MBL Oligomer ELISA Kit - Bioporto.com

Diagnostics
MBL Oligomer ELISA Kit
MBL Oligomer
ELISA Kit
KIT 029
IVD
EN
DE
FR
IT
ES
DA
SE
CZ

MBL Oligomer ELISA Kit
Revision: MO2010-07-EN
Please read these instructions carefully
INTENDED USE
For the determination of oligomerized mannanbinding
lectin in human serum or heparin plasma.
CLINICAL SIGNIFICANCE
Determination of susceptibility to infections, and
hence a possible requirement for the aggressive
administration of antibiotics in:
• Patients receiving or about to receive cancer
chemotherapy or immunosuppressive treatment
•
Children with recurrent infections
May also be used as a prognostic marker for disease
severity in rheumatoid arthritis and systemic lupus
erythematosus.
Mannan-binding lectin (MBL; also called mannosebinding
lectin or protein) is a multimeric carbohydrate-binding
protein produced in the liver and
secreted into the blood, where it constitutes an
important element in innate immune defense against
invading microorganisms. Its normally oligomerized
proteases (the MASPs) which are activated when
MBL binds to microbial carbo hydrate surfaces and
in turn activate complement via the MBL or lectin
pathway 1 .
may be associated with increased susceptibility
to infections when the adaptive immune system
is immature (in early childhood) 2 or has been
suppressed (e.g. after organ transplantation or
during cancer chemothera py) 3
associated with a more severe course of autoimmune
diseases such as systemic lupus erythematosus
(SLE) 4 or rheumatoid arthritis 5 , and with a poorer
6 .
in the promoter and/or structural regions of the
MBL gene 7 . Certain promoter alleles are associated
with lower serum concentrations of MBL, while the
structural variants impair both normal oligomerization
of MBL and total chain synthesis. Subjects who
2
are homozygous for a structural defect show very
low levels of oligomerized MBL, while heterozygotes
show low-intermediate levels. In 100 healthy
Danish blood donors, serum MBL concentrations
determined by an oligomer-selective immunoassay
showed low values (

Step 2. Biotinylated monoclonal detection
antibody is added to each test well and incubated.
The detection antibody attaches to bound MBL
oligomers via carbohydrate-binding domains that
are not occupied by being bound down to the
coat. Unbound detection antibody is removed by
washing.
Step 3. HRP-conjugated streptavidin is added
to each test well and allowed to form a complex
with the bound biotinylated antibody. Unbound
conjugate is removed by washing.
Step 4. A chromogenic peroxidase substrate
containing tetramethylbenzidine (TMB) is added to
each test well. The bound HRP-streptavidin reacts
with the substrate to generate a colored product.
The enzymatic reaction is stopped chemically, and
the color intensity is read at 450 nm in an ELISA
reader. The color intensity (optical density) is a
function of the concentration of MBL oligomeric
forms originally added to each well. The results for
the calibrators are used to construct a calibration
curve from which the concentrations of MBL in the
test specimens are read.
S
MBL Oligomer ELISA Kit
Mannan
1 hour
Plates Mannan MBL are precoated with Mannan.
The plates are ready for use
PRINCIPLE OF Mannan THE ASSAY PROCEDURE
Diluted
Plates are
samples
precoated
and
with
calibrators
Mannan.
The plates are ready for use
are Plates added Mannan MBL are Antibody precoated to each well with and Manincu-
1 hour
batednan. MBL The plates are ready for use
Plates are precoated with MBL anti-
Plates are precoated with Manbody.
The plates are ready for use 1 hour
Diluted nan. MBL The samples plates are and ready calibrators for use 1 hour
B
are added Biotinylated to each well MBL and antibody incu- 1 hour
bated Diluted MBL
samples and calibrators
B B
1 hour
Biotinylated are added to each
Diluted samples detection well and
and calibrators antibody incu-
are is
bated Diluted MBL samples and calibrators
added to each well and incubated 1 hour
added B
are added
to
to
each
each
well
well
and
and incuincuba-
Biotinylated MBL antibody
ted
B bated Diluted B samples and calibrators 1 hour
B
are Biotinylated added Biotinylated to detection each MBL well Antibody antibody and incuis
B bated
B added B to each well and incuba- 1 hour 1 hour
Biotinylated detection antibody is add-
Biotinylated ted Biotinylated
ed to Streptavidin detection MBL
each well and incubated - HRP antibody is
B B added 1 hour
B to each well and incuba-
B B
Biotinylated Biotinylated detection MBL antibody is
HRP-conjugated ted
streptavidin is 1 hour
B B added Streptavidin to each well ñ HRP and incuba-
added
Streptavidin
Biotinylated ted
to each
-
detection well
HRP
antibody and incuba- is
B B
1 hour
ted added HRP-conjugated to each well streptavidin and incuba- is added
HRP-conjugated Streptavidin - streptavidin HRP is
to each well and incubated
B Badded
ted to each well and incuba- 1 hour
ted HRP-conjugated Streptavidin - streptavidin HRP is 15 min.
B Badded
S TMB to Substrate each Substrate well and incuba- 1 hour
ted HRP-conjugated Streptavidin - streptavidin HRP is 15 min.
B B
S B Badded
Substrate to is each added well to and each incuba- well. De-
S
S TMB Substrate
S Substrate
HRP-conjugated velop for 15 minutes is added
streptavidin in the to dark each well.
ted
is
S B B
15 min.
Develop added S TMB to each for 15
Substrate well minutes and incuba- in the
S S
S
S
S Substrate is added to each well.
dark
B Bted
Develop Stop for solution 15 minutes in the 15 min.
S
S
S TMB Substrate
S Substrate dark is added to each well.
B BDevelop
Stop Solution for 15 is added minutes to in each the well. 15 min.
S
Read S TMB plate Substrate
within 30 min.
S
S Substrate darkStop
solution is added to each well.
B BDevelop
for 15 minutes in the
S Quantitative Stop solution results are obtained by
S
S Substrate dark measuring is the added absorbances to each of the well.
Stop Solution is added to each wells
Develop S Stop at 450 Stop Solution nmsolution
for 15 is minutes added to in each the
well.
well. dark
Read plate within 30 min.
Read plate within 30 min.
Stop Stop Solution solution is added to each
Quantitative well. Quantitative Read plate results results within are 30 are obtained min. obtained
by Stop by measuring Stop Solution solution the is the added absorbances to each of of
the well. Quantitative the wells Read at at plate 450 results 450 nm within nmare
30 obtained min.
Stop by measuring Solution the is added absorbances to each of
well. Quantitative the wells Read at plate 450 results nm within are 30 obtained min. Total assay
3
Total assay time less time
by measuring the absorbances of than
than
4 hours
4 hour
B B
B B
B
B B
B B
B B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
EN

MBL Oligomer ELISA Kit
KIT COMPONENTS
Note: Liquid reagents contain the preservatives sodium azide,
thimerosal or Bronidox L. These may be harmful if ingested.
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
1. Adjustable micropipettes covering the range
1-1000 µL and corresponding disposable
pipette tips
2. Polypropylene tubes to contain up to 1000 µL
3. Tube racks
4. Adjustable 8- or 12-channel micropipette
(50-250 µL range) or repeating micropipette
(optional).
5. Clean 1 L graduated cylinder
6. Deionized or distilled water
7. Cover for microplate
8. Clean container for diluted Wash Solution
9. Apparatus for filling wells during washing
procedure (optional)
10. Lint-free paper towels or absorbent paper
11. Disposable pipetting reservoirs
12. Timer (60-minute range)
13. Calibrated ELISA plate reader capable of
reading at 450 nm (preferably subtracting
reference values at 650 or 620 nm)
14. Sodium hypochlorite (household bleach 1:10
dilution) for decontamination of specimens,
reagents, and materials
4
Item Contents Quantity
1
12 x 8 coated Microwells
+ Frame
96 wells
2 Sample Diluent 1 x 60 mL
3a - 3h MBL Calibrator 1-8 8 x 1 mL
4 25x Wash Solution Conc. 1 x 30 mL
5 Biotinylated MBL Antibody 1 x 12 mL
6 HRP-Streptavidin 1 x 12 mL
7 TMB Substrate 1 x 12 mL
8 Stop Solution 1 x 16 mL
PRECAUTIONS
For in vitro diagnostic use only
1. This kit should only be used by qualified laboratory
staff.
2. The MBL calibrators were prepared from MBL
purified from human plasma. Each blood
unit used for its preparation was tested by
approved methods and found to be nonreactive
for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and
antibodies against human immunodeficiency
virus (HIV) 1 and 2, and hepatitis C virus (HCV).
In addition, the product was subjected to virus
deactivation procedures. However, as no
test method can offer complete security that
infectious agents are absent, the calibrators
and patients’ specimens should be handled
at Biosafety Level 2 as recommended for any
potentially infectious human serum or blood
specimen in the CDC/NIH manual “Biosafety
In Microbiology and Biomedical Laboratories”,
1999. Solutions containing human serum
should be treated as potentially infectious and
handled accordingly.
3. Use separate pipette tips for each sample,
calibrator and reagent to avoid cross-contamination.
4. Use separate reservoirs for each reagent. This
applies especially to the TMB Substrate.
5. After use, decontaminate all specimens,
reagents and materials by soaking for at least
30 minutes in sodium hypochlorite solution
(household bleach diluted 1:10).
6. To avoid droplet formation during washing,
aspirate the wash solution into a bottle containing
bleach.
7. Avoid release to the environment. Dispose
of containers and unused contents in a safe
way and in accordance with national and local
regulations.
8. Reagents in this kit are preserved with up
to 0.05% sodium azide, 0.038% thimerosal,
also called thiomersal or merthiolate, or 0.2%
Bronidox L. These may be toxic if ingested.
9. The Stop Solution contains 0.5 mol/L sulfuric
acid and can cause irritation or burns to the

skin and eyes. If contact occurs, rinse immediately
with plenty of water and seek medical
advice.
10. Do not interchange components from kits with
different batch numbers. The components have
been standardized as a unit for a given batch.
11. Hemolyzed or hyperlipemic specimens may
give erroneous results.
12. Do not dilute serum or plasma specimens
directly in the microwells.
13. Do not touch or scrape the bottom of the
microwells when pipetting or aspirating fluid.
14. Incubation times and temperatures other than
those specified may give erroneous results.
15. Do not allow the wells to dry once the assay has
begun.
16. The TMB Substrate is light sensitive. Keep
away from bright light.
17. Do not reuse microwells or pour reagents back
into their bottles once dispensed.
STABILITY AND STORAGE
1. Store the kit with all reagents at 2-8°C. Do not
freeze.
2. Use all reagents before the expiry date on the
vial labels.
3. Diluted Wash Solution remains stable for
4 weeks at 2-8°C. If not all wells are to be
used, dilute only the portion of Wash Solution
Concentrate required.
4. For subsequent use, store unused wells in the
foil pouch with the desiccant provided and
reseal. Always allow foil pouch to equilibrate
to room temperature before opening to avoid
condensation in/on the coated microwells.
COLLECTION OF SPECIMENS
Handle and dispose of all blood, serum or plasma
specimens as if they were potentially infectious.
See Precautions, sections 2, 3, 5, 6 and 7.
Determination of MBL in a single specimen requires
5-50 µL of serum or plasma. Blood specimens
should be collected aseptically into a plain or
heparinized tube by qualified staff using approved
venepuncture techni ques. Serum or plasma should
MBL Oligomer ELISA Kit
be prepared by standard techniques for clinical
laboratory testing. Cap the specimens and store
them at 2-8°C for assay within 24 hours. If the
assay cannot be performed within 24 hours or if the
specimen is to be shipped, cap the specimen and
keep it frozen at −20°C or below. Avoid repeated
freezing and thawing. Do not use hemolyzed,
hyperlipemic, heat-treated or contaminated
specimens.
PREPARATION OF REAGENTS AND SAMPLES
1. Bring all specimens and reagents to room
temperature (20-25°C). Mix specimens
thoroughly by gentle inversion and if necessary
clear visible particulate matter by low-speed
centrifugation.
2. Determine the number of specimens to be
tested (in duplicate) plus any internal laboratory
control specimens (in duplicate) plus any
reagent blank wells. The pre-coated wells can
be used as strips of 8 or as individual wells.
Single wells are handled by breaking individual
wells apart and placing each well in the frame
at an appropriate position. Letters and notches
on the wells allow the individual wells to be
identified. Add 16 wells for the 8 calibrators (in
duplicate). Remove the number of microwells
required and replace the remainder in the foil
pouch with desiccant at 2-8°C.
3. Wash Solution: Dilute the 25x Wash Solution
Concentrate by pouring the total contents of
the bottle (30 mL) into a 1-L graduated cylinder
and add distilled or deionized water to a final
volume of 750 mL. Mix thoroughly and store at
2-8°C after use.
4. Sample Diluent: Ready to use, do not dilute
further.
5. MBL Calibrators: Ready to use. The assigned
concentrations are indicated on their labels. Do
not dilute further.
6. Biotinylated MBL Antibody: Ready to use, do
not dilute further.
7. HRP-Streptavidin Conjugate: Ready to use, do
not dilute further.
8. TMB Substrate: Ready to use, do not dilute
5
EN

MBL Oligomer ELISA Kit
further.
9. Stop Solution: Ready to use, do not dilute
further.
10. Patient specimens: Dilute each specimen in
a recorded proportion with Sample Diluent to
obtain at least 250 µL of diluted solution that
can be set up in duplicate wells at 100 µL
per well. An initial screening at a dilution of
1/100 (e.g. 5 µL of serum + 495 µL of Sample
Diluent, mixed by inversion or slow vortexing)
is suggested for most samples, followed by
reassay of out-of-range samples at lower or
higher dilution, as appropriate. Dilutions lower
than 1/10 should not be used.
ASSAY PROCEDURE
1. Prepare the assay protocol, assigning the
appropriate wells for setting up calibrators,
diluted patient specimens and any internal
laboratory controls in duplicate. If a reference
wavelength of 650 or 620 nm is not available on
the ELISA reader, a reagent blank well can be
assigned. This is set up with 100 µL of Sample
Diluent instead of diluted serum or plasma and
processed like the other wells.
2. Pipette 100 μL volumes of each calibrator,
diluted specimens and any internal laboratory
controls into the corresponding positions in the
microwells. Cover the wells and incubate for
60 minutes at room temperature on a shaking
platform set at 200/minute.
3. Aspirate the contents of the microwells and
wash the microwells three times with at least
300 μL of diluted Wash Solution. If washing
is done manually, empty the microwells by
inversion and gentle shaking into a suitable
container, followed by blotting in the inverted
position on a paper towel. A dwell time of 1
minute before emptying is recommended for at
least the last wash of the cycle. The vigor with
which Wash Solution is filled into or emptied
from the wells influences final color development.
Manual pipetting, which may be very
gentle and lead to high color development, is
only recommended in the absence of alterna-
6
tives such as filling the wells by immersion,
using a multi-channel manual washing
dispenser, or using an automatic washing
apparatus.
4. Dispense 100 μL of Biotinylated MBL Antibody
(ready to use) into each microwell. A multichannel
or repeating micropipette can be used.
Cover the wells and incubate for 60 minutes at
room temperature on a shaking platform (200/
minute).
5. Wash as described above in Step 3.
6. Dispense 100 μL of HRP-Streptavidin
Conjugate (ready to use) into each microwell.
A multichannel or repeating micropipette can
be used. Cover the wells and incubate for 60
minutes at room temperature on a shaking
platform (200/minute).
7. Wash as described above in Step 3.
8. Dispense 100 μL of TMB Substrate (ready
to use) into each microwell. The use of a
multichannel micropipette is recommended
to reduce pipetting time. Cover the wells
and incubate for exactly 15 minutes at room
temperature in the dark. Start the clock when
filling the first well.
9. Add 100 µL of Stop Solution (ready to use)
to each well, maintaining the same pipetting
sequence and rate as in Step 7. Mix by gentle
shaking for 20 seconds, avoiding splashing.
Read the wells within 30 minutes.
10. Read the absorbances of the wells at 450 nm
in an appropriate microplate reader (reference
wavelength 650 or 620 nm). If no reference
wavelength is available, the value of the reagent
blank well is subtracted from each of the other
values before other calculations are performed.

SCHEMATIC OVERVIEW
Bring reagents to room temperature (RT)
Incubate
1 h at RT
Incubate
1 h at RT
Incubate
1 h at RT
Incubate
15 min at RT
in the dark
Dilute samples
100 µL Calibrator or diluted sample
Wash x 3
100 µL Biotinylated MBL Antibody
100 µL HRP-Streptavidin
100 µL TMB Substrate
100 µL Stop Solution
Read at 450 nm
Wash x 3
Wash x 3
CALCULATION OF RESULTS
The basic principle is to construct a calibration
curve by plotting the mean of duplicate absorbance
values for each MBL Calibrator on the y-axis against
the corresponding MBL concentrations in ng/mL
MBL Oligomer ELISA Kit
on the x-axis. The calibration curve must meet the
validation requirements. The MBL concentration of
each diluted serum sample is then found by locating
the point on the curve corresponding to the mean of
duplicate absorbance values for the diluted serum
sample and reading its corresponding concentration
in ng/mL from the x axis. The concentration of
MBL in the undiluted serum specimen is calculated
by multiplying this result by the sample dilution
factor.
This procedure can be performed manually
using graph paper with linear x and y scales. A
smooth curve can be drawn through the points or
adjacent points can be joined by straight lines. The
latter procedure may slightly overestimate concentration
values between points when the curve is
slightly convex to left, which is the typical finding.
Although the curve may approxi mate to a straight
line, it is both practically and theore tically incorrect
to calculate and draw the straight line of best fit and
to read the results from this.
The procedure can also be performed by an
ELISA reader software program incorporating curve
fitting procedures. The procedure of choice is to use
linear x and y axes with 4-parameter logistic curve
fitting.
Diluted samples that give a mean absorbance
above that for the 40 ng/mL MBL Calibrator or below
that for the 0.5 ng/mL MBL Calibrator are out of the
range of the assay and their concentrations should
be noted as >40 ng/mL and (40 x dilution factor) ng/mL
and 1.5. The mean absorbance for
any MBL Calibrator should be higher than that for
7
EN

MBL Oligomer ELISA Kit
the previous MBL Calibrator, e.g. absorbance(10 ng/
mL MBL) > absorbance(5 ng/mL). The curve should
be slightly convex to the left when the results are
plotted on linear axes.
Out-of-line points for individual calibrators:
One or more individual calibrators may give
anomalous absorbance readings. One or both of
the duplicate values may be out of line, and the
mean of the duplicates may be out of line. This error
is significant if it impairs satisfactory curve fitting
by the 4-parameter logistic method, which as a
result of the anomalous value, is shifted away from
other calibrator points that are in fact correct. The
calibrator points and fitted curve should always be
examined for correct fit before any calculations of
concentration from it are accepted. A poorly fitting
curve will also be revealed by a high value for the
sum of residual squares. If only one calibrator is
affected, which is not the highest calibrator, two
courses of action are possible:
i) An erroneous singlet or duplicate result
should be eliminated from the curve, and the
remaining results refitted by the 4-parameter
logistic procedure. If a satisfactory fit is obtained,
provisional concentration results can be calculated
from it.
ii) If no satisfactory fit can be obtained in
this way, but the curve is otherwise consistent,
provisional results can be obtained from straight
lines between the means of duplicates, omitting the
erroneous point.
If two or more calibrators are affected, the
assay should be repeated.
A deviant result for an individual calibrator can
be due to operator error or to calibrator deterioration.
If both duplicate values are consistently out of
line in successive assays, the calibrator is faulty and
should be omitted.
TRACEABILITY OF CALIBRATOR VALUE
Assignment of the MBL value was carried out by
ELISA ensuring traceability to in-house standards at
Statens Serum Institut (Denmark).
8
INTERPRETATION OF RESULTS
The full range of MBL concentrations in serum or
plasma from healthy human donors as measured by
this assay and analogous assays is 0 to 7000 ng/
mL. Values below 100 ng/mL may be found in O/O
structural genotypes (where O = B, C or D) regardless
of promoter genotype, or in A/O structural
genotypes (where A = wild-type) in combination
with HY/LX or LX/LY promoter genotypes, or in
the LX/LX promoter genotype. Values between
100 ng/mL and 1000 ng/mL may be found in A/O
structural genotypes or in LX/LY or LX/LX promoter
genotypes. Values above 1000 ng/mL are associated
with wild-type MBL (A/A), although A/D heterozygotes
may occasionally reach this level. The HY/
HY promoter genotype typically shows values
above 1500 ng/mL for wild-type MBL, but such
values are also shown by other promoter genotypes
in the absence of O structural alleles.
Clinical studies have used cutoff values of
50 ng/mL or 100 ng/mL for defining severe MBL
deficiency. Values below these cutoffs may be
associated, in certain individuals, with a history of
increased susceptibility to infections.
QUALITY CONTROL
Laboratories intending to perform repeated assays
should establish their own high-reading (>1000 ng/
mL) and low-reading (

LIMITATIONS
A low concentration of MBL in serum or plasma
does not necessarily imply the existence of any
clinical features.
EXPECTED RESULTS
108 plasma specimens from healthy Danish blood
donors were assayed in the BioPorto Diagnostics
MBL Oligomer ELISA. MBL concentration values
ranged from

MBL Oligomer ELISA Kit
Revision: MO2010-07-EN-DE
Diese Anleitung bitte sorgfältig lesen
VERWENDUNGSZWECK
Zur Bestimmung von oligomerisiertem Mannanbindendem
Lektin in humanem Serum oder heparinisiertem
Plasma.
KLINISCHE BEDEUTUNG
Bestimmung der Infektionsanfälligkeit und daraus
folgend einer möglicherweise notwendigen aggressiven
Verabreichung von Antibiotika an:
• Patienten, die eine Krebschemotherapie oder
immunsuppressive Behandlung erhalten oder
erhalten sollen.
• Patienten mit Mukoviszidose (cystischer Fibrose).
• Kinder mit rekurrierenden Infektionen.
Kann auch als prognostischer Marker für den
Schweregrad der Erkrankung bei rheumatischer
Arthritis und systemischem Lupus erythematodes
eingesetzt werden.
Das Mannan-bindende Lektin (MBL; auch bekannt
als mannosebindendes Lektin oder Protein) ist ein
multimeres kohlenhydratbindendes Protein, das in
der Leber produziert und ins Blut abgegeben wird,
Immunantwort gegen eindringende Mikroorganismen
ist. Seine normal oligomerisierten Formen sind
assoziiert, die durch Bindung von MBL an mikrobi-
ihrerseits über den MBL- oder Lektinweg Komplement
aktivieren 1 .
Mangel an normalem oligomeren MBL kann in
Situationen mit unreifem (in früher Kindheit) 2 oder
unter Krebschemotherapie) 3 adaptivem Immunsystem
mit erhöhter Anfälligkeit gegenüber Infektionen
zusammenhängen. Der Mangel ist ebenfalls mit
einem schwereren Verlauf von Autoimmunerkrankungen
wie systemischem Lupus erythematodes (SLE) 4
oder rheumatoider Arthritis 5 verbunden, sowie mit
einer schlechteren Prognose bei Mukoviszidose 6 .
Allele in der Promotorregion und/oder den struktu-
10
rellen Regionen des MBL-Gens verursacht werden 7 .
Bestimmte Promotorvarianten sind mit niedrigeren
MBL-Serumkonzentrationen assoziiert, während
strukturelle Varianten sowohl die normale Oligomerisierung
als auch die Gesamtkettensynthese von
MBL beeinträchtigen. Individuen mit homozygotem
strukturellem Defekt zeigen sehr niedrige Werte
für oligomerisiertes MBL, während heterozygote
Individuen niedrige bis mittlere Werte aufweisen.
Die Untersuchung der MBL-Serumkonzentration
in 100 gesunden dänischen Blutspendern mit
einem oligomerselektiven Immunoassay ergab für
12 Individuen niedrige Werte (

Vergleich der MBL-Immunreaktivität in einzelnen
Humanserumproben zwischen den Testergebnissen
und Molekülgrößen-Chromatographie lässt
darauf schließen, dass der eingesetzte monoklonale
Antikörper spezifisch für MBL-Oligomere ist, wenn
er sowohl als Capture- als auch als Detektionsantikörper
benutzt wird. Der Test besteht aus vier
Schritten:
Schritt 1. Aliquots der Standards, verdünnten
Serumproben und Kontrollen werden in Mikrotitervertiefungen
inkubiert, die mit monoklonalem
Antikörper gegen MBL vorbeschichtet sind. Das
in den Lösungen vorhandene MBL wird über
seine kohlenhydratbindenden Domänen an die
antikörperbeschichteten Oberflächen der Vertiefungen
binden. Ungebundenes Material wird durch
Waschen entfernt.
Schritt 2. Biotinylierter monoklonaler Detektionsantikörper
wird zu jeder Vertiefung gegeben und
inkubiert. Der Detektionsantikörper bindet über freie
kohlenhydratbindende Domänen, die nicht an die
Beschichtung der Vertiefung gebunden sind, an die
MBL-Oligomere. Ungebundener Detektionsantikörper
wird durch Waschen entfernt.
Schritt 3. HRP-konjugiertes Streptavidin
wird zu jeder Vertiefung hinzugegeben, um mit
dem gebundenen biotinylierten Antikörper einen
Komplex zu bilden. Ungebundenes Material wird
durch Waschen entfernt.
Schritt 4. Ein chromogenes, Tetramethylbenzidin
(TMB) enthaltendes Peroxidasesubstrat
wird zu den Testvertiefungen hinzugegeben. Das
gebundene HRP-Streptavidin reagiert mit dem
Substrat, wodurch ein farbiges Produkt entsteht.
Die enzymatische Reaktion wird chemisch
gestoppt und die Farbintensität bei 450 nm in
einem ELISA-Platten-Lesegerät gemessen. Die
Farbintensität (optische Dichte) wird durch die
Konzentration der ursprünglich in die einzelnen
Vertiefungen gegebenen MBL-Oligomere bestimmt.
Die Ergebnisse der Standards werden zur Erstellung
einer Standardkurve genutzt, von der die
MBL-Konzentrationen in den Testproben abgelesen
werden.
Plates are precoated with Mannan.
MBL Oligomer ELISA Kit
Mannan The plates are ready for use
Plates Mannan
are precoated with Mannan.
Mannan
The plates are ready for use 1 hour
TESTPRINZIP Plates Plates Mannan are precoated with Man-
Mannan MBL are precoated with Man-
Plates nan. Plates nan. The The
are are plates plates
precoated precoated are are ready ready
with with for for
ManMan- use use
Plates nan. Mannan MBL-Antikörper
The are plates precoated are ready with for Man- use 1 hour
Diluted Plates nan. Mannan The are
nan. MBL
samples plates precoated are ready and with for calibrators Man- use
The plates are ready for use
are nan.
Die Plates added The plates
gebrauchsfertigen are precoated to each are ready well for
Platten with and use
Man- sind incu- mit 1 hour
Plates are precoated with Man- 1 hour
bated primärem nan. The MBL-Antikörper plates are ready vorbeschichnan.
Diluted MBL MBL
for use
tet. The samples plates are and ready calibrators for use 1 hour
1 hour
are MBL added MBL to each well and incu- 1 hour
1 hour
Diluted bated Diluted MBL samples and calibrators
MBL
samples and calibrators 1 hour
B
are Diluted
are Diluted added added Biotinylated samples samples to to each each
and and well MBL well
calibrators calibrators and and antibody incuincu- 1 hour
1 hour
bated Verdünnte Diluted MBL samples Proben und and Standards calibrators wer-
are
bated are added to each well and incu- 1 hour
Diluted Badded
MBL samples to each and well calibrators and incudenbated
are added Biotinylated in die Vertiefungen to each MBL well antibody gegeben and incu- und
Biotinylated bated are inkubiert. added to each detection well and antibody incu- is
bated Diluted samples and calibrators 1 hour
bated Diluted B samples and calibrators 1 hour
added B
are Biotinylated added Biotinylated to to each detection each MBL well well antibody and antibody and incuincuba- are Badded
Biotinylated to each MBL well antibody and incuis
1 hour
1 hour
tedB
batedbated added Biotinylated Biotinylierter MBL-Antikörper
MBL antibody 1 hour
BBiotinylated
to each well MBL and antibody incuba-
1 hour
B
Biotinylated ted Biotinylated detection MBL antibody is
Biotinylated detection MBL antibody is
Biotinylierter Biotinylated Detektionsantikörper detection antibody is wird
added Biotinylated
added 1 hour
B to to each each
detection well well and and
antibody incubaincuba- is 1 hour 1 hour
in B added jede Biotinylated Vertiefung MBL gegeben antibody und inku-
added tedted Biotinylated to each detection well and antibody incubais
1 hour
Biotinylated biertBiotinylated
Streptavidin to each detection well MBL - and HRP antibody incubais
added ted added ted Streptavidin
to
to
each
each
well
well - HRP
and
and
incubaincubated
Biotinylated detection antibody is 1 hour
HRP-conjugated ted Biotinylated detection
added Streptavidin HRP-konjugiertes to each well - HRP
streptavidin antibody is is 1 hour
added HRP-conjugated to each well streptavidin and and Streptavidin incubaincubais 1 hour
1 hour
added
Streptavidin
added ted Streptavidin to to each each
-
well well
HRP
- HRP and and incubaincubated Streptavidin - HRP
1 hour
1 hour
ted HRP-konjugiertes HRP-conjugated Streptavidin Streptavidin - streptavidin HRP wird is in
HRP-conjugated ted
jede Streptavidin
added Vertiefung gegeben - streptavidin HRP is
und inkubiert
added HRP-conjugated HRP-conjugated to to each each well well
streptavidin streptavidin and and incubaincuba- is is 1 hour
1 hour
added ted added ted HRP-conjugated Streptavidin to each well - streptavidin HRP and incubais
15 min.
HRP-conjugated Streptavidin to each well - streptavidin HRP and incubais
15 min.
S added ted S
added ted TMB TMB-Substrat to
to
each
each Substrate well
well
and
and
incubaincubated
HRP-conjugated streptavidin is 15 min.
ted HRP-conjugated streptavidin is 15 min.
Substrat S
S added TMB to wird each Substrate in jede well Vertiefung and incubagege- S Substrate S added TMB to each Substrate is added to each well. 15 min.
S
well and incuba- 15 min.
S Substrate ben. S ted Develop TMB Für 15 is
for Substrate Minuten added
15 minutes im to Dunkeln each well.
in the ent-
S
S ted
15 min.
Develop wickeln TMB Substrate
S
S
S Substrate darkTMB
for
Substrate is added 15 minutes to each well. in the 15 min.
S
S
S
S Substrate TMB Substrate is added to each well.
dark
S Develop S S Substrate Stopplösung for is added 15 minutes to each in well. the 15 min.
S
S Substrate Develop for is added 15 minutes to each in well. the
S
15 min.
S
S Develop TMB Substrate
S S Substrate dark S TMB for Substrate is added 15 minutes to each in well. the
S
S Substrate Develop dark for is added 15 minutes to each in well. the
S
Stopplösung Develop darkStop
solution for wird 15 zu minutes den Vertiefungen in the
S Develop dark for 15 minutes in the
S gegeben. Platte innerhalb von 30 min.
S
S Substrate dark is added to each well.
S
S Substrate darkStop
solution
messen. is added to each well.
Develop Stop Stop Solution solution for 15 is minutes added to in each the
S Develop Stop solution for 15 minutes in the
S
dark Durch well. darkStop
Read die solution Messung plate within der Absorption 30 min.
Stop Stop Solution solution is added to each bei
450 Stop Stop nm Solution werden solution quantitative is added to Ergebnisse each
well.
Stop Stop solution
Stop erzielt. Stop well. Quantitative Read
Solution
Read
Solution Solution plate plate
is added
results is is within
added added within
to
are 30 obtained 30
each
to to min.
each each min.
well. Read plate within 30 min.
Stop well. Stop by well. Stop measuring Stop Read Read
Solution
Solution solution solution plate plate the
is
is within within
added
added absorbances 30 30
to
to min. min.
each
each of
Quantitative well. Quantitative the wells Read at plate 450 results nm within are 30 obtained
well. Quantitative Read plate results results
within are are
30 obtained min.
min. obtained
by Stop by Quantitative Stop by Quantitative measuring Solution Solution results results the the
is is the added absorbances added absorbances are are obtained obtained to to each each of of of
the by well. by well. Quantitative the measuring wells
Read Read at
plate plate 450 results the within
nm
Quantitative measuring wells at at 450 results 450 the nm within absorbances nm absorbances
are
are 30 30
obtained
obtained min. min. Total of of assay 11 time less
the by
by the
measuring
measuring wells wells at at 450 450
the
the nm nm
absorbances
absorbances
of
of than 4 hours
Quantitative the wells at 450 results nm are obtained Total assay time less
B B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B
B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
DE

MBL Oligomer ELISA Kit
BESTANDTEILE DES KITS
Einheit Inhalt
12 x 8 beschichtete
Menge
1 Mikrotitervertiefungen +
Rahmen
96 Vertfg.
2 Probenverdünnungsmittel 1 x 60 mL
3a - 3h MBL-Standards 1-8 8 x 1 mL
4
25x Waschlösungskonzentrat
1 x 30 mL
5
Biotinylierter MBL-
Antikörper
1 x 12 mL
6 HRP-Streptavidin 1 x 12 mL
7 TMB-Substrat 1 x 12 mL
8 Stopplösung 1 x 16 mL
Anmerkung: Flüssige Reagenzien enthalten die Konservierungsmittel
Natriumazid, Thimerosal oder Bronidox L. Diese
sind gesundheitsschädlich beim Verschlucken.
ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN
1. Einstellbare Mikropipetten (für einen Bereich
von 1-1000 µL) sowie dazugehörige Einweg-
Pipettenspitzen
2. Polypropylen-Reaktionsgefäße mit einem
zulässigen Füllvolumen von mindestens 1000
µL
3. Reaktionsgefäßhalter
4. Eine einstellbare 8- oder 12-Kanal-Mikropipette
(für einen Bereich von 50-250 µL) oder Multipipette
(optional)
5. Einen sauberen 1-L-Messzylinder
6. Deionisiertes oder destilliertes Wasser
7. Eine Abdeckung für Mikrotiterplatten
8. Einen sauberen Behälter für die verdünnte
Waschlösung
9. Ein Gerät zur Befüllung der Vertiefungen in den
Waschschritten (optional)
10. Flusenfreie Papierhandtücher oder absorbierendes
Papier
11. Einweg-Pipettierreservoirs
12
12. Eine Zeitschaltuhr (für eine Zeitspanne bis 60
Minuten)
13. Ein kalibriertes ELISA-Platten-Lesegerät, das
die Platten bei 450 nm messen kann (vorzugsweise
mit der Möglichkeit, Referenzwerte bei
650 oder 620 nm abziehen zu können)
14. Natriumhypochlorit (Haushaltsbleiche,
1:10-Verdünnung) zur Dekontamination der
Proben, Reagenzien und Materialien
VORSICHTSMASSNAHMEN
Nur für die In-vitro-Diagnostik
1. Dieser Kit sollte nur von qualifiziertem
Laborpersonal benutzt werden.
2. Die MBL-Standards wurden mit MBL aus
gereinigtem Humanplasma hergestellt. Alle zur
Präparation verwendeten Bluteinheiten wurden
mit anerkannten Methoden getestet und waren
negativ für das Hepatitis B-Oberflächenantigen
(HBsAg), Antikörper gegen das humane
Immunschwächevirus (HIV) 1 und 2, sowie das
Hepatitis C-Virus (HCV). Zusätzlich durchlief
das Produkt Verfahren zur Virusinaktivierung.
Da jedoch keine Testmethode die Abwesenheit
von Infektionserregern garantieren kann, sollten
die Standards und Patientenproben unter den
Bedingungen der Biologischen Sicherheitsstufe
2 gehandhabt werden, so wie in dem CDC/
NIH-Handbuch „Biosafety In Microbiology and
Biomedical Laboratories“ (1999) für alle potenziell
infektiösen humanen Seren oder Blutproben
empfohlen. Lösungen, die Humanserum
enthalten, sollten als potenziell infektiös
betrachtet und entsprechend behandelt werden.
3. Zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen für
jede Probe, jeden Standard und jedes Reagenz
gesonderte Pipettenspitzen benutzen.
4. Für jedes Reagenz gesonderte Reservoirs
benutzen. Dies gilt im Besonderen für das
TMB-Substrat.
5. Alle Proben, Reagenzien und Materialien nach
Gebrauch durch mindestens 30-minütiges
Einweichen in Natriumhypochloritlösung
(Haushaltsbleiche, 1:10 verdünnt) dekontaminieren.

6. Um Tröpfchenbildung während der Waschprozedur
zu vermeiden, sollte die Waschlösung in
eine Bleiche enthaltende Flasche abgesaugt
werden.
7. Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Behälter
und unbenutzte Bestandteile müssen unter
Beachtung der nationalen und örtlichen
Vorschriften sicher entsorgt werden.
8. Die Reagenzien in diesem Kit sind mit bis zu
0,05% Natriumazid, 0,038% Thimerosal, auch
bekannt als Thiomersal oder Merthiolat, oder
0,2% Bronidox L konserviert. Diese sind giftig
beim Verschlucken.
9. Die Stopplösung enthält 0,5 mol/L Schwefelsäure
und kann Reizungen oder Verätzungen
der Haut und Augen verursachen. Bei
Berührung sofort mit viel Wasser spülen und
ärztlichen Rat einholen.
10. Komponenten von Kits mit unterschiedlichen
Chargennummern nicht vertauschen. Die
Komponenten wurden als Einheit für eine
bestimmte Charge standardisiert.
11. Hämolysierte oder hyperlipämische Proben
können zu fehlerhaften Ergebnissen führen.
12. Verdünnungen der Serum- order Plasmaproben
nicht direkt in den Mikrotitervertiefungen
durchführen.
13. Beim Pipettieren oder Absaugen von Flüssigkeit
die Berührung oder das Kratzen am Boden
der Mikrotitervertiefungen vermeiden.
14. Die Verwendung anderer als der angegebenen
Inkubationszeiten und –temperaturen kann zu
fehlerhaften Ergebnissen führen.
15. Während des Versuchs dürfen die Vertiefungen
nicht austrocknen.
16. Das TMB-Substrat ist lichtempfindlich. Vor
Licht geschützt aufbewahren.
17. Benutzte Mikrotitervertiefungen und Reagenzien
nicht wieder verwenden oder in ihre
Flaschen zurückschütten.
STABILITÄT UND LAGERUNG
1. Kit mit allen Reagenzien bei 2-8°C lagern. Nicht
einfrieren.
2. Alle Reagenzien sind vor den auf den Fläsch-
MBL Oligomer ELISA Kit
chenetiketten angegebenen Verfallsdaten zu
verwenden.
3. Die verdünnte Waschlösung ist bei 2-8°C für 4
Wochen haltbar. Falls nicht alle Vertiefungen
benutzt werden, nur den benötigten Anteil des
Waschlösungskonzentrats verdünnen.
4. Nicht eingesetzte Vertiefungen können für
späteren Gebrauch zusammen mit dem
Antikondensationsmittel in dem mitgelieferten
Folienbeutel versiegelt und gelagert
werden. Folienbeutel vor dem Öffnen stets auf
Raumtemperatur bringen, um eine Kondensation
in/auf den beschichteten Mikrotitervertiefungen
zu vermeiden.
PROBENENTNAHME
Alle Blut-, Serum- oder Plasmaproben sind als
potenziell infektiöses Material zu behandeln
und zu entsorgen. Siehe Vorsichtsmaßnahmen,
Abschnitte 2, 3, 5, 6 und 7.
Die Bestimmung von MBL in einer einzelnen Probe
erfordert 5-50 µL Serum oder Plasma. Blutproben
sollten von qualifiziertem Personal mittels einer
anerkannten Venenpunktionstechnik aseptisch
in einem einfachen oder heparinisierten Gefäß
gesammelt werden. Serum oder Plasma sollte mit
klinischen Standardlabormethoden hergestellt
werden. Proben verschließen und bis zur Analyse
innerhalb von 24 Stunden bei 2-8°C lagern. Falls der
Test nicht innerhalb von 24 Stunden durchgeführt
werden kann oder falls die Probe verschickt werden
soll, kann die verschlossene Probe bei -20°C oder
darunter gelagert werden. Wiederholtes Auftauen
und Einfrieren ist zu vermeiden. Keine hämolysierten,
hyperlipämischen, hitzebehandelten oder
kontaminierten Proben verwenden.
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
UND PROBEN
1. Alle Proben und Reagenzien auf Raumtemperatur
(20-25°C) bringen. Die Proben durch
vorsichtiges Schütteln gründlich mischen. Falls
notwendig, sichtbare Teilchen durch Zentrifugation
bei niedriger Geschwindigkeit entfernen.
2. Anzahl der zu testenden Proben (im Duplikat)
13
DE

MBL Oligomer ELISA Kit
plus Anzahl der internen Laborkontrollproben
(im Duplikat) plus Anzahl der Leerwerte
bestimmen. Die vorbeschichteten Vertiefungen
können einzeln oder als 8er-Streifen verwendet
werden. Nach dem Abbrechen einzelner
Vertiefungen werden diese jeweils an einer
passenden Position im Rahmen platziert.
Individuelle Vertiefungen können anhand von
Buchstaben und Einkerbungen auf den Vertiefungen
identifiziert werden. 16 Vertiefungen
für die 8 Standards (im Duplikat) hinzufügen.
Die benötigte Anzahl der Mikrotiterstreifen
abtrennen und den Rest zusammen mit dem
Antikondensationsmittel im Folienbeutel bei
2-8°C lagern.
3. Waschlösung: Den gesamten Inhalt des 25x
Waschlösungskonzentrats (30 mL) in einen
1-L-Messzylinder geben und mit destilliertem
oder deionisiertem Wasser auf ein Endvolumen
von 750 mL auffüllen. Gründlich mischen und
nach gebrauch bei 2-8°C lagern.
4. Probenverdünnungsmittel: Gebrauchsfertig,
nicht weiter verdünnen.
5. MBL-Standards: Gebrauchsfertig. Die
entsprechenden Konzentrationen sind auf den
Etiketten angegeben. Nicht weiter verdünnen.
6. Biotinylierter MBL-Antikörper: Gebrauchsfertig,
nicht weiter verdünnen.
7. HRP-Streptavidin: Gebrauchsfertig, nicht
weiter verdünnen.
8. TMB-Substrat: Gebrauchsfertig, nicht weiter
verdünnen.
9. Stopplösung: Gebrauchsfertig, nicht weiter
verdünnen.
10. Patientenproben: Jede Probe in einem
notierten Verhältnis mit dem Probenverdünnungsmittel
bis auf ein Volumen von mindestens
250 µL verdünnte Lösung verdünnen,
so dass Doppelbestimmungen mit 100 µL
pro Vertiefung möglich sind. Für die meisten
Proben wird empfohlen, einen Vorversuch mit
einer Verdünnung von 1/100 (z. B. 5 µL Serum
+ 495 µL Probenverdünnungsmittel, durch
Inversion oder langsames Vortexen gemischt)
durchzuführen, gefolgt von einem erneuten
14
Test für Proben außerhalb des Messbereichs
bei entsprechend niedrigerer oder höherer
Verdünnung. Niedrigere Verdünnungen als 1/10
sollten nicht verwendet werden.
TESTDURCHFÜHRUNG
1. Testprotokoll erstellen und dabei die Standards,
verdünnten Patientenproben und internen
Laborkontrollen den entsprechenden Vertiefungen
(im Duplikat) zuweisen. Falls das ELISA-
Platten-Lesegerät keine Referenz-Wellenlänge
bei 650 oder 620 nm zulässt, kann einer
Vertiefung ein Reagenzleerwert zugewiesen
werden. Hierfür wird eine Vertiefung mit 100 µL
des Probenverdünnungsmittels anstelle von
verdünntem Serum oder Plasma befüllt und in
gleicher Weise behandelt wie die anderen Vertiefungen.
2. 100 μL-Volumina der Standards, verdünnten
Proben und internen Laborkontrollen in die
entsprechenden Vertiefungen pipettieren.
Vertiefungen abdecken und 60 Minuten bei
Raumtemperatur auf einem Schüttler bei 200
U/min inkubieren.
3. Inhalt der Mikrotitervertiefungen absaugen
und die Vertiefungen dreimal mit mindestens
300 μL der verdünnten Waschlösung waschen.
Falls der Waschvorgang von Hand durchgeführt
wird, die Mikrotitervertiefungen durch
Umdrehen und vorsichtiges Schütteln über
einem passenden Behälter leeren, gefolgt von
Ausklopfen in der umgedrehten Position auf
einem Papierhandtuch. Eine Verweilzeit von 1
Minute vor dem Leeren wird mindestens beim
letzten Waschgang empfohlen. Die Heftigkeit,
mit der die Waschlösung in die Vertiefungen
gefüllt oder aus diesen geleert wird, beeinflusst
die Farbentwicklung am Ende. Pipettieren von
Hand, welches sehr behutsam sein und zu
hoher Farbentwicklung führen kann, wird nur
in der Abwesenheit von Alternativen wie z. B.
Füllung der Vertiefungen durch Eintauchen,
Anwendung eines manuellen Mehrkanal-
Waschlösungsspenders oder Nutzung eines
automatischen Waschapparats empfohlen.

4. 100 μL des gebrauchsfertigen biotinylierten
MBL-Antikörpers pro Mikrotitervertiefung
verteilen. Hierzu kann eine Mehrkanal- oder
Multipipette benutzt werden. Vertiefungen
abdecken und 60 Minuten bei Raumtemperatur
auf einem Schüttler (200 U/min) inkubieren.
5. Waschen wie in Schritt 3 beschrieben.
6. 100 μL des gebrauchsfertigen HRP-Streptavidinkonjugats
pro Mikrotitervertiefung verteilen.
Hierzu kann eine Mehrkanal- oder Multipipette
benutzt werden. Vertiefungen abdecken und
60 Minuten bei Raumtemperatur auf einem
Schüttler (200 U/min) inkubieren.
7. Waschen wie in Schritt 3 beschrieben.
8. 100 μL des gebrauchsfertigen TMB-Substrats
pro Mikrotitervertiefung verteilen. Die
Anwendung einer Mehrkanal-Pipette wird
empfohlen, um die Pipettierzeit zu reduzieren.
Vertiefungen abdecken und genau 15 Minuten
bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
Uhr starten, wenn die erste Vertiefung gefüllt
wird.
9. 100 µL der gebrauchsfertigen Stopplösung pro
Vertiefung zugeben, unter Beibehaltung der
gleichen Pipettierreihenfolge und -geschwindigkeit
wie in Schritt 7. 20 Sekunden lang durch
vorsichtiges Schütteln unter Vermeidung von
Spritzern mischen. Vertiefungen innerhalb von
30 Minuten analysieren.
10. Extinktion der Vertiefungen bei 450 nm in
einem geeigneten Mikrotiterplatten-Lesegerät
messen (Referenz-Wellenlänge 650 oder
620 nm). Falls keine Referenz-Wellenlänge
verfügbar ist, den Wert der Reagenzleerwert-
Vertiefung von allen anderen Werten abziehen,
bevor weitere Berechnungen durchgeführt
werden.
SCHEMATISCHE ÜBERSICHT
MBL Oligomer ELISA Kit
100 μL Standards oder verdünnte Probe
1 h bei RT
inkubieren
1 h bei RT
inkubieren
1 h bei RT
inkubieren
3 x Waschen
100 μL Biotinylierter MBL-Antikörper
3 x Waschen
100 μL HRP-konjugiertes Streptavidin
15 min bei RT
im Dunkeln
inkubieren
Reagenzien auf RT bringen
Proben verdünnen
100 μL TMB-Substrat
100 μL Stopplösung
Messung bei 450 nm
3 x Waschen
AUSWERTUNG
Als Grundlage für die Auswertung dient die
Erstellung einer Standardkurve, bei der die Extinktionsmittelwerte
für jeden der doppelt bestimmten
MBL-Standards auf der y-Achse gegen die
15
DE

MBL Oligomer ELISA Kit
entsprechende MBL-Konzentration des jeweiligen
Standards (in ng/mL) auf der x-Achse aufgetragen
werden. Die Standardkurve muss mit den Validierungsanforderungen
übereinstimmen. Zur Ermittlung
der MBL-Konzentration einer verdünnten Probe
wird demjenigen Punkt der Kurve, der dem Extinktionsmittelwert
der doppelt bestimmten Probe auf
der y-Achse entspricht, die dazugehörige Konzentration
auf der x-Achse (in ng/mL) zugeordnet. Die
MBL-Konzentration der unverdünnten Probe erhält
man durch die Multiplikation dieses Resultats mit
dem Probenverdünnungsfaktor.
Dieses Verfahren kann unter Verwendung von
Millimeter-Papier mit linearen x- und y-Achsen von
Hand durchgeführt werden. Es kann entweder eine
stetige Kurve durch die Punkte gezeichnet oder
angrenzende Punkte können durch gerade Linien
verbunden werden. Durch letztere Vorgehensweise
könnten Konzentrationswerte zwischen
den Punkten leicht überbewertet werden, falls die
Kurve leicht konvex nach links verläuft, was häufig
vorkommt. Auch wenn die Kurve ungefähr einer
geraden Linie entspricht, ist es sowohl praktisch
als auch theoretisch inkorrekt, eine Ausgleichsgerade
zu zeichnen und von dieser die Ergebnisse
abzulesen.
Die Analyse kann ebenso mit einem
ELISA-Platten-Lesegerät-Softwareprogramm
durchgeführt werden, sofern es mit Kurvenanpassungsmethoden
ausgestattet ist. Die Methode
der Wahl ist die Kurvenanpassung mit Hilfe eines
Vier-Parameter-Modells (4-parameter logistic curve
fitting) mit linearen x- und y-Achsen.
Verdünnte Proben, deren durchschnittliche
Extinktionswerte oberhalb dem des 40 ng/mL
MBL-Standards oder unterhalb dem des 0,5 ng/
mL MBL-Standards liegen, sind außerhalb des
Messbereichs des Tests, und ihre Konzentrationen
sollten als >40 ng/mL beziehungsweise (40 x Verdünnungsfaktor) ng/mL beziehungsweise
1,5 sein. Die mittlere Extinktion eines
MBL-Standards sollte größer sein als diejenige des
vorherigen MBL-Standards, beispielsweise Extinktion
(10 ng/mL MBL) > Extinktion (5 ng/mL). Nach
Auftragen der Ergebnisse auf linearen Achsen sollte
die Kurve links leicht konvex verlaufen.
Aus dem Rahmen fallende Punkte für einzelne
Standards: Für einen oder mehrere individuelle
MBL-Standards können abweichende Extinktionswerte
auftreten. Es kann vorkommen, dass einer
oder beide der Doppelwerte aus dem Rahmen fallen
oder dass der Mittelwert der Duplikate aus dem
Rahmen fällt. Dieser Fehler ist signifikant, wenn er
die zufrieden stellende Kurvenanpassung mittels
des Vier-Parameter-Modells beeinträchtigt, wobei
die Kurve sich aufgrund des abweichenden Wertes
von anderen Standardpunkten entfernt, obwohl
diese eigentlich korrekt sind. Die angemessene
Übereinstimmung zwischen den Standardpunkten
und der angepassten Kurve sollte immer überprüft
werden, bevor hieraus berechnete Konzentrationen
akzeptiert werden. Eine schlecht angepasste
Kurve kommt auch durch eine große Summe der
Abweichungsquadrate zum Ausdruck. Falls nur
ein Standard betroffen ist, und es sich dabei nicht
um den höchsten Standard handelt, sind zwei
Vorgehensweisen möglich:
i) Ein einzelner fehlerhafter Wert oder fehlerhaftes
Resultat einer Doppelbestimmung sollte von der
Kurve ausgeschlossen und für die übrigen Resultate
mit dem Vier-Parameter-Modell eine neue Kurve
erstellt werden. Wenn eine zufrieden stellende Kurve
ermittelt wurde, können mit ihrer Hilfe vorläufige
Konzentrationsbestimmungen vorgenommen werden.
ii) Falls auf diese Weise keine zufrieden

stellende Anpassung erzielt werden kann, die Kurve
ansonsten jedoch konsistent ist, können vorläufige
Resultate anhand gerader Linien zwischen den
Mittelwerten der Duplikate, unter Ausschluss des
fehlerhaften Punktes, bestimmt werden.
Wenn zwei oder mehr Standards betroffen
sind, sollte der Test wiederholt werden.
Ein abweichendes Ergebnis für einen einzelnen
Standard kann durch Anwenderfehler oder durch
einen verdorbenen Standard verursacht werden.
Wenn beide Doppelwerte in aufeinander folgenden
Tests durchweg aus dem Rahmen fallen, ist der
Standard fehlerhaft und sollte verworfen werden.
RÜCKVERFOLGBARKEIT
DER STANDARDWERTE
Der MBL-Wert wurde durch einen ELISA bestimmt,
mit dem die Rückverfolgbarkeit zu hausinternen
MBL-Standards am Statens Serum Institut
(Dänemark) gewährleistet ist.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Die Spannbreite von MBL-Konzentrationen im
Serum oder Plasma von gesunden humanen
Spendern wurde mit diesem Test und analogen
Tests als 0 bis 7000 ng/mL bestimmt. Werte
unterhalb von 100 ng/mL können in strukturellen
O/O-Genotypen (wobei O = B, C oder D) ungeachtet
des Promotor-Genotyps oder in strukturellen
A/O-Genotypen (wobei A = Wildtyp) in Verbindung
mit HY/LX- oder LX/LY-Promotor-Genotypen oder
in LX/LX-Promotor-Genotypen gefunden werden.
Werte zwischen 100 ng/mL and 1000 ng/mL können
in strukturellen A/O-Genotypen oder in LX/LY- oder
LX/LX-Promotor-Genotypen gefunden werden.
Werte über 1000 ng/mL sind assoziiert mit Wildtyp-
MBL (A/A), wenngleich heterozygote Individuen für
A/D ebenfalls gelegentlich dieses Niveau erreichen.
Der HY/HY-Promotor-Genotyp zeigt typischerweise
Werte über 1500 ng/mL für Wildtyp-MBL, aber
solche Werte werden auch von anderen Promotor-
Genotypen in der Abwesenheit von O-Struktur-
Allelen erreicht.
In klinischen Studien wurden Grenzwerte
von 50 ng/mL oder 100 ng/mL als Definition einer
MBL Oligomer ELISA Kit
schweren MBL-Defizienz benutzt. Werte unterhalb
dieser Grenzen können in bestimmten Individuen
mit einer Geschichte einer erhöhten Anfälligkeit
gegenüber Infektionen assoziiert sein.
QUALITÄTSKONTROLLE
Laboratorien, die häufiger Tests durchführen wollen,
sollten ihre eigenen hoch (>1000 ng/mL) und niedrig
(

MBL Oligomer ELISA Kit
abweichung (SD) von 1325 ng/mL. 18 Proben (16,7%)
erzielten Messergebnisse unter 100 ng/mL, 30
Proben (27,8%) zeigten Messergebnisse zwischen
100 ng/mL und 1000 ng/mL, und 60 Proben (55,5%)
erzielten Messwerte über 1000 ng/mL.
TESTEIGENSCHAFTEN
Nachweisgrenze: Die niedrigste MBL-Konzentration,
die einen Extinktionswert größer als 2 SD
über dem mittleren Extinktionswert des Nullstandards
(n = 8) ergab, war 0,02 ng/mL, welches einer
Serumkonzentration von 2 ng/mL in einer Probe
entspricht, die 1/100 verdünnt wurde.
Intra-Test (innerhalb des Versuchs)-Reproduzierbarkeit:
Zur Ermittlung der Reproduzierbarkeit
innerhalb desselben Versuchs wurden zwei Seren in
10-facher Parallelbestimmung getestet. Dies ergab
Durchschnittliche
MBL-Konz.
Inter-Test (zwischen verschiedenen Versuchen)-
Reproduzierbarkeit (unterschiedliche Tage/
Anwender): Zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit
zwischen verschiedenen Versuchen wurden die
gleichen zwei Seren im Duplikat in vier verschiedenen
Tests durch zwei Anwender an verschiedenen
Tagen untersucht. Dies ergab die folgenden
Resultate:
18
Serum 1 Serum 2
2279 ng/mL 28,4 ng/mL
SD 81,2 1,07
VK 3,6% 3,8%
Durchschnittliche
MBL-Konz.
Serum 1 Serum 2
2310 ng/mL 29,7 ng/mL
SD 212 1,28
VK 9,2% 4,3%
Spezifität: In Western-Blot-Untersuchungen von
Plasma oder Plasmafraktionen wurden keine anderen
mit dem Antikörper reagierenden Banden als den
MBL zuschreibbaren gefunden. Die Abwesenheit
von Kreuzreaktionen mit anderen Plasmabestandteilen
wird durch die Tatsache unterstützt, dass
aber normalen Spendern von Null ununterscheidbare
Ergebnisse ergaben.
HAFTUNG
Zur In-vitro-Diagnose in ausgewählten Ländern. Für
Erhältlichkeit in Ihrem Land siehe www.bioporto.
com.
Dieser Kit ist einzig zur In-vitro-Bestimmung
von Mannan-bindendem Lektin in humanem Serum
oder Plasma vorgesehen.
-
ziertes Personal vorgesehen, welches Forschungs-
oder Diagnosetätigkeiten ausführt.
Falls der Empfänger dieses Kits diesen in
irgendeiner Weise an Dritte weitergibt, muss diese
Anleitung beigefügt sein, und der Drittempfänger
stellt BioPorto Diagnostics A/S auf eigenes Risiko
von allen Haftungsansprüchen frei.
BioPorto Diagnostics A/S kann in keiner Weise
für jedwede Schäden oder Verluste aufgrund einer
anderen Nutzung dieses Kits als ausdrücklich
in dieser Anleitung angegeben verantwortlich
gemacht werden.
Die Haftung von BioPorto Diagnostics A/S
übersteigt unter keinen Umständen den kommerziellen
Wert des Kits.
BioPorto Diagnostics A/S ist unter keinen
Umständen für indirekte, konkrete oder Folgeschäden,
insbesondere für entgangenen Gewinn, verantwortlich
zu machen.

MBL Oligomer ELISA Kit
19
DE

MBL Oligomer ELISA Kit
Révision: MO2010-07-EN-FR
Veuillez lire les instructions attentivement
UTILISATION
Pour le dosage in vitro d’oligomère de la lectine
plasma hépariné.
PERTINENCE CLINIQUE
Détermination de la susceptibilité aux infections et
donc de la nécessité d’une administration agressive
d’antibiotiques chez:
• Les
patients
recevant
ou
qui
vont
recevoir
de
la
chimiothérapie pour le traitement du cancer ou
sous un traitement avec des immunosuppresseurs
• Les patients atteints de mucoviscidose
• Les enfants avec des infections récurrentes.
Ce dosage peut aussi être utilisé comme un
marqueur pronostique de sévérité de l’arthrite
rhumatoïde et du lupus érythémateux disséminé.
par le foie et sécrétée dans le sang où elle constitue
un élément important dans la réponse immunitaire
innée contre les microorganismes envahissants.
Ses formes normales oligomérisées sont associées
-
ments glucidiques des surfaces microbiennes et
qui activent, à leur tour, le complément via la voie
lectine ou la MBL 1 .
-
sée peut être associée à une susceptibilité accrue
aux infections quand le système immunitaire acquis
est immature (pendant la petite enfance 2 ou quand
celui-ci a été supprimé (ex. après une transplantation
d’organe ou pendant un traitement contre le
cancer avec de la chimiothérapie) 3
aussi associée à des maladies auto-immunes plus
graves comme le lupus érythémateux systémique
(LES 4 ou l’arthrite rhumatoïde 5 et à un plus mauvais
pronostic pour la mucoviscidose 6 .
20
variants allèliques au niveau du promoteur et/ou des
régions structurales du gène MBL 7 . Certains allèles
du promoteur sont associés à des concentrations
sériques de MBL plus faibles tandis que les variants
structuraux affectent à la fois l’oligomérisation
normale de la MBL et tout le processus de synthèse
des chaînes. Les sujets qui sont homozygotes
pour une anomalie structurale ont des taux de
MBL oligomérisée très faibles alors que les hétérozygotes
ont des taux bas-intermédiaires. Chez 100
donneurs de sang danois sains, les concentrations
de la MBL sérique déterminées par un immunoessai
oligomère-sélectif sont basses (

de la MBL dans des échantillons individuels de
sérums humains suggère que l’anticorps monoclonal
utilisé est spécifique aux oligomères MBL quand
il est utilisé à la fois comme anticorps de détection
et de capture. Cet essai est une procédure en quatre
étapes:
Étape 1. Les aliquotes des étalons, les
échantillons de sérum dilués et les contrôles sont
incubés dans des micropuits recouverts avec un
anticorps monoclonal anti-MBL. La MBL présente
dans les solutions va se lier aux micropuits
recouverts d’anticorps via son domaine de fixation
aux glucides. Les éléments non fixés sont éliminés
par lavage.
Étape 2: L’anticorps de détection monoclonal
biotinylé est ajouté à chaque puits et mis à incuber.
L’anticorps de détection se lie aux oligomères
MBL liés au niveau de leurs domaines de fixation
glucidiques qui ne sont pas occupés par la fixation
aux anticorps de revêtement des puits. Les
anticorps de détection non fixés sont éliminés par
lavage.
Etape 3: La streptavidine-HRP conjuguée est
ajoutée dans chaque puits pour former un complexe
avec l’anticorps biotinylé fixé. Les conjugués non
fixés sont éliminés par lavage.
Etape 4: Un substrat chromogénique de la
peroxydase contenant du tétraméthylbenzidine
(TMB) est ajouté à chaque puits. La streptavidine-
HRP liée réagit avec le substrat pour donner un
produit coloré. La réaction enzymatique est stoppée
chimiquement et l’intensité de la coloration est lue
à 450 nm dans un lecteur ELISA. L’intensité de la
coloration (la densité optique) est proportionnelle à
la concentration d’oligomères de MBL ajoutée initialement
dans chaque puits. Les résultats des étalons
sont utilisés pour tracer une courbe de calibration
à partir de laquelle les concentrations de MBL
présentes dans les échantillons testés sont lues.
Plates are precoated with Mannan.
MBL Oligomer ELISA Kit
Mannan The plates are ready for use
Plates Mannan
are precoated with Mannan.
The plates are ready for use 1 hour
PRINCIPE Plates Plates Mannan
DE LA MBL
Mannan
PROCÉDURE are are precoated precoated
DU with with
DOSAGE ManMannan.nan. Mannan The Mannan The plates plates are are ready ready for for use use
Plates Mannan are precoated with Man-
Anticorps MBL
1 hour
Diluted
Plates Mannan are
Plates nan. MBL The are samples
precoated
plates precoated are ready and
with
with calibrators
Man-
Plates nan. The are plates precoated are ready with for for
ManMan-
use use
are Les Plates nan. added plaques The are plates precoated sont to each are recouvertes ready well with for and avec Man- useincu
1 hour
Plates nan. The are plates precoated are ready with for Man- use 1 hour
bated l’anticorps nan. The plates MBL primaire. are ready Les for use plaques
nan. Diluted MBL MBL
sont prêtes The samples plates à l’emploi. are and ready calibrators for use
are added to each well and incu- 1 hour
1 hour
Diluted bated Diluted MBL MBL
samples samples and and calibrators calibrators 1 hour
1 hour 1 hour
B
are are added MBL added Biotinylated MBL
to to each each well MBL well and and antibody incuincu- 1 hour
1 hour
bated Diluted bated Diluted MBL samples and calibrators
BMBL
samples and calibrators 1 hour
Les are Diluted added échantillons Biotinylated samples to each dilués MBL and well et calibrators antibody and les incu- étalons
Biotinylated are Diluted added samples to each
sont bated are ajoutés à chaque puits et mis à
Diluted added samples to detection and well calibrators and
each and well calibrators and antibody incuincu-
is
bated are 1 hour
Diluted B incuber added samples to each and well calibrators and incu- 1 hour
added B bated are Biotinylated added Biotinylated to to each detection each MBL well well antibody and antibody and incuincubabated are added Biotinylated to each MBL well antibody and incuis
tedbated 1 hour
bated added B to each well and incuba- 1 hour
B
Biotinylated ted Biotinylated Biotinylated Anti-MBL biotinylé MBL antibody 1 hour
BBiotinylated
detection detection MBL antibody antibody is is
1 hour
B
added added Biotinylated MBL antibody 1 hour
BBiotinylated
to to each each well well MBL and and antibody incubaincuba- 1 hour 1 hour
L’anticorps Biotinylated B Biotinylated de detection détection MBL antibody biotinylé is est
ted Biotinylated ted
ajouté Biotinylated Streptavidin detection
added à chaque puits MBL - et HRP antibody
mis antibody is 1 hour
à incuber
added Biotinylated
Biotinylated Streptavidin to to each each
detection
detection well well - HRP and and
antibody
antibody incubaincuba- is
is
added ted Biotinylated to each detection well and antibody incubais
1 hour
HRP-conjugated added ted Biotinylated to each detection well
added ted Streptavidin Streptavidine to each well - HRP
streptavidin and antibody incubais
is 1 hour
added ted HRP-conjugated streptavidin and incubais
added
Streptavidin to
added ted to to each
each each well -
well well
HRP and
and and incubaincubaincuba1
hour
ted
1 hour
ted La HRP-conjugated streptavidine Streptavidin HRP-conjuguée - streptavidin HRP is est
HRP-conjugated ted Streptavidin - streptavidin HRP is 1 hour
1 hour
ajoutée added Streptavidin à to chaque each puits well - HRP et and mise incuba- à incuber
added Streptavidin to each well - HRP and incuba- 1 hour
1 hour
ted HRP-conjugated ted HRP-conjugated Streptavidin - streptavidin HRP is
Streptavidin - streptavidin HRP is 15 min. 15 min.
added HRP-conjugated S
added S HRP-conjugated TMB Substrat to to each each Substrate
TMB well well
streptavidin
streptavidin and and incubaincuba- is
is
added ted added ted HRP-conjugated to each well streptavidin and incubais
15 min.
HRP-conjugated to each well streptavidin and incubais
15 min.
Le S
S added tedsubstrat
TMB to each Substrate est ajouté well and à chaque incuba- puits.
S Substrate S added ted TMB to each Substrate is added to each well.
S
well and incuba-
S Substrate Développer is
ted Develop for pendant added
15 minutes 15 to minutes each
in the dans well.
15 min.
S ted
15 min.
Develop le Snoir
S TMB Substrate
S Substrate dark for is added 15 minutes to each well. in the
S
S
15 min.
S TMB Substrate
S Substrate is added to each well. 15 min.
dark S Develop TMB Solution for Substrate 15 S
S Develop TMB for Substrate 15 d’arrêt minutes minutes in in the the 15 min.
S
15 min.
S
S
S Substrate darkTMB
Substrate is added to each well.
S
S
S Substrate darkTMB
Substrate is added to each well.
S
S S La Develop Substrate solution Stop solution for d’Arrêt is added 15 est minutes to ajoutée each in à well. chaque the
S
S Substrate Develop for is added 15 minutes to each in well. the
S
puits. Lire la plaque dans les 30 minu-
S Develop S S Substrate dark for is added 15 minutes to each in well. the
S
S S Substrate Develop darkStop
for solution
tes. is added 15 minutes to each in well. the
Develop Stop darkStop
Solution solution for 15 is minutes added to in each the
S Develop darkStop
solution for 15 minutes in the
S
dark Des well. darkrésultats
Read plate quantitatifs within 30 sont min.
Stop obtenus
en Stop mesurant Stop Solution
Solution solution is added to each
Stop solution l’absorbance is added to des each puits à
well.
Stop
450 well. Quantitative Stop Stop Read
Solution
nmRead
solution solution plate plate
is added
results within within
to
are 30 obtained 30
each
min. min.
well. Read plate within 30 min.
Stop Stop by measuring Stop Solution solution the is added absorbances to each
Stop Solution solution is added to each of
Quantitative Stop well. Quantitative
Stop well. Quantitative the wells Read Read
Solution
Solution at plate plate 450 results results is
is within nm within
added
added
are are 30 are 30
obtained obtained to
to min. min. obtained each
each
by Stop by well. measuring Read Solution plate the is within added absorbances 30 to min.
Stop by well. measuring Read Solution plate the is the within added absorbances 30 to min. each each of of of
the well. Quantitative the wells Read at plate 450 results nm within are 30 obtained
well. Quantitative wells Read at at plate 450 results 450 nm within nmare
30 obtained min. min. Total assay 21 time less
by Quantitative
by Quantitative measuring measuring
results
results the the absorbances absorbances
are
are
obtained
obtained of of than 4 hours
the by Quantitative the measuring wells wells at at 450 450 results the nm nmabsorbances
are obtained Total of assay time less
B B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B
B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
FR

MBL Oligomer ELISA Kit
COMPOSITION DE LA TROUSSE
Item Eléments Quantité
1
12 x 8 micropuits avec
revêtement + Cadre
96 puits
2 Diluant Échantillon 1 x 60 mL
3a - 3h Etalons MBL, 1-8 8 x 1 mL
4
Solution de lavage
concentrée 25x
1 x 30 mL
5 Anticorps MBL Biotinylé 1 x 12 mL
6 Streptavidine-HRP 1 x 12 mL
7 Substrat TMB 1 x 12 mL
8 Solution d’Arrêt 1 x 16 mL
Note: Les réactifs liquides contiennent comme conservateurs
de l’azide de sodium, du Thimérosal ou du Bronidox L.
L’ingestion de ces produits peut être nocive.
MATÉRIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
1. Micropipettes ajustables allant de 1 à 1000
μL et embouts de pipettes correspondants
jetables
2. Tubes de polypropylène pouvant contenir
jusqu’à 1000 μL
3. Portoirs à tubes.
4. Micropipettes ajustables de 8 ou de 12
canaux (50-250 µL) ou une pipette répétitrice
(optionnel)
5. Une éprouvette graduée et propre de 1L.
6. Eau distillée ou déionisée
7. Couvercle pour microplaque
8. Contenant propre pour la dilution de la Solution
de Lavage
9. Appareil pour remplir les puits pendant les
procédures de lavage (optionnel).
10. Du papier serviette sans peluche ou du papier
absorbant
11. Contenants pour récupérer les déchets des
pipettes
12. Minuterie (de 60 minutes)
13. Lecteur de plaque d’ELISA calibré capable de
22
lire à 450 nm (de préférence capable de faire la
soustraction des valeurs de références à 650
ou 620 nm)
14. Hypochlorite de sodium (eau de Javel
ménagère, dilution 1:10) pour la décontamination
des spécimens, des réactifs et du matériel.
PRÉCAUTIONS
Uniquement pour le diagnostic in vitro
1. Cette trousse ne devrait être utilisée que par du
personnel de laboratoire qualifié.
2. Les étalons MBL ont été préparés à partir de la MBL
purifiée à partir du plasma humain. Chaque unité
de sang utilisée pour sa préparation a été testée
par des méthodes approuvées et s’est révélée
non réactive vis-à-vis de l’antigène de surface de
l’hépatite B (AgHBs) et des anticorps contre le
virus de l’immunodéficience humaine(VIH) 1 et 2 et
le virus de l’hépatite C (VHC). En outre, le produit a
été soumis à des procédures de désactivation des
virus. Cependant, étant donné qu’aucun test ne
peut garantir l’absence totale d’agents infectieux,
les étalons et les spécimens des patients doivent
être manipulés à un niveau de biosécurité 2 comme
il est recommandé pour n’importe quel spécimen
de sérum humain ou de sang potentiellement
infectieux dans le manuel CDC/NIH «Biosafety
in Micribiology and Biomedical Laboratories»,
1999. Les solutions contenant du sérum humain
doivent être traitées comme étant potentiellement
infectieuses et doivent donc être manipulées
comme telles.
3. Utiliser des embouts de pipettes différents
pour chaque spécimen, étalon et réactif pour
empêcher la contamination croisée.
4. Utiliser des contenants différents pour chaque
réactif. Ceci s’applique particulièrement au
Substrat TMB.
5. Après utilisation, décontaminer tous les
spécimens, réactifs et matériels en les trempant
au moins 30 minutes dans une solution d’hypochlorite
de sodium (eau de Javel ménagère,
dilution 1:10).
6. Pour prévenir la formation de gouttelettes
pendant le lavage, aspirez la solution de lavage

dans une bouteille contenant de l’eau de Javel.
7. Eviter le rejet dans l’environnement. Se débarrasser
des récipients et du contenu non utilisé en
suivant les règles de sécurité conformément à la
législation nationale et aux règlements locaux.
8. Les réactifs de cette trousse sont préservés avec
jusqu’à 0,05% de azodure de sodium, 0,038% de
Thimérosal, aussi appelé Thiomersal ou merthiolate
ou 0,2% de Bronidox L. Ces réactifs peuvent
être toxiques s’ils sont ingérés.
9. La Solution d’Arrêt contient 0,5 mol/L d’acide
sulfurique et peut causer de l’irritation ou des
brûlures au niveau de la peau et des yeux. En cas
de contact, rincer abondamment et immédiatement
à l’eau et consulter un médecin.
10. Ne pas changer les composants de cette trousse
avec les composants de trousses portant des
numéros de lots différents. Les composants ont
été standardisés comme une unité pour un lot
donné.
11. Les spécimens hémolysés ou hyperlipémiques
peuvent donner des résultats erronés.
12. Ne pas diluer les spécimens de sérums ou de
plasma directement dans les micropuits.
13. Ne pas toucher ou gratter le fond des micropuits
quand vous pipetez ou aspirez du liquide.
14. Des temps d’incubation et des températures
différents de ceux recommandés peuvent donner
des résultats erronés.
15. Ne pas laisser les puits s’assécher une fois
l’analyse commencée.
16. Le substrat TMB est sensible à la lumière. À
conserver à l’abri de la lumière intense.
17. Ne pas réutiliser les micropuits ni remettre les
réactifs dans leurs bouteilles une fois utilisés.
STABILITÉ ET STOCKAGE
1. Stocker la trousse et tous les réactifs à 2-8°C. Ne
pas congeler.
2. Utiliser tous les réactifs avant la date d’expiration
indiquée sur les étiquettes des flacons.
3. La Solution de Lavage diluée reste stable pendant
4 semaines à 2-8°C. Si les puits ne sont pas tous
utilisés, diluer seulement la quantité de Solution
de Lavage Concentrée requise.
MBL Oligomer ELISA Kit
4. Pour une utilisation ultérieure, conserver les
micropuits non utilisés dans le sac en aluminium
contenant le déshydratant fourni et fermer
hermétiquement. Avant utilisation, toujours laisser
la pochette d’aluminium revenir à la température
ambiante avant de l’ouvrir afin d’éviter la condensation
sur ou dans les micropuits enduits.
COLLECTE DES SPÉCIMENS
Manipuler et éliminer tous les spécimens de
sang, de plasma ou de sérum comme s’ils étaient
potentiellement infectieux. Voir Précautions,
sections 2, 3, 5, 6 et 7.
La détermination de la MBL dans un spécimen
requiert 5-50 µL de sérum ou de plasma. Les
spécimens de sang doivent être collectés dans un
tube sec ou hépariné, de façon stérile et par un
personnel qualifié selon les procédures de prélèvements
veineux approuvées. Le sérum ou le plasma
doivent être obtenus selon les techniques standards
de dosages en laboratoire clinique. Reboucher les
spécimens et gardez-les à 2-8°C pour un dosage
dans les 24 heures. Si l’analyse ne peut pas être
effectuée dans les 24 heures ou que le spécimen
doit être expédié, reboucher le spécimen et le
congeler à -20°C ou moins. Eviter des cycles de
congélation-décongélation répétés. Ne pas utiliser
des spécimens hémolysés, hyperlipémiques, traités
par la chaleur ou contaminés.
PRÉPARATION DES RÉACTIFS
ET DES ÉCHANTILLONS
1. Laisser tous les spécimens et réactifs
atteindre la température ambiante (20-25°C).
Bien mélanger les spécimens en inversant
doucement les tubes et si nécessaire éliminer
les particules visibles par centrifugation à
basse vitesse.
2. Déterminer le nombre d’échantillons à tester
(en duplicata) plus les échantillons de contrôle
interne (en duplicata) et les puits blanc. Les
puits à revêtement peuvent être utilisés par
bande de 8 puits ou par puits individuels. Pour
l’utilisation des puits individuellement, il faut les
séparer et les placer dans le cadre à l’empla-
23
FR

MBL Oligomer ELISA Kit
cement approprié. Les lettres et les encoches
dont les puits sont dotés permettent d’identifier
les puits individuellement. Ajouter 16 puits pour
les étalons (en duplicata). Enlever le nombre
de micropuits nécessaires et replacer les puits
restants dans le sac en aluminium contenant le
déshydratant à 2-8°C.
3. Solution de Lavage: Diluer la Solution de Lavage
Concentrée 25x en versant tout le contenu de la
bouteille (30 mL) dans une éprouvette graduée
de 1L et compléter avec 750 mL d’eau distillée
ou déionisée. Bien mélanger et conserver entre
2-8°C après usage.
4. Diluant d’Échantillon: Prêt à l’emploi, ne pas
diluer.
5. Etalons MBL: Prêts à l’emploi. Les concentrations
assignées sont indiquées sur les
étiquettes. Ne pas diluer.
6. Anticorps Biotinylé MBL: Prêt à l’emploi, ne pas
diluer.
7. Streptavidine-HRP Conjuguée: Prête à l’emploi,
ne pas diluer.
8. Substrat TMB: Prêt à l’emploi, ne pas diluer.
9. Solution d’Arrêt: Prête à l’emploi, ne pas diluer.
10. Spécimens des patients: Diluer chaque
spécimen avec le Diluant d’Échantillon pour
obtenir au moins 250 µL de solution diluée pour
déposer en duplicata 100 µL par puits. Un
criblage initial avec une dilution de 1/100 (ex.
5 µL de sérum + 495 µL de Diluant d’Échantillon,
mélanger par inversion ou doucement
au vortex) est suggéré pour la plupart des
échantillons, suivi par un second dosage
des échantillons qui se situent en dehors des
limites de mesure à des dilutions plus grandes
ou plus faibles selon les cas. Des dilutions de
moins de 1/10 ne doivent pas être utilisées.
PROCEDURE DU DOSAGE
1. Préparer le protocole d’essai, en identifiant
les puits pour les étalons, les spécimens
des patients dilués et les contrôles internes
de laboratoire en duplicata. Si une longueur
d’onde de référence de 650 ou 620 nm n’est
pas disponible sur le lecteur ELISA, faire un
24
blanc avec le réactif. Le blanc est obtenu avec
100 µL de Diluant d’Échantillon au lieu du
sérum dilué ou du plasma et procéder ensuite
comme pour les autres puits.
2. Pipeter des volumes de 100 μL de chaque
étalon, spécimens dilués et des contrôles
internes de laboratoire dans les micropuits aux
positions correspondantes. Couvrir les puits
et incuber pendant 60 minutes à température
ambiante sur un agitateur de plaque réglé à
200/minute.
3. Aspirer le contenu des micropuits et laver les
micropuits trois fois avec au moins 300 μL de
Solution de Lavage diluée. Si le lavage est
manuel, vider les micropuits par inversion
et secouer les légèrement dans un récipient
adéquat suivi d’une absorption en position
inversée sur une serviette en papier. Il est
recommandé, au moins pour le dernier cycle de
lavage, de laisser la Solution de Lavage pendant
une minute avant de la vider. La vigueur avec
laquelle la Solution de Lavage est déposée ou
vidée du micropuits a un effet sur le développement
de la coloration finale. Le pipetage
manuel qui peut être très doux et conduit ainsi
au développement d’une forte coloration est
recommandé uniquement en l’absence d’autres
alternatives comme le remplissage des puits
par immersion, l’utilisation d’une pipette de
lavage multicanaux manuelle ou l’utilisation d’un
appareil de lavage automatique.
4. Déposer 100 μL d’Anticorps Biotinylé MBL (prêt
à l’emploi) dans chaque micropuits. Une pipette
multicanaux ou une micropipette répétitrice
peuvent être utilisées. Couvrez les puits
pendant 60 minutes à température ambiante
sur un agitateur de plaque (200/minute).
5. Laver comme décrit ci-dessus à l’étape 3.
6. Déposer 100 μL de Streptavidine-HRP
conjuguée (prête à l’emploi) dans chaque
micropuits. Une pipette multicanaux ou une
micropipette répétitrice peuvent être utilisées.
Couvrir les puits et incuber pendant 60 minutes
à température ambiante sur un agitateur de
plaque (200/minute).

7. Laver comme décrit ci-dessus à l’étape 3.
8. Déposer 100 μL de Substrat TMB (prêt à
l’emploi) dans chaque micropuits. L’utilisation
d’une pipette multicanaux est recommandée
pour réduire le temps de pipetage. Couvrir
les puits et incuber pendant exactement 15
minutes à température ambiante dans l’obscurité.
Déclencher la minuterie dés le remplissage
du premier puits.
9. Ajoutez 100 µL de Solution d’Arrêt (prête à
l’emploi) dans chaque puits, en maintenant
la même séquence de pipetage et la même
vitesse qu’à l’étape 7. Mélanger en secouant
doucement pendant 20 secondes, éviter de
faire gicler. Lire les puits dans les 30 minutes.
10. Lire les densités optiques (absorbances) des
puits à 450 nm dans un lecteur de microplaque
approprié (longueur d’onde de référence
650 nm à 620 nm). Si la longueur d’onde de
référence n’est pas disponible, la valeur du
blanc est soustraite de chaque autre valeur des
autres puits avant d’effectuer d’autres calculs.
RÉSUMÉ SCHEMATIQUE
Incubez
1 h à TA
Incubez
1 h à TA
Incubez
1 h à TA
MBL Oligomer ELISA Kit
100 μL Etalons ou échantillon dilué
100 μL Anti-MBL biotinylé
Lavage x 3
Lavage x 3
100 μL de Conjugué HRP-Streptavidine
Incubez
15 min à TA
Dans le noir
Laissez les réactifs atteindre la TA
Diluez les échantillons
100 μL Substrat TMB
100 μL Solution d’arrêt
Lire à 450 nm
Lavage x 3
CALCUL DES RÉSULTATS
Le principe de base est de tracer une courbe de
calibration en mettant la moyenne des densités
optiques de chaque Etalon MBL sur l’axe des
25
FR

MBL Oligomer ELISA Kit
ordonnées et les concentrations correspondantes
de MBL en ng/mL sur l’axe des abscisses. La
courbe de calibration doit satisfaire les conditions
de validation. La concentration en MBL de chaque
échantillon dilué est ensuite déterminée en localisant
le point de la courbe correspondant à la moyenne
des valeurs de la densité optique en duplicata et en
lisant la concentration correspondante sur l’axe des
abscisses en ng/mL. La concentration en MBL dans
l’échantillon non dilué est calculée en multipliant ce
résultat par le facteur de dilution de l’échantillon.
Cette procédure peut être effectuée manuellement
en utilisant du papier millimétré avec
des échelles linéaires pour les abscisses et les
ordonnées. Une courbe lissée peut être tracée en
passant entre les points ou en joignant les points
adjacents par des lignes droites. Cette dernière
procédure peut légèrement surestimer les valeurs
de concentrations entre les points quand la courbe
est légèrement convexe sur la gauche, ce qui
est généralement le cas. Même si la courbe peut
s’approcher d’une ligne droite, il est à la fois théoriquement
et pratiquement incorrect de calculer et de
tirer une ligne droite puis de lire les résultats à partir
de celle-ci.
Cette procédure peut aussi être effectuée par
un logiciel de lecture d’ELISA qui incorpore des
procédures de lissage des courbes. La procédure
de choix doit utiliser des axes linéaires pour les
abscisses et les ordonnés avec un lissage des
courbes logistique à 4 paramètres.
Les échantillons dilués qui donnent une valeur
de densité optique moyenne supérieure à celle de
40 ng/mL de l’Etalon MBL ou inférieure à celle de 0,5
ng/mL de l’Etalon MBL sont en dehors des limites
de mesure et leurs concentrations doivent être
rapportées comme étant respectivement >40 ng/mL
et (40 x facteur de dilution) ng/mL et 1,5. L’absorbance moyenne pour
tout Étalon MBL devrait être supérieure à celle de
l’Étalon MBL précédent, ex., absorbance (10 ng/mL
MBL) > absorbance (5 ng/mL). La courbe devrait être
légèrement convexe dans sa partie gauche lorsque
les résultats sont tracés sur des axes linéaires.
Points hors limites pour les étalons individuels:
Un ou plusieurs étalons peuvent donner des
lectures de densité optique anormales. L’une ou
les deux valeurs du duplicata ainsi que la moyenne
des duplicata peuvent être hors limites. L’erreur est
significative si elle diminue l’efficacité du lissage de
la courbe par la méthode logistique à 4-paramètres,
qui à cause de la valeur anormale, est décalée par
rapport aux autres valeurs de points des étalons
qui sont en fait correctes. La correspondance
des points des étalons et de la courbe lissée doit
toujours être examinée avant d’accepter les calculs
de concentrations effectués. Une courbe mal lissée
peut être détectée par une somme des carrés
résiduels élevée. Si un étalon seulement est affecté
mais pas l’étalon le plus concentré, deux recours
sont possibles:
i) Une valeur simple ou en duplicata erronée doit
être éliminée de la courbe et le reste des résultats
repris par la procédure logistique à 4-paramètres.
Si on obtient un lissage satisfaisant, des résultats
provisoires de concentrations peuvent alors être
calculés.
ii) Si on n’obtient pas de lissage satisfaisant
de cette façon, mais que la courbe est par ailleurs
cohérente, des résultats provisoires peuvent être
obtenus à partir d’un tracé de lignes droites entre
les moyennes des duplicata, en ignorant le point
erroné.
Si deux ou plusieurs étalons sont affectés, il
faut refaire l’analyse.

Un résultant erroné pour un seul étalon peut
être dû à une erreur de manipulation ou à la détérioration
de l’étalon. Si les deux valeurs du duplicata
sont hors limites de la même façon dans deux
essais successifs, l’étalon est en cause et doit être
omis.
TRAÇABILITÉ DE LA VALEUR DE L’ÉTALON
La valeur de MBL assignée a été attribuée à l’aide
d’ELISA garantissant la traçabilité conformément
aux normes internes appliquées au Statens Serum
Institut (Danemark).
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Les concentrations de MBL dans le sérum ou le
plasma des donneurs humains sains, mesurées
par cet essai, et des essais analogues s’étendent
de 0 à 7000 ng/mL. Des valeurs inférieures à 100
ng/mL peuvent être trouvées en présence des
génotypes structuraux O/O (dans lesquels O = B, C
ou D) quel que soit le génotype du promoteur, ou
en présence des génotypes structuraux A/O (dans
lesquels A = souche sauvage) en combinaison
avec les génotypes de promoteurs HY/LX ou LX/
LY ou avec le génotype de promoteur LX/LX. Des
concentrations comprises entre 100 ng/mL et 1000
ng/mL peuvent être trouvées avec les génotypes
structuraux A/O ou les génotypes de promoteur
LX/LY ou LX/LX. Des concentrations supérieures
à 1000 ng/mL sont associées à un génotype de la
souche sauvage (A/A) de MBL, même si les hétérozygotes
A/D peuvent occasionnellement atteindre
ce niveau. Le génotype du promoteur HY/HY donne
généralement des concentrations supérieures à
1500 ng/mL pour les souches sauvages de MBL
mais d’autres génotypes de promoteur en l’absence
des allèles structuraux O aussi.
Des études cliniques ont utilisées comme
valeur seuil pour définir une déficience grave
en MBL, 50 ng/mL ou 100 ng/mL. Les valeurs
inférieures à ces seuils peuvent être associées, chez
certains individus, à des antécédents de susceptibilité
aux infections accrue.
MBL Oligomer ELISA Kit
CONTROLE DE QUALITÉ
Les laboratoires qui effectuent des analyses
répétées doivent préparer leurs propres sérums
de contrôle pour les valeurs élevées (>1000 ng/mL)
et les valeurs basses (

MBL Oligomer ELISA Kit
CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE
Limite de détection: La plus faible concentration
de MBL avec une absorbance supérieure à 2 ET
au dessus de l’absorbance moyenne de l’étalon
zéro (n = 8) était de 0,02 ng/mL, correspondant à
une concentration de sérum de 2 ng/mL dans un
spécimen dilué à 1/100.
Reproductibilité intra-essai (pendant un essai):
Deux échantillons de sérums ont été testés en 10
exemplaires pour déterminer la reproductibilité de
l’essai. Les résultats suivants ont été obtenus (CV =
Reproductibilité inter-essai (entre les essais)
(jours et techniciens différents): Deux mêmes
échantillons de sérum ont été testés en duplicata
lors de 4 essais effectués par 2 techniciens à
différents jours pour déterminer la reproductibilité
inter-essai. Les résultats suivants ont été obtenus:
Spécificité: Le Western blot du plasma ou des
fractions du plasma n’a pas mis en évidence de
bandes qui réagissent avec l’anticorps autres
que celles correspondant à la MBL. L’absence
de réaction croisée avec les autres composants
du plasma s’explique par le fait que les lectures
non distinguables du zéro ont été obtenues avec
normaux
28
Sérum 1 Sérum 2
Conc. MBL Moy. 2279 ng/mL 28,4 ng/mL
ET 81,2 1,07
CV 3,6% 3,8%
Sérum 1 Sérum 2
Conc. MBL Moy. 2310 ng/mL 29,7 ng/mL
ET 212 1,28
CV 9,2% 4,3%
RESPONSABILITÉ
Pour le diagnostic in vitro dans certains pays
uniquement. Voir www.bioporto.com pour trouver
s’il est disponible dans votre pays.
Cette trousse est destinée uniquement à la
dans le sérum humain ou le plasma.
La trousse doit être utilisée uniquement par un
recherche ou de diagnostique.
Si le récipiendaire de cette trousse la prête, de
n’importe quelle façon, à un tiers, cette instruction
doit être incluse et ledit récipiendaire doit, à ses
propres risques, assurer en faveur de BioPorto
Diagnostics A/S toutes les limitations et responsabilités
décrites ici.
BioPorto Diagnostics A/S ne sera pas responsable
des dommages ou pertes pouvant être
occasionnés par l’utilisation de cette trousse d’une
autre façon que celle indiquée dans ces instructions.
La responsabilité de BioPorto Diagnostics A/S
n’excèdera en aucun cas la valeur marchande de
cette trousse.
BioPorto Diagnostics A/S ne sera en aucun cas
responsable de dommages indirects ou spéciaux,

MBL Oligomer ELISA Kit
29
FR

MBL Oligomer ELISA Kit
Revisione: MO2010-07-EN-IT
Leggere attentamente queste istruzioni
DESTINAZIONE D’USO
Per la determinazione in vitro della lectina legante
mannosio nel siero e nel plasma-eparina.
IMPORTANZA CLINICA
Determinazione della suscettibilità alle infezioni
e quindi di una aggressiva somministrazione di
antibiotici in:
• Pazienti sottoposti o che stanno per sottoporsi a
chemioterapia o a trattamento immunosoppressivo
•
Bambini con infezioni ricorrenti
Può anche essere usato come marker prognostico
della gravità della malattia nell’artrite reumatoide e
nel lupus eritematoso sistemico.
La lectina legante-mannosio (MBL, chiamata
anche proteina legante il mannosio) è una proteina
multimerica che si lega ai carboidrati, prodotta nel
fegato e secreta nel sangue dove costituisce un
importante elemento nella immunodifesa innata
contro microrganismi invasori. Le sue forme di
pro-proteasi del siero (le MASP) che si attivano
carboidrato e, successivamente, attivano il complemento
attraverso il percorso di MBL o della lectina1 .
La mancanza di MBL normalmente oligomerizzata
può essere associata con una accresciuta
suscettibilità alle infezioni quando il sistema immune
adattivo è immaturo (nella prima infanzia) 2 o è stato
soppresso (per es. dopo un trapianto o durante la
chemioterapia) 3 . La mancanza è anche associata
con gravi malattie auto-immuni come il lupus
eritematoso sistemico (SLE) 4 o l’artrite reumatoide 5
6 .
La mancanza di MBL può essere causata da
varianti alleliche nelle regioni promotrici e/o strutturali
del gene MBL7 . Certi alleli promotori vengono
associati con concentrazioni di MBL più basse nel
siero mentre le varianti strutturali hanno effetto
sia sulla normale oligomerizzazione di MBL che
30
sulla sintesi totale della catena. Soggetti omozigoti
per un difetto strutturale mostrano livelli di MBL
oligomerizzerata molto bassi mentre gli eterozigoti
mostrano livelli basso-intermedi. In 100 donatori di
sangue danesi sani, le concentrazioni di MBL nel
siero determinate da un immunotest oligomeroselettivo
mostrarono valori bassi (

domini leganti i carboidrati. Il materiale non legato
viene rimosso per mezzo di lavaggio.
Fase 2. Anticorpo biotinilato MBL monoclonale
di rilevamento viene aggiunto a ciascun pozzetto
e incubato. L’anticorpo di rilevamento si attacca
agli oligomeri MBL attraverso i domini leganti i
carboidrati che non sono occupati essendo legati al
rivestimento. L’anticorpo di rilevamento non legato
viene rimosso per mezzo di lavaggio.
Fase 3. Streptavidina-HRP viene aggiunta
a ciascun pozzetto a formare un complesso con
l’anticorpo biotinilato legato. Il coniugato non legato
viene rimosso per mezzo di lavaggio.
Fase 4. Un substrato cromogenico per la
perossidasi contenente tetrametilbenzidina (TMB)
viene aggiunto a ciascun pozzetto del test. La
HRP-streptavidin legata reagisce con il substrato
generando un prodotto colorato. La reazione
enzimatica viene interrotta chimicamente e l’intensità
del colore viene letta a 450 nm in un lettore
ELISA. La densità del colore (densità ottica) è una
funzione della concentrazione delle forme oligomeriche
di MBL originariamente aggiunta a ciascun
pozzetto. I risultati per i calibratori vengono utilizzati
per costruire una curva di calibrazione da cui
vengono lette le concentrazioni di MBL presenti nei
campioni.
Plates are precoated with Mannan.
MBL Oligomer ELISA Kit
Mannan The plates are ready for use
Plates Mannan
are precoated with Mannan.
Mannan
The plates are ready for use 1 hour
PRINCIPIO Plates Plates
DELLA MBL are are
PROCEDURA precoated precoated
DEL with with
TEST ManMan- Plates nan. Plates nan. Mannan The Mannan The
are are plates plates
precoated precoated are are ready ready
with with for for
ManMan- use use
nan. Mannan Anticorpo The plates MBL are ready for use 1 hour
Diluted nan. Mannan The
Plates MBL are samples plates are ready
precoated and for
with calibrators use
Plates are precoated with ManMan-
are Le Plates nan. piastre added The are plates sono precoated to each are pre-rivestite ready well with for and Man- con useincu
an- 1 hour
Plates nan. The are plates precoated are ready with for Man- use 1 hour
batedticorponan. The primario plates MBL. are ready Le piastre for usesono
nan. Diluted MBL MBL
pronte The samples
per plates l’uso are and ready calibrators for use 1 hour
1 hour
are MBL added MBL to each well and incu-
Diluted bated Diluted samples samples and and calibrators calibrators 1 hour
1 hour 1 hour
B
are MBL
Diluted
are Diluted added MBL added Biotinylated MBL samples samples to to each each
and and well MBL well
calibrators calibrators and and antibody incuincu- 1 hour
1 hour
bated are
bated are added MBL to each well and incu-
Badded
MBL to each well and incu- 1 hour
Campioni bated Diluted Biotinylated samples e calibratori MBL and diluiti calibrators antibody sono ag-
Biotinylated bated Diluted samples
giunti are a ciascun pozzetto e incubati
Diluted added samples to detection and calibrators
each and well calibrators and antibody incu- is
are 1 hour
Diluted Badded
samples to each and well calibrators and incu- 1 hour
added B bated are Biotinylated added Biotinylated to to each detection each MBL well well antibody and antibody and incuincubabated are Badded
Biotinylated to each MBL well antibody and incuis
1 hour
1 hour
tedB
batedbated added Biotinylated Anticorpo to each Biotilinata well MBL MBL and antibody
MBL incuba-
Biotinylated ted Biotinylated 1 hour
B detection detection antibody antibody is is
1 hour
B
Anticorpo Biotinylated Biotinylated Biotilinata detection MBL antibody di rivelazione
added Biotinylated
added is 1 hour
BBiotinylated
to to each each
detection well well MBL and and
antibody incubaincuba- is 1 hour 1 hour
è added aggiunto B Biotinylated to each a ciascun well MBL pozzetto and antibody incuba- e incu-
added tedtedbatoBiotinylated Streptavidin to each well MBL - and HRP antibody incuba- 1 hour
ted Biotinylated ted Biotinylated Streptavidin detection
detection - HRP antibody
antibody
is
is
added Biotinylated to each detection well and antibody incubais
1 hour
HRP-conjugated added Biotinylated to each detection well
added ted Streptavidin Streptavidina to each well HRP-conjugata
- HRP
streptavidin and antibody incubais
is 1 hour
added ted HRP-conjugated to each well streptavidin and and incubaincubais 1 hour
1 hour
added
Streptavidin
added ted Streptavidin to to each each
-
well well
HRP
- HRP and and incubaincubated Streptavidin - HRP
ted Streptavidina HRP-conjugated HRP-conjugata streptavidin -è aggiun-
HRP-conjugated ted
streptavidin is is 1 hour
1 hour
ta added a ciascun Streptavidin pozzetto - HRP e incubata
added HRP-conjugated HRP-conjugated Streptavidin to to each each well well - streptavidin streptavidin HRP and and incubaincuba- is is 1 hour
1 hour
added ted added ted
Streptavidin to to each each well well - HRP HRP and and incubaincuba- 15 min. 15 min.
ted HRP-conjugated S
TMB Substrato Substrate TMBstreptavidin
is
ted HRP-conjugated TMB Substrate streptavidin is
added
added HRP-conjugated to each well streptavidin and incubais
15 min.
HRP-conjugated to each well streptavidin and incubais
15 min.
Il S
S added ted substrato TMB to each Substrate è aggiunto well and a ciascun incubapoz-
S Substrate S added ted TMB to each Substrate is added to each well. 15 min.
S
well and incuba- 15 min.
S Substrate zetto. S ted Develop TMB Sviluppare is added
for Substrate 15 per minutes 15 minuti to each
in al the buio well.
S
S
Develop ted TMB Substrate
S
S Substrate dark for is added 15 minutes to each well. in the
S
15 min.
S
S Substrate is added to each well. 15 min.
dark S
S Develop TMB Soluzione Substrate
S S Substrate S for is added 15 di minutes Arresto to each in well. the 15 min.
S TMB Substrate
S Substrate Develop for is added 15 minutes to each in well. the
S
15 min.
S Develop darkTMB
for Substrate 15 minutes in the
S
S Develop darkTMB
for Substrate 15 minutes in the
S
S
S Soluzione Substrate darkStop
solution di is Arresto added to viene each aggiunta well. a
S
S Substrate dark is added to each well.
ciascun pozzetto. Leggere la piastra
S Develop S S Substrate for is added 15 minutes to each in well. the
S
S S Substrate Develop Stop for solution
entro 30 min. is added 15 minutes to each in well. the
Develop Stop darkStop
Solution solution for 15 is minutes added to in each the
S Develop darkStop
solution for 15 minutes in the
S
dark I well. dark risultati Stop Read qualitativi solution plate within si ottengono 30 min.
Stop Stop Solution solution is added to misu- each
rando Stop Solution le assorbanze is added dei pozzetti to each 450
well.
Stop
Stop nm Stop well. Quantitative Stop Stop Read
Solution
Read
Solution Solution solution solution plate plate
is added
results is is within
added added within
to
are 30 obtained 30
each
to to min.
each each min.
well. Read plate within 30 min.
well. by well. Stop measuring Stop Read Read solution solution plate plate the within within absorbances 30 30 min. min. of
Quantitative Stop Quantitative
Stop Quantitative the wells Solution
Solution at 450 results results is
is nm added
added
are are are obtained obtained to
to obtained each
each
by Stop by well. Quantitative measuring Read Solution plate results the is within added absorbances are 30 obtained to min.
Stop by well. Quantitative measuring Read Solution plate results the is the within added absorbances are 30 obtained to min. each each of of of
the by well.
by well. the
measuring measuring wells Read Read at at at plate plate 450 450 the the nm within
nm within absorbances nm absorbances
30 30 min. min. Total of of assay 31 time less
Quantitative
Quantitative the wells at 450 results
results nm are
are
obtained
obtained
the wells at 450 nm
than 4 hours
by Quantitative measuring results the absorbances are obtained Total of assay time less
B B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B
B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
IT

MBL Oligomer ELISA Kit
COMPONENTI DEL KIT
Articolo Contenuto Quantità
1
12 x 8 Pozzetti ricoperti +
supporto
96
pozzetti
2 Diluente per campione 1 x 60 mL
3a - 3h Calibratori MBL, 1-8 8 x 1 mL
4
25x soluzione di lavaggio
concentrata
1 x 30 mL
5 Anticorpo biotinilato MBL 1 x 12 mL
6 Streptavidina-HRP 1 x 12 mL
7 Substrato TMB 1 x 12 mL
8 Soluzione di arresto 1 x 16 mL
Nota: i reagenti liquidi contengono i conservanti azoturo di
sodio, timerosal o Bronidox L. Le sostanze in esso contenute
possono essere nocive se ingerite.
MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI
1. Micropipette regolabili in una gamma da 1 a
1000 µL e corrispondenti punte per pipette usa
e getta
2. Provette il polipropilene in grado di contenere
fino a 1000 µL
3. Porta-provette
4. Micropipetta regolabile da 8- o 12-canali
(gamma 50-250 µL) o micropipetta a ripetizione
(opzionale)
5. 1 cilindro pulito graduato da 1 L
6. Acqua deionizzata e distillata
7. Coperchio per micropiastra
8. Contenitore pulito per soluzione di lavaggio diluita
9. Dispositivo per pulire i pozzetti durante la
procedura di lavaggio (opzionale)
10. Fazzoletti di carta non garzati o carta
assorbente
11. Serbatoi per pipettaggio usa e getta
12. Timer (60-minuti)
13. Lettore a piastra ELISA calibrato in grado di
leggere a 450 nm (preferibilmente sottraendo i
valori di riferimento a 650° 620 nm)
32
14. Ipoclorito di sodio (candeggiante domestico
diluizione 1:10) per la decontaminazione di
campioni, reagenti e materiali)
PRECAUZIONI
Solo per uso diagnostico in vitro
1. L’utilizzo di questo kit è riservato esclusivamente
a personale di laboratorio qualificato.
2. I calibratori MBL furono preparati da MBL
purificata di plasma umano. Ciascuna unità di
sangue usata per la preparazione fu testata
secondo metodi approvati e trovata non
reattiva per l’antigene superficiale dell’epatite
B (HBsAg) e per anticorpi contro il virus
da immunodeficienza umana (HIV) e il virus
dell’epatite C (HCV). Inoltre il prodotto fu
sottoposto a procedure di disattivazione dei
virus. siccome, però, nessuna metodica di test
può offrire la completa sicurezza che siano
assenti agenti infettivi, i calibratori e i campioni
dei pazienti devono essere maneggiati a livello
di biosicurezza 2 come raccomandato nel
manuale CDC/NIH “Biosafety In Microbiology
and Biomedical Laboratories”, 1999. Per
qualsiasi siero umano o campione di sangue
potenzialmente infetto, le soluzioni contenenti
siero umano devono essere trattate come
potenzialmente infette e maneggiate di
conseguenza.
3. Usare punte di pipette separate per ciascun
campione, calibratore e reagente per evitare la
contaminazione incrociata.
4. Usare serbatoi separati per ciascun reagente.
Questo si applica soprattutto al substrato TMB.
5. Dopo l’uso, decontaminare tutti i campioni, i
reagenti e i materiali immergendo per almeno
30 minuti in soluzione di ipoclorito di sodio
(candeggiante domestico diluito 1:10).
6. Per evitare la formazione di goccioline durante
il lavaggio, aspirare la soluzione di lavaggio in
una bottiglia contenente candeggiante.
7. Evitare il rilascio nell’ambiente. Smaltire i
contenitori e il contenuto inutilizzato in modo
sicuro e in conformità con le disposizioni
nazionali e locali.

8. I reagenti di questo kit sono conservati con
un massimo di 0,05% di azoturo di sodio,
0,038% timerosal, chiamato anche tiomersal o
mertiolato, o 0,2% Bronidox L. Questi possono
essere tossici se ingeriti.
9. La soluzione di arresto contiene 0,5 mol/L
di acido solforico e può causare irritazioni o
ustioni alla pelle e agli occhi. In caso di contatto,
sciacquare abbondantemente con acqua e
consultare immediatamente un medico.
10. Non scambiare i componenti di kit con numeri
di lotto diversi. I componenti sono stati
standardizzati come unità per un dato lotto.
11. Campioni emolizzati o iperlipemici possono
dare risultati errati.
12. Non diluire i campioni di siero o il plasma
direttamente nei micropozzetti.
13. Non toccare né raschiare il fondo dei micropozzetti
quando si pipetta o si aspira il liquido.
14. Tempi e temperature diversi da quelli specificati
possono dare risultati errati.
15. Non lasciare che i pozzetti si asciughino una
volta che il test è iniziato.
16. Il substrato TMB è sensibile alla luce. Conservare
lontano da fonti di luce.
17. Non riutilizzare i pozzetti né versare di nuovo i
reagenti nelle bottiglie una volta versati.
STABILITÀ E CONSERVAZIONE
1. Conservare il kit con tutti i reagenti a 2-8°C.
Non congelare.
2. Usare tutti i reagenti prima della data di
scadenza riportata sull’etichetta delle fiale.
3. La soluzione di lavaggio diluita resta stabile
per 4 settimane a 2-8°C. Se non devono essere
utilizzati tutti i pozzetti, diluire solo la parte di
soluzione di lavaggio concentrata richiesta.
4. Per l’uso successivo, conservare le strisce di
pozzetti nella sacca di alluminio con il disseccante
in dotazione e sigillare di nuovo. Lasciare
sempre che la sacca protettiva si equilibri
a temperatura ambiente prima di aprire per
evitare la condensazione in/su i micropozzetti
rivestiti.
MBL Oligomer ELISA Kit
RACCOLTA DEI CAMPIONI
Maneggiare e smaltire tutti i campioni di sangue,
siero e plasma come se fossero potenzialmente
infetti. Vedere Precauzioni, sezioni 2, 3, 5, 6 e 7.
La determinazione di MBL in un singolo campione
richiede 5-50 µL di siero o plasma. I campioni di
sangue devono essere raccolti in modo asettico
in una provetta semplice o eparinizzata da parte di
personale qualificato che usa tecniche di venopuntura
approvate. Il siero o il plasma devono essere
preparati con tecniche standard per test clinici di
laboratorio. Coprire i campioni e conservarli a 2-8°C
per testarli entro 24 ore. Se il test non può essere
eseguito entro 24 ore o se il campione deve essere
spedito, coprire il campione e tenerlo congelato
ad una temperatura di almeno −20°C. Evitare
congelamento e scongelamento ripetuti. Non usare
campioni emolizzati, iperlipemici, trattati a caldo o
contaminati.
PREPARAZIONE DI REAGENTI E CAMPIONI
1. Portare tutti i campioni e i reagenti a temperatura
ambiente (20-25°C). Mescolare a fondo
i campioni capovolgendoli delicatamente e,
se necessario, eliminare materia particellare
visibile con una centrifugazione a bassa
velocità.
2. Stabilire il numero di campioni da testare
(in duplicato) oltre a qualunque campione di
controllo interno del laboratorio (in duplicato)
e qualsiasi pozzetto del bianco reagente. I
pozzetti pre-rivestiti possono essere utilizzati
nel formato strip o singolarmente. I pozzetti
singoli possono essere utilizzati spaccandoli
individualmente ed inserendoli nell’apposita
cornice nella posizione prevista. Lettere e
numeri permettono l’identificazione di ogni
pozzetto. Aggiungere 16 pozzetti per gli 8
calibratori (in duplicato). Estrarre il numero
di micropozzetti necessario e rimettere le
rimanenti nel sacchetto di alluminio con il
dissecante a 2-8°C.
3. Soluzione di lavaggio: Diluire la soluzione di
lavaggio concentrata 25x versando tutto il
contenuto della bottiglia (30 mL) in un cilindro
33
IT

MBL Oligomer ELISA Kit
graduato da 1 L e aggiungere acqua distillata o
deionizzata fino a raggiungere un volume di 750
mL. Mescolare bene e, dopo l’uso conservare a
2-8°C.
4. Diluente per campione: Pronto all’uso, non
diluire ulteriormente.
5. Calibratori MBL: Pronti all’uso. Le concentrazioni
assegnate sono indicate sulle etichette.
Non diluire ulteriormente.
6. Anticorpo biotinilato MBL: Pronto all’uso, non
diluire ulteriormente.
7. Streptavidina HRP-coniugata: Pronta all’uso,
non diluire ulteriormente.
8. Substrato TMB: Pronto all’uso, non diluire
ulteriormente.
9. Soluzione di arresto: Pronta all’uso, non diluire
ulteriormente.
10. Campioni paziente: Diluire ciascun campione
in una proporzione registrata con diluente per
campione fino ad ottenere almeno 250 µL di
soluzione diluita che può essere impostata in
pozzetti duplicati a 100 µL per pozzetto. Per la
maggior parte dei campioni, si consiglia uno
screening iniziale ad una diluizione di 1/100
(per es. 5 µL di siero + 495 µL di diluente per
campione, mescolati capovolgendo o ruotando
lentamente), seguito da un nuovo test di
campioni fuori gamma a diluizione più bassa
o più alta secondo come è appropriato. Non
usare diluizioni inferiori a 1/10.
PROCEDURA DEL TEST
1. Preparare il protocollo del test, assegnando i
pozzetti appropriati per impostare calibratori,
campioni paziente diluiti e qualsiasi controllo
interno di laboratorio in duplicato. Se non è
disponibile una lunghezza d’onda di riferimento
di 650 o 620 nm sul lettore ELISA, può essere
assegnato un pozzetto del bianco-reagente
Questo viene impostato con 100 µL di diluente
per campione invece che siero o plasma diluiti
ed elaborati come gli altri pozzetti.
2. Pipettare volumi di 100 μL di ciascun calibratore,
campioni diluiti e qualsiasi controllo
interno di laboratorio nelle corrispondenti
34
posizioni di micropozzetti. Coprire i pozzetti e
incubare per 60 minuti a temperatura ambiente
su una piattaforma oscillante impostata a 200/
minuto.
3. Aspirare il contenuto dei micropozzetti e lavarli
tre volte con almeno 300 μL di soluzione di
lavaggio diluita. Se il lavaggio si esegue manualmente,
svuotare i micropozzetti capovolgendoli
e scuotendoli delicatamente in un contenitore
adatto tamponando successivamente in
posizione capovolta su un asciugamano di
carta. Si consiglia una sosta di 1 minuto prima
di svuotare almeno per l’ultimo lavaggio del
ciclo. La forza con cui la soluzione di lavaggio
entra o esce dai pozzetti influenza lo sviluppo
finale del colore. Il pipettaggio manuale, che
può essere molto delicato e portare ad un
elevato sviluppo di colore, è consigliato solo
in assenza di alternative come il riempimento
dei pozzetti per immersione, utilizzando un
dispenser di lavaggio manuale multicanale o un
dispositivo di lavaggio automatico.
4. Versare 100 μL di anticorpo biotinilato MBL
(pronto all’uso) in ciascun micropozzetto. Può
essere usata una micropipetta multicanale o a
ripetizione. Coprire i pozzetti e incubare per 60
minuti a temperatura ambiente su una piattaforma
oscillante (200/minuto).
5. Lavare come descritto in precedenza, nella
fase 3.
6. Versare 100 μL di streptavidina HRP-coniugata
(pronta all’uso) in ciascun micropozzetto. Può
essere usata una micropipetta multicanale o a
ripetizione. Coprire i pozzetti e incubare per 60
minuti a temperatura ambiente su una piattaforma
oscillante (200/minuto).
7. Lavare come descritto in precedenza, nella
fase 3.
8. Versare 100 μL di substrato TMB (pronto
all’uso) in ciascun micropozzetto. L’uso di
una micropipetta multicanale è consigliato
per ridurre il tempo di pipettaggio. Coprire i
pozzetti ed incubare per esattamente 15 minuti
a temperatura ambiente, al buio. Impostare
l’orologio quando si riempie il primo pozzetto.

9. Aggiungere 100 µL di soluzione di arresto
(pronta all’uso) a ciascun pozzetto,
mantenendo la stessa sequenza e lo stesso
tasso di pipettaggio della fase 7. Mescolare
scuotendo delicatamente per 20 secondi,
evitando fuoriuscite. Leggere i pozzetti entro
30 minuti.
10. Leggere le densità ottiche (OD) o assorbanze
dei pozzetti a 450 nm in un lettore per
micropiastra appropriato (lunghezza d’onda di
riferimento 650 o 620 nm). Se non è disponibile
alcuna lunghezza d’onda di riferimento, il
valore di ciascun bianco reagente è sottratto da
ciascuno degli altri valori prima di eseguire gli
altri calcoli.
VISTA SCHEMATICA
Incubare
1 h a TA
Incubare
1 h a TA
Incubare
1 h a TA
Incubare
15 min a TA
al buio
MBL Oligomer ELISA Kit
Portare i reagetni a TA
Diluire i campioni
Calibratori o campione diluito 100 μL
Lavare x 3
100 μL Anticorpo Biotilinato MBL
Lavare x 3
100 μL Streptavidina HRP-coniugata
100 μL Substrato TMB
100 μL Soluzione di Arresto
Leggere a 450 nm
Lavare x 3
CALCOLO DEI RISULTATI
Il principio di base è quello di costruire una curva
di calibrazione punteggiando la media dei valori di
densità ottica duplicata per ciascun MBL calibratore
sull’asse y rispetto alle corrispondenti concentra-
35
IT

MBL Oligomer ELISA Kit
zioni di MBL in ng/mL sull’asse x. La curva di calibrazione
deve corrispondere ai requisiti di validazione.
La concentrazione di MBL per ciascun campione
di siero diluito viene quindi trovata localizzando il
punto sulla curva che corrisponde alla media dei
valori di densità ottica in duplicato per il campione
diluito e leggendo la concentrazione corrispondente
in ng/mL sull’asse x. La concentrazione di MBL nel
campione di siero non diluito è calcolata moltiplicando
questo risultato per il fattore di diluizione del
campione.
Questa procedura può essere eseguita
manualmente usando grafici con scale lineari x e y.
Una curva intera può essere disegnata attraverso
i punti oppure i punti adiacenti possono essere
uniti con linee diritte. La seconda procedura può
leggermente sovrastimare i valori di concentrazione
tra i punti nel caso in cui la curva è leggermente
convessa verso sinistra, cosa che si riscontra
comunemente. Sebbene la curva può approssimarsi
ad una linea diritta, è praticamente e teoricamente
scorretto calcolare e tracciare la linea diritta del
miglior adattamento e leggere i risultati da questo.
La procedura può anche essere eseguita con
un programma software di lettura ELISA che include
procedure di adattamento alla curva. La procedura
maggiormente scelta è usare assi lineari x e y con
adattamento logistico alla curva a 4-parametri.
Campioni diluiti che danno un valore di densità
ottica medio superiore a quello per il MBL calibratore
da 40 ng/mL o al di sotto di quello per il MBL
calibratore da 0,5 ng/mL sono fuori dalla gamma
del test e le loro concentrazioni devono essere
annotate rispettivamente come >40 ng/mL e (fattore
di diluizione 40 x) ng/mL e 1,5. Il valore
medio OD per ogni calibratore MBL dovrebbe
essere superiore a quello del precedente calibratore
MBL, per es. OD(10 ng/mL MBL) > OD(5 ng/
mL). La curva standard dovrebbe essere lievemente
convessa verso sinistra quando i risultato vengono
plottati su un asse lineare.
Punti fuori linea per singoli calibratori: Uno o
più calibratori singoli possono dare letture anomale
dell’OD. Uno o entrambi i valori duplicati possono
essere fuori linea e la media dei duplicati può essere
fuori linea. Questo errore è significativo se crea
problemi ad un adattamento soddisfacente della
curva con il metodo logistico a 4 parametri che,
come risultato del valore anomalo, viene allontanato
dagli altri punti del calibratore che sono in realtà
corretti. I punti del calibratore e la curva adattata
devono essere esaminati per verificare l’adattamento
corretto prima di accettare qualunque
calcolo della concentrazione desunto da esso. Una
curva che non si adatta in modo soddisfacente
sarà rivelata anche da un’alta somma di quadrati
residuali. Se è influenzato solo un calibratore, che
non è il più alto, sono possibili due azioni:
i) Un risultato erroneo singolo o duplicato deve
essere eliminato dalla curva e i rimanenti risultati
riadattati con la procedura logistica a 4-parametri.
Se si ottiene un adattamento soddisfacente, i
risultati di concentrazione di previsione possono
essere calcolati a partire da esso.
ii) Se non si può ottenere un adattamento
soddisfacente in questo modo ma la curva è
comunque coerente, i risultati di previsione si
possono ottenere dalle linee diritte tra le medie dei
duplicati, omettendo i punti erronei.
Se sono influenzati due o più calibratori, il test
deve essere ripetuto.
Un risultato deviante per un singolo calibratore
può essere dovuto ad un errore dell’operatore o
ad un deterioramento del calibratore. Se entrambi
i valori duplicati sono coerentemente fuori linea

in test successivi, il calibratore è difettoso e deve
essere tralasciato.
TRACCIABILITÀ DEL VALORE
DEL CALIBRATORE
L’assegnazione del valore MBL è stata realizzata
da ELISA assicurando la tracciabilità rispetto agli
standard interni applicati presso lo Statens Serum
Institut (Danimarca).
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
L’intera gamma delle concentrazioni di MBL nel
siero o nel plasma di donatori umani sani così
come misurata da questo test è da 0 a 7000 µg/
mL. Valori al di sotto di 100 ng/mL possono essere
trovati in genotipi strutturali O/O (dove O = B, C
o D) qualunque sia il genotipo promotore, o in
genotipi strutturali A/O (dove A = di tipo selvatico)
in combinazione con genotipi promotori HY/LX o
LX/LY, o nel genotipo promotore LX/LX. Valori tra
100 ng/mL e 1000 ng/mL possono essere trovati in
genotipi strutturali A/O o in genotipi strutturali LX/
LY o LX/LX. Valori al di sopra di 1000 ng/mL sono
associati con MBL di tipo selvatico (A/A), sebbene
eterozigoti A/D possono occasionalmente raggiungere
questo livello. Il genotipo promotore HY/HY di
solito mostra valori al di sopra di 1500 ng/mL per
MBL di tipo selvatico ma tali valori sono anche
mostrati da altri genotipi promotori in assenza di
alleli strutturali O.
Studi clinici hanno usato valori di cut-off di 50
ng/mL o 100 ng/mL per definire una grave deficienza
di MBL. Valori al di sotto di questi cut-off possono
essere associati, in certi soggetti, con una storia di
accresciuta suscettibilità alle infezioni.
CONTROLLO DELLA QUALITÀ
Laboratori che intendono eseguire test ripetuti
devono fissare i propri sieri di controllo ad alta lettura
(>1000 ng/mL) e a bassa lettura (

MBL Oligomer ELISA Kit
Riproducibilità intertest (fra cicli) (giorni/
operatori diversi): Gli stessi due sieri furono
elaborati in duplicato in 4 diversi test eseguiti da 2
operatori in giorni diversi per stabilire la riproducibilità
tra cicli. Si ottennero i seguenti risultati:
Specificità: Il Western blot di plasma o frazioni di
con l’anticorpo se non quelle attribuibili a MBL.
L’assenza di reazioni incrociate con altri componenti
del plasma è supportata dal fatto che letture non
distinguibili da zero si ottengono da alcuni donatori
RESPONSABILITÀ
Per uso diagnostico in vitro solo in paesi autorizzati.
disponibilità nel vostro paese.
Questo kit è destinato solo alla determinazione
in vitro della lectina legante mannosio nel siero e nel
plasma umano.
Il kit è destinato ad essere usato solo da
di diagnostica.
Se la persona che riceve questo kit, lo passa in
qualunque modo a terzi, queste istruzioni devono
essere allegate, e il suddetto ricevente deve a
proprio rischio rendersi garante nei confronti della
BioPorto Diagnostics A/S per tutti i relativi limiti e
responsabilità.
38
Siero 1 Siero 2
Conc. MBL media 2279 ng/mL 28,4 ng/mL
SD 81,2 1,07
CV 3,6% 3,8%
Siero 1 Siero 2
Conc. MBL media 2310 ng/mL 29,7 ng/mL
SD 212 1,28
CV 9,2% 4,3%
BioPorto Diagnostics A/S non sarà responsabile
per danni o perdite causati dall’uso di questo
kit diverso da quello espressamente dichiarato in
queste istruzioni.
La responsabilità di BioPorto Diagnostics A/S
non andrà in alcun modo oltre il valore commerciale
del kit.
In nessuna circostanza, BioPorto Diagnostics
A/S sarà responsabile per danni indiretti, speciali o
consequenziali compresa, ma non solo, la perdita di

MBL Oligomer ELISA Kit
39
IT

MBL Oligomer ELISA Kit
Revisión: MO2010-07-EN-ES
Le rogamos que lea atentamente estas instrucciones
USO PREVISTO
Para la determinación in vitro
de manano oligomerizada en suero o plasma con
heparina humanos.
IMPORTANCIA CLÍNICA
Determinación de la susceptibilidad ante las
infecciones y, por tanto, de la necesidad de la
administración agresiva de antibióticos en:
• Pacientes con cáncer que reciben o van a recibir
un tratamiento de quimioterapia o inmunodepresión
•
Niños con infecciones recidivantes
Se puede utilizar también como marcador pronóstico
para determinar la gravedad de la enfermedad
en los casos de artritis reumatoide y lupus eritematoso
sistémico.
hidratos de carbono que se produce en el hígado
y se secreta a la sangre, donde constituye un
elemento importante en la defensa inmunitaria
innata ante microorganismos invasores. Sus
formas oligomerizadas habituales se asocian a
cuando la MBL se une a los hidratos de carbono
-
mento mediante la ruta de la MBL o de la lectina 1 .
-
zada puede asociarse a un aumento de la susceptibilidad
ante las infecciones cuando el sistema
inmunitario adaptativo es inmaduro (en la niñez
temprana) 2 o está deprimido (p.ej. tras el transplante
de un órgano o durante la quimioterapia contra el
cáncer) 3
evolución más intensa de las enfermedades autoinmunitarias
como, por ejemplo, el lupus eritematoso
(SLE) 4 o la artritis reumatoide 5 , y con un pronóstico
6 .
40
variantes alélicas en las regiones promotora y/o
estructural del gen MBL 7 . Ciertos alelos promotores
se asocian a concentraciones séricas menores
de MBL, mientras que las variantes estructu-
de la MBL como la síntesis total de la cadena.
Los pacientes homocigóticos para un defecto
estructural presentan niveles muy bajos de MBL
oligomerizada, mientras que los heterocigóticos
muestran niveles bajos/medios. En 100 donantes
de sangre daneses sanos, las concentraciones
de MBL en suero determinadas mediante un
inmunoanálisis selectivo de oligómeros mostraron
valores bajos (

cromógeno. La comparación de los resultados
del análisis con la inmunorreactividad de la MBL
mediante cromatografía de tamaño molecular en
muestras de suero humano individuales sugiere que
el anticuerpo monoclonal empleado es selectivo
para los oligómeros de MBL cuando se utiliza como
anticuerpo, tanto de captura como de detección.
El análisis consiste en un procedimiento en cuatro
etapas:
Etapa 1. Las alícuotas de los calibradores, de
las muestras de suero diluidas y de los controles
necesarios se incuban en los micropocillos recubiertos
previamente con anticuerpo monoclonal contra
la MBL. La MBL presente en las soluciones se unirá
a los pocillos recubiertos con anticuerpo a través de
sus dominios de fijación de hidratos de carbono. El
material no fijado se elimina mediante lavado.
Etapa 2. Se añade a cada pocillo de prueba
un anticuerpo de detección monoclonal biotinilado
y se incuba. El anticuerpo de detección se une
a los oligómeros de MBL fijados a través de los
dominios de fijación de hidratos de carbono que no
estén ocupados por estar unidos al recubrimiento.
El anticuerpo de detección no fijado se elimina
mediante lavado.
Etapa 3. Se añade a cada pocillo de prueba
estreptavidina conjugada con HRP y se deja que
forme un complejo con el anticuerpo biotinilado
fijado. El conjugado no fijado se elimina mediante
lavado.
Etapa 4. Se añade a cada pocillo de prueba un
sustrato cromógeno de la peroxidasa que contiene
tetrametilbenzidina (TMB). La estreptavidina-HRP
fijada reacciona con el sustrato para dar lugar a
un producto coloreado. La reacción enzimática se
detiene químicamente y se lee la intensidad de color
a 450 nm en un lector ELISA. La intensidad de color
(densidad óptica) es función de la concentración
de las formas oligoméricas de MBL añadida inicialmente
a cada pocillo. Los resultados obtenidos
con los calibradores se emplean para construir una
curva de calibración con la que se leen las concentraciones
de MBL en las muestras de prueba.
Plates are precoated with Mannan.
MBL Oligomer ELISA Kit
Mannan The plates are ready for use
Plates Mannan
are precoated with Mannan.
The plates are ready for use 1 hour
PRINCIPIO Plates Plates Mannan
DEL MBL
Mannan
PROCEDIMIENTO are are precoated precoated with with
DE ANÁLISIS ManMannan.nan. Mannan The Mannan The plates plates are are ready ready for for use use
Plates Mannan are precoated with Man-
Anticuerpo anti-MBL
1 hour
Diluted
Plates Mannan are
Plates nan. MBL The are samples
precoated
plates precoated are ready and
with
with calibrators
Man-
Plates nan. The are plates precoated are ready with for for
ManMan-
use use
are Las Plates nan. added placas The are plates están precoated to each recubiertas are ready well with for and Man- useincu
1 hour
Plates nan. The are plates precoated are ready with for Man- use 1 hour
bated con nan. anticuerpo The plates primario are ready contra for MBL
nan. Diluted MBL MBL
use
y están The samples
listas plates para are and
su ready calibrators
uso for use
are added to each well and incu- 1 hour
1 hour
Diluted bated Diluted MBL MBL
samples samples and and calibrators calibrators 1 hour
1 hour 1 hour
B
are are added MBL added Biotinylated MBL
to to each each well MBL well and and antibody incuincu- 1 hour
1 hour
bated Diluted bated Diluted MBL samples and calibrators
BMBL
samples and calibrators 1 hour
Se are Diluted añaden added Biotinylated samples las to each muestras MBL and well calibrators antibody diluidas and incuy
los
Biotinylated are Diluted added samples to each
calibradores bated are a cada pocillo y se incuba
Diluted added samples to detection and well calibrators and
each and well calibrators and antibody incuincu-
is
bated are 1 hour
Diluted Badded
samples to each and well calibrators and incu- 1 hour
added B bated are Biotinylated added Biotinylated to to each detection each MBL well well antibody and antibody and incuincubabated are added Biotinylated to each MBL well antibody and incuis
tedbated 1 hour
bated added B to each well and incuba- 1 hour
B
Biotinylated ted Biotinylated Biotinylated Anticuerpo Biotinilado MBL antibody anti-MBL 1 hour
BBiotinylated
detection detection MBL antibody antibody is is
1 hour
B
added added Biotinylated MBL antibody 1 hour
BBiotinylated
to to each each well well MBL and and antibody incubaincuba- 1 hour 1 hour
Se Biotinylated Bañade
Biotinylated a cada detection pocillo MBL antibody Anticuerpo antibody is de
ted Biotinylated ted
Detección Biotinylated Streptavidin detection
added Biotinilado MBL - y HRP antibody
se antibody is 1 hour
incuba
added Biotinylated
Biotinylated Streptavidin to to each each
detection
detection well well - HRP and and
antibody
antibody incubaincuba- is
is
added ted Biotinylated to each detection well and antibody incubais
1 hour
HRP-conjugated added ted Biotinylated to each detection well
added ted Streptavidin Estreptavidina-HRP
to each well - HRP
streptavidin and antibody incubais
is 1 hour
added ted HRP-conjugated streptavidin and incubais
added
Streptavidin to
added ted to to each
each each well -
well well
HRP and
and and incubaincubaincuba1
hour
ted
1 hour
ted Se HRP-conjugated añade Streptavidin Estreptavidina - streptavidin HRP conjugada is con
HRP-conjugated ted Streptavidin - streptavidin HRP is 1 hour
1 hour
HRP added Streptavidin a cada to each pocillo well y - se HRP and incuba
added Streptavidin to each well - HRP and incubaincuba- 1 hour
1 hour
ted HRP-conjugated ted HRP-conjugated Streptavidin - streptavidin HRP is
Streptavidin - streptavidin HRP is 15 min. 15 min.
added HRP-conjugated S
added S HRP-conjugated TMB Sustrato to to each each Substrate
TMB well well
streptavidin
streptavidin and and incubaincuba- is
is
added ted added ted HRP-conjugated to each well streptavidin and incubais
15 min.
HRP-conjugated to each well streptavidin and incubais
15 min.
Se S
S added tedañade
TMB to el each Substrate sustrato well a and cada incuba- pocillo. Se
S Substrate S added ted TMB to each Substrate is added to each well.
S
well and incuba-
S Substrate revela ted Develop durante is
for 15 added
15 minutos to
minutes protegido each well.
in the de 15 min.
S ted
15 min.
Develop la Sluz
S TMB Substrate
S Substrate dark for is added 15 minutes to each well. in the
S
S
15 min.
S TMB Substrate
S Substrate is added to each well. 15 min.
dark S Develop TMB Solución for Substrate 15 S
S Develop TMB for Substrate 15 de minutes Parada minutes in in the the 15 min.
S
15 min.
S
S
S Substrate darkTMB
Substrate is added to each well.
S
S
S Substrate darkTMB
Substrate is added to each well.
S
S S Se Develop Substrate añade Stop solution for Solución is added 15 minutes de to Parada each in well. a the cada
S
S Substrate Develop for is added 15 minutes to each in well. the
S
pocillo. Leer la placa tras 30 min.
S Develop S S Substrate dark for is added 15 minutes to each in well. the
S
S S Substrate Develop darkStop
for solution is added 15 minutes to each in well. the
Develop Stop darkStop
Solution solution for 15 is minutes added to in each the
S Develop dark
S Se Stop obtienen solution for 15 resultados minutes cuantitativos in the
dark midiendo well. dark Read las plate absor-bancias within 30 min.
Stop de los pocillos
Stop Stop Solution
a Solution 450 solution is added to each
Stop solution nm is added to each
well.
Stop
well. Quantitative Stop Stop Read
Solution
Read solution solution plate plate
is added
results within within
to
are 30 obtained 30
each
min. min.
well. Read plate within 30 min.
Stop Stop by measuring Stop Solution solution the is added absorbances to each
Stop Solution solution is added to each of
Quantitative Stop well. Quantitative
Stop well. Quantitative the wells Read Read
Solution
Solution at plate plate 450 results results is
is within nm within
added
added
are are 30 are 30
obtained obtained to
to min. min. obtained each
each
by Stop by well. measuring Read Solution plate the is within added absorbances 30 to min.
Stop by well. measuring Read Solution plate the is the within added absorbances 30 to min. each each of of of
the well. Quantitative the wells Read at plate 450 results nm within are 30 obtained
well. Quantitative wells Read at at plate 450 results 450 nm within nmare
30 obtained min. min. Total assay 41 time less
by Quantitative
by Quantitative measuring measuring
results
results the the absorbances absorbances
are
are
obtained
obtained of of than 4 hours
the by Quantitative the measuring wells wells at at 450 450 results the nm nmabsorbances
are obtained Total of assay time less
B B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B
B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
ES

MBL Oligomer ELISA Kit
COMPONENTES DEL KIT
Elemento Contenido Cantidad
1
12 x 8 Micropocillos
recubiertos + Estructura
96 pocillos
2 Tampón de dilución 1 x 60 mL
3a - 3h Calibrador MBL 1-8 8 x 1 mL
4
Solución de lavado
concentrada 25x
1 x 30 mL
5
Anticuerpo biotinilado
anti-MBL
1 x 12 mL
6 Estreptavidina-HRP 1 x 12 mL
7 Sustrato TMB 1 x 12 mL
8 Solución de parada 1 x 16 mL
Nota: los reactivos líquidos contienen los conservantes azida
sódica, timerosal o Bronidox L. Estos compuestos pueden
resultar nocivos por ingestión.
MATERIALES NECESARIOS NO INCLUIDOS
1. Micropipetas ajustables que cubran un
intervalo de 1-1000 µL y las correspondientes
puntas de pipeta desechables
2. Tubos de polipropileno con capacidad de hasta
1000 µL
3. Gradillas para tubos
4. Micropipeta de 8 ó 12 canales ajustables
(intervalo 50-250 µL) o micropipetas de repetición
(opcional)
5. Probeta graduada de 1 L limpia
6. Agua desionizada o destilada
7. Cubierta para microplacas
8. Envase limpio para la Solución de lavado
diluida
9. Aparato para el llenado de los pocillos durante
el procedimiento de lavado (opcional)
10. Toallitas de papel sin pelusa o papel absorbente
11. Recipientes para pipetas desechables
12. Cronómetro (intervalo de 60 minutos)
13. Lector de placas ELISA calibrado, capaz de
leer a 450 nm (preferiblemente con capacidad
42
para restar valores de referencia a 650 ó 620
nm)
14. Hipoclorito sódico (lejía doméstica diluida
1:10) para la descontaminación de muestras,
reactivos y materiales
PRECAUCIONES
Sólo para diagnóstico in vitro
1. Este kit sólo debe ser utilizado por personal de
laboratorio cualificado.
2. Los calibradores MBL se prepararon a partir
de MBL purificada de plasma humano. Se
analizó cada unidad de sangre empleada en su
preparación mediante métodos aprobados y
se comprobó que no mostró reactividad ante el
antígeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB)
y ante los anticuerpos contra el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) 1 y 2 y el virus
de la hepatitis C (VHC). Además, el producto
se sometió a procedimientos de desactivación
vírica. No obstante, dado que ningún método
de prueba puede descartar con total seguridad
la presencia de agentes infecciosos, las
muestras de los calibradores y de los pacientes
deben manipularse con un nivel de seguridad
biológica 2, según las recomendaciones
para la manipulación de muestras de suero o
sangre humanos potencialmente infecciosas,
descritas en el manual del CDC/NIH “Biosafety
In Microbiology and Biomedical Laboratories”
(seguridad biológica en laboratorios microbiológicos
y biomédicos) de 1999. Las soluciones
que contengan suero humano deben tratarse
como material potencialmente infeccioso y
manipularse adecuadamente.
3. Utilice puntas de pipeta nuevas para cada
muestra, calibrador y reactivo, para evitar la
contaminación cruzada.
4. Utilice depósitos separados para cada
reactivo, en especial para el Sustrato TMB.
5. Una vez utilizados, descontamine todos los
materiales que hayan entrado en contacto con
las muestras y los reactivos sumergiéndolos
durante al menos 30 minutos en una solución de
hipoclorito sódico (lejía doméstica diluida 1:10).

6. Aspire la solución de lavado en un frasco que
contenga lejía para evitar la formación de gotas
durante el lavado.
7. Evite su emisión al medio ambiente. Deseche
los recipientes y el contenido no utilizado
de forma segura y de conformidad con la
normativa nacional y local.
8. Los reactivos incluidos en este kit se conservan
con hasta un 0,05% de azida sódica, 0,038%
de timerosal, también denominado tiomersal
o mertiolato, o 0,2% de Bronidox L. Estos
compuestos pueden resultar tóxicos por
ingestión.
9. La Solución de parada contiene ácido sulfúrico
0,5 mol/L y puede causar irritación o quemaduras
dérmicas u oculares. En caso de contacto,
aclare inmediatamente con agua abundante y
consulte a un médico.
10. No intercambie componentes procedentes
de kits con números de lote distintos. Los
componentes se han estandarizado como una
unidad para un lote dado.
11. Las muestras hemolizadas o hiperlipidémicas
pueden dar lugar a resultados erróneos.
12. No diluya las muestras de suero o plasma
directamente en los micropocillos.
13. No toque ni rasque el fondo de los micropocillos
al pipetear o aspirar el líquido.
14. Tiempos y temperaturas de incubación diferentes
a los especificados pueden conducir a
resultados erróneos.
15. Una vez comenzado el análisis, no se debe
dejar que los pocillos se sequen.
16. El Sustrato TMB es sensible a la luz. Manténgalo
apartado de la luz brillante.
17. No reutilice los micropocillos ni vierta
nuevamente los reactivos en sus frascos una
vez administrados.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO
1. Conserve el kit con todos los reactivos a 2-8°C.
No los congele.
2. Utilice todos los reactivos antes de la fecha
de caducidad indicada en las etiquetas de los
viales.
MBL Oligomer ELISA Kit
3. La Solución de lavado diluida permanece
estable durante 4 semanas a 2-8°C. Si no
se van a emplear todos los pocillos, diluya
únicamente la parte de Solución de lavado
concentrada necesaria.
4. Para su uso posterior, almacene los pocillos
no utilizados en la bolsa de aluminio con el
desecante suministrado y séllela nuevamente.
Deje que la bolsa de aluminio se estabilice a
temperatura ambiente antes de abrirla, para
evitar la condensación en o sobre los micropocillos
recubiertos.
OBTENCIÓN DE MUESTRAS
Manipule y deseche todas las muestras
de sangre, suero o plasma como si fueran
potencialmente infecciosas. Consulte la sección
Precauciones, apartados 2, 3, 5, 6 y 7.
La determinación de MBL en una única muestra
precisa 5-50 µL de suero o plasma. Solo el personal
cualificado debe recoger las muestras de sangre
asépticamente en un tubo vacío o con heparina,
mediante técnicas de venopunción aprobadas.
El suero o el plasma deben prepararse mediante
técnicas estándar para pruebas clínicas de laboratorio.
Tape las muestras y consérvelas a 2-8°C si se
va a realizar el análisis antes de 24 horas. En caso
de que el análisis no se pueda realizar antes de 24
horas o si es necesario enviar la muestra, tápela y
manténgala congelada a una temperatura inferior a
−20°C. Evite congelar y descongelar las muestras
repetidamente. No utilice muestras hemolizadas,
hiperlipidémicas, sometidas a tratamiento térmico
o contaminadas.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS Y MUESTRAS
1. Deje que todas las muestras y los reactivos
alcancen temperatura ambiente (20-25°C).
Mezcle bien las muestras invirtiendo los tubos
suavemente y, si es necesario, elimine las
partículas visibles mediante centrifugación a
baja velocidad.
2. Determine el número de muestras a analizar
(por duplicado), el número de muestras de
control interno del laboratorio (por duplicado) y
43
ES

MBL Oligomer ELISA Kit
el número de pocillos para blanco de reactivo.
Los pocillos previamente recubiertos pueden
usarse en tiras de ocho o de manera individual.
Para manipular los pocillos de uno en
uno es preciso separarlos y colocar cada uno
de ellos sobre la estructura, en la posición
adecuada. Se pueden identificar mediante
letras y muescas. Añada 16 pocillos para los 8
calibradores (por duplicado). Tome el número
de micropocillos necesarios y guarde el resto
en la bolsa de aluminio con desecante, conservándolos
a 2-8°C.
3. Solución de lavado: Diluya la Solución de
lavado concentrada 25x vertiendo todo el
contenido del frasco (30 mL) en una probeta
graduada de 1 L y añada agua destilada o
desionizada hasta un volumen final de 750 mL.
Mezcle bien y conserve la solución a 2-8°C una
vez utilizada.
4. Tampón de dilución: Listo para su uso, no
precisa dilución adicional.
5. Calibradores MBL: Listos para su uso. Las
concentraciones asignadas se indican en sus
etiquetas. No precisan dilución adicional.
6. Anticuerpo biotinilado anti-MBL: Listo para su
uso, no precisa dilución adicional.
7. Estreptavidina-HRP conjugada: Lista para su
uso, no precisa dilución adicional.
8. Sustrato TMB: Listo para su uso, no precisa
dilución adicional.
9. Solución de parada: Lista para su uso, no
precisa dilución adicional.
10. Muestras de pacientes: Diluya cada muestra
en una proporción registrada con Tampón
de dilución para obtener al menos 250 µL de
solución diluida que se pueda distribuir en
pocillos duplicados a 100 µL por pocillo. Para
la mayor parte de las muestras, se sugiere
realizar una prueba de detección inicial con
una dilución de 1/100 (p.ej. 5 µL de suero +
495 µL de Tampón de dilución, mezclados por
inversión de los tubos o agitando lentamente
con ayuda de un mezclador vorticial), repitiendo
a continuación el ensayo con las muestras
que se encuentren fuera del intervalo con una
44
dilución menor o mayor, según proceda. No
deben emplearse diluciones inferiores a 1/10.
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
1. Prepare el protocolo del análisis, asignando los
pocillos apropiados para disponer los calibradores,
las muestras de pacientes diluidas y
cualquier control interno del laboratorio por
duplicado. En caso de que el lector ELISA no
cuente con una longitud de onda de referencia
de 650 ó 620 nm, puede asignarse un pocillo
de blanco de reactivo. A éste se le añaden 100
µL de Tampón de dilución en lugar de suero o
plasma diluido y se procesa de igual forma que
el resto de los pocillos.
2. Pipetee volúmenes de 100 μL de cada calibrador,
de las muestras diluidas y de cualquier
control interno del laboratorio en las posiciones
correspondientes de las tiras de micropocillos.
Cubra los pocillos e incube durante 60 minutos
a temperatura ambiente en una plataforma de
agitación fijada a 200/minuto.
3. Aspire el contenido de los micropocillos y
lávelos tres veces con al menos 300 μL de
Solución de lavado diluida. Si el lavado se
realiza de forma manual, vacíe los micropocillos
invirtiéndolos y agitándolos suavemente
sobre un recipiente adecuado, dejándolos
reposar en posición invertida sobre una toallita
de papel. Se recomienda un tiempo de reposo
de 1 minuto antes del vaciado, al menos
durante el último lavado del ciclo. La fuerza
con la que se añade o se retira la Solución de
lavado de los pocillos influye en el color final
alcanzado. El pipeteo manual, que puede ser
muy suave y conducir a una elevada formación
de color, sólo se recomienda en ausencia de
alternativas como el llenado de los pocillos por
inmersión, el uso de un dispensador de lavado
manual multicanal o el uso de un aparato de
lavado automático.
4. Añada 100 μL de Anticuerpo biotinilado
anti-MBL (listo para su uso) a cada micropocillo.
Puede emplearse una micropipeta multicanal
o de repetición. Cubra los pocillos e incube

durante 60 minutos a temperatura ambiente en
una plataforma de agitación (200/minuto).
5. Realice el lavado según lo descrito anteriormente
en la etapa 3.
6. Añada 100 μL de Estreptavidina-HRP
conjugada (lista para su uso) a cada micropocillo.
Puede emplearse una micropipeta multicanal
o de repetición. Cubra los pocillos e incube
durante 60 minutos a temperatura ambiente en
una plataforma de agitación (200/minuto).
7. Realice el lavado según lo descrito anteriormente
en la etapa 3.
8. Añada 100 μL de Sustrato TMB (listo para
su uso) a cada micropocillo. Se recomienda
utilizar una micropipeta multicanal para reducir
el tiempo de pipeteo. Cubra los pocillos e
incúbelos durante 15 minutos exactamente
a temperatura ambiente protegidos de la luz.
Ponga en marcha el cronómetro al llenar el
primer pocillo.
9. Añada 100 µL de Solución de parada (lista para
su uso) a cada pocillo, manteniendo la misma
secuencia y ritmo de pipeteo que en la etapa
7. Mezcle el contenido agitando suavemente
durante 20 segundos, evitando las salpicaduras.
Lea los pocillos pasados 30 minutos.
10. Lea las absorbancias de los pocillos a 450 nm
en un lector de microplacas adecuado (longitud
de onda de referencia 650 ó 620 nm). Si no se
dispone de una longitud de onda de referencia,
el valor del pocillo de blanco de reactivo se
resta de cada uno de los demás valores antes
de realizar cálculos posteriores.
RESUMEN ESQUEMÁTICO
Incubar
1 h a TA
Incubar
1 h a TA
Incubar
1 h a TA
MBL Oligomer ELISA Kit
100 μL Calibrator o muestra diluida
Lavar x 3
100 μL Anticuerpo Biotinilado anti-MBL
Incubar
15 min a TA
prot. de la luz
Dejar que reactivos alcancen TA
Diluir las muestras
100 μL Estreptavidina-HRP
100 μL Sustrato TMB
100 μL Solución de Parada
Leer a 450 nm
Lavar x 3
Lavar x 3
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
El principio básico consiste en construir una curva
de calibración representando la media de los valores
duplicados de la absorbancia para cada calibrador
MBL en el eje y, en función de las correspondientes
45
ES

MBL Oligomer ELISA Kit
concentraciones de MBL en ng/mL en el eje x. La
curva de calibración debe cumplir los requisitos de
validación. Posteriormente se calcula la concentración
de MBL de cada muestra de suero diluida
localizando el punto sobre la curva correspondiente
a la media de los valores duplicados de la absorbancia
para la muestra de suero diluida y leyendo en el
eje x su concentración correspondiente en ng/mL.
La concentración de MBL en la muestra de suero
sin diluir se calcula multiplicando este resultado por
el factor de dilución de la muestra.
Este procedimiento puede realizarse de forma
manual empleando un papel gráfico con escalas x
e y lineales. Puede dibujarse una curva suavizada
a través de los puntos o se pueden unir puntos
adyacentes mediante líneas rectas. Es posible que
este último procedimiento estime por exceso los
valores de concentración entre los puntos cuando
la curva sea ligeramente convexa hacia la izquierda,
lo que ocurre habitualmente. Aunque la curva puede
aproximarse a una línea recta, resulta incorrecto,
tanto desde el punto de vista práctico como teórico,
calcular y dibujar la línea recta que mejor se ajuste y
leer los resultados a partir de la misma.
De igual modo, el procedimiento puede
realizarse con ayuda de un programa de software
incluido en el lector ELISA, que incorpore procedimientos
de ajuste de curvas. Debe elegirse el
procedimiento que emplee ejes x e y lineales con un
ajuste de curva logística de 4 parámetros.
Las muestras diluidas que proporcionen un
valor medio de la absorbancia superior al correspondiente
al calibrador MBL 40 ng/mL o inferior
al correspondiente al calibrador MBL 0,5 ng/mL
se encuentran fuera del intervalo del ensayo y sus
concentraciones han de indicarse como >40 ng/
mL y (40 x factor de dilución) ng/mL y
1,5. La absorbancia media de cualquier
calibrador MLB debe ser superior a la del calibrador
MBL anterior, p.ej., absorbancia (10 ng/mL MBL) >
absorbancia (5 ng/mL). La curva debe ser ligeramente
convexa por la izquierda si los resultados se
presentan en ejes lineales.
Puntos desalineados para calibradores individuales:
Es posible que uno o más calibradores
individuales produzcan unas lecturas de absorbancia
anómalas. Uno o ambos valores duplicados pueden
estar desalineados y es posible que la media de los
duplicados se encuentre desalineada. Este error es
significativo siempre que perjudique el ajuste satisfactorio
de la curva mediante el método logístico de 4
parámetros que, como resultado del valor anómalo,
se desplaza de otros puntos de calibradores que son
realmente correctos. Deben examinase siempre los
puntos de los calibradores y la curva ajustada para
comprobar que el ajuste es correcto, antes de aceptar
cualquier cálculo de concentración obtenido a partir
de estos. Asimismo, un valor elevado de la suma de
cuadrados residuales pondrá de manifiesto una curva
mal ajustada. En caso de que sólo un calibrador se
vea afectado, siempre que no sea el calibrador más
alto, existen dos opciones:
i) Puede eliminarse de la curva un resultado
simple o duplicado erróneo y ajustarse de nuevo el
resto de los resultados mediante el procedimiento
logístico de 4 parámetros. Si se obtiene una curva
satisfactoria, es posible calcular resultados de
concentración provisionales a partir de la misma.
ii) Si no se puede obtener un ajuste satisfactorio
de esta forma, pero la curva parece coherente por
lo demás, pueden obtenerse resultados provisionales
mediante líneas rectas entre la media de los
duplicados, omitiendo el punto erróneo.
En caso de que dos o más calibradores se vean
afectados, debe repetirse el análisis.

Un resultado desviado para un calibrador
individual puede deberse a un error del investigador
o al deterioro del calibrador. Si ambos
valores duplicados se encuentran constantemente
desalineados en análisis sucesivos, el calibrador es
defectuoso y debe omitirse.
TRAZABILIDAD DEL VALOR DEL CALIBRADOR
Se asignó el valor de MBL mediante ELISA,
asegurando su trazabilidad por normas internas en
el Statens Serum Institut (Dinamarca).
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
El intervalo completo de concentraciones de
MBL en suero o plasma procedente de donantes
humanos sanos medido según este análisis
y análisis análogos es de 0 a 7000 ng/mL. Es
posible encontrar valores inferiores a 100 ng/mL
en genotipos estructurales O/O (donde O = B, C
o D) independientemente del genotipo promotor,
o en genotipos estructurales A/O (donde A = tipo
salvaje) combinados con genotipos promotores HY/
LX o LX/LY, o en el genotipo promotor LX/LX. Se
pueden encontrar valores entre 100 ng/mL y 1000
ng/mL en los genotipos estructurales A/O o en los
genotipos promotores LX/LY o LX/LX. Los valores
superiores a 1000 ng/mL se asocian al tipo salvaje
de MBL (A/A), mientras que los heterocigotos A/D
pueden alcanzar este nivel ocasionalmente. El
genotipo promotor HY/HY normalmente muestra
valores superiores a 1500 ng/mL para MBL de tipo
salvaje, pero otros genotipos promotores también
presentan estos valores en ausencia de alelos
estructurales O.
En los estudios clínicos se han empleado
valores discriminatorios de 50 ng/mL ó 100 ng/mL
para definir la deficiencia grave de MBL. Los valores
inferiores a estos valores discriminatorios pueden
asociarse, en algunos casos, a una historia de
mayor susceptibilidad ante las infecciones.
CONTROL DE CALIDAD
Los laboratorios que pretendan realizar análisis
repetidos deben establecer sus propios sueros de
control de lectura alta (>1000 ng/mL) y de lectura
MBL Oligomer ELISA Kit
baja (

MBL Oligomer ELISA Kit
de MBL que produjo una lectura de absorbancia
superior a 2 DT por encima de la lectura media del
cero del calibrador (n=8) fue 0,02 ng/mL, correspondiente
a una concentración de suero de 2 ng/mL en
una muestra diluida 1/100.
Reproducibilidad intraanálisis (dentro del
análisis): Se analizaron dos sueros con 10 repeticiones
para determinar la reproducibilidad dentro
del análisis. Se obtuvieron los siguientes resultados
Reproducibilidad interanálisis (entre análisis,
distintos días/investigadores): Se analizaron los
mismos dos sueros por duplicado en cuatro análisis
distintos realizados por dos investigadores en días
diferentes para determinar la reproducibilidad entre
análisis. Se obtuvieron los siguientes resultados:
Especificidad:
reaccionen con el anticuerpo, aparte de las atribuibles
a la MBL, mediante Western blot del plasma o
de fracciones de plasma. La ausencia de reacción
cruzada con otros componentes del plasma se ve
respaldada por el hecho de que se obtienen lecturas
no distinguibles de cero a partir de muestras de
48
Suero 1 Suero 2
Con. MBL media 2279 ng/mL 28,4 ng/mL
DT 81,2 1,07
CV 3,6% 3,8%
Suero 1 Suero 2
Con. MBL media 2310 ng/mL 29,7 ng/mL
DT 212 1,28
CV 9,2% 4,3%
RESPONSABILIDAD
Destinado únicamente para el uso diagnóstico in
vitro en determinados países. Visite www.bioporto.
com para consultar la disponibilidad en su país.
Este kit está pensado únicamente para la
determinación cuantitativa in vitro
de manano en suero o plasma humanos.
El kit sólo está pensado para su uso por parte
investigación y diagnóstico.
cualquier forma a un tercero, deberá adjuntar estas
instrucciones, y dicho receptor debe por su cuenta
y riesgo garantizar, en favor de BioPorto Diagnostics
A/S, todas las limitaciones de responsabilidad
respecto al mismo.
BioPorto Diagnostics A/S no será responsable
de ningún daño o pérdida debidos al uso de este kit
de forma diferente a la indicada expresamente en
estas instrucciones.
La responsabilidad de BioPorto Diagnostics
A/S no excederá en ningún caso el valor comercial
del kit.
BioPorto Diagnostics A/S no será responsable
bajo ninguna circunstancia de los daños indirectos,
especiales o resultantes incluyendo, sin limitación,

MBL Oligomer ELISA Kit
49
ES

MBL Oligomer ELISA Kit
Revision: MO2010-07-EN-DA
Læs venligst disse instruktioner omhyggeligt
TILSIGTET ANVENDELSE
Til bestemmelse af oligomeriseret mannanbindende
lektin i humant serum eller heparinplasma.
KLINISK BETYDNING
Bestemmelse af modtagelighed over for infektioner,
og derfor et muligt behov for aggressiv indgivelse af
antibiotika hos:
• Patienter, der modtager eller skal til at modtage
cancer kemoterapi eller immunosuppresiv
behandling
•
Børn med tilbagevendende infektioner
Kan også anvendes som prognostisk markør for
sygdomsalvor ved reumatoid artritis og systemisk
lupus erythematosus.
Mannan-bindende lektin (MBL; også kaldet
mannose-bindende lektin eller protein) er et
multimerisk kulhydrat-bindende protein, der
produceres i leveren og udskilles i blodet, hvor det
udgør et vigtigt element i det medfødte immunforsvar
mod invaderende mikroorganismer. Dets
normalt oligomeriserede former er associeret med
aktiveres når MBL binder til mikrobielle kulhydrato-
eller lektinpathway’en 1 .
Mangel på normalt oligomeriseret MBL kan
være associeret med øget modtagelighed for
infektioner, når det adaptive immunsystem er
umodent (i tidlig barndom) 2 eller er blevet supprimeret
(f.eks. efter organtransplantation eller under
cancer-kemoterapi) 3 . Mangel associeres også med
et mere alvorligt forløb af autoimmune sydomme
såsom systemisk lupus erythematosus (SLE) 4 eller
reumatoid artritis 5 , og med en dårligere prognose i
6 .
MBL-mangel kan skyldes alleliske varianter
i promotor og/eller strukturelle regioner af
MBL-genet 7 . Visse promotor-alleler er associeret
med lavere serumkoncentrationer af MBL, mens
de strukturelle varianter svækker såvel normal
50
oligomerisation af MBL som total kædesyntese.
Personer, der er homozygote for en strukturel
defekt, viser meget lave niveauer af oligomeriseret
MBL, mens heterozygoter viser lave til mellemhøje
niveauer. Hos 100 sunde danske bloddonorer
viste serum MBL-koncentrationer, bestemt med
en oligomer-selektiv immunanalyse, lave værdier
kombinationer af strukturelle og/eller promotoralleler
7 . Dette tyder på udbredelsen i en vestlig
befolkning af lave niveauer af MBL, der kan føre til
kliniske manifestationer. Det vides imidlertid ikke,
hvorfor kun nogle individer med lave MBL-niveauer
viser øget modtagelighed for infektion. De mulige
forklaringer omfatter tilfældige forskelle i eksponering
eller at det er en forudsætning, at der samtidig
eksisterer en anden, muligvis subtil, immundefekt.
Bestemmelse af MBL-koncentrationen i
serum kan være nyttig til belysning af formodede
immundefekter og som prognostisk indikator, der
gør opmærksom på behovet for øgede terapeutiske
eller profylaktiske foranstaltninger hos immunosupprimerede
patienter, deriblandt patienter, der
modtager cancer-kemoterapi, samt patienter med
PRINCIPPET I ASSAY PROCEDUREN
Assay’et er en ELISA, der udføres i mikrotiterbrønde
coatet med et monoklonalt antistof imod det
MBL-kulhydrat-bindende domæne. Bundet MBL
detekteres med det samme antistof, som er blevet
mærket med biotin, efterfulgt af fremkaldelse med
peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret streptavidin
og inkubation med et kromogent substrat.
Sammenligning af analyseresultaterne med
-
aktivitet i individuelle humanserumprøver viser,
at det anvendte monoklonale antistof er selektivt
for MBL-oligomerer, når det anvendes både som
capture- og detektionsantistof. Analysen er en
Trin 1. Alikvoter af kalibratorer, fortyndede
serumprøver og eventuelle kontroller inkuberes
i mikrotiterbrønde, som i forvejen er coatet med
monoklonalt antistof imod MBL. MBL tilstede i

opløsningerne vil binde sig til de antistofbelagte
brønde via dets kulhydratbindende domæner.
Ubundet materiale fjernes ved vask.
Trin 2. Biotinyleret monoklonalt detektionsantistof
tilsættes til hver testbrønd og inkuberes.
Detektionsantistoffet fæstner sig til bundne
MBL-oligomerer via de kulhydratbindende
domæner, som ikke er optaget ved at være bundet
ned til belægningen. Ubundet detektionsantistof
fjernes ved vask.
Trin 3. HRP-konjugeret streptavidin tilsættes til
hver testbrønd og får lov til at danne et kompleks
med det bundne biotinylerede antistof. Ubundet
konjugat fjernes ved vask.
Trin 4. Et kromogent peroxidase-substrat
indeholdende tetrametylbenzidin (TMB) tilsættes
til hver testbrønd. Det bundne HRP-streptavidin
reagerer med substratet og danner et farvet
produkt. Den enzymatiske reaktion standses
kemisk, og farveintensiteten aflæses ved 450 nm i
en ELISA-læser. Farveintensiteten (optisk densitet)
er en funktion af koncentrationen af det oligomeriserede
MBL, der oprindeligt blev tilsat til hver
brønd. Resultaterne for kalibratorerne anvendes til
at konstruere en kalibrationskurve, hvorfra koncentrationerne
af MBL i prøverne aflæses.
Plates are precoated with Mannan.
MBL Oligomer ELISA Kit
Mannan The plates are ready for use
Plates Mannan
Mannan are precoated with Mannan.
The plates are ready for use
1 hour
Plates Mannan are precoated with Man-
PRINCIPPET Plates I ASSAY Mannan MBL are PROCEDUREN
precoated with Mannan.
Mannan The plates are ready for use
nan. Mannan The plates are ready for use
Plates Mannan are precoated with Man-
MBL-antistof
1 hour
Diluted
Plates
Plates nan.
Mannan are
MBL The are samples
precoated
plates precoated are ready and
with
with calibrators
Man-
for Man- use
Plates nan. The are plates precoated are ready with for Man- use
are Pladerne Plates nan. added The are på plates precoated to forhånd each are ready coatet well with for and med Man- useincu
pri- 1 hour
Plates nan. The are plates precoated are ready with for Man- use 1 hour
batedmært Diluted nan. MBL The MBL-antistof. samples plates are and Pladerne ready calibrators for er use klar til
nan. MBL brug. The plates are ready for use
are added to each well and incu- 1 hour
1 hour
Diluted MBL samples and calibrators 1 hour
Diluted
bated MBL samples and calibrators 1 hour 1 hour
B are added MBL MBL to each well and incu- 1 hour
are added MBL Biotinylated to each well MBL and antibody incu- 1 hour
bated Diluted MBL samples and calibrators
bated Diluted 1 hour
B
Fortyndede are
MBL samples and calibrators
Diluted added Biotinylated samples to prøver each MBL and og well kalibratorer calibrators antibody and incutil- Biotinylated are Diluted added samples to each
sættesbated are Diluted added hver samples to brønd detection and well calibrators and
each og and well inkuberes. calibrators and antibody incuincu-
is 1 hour
bated are Diluted Badded
samples to each and well calibrators and incu- 1 hour
added B bated are Biotinylated added Biotinylated to to each detection each MBL well well antibody and antibody and incuincubabated is
are added Biotinylated to each MBL well antibody and incutedbated
added 1 hour
B to each well and incubabated
1 hour
B Biotinylated Biotinylated
B Biotinyleret detection MBL MBL Antistof antibody is 1 hour
Biotinylated
ted Biotinylated detection MBL antibody is 1 hour
B added Biotinylated to each well MBL and antibody incuba- 1 hour
added BBiotinylated
to each well MBL and antibody incuba- 1 hour 1 hour
Biotinyleret ted Biotinylated B Biotinylated detektionsantistof detection MBL antibody tilsættes is
ted Biotinylated 1 hour
hver added
Biotinylated
Biotinylated brønd Streptavidin detection
to og each detection inkuberes well
MBL - HRP antibody
and
antibody is
antibody incuba-
added
is
Biotinylated Streptavidin to each detection well - HRP and antibody incubais
added ted Biotinylated to each detection well and antibody incubais
1 hour
HRP-conjugated added ted Biotinylated to each detection well
added ted HRP-conjugated Streptavidin HRP-Streptavidin
to each well - streptavidin HRP streptavidin and antibody incubais
and incubais
is 1 hour
added ted
added
Streptavidin to
added ted to each
each well -
well well
HRP and
and and incubaincubaincuba1
hour
ted
1 hour
ted HRP-konjugeret HRP-conjugated Streptavidin streptavidin - streptavidin HRP tilsættes is 1 hour
HRP-conjugated ted Streptavidin - streptavidin HRP is 1 hour
hver added brønd Streptavidin to og each inkuberes. well - HRP and incuba- 1 hour
added Streptavidin to each well - HRP and incuba- 1 hour
ted HRP-conjugated Streptavidin - streptavidin HRP is
ted HRP-conjugated 15 min.
added
Streptavidin
HRP-conjugated S TMB to each well
- streptavidin HRP is 15 min.
streptavidin and incuba-
added S
is
HRP-conjugated TMB to substrat each Substrate well streptavidin and incubais
added ted HRP-conjugated to each well streptavidin and incubais
15 min.
added ted HRP-conjugated to each well streptavidin and incubais
15 min.
S
S Substrat added ted TMB to tilsættes each Substrate well hver and brønd. incuba- Reagerer
S Substrate S is added to each well.
added ted TMB to each Substrate
S
well and incuba-
S Substrate 15 ted Develop minutter for i is mørke. 15
added
minutes
to each
in the
well. 15 min.
S ted
15 min.
S
S Develop TMB Substrate
S Substrate dark for is added 15 minutes to each well. in the
S
S
15 min.
S TMB Substrate
S Substrate is added to each well. 15 min.
S dark Develop TMB for Substrate 15 minutes in the
S
S
15 min.
Develop TMB Stopopløsning for Substrate 15 minutes in the
S
15 min.
S
S
S Substrate darkTMB
Substrate is added to each well.
S
S
S Substrate dark
S
S S Stopopløsningen Develop
TMB
Substrate Stop solution for
Substrate is added to each well.
is added 15 tilsættes minutes to each til hver in well. the brønd.
S
S Substrate Develop for is added 15 minutes to each in well. the
S
S Pladen Develop aflæses inden for 30 min.
S S Substrate dark for is added 15 minutes to each in well. the
S
S S Substrate Develop darkStop
for solution is added 15 minutes to each in well. the
Develop Stop darkStop
Solution solution for 15 is minutes added to in each the
S Develop dark
S Kvantitative Stop solution for resultater 15 minutes opnås in the ved at
well. dark Read plate within 30 min.
Stop dark måle prøvens absorbans ved 450 nm
Stop Stop Solution solution is is added added to to each each
Stop solution
well.
Stop
well. Quantitative Stop Read
Solution
Read solution plate
is added
results within within
to
are 30 obtained 30
each
min. min.
well. Stop Read solution plate within 30 min.
Stop by measuring Stop Solution solution the is added absorbances to each
Stop of
Stop well.
Stop Solution
Quantitative the wells Read
solution is added to each
Quantitative Solution at plate 450 results is nm within added are 30 obtained to min. each
Stop well. Quantitative Read Solution plate results results is within added are 30 are obtained to min. obtained each
by Stop by well. measuring Read Solution plate the is within added absorbances 30 to min. each of
Stop by well. measuring Read
well. Quantitative
Solution plate the
the wells Read at plate 450 results
is the within added absorbances 30
nm within are 30 obtained
to min. each of of
the min. Total assay 51 time less
well. Quantitative wells
by Quantitative measuring
Read at at plate 450 results 450 nm
results the
within nmare
absorbances
30 obtained min.
are obtained of
by Quantitative measuring results the absorbances are obtained of than 4 hours
by Quantitative the measuring wells at 450 results the nmabsorbances
are obtained Total of assay time less
B B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B
B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
DA

MBL Oligomer ELISA Kit
KITKOMPONENTER
Enhed Indhold Antal
1
12 x 8 coatede mikrotiterbrønde
+ ramme
96 brønde
2 Prøvediluent 1 x 60 mL
3a - 3h MBL-kalibrator 1-8 8 x 1 mL
4 25x Vaskeopløsningskonc. 1 x 30 mL
5 Biotinyleret MBL-antistof 1 x 12 mL
6 HRP-streptavidin 1 x 12 mL
7 TMB-substrat 1 x 12 mL
8 Stopopløsning 1 x 16 mL
Bemærk: Flydende reagenser indeholder konserveringsmidlerne
natriumazid, thimerosal eller Bronidox L. Disse kan være
sundhedsskadelige ved indtagelse.
NØDVENDIGE MATERIALER,
SOM IKKE MEDFØLGER
1. Justerbare mikropipetter dækkende en skala
1-1000 µL og tilsvarende engangs pipettespidser
2. Polypropylen reagensglas indeholdende op til
1000 µL
3. Stativer til reagensglas
4. Justerbar 8- eller 12-kanals mikropipette
(50-250 µL) eller repeterende mikropipette
(valgfri)
5. Rent 1 L gradueret cylinderglas
6. Deioniseret eller destilleret vand
7. Låg til mikrotiterplade
8. Ren beholder til fortyndet vaskeopløsning
9. Udstyr til påfyldning af brønde under vaskeprocedure
(valgfri)
10. Fnugfrie papirhåndklæder eller absorberende
papir
11. Engangs pipetteringsreservoirer
12. Timer (område 60 minutter)
13. Kalibreret ELISA pladelæser, som kan aflæse
ved 450 nm (og helst fratrække referenceværdier
ved 650 eller 620 nm)
52
14. Natriumhypoklorit (husholdningsblegemiddel
fortyndet 1:10) til dekontaminering af prøver,
reagenser, og materialer
SIKKERHEDSFORANSTALTNINGER
Kun til in vitro-diagnostik
1. Dette kit må kun anvendes af kvalificeret
laboratoriepersonale.
2. MBL-kalibratorerne er fremstillet ud fra MBL
oprenset fra humant plasma. Hver blodenhed
anvendt til fremstillingen er blevet testet
med anerkendte metoder og fundet at være
ikke-reaktiv over for hepatitis B overfladeantigen
(HBsAg) og antistoffer mod human
immundefekt virus (HIV) 1 og 2, samt hepatitis
C virus (HCV). Derudover blev produktet
underkastet virus de-aktiveringsprocedurer.
Men da ingen testmetode kan give fuldstændig
sikkerhed for fravær af smitsomme stoffer,
skal kalibratorerne og patientprøverne
behandles i overensstemmelse med biosikkerhedsniveau
2 som anbefalet for potentielt
smitsomme humane sera eller blodprøver i
CDC/NIH-manualen ”Biosafety In Microbiology
and Biomedical Laboratories” (Biosikkerhed
i mikrobiologiske og biomedicinske laboratorier),
1999.
3. Anvend separate pipettespidser til hver prøve,
kalibrator og reagens for at undgå krydskontamination.
4. Anvend separate reservoirer til hvert reagens.
Dette gælder især TMB-substratet.
5. Efter brug dekontamineres alle prøver,
reagenser og materialer ved iblødsætning i
mindst 30 minutter i natriumhypokloritopløsning
(husholdningsblegemiddel fortyndet 1:10).
6. For at undgå dråbedannelse under vask
aspireres vaskeopløsningen i en flaske indeholdende
blegemiddel.
7. Undgå udslip til miljøet. Ubrugte beholdere
og indhold bortskaffes på en sikker måde i
overensstemmelse med nationale og lokale
regler.
8. Reagenserne i dette kit er konserveret med op
til 0,05% natriumazid, 0,038% thimerosal også

kaldet thiomersal eller merthiolat, eller 0,2%
Bronidox L. Disse kan være skadelige ved
indtagelse.
9. Stopopløsningen indeholder 0,5 mol/L
svovlsyre og kan forårsage irritation eller
forbrændinger på hud og øjne. I tilfælde af
kontakt skyl med rigeligt vand og søg læge.
10. Udskift ikke komponenter fra kits med forskellige
batch-numre. Komponenterne er blevet
standardiseret som en enhed for en given
batch.
11. Hæmolyserede eller hyperlipæmiske prøver
kan give fejlagtige resultater.
12. Fortynd ikke serum- og plasmaprøver direkte i
mikrotiterbrøndene.
13. Undgå at berøre eller skrabe imod bunden
af mikrotiterbrøndene under pipettering eller
aspirering af væske.
14. Andre inkubationstider og –temperaturer end
de specificerede kan give forkerte resultater.
15. Lad ikke brøndene tørre, når først analysen er i
gang.
16. TMB-substratet er lysfølsomt. Hold det væk fra
stærkt lys.
17. Genbrug ikke mikrotiterbrøndene og hæld ikke
reagenser tilbage i flaskerne, når de er hældt
fra.
STABILITET OG OPBEVARING
1. Opbevar kittet med alle reagenser ved 2-8°C.
Må ikke nedfryses.
2. Anvend alle reagenser inden udløbsdatoen på
flaskeetiketterne.
3. Fortyndet vaskeopløsning forbliver stabil i 4
uger ved 2-8°C. Hvis ikke alle brøndene skal
bruges, skal man kun fortynde den mængde
vaskeopløsningskoncentrat, som er nødvendig.
4. Til senere brug placeres ubrugte brønde i
folieposen sammen med den medfølgende
desikkant, hvorefter posen og genforsegles.
Lad altid folieposen afbalancere til stuetemperatur
før den åbnes. Herved undgås kondensdannelse
i/på de coatede mikrotiterbrønde.
MBL Oligomer ELISA Kit
INDSAMLING AF PRØVER
Alle blod-, serum- eller plasmaprøver skal
håndteres og bortskaffes som om de var
potentielt smitsomme. Se Sikkerhedsforanstaltninger,
afsnit 2, 3, 5, 6 og 7.
Bestemmelse af MBL i en enkelt prøve kræver
5-50 µL serum eller plasma. Blodprøver skal
indsamles aseptisk i et almindeligt eller hepariniseret
reagensglas af kvalificeret personale under
anvendelse af anerkendte venepunkturteknikker.
Serum eller plasma skal klargøres med standardteknikker
for klinisk laboratorietestning. Sæt låg
på prøverne og opbevar dem ved 2-8°C til analyse
inden for 24 timer. Hvis analysen ikke kan udføres
inden for 24 timer, eller hvis prøven skal transporteres,
skal man sætte låg på prøven og holde den
frossen ved -20°C eller derunder. Undgå gentagen
frysning og optøning. Anvend ikke hæmolyserede,
hyperlipæmiske, varmebehandlede eller kontaminerede
prøver.
KLARGØRING AF REAGENSER OG PRØVER
1. Bring alle prøver og reagenser til stuetemperatur
(20-25°C). Prøverne blandes grundigt ved
let invertering og om nødvendigt fjernes synligt
partikelmateriale med centrifugering ved lav
hastighed.
2. Bestem antallet af prøver, der skal testes (som
dobbeltbestemmelse) plus eventuelle interne
laboratoriekontroller (som dobbeltbestemmelse)
plus eventuelle blankprøver. De på forhånd
coatede brønde kan anvendes som strimler
på 8 eller som individuelle brønde. Enkelte
brønde behandles ved at brække individuelle
brønde fra hinanden og placere dem i rammen
i en passende position. Bogstaver og hak på
brøndene bruges til at identificere de individuelle
brønde. Tilføj 16 brønde til de 8 kalibratorer (som
dobbeltbestemmelse). Udtag det ønskede antal
mikrotiterbrønde og opbevar resten i folieposen
med desikkant ved 2-8°C.
3. Vaskeopløsning: Fortynd 25x vaskeopløsningskoncentrat
ved at hælde hele flaskens indhold
(30 mL) i et 1 L gradueret cylinderglas og tilsæt
destilleret eller deioniseret vand, til en slutvolu-
53
DA

MBL Oligomer ELISA Kit
men på 750 mL. Bland grundigt og opbevar ved
2-8°C efter brug.
4. Prøvediluent: Klar til brug, skal ikke fortyndes
yderligere.
5. MBL-kalibratorer: Klar til brug. De tildelte
koncentrationer er angivet på etiketterne. Skal
ikke fortyndes yderligere.
6. Biotinyleret MBL-antistof: Klar til brug, skal ikke
fortyndes yderligere.
7. HRP-streptavidin-konjugat: Klar til brug, skal
ikke fortyndes yderligere.
8. TMB-substrat: Klar til brug, skal ikke fortyndes
yderligere.
9. Stopopløsning: Klar til brug, skal ikke fortyndes
yderligere.
10. Patientprøver: Fortynd hver prøve i noteret
forhold med prøvediluent for at opnå mindst
250 µL fortyndet opløsning, som kan bruges
til dobbeltbestemmelse i brønde med 100 µL
pr. brønd. En indledende screening ved en
fortynding på 1/100 (f.eks. 5 µL serum + 495
µL prøvediluent, blandet ved invertering eller
langsom vortexning) foreslås for de fleste
prøver, efterfulgt af gentagen analyse af prøver,
der er uden for området, ved lavere eller højere
fortynding, efter behov. Fortyndinger under
1/10 bør ikke anvendes.
ANALYSEPROCEDURE
1. Klargør analyseprotokollen ved at tildele de
relevante brønde til opsætning af kalibratorer,
fortyndede patientprøver og eventuelle interne
laboratoriekontroller til dobbeltbestemmelse.
Hvis en referencebølgelængde på 650 eller
620 ikke er tilgængelig på ELISA-læseren, kan
en blankprøve medtages. Denne opsættes
med 100 µL prøvediluent i stedet for fortyndet
serum eller plasma og behandles som de andre
brønde.
2. Pipettér 100 μL volumener af hver kalibrator,
fortyndede prøver og eventuelle interne laboratorikontroller
ned i de tilsvarende positioner
i mikrotiterbrøndene. Dæk brøndene til og
inkubér i 60 minutter ved stuetemperatur på en
rysteplatform sat til 200/minut.
54
3. Aspirér indholdet i mikrotiterbrøndene og vask
mikrotiterbrøndene tre gange med mindst 300
μL fortyndet vaskeopløsning. Hvis vaskningen
udføres manuelt, tømmes mikrotiterbrøndene
ved invertering og let rysten over i en passende
beholder, efterfulgt af aftrykning i omvendt
position på et papirhåndklæde. En hviletid på
1 minut inden tømning anbefales for mindst
den sidste vask i cyklusen. Kraften, hvormed
den fortyndede vaskeopløsning fyldes i eller
tømmes fra brøndene, påvirker den endelige
farveudvikling. Manuel pipettering, som kan
være meget skånsom og føre til kraftig farveudvikling,
anbefales kun i mangel af alternativer
som at fylde brøndene ved nedsænkning,
anvendelse af en multikanals manuel vaskedispenser
eller anvendelse af et automatisk
vaskeudstyr.
4. Fyld 100 μL biotinyleret MBL-antistof (klar til
brug) i hver mikrotiterbrønd. En multikanals
eller repeterende mikropipette kan anvendes.
Dæk brøndene til og inkubér i 60 minutter
ved stuetemperatur på en rysteplatform (200/
minut).
5. Vask som ovenfor beskrevet i Trin 3.
6. Fyld 100 μL HRP-streptavidin-konjugat (klar
til brug) i hver mikrotiterbrønd. En multikanals
eller repeterende mikropipette kan anvendes.
Dæk brøndene til og inkubér i 60 minutter
ved stuetemperatur på en rysteplatform (200/
minut).
7. Vask som ovenfor beskrevet i Trin 3.
8. Fyld 100 μL TMB-substrat (klar til brug) i hver
mikrotiterbrønd. Anvendelse af en multikanals
mikropipette anbefales for at reducere pipetteringstid.
Dæk brøndene til og inkubér i nøjagtigt
15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Start
uret under påfyldning af den første brønd.
9. Tilsæt 100 µL stopopløsning (klar til brug) til
hver brønd, idet man opretholder den samme
pipetteringssekvens som i Trin 7. Bland ved
forsigtig omrysten i 20 sekunder idet sprøjt skal
undgås. Aflæs brøndene inden for 30 minutter.
10. Aflæs brøndenes absorbanser ved 450 nm i
en passende mikrotiterplade-læser (referen-

cebølgelængde 650 eller 620 nm). Hvis ingen
referencebølgelængde er tilgængelig, trækkes
værdien af blankprøven fra hver af de andre
værdier, inden andre beregninger udføres.
SKEMATISK OVERSIGT
Lad reagenserne opnå stuetemperatur
100 μL Kalibrator eller fortyndet prøve
Inkuber 1 time
ved stuetemp.
Inkuber 1 time
ved stuetemp.
Inkuber 1 time
ved stuetemp.
Inkuber 15 min.
ved stuetemp.
i mørke
Fortynd prøver
Vask x 3
100 μL Biotinyleret MBL antistof
100 μL HRP-Streptavidin
100 μL TMB-Substrat
100 μL Stopopløsning
Afl æs ved 450 nm
Vask x 3
Vask x 3
MBL Oligomer ELISA Kit
BEREGNING AF RESULTATER
Det grundlæggende princip er at konstruere en
kalibreringskurve ved at plotte gennemsnittet af
dobbeltbestemmelserne af absorbansværdierne for
hver MBL-kalibrator ind på y-aksen mod de tilsvarende
MBL-koncentrationer i ng/mL på x-aksen.
Kalibreringskurven skal opfylde valideringskravene.
MBL-koncentrationen i hver fortyndet serumprøve
findes herefter ved at lokalisere det punkt på kurven,
der svarer til gennemsnittet af dobbeltbestemmelserne
af absorbansværdierne for den fortyndede
serumprøve og aflæse dets tilsvarende koncentration
i ng/mL fra x-aksen. Koncentrationen af MBL i
den ufortyndede prøve beregnes ved at gange dette
resultat med prøvens fortyndingsfaktor.
Denne procedure kan udføres manuelt ved
hjælp af grafpapir med lineære x og y skalaer. En
jævn kurve kan tegnes gennem punkterne eller
man kan forbinde punkter, der ligger ved siden af
hinanden, med lige linier. Sidstnævnte procedure
kan overvurdere koncentrationsværdier mellem
punkter en smule, når kurven er let konveks til
venstre, hvilket er det typiske resultat. Selv om
kurven kan nærme sig en lige linie, er det såvel
praktisk som teoretisk ukorrekt at beregne og tegne
en tilpasset lige linie og aflæse resultater herfra.
Proceduren kan også udføres med et ELISAlæser-softwareprogram,
der inkorporerer kurvetilpasningsprocedurer.
Den bedste procedure er at
anvende lineære x og y akser med 4-parameter
logistisk kurvetilpasning.
Fortyndede prøver, der giver en gennemsnitsabsorbans
over den for 40 ng/mL MBL-kalibratoren eller
under den for 0,5 ng/mL MBL-kalibratoren, er uden
for analyseområdet, og deres koncentrationer skal
noteres som henholdsvis >40 ng/mL og (40 x fortyndingsfaktor) ng/
mL og

MBL Oligomer ELISA Kit
VALIDERING AF KALIBRERINGSKURVE
Den gennemsnitlige absorbans for 40 ng/mL
MBL-kalibrator skal være >1,5. Den gennemsnitlige
absorbans for enhver MBL-kalibrator skal være
højere end for den for den forudgående kalibrator,
f.eks. absorbans (10 ng/mL MBL) > absorbans (5
ng/mL). Kurven skal være let konveks til venstre, når
resultaterne plottes på lineære akser.
Punkter uden for linien for individuelle kalibratorer:
En eller flere individuelle kalibratorer kan
give unormale absorbansaflæsninger. En eller
begge dobbeltbestemmelser kan ligge uden for
linien, og gennemsnittet af dobbeltbestemmelserne
kan ligge uden for linien. Denne fejl er signifikant,
hvis den forringer tilfredsstillende kurvetilpasning
ved den 4-parameter logistiske metode, der som
resultat af den unormale værdi, flyttes væk fra andre
kalibratorpunkter, der i virkeligheden er korrekte.
Kalibratorpunkter og den tilpassede kurve skal
altid undersøges for korrekt tilpasning, før nogen
koncentrationsberegning derfra accepteres. En
dårligt tilpasset kurve vil også blive afsløret af en høj
værdi for summen af resterende kvadrater. Hvis kun
én kalibrator, som ikke er den højeste kalibrator, er
påvirket, er der to handlemuligheder:
i) En fejlagtig enkelt- eller dobbeltbestemmelse
kan elimineres fra kurven, og de resterende
resultater gentilpasses ved den 4-parameter logistiske
procedure. Hvis en tilfredsstillende tilpasning
opnås, kan der beregnes foreløbige koncentrationsresultater
derfra.
ii) Hvis der ikke kan opnås en tilfredsstillende
tilpasning ad denne vej, men kurven ellers er
konsistent, kan foreløbige resultater opnås fra lige
linier mellem gennemsnittene af dobbeltbestemmelserne,
idet man udelader det forkerte punkt.
Hvis to eller flere kalibratorer er påvirket, skal
analysen gentages.
Et afvigende resultat for en individuel kalibrator
kan skyldes operatørfejl eller nedbrydning af
kalibratoren. Hvis begge dobbeltbestemmelsesværdier
konsekvent ligger uden for linien i flere på
hinanden følgende analyser, er kalibratoren defekt
og skal udelades.
56
SPORBARHED AF KALIBRATORVÆRDI
Tildeling af MBL-værdien blev udført med ELISA,
under sikring af sporbarhed til interne standarder
hos Statens Serum Institut (Danmark).
TOLKNING AF RESULTATER
Det fulde område af MBL-koncentrationer i serum
eller plasma fra sunde humane donorer som målt
med denne analyse og analoge analyser er 0 til 7000
ng/mL. Værdier under 100 ng/mL kan findes i O/O
strukturelle genotyper (hvor O = B, C eller D) uanset
promotorgenotype, eller i A/O strukturelle genotyper
(hvor A = vildtype) i kombination med HY/LX- eller
LX/LY-promotorgenotyper, eller i LX/LX-promotorgenotypen.
Værdier mellem 100 ng/mL og 1000 ng/
mL kan findes i A/O strukturelle genotyper eller i LX/
LY- eller LX/LX-promotorgenotyper. Værdier over 1000
ng/mL associeres med vildtype MBL (A/A), selv om
A/D-heterozygoter af og til kan nå dette niveau. HY/
HY-promotorgenotypen viser typisk værdier over
1500 ng/mL for vildtype MBL, men sådanne værdier
vises også af andre promotorgenotyper i fravær af
O-strukturelle alleler.
Kliniske studier har anvendt grænseværdier
på 50 ng/mL eller 100 ng/mL for at definere alvorlig
MBL-mangel. Værdier under disse grænseværdier kan
hos visse personer være associeret med en anamnese
med øget modtagelighed over for infektioner.
KVALITETSKONTROL
Laboratorier, der agter at udføre gentagne analyser,
skal etablere deres egne høje (>1000 ng/mL) og lave
(

efter de først er tøet op, og såfremt en ny analyse
skal udføres, skal der anvendes friske kontrolalikvoter
og friske fortyndinger af patientprøver
BEGRÆNSNINGER
En lav koncentration af MBL i serum eller plasma
indebærer ikke nødvendigvis eksistensen af
sygdom. Lægen skal tolke betydningen af enhver
MBL-mangel i lyset af patientens kliniske tilstand.
FORVENTEDE RESULTATER
108 plasmaprøver fra sunde danske bloddonorer
blev analyseret i BioPorto Diagnostics MBL oligomer
ELISA. MBL-koncentrationsværdierne spændte fra

MBL Oligomer ELISA Kit
Revidering: MO2010-07-EN-SE
Läs dessa anvisningar noggrant
AVSEDD ANVÄNDNING
För bestämning av oligomeriserat mannanbindande
lectin i humanserum eller heparinplasma.
KLINISK SIGNIFIKANS
Bestämning av infektionskänslighet som kan kräva
aggressiv administration av antibiotika hos:
• Patienter som får eller ska få cancerkemoterapi
eller immunsuppressiv behandling
•
Barn med återkommande infektioner
Kan också användas som en prognostisk markör för
allvarlighetsgraden hos sjukdomar som reumatoid
artrit och systemisk lupus erytematosus.
Mannan-bindande lectin (MBL, också kallat
mannos-bindande lectin eller -protein) är ett
multimert kolhydrat-bindande protein som bildas
i levern och utsöndras i blodet där det utgör en
viktig del i medfött immunförsvar mot invaderande
mikroorganismer. Dess vanligtvis oligomeriserade
(MASP) som aktiveras när MBL binder till mikrobiella
kolhydratytor och i sin tur aktiverar komplement via
MBL- eller lectinreaktionsvägen 1 .
Brist på vanligtvis oligomeriserat MBL
kan associeras med ökad infektionskänslighet
när det adaptiva immunsystemet är omoget
(i tidig barndom) 2 eller har dämpats (t.ex. efter
organtransplantation eller vid cancerkemoterapi) 3 .
Brist associeras också med en allvarligare form
av autoimmuna sjukdomar som systemisk lupus
erytematosus (SLE) 4 eller reumatoid artrit 5 och med
6 .
MBL-brist kan bero på allelvarianter i promotorn
och/eller strukturella regioner i MBL-genen 7 . Vissa
promoteralleler associeras med lägre serumkoncentrationer
av MBL, medan strukturella varianter
både försämrar normal oligomerisering av MBL
och total kedjesyntes. Försökspersoner som är
homozygota för en strukturell defekt visar mycket
låga nivåer av oligomeriserat MBL, medan heterozygota
visar låga-intermediära nivåer. Hos 100 friska
58
danska blodgivare bestämdes koncentrationer av
serum-MBL med en oligomer-selektiv immunanalys
och då uppvisades låga värden (

MBL-oligomerer, via kolhydrat-bindande domäner,
som inte är bundna till beläggningen. Obunden
detektionsantikropp avlägsnas med tvättning.
Steg 3. HRP-konjugerat streptavidin tillsätts
till varje testbrunn och tillåts bilda ett komplex med
den bundna biotinylerade antikroppen. Obundet
konjugat avlägsnas med tvättning.
Steg 4. Ett kromogent peroxidassubstrat
innehållande tetrametylbenzidin (TMB) tillsätts till
varje testbrunn. Bundet HRP-streptavidin reagerar
med substratet för att ge en färgad produkt. Den
enzymatiska reaktionen stoppas kemiskt och färgintensiteten
avläses vid 450 nm i en ELISA-avläsare.
Färgintensiteten (optisk densitet) är en funktion
av koncentrationen av MBL-oligomerformer som
ursprungligen tillsattes till varje brunn. Resultaten
för kalibratorerna används för att konstruera en
kalibreringskurva från vilken man avläser koncentrationerna
av MBL i proverna.
nan. Mannan The plates are ready for use
MBL Oligomer ELISA Kit
Plates Mannan
are precoated with Mannan.
The plates are ready for use 1 hour
Plates Plates Mannan MBL
Mannan
are are precoated precoated with with ManMan- ANALYSPRINCIP nan.nan. Mannan The Mannan The plates plates are are ready ready for for use use
Plates are precoated with Man- 1 hour
Diluted
Plates are
Plates nan. MBL Mannan MBL-antikropp
The are samples
precoated
plates precoated are ready and
with
with calibrators
Man-
Plates nan. Mannan The are plates precoated are ready with for for
ManMan-
use use
are nan. added The plates to each are ready well for and useincu
nan. The plates are ready for use 1 hour
1 hour
bated Plattor Plates är are förbelagda precoated med with primär ManMBL-
Plates Diluted MBL MBL are samples precoated and with calibrators Manantikropp.nan.
The plates Plattorna are är ready bruksfärdiga.
nan. are added The plates to each are ready well and for for incu- use use 1 hour
1 hour
Diluted bated Diluted MBL MBL
samples samples and and calibrators calibrators 1 hour
1 hour 1 hour
B
are are added MBL added Biotinylated MBL
to to each each well MBL well and and antibody incuincu- 1 hour
bated Diluted bated Diluted samples and calibrators
B samples and calibrators 1 hour hour
Spädda are Diluted added Biotinylated MBL prover samples to each och MBL and kalibratorer well calibrators antibody and incu- tillsätts
Biotinylated are Diluted added MBL samples to each
till bated are varje added brunn to och detection and well calibrators and
each inkuberas well and antibody incuincu-
is
bated are Badded
to each well and incu- 1 hour
1 hour
added B bated Diluted Biotinylated Biotinylated to samples each detection MBL well and antibody calibrators and antibody incubabated
Diluted Biotinylated samples MBL and calibrators antibody is
ted are are added added to each well and incu-
Badded
to each to each well well and and incubaincu- 1 hour
1 hour
B
bated Biotinylated
batedted Biotinylated Biotinylated Biotinylerad MBL-Antikropp MBL antibody 1 hour
BBiotinylated
detection detection MBL antibody antibody is is
1 hour
B
added added Biotinylated to to each each well well MBL MBL and and antibody
incubaincuba- 1 hour
Biotinylerad Biotinylated detection detektionsantikropp antibody is till- 1 hour
ted Biotinylated tedB
sätts Streptavidin detection
added Biotinylated till varje brunn MBL och - HRP antibody is 1 hour hour
B
inkuberas
added Biotinylated
Biotinylated Biotinylated Streptavidin to to each each
detection
detection well well MBL - HRP and and
antibody
antibody
incubaincuba- is
is
added ted to each well and incuba- 1 hour
HRP-conjugated added ted to each well
ted Biotinylated Streptavidin HRP-Streptavidinkonjugat
detection - HRP
streptavidin and incuba-
antibody is is 1 hour
ted Biotinylated HRP-conjugated detection streptavidin antibody is is
added
Streptavidin
added to to each each
-
well well
HRP
and and incubaincuba-
added to each well and incuba- 1 hour
1 hour
ted HRP-konjugerat ted HRP-conjugated Streptavidin streptavidin - streptavidin HRP tillsätts is till
ted HRP-conjugated ted Streptavidin - streptavidin HRP is 1 hour
1 hour
varje added Streptavidin brunn to each och inkuberas
added Streptavidin to each well well - HRP HRP and and incubaincubated HRP-conjugated streptavidin is 1 hour
ted HRP-conjugated streptavidin is 1 15 hour min. 15 min.
added HRP-conjugated S
added S HRP-conjugated Streptavidin TMB Streptavidin TMB TMB-Substrat to to each each Substrate well well - streptavidin
streptavidin HRP HRP and and incubaincuba- is
is
added ted added ted
to
to
each
each
well
well
and
and
incubaincuba-
15 min.
15 min.
Substrat ted HRP-conjugated S
S TMB tillsätts Substrate till streptavidin varje brunn. is Låt
S HRP-conjugated Substrate S ted TMB Substrate is added streptavidin to each well. is
S
S Substrate verka added Develop i 15 to minuter for each is added
15 well i mörker minutes and to each incubawell.
in the 15 min.
S added to each well and incuba- 15 min.
Develop S
S ted TMB Substrate
S ted Substrate dark for is added 15 minutes to each well. in the
S
S
15 min.
S TMB Substrate
S Substrate is added to each well. 15 min.
dark S Develop TMB Stopplösning for Substrate 15 minutes in the
S
S Develop TMB for Substrate 15 minutes in the
S
S
S Substrate dark is added to each well. 15 min.
S
S Substrate dark is added to each well. 15 min.
S
S Stopplösning Develop TMB Substrate
S S Substrate S Stop TMB solution for Substrate is added tillsätts 15 minutes to till each varje in well. the brunn.
S
S Substrate Develop for is added 15 minutes to each in well. the
S
Avläs Develop dark platta for inom 15 30 minutes min. in the
S Develop darkStop
for solution 15 minutes in the
S
S
S Substrate Stop darkStop
Solution solution is added is added to each to each well.
S
S Substrate dark Kvantitativa Stop solution is resultat added erhålls to each genom well. att
Develop for 15 minutes in the
S Develop mäta well. Read brunnarnas for plate 15 within absorbanser minutes 30 min. in S Stop vid the 450
dark nm Stop darkStop
Solution
Solution solution is added to each
Stop solution is added to each
well.
Stop
well. Quantitative Stop Stop Read
Solution
Read solution solution plate plate
is added
results within within
to
are 30 obtained 30
each
min. min.
well. Read plate within 30 min.
Stop Stop by measuring Solution Solution the is is added added absorbances to to each each of
Quantitative Stop well. Quantitative
Stop well. Quantitative the Stop Stop wells Read Read
Solution
Solution solution solution at plate plate 450 results results is
is within nm within
added
added
are are 30 are 30
obtained obtained to
to min. min. obtained each
each
by well. by well.
measuring Read
Read
plate
plate
the the within
within
absorbances absorbances 30
30
min.
min.
of of of
the Stop Quantitative Stop Quantitative the wells Solution Solution
at at at 450 450 results 450 results is is
nm nm added added nmare
are obtained obtained to to each each Total assay time less
by well. Quantitative
by well. Quantitative measuring measuring Read Read plate plate
results
results the the within within absorbances absorbances
are
are 30 30
obtained
obtained min. min. of of than 59 4 hours
the by
by the
measuring
measuring wells wells at at 450 450
the
the nm nm
absorbances
absorbances
Total Total of
of
assay assay time time less less
Quantitative the wells at 450 results nm are obtained Total assay time
than 4 hours
B B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B
B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
SE

MBL Oligomer ELISA Kit
KITKOMPONENTER
Artikel Innehåll Kvantitet
1
12 x 8 belagda mikrobrunnar
96 brunnar
+ ram
2 Provspädningsvätska 1 x 60 mL
3a - 3h MBL-kalibratorer, 1-8 8 x 1 mL
4 25x koncentrerad tvättlösning 1 x 30 mL
5 Biotinylerad MBL-antikropp 1 x 12 mL
6 HRP-streptavidin 1 x 12 mL
7 TMB-substrat 1 x 12 mL
8 Stopplösning 1 x 16 mL
Obs! Flytande reagenser innehåller konserveringsmedlen
natriumazid, timerosal eller Bronidox L. Dessa kan vara
hälsoskadliga vid förtäring.
MATERIAL SOM BEHÖVS
MEN INTE MEDFÖLJER
1. Justerbara mikropipetter i intervallet 1-1000 µL
och motsvarande engångspipettspetsar
2. Provrör av polypropylen som rymmer 1000 µL
3. Rörställ
4. Justerbar mikropipett med 8 eller 12 kanaler
(50-250 µL) eller repeterbar mikropipett (valfri)
5. Ren bägare på 1 L
6. Avjoniserat eller destillerat vatten
7. Lock för mikroplatta
8. Rena behållare för spädd tvättlösning
9. Apparat för att fylla brunnarna under tvättproceduren
(valfri)
10. Luddfria pappershanddukar eller absorberande
papper
11. Engångsbehållare för pipettering
12. Tidtagarur (för 60 minuter)
13. Kalibrerad ELISA-plattavläsare som kan
avläsa vid 450 nm (helst med subtraktion av
referensvärden vid 650 eller 620 nm)
14. Natriumhypoklorit (hushållsblekmedel,
spädning 1:10) för dekontaminering av prover,
reagenser och material
60
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
Endast för in vitro-diagnostik
1. Denna sats ska endast användas av kvalificerad
laboratoriepersonal.
2. MBL-kalibratorerna bereddes från MBL renat
från humanplasma. Varje blodenhet som
användes vid beredningen testades med
godkända metoder och befanns vara inreaktiv
för hepatit B-ytantigen (HBsAg) och antikroppar
mot humant immunbristvirus (HIV) 1
och 2 och hepatit C-virus (HCV). Dessutom
genomgick produkten virusavaktiveringsprocedurer.
Ingen testmetod kan emellertid
fullständigt garantera att smittsamma ämnen
inte förekommer och därför bör kalibratorer och
patientprover hanteras vid biosäkerhetsnivå
2 enligt rekommendationerna för potentiellt
smittsamt humanserum eller blodprov i CDC/
NIH-handboken ”Biosafety In Microbiology
and Biomedical Laboratories”, 1999. Lösningar
innehållande humanserum bör hanteras som
potentiellt smittsamt och hanteras därefter.
3. Använd separata pipetter för varje prov,
kalibrator och reagens för att undvika korskontamination.
4. Använd separata behållare för varje reagens.
Detta gäller särskilt TMB-substrat.
5. Efter användning ska alla prover, reagenser och
allt material dekontamineras med blötläggning
under minst 30 minuter i natriumhypokloritlösning
(hushållsblekmedel, spädning 1:10).
6. För att undvika droppbildning vid tvättning
ska tvättlösningen tillsättas en flaska med
blekmedel.
7. Undvik utsläpp till miljön. Kassera behållare
och oanvänt innehåll på ett säkert sätt och i
enlighet med nationella och lokala riktlinjer.
8. Reagenserna i detta kit är konserverade med
upp till 0,05% natriumazid, 0,038% timerosal,
också kallat tiomersal eller mertiolat, eller 0,2%
Bronidox L. Dessa kan vara giftiga vid förtäring.
9. Stopplösning innehåller 0,5 mol/L svavelsyra
och kan ge irritationer eller brännskador på hud
och ögon. Vid kontakt, skölj omedelbart med
stora mängder vatten och kontakta läkare.

10. Blanda inte ihop komponenter från satser
med olika batchnummer. Komponenterna har
standardiserats som en enhet för en given
batch.
11. Hemolyserade eller hyperlipemiska prover kan
ge felaktiga resultat.
12. Späd inte serum- eller plasmaprover direkt i
mikrobrunnarna.
13. Vidrör eller skrapa inte mikrobrunnarnas botten
vid pipettering eller aspiration av vätska.
14. Andra inkubationstider och temperaturer än de
specificerade kan ge felaktiga resultat.
15. Låt inte brunnarna torka när analysen väl har
börjat.
16. TMB-substratet är ljuskänsligt. Håll borta från
skarpt ljus.
17. Återanvänd inte mikrobrunnar eller häll inte
oanvända reagenser tillbaka i flaskorna.
STABILITET OCH FÖRVARING
1. Förvara satsen med alla reagenser vid 2-8°C.
Frys inte ned.
2. Använd alla reagenser före utgångsdatumet på
flasketiketterna.
3. Spädd tvättlösning är stabil i fyra veckor vid
2-8°C. Om inte alla brunnarna ska användas,
späd endast den del av tvättlösningen som
krävs.
4. Förvara oanvända brunnar i foliepåsen med
den medföljande torkmedelspåsen och
försegla igen för senare användning. Låt alltid
foliepåsen komma i jämvikt vid rumstemperatur
före öppnande för att undvika kondensation i/
på de belagda mikrobrunnarna.
PROVTAGNING
Hantera och kassera alla blod-, serum- eller
plasmaprover som om de är potentiellt
smittsamma. Se Försiktighetsåtgärder, avsnitt 2,
3, 5, 6 och 7.
Bestämning av MBL i ett enskilt prov kräver 5-50 µL
serum eller plasma. Blodprover bör tas aseptiskt i ett
tomt eller hepariniserat provrör av kvalificerad personal
med användning av godkända venpunktionstekniker.
Serum eller plasma bör beredas med standardmeto-
MBL Oligomer ELISA Kit
der för klinisk laboratorietestning. Förse proverna med
lock och förvara dem vid 2-8°C för analys inom 24
timmar. Om analysen inte kan utföras inom 24 timmar
eller om provet ska transporteras ska provet förses
med lock och hållas nedfryst vid -20°C eller lägre.
Undvik upprepad nedfrysning och upptining. Använd
inte hemolyserade, hyperlipemiska, värmebehandlade
eller kontaminerade prover.
BEREDNING AV REAGENSER OCH PROVER
1. Låt alla prover och reagenser anta rumstemperatur
(20-25°C). Blanda proverna noggrant
genom att försiktigt vända på provröret och ta
vid behov bort synliga partiklar med låghastighetscentrifugering.
2. Bestäm antal prover (dubbla) och interna laboratoriekontroller
(dubbla) som ska testas samt
eventuella reagensblankprov. De förbelagda
brunnarna kan användas som stickor med åtta
brunnar eller som enskilda brunnar. Enskilda
brunnar hanteras genom att man bryter av
dem en och en som därefter placeras i ramen
på lämplig plats. Bokstäver och skåror på
brunnarna gör att enskilda brunnar kan identifieras.
Lägg till 16 brunnar för 8 kalibratorer
(dubbla). Ta fram antalet mikrobrunnar som
krävs och placera tillbaka de återstående i
foliepåsen med torkmedel vid 2-8°C.
3. Tvättlösning: Späd 25x koncentrat av tvättlösning
genom att hälla flaskans hela innehåll (30
mL) i en bägare på 1 L och tillsätt destillerat
eller avjoniserat vatten till en slutvolym på 750
mL. Blanda noggrant och förvara vid 2-8°C
efter använding.
4. Provspädningsvätska: Bruksfärdig, späd inte
ytterligare.
5. MBL-kalibratorer: Bruksfärdiga. De tilldelade
koncentrationerna anges på etiketterna. Späd
inte ytterligare.
6. Biotinylerad MBL-antikropp: Bruksfärdig, späd
inte ytterligare.
7. HRP-streptavidinkonjugat: Bruksfärdigt, späd
inte ytterligare.
8. TMB-substrat: Bruksfärdigt, späd inte ytterligare.
61
SE

MBL Oligomer ELISA Kit
9. Stopplösning: Bruksfärdig, späd inte ytterligare.
10. Patientprover: Späd varje prov i en angiven
proportion med provspädningsvätska för
att erhålla minst 250 µL spädd lösning som
kan tillsättas dubbla brunnar med 100 µL per
brunn. En initial undersökning vid en spädning
på 1/100 (t.ex. 5 µL serum + 495 µL provspädningsvätska
blandad med upp- och nedvändning
eller långsam vortexblandning) föreslås
för de flesta prover, följt av omanalys av prover
utanför intervall vid lägre eller högre spädning,
beroende på vad som är lämpligt. Spädningar
lägre än 1/10 ska inte användas.
ANALYSPROCEDUR
1. Förbered analysprotokollet genom att
tilldela lämpliga brunnar för kalibratorer,
spädda patientprover och interna laboratoriekontroller
i dubbel uppsättning. Om en
referensvåglängd på 650 eller 620 nm inte finns
tillgänglig på ELISA-avläsaren kan ett reagensblankprov
tilldelas. Reagensblankprovet är
100 µL provspädningsvätska istället för spätt
serum eller spädd plasma och det bearbetas
på samma sätt som de andra brunnarna.
2. Pipettera 100 µL av varje kalibrator, spädda
prover och interna kontroller till motsvarande
positioner på mikrobrunnsremsan. Täck
brunnarna och inkubera i 60 minuter vid
rumstemperatur på en skakplatta vid 200
skakningar/minut.
3. Aspirera innehållet i mikrobrunnarna och tvätta
mikrobrunnarna tre gånger med minst 300
µL spädd tvättlösning. Om tvättning utförs
manuellt ska brunnarna tömmas genom att
vända och försiktigt skaka dem över en lämplig
behållare, följt av avtorkning upp och ned med
en pappershandduk. En väntetid på en minut
innan tömning rekommenderas för åtminstone
den sista tvättcykeln. Sättet på vilket tvättlösning
fylls i eller töms ur brunnarna påverkar den
slutliga färgutvecklingen. Manuell pipettering,
som kan utföras mycket försiktigt och leda
till stark färgutveckling, rekommenderas
62
endast när det inte finns alternativ som t.ex.
immersionsfyllning av brunnarna, användning
av en manuell flerkanalstvättdispenser eller
användning av en automatisk tvättapparat.
4. Dispensera 100 µL biotinylerad MBL-antikropp
(bruksfärdig) i varje mikrobrunn. En flerkanals-
eller repeterbar mikropipett kan användas.
Täck brunnarna och inkubera i 60 minuter
vid rumstemperatur på en skakplatta (200
skakningar/minut).
5. Tvätta som beskrivet ovan i steg 3.
6. Dispensera 100 µL HRP-streptavidinkonjugat
(bruksfärdigt) i varje mikrobrunn. En flerkanals-
eller repeterbar mikropipett kan användas.
Täck brunnarna och inkubera i 60 minuter
vid rumstemperatur på en skakplatta (200
skakningar/minut).
7. Tvätta som beskrivet ovan i steg 3.
8. Dispensera 100 µL TMB-substrat (bruksfärdigt)
i varje mikrobrunn. Användning av en flerkanalspipett
rekommenderas för att minska pipetteringstiden.
Täck brunnarna och inkubera i exakt
15 minuter vid rumstemperatur i mörker. Starta
klockan när den första brunnen fylls.
9. Tillsätt 100 µL stopplösning (bruksfärdig) till
varje brunn med samma pipetteringssekvens
och hastighet som i steg 7. Blanda genom att
försiktigt skaka i 20 sekunder och undvik spill.
Avläs brunnarna inom 30 minuter.
10. Avläs brunnarnas optiska densiteter (absorbanser)
vid 450 nm i en lämplig mikroplattavläsare
(referensvåglängd 650 eller 620 nm). Om ingen
referensvåglängd finns tillgänglig ska värdet
för reagensblankprovet subtraheras från varje
annat värde innan andra beräkningar utförs.

SCHEMATISK ÖVERSIKT
Inkubera
1 t vid RT
Inkubera
1 t vid RT
Inkubera
1 t vid RT
Inkubera
15min vid RT
i mörker
Låt reagenserna anta rumstemp.
Späd prover
100 μL Kalibrator eller spätt prov
Tvätta x3
100 μL Biotinylerad MBL-Antikropp
Tvätta x3
100 μL HRP-Streptavidinkonjugat
100 μL TMB-Substrat
100 μL Stopplösning
Avläs vid 450 nm
Tvätta x3
BERÄKNING AV RESULTAT
Huvudprincipen är att konstruera en kalibreringskurva
genom att rita upp medelvärdet för optisk
densitet för dubbelproverna av varje MBL-kalibrator
MBL Oligomer ELISA Kit
på y-axeln mot motsvarande koncentrationer
av MBL i ng/mL på x-axeln. Kalibreringskurvan
måste överensstämma med valideringskraven.
Koncentrationen av MBL för varje spätt serumprov
uppskattas därefter genom att man letar efter den
punkt på kurvan som motsvarar medelvärdet för
optisk densitet för dubbelproverna av det spädda
serumprovet och avläser den motsvarande koncentrationen
i ng/mL på x-axeln. Koncentrationen av
MBL i det ospädda serumprovet beräknas genom
att man multiplicerar resultatet med provets
spädningsfaktor.
Denna procedur kan utföras manuellt med hjälp
av ett diagrampapper med linjära x- och y-skalor. En
mjuk kurva kan dras genom punkterna eller närliggande
punkter kan sammanfogas med raka linjer.
Den senare proceduren kan övervärdera koncentrationsvärdena
mellan punkter en aning när kurvan är
konvex åt vänster, vilket är vanligt. Även om kurvan
kan uppskattas till en rak linje är det både praktiskt
och teoretiskt inkorrekt att beräkna och dra den
raka linjen för bäst anpassning och därefter avläsa
resultaten.
Proceduren kan också utföras med en
programvara med kurvanpassningsfunktion för en
ELISA-avläsare. Proceduren som ska användas är
linjära x- och y-axlar med en 4-parameters logistisk
kurvanpassning.
Spädda prover som ger ett medelvärde på
optisk densitet över det för 40 ng/mL MBL-kalibrator
eller under det för 0,5 ng/mL MBL-kalibrator ligger
utanför analysens intervall och koncentrationerna
bör registreras som >40 ng/mL repektive (40 x spädningsfaktor) ng/
mL respektive < (0,5 x spädningsfaktor) ng/mL.
Dessa prover bör omanalyseras vid högre och
lägre spädningar för prover med höga respektive
låga avläsningar. De nya spädningsfaktorerna ska
uppskattas på så sätt att värden för optisk densitet
hamnar inom kalibreringskurvans intervall, men
spädningar lägre än 1/10 ska inte användas.
VALIDERING AV KALIBRERINGSKURVA
Medelabsorbansen för 40 ng/mL MBL-kalibrator bör
63
SE

MBL Oligomer ELISA Kit
vara >1,5. Medelabsorbansen för en MBL-kalibrator
bör vara högre än den för den föregående
MBL-kalibratorn, t.ex. absorbans (10 ng/mL MBL) >
absorbans (5 ng/mL). Grafen bör vara svagt konvex
till vänster när resultaten plottas på linjära axlar.
Punkter utanför linjen för enskilda kalibratorer:
En eller flera enskilda kalibratorer kan ge avvikande
OD-avläsningar. Ett eller båda av de dubbla
värdena kan ligga utanför linjen och medelvärdet
kan ligga utanför linjen. Detta fel är signifikant om
det försämrar en tillfredsställande kurvanpassning
med den 4-parameters logistiska metoden som, på
grund av det avvikande värdet, kommer att avvika
från de andra kalibratorpunkterna som är korrekta.
Kalibratorpunkterna och den anpassade kurvan
bör alltid undersökas för korrekt anpassning innan
några koncentrationsberäkningar accepteras. En
dåligt anpassad kurva kommer också att avslöjas av
en hög restkvadratsumma. Om endast en kalibrator
är påverkad, som inte är den högsta kalibratorn, kan
två åtgärder utföras:
i) Ett felaktigt enkel- eller dubbelresultat bör
elimineras från kurvan och återstående resultat ska
anpassas igen med den 4-parameters logistiska
proceduren. Om en tillfredsställande anpassning
erhålls kan provisoriska koncentrationsresultat
beräknas från den.
ii) Om ingen tillfredsställande anpassning
erhålls på detta sätt, men kurvan är konsekvent i
övrigt, kan provisoriska resultat erhållas från raka
linjer mellan medelvärden för dubbelprov och
uteslutning av den felaktiga punkten.
Om två eller fler kalibratorer påverkas bör
analysen göras om.
Ett avvikande resultat för en enskild kalibrator
kan bero på operatörsfel eller försämring av kalibratorn.
Om båda dubbelvärdena konsekvent ligger
utanför linjen i flera analyser är kalibratorn felaktig
och bör uteslutas.
SPÅRBARHET FÖR KALIBRATORVÄRDE
Fastställandet av MBL-värdet utfördes med ELISA
för att garantera spårbarheten till interna standarder
vid Statens Serum Institut (Danmark).
64
TOLKNING AV RESULTAT
Hela intervallet för koncentrationer av MBL i
serum eller plasma från friska humangivare med
denna analys och analoga analyser är 0 till 7000
ng/mL. Värden under 100 ng/mL kan påträffas i
O/O-strukturella genotyper (där O = B, C eller D)
oavsett promotergenotyp eller i A/O-strukturella
genotyper (där A = vildtyp) i kombination med HY/
LX- eller LX/LY-promotergenotyper eller i LX/
LX-promotergenotypen. Värden mellan 100 ng/mL
och 1000 ng/mL kan påträffas i A/O-strukturella
genotyper eller i LX/LY- eller LX/LX-promotergenotyper.
Värden över 1000 ng/mL associeras med
vildtyp MBL (A/A), även om A/D-heterozygoter
ibland kan uppnå denna nivå. HY/HY-promotergenotypen
visar vanligtvis värden över 1500 ng/
mL för vildtyp MBL, men sådana värden uppvisas
också av andra promotergenotyper i frånvaro av
O-strukturella alleler.
Kliniska studier har använt cutoff-värden på
50 ng/mL eller 100 ng/mL för definition av allvarlig
MBL-brist. Värden under dessa cutoff-värden kan
associeras, hos vissa individer, med en anamnes av
ökad infektionskänslighet.
KVALITETSKONTROLL
Laboratorier som tänker utföra upprepade analyser
bör fastställa sina egna kontrollsera för hög (>1000
ng/mL) och låg (

BEGRÄNSNINGAR
En låg koncentration av MBL i serum eller plasma
behöver inte nödvändigtvis betyda förekomst av
MBL-brist i ljuset av varje patients kliniska tillstånd.
FÖRVÄNTADE RESULTAT
108 plasmaprover från friska danska blodgivare
analyserades i BioPorto Diagnostics MBL-oligomer
ELISA. Koncentrationsvärden för MBL fanns i ett
intervall från

MBL Oligomer ELISA Kit
Přečtěte si prosím pozorně tyto instrukce
Použití
MBL oligomer ELISA je souprava pro in vitro detekci
oligomerizovaného mannan-vázajícího lektinu
v lidském séru nebo plazmě.
KlinicKé využití
Stanovení MBL pomáhá při určování náchylnosti
k infekcím, a tedy zjištění potřeby agresivní
preventivní antibiotické intervence v následujících
případech:
• Pacienti podstupující (nebo u nichž je zahajována)
chemoterapii nebou imunosupresivní léčbu
• Pacienti s cystickou fibrózou
Děti s rekurentními infekcemi
•
Mannan-vázající lektin (MBL; zvaný také manózu
vázající lektin nebo protein) je multimerní karbohydráty
vázající protein produkovaný v játrech a
vylučovaný do krve, kde se stává důležitým prvkem
vrozené obranyschopnosti jedince proti napadajícím
mikroorganismům. Jeho normální oligomerizované
formy jsou spojeny se specifickými serinovými
pro-proteázami (MASPs), které jsou aktivovány
vazbou MBL na karbohydrátové povrchy mikrobů a
dále aktivují komplement cestou MBL nebo lektinu 1 .
Deficience normálně oligomerizovaných forem
MBL může být spojena se zvýšenou náchylností
k infekcím v době, kdy je získaná imunita ještě
nezralá (v časném dětství) 2 , nebo je suprimovaná
(po transplantaci orgánů, nebo v průběhu chemoterapie)
3 . Deficience také souvisí s těžším průběhem
autoimunitních nemocí jako je systémový lupus
erythematosus (SLE) 4 nebo revmatoidní artritida
(RA) 5 , a cystická fibróza s nepříznivou prognózou 6 .
Deficience MBL může vzniknout následkem
alelických variant v promotorových a/nebo strukturálních
oblastech MBL genu 7 . Přítomnost některých
promotorových alel souvisí s nižší sérovou koncentrací
MBL, zatímco abnormality strukturálních alel
poškozují jak normální oligomerizaci MBL, tak
celkovou syntézu řetězce. Jedinci homozygotní
v defektech strukturálních alel vykazují velmi
nízké hladiny oligomerizovaného MBL, zatímco
66
heterozygoti pouze nízké. Ze skupiny 100 zdravých
dánských dárců krve byly oligomer-selektivní
imunometodou zjištěny nízké hodnoty (

karbohydráty vázajících domén, které nejsou
obsazeny vazbou k protilátce. Nenavázaná detekční
protilátka je odstraněna promytím.
3) Do každé testovací jamky je přidán
streptavidin konjugovaný s křenovou peroxidázou
(HRP-streptavidine) a ponechán, aby vytvořil
komplex s navázanou biotinylovanou protilátkou.
Nenavázaný konjugát je odstraněn promytím.
4) Do každé testovací jamky je přidán
chromogenní peroxidázový substrát obsahující
tetramethylbenzidin (TMB). Navázaný HRP-streptavidin
reaguje se substrátem a vytváří zabarvený
produkt. Enzymatická reakce je chemicky zastavena
a ELISA readerem je změřena barevná intenzita při
450 nm. Barevná intenzita (optická hustota) je funkcí
koncentrace MBL oligomerových forem původně
přidaných do každé jamky. Výsledky měření kalibrátorů
slouží pro sestrojení kalibrační křivky, ze které
jsou poté odvozeny koncentrace MBL v původním
vzorku séra.
nan. Mannan The
MBL
plates
Oligomer
are ready
ELISA
for use
Kit
Plates Mannan
are precoated with Mannan.
The plates are ready for use 1 hour
Plates Plates Mannan MBL
Mannan
are are precoated precoated with with ManMan- PrinciP stanovení nan.nan. Mannan The Mannan The plates plates are are ready ready for for use use
Plates are precoated with Man- 1 hour
Diluted
Plates are
Plates nan. MBL Mannan MBL The are samples
precoated
protilátka plates precoated are ready and
with
with calibrators
Man-
Plates nan. Mannan The are plates precoated are ready with for for
ManMan-
use use
are nan. added The plates to each are ready well for and useincu
nan. The plates are ready for use 1 hour
1 hour
bated Destičky Plates are jsou precoated potažené with primární ManMBL
Plates Diluted MBL MBL are samples precoated and with calibrators Man-
protilátkou. nan. The plates Destičky are ready jsou připraveny for use k
nan. are added
použití. The plates to each are ready well and for incu- use 1 hour
1 hour
Diluted bated Diluted MBL MBL
samples samples and and calibrators calibrators 1 hour
1 hour 1 hour
B
are are added MBL added Biotinylated MBL
to to each each well MBL well and and antibody incuincu- 1 hour
bated Diluted bated Diluted samples and calibrators
B samples and calibrators 1 hour hour
Naředěné are Diluted added Biotinylated MBL samples vzorky to each MBL and a well kalibrátory calibrators antibody and incujsou
Biotinylated are Diluted added MBL samples to each
přidány bated are added do každé to detection and well calibrators and
each jamky well a inkubovány. and antibody incuincu-
is
bated are Badded
to each well and incu- 1 hour
1 hour
added B bated Diluted Biotinylated Biotinylated to samples each detection MBL well and antibody calibrators and antibody incubabated
Diluted Biotinylated samples MBL and calibrators antibody is
ted are are added added to each well and incu-
Badded
to each to each well well and and incubaincu- 1 hour
1 hour
B
bated Biotinylated
batedted Biotinylated Biotinylated Biotinylovaná MBL protilátka antibody 1 hour
BBiotinylated
detection detection MBL antibody antibody is is
1 hour
B
added added Biotinylated to to each each well well MBL MBL and and antibody
incubaincuba- 1 hour
Biotinylovaná Biotinylated detection detekční antibody protilátka is je 1 hour
ted Biotinylated tedB
přidána Streptavidin detection
added Biotinylated do každé jamky - HRP antibody is 1 hour hour
B
MBL a antibody inkubována.
added Biotinylated
Biotinylated Biotinylated Streptavidin to to each each
detection
detection well well MBL - HRP and and
antibody
antibody incubaincuba- is
is
added ted to each well and incuba- 1 hour
HRP-conjugated added ted to each well
ted Biotinylated Streptavidin detection – - HRP HRP
streptavidin and incuba-
antibody is is 1 hour
ted Biotinylated HRP-conjugated detection streptavidin antibody is is
added
Streptavidin
added to to each each
-
well well
HRP
and and incubaincuba-
added to each well and incuba- 1 hour
1 hour
ted Streptavidin ted HRP-conjugated Streptavidin konjugovaný - streptavidin HRP s křenovou
ted HRP-conjugated ted Streptavidin - streptavidin HRP is is 1 hour
1 hour
peroxidázou added Streptavidin to each je přidán well - HRP do and každé incuba- jamky a
added inkubován. Streptavidin to each well - HRP and incubated
HRP-conjugated streptavidin is 1 hour
ted HRP-conjugated streptavidin is 1 15 hour min. 15 min.
added HRP-conjugated S
added S HRP-conjugated Streptavidin TMB Streptavidin TMB to to Substrát each each Substrate well well - streptavidin
streptavidin HRP HRP and and incubaincuba- is
is
added ted added ted
to
to
each
each
well
well
and
and
incubaincuba-
15 min.
15 min.
Substrát ted HRP-conjugated S
S TMB je přidán Substrate do streptavidin každé jamky. Nech- is
S HRP-conjugated Substrate S ted TMB Substrate is added streptavidin to each well. is
S
S Substrate te added Develop reagovat to for each ve is tmě added
15 well po minutes dobu and to 15 each incuba- in minut. well.
the 15 min.
S added to each well and incuba- 15 min.
Develop S
S ted TMB Substrate
S ted Substrate dark for is added 15 minutes to each well. in the
S
S
15 min.
S TMB Substrate
S Substrate is added to each well. 15 min.
dark S Develop TMB Stop for činidlo Substrate 15 minutes in the
S
S Develop TMB for Substrate 15 minutes in the
S
S
S Substrate dark is added to each well. 15 min.
S
S Substrate dark is added to each well. 15 min.
S
S Stop Develop TMB činidlo Substrate
S S Substrate S Stop TMB solution for Substrate is je added přidáno 15 minutes to do each každé in well. the jamky.
S
S Substrate Develop for is added 15 minutes to each in well. the
S
Odečtení Develop dark destičky for 15 minutes proveďte do in 30 the mi-
S Develop darkStop
for solution 15 minutes in the
S nut.
S
S Substrate Stop darkStop
Solution solution is added is added to each to each well.
S
S Substrate darkStop
solution is added to each well.
Develop for 15 minutes in the
S Develop Kvantitativní well. Read for plate 15 výsledky within minutes 30 se min. in the
S Stop získají
dark měřením Stop darkStop
Solution
Solution absorbance solution is added to each
Stop solution is added jamek to při each vlnové
well.
Stop
délce well. Quantitative Stop Stop Read
Solution
Read 450 solution solution nmplate
plate
is added
results within within
to
are 30 obtained 30
each
min. min.
well. Read plate within 30 min.
Stop Stop by measuring Solution Solution the is is added added absorbances to to each each of
Quantitative Stop well. Quantitative
Stop well. Quantitative the Stop Stop wells Read Read
Solution
Solution solution solution at plate plate 450 results results is
is within nm within
added
added
are are 30 are 30
obtained obtained to
to min. min. obtained each
each
by well. by well.
measuring Read
Read
plate
plate
the the within
within
absorbances absorbances 30
30
min.
min.
of of of
the Stop Quantitative Stop Quantitative the wells Solution Solution
at at at 450 450 results 450 results is is
nm nm added added nmare
are obtained obtained to to each each Total assay time less
by well. Quantitative
by well. Quantitative measuring measuring Read Read plate plate
results
results the the within within absorbances absorbances
are
are 30 30
obtained
obtained min. min. of of than 67 4 hours
the by
by the
measuring
measuring wells wells at at 450 450
the
the nm nm
absorbances
absorbances
Total Total of
of
assay assay time time less less
Total assay time
B B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B
B
B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
B B
CZ

MBL Oligomer ELISA Kit
složení souPravy
Položka Obsah
12 proužků po 8 jamkách
Množství
1 potažených protilátkou proti
MBL + rámeček
96 jamek
2 ředicí roztok 1 x 60 mL
3a - 3h MBL kalibrátor 1-8 8 x 1 mL
4
25x koncentrovaný
promývací roztok
1 x 30 mL
5
Biotinylovaná protilátka
proti MBL
1 x 12 mL
6 HRP-streptavidin 1 x 12 mL
7 TMB substrát 1 x 12 mL
8 Stop činidlo 1 x 16 mL
Poznámka: Tekuté reagencie obsahují jako konzervans azid
sodný, thimerosal nebo Bronidox L. Mohou být škodlivé při
požití.
Další Potřebný materiál
(nedodávaný se soupravou)
1. nastavitelné mikropipety pracující v rozsahu
1-1000 µL a odpovídající jednorázové špičky
2. polypropylenové zkumavky s objemem do 1000 µL
3. stojany na zkumavky
4. nastavitelná 8- nebo 12-ti kanálová mikropipeta
(s rozsahem 50-250 µL) nebo mikropipeta
dávkující opakovaně stejná množství (volitelná)
5. čistý válec se stupnicí do 1 litru
6. deionizovaná nebo destilovaná voda
7. kryt na mikrodestičku
8. čistou nádobku pro naředěný promývací roztok
9. přístroj pro plnění jamek během promývací
procedury (volitelný)
10. papírové ubrousky nepouštějící chloupky nebo
absorpční papír
11. jednorázové pipetovací kontejnery
12. budík (s rozsahem 60 min)
13. kalibrovaný reader ELISA destiček schopný
odečítat při 450 nm (s referenční vlnovou délkou
650 nebo 620 nm)
68
14. chlornan sodný (domácí bělidlo v ředění 1:10) pro
dekontaminaci vzorků, reagencií a materiálů
uPozornění
Pouze pro použití in vitro
1. Tato souprava by měla být používána pouze
kvalifikovanou laboratorní obsluhou
2. MBL kalibrátory byly připraveny z MBL purifikovaného
z lidské plazmy. Každá jednotka krve použitá
pro jejich přípravu byla schválenými metodami
testována a potvrzena negativní na hepatitis B
povrchový antigen (HBsAg) a protilátky proti viru
lidské imunodeficience (HIV) 1 a 2, a dále viru
hepatitidy C (HCV). Navíc byl výsledný produkt
podroben virus deaktivačním procedurám.
Nicméně, protože žádný test není schopen poskytnout
kompletní důkazy o absenci infekčních agens,
mělo by být s kalibrátory a se vzorky od pacientů
manipulováno dle úrovně biologické bezpečnosti
číslo 2, tak jak je doporučeno pro každé potenciálně
infekční lidské sérum nebo vzorek krve v návodech
CDC/NIH „Bezpečnost práce v mikrobiologických
a biomedicínských laboratořích“, 1999. Roztoky
obsahující lidské sérum by měly být považovány za
potenciálně infekční a podle toho by s nimi mělo být
manipulováno.
3. K předcházení křížové kontaminace používejte
pro každý vzorek, kalibrátor a reagencii
samostatnou pipetovací špičku.
4. Pro každou reagencii používejte samostatnou
nádobku, to platí zejména pro TMB substrát.
5. Po použití dekontaminujte všechny vzorky,
reagencie a materiály namočením do roztoku
chlornanu sodného min. na 30 min (domácí
bělidlo naředěné 1:10).
6. K zamezení tvorby kapek během mytí aspirujte
promývací roztok do lahvičky obsahující bělidlo.
7. Zabraňte znečištění životního prostředí.
Likvidujte nádobky a nepoužité zbytky reagencií
v souladu s národními a místními předpisy.
8. Reagencie v této soupravě jsou konzervovány
azidem sodným v koncentraci až 0,05%,
thimerosalem v koncetraci do 0,038% (zvaným
také thiomersal, merthiolát) nebo 0,2% Bronidoxem
L. Tyto mohou být po pozření toxické.

9. Stop činidlo obsahuje 0,5 mol/L kyselinu sírovou
a může způsobit podráždění nebo popáleniny
kůže a očí. Jestliže dojde ke kontaktu, okamžitě
postižené místo opláchněte proudem vody a
vyhledejte lékařskou pomoc.
10. Nezaměňujte součásti souprav z různých šarží.
Komponenty jsou standardizovány jednotlivě
pro každou šarži.
11. Hemolytické nebo vysoce lipemické vzorky
mohou způsobit nesprávné výsledky.
12. Neřeďte vzorky sér přímo v jamkách mikrodestiček.
13. Nedotýkejte se a nepoškrábejte dno jamek v
mikrodestičkách při pipetování nebo aspiraci
tekutiny.
14. Jiné než zde uvedené inkubační doby a teploty
mohou způsobit nesprávné výsledky.
15. Jakmile jednou začnete provádět metodu,
nenechejte vyschnout jamky mikrodestiček.
16. TMB substrát je citlivý na světlo. Uchovávejte jej
mimo přímé světlo.
17. Jakmile jednou rozlijete jakékoliv reagens,
nevracejte je do jejich lahviček zpět; použité
mikrodestičky nepoužívejte znovu.
stabilita a uchovávání
1. Uchovávejte soupravu se všemi reagenciemi při
teplotě 2-8°C. Nezmrazujte ji.
2. Použijte všechny reagencie před uplynutím
exspirační doby uvedené na etiketě lahvičky.
3. Naředěný promývací roztok je stabilní při teplotě
2-8°C 4 týdny. Pokud nepoužijete všechny jamky,
nařeďte si pouze část promývacího roztoku.
4. Pro následné použití jednotlivých proužků
mikrodestiček vložte nepoužité proužky zpět do
původního obalu s desikantem a znovu zalepte.
Před otevřením nechte vždy obal s destičkami
vytemperovat na laboratorní teplotu, aby se
zabránilo kondenzaci vlhkosti v/na jamkách.
oDběr vzorKů
zacházejte se všemi vzorky krve, séra nebo
plazmy jako s potenciálně infekčními. viz. upozornění,
body 2, 3, 5, 6 a 7.
Stanovení MBL v jednom vzorku vyžaduje 5-50
MBL Oligomer ELISA Kit
µL séra nebo plazmy. Vzorky krve by měly být
odebírány asepticky do obyčejných nebo heparinizovaných
zkumavek kvalifikovanou osobou schváleným
způsobem odběru krve. Sérum nebo plazma
by měly být zpracovány standardními technikami
pro klinické laboratorní testování. Uzavřete vzorky
zátkou a pro stanovení do 24 hodin je uchovejte při
teplotě 2-8°C. Nebude-li měření provedeno do 24
hodin, nebo musí-li být vzorek poslán do laboratoře,
uzavřete zkumavku zátkou a uchovejte zmražené na
teplotu -20°C nebo nižší. Vyhněte se opakovanému
zamrazování a rozmrazování. Nepoužívejte hemolytické,
vysoce lipemické, tepelně ošetřené nebo
kontaminované vzorky.
PříPrava reagencií a vzorKů
1. Před zahájením měření ponechte všechny
vzorky a reagencie vytemperovat na pokojovou
teplotu (20-25°C). Důkladně promíchejte vzorky
jemným obracením a je-li to nutné, odstraňte
viditelné pevné částice šetrnou nízkorychlostní
centrifugací.
2. Určete počet vzorků, který budete testovat (v
dubletech) plus počet vzorků potřebných pro
vnitřní laboratorní kontrolu (v dubletech), plus
počet jamek pro blanky. Mikrojamky mohou
být použity ve stripech po 8 nebo jednotlivě.
Jednotlivé jamky se vylomí ze stripu a umístí se
do rámečku na vhodné místo. Písmena a zářezy
na jamkách slouží k identifikaci jednotlivých
jamek. Přidejte 16 jamek pro 8 kalibrátorů (v
dubletech). Vyjměte potřebný počet proužků,
zbytek v hliníkové fólii nahraďte desikantem a
uchovejte při teplotě 2-8°C.
3. Promývací roztok: Nařeďte 25x koncentrovaný
promývací roztok vylitím celkového objemu
lahvičky (30 mL) do válce (kalibrovaného do
objemu 1l) a přidejte destilovanou nebo deionizovanou
vodu do výsledného objemu 750 mL.
Důkladně promíchejte a uchovejte při teplotě
2-8°C.
4. Ředicí roztok: Připraven k použití, dále neředit.
5. MBL kalibrátory: Připraveny k použití. Příslušné
koncentrace jsou uvedeny na etiketách. Dále
neředit.
69
CZ

MBL Oligomer ELISA Kit
6. Biotinylovaná MBL protilátka: Připravena k
použití, dále neředit..
7. HRP-streptavidin konjugát: Připraven k použití,
dále neředit..
8. TMB substrát: Připraven k použití, dále neředit.
9. Stop činidlo: Připraveno k použití, dále neředit.
10. Vzorky pacienta: Nařeďte každý vzorek s
ředicím roztokem tak, aby jste získali minimálně
250 µL naředěného roztoku, který může být v
dubletech připraven do jamek v množství 100
µL na jamku. Pro počáteční screening většiny
vzorků je doporučováno ředění 1:100 (např. 5
µL séra + 495 µL ředicího roztoku, promícháno
obracením nebo pomalým vortexováním),
které je následováno přeměřením více či méně
naředěných vzorků (jak je nutno) u výsledků
ležících mimo měřící rozsah metody. Ředění
nižší než 1/10 by nemělo být používáno.
PostuP měření
1. Připravte si protokol metody a přiřaďte v něm
příslušné jamky kalibrátorům, naředěným
vzorkům séra a veškerým laboratorním
kontrolám v dubletech. Jestliže na ELISA
readeru není dostupná referenční vlnová délka
620 nebo 650 nm, může být přiřazena jamka pro
blank. Ten je připraven napipetováním 100 µL
ředicího roztoku místo naředěného séra nebo
plazmy a dále je postupováno stejně jako u
ostatních jamek.
2. Napipetujte 100 µL objemu každého kalibrátoru,
naředěných vzorků a všech laboratorních
kontrol do patřičných pozic v mikrodestičce.
Zakryjte jamky a inkubujte 60 minut při pokojové
teplotě na třepačce nastavené na rychlost 200/
min.
3. Odsajte obsah jamek a třikrát je promyjte
naředěným promývacím roztokem v množství
minimálně 300 µL/jamka. Promýváte-li jamky
manuálně, vyprázdněte jamky otočením
destičky a jemným vytřepáním jejího obsahu
do vhodného kontejneru, a následně osušte
takto otočenou destičku papírovým ručníkem.
Minimálně před posledním promývacím cyklem
je doporučeno před vyprázdněním jamek cca
70
1 min počkat. Energičnost, s jakou je plněn
nebo odstraňován promývací roztok z jamek,
ovlivňuje vývoj finálního zabarvení. Manuální
pipetování, které může být velmi jemné a vést
ke vzniku intenzivního zabarvení, je doporučováno
pouze při absenci alternativ jako je plnění
jamek ponořením multikanálového manuálního
promývacího automatu, nebo používání
automatického promývacího přístroje.
4. Napipetujte do každé jamky 100 µL biotinylované
MBL protilátky (připravené k použití). Může
být použita multikanálová pipeta nebo pipeta
dávkující opakovaně stejná množství. Zakryjte
jamky a inkubujte 60 minut při pokojové teplotě
na třepačce nastavené na rychlost 200/min.
5. Promyjte tak, jak je popsáno výše v bodě 3.
6. Napipetujte do každé jamky 100 µL
HRP-streptavidin konjugátu (připraveného
k použití). Může být použita multikanálová
pipeta nebo pipeta dávkující opakovaně stejná
množství. Zakryjte jamky a inkubujte 60 minut
při pokojové teplotě na třepačce nastavené na
rychlost 200/min.
7. Promyjte tak, jak je popsáno výše v bodě 3.
8. Napipetujte do každé jamky 100 µL TMB
substrátu (připraveného k použití). Z důvodu
úspory času je doporučeno použití multikanálové
pipety. Zakryjte jamky a inkubujte přesně
15 minut při pokojové teplotě v temnu. Zapněte
odpočítávání, když plníte první jamku.
9. Přidejte 100 µL Stop činidla (připraveného k
použití) do každé jamky, a dodržujte stejný
pipetovací postup a rychlost jako v kroku 7.
Promíchejte jemným protřepáváním cca 20 s,
vyhněte se vystříknutí obsahu z jamek. Během
30 minut změřte absorbanci jamek.
10. Absorbanci jamek měřte při vlnové délce 450 nm
na vhodném readeru mikrodestiček (referenční
vlnová délka 620 nebo 650 nm). Jestliže není
k dispozici žádná referenční vlnová délka, pak
absorbance jamky obsahující blank je odečtena
od každé jednotlivé naměřené absorbance
ostatních jamek předtím, než jsou provedeny
jakékoliv další kalkulace.

schématicKý PřehleD
Nechte reagencie vytemperovat na pokojovou teplotu
100 μL kalibrátoru nebo naředěného vzorku
Inkubujte 1h při
pokojové teplotě
Promyjte 3x
100 μL Biotinylované MBL protilátky
Inkubujte 1h při
pokojové teplotě
Inkubujte 1h při
pokojové teplotě
Inkubujte 15min
při pokojové
teplotě ve tmě
Nařeďte vzorky
100 μL HRP-Streptavidinu
100 μL TMB substrátu
100 μL Stop činidla
Změřte absorbance při 450 nm
Promyjte 3x
Promyjte 3x
výPočet výsleDKů
Základním principem je vytvoření kalibrační křivky
vynesením průměrů získaných hodnot absorbancí
MBL kalibrátorů měřených v dubletech na osu Y proti
odpovídající koncentraci MBL v ng/mL vynesených na
MBL Oligomer ELISA Kit
osu X. Kalibrační křivka musí respektovat validační
požadavky. Koncentrace MBL v každém naředěném
vzorku séra je poté zjištěna nalezením místa na křivce
odpovídajícím průměrné hodnotě absorbancí naředěného
vzorku séra a zjištěním odpovídající koncentrace
v ng/mL na ose X. Koncentrace MBL v neředěném
vzorku séra je vypočítána vynásobením této hodnoty
dilučním faktorem.
Tato metoda může být prováděna manuálně
použitím milimetrového papíru s vynesenými osami
X a Y. Skrz body může být nakreslena plynulá křivka
nebo mohou být vedle sebe ležící body spojeny
přímkami. Druhý způsob může mírně nadhodnotit
hodnoty koncentrací mezi body, je-li křivka mírně
konvexní vlevo, což je typické zjištění. Ačkoli se křivka
může podobat přímé lince, je prakticky i teoreticky
nesprávné počítat a nakreslit přímou nejvíce vyhovující
linku a odečítat výsledky z ní.
Metoda může být prováděna také za použití
softwarového programu ELISA readeru, který dokáže
vytvářet kalibrační křivky. Metodou volby k sestavení
křivky je 4-parametrová funkce za použití lineární X a
Y osy.
Naředěné vzorky dávající střední hodnotu
absorbance vyšší než hodnotu absorbance kalibrátoru
o koncentraci 40 ng/mL, resp. nižší než hodnotu
absorbance kalibrátoru o koncentraci 0,5 ng/mL jsou
mimo měřící rozsah a jejich koncentrace by měla být
uváděna jako >40ng/mL, resp. (40 x diluční faktor) ng/mL, resp. 1,5. Střední hodnota
absorbance každého dalšího MBL kalibrátoru by měla
být vyšší než hodnota pro předešlý MBL kalibrátor,
např. absorbance (10 ng/mL MBL) > absorbance
(5 ng/mL MBL). Kalibrační křivka by měla být lehce
71
CZ

MBL Oligomer ELISA Kit
konvexní doleva pokud jsou výsledky vynášeny na
lineární osy.
hodnoty kalibrátorů ležící mimo rozmezí: Jeden
nebo více jednotlivých kalibrátorů může vykazovat
abnormální hodnoty absorbance. Jedna nebo obě
hodnoty dubletu mohou být mimo rozmezí, a průměr
hodnot dubletů může být mimo rozmezí. Tato chyba
je významná, pokud ovlivňuje uspokojivé vytvoření
kalibrační křivky pomocí 4-parametrové funkce,
která je následkem abnomální hodnoty odchýlena
od ostatních vynesených hodnot kalibrátorů, které
jsou ve skutečnosti správné. Správnost vynesených
hodnot kalibrátorů a vytvořená křivka by měly být před
jakýmikoliv kalkulacemi koncentrací vždy prověřeny.
Špatně vytvořená křivka se také projevuje vysokou
hodnotou R 2 . Je-li ovlivněn pouze jeden kalibrátor (a
není-li nejvyšším kalibrátorem), existují 2 možnosti:
i) Z bodů tvořících křivku by měla být eliminována
nesprávná hodnota, a ostatní zbývající hodnoty
použity k vytvoření nové křivky 4-parametrovou funkcí.
Je-li dosaženo uspokojivého výsledku, mohou z ní být
provizorně odvozeny koncentrace vzorků.
ii) Jestliže není možno tímto způsobem získat
uspokojivou křivku, ale křivka je jinak konzistentní,
mohou být prozatímní výsledky získány z přímých
úseček vedených průměry dubletů s vynecháním
nesprávného bodu.
Jestliže jsou špatné hodnoty dvou nebo více kalibrátorů,
mělo by být měření zopakováno.
Odlišný výsledek u některého z kalibrátorů může být
následkem chyby laboranta nebo vadného kalibrátoru.
Jestliže jsou obě hodnoty měření v dubletu opakovaně
mimo linii hodnot, je kalibrátor vadný a měl by být
vynechán.
návaznost Kalibrátoru
Stanovení hodnoty koncentrace MBL kalibrátoru bylo
zajištěno pomocí ELISA stanovení v návaznosti na
interní standardy v Statens Serum Institutu (Dánsko).
interPretace výsleDKů
Rozmezí koncentrací MBL v plazmě nebo séru
zdravých lidských dárců krve, které bylo naměřeno
touto metodou nebo analogickými metodami, je
72
0-7000 ng/mL. Hodnoty menší než 100 ng/mL mohou
být zachyceny při strukturálním genotypu O/O (O=B,
C, nebo D) bez ohledu na promotorový genotyp, nebo
při A/O strukturálních genotypech (kdy A = divoký
typ) v kombinaci s HY/LX nebo LX/LY promotorovými
genotypy, nebo při LX/LX promotorových genotypech.
Hodnoty mezi 100 ng/mL a 1000 ng/mL mohou být
zachyceny u A/O strukturálních genotypů nebo LX/LY
nebo LX/LX promotorových genotypů. Hodnoty vyšší
než 1000 ng/mL souvisejí s divokým typem MBL (A/A),
ačkoli heterozygoti s genotypem A/D mohou také
příležitostně dosáhnout těchto hodnot. Promotorový
genotyp HY/HY divokého typu MBL typicky vykazuje
hodnoty nad 1500 ng/mL, ale takové hodnoty jsou také
charakteristické pro ostatní promotorové genotypy
s absencí O strukturálních alel.
Klinické studie používaly pro definici těžké deficience
MBL hodnoty cut-off 50 ng/mL nebo 100 ng/mL.
Hodnoty nižší než tyto cut-off mohou být u některých
jedinců spojeny s anamnézou zvýšené náchylnosti
k infekcím.
Kontrola Kvality
Laboratoře provádějící tuto metodu opakovaně
by měly vyrobit svá vlastní kontrolní séra s nízkou
absorbancí (méně než 100 ng/mL) a vysokou
absorbancí (více než 1000 ng/mL) a uchovávat je
v alikvotních množstvích cca 50 µL při teplotě -20 °C
nebo nižší. Alikvotní množství každého kontrolního
séra by mělo být rozmraženo a změřeno při každém
jednotlivém měření a záznam o tom uschován. To
slouží jako kontrola kvality testu, neporušenosti
testu a věrohodnosti laboranta. Výsledky by měly být
přešetřeny na posun (tendence následných výsledků
růst nebo klesat), nebo významné kolísání od průměrů
předchozích měření. Výsledky neodchylující se o více
než 20% od průměrů předchozích měření mohou
být považovány za indikátory přijatelnosti testu.
Uschovaná alikvotní množství kontrolních sér by
neměla být opakovaně rozmrazována pro opakovaná
měření, byla-li již jednou zmrazena. Jestliže je
prováděno nové měření, měly by být použity čerstvé
vzorky kontrol a čerstvá ředění vzorků pacienta.

omezení
Nízké množství MBL v séru nebo plazmě nemusí
nezbytně znamenat přítomnost jakéhokoliv onemocnění.
Lékaři musí interpretovat významnost deficience
MBL v porovnání s klinickým obrazem každého
pacienta.
očeKávané výsleDKy
Soupravou BioPorto Diagnostics MBL oligomer
ELISA bylo v Dánsku vyšetřeno 108 vzorků plazmy
od zdravých dárců krve. Hodnoty koncentrace MBL
se pohybovaly od

MBL Oligomer ELISA Kit
REFERENCES
LITERATUR
RÉFÉRENCES
BIBLIOGRAFIA
BIBLIOGRAFÍA
REFERENCER
REFERENSER
oDKazy
1. Turner MW (1998) Mannose-binding lectin
(MBL) in health and disease. Immunobiology
199:327-339.
2. Koch A, Melbye M, Sorensen P, Homoe P,
Madsen HO, Mølbak K, Hansen CH, Andersen
LH, Hahn GW, Garred P (2001) Acute respiratory
tract infections and mannose-binding
lectin insufficiency during early childhood.
JAMA 285:1316-1321.
3. Peterslund NA, Koch C, Jensenius JC, Thiel
S (2001) Association between deficiency of
mannose-binding lectin and severe infections
after chemotherapy. Lancet 358:637-638.
4. Garred P, Voss A, Madsen HO, Junker P (2001)
Association of mannose-binding lectin gene
variation with disease severity and infections in
a population-based cohort of systemic lupus
erythematosus patients. Genes Immun 2:442-450.
5. Saevarsdottir S, Vikingsdottir T, Vikingsson A,
Manfredsdottir V, Geirsson AJ, Valdimarsson
H (2001) Low mannose binding lectin predicts
poor prognosis in patients with early rheumatoid
arthritis. A prospective study. J Rheumatol
28:728-734.
6. Garred P, Pressler T, Madsen HO, Frederiksen
B, Svejgaard A, Hoiby N, Schwartz M, Koch
C (1999) Association of mannose-binding
lectin gene heterogeneity with severity of lung
disease and survival in cystic fibrosis. J Clin
Invest 104:431-437.
7. Steffensen R, Thiel S, Varming K, Jersild C,
Jensenius JC (2000) Detection of structural
gene mutations and promoter polymorphisms
in the mannan-binding lectin (MBL) gene by
polymerase chain reaction with sequencespecific
primers. J Immunol Methods 241:33-42.
74

MBL Oligomer ELISA Kit
75
REF

MBL Oligomer ELISA Kit
76
REF
IVD
LOT
IFU
Catalogue number
Bestellnummer
Référence du catalogue
Numero di catalogo
Número de catálogo
Katalognummer
Katalognummer
Katalogové číslo
In vitro diagnostic medical device
In-Vitro-Diagnostikum
Dispositif médical de diagnostic in vitro
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Producto sanitario para diagnóstico in vitro
Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik
Medicintekniska produkter för in vitro diagnostik
In Vitro diagnostický zdravotnický prostředek
Batch code
Chargenbezeichnung
Code du lot
Codice del lotto
Código de lote
Lotnummer
Lot nummer
Číslo šarže
Valid version of instructions
Gültige Version der Anleitung
Version valide des instructions
Versione valida delle istruzioni
Versión válida de las instrucciones
Gældende udgave af instruktionen
Gilttiga versionen av anvisningar
Platná verze návodu
Consult instructions for use
Gebrauchsanweisung beachten
Consulter les instructions d’utilisation
Consultare le istruzioni per l’uso
Consulte las instrucciones de uso
Se brugsanvisning
Se handhavandebeskrivningen
Viz návod k použití
2˚C
8˚C
European Conformity
CE-Konformitätskennzeichung
Conformité aux normes européennes
Conformità europea
Conformidad europea
Europæisk overensstemmelse
Europeisk översensstämmelse
Evropská shoda
Use by
Verwendbar bis
Utiliser jusque
Utilizzare entro
Fecha de caducidad
Anvend før
Använd före
Použitelné do
Manufacturer
Hersteller
Fabricant
Fabbricante
Fabricante
Fabrikant
Tillverkare
Výrobce
Keep away from sunlight
Vor Sonnenlicht schützen
Ne pas exposer aux rayons solaires
Evitare l’esposizione alla luce del sole
Mantener fuera de la luz solar
Må ikke udsættes for sollys
Utsätts ej för direkt solljus
Chraňte před slunečním svĕtlem
Temperature limitation
Temperaturbegrenzung
Limites de température
Limiti di temperatura
Límite de temperatura
Temperaturbegrænsning
Temperaturbegränsning
Teplotní rozmezí od do

WASH SOLUTION 25X
Do not reuse
Nicht zur wiederverwendung
Ne pas réutiliser
Non riutilizzare
No reutilizar
Må ikke genbruges
Återanvänd ej
Pro jednorázové použití
Caution, consult accompanying documents
Achtung, Begleitdokumente beachten
Attention, voir notice d’instructions
Attenzione, vedere le istruzioni per l’uso
Atención, ver instrucciones de uso
Forsigtig, se brugsanvisning
Försiktighet, se handhavandebeskrivningen
Upozomĕní viz přiložená dokumentace
Biological risk
Biogefährdung
Risques biologiques
Rischio biologico
Riesgo biológico
Biologisk fare
Biologisk risk
Biologicky nebezpečné
Do not use if package is damaged
Inhalt beschädigter Packung nicht verwenden
Ne pas utiliser si l’emballage est endommagé
Non utilizzare se la confezione è danneggiata
No usar si el paquete está dañado
Må ikke anvendes hvis emballagen er beskadiget
Använd inte om förpackningen är skadad
Nepoužívejte, je-li obal poškozen
Concentrated Wash Solution. Dilute before use.
Konzentrierte Waschlösung. Vor Gebrauch verdünnen.
Solution de bain concentrée. Diluer avant usage.
Soluzione di lavaggio concentrata. Diluire prima dell’uso.
Tampón de lavado concentrado. Diluir antes de usar.
Vaskeopløsningskoncentrat. Fortyndes før anvendelse.
Koncentrerad tvättlösning. Späd före användning.
Koncentrat promyvaciho roztoku. Pred pouzitim zredte.
MBL Oligomer ELISA Kit
77

MBL Oligomer ELISA Kit
BioPorto Diagnostics A/S
Grusbakken 8
DK-2820 Gentofte
Denmark
Diagnostics
Phone (+45) 4529 0000
Fax (+45) 4529 0001
E-mail info@bioporto.com
Web www.bioporto.com
10050/072010/e · Revision: 2010-07