Clajus, Christian: Die Rolle von uPAR beim akuten - Medizinische ...

Aus der Abteilung für Nephrologie
der Medizinischen Hochschule Hannover
Die Rolle von uPAR beim akuten Nierenversagen
und bei der akuten Nierentransplantatabstoßung im
Mausmodell
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
an der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Christian Clajus
aus Chur, Schweiz
Hannover 2008

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 09.07.2008.
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover.
Präsident: Professor Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer/Betreuerin der Arbeit: Professorin Dr. med. Faikah Güler
Professor Dr. med. Hermann Haller
Referent: PD Dr. med. Lars Pape
Korreferent: Professor Dr. med. Gregor Theilmeier
Tag der mündlichen Prüfung: 09.07.2008
Promotionsausschussmitglieder: Professor Dr. med. Michael Manns
Professor Dr. med. Arnold Ganser
Professorin Dr. med. Marion Haubitz

Für meine liebe Familie

Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Seite
1 Einleitung 1
1.1 Akutes Nierenversagen 1
1.2 Nierentransplantatabstoßung 7
1.3 Das uPA/uPAR-System 7
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit 8
2 Material und Methoden 10
2.1 Material 10
2.1.1 OP-Materialien 10
2.1.1.1 OP-Geräte 10
2.1.1.2 Bestecke und Nahtmaterialien 10
2.1.1.3 Narkosematerialien 11
2.1.1.4 Sonstige OP-Materialien 11
2.1.2 Geräte für die immunhistochemischen Färbungen 11
2.1.3 Quantitative real-time-PCR 11
2.1.4 Tierstämme 12
2.1.5 Chemikalien 12
2.1.6 Antikörper 14
2.2 Methoden 15
2.2.1 Ischämie-Reperfusionsschaden 15
2.2.2 Heterotrope Nierentransplantation und Gewebeentnahme 15
2.2.3 Organentnahme 16

II
Inhaltsverzeichnis
2.2.4 Blutabnahme und Kreatininbestimmung 16
2.2.5 Histologie und Immunhistologie 16
2.2.5.1 PAS-Färbung 17
2.2.5.2 Immunhistochemische Färbung 17
2.2.5.3 Dihydroethidium-Markierung 19
2.2.5.4 TUNEL-Assay (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated
dUTP Nick End-Labeling) 20
2.2.6 mRNA-Isolation und quantitative PCR 22
2.2.7 Statistische Analysen 23
3 Ergebnisse 24
3.1 Einfluss von uPA/uPAR-Defizienz auf den IR-Schaden 24
3.1.1 Nierenfunktion bei IR-Schaden 24
3.1.2 Histologie bei IR-Schaden 26
3.1.3 Zelluntergang beim IR-Schaden 27
3.2 uPA/uPAR bei allogener Nierentransplantation 29
3.2.1 Renale uPA/uPAR-Expression nach allogener
Nierentransplantation 29
3.2.2 Überleben nach allogener Nierentransplantation bei uPA- und
uPAR-Defizienz 33
3.2.3 Nierenfunktion nach allogener Nierentransplantation bei uPA-
und uPAR-Defizienz 34
3.2.4 Histologie nach allogener Nierentransplantation bei uPA- und
uPAR-Defizienz 37
3.2.5 Apoptose nach allogener Nierentransplantation bei uPAR-
Defizienz 39
3.2.6 Freie Radikale nach allogener Nierentransplantation bei uPAR-
Defizienz 41
3.2.7 Inflammatorische Zellinfiltrate nach allogener
Nierentransplantation bei uPAR-Defizienz 43

III
Inhaltsverzeichnis
4 Diskussion 49
4.1 uPAR-Defizienz und die Generierung von ROS 49
4.2 uPAR-Defizienz und die Migration von inflammatorischen
Zellen 52
5. Zusammenfassung 56
6 Literaturverzeichnis 57
7 Abkürzungsverzeichnis 62
8. Abbildungsverzeichnis 65
Danksagung 66
Lebenslauf 67
Erklärung 68

1 Einleitung
1.1 Akutes Nierenversagen
1
1 Einleitung
Die Niere ist ein Organ, welches sehr sensibel auf Sauerstoffunterversorgung
reagiert. Schon bei kleineren Mangelzuständen werden verschiedene Signalwege in
der Niere aktiviert und führen vorübergehend oder dauerhaft zu einer Einschränkung
der Nierenfunktion (akutes Nierenversagen, ANV). Durch die Niere fließen ca. 25%
des Herzzeitvolumens. Um den Perfusionsdruck und auch die Sauerstoffversorgung
des Nierenparenchyms konstant zu halten, verfügt diese über einen
Autoregulationsmechanismus (Bayliss-Effekt). Über die Vasa afferentes und Vasa
efferentes kann der Blutfluss reguliert werden, was es der Niere ermöglicht,
systolische Blutdruckschwankungen zwischen 80-200 mmHg zu tolerieren. Sollte
aber diese Autoregulation ausfallen, der Perfusionsdruck stark abfallen (z.B. durch
Schock, Infarkt oder Urinabflussstörungen) und sich nachfolgend auch die
Sauerstoffversorgung des Gewebes reduzieren, entstehen zum Teil reversible oder
aber irreversible Schäden an der Niere, je nach Ausprägung der Ischämie.
Besonders betroffen ist der Abschnitt in der Niere, in der die niedrigsten
Sauerstoffpartialdrücke herrschen. Dies ist das Segment 3 im äußeren Streifen der
äußeren Medulla (outer-stripe of the outer-medulla, OSOM). Die Gefäßversorgung
der Niere mit sauerstoffreichem arterialisiertem Blut erfolgt kortikal über die
afferenten Arteriolen. Dieses durchfließt im Glomerulum das erste Kapillarbett und
anschließend in den Vasa recta, zur Versorgung des Marks, das zweite Kapillarbett.
Die Vasa recta ziehen aber direkt herunter zur Papillenspitze, um erst dann wieder in
den äußeren Teil der Medulla zu gelangen (dem Tubulusverlauf folgend). Dadurch
befindet sich im OSOM, mit Sauerstoffpartialdrücken von ca. 10-20 mmHg, das
Gebiet der geringsten Sauerstoffversorgung, im Kortex hingegen liegt der
Sauerstoffpartialdruck bei 40-50 mmHg (Abb. 1.1.1).

pO2 = 50 mmHg
pO2 = 10-20 mmHg
Kortex
S3
Dünner
absteigender
Ast
S3
2
Dicker
aufsteigender
Ast
Äußerer
Streifen
Innerer
Streifen
Sammelrohr
Äußere
Medulla
Innere
Medulla
1 Einleitung
Abb. 1.1.1 zeigt die Nierenarchitektur und die entsprechenden
Sauerstoffpartialdrücke.
Sauerstoffpartialdruck.
Im OSOM Bereich herrscht der niedrigste
Ein weiterer Faktor, der neben der Sauerstoffunterversorgung zum ANV führt, ist die
postischämische Reperfusion. Wird dem unterversorgten Gewebe nach dem
ischämischen Ereignis nun wieder Sauerstoff angeboten, kommt es zur Ausbildung
von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Diese Sauerstoffradikale fallen dann in so
hoher Menge an, dass die antioxidative Kapazität des Nierengewebes überschritten
wird. Dieser oxidative Stress führt dann in weiterer Konsequenz zur Apoptose von
Nierenzellen mit nachfolgender Entzündungsreaktion und Funktionsverlust der Niere
(ANV).
In der Klinik hat das akute Nierenversagen eine wichtige Bedeutung. Es handelt sich
dabei um eine abrupt auftretende Verschlechterung der Nierenfunktion mit Anstieg
S2
S1
Kriz and Bankir, 1988

3
1 Einleitung
der Retentionsparameter (Serum-Harnstoff, Serum-Kreatinin) bis hin zur Urämie mit
Bewusstseinsverlust und Multiorganversagen. Oftmals ist beim ANV die Harnbildung
deutlich vermindert oder ganz versiegt (Oligo- oder Anurie).
Klinisch wird das ANV in drei Gruppen eingeteilt:
1. Prärenales akutes Nierenversagen: Aufgrund einer renalen Minderperfusion,
z. B. im Rahmen von Schockzuständen, Blutverlusten oder Hypotensionen,
kann ein ANV eintreten.
2. Intrarenales akutes Nierenversagen: Durch direkte toxische
Tubulusschädigung (z.B. durch nephrotoxische Medikamente wie
Aminoglykoside oder bestimmte Kontrastmittel) oder durch primäre
Nierenerkrankungen (akute Glomerulonephritis oder interstitielle Nephritis)
kann es zu einem ANV kommen.
3. Postrenales akutes Nierenversagen: Harnabflussstörungen durch Steinleiden
oder Prostatahypertrophie können zu Stauungsnieren und somit zum ANV
führen.
Die Ursachen für ein akutes Nierenversagen sind zumeist exogene oder endogene
Gefäßverengungen, hypoxische Ereignisse im weitesten Sinne (z.B. intra-, peri- und
postoperative Kreislaufinsuffizienz) und Nephrotoxine (z.B. Kontrastmittel,
Antibiotika). Auch im Rahmen der Nierentransplantation spielt das akute
Nierenversagen eine wichtige Rolle. Im Falle von Leichennierenspenden treten
immer längere kalte Ischämiezeiten (im Mittel ca. 12 Stunden) der Spenderniere auf,
so dass auch hier postoperativ ein ANV im Rahmen des IR-Schadens auftreten kann.
In der folgenden Tab. 1.1.2 sind Inzidenzzahlen für das Auftreten eines akuten
Nierenversagens im Rahmen von kardiochirurgischen Eingriffen bzw. bei Sepsis und
Intensivaufenthalten dargestellt.

Kardiochirurgie
abdominelle Aortenaneurysma
Resektionen
Sepsis
ICU
Aminoglykosid Therapie
mildes ANV
(Kreatinin < 3 mg/dl)
in %
4
5 - 20
5 - 10
30 - 35
19 - 50
5 - 20
Tab.1.1.2 zeigt die Inzidenzzahlen für das Auftreten des ANV.
1 Einleitung
schweres ANV
(Kreatinin > 5 mg/dl)
in %
2 - 5
2 – 5
15 - 25
10-15
1 - 2
Schrier NEJM 2004
Das postischämische akute Nierenversagen ist das Resultat mehrerer
pathophysiologischer Mechanismen. Zum einen entsteht durch die lokale Produktion
von Vasokonstriktoren (Endothelin, Angiotensin-II) eine mikrovaskuläre
Gefäßverengung, zum anderen wird eine ausgeprägte tubuläre Apoptose
herbeigeführt (Bonventre, J. V. et al. 2003). In den Tubuli werden die
postischämischen Ereignisse sehr deutlich, es entwickelt sich eine akute
Tubulusnekrose (ATN). Dabei kommt es zum Verlust des Bürstensaums, einem
Polaritätsverlust an der Basalmembran und schließlich zur Apoptose der
Tubuluszellen mit Zelldetritus im Tubuluslumen (Abb. 1.1.3 und Abb. 1.1.4).

apikal
Tubulus-
lumen
Verlust
Bürstensaum
Integrine
Na/K
ATPase
Lebende
Epithelzelle
Abb.1.1.3 zeigt ein Schema der Pathophysiologie des ANV.
5
Zelltod
Polaritäts-
verlust
basolateral
1 Einleitung
Apoptose
Schrier JCI 2004

Normale Niere Akute Tubulusnekrose
6
Gueler et al., J. Am. Soc
Nephrol.2002
� Verlust des Bürstensaums
� Tubulusepithelzellen im Lumen
� interstitielles Ödem
� interstitielle Inflammation
1 Einleitung
Abb. 1.1.4 zeigt die histologischen Veränderungen bei ANV. Zu sehen ist der
Verlust des Bürstensaums, Tubulusepithelzellen im Lumen, ein interstitielles
Ödem und vermehrt interstitielle Entzündungszellen; aus Gueler, F. et al. 2002.
Die aus den morphologischen Schäden resultierende renale Dysfunktion ist das
Produkt aus mehreren pathopysiologischen Ereignissen. So spielen mikrovaskuläre
Ereignisse in Kortex und Medulla, wie auch zelluläre Veränderungen der Tubuli eine
wichtige Rolle.
Der IR-Schaden kann gut im Tiermodell simuliert werden. Durch passageres
Abklemmen des Nierengefäßstiels kann im Mausmodell ein ANV mit konsekutivem
Kreatininanstieg erzeugt werden. Diese Modelle eignen sich zur Analyse molekularer

7
1 Einleitung
Mechanismen, die zum ANV führen, zur Untersuchung von knock-out Mäusen und
auch zum Erproben neuer therapeutischer Strategien.
Trotz der vielen erfolgreichen Ansätze zur Verhinderung eines ANV in
tierexperimentellen Studien hat sich bisher keine einheitliche Therapie für dieses
heterogene Krankheitsbild durchgesetzt (Dishart, M. K. et al. 2000).
1.2 Nierentransplantatabstoßung
Das akute Nierenversagen spielt auch in der Transplantationsmedizin eine große
Rolle. Bei jeder Organtransplantation treten durch die Organentnahme und
Transportwege Ischämiezeiten (Zeiten mit Sauerstoffmangel) auf, das bedeutet, dass
die Organe im Durchschnitt 12-15 Stunden (zum Teil auch länger) nicht durchblutet
werden und einen Sauerstoffmangel erleiden. Die Dauer der kalten Ischämiezeit ist
ein wichtiger Trigger für die akute Nierentransplantatabstoßung (Land, W. G. 2005).
Durch die Hypoxie werden zelluläre Signalkaskaden aktiviert, die zu einer Aktivierung
von immunkompetenten Zellen führen und somit auch eine Abstoßung vermitteln
können. Auch für das chronische Transplantatversagen spielt die kalte Ischämiezeit
eine erhebliche Rolle. Bereits 6 Monate nach Transplantation ist in ca. 40% der
Nierentransplantate eine massive Bindegewebsvermehrung (Fibrosierung) mit einem
erheblichen Verlust von niereneigenem Gewebe sichtbar. Wichtige Faktoren, die zu
einer späteren Bindegewebsvermehrung beitragen, sind lange Ischämiezeiten vor
der Transplantation und wiederkehrende Abstoßungsereignisse. Die Länge der
kalten Ischämiezeit ist einer der wichtigsten Prädiktoren für die Ausbildung einer
chronischen Nierentransplantatabstoßung (Schwarz, A. et al. 2002). Diese ist durch
eine zunehmende Eiweißausscheidung (Proteinurie), einen zunehmenden
Nierenfunktionsverlust und eine zunehmende Bindegewebsvermehrung und auch
Entzündung (Inflammation) der Niere gekennzeichnet.
1.3 Das uPA/uPAR-System
Der Urokinase-Typ-Plasminogen-Aktivator (uPA) ist ein multifunktionelles Molekül,
welches einerseits als ein proteolytisches Enzym und andererseits als Ligand zur
Induktion von Signalkaskaden dient. Der entsprechende Urokinase-Typ-
Plasminogen-Aktivator-Rezeptor (uPAR; CD87) war ursprünglich als

1 Einleitung
Proteinaserezeptor für uPA identifiziert worden. Er steuerte proteolytische Vorgänge,
welche sich perizellulär abspielen. Vermehrt zeichnet sich in der Literatur jedoch ab,
dass der uPA-Rezeptor auch andere intrazelluläre Signalwege aktivieren kann. Dies
geschieht zum Beispiel über Interaktionen mit verschiedenen
Zelloberflächenproteinen. Dazu gehören auch Integrine, Wachstumsfaktorrezeptoren
und G-Protein-gebundene Membranproteine. Über diese Signalwege kann das
uPA/uPAR-System nicht nur die perizelluläre Fibrinolyse oder Proteolyse steuern,
sondern auch Vorgänge wie Zelladhäsion, Migration, Proliferation und
Zelldifferenzierung (Blasi, F. et al. 2002) (Kiyan, J. et al. 2005).
Weiterhin werden immer mehr wichtige Funktionen des uPA/uPAR-Systems bekannt.
So konnte nachgewiesen werden, dass dieses System eine wichtige Rolle bei der
Modulation von Abwehrreaktionen, sowohl des angeborenen als auch des
erworbenen Immunsystems, innehat (Mondino, A. et al. 2004). Andere wichtige
Schritte in der Immunmodolation bestehen in der Antigenprozessierung, der
Antigenpräsentation des Abwehrsystems (Woodhead 2000) und der
Lymphozytenaktivierung (Nykjaer, A. et al. 1994). Die genannten Funktionen von
uPA/uPAR lassen vermuten, dass die beteiligten Signalkaskaden auch relevant bei
der Ausbildung eines ANV (bzw. des IR-Schadens) und der
Nierentransplantatabstoßung sein könnten. Viele der oben genannten Erkenntnisse
wurden mit Hilfe von Untersuchungen an gendefizienten Mäusen erzielt. Durch
gezieltes Ausschalten von uPA oder uPAR konnte deren Rolle in verschiedenen
Signalkaskaden genauer analysiert werden.
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit
Bisher wurde die genaue Beteiligung des uPA/uPAR-Systems in der Entwicklung des
akuten Nierenversagens und der akuten Nierentransplantatabstoßung nicht
untersucht. Diese Arbeit sollte die Rolle des uPA/uPAR-Systems bei der Ausbildung
des akuten Nierenversagens (IR-Schaden) und bei der allogenen akuten
Nierentransplantatabstoßung untersuchen. Für das akute Nierenversagen (bzw. den
IR-Schaden) und die Nierentransplantatabstoßung wurden standardisierte und gut
charakterisierte Mausmodelle verwendet, die eine Untersuchung molekularer
Zusammenhänge gestatten. Der Einsatz von uPA- bzw. uPAR-defizienten Mäusen in
diesen Modellen sollte es ermöglichen, die Beteiligung von uPA und uPAR an
8

9
1 Einleitung
molekularen Mechanismen zu untersuchen, die das ANV bzw. die akute
Nierentransplantatabstoßung vermitteln.

2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 OP-Materialien
10
2 Material und Methoden
Für die Nierentransplantationen wurden folgende Geräte und Zubehör verwendet:
2.1.1.1 OP-Geräte
○ Chirurgisches Mikroskop (Firma Leica, Wetzlar Deutschland)
○ Elektrokoagulator ICC50 (Firma Erbe, Tübingen Deutschland)
○ Wärmetisch C10 (Firma Haake, Karlsruhe Deutschland)
2.1.1.2 Bestecke und Nahtmaterialien
Folgende Instrumente der Firma Aesculap (Tuttlingen, Deutschland) wurden
verwendet:
○ Chirurgische Pinzette BD537 ○ Mikroschere OC498R
○ Nadelhalter für Bauchwandnähte BM54 ○ Mikronadelhalter FD243
○ Mikropinzette BD331R ○ Mikrogefäßklemmer 2x FE690K
○ gebogene Mikrofederschere OC497R ○ Mikropinzette BD329 für innere
operative Eingriffe
Als Nahtmaterialien wurden folgende Fäden der Firma Ethicon (Hamburg,
Deutschland) benutzt:
○ 4/0 Mersilene FS-2 für Bauchverschluss,
○ 7/0 Ethicon BV-1 für Gefäßligaturen,
○ 10/0 Prolene BV-6 für Mikrogefäßanastomosen und Ureteranastomosen.

2.1.1.3 Narkosematerialien
11
2 Material und Methoden
2,5%iges Avertin wurde als Narkosematerial benutzt. Avertin besteht aus 2,2,2
Tribromoethanol und 2-Methyl-2-Butanol. Eine 100%ige (w/v) Stammlösung des
Avertin wurde durch das Lösen von 10g des 2,2,2-Tribromoethanol in 10ml 2-Methyl-
2-Butanol hergestellt. Die Lösung wurde abgedunkelt bei 4 °C aufbewahrt.
Vor Gebrauch wurde die 100%ige Stammlösung Avertin mit 0,9%iger
Kochsalzlösung (NaCl) auf eine 2,5%ige Lösung verdünnt. Anschließend wurde das
2,5%ige Avertin bei Raumtemperatur aufbewahrt (bis sechs Monate haltbar).
Als Dosierung wurden 15 ml/kg Körpergewicht eingesetzt.
2.1.1.4 Sonstige OP-Materialien
○ Kompressen ○ Spritzen 1 ml und 2 ml
○ Wattestäbchen ○ Kanülen 21G, 27G, 30G
○ 0,9%ige Kochsalzlösung
2.1.2 Geräte für die immunhistochemischen Färbungen
Zur Herstellung der 3 μm Paraffinschnitte wurde ein Rotationsmikrotom der Firma
Leica, RM 2245 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) benutzt.
Die kryokonservierten Proben wurden mit einem Kryostat der Firma Leica, CM 3050S
(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) 6 μm dick geschnitten.
Die Proben wurden im Labor mit Hilfe der folgenden Mikroskope untersucht und
fotografiert:
○ Leica LM DB (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland)
○ Zeiss Axioplan-2 (Zeiss, Jena, Deutschland)
Zur Fotografie und Archivierung der Bilder wurde das Computerprogramm Axio
Vision 3.0 (Zeiss, Jena, Deutschland) verwendet.
2.1.3 Quantitative real-time-PCR
○ ABI Prism TM 7700 Sequence Detector, Perkin Elmer Boston, USA

2.1.4 Tierstämme
12
2 Material und Methoden
Die uPA- und uPAR-knock-out Mäuse (uPA-/- und uPAR-/-) waren ein großzügiges
Geschenk von Peter Carmeliet und Mieke Dewerchin (Zentrum für transgene
Technologie and Gentherapie, Universität von Leuven, Belgien) (Carmeliet, P. et al.
1996).
Die uPA-/- Mäuse wurden auf einem C57BL/6J-Hintergrund gezüchtet, die
entsprechenden Wildtyp-Kontrollen (WT1) stammten aus einer reinen C57BL/6J-
Population und wurden über die Firma Charles River (Sulzfeld, Deutschland) bestellt.
Die uPAR-/- Tiere wurden auf einem Hybridhintergrund gezüchtet (75% C57BL/6J
und 25% 129/SV), als Kontrolltiere dienten entsprechende Geschwistertiere mit dem
gleichen Hintergrund (WT2). Für die Untersuchungen des IR-Schadens wurden 12-
14 Wochen alte uPA-/-, uPAR-/-, WT1- und WT2-Mäuse verwendet. Im
Transplantationsmodell dienten homozygote weibliche uPA-/-, uPAR-/-, WT1- und
WT2-Mäuse als Nierenspender. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Als
Nierenempfänger wurden weibliche BALB/c(H2 d )-Mäuse verwendet, welche ebenfalls
von Charles River (Sulzbach, Deutschland) stammten. Die Mäuse waren zwischen
12 und 16 Wochen alt und wogen 25-30 g.
Die Tiere wurden unter artgerechten Bedingungen bei konstantem Tag-Nacht-
Rhythmus mit freiem Zugang zu Wasser und Futter bei der Phenos GmbH, Hannover
gehalten. Sämtliche Experimente entsprachen den Richtlinien des behördlichen
Tierschutzkomitees.
2.1.5 Chemikalien
Für die immunhistochemischen Färbungen wurden Feinchemikalien und
Lösungsmittel der Firmen Fluka Biochemika (Buchs, Schweiz), Merck (Darmstadt,
Deutschland), Sigma Chemie (Deisenhof, Deutschland), der Pap-Pen (BioGenex,
San Ramon, Kalifornien, USA) und Histoclear (Roth, Karlsruhe, Deutschland)
verwendet.
Für Westernblots wurden Entwicklungslösungen der Firma Perkin Elmer (Boston,
USA) und Tetenal (Noderderstedt, Deutschland) und Röntgenfilme der Firma Kodak
(Rochester, USA) verwendet.

13
2 Material und Methoden
Zur RNA Isolation wurde Trizol-Reagenz und Superscript II reverse Transkriptase
(Invitrogen, Deutschland) verwendet. Rox-Farbstoff, sowie Fam-Tamra markierte
Primer (BioTez, Deutschland) und FastStart-Taq-Polymerase (Roche Diagnostics,
Deutschland) kamen ebenfalls zur Anwendung.

2.1.6 Antikörper
Antikörper Firma Verdünnung
Rat anti Mouse
Monozyten/Makrophagen,
F4/80 (Cl: A3-1)
Rat anti Mouse, CD 54
(ICAM-1)
Rabbit anti Mouse, aktive
Caspase-3
Rat anti Mouse
Neutrophile, GR-1
Armenischer Hamster anti
Mouse, CD11c,
Dendritische Zellen (Cl:
HL3)
Rat anti Mouse, CD4, T-
Lymphozyten (L3T4)
Rat anti Mouse, CD8, T-
Lymphozyten (Ly-2)
Rat anti Mouse, CD22, B-
Lymphozyten (Cl-2D6)
Rabbit anti Mouse, uPAR
Sekundärer Antikörper
Donkey anti Rat (Cy3)
Sekundärer Antikörper
Goat anti armenischer
Hamster (Cy-3)
14
2 Material und Methoden
Serotec, Oxford, UK 1:2500
Serotec, Oxford, UK 1:10000
BD, PharMingen,
Heidelberg, Deutschland
Geschenk von Prof.
Hoffmann, Med.
Hochschule Hannover,
Deutschland
BD PharMingen, Heidelber,
Deutschland
BD PharMingen,
Heidelberg, Deutschland
BD PharMingen,
Heidelberg, Deutschland
SouthernBiotech,
Birmingham, USA
Santa Cruz Biotechnology,
California, USA
Jackson Immuno Research
Laboratories Inc., West
Grove, USA
Jackson ImmunoResearch
Laboratories Inc., West
Grove, USA
Tab. 2.1: Tabelle der verwendeten Antikörper
1:250
1:200
1:500
1:750
1:1000
1:100
1:50
1:500
1:500

2.2 Methoden
2.2.1 Ischämie-Reperfusionsschaden
15
2 Material und Methoden
Sowohl der Ischämie-Reperfusionsschaden (IR-Schaden) als auch die
Nierentransplantation wurden von Dr. Song Rong durchgeführt. Der renale IR-
Schaden wurde durch bilaterales Klippen des Nierengefäßstiels induziert. Die Mäuse
erhielten eine Inhalationsnarkose mit Isofluran. Anschließend wurde eine mediane
Laparotomie durchgeführt und der Nierenhilus stumpf frei präpariert. Mit Hilfe von
nichttraumatischen Gefäßklemmen wurde eine 35-minütige Ischämie erzeugt,
anschließend die Perfusion freigegeben und der Bauch wieder verschlossen. Das
Serumkreatinin (S-Kreatinin) wurde 24h nach dem ischämischen Ereignis mit einem
Kreatinin-Analyzer (Beckman, Deutschland) bestimmt.
2.2.2 Heterotrope Nierentransplantation und Gewebeentnahme
Die Nierentransplantation wurde ebenfalls von Dr. Song Rong durchgeführt.
Dafür dienten homozygote weibliche uPA-/-, uPAR-/-, WT1-und WT2-Mäuse als
Nierenspender und weibliche BALB/c (H2 b ) als Nierenempfänger. Hierbei wurde die
Niere, einschließlich ihrer versorgenden Gefäße und dem Ureter, entsprechend der
Arbeit von Ziegler et al. transplantiert (Ziegler, E. et al. 2006).
Nachdem die Spendertiere mit Isofluran anästhesiert worden sind, wurde ihnen die
linke Niere, zusammen mit der Nierenarterie und einem Aortenpatch, der Nierenvene
und einem kleinen V. cava-Patch und dem gesamten Ureter en bloc entnommen. Die
Empfängertiere erhielten ebenfalls eine Isofluran-Anästhesie. Zunächst wurde die
linke Eigenniere entnommen, dann erfolgte die Anastomose der großen Gefäße an
die Aorta und an die V. cava. Die Gefäßanastomosen wurden kurz unterhalb der
natürlichen Abgänge der Nierengefäße angelegt. Der Ureter wurde direkt mit der
Harnblase des Empfängertieres verbunden (Han, W. R. et al. 1999). Für die
Transplantate betrug die kalte Ischämiezeit 60 min. und die warme Ischämiezeit 30
min. Die Nephrektomie der bisher verbliebenen rechten Eigenniere des
Empfängertieres erfolgte entweder am OP-Tag oder vier Tage später über einen
Flankenschnitt.

16
2 Material und Methoden
Zur Beurteilung der Nierenfunktion wurde regelmäßig der Serumkreatininwert
bestimmt.
2.2.3 Organentnahme
Für molekulare Analysen und histologische Untersuchungen erfolgte die
Organentnahme der Transplantatniere nach 24h (zur Beurteilung des IR-Schadens)
und nach 6 Tagen (Beurteilung der Abstoßungsreaktion).
Zur Organentnahme wurden die Tiere getötet und die Transplantatniere vorher mit
ca. 20 ml kalter 0,9%ige Kochsalzlösung über das Herz perfundiert. Die
entnommenen Nieren wurden gedrittelt und unterschiedlich fixiert: In 4% PFA für die
Histologie, in Methylbutan auf Trockeneis für die Immunhistochemie und in flüssigem
Stickstoff schockgefroren für die Molekularbiologie (mRNA- und Proteinisolation).
2.2.4 Blutabtnahme und Kreatininbestimmung
Im Zeitintervall zwischen Transplantation und Gewebeentnahme wurde zu
verschiedenen Zeitpunkten der Kreatininwert bestimmt. Dafür wurde für jede
Blutentnahme ca. 200 μl Blut aus dem Kapillarplexus am Auge entnommen.
Zur Bestimmung des S-Kreatinins wurde der Kreatinin Analyser 2 der Firma
Beckman (Deutschland) verwendet. Nach den Angaben des Herstellers wurden 45
ml Pikrinsäure-Fertiglösung (Lsg. A) mit 180 ml alkalischer Puffer-Fertiglösung (Lsg.
B) gleichmäßig gemischt und für 10 min. bei 37 °C inkubiert. Mittels 30 μl eines
Kreatininstandards wurde das Gerät auf 440 μmol/l geeicht. Nun wurde die Messung
mit ca. 30 μl Serum durchgeführt. Aus drei aufeinander folgenden Messungen wurde
der Mittelwert bestimmt.
2.2.5 Histologie und Immunhistologie
Zur Übersichtsfärbung wurde die „Perjodic-Acid-Schiff-Reaktion“ (PAS-Färbung)
verwendet. Hierfür wurden 3 μm dicke Paraffin-Schnitte aus 4% Paraformaldehyd
(PFA) fixierten Nierenpräparaten benutzt. Die Morphologie wurde unter Anleitung von
Dr. Mengel (Nephropathologie der MHH) lichtmikroskopisch beurteilt und
entsprechend der Banff Klassifikation (Racusen, L. C. 2004) ausgewertet. Der

17
2 Material und Methoden
Untersucher kannte die Gruppenzugehörigkeit der Präparate nicht. Für die
immunhistochemischen Färbungen wurden vom kryokonservierten Gewebe mit Hilfe
des Kryotoms 6 μm dicke Schnitte angefertigt. Nach der immunhistochemischen
Färbung wurden die Präparate ebenfalls ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit
beurteilt.
2.2.5.1 PAS-Färbung
Das Protokoll der einzelnen Färbeschritte sah wie folgt aus:
Entparaffinierung:
○ 3 x 5 min. Histoclear
Rehydratation:
○ kurz in 50%iger Alkohollösung eintauchen
○ kurz in A. dest. eintauchen
PAS-Färbung:
○ 10 min. in 0,5%iger Perjodsäure oxidieren
○ 3 x 5 min. in A. dest. spülen
○ 20 min. in Schiffscher-Reagenz (Merck, Darmstadt, Deutschland) inkubieren
○ 3 x 2 min. mit Sulfitwasser differenzieren
Sulfitwasser: 12 ml 10%ige Na2SO3-Lösung, 10 ml 1 normale
HCl und 200 ml A. dest.
○ 10 min. spülen unter fließendem Leitungswasser
○ 2,5 min. Kerfärbung in Hämalaun (Hämatoxylin n. Delafield)
○ 10 min. bläuen unter fließendem Leitungswasser
○ Eindecken mit Histokitt
Anschließend wurden die Schnitte am Lichtmikroskop (Vergrößerung x200 und x400)
histologisch ausgewertet.
2.2.5.2 Immunhistochemische Färbung
Die Immunfluoreszenzfärbung wurde 1941 von dem amerikanischen Mikrobiologen
und Pathologen Albert Coons eingeführt. Seither gewann diese Technik in Diagnostik

18
2 Material und Methoden
und Forschung große Bedeutung, denn sie garantiert eine selektive Anfärbung von
spezifischen Antigenstrukturen auf histologischem Gewebe.
Vor Beginn der eigentlichen Färbeschritte wurden die 6 μm dicken kryokonservierten
Schnitte für 15 min. in -20 °C gekühltem Aceton fixiert. Danach trocknete das
Präparat an der Luft.
Anschließend wurden alle Schnitte mit dem Pap-Pen eingekreist, um ein Verlaufen
der Lösungen in den einzelnen Färbeschritten zu vermeiden.
Die einzelnen Schritte der immunhistochemischen Färbung gestalteten sich wie folgt:
○ 10 min. in feuchter Kammer mit 10%igem Donkey-Serum blockieren
○ 1h bei RT mit primärem Antikörper inkubieren (Verdünnung in TBS
entsprechend der Antikörper-Tabelle 2.1.6)
○ 3 x 5 min. mit TBS waschen
○ 1h bei RT mit Sekundär-Antikörper (Cy3, 1:500) lichtgeschützt inkubieren
○ 3 x 5 min. mit TBS waschen
In dieser Arbeit wurde ausschließlich die indirekte Immunfluoreszenzfärbung
verwendet (Abb. 2.2.5.2).

19
2 Material und Methoden
Abb. 2.2.5.2 zeigt ein Schema der indirekten Immunfluoreszenzfärbung.
Als sekundärer Antikörper wurde CY3 (Emissionsmaximum: 548 nm) verwendet, der
das anzufärbende Antigen in der Mikroskopie rot erscheinen lässt. Die
Eigenfluoreszenz des Nierengewebes war grün fluoreszierend. Diese eignete sich
gut für die Darstellung der Topografie des Schnittes.
DAPI (4’-6-Diamidino-2-phenylindol) wurde zur Darstellung der Zellkerne verwendet.
Es bildet spezifisch mit Doppelstrang-DNA einen Komplex, der unter dem Mikroskop
blau fluoresziert (Emissionsmaximum: 359 nm).
Die Lagerung der gefärbten Schnitte erfolgte bei 4°C im Dunkeln, um das
Ausbleichen des Chromogens zu verzögern.
2.2.5.3 Dihydroethidium-Markierung
Die Produktion freier Radikale (reactive-oxygen-species: ROS) wurde mit Hilfe von
fluoreszierendem Dihydroethidium (DHE) nachgewiesen. Für diese Färbung wurden

20
2 Material und Methoden
frische kryokonservierte Nierenschnitte mit einer Schnittdicke von 6μm hergestellt
(n=5 von jeder Gruppe). Diese inkubierten sofort in einer Lösung von 2,5 μl DHE und
10 ml Hepes-Tyrode-Puffer (siehe unten) für 12 min. bei Raumtemperatur.
Da die Markierung schnell an Intensität verliert und ihr Emissionsmaximum nach 12
min. erreicht ist, musste umgehend die Beurteilung unter dem Leica Mikroskop
IM500 erfolgen (Ex: 520 nm, Em: 605 nm).
Zur Herstellung des Hepes-Tyrode-Puffer in 100 ml bidest. H2O werden benötigt:
NaCl 0,771g (≙ 132 mM)
KCl 0,030g (≙ 4 mM)
CaCl2
0,011g (≙ 1 mM)
MgCl2 0,010g (≙ 0,5 mM)
* HEPES 0,013g (≙ 0,5 mM)
Glucose 0,099g (≙ 5 mM)
*HEPES: (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure) ist eine
organische Pufferlösung zur Aufrechterhaltung des physiologischen pH-
Wertes.
2.2.5.4 TUNEL-Assay (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP
Nick End-Labeling)
Der TUNEL-Assay dient zur Darstellung von abgestorbenen Zellen. Die toten
Zellkerne erscheinen grün fluoreszierend im Gewebe. Diese Methode kann nicht
zwischen nekrotischen und apoptotischen Zellen unterscheiden, hierfür sind im
Anschluss Zusatzfärbungen erforderlich. Für den TUNEL-Assay wurden 2 µm dicke
Paraffinschnitte (n=5, pro Gruppe) angefertigt. Die einzelnen Färbeschritte
gestalteten sich wie folgt:
Entparaffinierung:
○ 3 x 5 min. in Xylol
Rehydrierung in der absteigenden Alkoholreihe:
○ 2 x 5 min. in 100%iger Ethanollösung

○ 5 min. in 96%iger Ethanollösung
○ 5 min. in 70%iger Ethanollösung
○ Kurz in A. bidest spülen
21
2 Material und Methoden
TUNEL-Assay:
○ Einengung des Pipettierungsfeldes mit dem Pap-Pen
○ Demaskierung in der Mikrowelle: 2 min. bei 700 W in 10 mM Citratpuffer (pH
6,0)
○ Abkühlen auf Eis für 15 min.
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ Proteinase K (20 µg/ml) für 20 min. bei Raumtemperatur
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ 60 min bei 37°C mit 100 µl TUNEL-Reaktionsgemisch in einer feuchten
Kammer inkubieren
(Das Gemisch wird kurz vor Gebrauch aus den beiden Stammlösungen:
- Enzymlösung: terminale Deoxynucleotidyl-Transferase aus
Kälberthymus in Aufbewahrungspuffer und
- Labellösung: Nukleotidmischung in Reaktionspuffer im Verhältnis 1:10
hergestellt.)
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ ABC-Lösung wird aus 2 Tropfen A und 2 Tropfen B in 5 ml PBS hergestellt,
anschließend 30 min auf Eis stellen.
○ Blocken mit 2 % BSA für 10 min.
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ 30 min. Inkubation mit ABC-Lösung
○ 2 x 3 min. in PBS (0,1 M, pH 7,4) waschen
○ Inkubation mit 0,05 M Tris-Puffer (pH 7,6)
○ 5 min. Inkubation mit DAB/NaCl
○ 3 min. mit Wasser waschen
○ 2 - 4 min. Gegenfärbung mit Methylgrün
○ 2 x 3 min. in 96% Ethanol waschen
○ 3 x 3 min. Inkubation in Histoclear
○ Eindecken

22
2 Material und Methoden
Die Negativkontrollen wurden ebenfalls nach dem obigen Protokoll gefärbt, jedoch
wurde die terminale Deoxynucleotidyl-Transferase nicht zugefügt.
2.2.6 mRNA-Isolation und quantitative PCR
Um die mRNA-Expression in einer Probe zu bestimmen wurde die quantitative realtime
PCR (qPCR) verwendet. Kurz beschrieben wird aus dem Gewebe die mRNA
isoliert und in cDNA umgeschrieben. Mit Hilfe spezifischer Primer wird die cDNA
während der PCR amplifiziert und am Ende die Konzentration des betreffenden Gens
bestimmt. Bei der real-time PCR kann die amplifizierte cDNA Menge mittels Bezug
auf einen Housekeeper (das ist ein Referenzgen, das immer in bestimmter Menge
vorhanden ist und nicht reguliert wird) quantifiziert werden. Als Housekeeper wurde
ß-Aktin verwendet.
Die qPCR wurde von Frau Nicolai durchgeführt.
Aus gefrorenem Nierengewebe, welches nach der Transplantatentnahme in
flüssigem Stickstoff schockgefroren wurde, wurde die mRNA mit Hilfe von Trizol
Reagenz (Invitrogen, Detuschland) isoliert. Nach Behandlung mit DNase wurde
anschließend davon 1 µg mRNA mit Superscript II reverser Transkriptase versetzt
(Invitrogen, Deutschland). Die qPCR wurde am SDS 7700 Gerät (Applied
Biosystems, Deutschland) unter Verwendung von Rox dye (Invitrogen, Deutschland),
FastStart taq Polymerase (Roche diagnostics, Deutschland), genspezifischen
Primern und Fam-Tamra-labeled Proben (BioTez, Deutschland) durchgeführt.
Für die qPCR wurde ein standardisiertes Temperaturprofil verwendet. Dabei folgten
auf einen einmaligen Denaturierungsschritt bei 95° C über 10 min. 40 Zyklen der
Amplifikation bei 95° C für 10 sek. und 60° C für 1 min.
Die verwendeten Primer für den TaqMan sahen wie folgt aus (5’–3’):
mur MIP-2
sense: 5’- TGT GAC GCC CCC AGG A -3’
antisense: 5’- TTT GAC CGC CCT TGA GAG TG-3’

mur ß-Aktin
23
2 Material und Methoden
probe: 6-FAM- CCC ACT GCG CCC AGA CAG AAG TCA TA –TAMRA
sense: 5’- TCA CCC ACA CTG TGC CCA T -3’
antisense: 5’-AGC CAG GTC CAG ACG CAG -3’
probe: 6-FAM- AGG GCT ATG CTC TCC CTC ACG CCA T -TAMRA
mur MCP-1
sense: 5’- CCA ACT CTC ACT GAA GCC AGC -3’
antisense: 5’- CAG GCC CAG AAG CAT GAC A -3’
probe: 6-FAM- CTC TCT TCC TCC ACC ACC ATG CAG GT -TAMRA
mur uPA
sense: 5’- CGA TTC TGG AGG ACC GCT TA -3’
antisense: 5’- CCA GCT CAC AAT CCC ACT CA -3’
probe: 6-FAM- CTG TAA CAT CGA AGG CCG CCC AAC T -TAMRA
mur uPAR
sense: 5’- CCA CAG CGA AAA GAC CAA CA -3’
antisense: 5’- CGG TCT CTG TCA GGC TGA TGA -3’
probe: 6-FAM- ATG AGT TAC CGC ATG GGC TCC A -TAMRA
Für die quantitative Bestimmung wurde die qgene-Software benutzt (Muller, P. Y. et
al. 2002).
2.2.7 Statistische Analysen
Für die statistischen Auswertungen der Daten wurde die Auswertungssoftware SPSS
12.01 verwendet. Dargestellt sind Mittelwerte (MW) ± bzw. Standardabweichungen
(SD). Die Normalverteilung wurde durch den Klomogorov-Smirnov-Test überprüft.
Die statistische Signifikanz wurde mit dem T-Test berechnet, als signifikant wurde
p

3 Ergebnisse
3 Ergebnisse
3.1 Einfluss von uPA/uPAR-Defizienz auf den IR-Schaden
3.1.1 Nierenfunktion bei IR-Schaden
Das uPA/uPAR-System ist an vielen Signalkaskaden beteiligt, welche die Ausbildung
eines IR-Schadens begünstigen. Um herauszufinden, ob uPA oder uPAR beim IR-
Schaden an der Niere beteiligt ist, wurde der Nierenhilus von uPA-/-, uPAR-/-, WT1-
und WT2-Mäusen geklippt. Hierbei zeigte sich, dass 24h nach dem ischämischen
Ereignis die Tiere beider WT-Kontrollgruppen (WT1 und WT2), und die der uPA-/-
Gruppe schwere Nierenfunktionsstörungen mit Erhöhung des S-Kreatinins aufwiesen.
Die Tiere der uPAR-/- Gruppe zeigten einen signifikant geringeren Anstieg des S-
Kreatinins gegenüber den anderen Gruppen und schienen so vor einem schweren
IR-Schaden geschützt zu sein (Abb. 3.1.1).
24

A
B
S-Kreatinin [µmol/l]
S-Kreatinin [µmol/l]
300
200
100
0
300
200
100
0
Kontrolle
d0
Kontrolle
d0
25
WT d1 uPA-/- d1
WT d1 uPAR-/- d1
3 Ergebnisse
Abb. 3.1.1 zeigt die S-Kreatininwerte vor (Kontrolle) und 24h nach IR-Schaden
als Ausdruck der Nierenfunktion.
A) Der IR-Schaden verursachte eine schwere renale Dysfunktion, welche sich
durch die stark erhöhten S-Kreatininwerte zeigte. Die schwere
Nierenfunktionsstörung zeigte sich hier in beiden Gruppen, WT1 und uPA-/-,
24h nach dem ischämischen Ereignis. Die uPA-/- Tiere zeigten dabei eine
etwas geringere Erhöhung des S-Kreatinins 24h nach dem ischämischen
Ereignis als die Tiere der korrespondierenden WT-Gruppe.
B) Hier zeigte sich 24h nach dem ischämischen Ereignis eine deutlich geringere
Nierenfunktionsstörung bei den uPAR-defizienten Mäusen als bei der WT2
Kontrollgruppe (*** p

3.1.2 Histologie bei IR-Schaden
26
3 Ergebnisse
Die Übersichtshistologie korrelierte gut mit den Ergebnissen der Nierenfunktion. Die
Tiere der WT1-, WT2- und uPA-/- Gruppen zeigten Zeichen einer schweren akuten
tubulären Nekrose (ATN), 24h nach dem IR-Schaden. So waren Zelldetritus im
Tubuluslumen, Zellinfiltrate, der Untergang von Tubuluszellen und der Verlust des
Bürstensaums im Lichtmikroskop bei 200facher Vergrößerung zu erkennen. Im
Gegensatz dazu zeigten sich bei den Präparaten der uPAR-/- Gruppe weitaus
weniger Zeichen einer ATN (Abb. 3.1.2).
A
C
Abb. 3.1.2 zeigt die Nierenmorphologie in einer PAS-Färbung 24h nach IR-
Schaden.
A) zeigt eine normale Histologie vor dem ischämischen Ereignis.
B) zeigt die Histologie der WT-Kontrollgruppen mit schwerer akuter
Tubulusnekrose, C) zeigt die Histologie der uPA-/- Gruppe. Der IR-Schaden
verursachte einen schweren Zellschaden im S3-Segment der Niere (outerstripe-outer-medulla,
OSOM). Die Präparate der WT1-, WT2- und uPA-/-
Mäuse zeigten deutlich den Untergang des Bürstensaums und die Ablösung
der Epithelzellen von der Basalmembran. Dies führte zum Bild der „nackten
Basalmembran“ und der verstopften Tubuluslumen.
B
D

27
3 Ergebnisse
D) zeigt die Histologie der uPAR-/- Gruppe. Auch hier war der Untergang des
Bürstensaums und Ablösung der Epithelzellen von der Basalmembran zu
erkennen, jedoch ist der Schaden wesentlich milder als in B) und C).
3.1.3 Zelluntergang beim IR-Schaden
Es existieren unterschiedliche Ergebnisse über die pro- oder antiapoptotischen
Eigenschaften des uPA/uPAR-Systems. Da der IR-Schaden immer zum
Zelluntergang führt, wurde der TUNEL-Assay verwendet, um abgestorbene Zellen in
den ischämischen Nieren der WT1-, WT2-, uPA-/- und uPAR-/- Gruppen anzufärben
(Abb. 3.1.3). Dabei zeigte sich, dass in den WT- und uPA-/- Gruppen 24h nach dem
ischämischen Ereignis vermehrt TUNEL-positive Zellen vorhanden waren, die Zahl
der toten Zellen in den Nierenpräparaten der uPAR-/- Nieren, im Vergleich zur WT2-
Gruppe, war jedoch signifikant niedriger (Abb. 3.1.3). Dies ließ die Schlussfolgerung
zu, dass uPAR, unabhängig von uPA, den hypoxisch induzierten Zelluntergang
beeinflusste.

TUNEL pos. Zellen/Gesich
A B
C D
40
30
20
10
0
uPA uPAR
Abb. 3.1.3 zeigt die TUNEL-Färbung 24h nach IR-Schaden.
28
3 Ergebnisse
A) zeigt keine TUNEL-positiven Zellen im Nierengewebe von laparotomierten,
jedoch nicht geklippten Tieren (Negativkontrolle).
B) zeigt den Zelluntergang in den Nieren der WT-Kontrolltiere (da die Ergebnisse
der WT1- und WT2-Gruppen fast identisch waren, sind nur Abbildungen der
WT2-Gruppe gezeigt) und C) zeigt die TUNEL-positiven Zellen von uPA-/-
Nierenpräparaten. In beiden Fällen sind zahlreiche apoptotische Zellen,
größtenteils im tubulären Epithel, zu erkennen.
D) zeigt die TUNEL-positiven Zellen von einem Nierenschnitt der uPAR-/-
Gruppe. Es waren fast keine TUNEL-positiven Zellen zu sehen (je Gruppe
wurden 7 Tiere untersucht, Vergrößerung x200).
WT
knock out
E

29
3 Ergebnisse
E) zeigt die Quantifizierung der TUNEL-positiven Zellen pro Gesichtsfeld 24h
nach IR-Schaden. 10 Gesichtsfelder wurden je Niere analysiert. Die
Ergebnisse sind als MW ± SEM dargestellt. Die Anzahl der TUNEL-positiven
Zellen pro Gesichtsfeld waren bei beiden WT-Kontrollgruppen und den uPA-/-
Nieren ähnlich hoch. In der Gruppe der uPAR-/- Tiere waren fast keine
TUNEL-positiven Zellen zu sehen. Dies legte die Vermutung nahe, dass
uPAR-Defizienz zu einem Schutz vor der ischämisch-induzierten Apoptose
führt.
3.2 uPA/uPAR bei allogener Nierentransplantation
Das akute Nierenversagen hat auch einen erheblichen Einfluss auf die
Transplantationsmedizin. Die Dauer der kalten Ischämie ist ein wichtiger Prädiktor für
die verzögerte Funktionsaufnahme des Nierentransplantates, das Ausmaß des
akuten Nierenversagens nach Transplantation und die akute Transplantatabstoßung.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte daher weiterführend auch die Rolle des
uPA/uPAR-Systems bei der akuten allogenen Nierentransplantationsabstoßung im
Mausmodell untersucht werden.
3.2.1 Renale uPA/uPAR-Expression nach allogener
Nierentransplantation
Die niederländische Arbeitsgruppe Roelofs et al. hat in einer Biopsiestudie bei
humanen allogenen Nierentransplantationen mit akuter Abstoßungsreaktion eine
Aktivierung des uPA/uPAR-Systems nachgewiesen (Roelofs, J. J. et al. 2003). Im
ersten Schritt wurde nun überprüft, ob auch im Mausmodell bei allogener
Nierentransplantation und akuter Abstoßungsreaktion eine Aktivierung des
uPA/uPAR-Systems erfolgt. Hierfür wurde die mRNA-Expression in normalen WT2-
Nieren (Kontrolle) und in WT2-Nierentransplantaten zu den Zeitpunkten 4h und 24h
nach NTx gemessen. Es fand sich eine starke Erhöhung von uPA- und uPAR-mRNA
vier Stunden nach NTx und eine weitere Erhöhung der Expression 24 Stunden nach
NTx (Abb. 3.2.1.1) in den WT-Transplantaten.

A
rel. uPA/b-Aktin
mRNA
B
rel. uPAR/b-AKtin
mRNA
3
2
1
0
3
2
1
0
Kontrolle 4h d1
30
uPA
uPAR
Kontrolle 4h d1
3 Ergebnisse
Abb. 3.2.1.1 zeigt ein Diagramm der uPA/uPAR-mRNA-Expression bei akuter
allogener Nierentransplantatabstoßung nach 0h, 4h und 24h. Die quantitative
Bestimmung erfolgte mittels qPCR (* p

31
3 Ergebnisse
3.2.1.2). In den normalen Nieren lag eine geringe basale uPAR-Expression in den
Glomerula und in den Tubuli des S3 Segmentes (OSOM) vor.
Im Rahmen der akuten Abstoßung bei allogenen WT2-Transplantaten nahm die
uPAR-Expression sowohl in den Glomeruli als auch in den Tubuli deutlich zu. Am d6
erfolgte eine weitere deutliche Steigerung der uPAR Expression im Kortex und im
OSOM (Abb. 3.2.1.2).
Zusammenfassend konnte sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Proteinebene eine
deutliche Zunahme der uPA- und uPAR-Expression im Rahmen der akuten
allogenen Nierentransplantatabstoßung nachgewiesen werden.

Kortex
OSOM
A
A
Vor NTx d1 d6
B
B
32
3 Ergebnisse
Abb. 3.2.1.2 zeigt die immunhistochemische Färbung von uPAR im Gewebe
von normalen Nieren und rejezierenden Nieren am d1 und d6 nach allogener
NTx in 200facher Vergrößerung. Oben dargestellt sind repräsentative
Ausschnitte aus dem Kortex mit den Glomeruli, unten sind die Tubuli aus dem
OSOM gezeigt.
A) Sowohl im Kortex als auch im OSOM war im gesunden Nierengewebe der
WT2-Gruppe nur eine marginale basale uPAR-Expression nachweisbar.
B) Einen Tag (d1) nach allogener NTx war eine uPAR-Expression in den
Glomerlula und in den Tubuli des S3-Segmentes nachweisbar.
C) 6 Tage (d6) nach NTx zeigte sich eine weitere Intensivierung der Signale, also
eine noch stärkere Expression von uPAR in den allogenen
Nierentransplantaten. Im Kortex war die Expression von uPAR nun nicht mehr
nur noch auf die Glomerula begrenzt, sondern auch auf die umliegenden
Tubuli erweitert.
C
C

33
3 Ergebnisse
3.2.2 Überleben nach allogener Nierentransplantation bei uPA- und
uPAR-Defizienz
Als nächstes wurde die Fragestellung untersucht, ob uPA- oder uPAR-Defizienz des
Transplantates eine Auswirkung auf das Überleben der Mäuse nach allogener
Nierentransplantation hatte. Hierfür wurden verschiedene allogene
Nierentransplantationen durchgeführt. So dienten die uPA-, uPAR-defizienten Tiere
(H 2b ) und ihre korrespondieren Wildtyp-Kontrolltiere (WT1 und WT2) als
Nierenspender und Balb/C Mäuse (H 2d ) jeweils als Empfänger. Nach der
Nierentransplantation erfolgte keine immunsuppressive Behandlung, und es wurde
beobachtet, wie lange die Tiere überlebten. In der Gruppe der uPA-defizienten Tiere,
der WT1- und der WT2-Gruppe verstarb der größte Teil der Tiere kurz nach der
Nierentransplantation aufgrund der akuten Nierentransplantatabstoßung. Nach
spätestens 8 Wochen waren alle Tiere aus diesen Gruppen verstorben (Abb. 3.2.2).
Eine wesentlich längere Überlebensrate konnte jedoch in der Gruppe der uPARdefizienten
Nierentransplantatempfänger, im Gegensatz zu ihrer WT2-
Kontrollgruppe, beobachtet werden. Innerhalb der ersten 6 Tage kam es zu einer ca.
25%igen Mortalität bei den uPAR-defizienten Nierentransplantatempfängern, danach
aber überlebten ca. 75% der Tiere den gesamten weiteren Beobachtungszeitraum
von 20 Wochen nach der Organtransplantation, ohne jegliche immunsuppressive
Therapie.
uPAR-Defizienz des Nierentransplantates verbesserte das Überleben der Empfänger
nach allogener Nierentransplantation erheblich.

Überlebensrate [%]
10
7
5
2
0
d0 d2 d4 d6 d8 d10 d12 d14
Tag
34
3 Ergebnisse
Abb. 3.2.2 zeigt die Überlebensrate von Mäusen, welche uPA- und uPARdefiziente
Transplantate erhielten, verglichen mit Tieren, die ein WT-
Transplantat erhielten, in Prozent.
In diesem Diagramm ist das verbesserte Überleben der Tiere mit uPAR-/-
Transplantaten gegenüber ihrer WT2-Kontrollgruppe zu sehen. Nach 20 Wochen
(w20) waren noch ca. 75% der Tiere am Leben. Keinen Unterschied zur WT2-
Kontrollgruppe fand sich in der Gruppe der Tiere mit den uPA-/- Transplantaten.
Hier lief die Überlebenskurve ähnlich wie die der WT-Kontrollgruppe, nach
spätestens 8 Wochen (w8) waren alle Tiere dieser Gruppe verstorben. Das
Überleben der Empfänger von WT1- und WT2-Organen war identisch.
3.2.3 Nierenfunktion nach allogener Nierentransplantation bei uPA-
und uPAR-Defizienz
Zeit nach Nierentransplantation
WT
uPA-/uPAR-/-
w4 w8 w12 w16 w20
Woche
Neben der Überlebenszeit des Empfängertieres wurde nun auch die Nierenfunktion
überprüft. Um zu gewährleisten, dass ausschließlich die Folgen der Abstoßung des
Transplantates die Kreatininwerte im Blut veränderten, wurden den Empfängertieren
beide Eigennieren entnommen und anschließend das Transplantat eingesetzt. Es
wurde wieder dieselbe Konstellation der Gruppen wie zur Bestimmung der
Überlebenszeit (s. 3.2.2) verwendet. Um den S-Kreatininwert zu bestimmen, wurde

35
3 Ergebnisse
den Tieren vor der Operation (d0), einen Tag nach der Transplantation (d1) und
sechs Tage nach der Transplantation (d6) Blut entnommen.
Vor der Operation zeigten alle Gruppen normale S-Kreatininwerte. Einen Tag nach
der Transplantation konnte in allen Gruppen ein leichter Anstieg des S-Kreatinins
gemessen werden (Abb. 3.2.3). Es zeigte sich aber bereits zu diesem Zeitpunkt ein
wesentlich niedrigerer Kreatininanstieg bei den uPAR-/- Transplantatempfängern im
Vergleich zu der korrespondierenden Kontrollgruppe (WT2). Im Gegensatz dazu
waren die Kreatininwerte der Empfänger von uPA-/- Transplantaten ähnlich hoch wie
die der WT1-Kontrollgruppe.
Sechs Tage nach der Operation konnte in der Gruppe der Tiere mit den uPAR-/-
Transplantaten kein wesentlicher Anstieg des Kreatinins gemessen werden. Die
Nierenfunktion war gut. In der Kontrollgruppe WT2 stieg der Kreatininwert jedoch
stark an, was Ausdruck der schweren Nierenfunktionsstörung im Rahmen der
Nierentransplantatabstoßung war. Auch bei den uPA-/- Transplantaten und der WT1-
Gruppe war eine schwere Nierenfunktionsstörung in Form von sehr hohen
Kreatininwerten erkennbar (Abb. 3.2.3).
Wie bereits unter 3.2.2 beschrieben, waren nach 8 Wochen alle Empfänger mit uPAdefizienten
und WT-Transplantatnieren verstorben. Daher war der Kreatininwert ab
diesem Zeitpunkt nur noch bei den Tieren der uPAR-/- Transplantatempfängern
messbar. Diese wiesen bis 20 Wochen nach der Transplantation stabil niedrige S-
Kreatininwerte ohne wesentliche Nierenfunktionsstörung auf.
Diese Ergebnisse wiesen darauf hin, dass uPAR, nicht jedoch uPA, in der
Transplantatniere im allogenen Nierentransplantationsmodell zu einem schweren
Nierenfunktionsverlust mit akuter Transplantatabstoßungsreaktion führte.

S-Kreatinin [µmol/l]
250
200
150
100
50
0
***
***
d0 d1 d6 w8
Zeit nach Transplantation
w12 w16 w20
36
3 Ergebnisse
WT
uPA-/-
uPAR-/-
Abb. 3.2.3 zeigt die Nierenfunktion durch Messung der S-Kreatininwerte von
Tieren mit uPA-/- und uPAR-/- Transplantaten zu verschiedenen Zeitpunkten
nach allogener Nierentransplantation im Vergleich zur WT-Kontrollgruppe.
Dieses Diagramm zeigt den S-Kreatininanstieg nach allogener
Nierentransplantation von uPA-/- Nierentransplantatempfängern und ihrer
Kontrollgruppe WT1. Vor der Operation waren die gemessenen Kreatininwerte
der Empfängertiere normwertig niedrig. Bereits nach einem Tag (d1) zeigte
sich ein schwerer Verlust der Nierenfunktion mit einem, vor allem in der uPA-/-
Gruppe, um das 5-fache der Norm erhöhtem Kreatininwert. Dieser blieb auch
nach 6 Tagen (d6) konstant hoch. Der Kreatininwert der Empfängertiere der
WT1-Kontrollgruppe war nach einem Tag auch stark erhöht und wies nach 6
Tagen ebenfalls auf einen schweren Nierenfunktionsverlust mit massiv
erhöhtem Kreatininwert hin.
Weiterhin werden in diesem Diagramm die S-Kreatininwerte von Tieren mit
uPAR-/- Transplantaten nach allogener Nierentransplantation und ihrer
Kontrollgruppe WT2 dargestellt. Auch hier waren vor der Operation die
Kreatininwerte normwertig. Nach einem Tag (d1) zeigte sich bei der uPAR-/-
Gruppe ein moderater Anstieg des S-Kreatinins um das 2-fache der Norm.
Aber auch nach 6 Tagen (d6) hielt sich der S-Kreatininwert auf diesem
stabilen Level. Die WT2-Kontrollgruppe hingegen zeigte nach einem Tag
bereits einen deutlichen Anstieg der Kreatininwerte und einen weiteren
massiven Anstieg nach 6 Tagen, als Ausdruck der schweren

37
3 Ergebnisse
Nierenfunktionsstörung. Auch nach 20 Wochen zeigte sich eine stabil niedrige
Nierenfunktion in den Empfängertieren der uPAR-/- Transplantatnieren.
3.2.4 Histologie nach allogener Nierentransplantation bei uPA- und
uPAR-Defizienz
Nachdem festgestellt wurde, dass uPAR-defiziente Transplantate deutlich besseres
Überleben gegenüber ihrer Kontrollgruppe und auch den uPA-defizienten
Transplantaten haben, wurden die histologischen Veränderungen in den Geweben
der allogenen Nierentransplantate von den uPA-/-, uPAR-/-, WT1- und WT2-Gruppen
zu den Zeitpunkten einen (d1) und sechs (d6) Tage nach der allogenen
Transplantation untersucht (Abb. 3.2.4).
Vierundzwanzig Stunden nach der Operation zeigte sich im Gewebe der uPA-/-
Nieren (B) und allen WT-Kontrollen (A) eine akute Tubulusnekrose (ATN), mit Verlust
des Bürstensaumes, Zelldetritus im Tubuluslumen und Untergang der Tubuluszellen.
Bei der Gruppe der uPAR-/- Transplantate hingegen fanden sich keine Zeichen einer
ATN (C).
Sechs Tage nach der Transplantation konnte in allen Gruppen (WT1, WT2, uPA-/-,
uPAR-/-) eine starke interstitielle Infiltration mit Entzündungszellen und Zeichen einer
Tubulitis gefunden werden (Banff borderline und Banff 1A Rejektion). Die akute
Tubulusnekrose konnte in den WT1- und WT2-Kontrollgruppen und der uPA-/-
Gruppe nach wie vor festgestellt werden, wohingegen die Tubuli der uPAR-/- Gruppe
keine Zeichen einer akuten Nekrose zeigten (D, E, F).
Da uPA-Defizienz weder im Modell des IR-Schadens noch im Modell der allogenen
Nierentransplantation protektive Effekte aufwies, wurden in den folgenden
Experimenten nur noch Mäuse mit uPAR-Defizienz und Tiere ihrer
korrespondierende WT2-Kontrollgruppe verwendet.

24h
d 6
WT uPA-/- uPAR-/-
A B C
D E F
38
3 Ergebnisse
Abb. 3.2.4 zeigt die Nierenmorphologie anhand einer PAS-Färbung von WT-,
uPA- und uPAR-defizienten Transplantaten in 200facher Vergrößerung (je 6
Mäuse wurden pro Gruppe untersucht).
A) zeigt einen repräsentativen Schnitt eines Transplantates der WT2-Gruppe mit
stark ausgeprägtem akuten Tubulusschaden.
B) zeigt die Histologie eines uPA-/- Transplantates 24 Stunden nach der
allogenen Transplantation. Beide Abbildungen (A und B) zeigen Zeichen einer
akuten Tubulusnekrose, mit Verlust des Bürstensaumes, Zelldetritus im
Tubuluslumen und Untergang von Tubuluszellen.
C) zeigt einen Schnitt eines uPAR-/- Transplantates, 24 Stunden nach allogener
Transplantation. Die Tubulusstruktur, ebenso der Bürstensaum, waren
erhalten. Es waren keine Zeichen einer ATN zu erkennen.
D) zeigt die Histologie der WT-Gruppe und E) den Schnitt der uPA-/- Gruppe 6
Tage nach der Operation. Hier war die deutliche Infiltration mit
Entzündungszellen zu erkennen. Die ATN war weiterhin zu sehen, ebenso
eine Tubulitis (Banff borderline und Banff 1A Rejektion)
F) zeigt einen Schnitt der uPAR-/- Gruppe nach 6 Tagen. Hier war ebenfalls, wie
auch in D) und E), eine deutliche Infiltration mit inflammatorischen Zellen und
eine Tubulitis zu sehen. Eine ATN jedoch war auch nach 6 Tagen in dieser
Gruppe nicht nachzuweisen.

39
3 Ergebnisse
3.2.5 Apoptose nach allogener Nierentransplantation bei uPAR-
Defizienz
Das pathophysiologische Korrelat zur akuten Tubulusnekrose ist die hypoxisch
induzierte Apoptose. Zur Detektierung des Zelltodes wurde die TUNEL-Methode bei
der uPAR-/- Gruppe und ihrer Kontrollgruppe 4 Stunden, 24 Stunden und 6 Tage
nach der Transplantation durchgeführt (Abb. 3.2.5). In der WT2-Gruppe wurden im
gesamten Schnitt bereits nach vier Stunden TUNEL-positive Zellen nachgewiesen
(A). 24 Stunden nach der Transplantation erfolgte eine weitere deutliche Steigerung
der Anzahl an TUNEL-positiven Zellen (C). Im Gegensatz dazu fanden sich bei der
Gruppe der uPAR-/- Nierentransplantate vier und 24 Stunden nach Transplantation
kaum TUNEL-positive Zellen (B und D).
Sechs Tage nach der Operation fanden sich in der WT-Gruppe noch mehr positive
Signale als zu den Zeitpunkten 4 und 24 Stunden (E). Zwar wurden in der uPAR-/-
Gruppe nach sechs Tagen eine leicht erhöhte Anzahl von TUNEL-positiven Zellen
gefunden, diese war jedoch wesentlich niedriger als in der WT2-Kontrollgruppe zu
diesem Zeitpunkt (F).
Um zu differenzieren, ob die TUNEL-positiven Zellen in den Schnitten der WT- und
uPAR-/- Gruppen durch den programmierten Zelltod (Apoptose) oder durch Nekrose
untergegangen sind, wurde eine immunhistochemische Anfärbung der Gewebe mit
einem Antikörper gegen aktivierte Caspase-3 angefertigt. Aktivierte Caspase-3 ist ein
verlässlicher Marker für Apoptose.
Vor allem im S3-Segment (OSOM), dem Abschnitt, der am empfindlichsten auf
Sauerstoffmangel reagiert, und in der Media der Blutgefäße konnte 24 Stunden nach
der Transplantation aktivierte Caspase-3 in den Schnitten der WT2-Kontrollgruppe
nachgewiesen werden (Daten hier nicht gezeigt). Sechs Tage nach der
Transplantation konnte in diesen Bereichen aktivierte Caspase-3 noch deutlicher
nachgewiesen werden (G). Im Vergleich dazu zeigte sich bei der Gruppe der uPAR-/-
Transplantate eine wesentlich geringere Anzahl von positiven Signalen für aktivierte
Caspase-3 nach sechs Tagen (H).
Diese Ergebnisse korrelierten sehr gut mit denjenigen bei IR-Schaden (3.1.3) und
demonstrierten deutlich, dass die lokale uPAR-Expression für die ischämischinduzierte
Apoptose ausschlaggebend ist.

4h
24h
d 6
d 6
WT uPAR-/-
A B
C D
E F
G
40
3 Ergebnisse
Abb. 3.2.5 zeigt die TUNEL-Färbung nach allogener NTx bei uPAR-/- und WT2-
Kontrollgruppe nach 4h, 24h und d6 und die immunhistochemische Färbung
von aktivierter Caspase-3 nach d6. Zur Quantifizierung der TUNEL-positiven
Zellen wurden 10 Gesichtsfelder pro Niere (je 5 Mäuse pro Gruppe) ausgezählt.
Die gezeigten Daten sind als MW ± SEM dargestellt.
H
Zellen/ 10 GF
Zellen/ 10 GF
Zellen/ 10 GF
100
75
50
25
0
125
100
75
50
25
0
100
75
50
25
0
WT uPAR-/-
WT uPAR-/-
WT uPAR-/-
Caspase-3

41
3 Ergebnisse
A) Dargestellt sind repräsentative Schnitte der WT2-Gruppe 4h (A), 24h (C) und
sechs Tage (E) nach Transplantation. Im zeitlichen Verlauf kam es zu einem
deutlichen Anstieg der TUNEL-positiven Zellen.
B) Dargestellt sind repräsentative Schnitte der uPAR-/- Transplantate 4h (B), 24h
(D) und sechs Tage (F) nach Transplantation. Die uPAR-defizienten
Transplantate wiesen signifikant weniger TUNEL-positive Zellen auf als die
WT-Transplantate.
G) zeigt eine immunhistochemische Färbung mit aktivierter Caspase-3 an einem
WT-Transplantat (G) sechs Tage nach der Transplantation im Vergleich zu
einem uPAR-/- Transplantat (H). Im WT-Transplantat waren stark vermehrte
Signale von aktivierter Caspase-3 zu sehen. In der uPAR-defizienten
Transplantatniere kam es zu einer deutlich geringeren Caspase-3 Aktivierung.
3.2.6 Freie Radikale nach allogener Nierentransplantation bei uPAR-
Defizienz
Sauerstoffmangel im Gewebe führt zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies
(Sauerstoffradikalen, ROS). Diese schädigen das Gewebe, zum Beispiel über einen
Signalweg in den Mitochondrien, welcher zur Apoptose führt. Die Bedeutung von
ROS bei der Aktivierung dieses Signalweges ist bereits gut erforscht (Jonassen, J. A.
et al. 2003). Die bisherigen Ergebnisse zeigten in den uPAR-defizienten Nieren eine
stark reduzierte Zahl von apoptotischen Zellen nach ischämischen Ereignissen im
Rahmen des akuten Nierenversagens und der Nierentransplantatabstoßung. Es
wurde nun also die Hypothese überprüft, ob diese erniedrigte Zahl an apoptotischen
Zellen durch eine Downregulation der Produktion von ROS zustande kam.
Dafür wurde die DHE-Färbung auf Schnitten von Kontrollnieren und
Transplantatnieren 4h und 24h nach der Transplantation durchgeführt.
Tatsächlich fand sich ein wesentlicher Unterschied zwischen der uPAR-/- Gruppe
und ihrer WT2-Kontrollgruppe (Abb. 3.2.6). Vor der Transplantation zeigten beide
Gruppen eine niedrige basale Expression von ROS (A und B). Bereits 4h und auch
noch 24h nach der Transplantation zeigte die WT2-Gruppe aber eine massive
Hochregulation von ROS (C und E). Demgegenüber war die Expression von ROS im
Gewebe der uPAR-/- Transplantate deutlich vermindert (D und F). Dieser Effekt

42
3 Ergebnisse
wurde gleichermaßen im tubulären Interstitium (Abb.3.2.6.1), wie auch in den
Glomeruli (Daten hier nicht gezeigt) beobachtet.
Diese Versuche zeigten, dass uPAR nach hypoxischen Ereignissen zur Generierung
von ROS beiträgt und somit Apoptose induziert.
Vor NTx
4h
24h
WT uPAR-/-
A B
C D
E F
Abb. 3.2.6 zeigt eine DHE-Färbung von ROS in Transplantaten der WT2-
Kontrollgruppe im Vergleich zu uPAR-defizienten Transplantaten zu den
Zeitpunkten 0h, 4h und 24h nach Transplantation.
A) zeigt die DHE-Färbung in normalen WT-Nieren, B) zeigt die DHE-Färbung in
uPAR-/- Nieren. Es waren keine Unterschiede zwischen den Nieren
feststellbar, die basale ROS-Generierung im Gewebe war minimal.

43
3 Ergebnisse
C) zeigt die DHE-Färbung der WT-Gruppe 4h, E) 24h nach der Transplantation.
Gezeigt sind deutliche Signale der ROS im tubulären Interstitium. Die ROS-
Generierung stieg im Tubulointerstitium deutlich an.
D) zeigt die DHE-Färbung der uPAR-/- Gruppe nach 4h, und F) nach 24h nach
der Transplantation. ROS-Generierung war zwar zu erkennen, jedoch war
diese weitaus weniger deutlich als in der WT2-Kontrollgruppe zu diesen
Zeitpunkten.
3.2.7 Inflammatorische Zellinfiltrate nach allogener
Nierentransplantation bei uPAR-Defizienz
Die Infiltration des Transplantates mit Empfängerleukozyten ist ein Kennzeichen der
Transplantatabstoßung (El-Sawy, T. et al. 2005;Tinckam, K. J. et al. 2005). Um die
Zusammensetzung der infiltrierenden Zellen zu analysieren, wurden
immunhistochemische Färbungen auf verschieden Leukozytensubpopulationen
angefertigt. Zuerst wurden die Nierenpräparate der WT2-Gruppe und der uPAR-/-
Gruppe mit Antikörpern gegen neutrophile Granulozyten (Gr-1) und anschließend
gegen Monozyten und Makrophagen (F4/80) angefärbt (Abb. 3.2.7.1). Hierbei fanden
sich deutliche Unterschiede, was die Infiltration von WT2-Nieren und uPAR-/-
Nierentransplantaten sechs Tage nach allogener Nierentransplantation betrifft. So
zeigte sich eine erniedrigte Anzahl von infiltrierenden neutrophilen Granulozyten im
tubulo-interstitiellen Bereich von uPAR-defizienten Transplantaten, im Vergleich zu
der WT2-Kontrollgruppe (B). Die akute Transplantatabstoßung wird weiterhin auch
durch Monozyten und Makrophagen gesteuert. Ihre Anzahl war, im Gegensatz zur
WT2-Gruppe, bei der uPAR-/- Gruppe im tubulo-interstitiellen Bereich deutlich
reduziert (D).

GR-1 pos.
Zellen
F4/80 pos.
Zellen
WT uPAR-/-
A B
C D
44
3 Ergebnisse
Abb. 3.2.7.1 zeigt die Einwanderung von neutrophilen Granulozyten (Gr-1) und
Monozyten/Makrophagen (F4/80) 6 Tage nach allogener NTx.
A) zeigt die immunhistochemische Färbung von neutrophilen Granulozyten in
WT2-Transplantaten. Es imponierten vor allem peritubulär eingewanderte
Granulozyten.
B) zeigt die immunhistochemische Färbung von neutrophilen Granulozyten in
uPAR-/- Transplantaten. Im Tubulointerstitium zeigten sich weniger infiltrierte
Granulozyten als in den WT2-Transplantaten.
C) zeigt die immunhistochemische Färbung von Monozyten und Makrophagen in
einem WT2-Nierentransplantat. Im Tubulointerstitium war eine Vielzahl von
dichten Ansammlungen dieser infiltrierenden Zellen zu sehen.
D) zeigt die immunhistochemische Färbung von Monozyten und Makrophagen in
einem uPAR-/- Transplantat. uPAR-Defizienz führte zu einer wesentlich
geringeren Infiltration mit Monozyten und Makrophagen.
Zur weiteren Differenzierung der inflammatorischen Zellen erfolgten weitere
Untersuchungen. Es wurden Färbungen mit T-Lymphozyten CD4- und CD8-

45
3 Ergebnisse
spezifischen Antikörpern und Antikörpern gegen dendritische Zellen (CD11c)
durchgeführt. Hierbei fanden sich jedoch keinerlei Unterschiede zwischen den WT2-
und uPAR-/- Transplantaten (Daten hier nicht gezeigt).
Dieses Ergebnis unterstrich die Rolle von lokal in der Niere produziertem uPAR bei
der Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in
das Nierengewebe.
Die Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in
entzündetes Nierengewebe ist unter anderem von der Produktion von lokalen
proinflammatorischen Zytokinen abhängig. Solche chemoattraktiven Botenstoffe sind
zum Beispiel MIP-2 (Macrophage inflammatory protein-2) und MCP-1 (Macrophage
chemoattractand protein-1) (Wenzel, U. et al. 1997). Um zu überprüfen, ob die
verminderte Einwanderung von Monozyten/Makrophagen und neutrophilen
Granulozyten in die Transplantate der uPAR-/- Gruppe aus einer verminderten
Produktion dieser Chemokine stammt, wurde die mRNA-Expression von MIP-2 und
MCP-1 in uPAR-defizienten Transplantaten gemessen und mit der Expression in der
WT2-Kontrollgruppe verglichen. Wie erwartet war die Produktion dieser
proinflammatorischen Chemokine in der WT2-Kontrollgruppe stark hoch reguliert.
Doch überraschenderweise fanden sich in der uPAR-/- Gruppe ähnlich hohe Werte
der lokalen MIP-2 und MCP-1 Produktion wie in der WT2-Gruppe (Abb. 3.2.7.2). Die
Produktion von MIP-2 (A) erreichte nach 24h ein Maximum und fiel im Verlauf wieder
ab. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den WT2- und uPAR-/-
Transplantaten. Die Expression von MCP-1 (B) war in beiden Gruppen nach 24h
leicht und nach 6 Tagen deutlich erhöht. Erstaunlicherweise waren die Werte in den
uPAR-/- Transplantaten sogar signifikant höher als in den WT2-Transplantaten.
Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass die gestörte Einwanderung von
Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in uPAR-defiziente
Nierentransplantate nicht über einen Unterschied der exprimierten Menge der
chemoattraktiven Botenstoffe MIP-2 und MCP-1 vermittelt wird.

A
rel. MIP-2/b-Aktin
mRNA Expression
B
rel. MCP-1/b-Aktin
mRNA Expression
0,045
0,040
0,035
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
Kontrolle 24h d6
**
Kontrolle 24h d6
46
WT
uPAR-/-
3 Ergebnisse
Abb. 3.2.7.2 zeigt die mRNA-Expression von MIP-2- und MCP-1-mRNA nach
allogener NTx in uPAR-/- und WT2-Transplantaten.
A) zeigt die Expression von MIP-2 vor NTx, 24 Stunden und 6 Tage nach NTx.
Die maximale Expression fand 24 Stunden nach der Transplantation statt. Es
lag kein signifikanter Unterschied zwischen den WT2-Transplantaten und den
uPAR-/- Transplantaten vor.
B) zeigt die Expression von MCP-1 vor NTx, 24 Stunden und 6 Tagen nach NTx.
Es fand sich ein Maximum in beiden Gruppen nach 6 Tagen. Die MCP-1
Expression war in der uPAR-/- Gruppe sogar noch höher als in der WT2-
Kontrollgruppe.
**
WT
uPAR-/

47
3 Ergebnisse
Neben den Chemokinen spielt die Interaktion von Adhäsionsmolekülen auf
aktivierten Endothelzellen und den Leukozyten im Intravasalraum eine wichtige Rolle
bei der Einwanderung von Entzündungszellen. Um zu überprüfen, ob in diesem
Schritt der Leukozyteneinwanderung ein Unterschied zwischen uPAR-/-
Transplantaten und ihrer WT2-Kontrollgruppe bestand, wurde die Expression von
Adhäsionsmolekülen gemessen. In der qPCR wurde in den beiden Gruppen die
Expression des Adhäsionsmoleküls E-Selektin gemessen. Dabei fand sich kein
Unterschied zwischen den Gruppen (Daten hier nicht dargestellt). Ein weiteres
wichtiges Adhäsionsmolekül ist ICAM-1 (intracellular-adhesions-molecule-1). Die
Expression von ICAM-1 wurde immunhistochemisch untersucht. Im Gegensatz zu E-
Selektin fand sich bei der Expression von ICAM-1 bei der Gruppe der uPARdefizienten
Transplantate eine signifikant niedrigere Hochregulation nach NTx,
verglichen mit der WT2-Kontrollgruppe (Abb. 3.2.7.3). Die basale Expression von
ICAM-1 war in beiden Gruppen ähnlich.
Diese Ergebnisse sprachen dafür, dass die verminderte Einwanderung von
Monozyten/Makrophagen und neutrophilen Granulozyten in uPAR-defiziente
Transplantate durch eine verminderte Hochregulation von ICAM-1 verursacht sein
könnte.

Vor NTx
24h
WT uPAR-/-
A B
C D
48
3 Ergebnisse
Abb. 3.2.7.3 zeigt die Expression von ICAM-1 nach allogener NTx in uPAR-/und
WT2-Transplantaten 24h nach Transplantation.
A) zeigt die ICAM-1 Expression in einer WT2-Niere, B) in einem uPAR-/-
Transplantat vor der Transplantation. Es war eine geringe basale Expression
von ICAM-1 in WT2- und uPAR-/- Nieren zu erkennen.
C) zeigt die immunhistochemische Färbung von einem WT2-Transplantat 24h
nach allogener NTx. In den Glomeruli war eine starke Hochregulation von
ICAM-1 zu sehen.
D) zeigt die immunhistochemische Färbung eines uPAR-/- Transplantates 24h
nach allogener NTx. In den Glomeruli der uPAR-defizienten Nieren fand keine
Hochregulation von ICAM-1 statt.

4 Diskussion
4 Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass renal exprimiertem uPAR eine
bedeutende Rolle für die Pathogenese der hypoxie-induzierten akuten
Abstoßungsreaktion nach allogener Nierentransplantation und des IR-Schadens
zukommt. Die Expression von uPA spielte hierfür eine untergeordnete Rolle. Die
uPAR-Defizienz des Transplantates führte zu einer deutlich verminderten
Generierung von ROS und einer verminderten Apoptose nach allogener
Nierentransplantation. Aus der Resistenz des uPAR-/- Transplantates gegenüber
oxidativem Stress und hypoxie-induzierter Apoptose resultierte eine bessere
Transplantatfunktion und ein deutlich verlängertes Transplantatüberleben. Weiterhin
zeigte sich in den Blutgefäßen von uPAR-/- Nierentransplantaten eine inadäquat
niedrige Expression von Adhäsionsmolekülen und nachfolgend eine verringerte
Infiltration mit neutrophile Granulozyten, aber auch eine reduzierte Anzahl von
infiltrierenden Monozyten und Makrophagen. Diese Versuche belegen eine wichtige
kausale Rolle des renalen uPAR-Systems bei der Ausbildung des akuten
Nierenversagens im Rahmen des IR-Schadens und der akuten
Nierentransplantatabstoßung.
4.1 uPAR-Defizienz und die Generierung von ROS
Die akute Abstoßungsreaktion ist ein bedeutender negativer Prediktor für die
Transplantatfunktion und das Transplantatüberleben. Es können viele verschiedene
Ereignisse zur akuten Transplantatabstoßung führen, hervorgehoben sei hier die
Hypoxie des Transplantates mit nachfolgender Inflammationsreaktion. Das
Protokollbiopsieprogramm unserer Abteilung konnte bereits zeigen, dass eine
verlängerte kalte Ischämiezeit ein Hauptrisikofaktor für ein verschlechtertes
Transplantatüberleben ist (Schwarz, A. et al. 2005). Sauerstoffmangelzustände sind
bei Leichenspenden unumgänglich und induzieren über die Bildung von ROS einen
IR-Schaden. Letzterer führt zur gesteigerten Apoptose im Transplantat und zur
Aktivierung des angeborenen Immunsystems des Empfängers (Land, W. G. 2005).
49

50
4 Diskussion
Der tubuläre Zelluntergang wird als eine wichtige Vorstufe zur tubulären Atrophie bei
der fortschreitenden Nierenerkrankung betrachtet. In mehreren Arbeiten konnte
scheinbar eine Regulation des renalen Zelltodes via Apoptose durch uPAR
nachgewiesen werden. So zeigte die Arbeitsgruppe um Zhang, dass bei unilateraler
Ureterobstruktion signifikant mehr apoptotische Tubuluszellen in uPAR-/- Tieren
nachgewiesen werden konnte als in den WT-Kontrolltieren (Zhang, G. et al. 2003).
Diese Ergebnisse sprächen eher für eine proapoptotische Wirkung bei Abwesenheit
von uPAR. Bestätigt wurde diese Theorie durch eine in vitro Arbeit, in welcher
humane Gliomazellen mit uPAR-anti-sense versetzt wurden und ein vermehrter
apoptotischer Zelltod beobachtet wurde (Kin, Y. et al. 2000). Ein Hauptergebnis
dieser Arbeit ist jedoch, dass lokale uPAR-Defizienz durch verminderte Generierung
von ROS vor Apoptose schützt. Dieses gilt für beide Modelle in dieser Arbeit (NTx
und IR-Schaden). Eine mögliche Erklärung für diese gegensätzlichen Ergebnisse
könnte eine pro- und antiapoptotische Auswirkung von uPAR sein, welche über
verschiedene Signalkaskaden aktiviert werden. So zeigen Ergebnisse aus unserer
Abteilung, dass uPAR-/- glatte Muskelzellen (vascular smooth muscle cells, VSMC)
in vitro über einen ROS unabhängigen Weg (TNF-α vermittelt) vermehrt der Apoptose
unterliegen als die VSMC der WT-Kontrollgruppe (unveröffentlichte Arbeit). Jedoch
bleibt der genaue molekulare Mechanismus, welcher zu einer verminderten ROS-
Generierung bei uPAR-/- führt, unbekannt und offen für weitere Untersuchungen.
Kürzlich wurde in vitro nachgewiesen, dass uPA die ROS-Produktion in VSMC
stimuliert (Menshikov, M. et al. 2006). Ob eine Interaktion von uPA und uPAR für den
nachfolgenden ROS-Aktivierungsweg, mit Apoptose der renalen Zellen als Endpunkt,
von Bedeutung ist, wurde im IR-Schaden Mausmodell an entsprechenden uPA-/-,
uPAR-/- und WT-Tieren untersucht. Die Ergebnisse zeigen eindeutig einen
renoprotektiven Effekt für die Gruppe der uPAR-defizienten Tiere durch verminderte
ROS-assoziierter Apoptose von Zellen in der Niere. Bei der Gruppe der uPA-/-
Mäuse wurde dieser Effekt nicht beobachtet, was darauf schließen lässt, dass
Apoptose via Generierung von ROS nicht durch uPA, sondern über seinen Rezeptor,
uPAR, moduliert werden kann. Auch im NTx-Mausmodell konnten die Ergebnisse,
welche zuvor im IR-Schaden-Mausmodell erhoben wurden, bestätigt werden. So
wurde in der Gruppe der uPA-/- Transplantate nach allogener Nierentransplantation
kein signifikanter Unterschied im Vergleich zu der WT-Kontrollgruppe gefunden, was

51
4 Diskussion
das Graftüberleben, die Apoptoserate von Zellen und die Expression von ROS
betraf.
Unsere Untersuchungen haben zeigen können, dass nach Nierentransplantation eine
vermehrte Expression von uPA und uPAR in den Zellen des Nierenkortex und des
S3-Segmentes stattfindet (s. Abb. 3.2.1.2). Darüber hinaus konnte auch für PAI-1
(Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1), ein anderer freier Ligand für den uPA-Rezeptor,
eine vermehrte Expression beobachtet werden, sowohl in der uPAR-/- als auch in der
WT-Gruppe. Es fanden sich in der aktuellen Literatur keine Nachweise dafür, dass
die Interaktion von PAI-1 in vitro oder in vivo mit dem uPA-Rezeptor zu einer
vermehrten Bildung von ROS führt. Somit bleibt unklar, ob die vermehrte Expression
von PAI-1 in unserem Modell über diesen Signaltransduktionsweg zur erhöhten
Apoptoserate geführt hat. Jedoch könnte PAI-1 über einen alternativen Signalweg
zur Apoptose führen. So wurde in vivo, wie auch in vitro eine direkte Stimulation von
TGF-β mRNA (transforming-growth-factor-beta) und dessen Protein in Nierenzellen
durch PAI-1 beschrieben (Nicholas, S. B. et al. 2005). TGF-β ist als
Apoptoseinduktor in renalen Zellen bereits gut charakterisiert worden (Wada, T. et al.
2005;Wu, D. T. et al. 2005). Die Arbeit von Lodha et al. erbrachte die Erkenntnis,
dass ein TGF-β Signalweg zur Aktivierung der NADPH-Oxidase, und hierdurch zur
Generierung von ROS in renalen Mesangiumzellen führt (Lodha, S. et al. 2002). So
ergeben sich für diese Arbeit Hinweise, dass zwar nicht die Interaktion von uPAR mit
PAI-1 zur Apoptose führt, diese aber auch über alternative Wege initiiert werden
könnte.
Beim uPA-Rezeptor handelt es sich um einen glykosil-phosphatidylinositol (GPI)verankertes
Protein, welches die Eigenschaft hat, neben den physiologisch
nachgewiesenen Liganden (uPA und PAI-1) auch mit einer Vielzahl von
Membranproteinen zu interagieren. Hierzu gehören zum Beispiel Integrine,
endozytische Rezeptoren, Kaveolin, der gp130-Zytokinrezeptor, der EGF-Rezeptor
(epidermal-growth-factor) und platelet-derived-growth-factor-receptor (PDGF) (Blasi,
F. et al. 2002). Durch Bindung mit diesen Membranproteinen können variable prooder
antiapoptotische Signaltransduktionswege induziert werden. In einer Arbeit von
Zhang et al. konnte gezeigt werden, dass ROS-vermittelte Apoptose in
polymorphonukleären Leukozyten (PMN) von einem beta-2-Integrin abhängig ist

52
4 Diskussion
(Zhang, B. et al. 2003). Es kann also nicht ausgeschlossen werden, dass noch
weitere Bindungspartner für den uPA-Rezeptor zur ROS-assoziierten Apoptose
führen kann.
4.2 uPAR-Defizienz und die Migration von
inflammatorischen Zellen
Während der Reperfusion der Niere nach Transplantation beginnt bereits eine frühe
inflammatorische Reaktion mit Immigration von polymorphonukleären Leukozyten
(PMNs) (El-Sawy, T. et al. 2005) in das Transplantat. Im weiteren Verlauf wandern
auch Monozyten und Makrophagen (MO) in das Transplantat ein. Bei einer akuten
Abstoßungsreaktion bestehen ca. 38-60% des gesamten Infiltrates aus
Makrophagen. Das Auftreten von MO-Zellen im Transplantat korreliert eng mit einer
Komplementaktivierung und einer konsekutiven akuten Abstoßungsreaktion, wie in
früheren Studien an Protokollbiopsien von Nierentransplantaten gezeigt werden
konnte. Dabei befanden sich in den Biopsaten von Patienten mit akuten
Abstoßungsreaktionen signifikant mehr MO-Zellen als in den Biopsaten nicht
rejezierender Transplantate (Sund, S. et al. 2004). In einer weiteren Studie wurde
nachgewiesen, dass eine Infiltration mit MO-Zellen drei Monate nach Transplantation
invers mit der Transplantatfunktion und dem Transplantatüberleben korrelierte
(Srinivas, T. R. et al. 2004).
Die verminderte Migrationsfähigkeit von Leukozyten bei uPAR-Defizienz wurde
bereits früher in anderen Modellen in vivo und in vitro untersucht (Carlin, S. M. et al.
2005;May, A. E. et al. 1998). Die Arbeitsgruppe von May et al. zeigte in vivo, dass die
Migration von Leukozyten in entzündetes Peritoneum von uPAR-/- Mäusen im
Vergleich zur WT-Kontrollgruppe signifikant reduziert war. In vitro konnte Carlin et al.
eine Begünstigung der Leukozyteninflammation durch den uPA-Rezeptor und andere
membranständige Proteine, wie z.B. Caveolin und Integrine, nachweisen.
Hervorzuheben in diesem Zusammenhang ist, dass in der vorliegenden Studie nur
eine uPAR-Defizienz der Transplantatniere vorlag, die Empfängerleukozyten
hingegen den Wildtyptieren entstammten und somit über ein normales uPA/uPAR-
System verfügten. Trotz normaler uPAR-Expression auf den Leukozyten des
Empfängers, stellten wir eine deutliche Reduzierung von PMN/MO-Infiltraten in den

53
4 Diskussion
uPAR-defizienten Transplantatnieren verglichen mit den Wildtyp-Transplantatnieren
fest. Dieses Ergebnis unterstreicht die wichtige Bedeutung der lokalen uPAR-
Expression auf ortsständigen Nierenzellen für die Migration von Leukozyten in
entzündetes Gewebe. Kürzlich konnte auch gezeigt werden, dass eine Hemmung
der PMN-Infiltration in allogene Herztransplantate einen signifikanten Einfluss auf
den Effekt der T-Zellantwort des Empfängers gegenüber dem Allotransplantat hat
(El-Sawy, T. et al. 2005). In unserem Modell der akuten Nierentransplantatabstoßung
jedoch haben wir keine Unterschiede bezüglich der Expression von CD4- und CD8positiven
T-Lymphozyten feststellen können. Diese Ergebnisse legen nahe, dass in
dem hier untersuchten Modell der akuten Nierentransplantatabstoßung die frühen,
durch den IR-Schaden induzierten Ereignisse wie Apoptose und
Leukozyteninfiltration, relevanter für die Abstoßung des Transplantates sind als die
T-Zellvermittelte Immunantwort.
Für die Migration von inflammatorischen Zellen in den Extravasalraum im Rahmen
einer Entzündungsreaktion ist eine Vielzahl von Signalkaskaden verantwortlich.
Diese vermitteln unter anderem die Ausbildung eines chemotaktischen Gradienten
durch extravasale Zellen, die zu einer Anlockung von Leukozyten führen und die
Hochregulation von Adhäsionsmolekülen auf aktivierten Endothelzellen, welche die
Transmigration der Leukozyten in das entzündete Gewebe vermitteln. Verschiedene
Chemokine vermitteln selektiv die Migration spezifischer Leukozyten-Subtypen in
entzündetes Gewebe. Die Chemokine werden sowohl von intrinsischen
Nierenparenchymzellen als auch von infiltrierenden Leukozyten exprimiert (Segerer,
S. et al. 2000). Es wird vermutet, dass einzelne Untergruppen der Chemokine eine
zentrale Rolle in der Rekrutierung bestimmter Leukozyten und deren Stimulierung
spielen (Perez de Lema, G. et al. 2001). Als spezifisches Chemokin für Monozyten
wurde MCP-1 identifiziert (monocyte-chemattractant protein-1) (Wenzel, U. et al.
1997). Biopsien von Patienten mit akuter Abstoßungsreaktion zeigten in
immunhistochemischen Färbungen eine deutliche Signalvermehrung für das Zytokin
IL-8 (Interleukin-8) in den Epithelzellen des proximalen und des distalen
Tubulussystems (Schmouder, R. L. et al. 1992). Auch IL-8 gilt als chemotaktische
Substanz für die Lymphozyten- und die neutrophilen Granulozyteninfiltration, in der
Maus ist das dem IL-8 entsprechende Molekül MIP-2 (macrophage inflammatory
protein-2). Um zu untersuchen, ob die gestörte Immigration von PMN- und MO-Zellen
in unserem Modell auf eine reduzierte Expression von MCP-1 und MIP-2

54
4 Diskussion
zurückzuführen ist, wurde die mRNA-Expression dieser beiden Zytokine in WT- und
uPAR-/- allogenen Nierentransplantaten bestimmt. Das Ergebnis der Untersuchung
zeigte eine nahezu gleiche Hochregulation der Expression von MIP-2 und MCP-1 in
den Wildtyp- und den uPAR-defizienten-Allotransplantaten. Dies lässt den Schluss
zu, dass die Höhe der Expression von MCP-1 und MIP-2 nicht für die verminderte
PMN- und MO-Zellinfiltration in uPAR-/- Nierentransplantaten verantwortlich ist.
Weiterführend wurde untersucht, ob eine verminderte Expression von
Adhäsionsmolekülen die reduzierte Infiltration mit PMN/MO-Zellen erklären könnte.
Als Indikatormolekül wurde ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1, CD 54)
gewählt. Dieses Adhäsionsmolekül gilt als Hauptbindungspartner für beta2-integrin,
welches von Leukozyten exprimiert wird. Bereits zwei bis drei Stunden nach der
Transplantation konnte eine starke Hochregulation der Expression von ICAM-1
gemessen werden (Neto, J. S. et al. 2004), aber auch im Modell des IR-Schadens
wurde eine deutliche Hochregulation von ICAM-1 beschrieben (De Greef, K. E. et al.
2003). Die Blockade von ICAM-1 im Modell der renalen Ischämie durch ICAM-1
Antikörper oder im Modell einer ICAM-1-Knock-Out Maus verringerte die Infiltration
mit PMN-Zellen deutlich (Patel, N. S. et al. 2004;Rabb, H. et al. 1997). Passend zu
diesen Ergebnissen fand sich bei vermehrter Expression von ICAM-1 auch eine
vermehrte Infiltration mit Monozyten im Modell des IR-Schadens (De Greef, K. E. et
al. 2003). In der vorliegenden Arbeit konnte eine signifikant verringerte
Hochregulation von ICAM-1 in uPAR-/- Transplantaten im Vergleich zur WT-
Kontrollgruppe nach allogener Nierentransplantation nachgewiesen werden. Als
mögliche Ursache könnte ein gestörtes TNF-α- (Tumor Nekrose Faktor Alpha) und
C5a-Signaling auf Blutgefäßen von uPAR-/- Transplantaten im Vergleich zur WT-
Kontrollgruppe verantwortlich sein. Für TNF-α und C5a wurde bereits ein
proinflammatorischer Aspekt via Bildung von Adhäsionsmolekülen, auch ICAM-1,
beschrieben (Albrecht, E. A. et al. 2004). Diese Ergebnisse wurden von der
Arbeitsgruppe Piquet et al. bestätigt, welche die bedeutende Rolle von Blutplättchenassoziiertem
uPAR für die Aktivierung der Blutplättchen und ihre proinflammatorische
Wirkung auf das Endothel, als Antwort auf TNF-α Induktion, beschrieben hat (Piguet,
P. F. et al. 1999). In frühreren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe konnte bereits
nachgewiesen werden, dass uPAR für die C5a/C5aR-vermittelte Antwort von

55
4 Diskussion
alveolären Mausmakrophagen und von humanen glomerulären Mesangiumzellen
unabdingbar ist (Shushakova, N. et al. 2005).
Durch eine verminderte Hochregulation der ICAM-1-Expression in uPAR-/-
Nierentransplantaten kam es zu einer verminderten Einwanderung von PMN- und
MO-Zellen. Hieraus resultierte eine verminderte lokale Entzündungsreaktion, was zu
einer Abmilderung des IR-Schadens, einer verbesserter Nierenfunktion und einem
deutlich verbessertem Transplantatüberleben führte. Die vorliegenden
Untersuchungen belegen, dass uPAR eine kausale Rolle bei der Ausbildung und
Schwere des akuten IR-Schadens und der akuten Nierentransplantatabstoßung
einnimmt. uPAR könnte ein wichtiges therapeutisches Target für die Prävention von
Organschäden, induziert durch IR-Schäden oder im Rahmen einer akuten
Abstoßungsreaktion, werden. Ein uPAR-Antagonist könnte renoprotektiv für das
Outcome bei akutem Nierenversagen und bei akuter Transplantatabstoßung wirken.

5. Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des uPA/uPAR-Systems auf das akute
Nierenversagen und die akute Nierentransplantatabstoßung mit Hilfe von uPA- und
uPAR-defizienten Mäusen experimentell untersucht. uPAR-Defizienz, nicht jedoch
uPA-Defizienz, führten zu einer Nierenprotektion nach IR-Schaden. Diese wurde
durch eine deutliche Verringerung der Hypoxie bedingten Apoptose vermittelt.
Im Mausmodell der allogenen Nierentransplantation wurde der Einfluss des renalen
uPA/uPAR-Systems untersucht, indem uPA- bzw. uPAR-defiziente Spendernieren
allogen in Wildtyp-Empfänger transplantiert wurden. Empfänger von uPAR-
defizienten Nierentransplantaten zeigten ein deutlich längeres Überleben als
Empfänger von Wildtyptransplantaten, des weiteren war die Nierenfunktion bei
uPAR-defizienten Transplantatempfängeren signifikant besser als bei uPA- bzw.
Wildtyp-Transplantatempfängern. Als Mechanismus konnte eine Verringerung der
frühen Radikalbildung sowie eine Reduktion der Tubulusapoptose bei uPAR-
Defizienz des Nierentransplantates 24h nach allogener Transplantation
nachgewiesen werden. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass 6 Tage nach
allogener Transplantation deutlich weniger neutrophile Granulozyten und
Monozyten/Makrophagen in die uPAR-defizienten Nierentransplantate, im Vergleich
zu Wildtyp-Transplantaten, eingewandert waren. Als Mechanismus konnte eine
verringerte Hochregulation des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 in uPAR-defizienten
Transplantaten nachgewiesen werden.
Die vorliegenden Ergebnisse unterstreichen eine neue kausale Rolle des uPA-
Rezeptors bei der Ausbildung des akuten Nierenversagens und der akuten allogenen
Transplantatabstoßung
56

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7 Abkürzungsverzeichnis
62
7. Abkürzungsverzeichnis
A. Arterie
Abb. Abbildung
A. bidest. zweifach destilliertes Wasser
A. dest. destilliertes Wasser
a.e. am ehesten
ANV akutes Nierenversagen
ATN akute Tubulusnekrose
°C Grad Celsius
C5a complement component 5
cDNA komplementäre DNA
d day (Tag)
d0 vor Operation
d6 6 Tage nach Operation
DAPI 4’-6-Diamidino-2-phenylindole
DHE Dihydroethidium
DNA Desoxyribonuceinsäure
EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraacetat
EGF epidermal-growth-factor
GPI glykosil-phosphatidylinositol
h hour (Stunde)
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure
ICAM-1 intracellular-adhäsions-molecule-1
ICU intermediate-care-unit
IL-8 Interleukin-8
IR-Schaden Ischämie-Reperfusionsschaden
li. links
Lsg. Lösung
MAPK Mitogen-aktivierende Proteinkinase
MCP-1 macrophage chemoattractand protein-1
min. Minute
MIP-2 macrophage inflammatory protein-2
MO Monozyten/Makrophagen

63
7. Abkürzungsverzeichnis
mRNA messenger Ribonucleinsäure
MW Mittelwert
NaCl 0,9% Natriumchlorid (physiologische Kochsalzlösung)
NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
NTx Nierentransplantation
OP Operation
OSOM outer-stripe of the outer-medulla
PAI-1 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1
PAS Perjodic-Acid-Schiff-Reaktion
PBS phospate buffered saline
PCR Polymerase-Chain-Reaction
PFA Paraformaldehyd
PMN polymorphonukleären Leukozyten
qPCR quantitative real-time Polymerase-Chain-Reaction
re. rechts
RNA Ribonucleinsäure
ROS reaktive Sauerstoffspezies
RT Raumtemperatur
s. siehe
SD Standardabweichung
sek. Sekunde
SEM standard error of the mean, Standardfehler
S-Kreatinin Serumkreatinin
TBS Tris-buffered solution
TGF-β transforming-growth-factor-beta
TNF-α Tumor Nekrose Faktor Alpha
TUNEL Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP
Nick End-Labeling
Tx-Niere Transplantatniere
uPA urokinase-Typ Plasminogen Aktivator
uPAR urokinase-Typ Plasminogen Aktivator-Rezeptor
uPA-/- urokinase-Typ Plasminogen Aktivator Defizienz
uPAR-/- urokinase-Typ Plasminogen Aktivator-Rezeptor Defizienz
V. Vena

VSMC vascular smooth muscle cell
w week (Woche)
WT Wildtyp
z.B. zum Beispiel
64
7. Abkürzungsverzeichnis

8. Abbildungsverzeichnis
65
8. Abbildungssverzeichnis
Abb. 1.1.1 Schema der Nierenarchitektur mit Sauerstoffpartialdrücken 2
Tab.1.1.2 Tabelle der Inzidenzzahlen für das Auftreten des ANV 4
Abb.1.1.3 Schema der Pathophysiologie des ANV 5
Abb. 1.1.4 Übersicht der histologischen Veränderungen bei ANV 6
Tab. 2.1 Tabelle der verwendeten Antikörper 14
Abb. 2.2.5.2 Schema der indirekten Immunfluoreszenzfärbung. 19
Abb. 3.1.1 Nierenfunktion nach IR-Schaden 25
Abb. 3.1.2 Nierenmorphologie in einer PAS-Färbung nach IR-Schaden 26
Abb. 3.1.3 TUNEL-Assay nach IR-Schaden 28
Abb. 3.2.1.1 Diagramm der uPA/uPAR-mRNA-Expression nach allogener NTx 30
Abb. 3.2.1.2 Anti-uPAR Färbunge 24h und d6 nach allogener NTx 32
Abb. 3.2.2 Kaplan-Meier Überlebenskurve nach uPA-/- und uPAR-/- NTx
Abb. 3.2.3 Nierenfunktion von uPA-/- und uPAR-/- Transplantaten nach allogener
34
NTx 36
Abb. 3.2.4 Nierenmorphologie in einer PAS-Färbung von WT-, uPA- und uPARdefizienten
Nierentransplantaten 38
Abb. 3.2.5 TUNEL-Assay und anti-Caspase-3 Färbung nach allogener NTx bei
uPAR-/- und WT2-Transplantaten 40
Abb. 3.2.6 DHE-Färbung von ROS in uPAR-/- und WT2-Transplantaten nach
allogener NTx 42
Abb. 3.2.7.1 Einwanderung von neutrophilen Granulozyten und
Monozyten/Makrophagen 6 Tage nach allogener NTx. 44
Abb. 3.2.7.2 MIP-2- und MCP-1-mRNA-Expression nach allogener NTx in uPAR-/und
WT2-Transplantaten 46
Abb. 3.2.7.3 Hochregulation der ICAM-1-Expression nach allogener NTx in uPAR-/und
WT2-Transplantaten 48

Danksagung
66
Danksagung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Abteilung für Nephrologie der Medizinischen
Hochschule Hannover unter Leitung von Prof. Dr. med. Faikah Güler und Prof. Dr.
med. Hermann Haller angefertigt.
Bei Prof. Dr. med. H. Haller möchte ich mich dafür bedanken, dass er mir diese
Arbeit ermöglicht hat und mich durch seine fachliche Beratung stets unterstützt hat.
Frau Prof. Dr. med. F. Güler möchte ich für eine ausgezeichnete Betreuung während
der gesamten Arbeit herzlich danken. Durch Ihre ständige Diskussionsbereitschaft,
die konstruktive Kritik und nicht zuletzt die unzähligen hilfreichen Anregungen konnte
ich für diese Arbeit, aber auch das wissenschaftliche Arbeiten, sehr viel lernen.
Dr. med. Song Rong danke ich für die hervorragende Durchführung der
Nierentransplantation der Mäuse. Diese Arbeit fußt auf den Transplantaten, die in
seiner einzigartigen Technik gewonnen wurden.
Dr. rer. Nat. Joon-Keung Park gilt mein Dank für die exzellente Durchführung der
histologischen Untersuchungen und der konstruktiven Kritik.
Ganz besonderer Dank gilt Petra Berkefeld, Herle Chlebusch und Kerstin Bankes für
die immerwährende Unterstützung bei den ungezählten Versuchen der
Immunfluoreszenzfärbung. Die Tipps zur praktischen Arbeit im Labor halfen mir
immens bei der Fertigstellung dieser Arbeit, aber auch die Gespräche neben der
Arbeit machten die Zeit im Labor für mich sehr angenehm.
Vor allem aber möchte ich meiner Freundin Kathrin danken. Ohne Ihr Verständnis,
Ihre Unterstützung und ständige Motivation hätte ich diese Arbeit sicher nicht fertig
stellen können.

Name: Christian Clajus
Geburtsdatum: 18. November 1979
Lebenslauf
Geburtsort: Chur, Schweizerische Eidgenossenschaft
67
Lebenslauf
Schulbildung: 1986 – 1990 Grundschule, Aerzen
1990 – 1992 Orientierungsstufe Süd, Hameln
1992 – 1999 Viktoria-Luise-Gymnasium, Hameln
Abschluss: allgemeine Hochschulreife Juni
1999
Wehrersatzdienst: 1999 – 2000 Rettungsdienst beim Deutschen Roten
Kreuz, Kreisverband Hameln
Studium: 2000 – 2006 Studium der Humanmedizin an der
Medizinischen Hochschule Hannover
19.11.2006 2. Ärztliche Prüfung
11.12.2006 Approbationserteilung
Med. Tätigkeit: seit April 2007 Assistenzarzt in der Abteilung Nephrologie,
Medizinische Hochschule Hannover
………………………………………………….
(Unterschrift)

Erklärung
Erklärung
Ich erkläre, dass ich die der Medizinischen Hochschule Hannover eingereichte
Promotion mit dem Titel
„Die Rolle von uPAR beim akuten Nierenversagen und bei der akuten
Nierentransplantatabstoßung im Mausmodell“
in der Klinik der Nephrologie der Medizinischen Hochschule Hannover unter
Betreuung von Prof. Dr. med. H. Haller und Frau Prof. Dr. med. F. Güler ohne
sonstige Hilfe durchgeführt und bei der Abfassung der Dissertation keine Anderen als
die dort aufgeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe diese Dissertation bisher an keiner in- oder ausländischen Hochschule zur
Promotion eingereicht. Weiterhin versichere ich, dass ich den beantragten Titel
bisher noch nicht erworben habe.
Hannover, den 10.07.2008
………………………………………………….
(Unterschrift)
68