Chromatographische Trennverfahren - IBG

Chromatographische Trennverfahren
Trennprinzip in der Chromatographie:
- Als Chromatographie bezeichnet man eine Methode zur Trennung von Substanzen,
bei der sich die Moleküle, die zu trennen sind, zwischen zwei Phasen verteilen.
- Sie verteilen sich zwischen einer unbeweglichen (stationären) Phase und einer
beweglichen (mobilen) Phase.
- Die Trennung beruht auf den unterschiedlichen physikalisch-chemischen
Eigenschaften der verschiedenen Moleküle, die sich deshalb unterschiedlich lang in
den beiden Phasen aufhalten und somit getrennt werden können.
Gelchromatographie
- Säulenchromatographisches Trennverfahren, bei dem Substanzen nach ihrer
Molekülgröße getrennt werden.
- Verwendung poröser Gele als Säulenmaterial (Matrix)
- Der Porendurchmesser dieser Gele liegt in einem definierten Größenbereich.
- Moleküle, die größer als die größten Poren der Matrix sind, werden mit der mobilen
Phase ohne Verzögerung durch die Säule transportiert.
- Kleine Moleküle diffundieren in die Poren der Matrix und legen dadurch eine größere
Wegstrecke zurück.

Trenneffekt: - sterischer Ausschluß -> auch als Ausschlußchromatographie
bezeichnet
- Ursache: unterschiedliche Zugänglichkeit einzelner Porenbereiche
im porösen Festkörper
andere Bezeichnungen für das Trennverfahren:
- Gelfiltrations-Chromatographie
- Gelpermeationschromatographie

Gelmaterialien: Dextran, Agarose, Polyacrylamid
Dextran-Gele: - Handelsname: Sephadex
- Herstellung aus Polysaccharid Dextran (1,6-α-glycosidisch
verbundene Glucose-Einheiten), Vernetzung durch Epichlorhydrin
- je höher die Epichlorhydrinkonzentration, desto
• stärker die Vernetzung
• kleiner die Poren des Gels
• geringer der Anteil der hydrophilen OH-Gruppen
Anwendung der Gelchromatographie:
- Entsalzen von Proteinen
- Trennung von Polymer-, Protein-, Peptidgemischen
- Abschätzung der Molekulargewichte von Makromolekülen

Ionenaustausch-Chromatographie
- Chromatographisches Trennverfahren für Substanzen mit elektrischen Ladungen
- Verwendung einer unlöslichen, polymeren Matrix mit chemisch gebundenen
ionischen Gruppen
- die Gegenionen dieser Gruppen sind durch elektrostatische Kräfte nur locker
gebunden
- Gegenionen können gegen Ionen der mobilen Phase ausgetauscht werden
(reversibel)
Ionenaustausch-Matrix: - Polymerisations- und Polykondensationsharze
(z.B. Polystyrole)
- Cellulose
- vernetzte Polyacrylamid- oder Polydextrangele

Prinzip der Ionenaustauschchromatographie

Einteilung von Ionenaustauschern:
Art des Ionenaustauschers funktionelle Gruppe
Kationenaustauscher
stark sauer Sulfonsäure -SO 3 H
Phosphonsäure -PO(OH) 2
schwach sauer Hydroxy-Gruppe -OH
Anionenaustauscher
Carboxy-Gruppe -COOH
stark basisch quartäres Amin -N + (CH 3 ) 3
DEAE -(CH 2 ) 2 -N + H(C 2 H 5 ) 2
(Diethylaminoethyl-)
schwach basisch primäre Aminogruppe -NH 2
sekundäre Aminogruppe -NH-
tertiäre Aminogruppe -N-
I

Bestimmung von Proteinmengen
• Biuret-Probe: - colorimetrischer Test
- Bildung eines Komplexes zwischen Cu und den
N-Atomen der Peptidbindungen
- Messung der Farbvertiefung bei 540 nm
• Warburg-Test: - spektroskopischer Test
- geeicht auf Rinderserumalbumin
- Messung der Absorption bei 260 nm und 280 nm:
260 nm: Nucleinsäuren absorbieren
280 nm: aromatische Aminosäuren absorbieren
• Murphy, Kies: - spektroskopischer Test
- Absorption der Peptidbindung bei 215 nm und 225 nm

Expressionssysteme
Expressionsvektor:
- hier wird vermehrt ein Gen abgelesen, welches in ein Plasmid einkloniert
wurde, was zu einer erhöhten Expression führt.
wichtig für höhere Expression:
- starker Promotor � konservierte AT-reiche Sequenz (TATA-Box),
RNA-Polymerase mit hoher Affinität zu diesem Bereich
- Translation: Anlagerung der m-RNA mit der Shine-Dalgarno-Sequenz an die
Ribosomenuntereinheit � je konservierter die Sequenz, desto höher ist die
Affinität
Hohe Expressionsraten können den Zellmetabolismus beeinträchtigen und zum
Absterben der Zelle führen � es werden vorwiegend induzierbare Expressionssysteme
eingesetzt.

Induktion der Genexpression:
- Metabolitzugabe
- Entfernen bestimmter Kohlenstoffquellen
- Temperaturveränderung
Wichtige Promotoren in E. coli :
Promotor Quelle Induktion durch
pR Bakteriophage λ Temperatur
pL Bakteriophage λ Temperatur
lac β-Galactosidase-Gen (E. coli) IPTG
tac Hybrid aus lac- und trp-Promotor IPTG
T7 Bakteriophage T7 IPTG

Verschiedene Wirtssysteme mit Vor- und Nachteilen
Wirt Vorteile Nachteile
Bakterien • hohe Ausbeute • keine posttranslationalen
E.coli • einfache, billige Kultivierung Modifikationen eukaryotischer
• gute Raum/Zeit-Ausbeute Zellen, daher häufig keine
• Organismus umfassend bekannt, bioaktiven Proteine
einfach zu handhaben und zu • Expressionsprodukte eventuell
manipulieren schwerlöslich in Form von sog.
• zahlreiche Kontrollelemente „inclusion bodies“
auf Transkriptions- und
Translationsebene bekannt
Insektenzellen • viele posttranslationale Modifikationen, • Kultivierung von Insektenzellen
Proteinprozessierungs- und Sekretions- aufwendiger und langwieriger
mechanismen höherer eukaryotischer als von Bakterien
Zellen • einige posttranslationale Glyco-
• hohe Ausbeuten möglich sylierungen abweichend von
• System auch für die Expression Säugerzellen
großer Proteine gut geeignet

Wirt Vorteile Nachteile
Hefe • Organismus gut bekannt, • einige posttranslationale
Kultivierung und Manipulation Glycolisierungen abweichend
ausführlich beschrieben von Säugerzellen
• viele posttranslationale • Ausbeuten niedriger als bei
Modifikationen, Protein- Bakterien
prozeßierungsmechanismen
höherer eukaryotischer Zellen
Säugerzellen • alle posttranslationalen • Kultivierung vergleichsweise
Modifikationen, Protein- zeitaufwendig und teuer
prozeßierungsmechanismen • schlechte Raum-/Zeit-Ausbeute
höherer eukaryotischer Zellen