekomplementär zu jeweils einem der Bereiche ist, die das zuvermehrende DNS-Segment flankieren. Oligonukleotide (z.B. 20-mere) werden im Überschuß zugegeben und paarenschneller (nicht jedoch stabiler) mit den jeweiligenkomplementären Regionen auf der DNS als dies die beidenlangen DNS-Einzelstränge tun.(3.) Die so entstehenden basengepaarten, kurzendoppelsträngigen DNS-Regionen mit den in Richtung der zuamplifizierenden DNS weisenden 3´-OH-Enden der Primersind Substrat für DNS-Polymerase, d.h. sie werden vondiesem Enzym benötigt, um eine DNS-Synthese zu starten.Nach Temperaturerhöhung auf 72°C werden durch einethermostabile DNS-Polymerase (z. B. Taq-DNS-Polymerase) die Primer mit 2´-Desoxyribonukleosid-5´triphosphaten(dNTPs) verlängert, so dass die entstehendenDNS-Stränge nun als Matrize für den jeweils anderen Primer dienen können.(4.) Der neusynthetisierte DNS-Strang kann dann in einem folgenden Zyklus nachDenaturierung wieder als Vorlage für die nächste Syntheserunde dienen. Auf diese Weiseläßt sich die Anzahl der DNS-Moleküle mit jedem Durchgang verdoppeln, solangeausreichend Primer und freie Nukleotide als Bausteine vorhanden sind. In jedem PCR-1

Zyklus, auch Temperatur-Zyklus genannt, werden daher drei Temperaturen zurDenaturierung der DNS (95°C), Hybridisierung der Oligonukleotide (etwa 40-50°C,abhängig von GC-Gehalt und der Länge des Primers) und Synthese der DNS (72°C)durchlaufen. Wiederholte Hitzedenaturierung der DNS-Doppelstränge, Anhybridisierender Primer und Verlängerung durch DNS-Polymerase führt zur enormen Anreicherungeines doppelsträngigen DNS-Fragments, das von den 5´-Enden der beiden Primerbegrenzt wird.Theoretisch können auf diese Weise aus einem einzigen DNS-Molekül nach 20 Zykleninfolge der ja exponentiellen Kettenreaktion ca. 1 Million (2 20 ) Kopien einer bestimmtenRegion erhalten werden. Gerade deshalb wird PCR oft dann eingesetzt wenn nur sehr geringeMengen des biologischen Ausgangsmaterials vorliegen (z. B. in der Kriminalistik). Die PCRist eine Standardmethode der Molekularbiologie, weil sie so schnell ist und vielegentechnologische Prozesse vereinfachen kann (z. B. eine gezielte Mutagenese).Ein zentraler Aspekt der Automatisierung der PCR-Reaktion war die Isolierung einerhitzeresistenten Polymerase (Taq-Polymerase) aus thermophilen Bakterien (z. B. Thermusaquaticus), die den Hochtemperaturschritt der DNS-Denaturierung übersteht und darum nichtbei jedem Zyklus neu hinzugegeben werden muß. Prinzipiell ließe sich die PCR natürlichauch mit einer anderen DNS-Polymerase durchführen.PrimerdesignGeeignete Sequenzen für die beiden Primer zu finden ist keine einfache Angelegenheit. Esmüssen eine ganze Reihe von Kriterien berücksichtigt werden, um ein funktionierendes Paarvon Primern zu entwickeln, zum Beispiel:- Zunächst einmal muss, wie gesagt, die Sequenz links und rechts des zu amplifizierendenFragments bekannt sein oder abgeschätzt werden können.- Will man Primer entwerfen, die für eine Reihe von Arten funktionieren, so muss manmögliche Variation zwischen den Sequenzen berücksichtigen und degenerierte Primerentwickeln. Degenerierte Primer sind eine Mischung von Primern mit leichtunterschiedlichen Sequenzen. Z. B. enthält der degenerierte Primer ACTGGCRTA eineMischung aus den Primern ACTGGCATA und ACTGGCGTA.- Die zwei Primer dürfen keine zueinander komplementären Abschnitte enthalten, sonstbilden sich Primer-Dimere, d. h. die Primer hybridisieren miteinander anstatt mit der DNS.- Die beiden Enden eines Primers dürfen nicht zueinander komplementär sein, sonsthybridisiert der Primer einfach mit sich selbst.- Die Primer dürfen nicht zu kurz sein, sonst sind sie nicht spezifisch genug und können mitmehreren Stellen im Genom hybridisieren.Wahl der Hybridisierungs-TemperaturDie Hybridisierungs-Temperatur ist meist ein Kompromiss, der die Balance hält zwischenzwei ungewünschten Effekten. Ist die Temperatur zu hoch, so werden die Primer nicht mit derZiel-DNS hybridisieren und man bekommt kein PCR Produkt. Ist die Temperatur zu niedrig,so werden die Primer nicht nur an einem einzigen Ort, sondern an zwei oder mehr Stellen derZiel-DNS hybridsieren, so dass zwei oder mehr verschiedene Fragmente amplifiziert werden.Der gewünschte Effekt, dass nur ein einziges, bestimmtes Fragment amplifiziert wird, passiertmeist nur in einem ganz engen Temperaturbereich. Bei manchen Primerpaaren gibt es so eineideale Temperatur gar nicht, man geht beim Absenken der Temperatur direkt von gar keinerAmplifikation zur Amplifikation mehrerer Fragmente.2

Today’s LabIn today’s lab, each group will amplify a gene from the genomic DNA that you isolated inweek two. You will set up a PCR and amplify one of two different genes that are involved intestes development in Drosophila. You will then visualize your results by running a 1%agarose gel (with ethidium bromide) in TAE (buffer) and taking a picture of the gel.Wear gloves for all of these procedures. Because we are amplifying DNA, there is greatpotential for contaminating your sample and amplifying other pieces of DNA as well.Therefore, be very careful about your technique at every step. When pipetting, try not to touchthe sides of the tube or the cap.Each group should set up their PCR reaction with the genomic DNA that both of you isolated.There are two different primer sets for two different genes. Each group will be given a primerset. Each group will also be assigned positions on the thermocycler that will correspond to aspecific temperature. Details of this will be discussed in class.Primer Sequences:TX2for =TX2rev =TX19for =TX19rev =PCR:5’-GTTTGAATAGCACACAATCGCG-3’5’-CTAGACGACACTGGCCAATAG-3’5’-AGTCGTCATTGTATTCTATAC-3’5’-CGAGTCACTGAGAAATGG-3’Take three 0,2 ml tubes. Next, set up your master mix: For each reaction, this will use:H 2 O 19,75 µl10X buffer 2,5 µldNTPs 0,5 µlforward primer 0,5 µlreverse primer 0,5 µlTaq polymerase 0,25 µlInstead of pipetting each ingredient individually into each reaction tube, it saves a lot of timeto first create a master mix that contains all of these ingredients and then simply aliquot 24µlof this master mix into each of your three tubes. For creating the master mix, multiply theamounts mentioned above by four:H 2 O 79 µl10X buffer 10 µldNTPs 2 µlforward primer 2 µlreverse primer 2 µlTaq polymerase 1 µlYou may wonder why we multiply by four when you only have three reactions. This is incase of pipetting error. As you have already discovered, sometimes pipets do not seem toalways agree about volumes. By making up one extra reaction, you ensure that you will haveenough for each tube.As with other enzymes, taq polymerase should always be kept on ice. Once you have addedthe polymerase to your master mix, you must keep your master mix on ice while distributingit to your DNA samples. After adding 24µl master mix to each of your 3 tubes, add 2µl ofyour two DNA samples (this is called the template) into two of the tubes and 2µl of sterile3