Klonierung_A4_Heft_für schule..

Skript- GENTECHNIK Klonierung 2
Restriktionsenzyme und Transformation
Klonierung
Die Klonierung ist eine molekularbiologische
Arbeitsmethode der Gentechnik mit dem Ziel
transgene, genetisch identische Zellen (Klone)
herzustellen. Dazu erfolgt ein Einbau eines definierten
DNA Abschnittes in einen Vektor, z.B ein bakterielles
Plasmid. Die Klonierung ist heute aus dem
molekularbiologischen Laboralltag nicht weg zu
denken. Die Grundlagen wurden mit Entdeckung der
Restriktionsenzyme und Entwicklung von Vektoren
bereits in den 1970er Jahren gelegt.
Bakterienzelle mit Vektorplasmid
Vektorplasmid
Isolation von DNA
Restriktionsenzym
Leuchtquallenzelle
*
Fremd-DNA mit GFP-Gen *
PCR
in der PCR wird das Gen
mehrfach kopiert
Herstellung transgener Bakterien
Zur Herstellung von transgenen Bakterien nutzt man
zwei wichtige Werkzeuge der Molekularbiologie: die
Plasmide und die Restriktionsenzyme.
Im ersten Schritt muss DNA aus dem
Spenderorganismus isoliert werden und in einem
zweiten Ansatz muss das Vektorplasmid isoliert
werden. Beide Ansätzen werden mit den selben
Restriktionsenzymen geschnitten. Nach einem
Aufreinigungsschritt, werden die losen DNA Enden mit
Hilfe der Ligase wieder verknüpft. Dabei kann sich das
Plasmid selbst wieder schließen, oder die Fremd DNA
wird eingebaut. Die so neu entstehenden
(rekombinaten) Plasmide werden in Bakterien
übertragen. Diesen Schritt nennt man Transformation.
Der Erfolg des Experiments, also die Aufnahme eines
rekombinaten Plasmids wird erst durch die Selektion
der Bakterien auf Nährmedienplatten sichtbar. Nur
Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben,
können auf den Nährmedienplatten mit Antibiotikum
wachsen. Dann beginnt die Kontrolle, ob die Plasmide
auch das eingefügte Gen tragen.
T
C AG
Amp
Vektorplasmid mit „sticky end“
TTAA
T
ATC
T
C
AA
Amp
Selbstligation
Hitzeschock
Ligation
Ligase
Die Ligase verbindet die „sticky ends“.
3
Restriktion
Transformation
G ATC
GFP-Gen mit „sticky ends“
Amp
GFP-Gen
Plasmid mit Fremd-DNA
Selektion auf
Nährmedien- Platten
Abb. 1: schematischer Ablauf der Herstellung transgener Bakterien.
2
AA TT
A
T A
TA T
A T
Gläsernes Labor
www.glaesernes-labor.de
Gläsernes Labor

Versuche im Gläsernen Labor
In unserem Versuch soll das Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP) in Bakterien übertragen
werden. Dieses Protein spielt eine große Rolle in der molekularbiologischen Forschung (siehe Extrablatt).
Es stammt ursprünglich aus der Qualle Aequorea victoria. Wird das GFP-Gen von den Bakterien
abgelesen, wird in ihrem Inneren das GFP-Protein gebildet und die Bakterien fluoreszieren grün. Das GFP
ist ein anschaulicher Stellvertreter für beliebige DNA, die in Bakterien transformiert werden kann.
Das Experiment Teil 1
Zwei Schritte des allgemeinen Ablaufs der Herstellung transgener Bakterien werden praktisch
durchgeführt: Isolation der Plasmide und Restriktion. Das Schneiden von DNA ist, nach der Isolation der
DNA, der erste Schritt um DNA neu zu kombinieren. in unserem Experiment soll der korrekte Einbau von
Fremd DNA (GFP Gen) in ein Plasmid (pGLO) bestätigt werden.
Das Experiment Teil 2
Auch in Teil 2 wird eine Restriktion durchgeführt. Ziel unser Versuche im Gläsernen Labor ist es die
Ligation des rekombinanten Plasmids durch einen Restriktionsverdau zu kontrollieren. Im Anschluss wird
eine Transformation mit dem PGLO Plasmid durchgeführt und die Bakterien werden auf Agarplatten zur
Selektion ausgestrichen.

Versuch DNA Isolation der Plasmide
Plasmide
Plasmide sind kleine ringförmige DNA-Moleküle, die in Bakterien relativ
häufig vorkommen. Gegenüber der genomischen DNA von Bakterien mit
4.600 Kilobasen, sind Plasmide mit 2-9 Kilobasen recht klein. Auf Plasmiden
kann beliebige DNA neu eingebaut werden. Das pGLO- Plasmid trägt unter
anderem die Gene für das GFP-Protein (green fluorescent protein). Wenn wir
dieses Plasmid in die Bakterien einbringen, ein Prozess, den wir
Transformation nennen, wird das GFP- Gen ablesen und die Bakterien bilden
das GFP- Protein. Dieses Protein sammelt sich in den Zellen an und führt
dazu, dass die Bakterien unter UV Licht grün fluoreszieren. Unser Plasmid hat
noch weitere Gene, wie eine Antibiotikaresistenz- Gen und ein Arabinose
Operon.
Plasmidkarten
Um zu veranschaulichen welche Gene auf den Plasmiden liegen, werden sog.
„Plasmidkarten“ genutzt. In der Mitte des Ringes steht der Name des
Plasmids und die Gesamtgröße in bp (Basenpaaren) oder kb (kilo
Basenpaaren). Gene sind oft als Pfeile, oder dickere Balken dargestellt. Die
Schnittstellen für Restriktionsenzyme werden angezeigt, manchmal mit der
Angabe der Position. Dabei beginnt man oben im Ring (auf 12 Uhr) mit der
Zählung der Basen.
ori
PstI 3181
Amp R
5370 / 1
pGLO
5.370bp
EcoRV 386
EcoRI 2063
PstI 2106
araC
GFP
Abb. 2: Plasmidkarte des pGLO-
Plasmids. Gene sind als Pfeile
dargestellt, z.B. in grün das Gen für
GFP- Protein. An entlang des Ringes
sind die Restiktionsschnittstellen
verschiedener Enzyme
eingezeichnet.
BamHI 1239
Isolation von Plasmid DNA
Aus einer Bakterienkultur entnehmen die Schüler*innen 2ml und isolieren
daraus die Plasmide. Zuerst werden die Bakterien abzentrifugiert und das
Medium wird verworfen. Die Bakterienzellen werden in einem Puffer wieder
gelöst und dann mit Lysispuffer versetzt. Der Lysispuffer enthält SDS, welches
die Zellmembran zerstört und NaOH (Natronlauge), welche für eine
Denaturierung der Nukleinsäuren (der genomischen DNA und der Plasmide)
führt. Durch Zugabe eines Neutrisationspuffers kann sich die DNA der kleinen
Plasmidringe wieder zusammenfinden, während die große genomische DNA
sich unentwirrbar verknäult bleibt. Im abschließenden Zentrifugationsschritt,
wird sich die gen. DNA dann, zusammen mit den denaturierten Proteinen am
Boden des Eppis sammeln und die Plasmide werden im Überstand
schwimmen. Die Plasmide werden durch eine Fällung weiter aufgereinigt. Dazu
wird Alkohol hinzugefügt und erneut zentrifugiert. Die Plasmide sind dann im
Pellet und können weiterverarbeitet werden.
Zur Kontrolle der Aufreinigung wird ein Photometer eingesetzt, welches
winzige Mengen vermessen kann, 2µl reichen zur Konzentrationsbestimmung
aus. Bei einer Plasmidisolation aus 2ml spricht man von mini prep und erzielt
Ausbeuten von 30-300ng/µl. zusätzlich können die Plasmide auch auf einem
Agarosegel sichtbar gemacht werden.
Abb. 3: die Messzelle des nano drop,
eines Photometers für Messungen im μl
Bereich.

Versuch Restriktion
Restriktion (enzymatisches Schneiden von DNA)
Das Schneiden von DNA ist, nach der Isolation der DNA, der erste Schritt um DNA neu
zu kombinieren. in unserem Experiment soll der korrekte Einbau von Fremd DNA (GFP
Gen) in ein Plasmid (pGLO) bestätigt werden.
Restriktionsenzyme
wurden schon in den 1970er Jahren entdeckt. Sie stellen ein einfaches „Immunsystem“
von Bakterien dar. Sie können fremde DNA, die beispielsweise durch Viren in die
Bakterien gelangt ist zerschneiden. Es gibt ca. 6.000 natürlich vorkommende
Restriktionsenzyme. Die Enzyme schneiden die DNA an genau definierten Stellen. Die
DNA hat an diesen Stellen einen palindromischen Aufbau. Jedes Restriktionsenzym hat
seine eigene Erkennungsstelle, aber immer liegt auf den DNA ein Palindrom vor. Im
Labor können ca. 700 verschiedene Restriktionsenzyme zum Einsatz kommen. Einige
Enzyme schneiden an der Erkennungssequenz die DNA mit einem Versatz. Dadurch
entstehen Überhänge, sog. sticky ends, die der Ligase die Arbeit erleichtern, weil sich die
Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Überhängen ausbilden.
5´ . . G AATT C . . 3´
3´ . . C TTAA G . . 5´
5´ . . G GATC C . . 3´
3´ . . C CTAG G . . 5´
Abb. 2: Restriktionsschnittstelle
von EcoRI (grün) und von
BamHI (rosa). Beide haben eine
andere Erkennungssequenz,
aber beide bilden ein Palindrom.
Restriktionsverdau zur Kontrolle der Ligation
Das GFP Gen wurde aus der Qualle mittels PCR gewonnen. Im Anschluss wurde mit den
beiden Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI die Ende geschnitten. Auch das
Vektorplasmid wurde mit den beiden Enzymen geschnitten. Nach einer Aufreinigung
wurden beide geschnittenen DNAs gemischt und mit Ligase versetzt. Über Nacht bei
16°C sollte die Ligase das GFP Gen in das Plasmid einbauen. Das so entstandene Plasmid
trägt nun den Namen pGLO. Der Vorteil einer Ligation mit zwei unterschiedlichen
Restriktionsenzymen liegt darin, dass das eingebaute Gen nur in einer Richtung
eingebaut werden kann, das die sticky ends von den beiden Enzymen nicht kompartiebel
sind. Dies ist nicht immer zwingend nötig, aber ein sehr elegante Vorgehensweise.
Um zu kontrollieren, ob diese Ligation erfolgreich war wird das Plasmid pGLO erneut mit
den Enzymen geschnitten. In einem Ansatz wird das Plasmid ausschließlich mit EcoRI in
anderen Ansatz mit BamHI geschnitten. In einem dritten Ansatz werden beide Enzyme
eingesetzt. Um die durch die Restriktion entstandenen DNA Stücke von einander zu
trennen und sichtbar zu machen, wird die Gelelektrophorese eingesetzt.
Auswertung Restriktion: Agarosegelelektrophorese
Mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese können DNA-Fragmente der Größe nach
aufgetrennt und sichtbar gemacht werden. Gele aus Agarose liegen in einem Puffertank
an dessen Enden sich Elektroden befinden. Den Puffer im Tank brauchen wir, um den
pH-Wert konstant zu halten und die elektrische Leitfähigkeit zu gewährleisten. Agarose
ist ein Pulver aus einer Rotalge, mit dem man ein Gel herstellen kann. Die Agarose löst
sich beim Erhitzen im Wasser. Mit Hilfe eines „Kammes“ werden Taschen im Gel
hinterlassen, in welche die PCR Probe eingefüllt wird. Der Ladepuffer sorgt dafür, dass
die Proben in die Tasche einsinken. Durch Anlegen einer Spannung wandern die negativ
geladenen DNA Moleküle im Gel zu Anode (zum positiven Pol). Kurze DNA-Moleküle
können schneller durch das dichte Netz der Agarose wandern, als lange DNA-Moleküle.
So kommt es zu einer Auftrennung. Der im Gel eingesetzte Farbstoff (Ethidiumbromid)
bindet an die DNA, wodurch sie mit UV Licht sichtbar gemacht werden kann.
Abb. 1: Eine Kammer für die
Gelelektrophorese mit dem
Spannungsgeber, eingestellt auf 120V.

Versuch Transformation
Bakterien im Labor
Ein großer Vorteil der Bakterien ist die einfache Kultivierung. Sie lassen sich
in einem Nährmedium kostengünstig züchten und haben kurze
Generationszeiten. Das Darmbakterium E. coli teilt sich etwa alle 20 Minuten.
Die entstanden Tochterzellen sind ein identische Kopie der Elternzelle-
Klone. Erfolgt die Anzucht der Bakterien auf festen Nährmediumplatten
(Agarplatten), bilden sich über Nacht deutlich sichtbare Punkte auf der
Oberfläche. Jeder Punkt geht auf ein Bakterium zurück, man spricht von
einer „Kolonie“ oder einer „KBE“ (Kolonie bildenden Einheit).
Abb. 3: Agarplatte mit Kolonien.
Jede Kolonie besteht aus ca. 1
Millionen identischen Bakterien.
Transformation
Bakterien nehmen unter normalen Bedingungen sehr selten DNA aus der
Umgebung auf. Damit im Labor erfolgreich transformiert werden kann,
werden sogenannte „kompetente Bakterienzellen“ verwendet, die leichter
Fremd-DNA aufnehmen. Die Bakterien werden mit einer
Calciumchloridlösung (Transformationslösung) behandelt, was dazu führt,
dass die Zellwand „instabil“ wird. Durch einen künstlich herbeigeführten
Hitzeschock reißt die Doppellipidschicht kurzzeitig auf und die Plasmide
können ins Zellinnere gelangen. Die Bakterien sollten schnell in Eis
abgekühlt werden, damit sich die Membran wieder schließen kann.
Im Anschluss brauchen die Bakterien Zeit sich zu erholen und vor allem Zeit
um die Information auf den Plasmiden abzulesen. Denn zusätzlich zum GFP
Gen tragen die Plasmide noch eine Resistenzgen gegen ein Antibiotikum
(Ampicillin). Dieses ist für die anschließende Selektion entscheidend. Nur
Bakterien, die ein Plasmid aufgenommen haben werden auf den
Nährmedienplatten wachsen.
Abb. 5: Plasmide können durch die
Menbran gelagen, wenn diese durch
CaCl2 aufgeweicht wurde und durch
einen Hitzeschock kurzfristig aufreist.
Selektion auf Agarplatten
Bei der Transformation nehmen nur sehr wenige der kompetenten Zellen
(etwas jede tausendste) die Fremd-DNA auf. Um erfolgreich transformierte
Zellen von solchen zu unterscheiden, die keine Plasmid-DNA aufgenommen
haben, wird eine Selektion auf Medium mit Antibiotikum (Ampicillin)
verwendet. Nur die Bakterienzellen, die das Plasmid aufgenommen haben,
können auf einem ampicillinhaltigen Nährboden wachsen. Alle anderen
Bakterien sterben ab. Wichtig bei Experimenten ist das Mitführen von
Kontrollen! Daher werden in dem Versuch zwei Mal Bakterien angesetzt.
Einmal mit Zugabe von Plasmid, einmal ohne.

Versuchsdurchführung: Isolation von Plasmid DNA (mini prep)
+ 250µl Resuspensionlsg.
+ 2µl RNAse
A) Zellaufschluss
Pellet aus
Bakterien
25°C
auftauen
1. Taue die Eppis mit dem Bakterienpellet auf, oder entnimm 2ml
frische Bakterienkultur und zentrifugiere 5min bei 5.000rpm..
2. Gib in das Eppi 250µl Resuspensionspuffer (pH 8) hinzu.
3. Gib danach 2µl RNAse dazu.
4. Vortexe die Probe, bis sich das Pellet vollständig gelöst hat.
+ 250µl
Lysispuffer
+ 250µl
Neutralisationslösung
25°C
5min 0°C
30min
5. Gib 250µl Lysispuffer (SDS, NaOH pH12) dazu, mische
vorsichtig (nicht vortexen) und inkubiere für 5min bei
Raumtemperatur.
6. Gib 250µl Neutralisationslösung (KaAc pH5) dazu und mische
vorsichtig (nicht vortexen) und inkubiere für 10-30min auf Eis.
7. Zentrifugiere bei maximaler Geschwindigkeit (13.000rpm) für 10min.
10min
13.000 rpm
8. Pipettiere den Überstand vorsichtig ab und gib ihn in ein sauberes
Eppi.
500µl Isopropanol
10min
25°C
10min
13.000 rpm
500µl 70% Ethanol
B) Alkoholfällung
9. Gib 500µl Isopropanol zu dem Überstand, mische durch 3maliges
Kippen und inkubiere 10min bei Raumtemperatur.
10. Zentrifugiere bei maximaler Geschwindigkeit (13.000rpm) für
10min. Gieße den Überstand ab.
2min
25°C
10min
13.000 rpm
11. Gib 500µl 70% iges Ethanol in das Eppi und mische durch
3maliges Kippen und inkubiere 2min bei Raumtemperatur.
12. Zentrifugiere erneut bei 13.000rpm für 10min. Gieße den Überstand
ab.
10min trocknen
10min
55°C
13. Trockne das Pellet bei 55°C im Thermoblock
30µl Wasser
C) Lösen der DNA und ontrolle
10min lösen
10min
55°C
14. Gib 30µl reines Wasser auf das Pellet und löse es in 5min bei
55°C im Thermoblock.
15.Entnimm 2µl der Plasmidlösung und pipttiere dies vorsichtig auf das
Messfeld des nano Photometers.
16.Notiere die Konzentration der Plasmidlösung (Messung bei 260nm)
und die Reinheit (Quotient von 260nm zu 280nm)

Versuchsdurchführung: Restriktionsanalyse der Ligation
auftauen
25°C
A) Restriktionsansatz
Plasmid DNA
Restriktionspuffer
1. Taue die Eppis mit der Plasmid DNA sowie
Restriktionsenzyme, und den Restriktionspuffer auf.
10µl
Puffer
8µl
Plasmid DNA
10µl
Puffer
8µl
Plasmid DNA
10µl
Puffer
8µl
Plasmid DNA
2. Gib zu jedem Enzym je 10µl Restriktionspuffer und
8µl Plasmid DNA hinzu.
2µl EcoRI 2µl BamHI
2µl EcoRI
2µl BamHI
3. Zentrifugiere die Eppis kurz an um alle Tropfen auf dem
Gefäßboden zusammenzuführen.
zentrifugieren 20 sec
B) enzymatische Reaktion
37°C
30min
4. Stelle die Eppis in einen Heizblock und lasse diese bei 37°C
für 30min inkubieren.
4µl Probenpuffer
4µl Probenpuffer
4µl Proben
puffer
C) Agarosegel beladen
5. Nimm die Eppis aus dem Heizblock.
6. Gib 4µl Probenpuffer in jedes Reaktionsgefäß.
EcoRI
EcoRI
EcoRI
BamHI
7. Mische die Proben durch kurzes Andrücken der
verschlossenen Eppis an die rotierende Gummischeibe des
Vortexers.
20µl DNA Probe
8. Gib 20µl jeder Probe in jeweils eine separate Tasche des
vorbereiteten Agarose-Gels.
1% Agarosegel
9. pipettiere 5µl des Markers (1kb ladder) und 5µl der
Kontrollen in die letzten Taschen
TAE Puffer
D) Agarose-Gelelektrophorese
Tasche
10. lege den Deckel der Gelkammer so auf, dass die Anode (+)
von den Taschen abgewandt ist
11. stelle die Spannungsquelle auf 120 V ein und lass das Gel
für ca. 20 min laufen
12. nimm das Gel mit Handschuhen und einem Schieber aus
der Kammer und lege es auf den UV-Tisch, schalte das UV-
Licht an
Vorsicht: direkten Augenkontakt mit UV Licht
vermeiden; Handschuhe zum Schutz vor
Ethidiumbromid tragen!!
13. fotografiere das Gel und werte die Banden aus
Abb. 1: Eine Kammer für die Gelelektrophorese mit dem
Spannungsgeber, eingestellt auf 120V.

Versuchsdurchführung: Transformation
1. Lege je 250µl Transformationslösung in je ein
Eppis vor („+ pGLO" bzw. „- pGLO“).
250µl Transformationslösung
+ pGLO - pGLO
2. Überführe mit einer Impföse je eine Kolonie von
der Starterplatte in die vorgelegte
Transformationslösung.
Starterplatte
2µl Plasmid
3. Gib 2µl der Plasmid-Lösung nur in das „+pGLO“-
Eppi.
+ pGLO
- pGLO
4. Inkubiere beide Eppis für 10 min im Eisbad.
10min
Eisbad
0°C
5. Entnimm beide Eppis dem Eisbad und stelle sie für
50sek in einen auf 42°C temperierten Heizblock.
50sek
Heizblock
42°C
6. Stelle die Eppis sofort wieder ins Eisbad und kühle
sie für 2min ab.
2min
Eisbad
0°C
250µl Nährlösung
250µl Nährlösung
7. Gib 250µl Nährlösung in beide Eppis und
inkubiere für 10min bei Raumtemperatur.
+ pGLO
10 min
RT
25°C
- pGLO
8. Gib jeweils 50µl der beiden Proben
„+ pGLO" bzw. „- pGLO" auf die Agarplatten (siehe
Abbildung).
50µl 50µl 50µl 50µl
9. Verstreiche die Suspension mit einer Impföse
gleichmäßig auf jeder Platte.
10. Stelle die Platten bei 37°C in den Brutschrank
und inkubiere über Nacht.
Nähragar + Ampicillin+
Arabinose
Nähragar + Ampicillin
Nähragar
11. Betrachte die gewachsenen Kolonien unter der
UV-Handlampe.

Auswertung
Auswertung der DNA Isolation
Der Erfolg der DNA Isolation kann im Photometer
überprüft werden. Für die Vermessung von DNA
Proben sind die Photometer mit Küvetten nicht
geeignet, da die DNA Lösungen zu geringe Volumen
haben. Spezielle Photometer (Nano drop) können
kleinen Volumen von 1-2µl vermessen.
DNA hat ein Absorptionsmaximum bei einer
Wellenlänge von 260nm. Das Lambert-Beersche
Gesetzt besagt, dass die Absorbtion proportional zur
Konzentration ist. Moderne Geräte berechnen aus der
Extinktion gleich die Konzentration der DNA Probe.
Zusätzlich kann das Photometer eine weitere Messung
bei 280nm durchführen. Bei dieser Wellenlänge
absorbieren die Proteinen. Der Quotient von der
Extinktion bei 260 zu der Extinktion bei 280nm gibt
Auskunft über die Reinheit der Probe. Liegt der Wert
bei 1,8 spricht man von „sauberer“ DNA. Ist der Wert
kleiner als 1,8, ist die Probe mit Proteinen verunreinigt.
Dies kann vorkommen, wenn bei der Isolation etwas
von dem weißen Proteinpellet mit der Pipette
eingesaugt wurde. Eine starke Verunreinigung mit
Proteinen kann das Weiterbearbeiten der DNA, z.B. die
Restriktion stören.
Abb. 6: Display von unseren Nano drop. MUSTER Das
Absorptionsmaximun dieser Probe liegt bei 260nm und ergibt
eine Konzentration von 508ng/µl. Die Reinheit von 1, 9 ist sehr
gut. Es sind wenige Proteinreste in der Probe enthalten.

Auswertung
Auswertung der Restriktion
Das pGLO Plasmid wird von zwei unterschiedlichen
Restriktionsenzymen (EcoRI und BamHI) geschnitten. Die
entstanden Bruchstücke werden in einer Gelelektrophorese
aufgetrennt. Im Anschluss, können die unterschiedlich langen
DNA Fragmente des Restriktion als so genanntes Badenmuster
unter UV Licht sichtbar gemacht werden.
In der Plasmidkarte ist zu erkennen, dass beide Enzyme eine
Schnittstelle auf dem Plasmidring haben.
In Spur 1 ist der Ansatz mit EcoRI aufgetragen, in Spur 2 mit
BamHI. In beiden Fällen wird das pGLO Plasmid nur an einer
Stelle geschnitten, man spricht von einem linearisierten Plasmid.
Die Bande läuft auf der Höhe von 5.300bp. Wird das Plasmid
mit beiden Enzymen geschnitten (Spur 3), dann wird das GFP
Gen aus dem Plasmidring entfernt und bildet eine zweite Bande
bei 230bp. Der verbleibende Plasmidring ist dann natürlich
kleiner als im linearisierten Fall und die Bande liegt tiefer im Gel.
- Taschen
- Plasmid + GFP 5.300bp
- Plasmid - GFP 5.070bp
- GFP 230bp
Abb. 6: Foto eines Agarosegels. Die durch
Ethidiumbromid angefärbten DNA Banden
fluoreszieren. In zwei von unseren Laboren haben wir
Farbkameras, so dass die DNA Banden in orange
erscheinen.

Auswertung
Auswertung der Transformation
Das Plasmid pGLO
Für die Auswertung muss das verwendete Plasmid pGLO genauer angeschaut werden (siehe Plasmidkarte):
1) Das Plasmid trägt nicht nur das GFP-Gen (grün), sondern kodiert gleichzeitig für eine Antibiotikaresistenz gegen
Ampicillin (AmpR rosa). Nur die Bakterien, die das Plasmid aufgenommen haben, können auf einem
ampicillinhaltigen Nährboden wachsen. Alle anderen Bakterien sterben durch das Antibiotikum ab.
2) Das Plasmid trägt ein Gen für ein Regulator-Protein (araC hellblau). Für das Wachstum von Bakterien mit Arabinose
(Zweifachzucker) muss diese erst in Glucose umgewandelt werden. Dafür sind drei Enzyme notwendig, welche
gemeinsam auf einem DNA Abschnitt, dem ara-Operon codiert sind. Die Transskription dieser Strukturgene wird
durch ein Regulator-Protein (codiert von araC) verhindert. Erst bei Anwesenheit von Arabinose im Medium, gibt das
Regulator-Protein die Transskription der Stukturgene frei. Werden statt der Strukturgene andere Gene, z.B. das GFP
Gen in das Operon eingebaut, wird die Expression vom GFP erst in Anwesenheit von Arabinose angeschaltet.
Kontrollansatz:
Bakterien OHNE Plasmid
Transformationsansatz:
Bakterien MIT Plasmid
Über Nacht bei
37°C inkubieren
Bakterieller Rasen
Kein Wachstum
weiße Kolonien
grüne fluoreszierende
Kolonien
posiv Kontrolle: alle Bakterien
wachsen, es sei denn die Prozedur
der Transformaon war zu
stressig und die Bakterien haben
nicht überlebt.
negav Kontrolle: hier dürfen
keine Bakterien wachsen, da kein
Plasmid dazu gegeben wurde,
sind die Bakterien nicht resistent
gegen Ampicillin.
Hier wachsen alle Bakterien, die
ein Plasmid aufgenommen haben,
denn sie sind nun resistent gegen
das Anbiokum. Es wachsen
aber deutlich weniger als auf der
posiv Kontrolle, da nicht alle
Bakterien Plasmide aufnehmen.
Hier wachsen ebenfalls nur
Bakterien, die ein Plasmid
aufgenommen haben. Da im
Medium Arabinose vorhanden ist,
fluoreszieren die Bakterien grün,
weil Arabinose den Repressor
bindet und die Transskripon des
GFP-Gen freigibt.

Arbeitsblatt: Ablauf der Klonierung
Bakterienzelle mit Plasmid
Leuchtquallenzelle
Die Schritte der Klonierung.
Beschreibe die 5 Schritte.
- 1 ________________
1
Plasmide Fremd-DNA mit GFP-Gen *
*
PCR
- 2 ________________
- 3 ________________
- 4 ________________
- 5 ________________
Restriktionsenzym
e
in der PCR wird das Gen
mehrfach kopiert
T
C AG
c
T
T
AA
2
G ATC
GFP-Gen
AA TT
Amp
GFP-Gen mit „sticky ends“
Ligase
A
T A
TA T
A T
CT
AG
TTAA
b
Amp
Selbstligation
3
a
Amp
Plasmid mit Fremd-DNA
Die Ligase verbindet die „sticky ends“.
d
Ordne folgende Begriffe der
Abbildung (a bis e) zu und
beschreibe deren Funktion:
- Resistengen
4
- Zielgen
- Vektorplasmid
- rekombinates Plasmid
5
- Hitzeschock
Abb. 1: schematischer Ablauf der Herstellung transgener Bakterien.