cache

วิทยานิพนธ 

เรื่อง 

การแยกและคัดเลือกแบคทีเรียทางทะเลที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

Isolation and Selection of Marine Bacteria Producing Chitinase 

โดย 

นายอรรถวุฒิ กันทะวงศ 

เสนอ 

บัณฑิตวิทยาลัย มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร 

เพื่อความสมบูรณแหงปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต 

(วิทยาศาสตรทางทะเล) 

พ.ศ. 2548 

ISBN 974-9831-32-2

กิตติกรรมประกาศ 

ขาพเจาขอกราบขอบพระคุณ อาจารย ดร. สุริยัน ธัญกิจจานุกิจ ประธานกรรมการที่ปรึกษา 

ผศ. สุนันท ภัทรจินดา กรรมการสาขาวิชาเอก อาจารย ดร. อัธยา กังสุวรรณ กรรมการสาขาวิชารอง 

ที่กรุณาใหคําแนะนํา 

และใหคําปรึกษาตางๆ เปนอยางดีตลอดมา จนวิทยานิพนธฉบับนี้เสร็จ 

สมบูรณ ขอกราบขอบพระคุณ อ. ณรงค วีระไวทยะ ผูแทนบัณฑิตวิทยาลัยที่ไดกรุณาใหคําแนะนํา 

เพิ่มเติม 

ขอบพระคุณ อ.ดร. จินตนา สและนอย ที่ใหความอนุเคราะหสารเคมี 

และใหคําปรึกษาเกี่ยว 

กับการทดลอง ขอขอบพระคุณ ผศ. ดร. วันชัย วรวัฒนเมธีกุล ที่ใหความอนุเคราะหในการใช 

เครื่องบดละเอียด 

ขอขอบพระคุณ ผศ. ดร. พงษเทพ วิไลพันธ ที่ใหคําปรึกษา 

และใหความรูเกี่ยว 

กับการทดลอง ขอขอบพระคุณ คุณ จันทรจรัส วัฒนะโชติ ที่ใหความอนุเคราะหการทํา 

lyophylization ตัวอยาง และขอขอบพระคุณศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร มหาวิทยาลัย 

เกษตรศาสตร วิทยาเขตกําแพงแสน นครปฐม ที่สนับสนุนทุนในการวิจัย 

ขอขอบคุณคุณจีรภา หินซุย ที่ใหคําแนะนําและคําปรึกษาในการทําวิทยานิพนธ 

ขอขอบคุณคุณจตุพร เลิศล้ํา 

ที่คอยชวยเหลือในการทําวิทยานิพนธ 

คอยใหกําลังใจและเปนที่ 

ปรึกษาที่ดีตลอดมา 

และขอขอบคุณบุคลากรสถานีวิจัยประมงศรีราชา ที่เอื้อเฟอสถานที่ในการทํา 

การทดลอง และคําแนะนําที่ดี 

ขอขอบพระคุณ คุณพอ คุณแม รวมทั้งสมาชิกทุกคนในครอบครัวที่ใหกําลังใจ 

ใหความ 

ชวยเหลือ และการสนับสนุนในการศึกษาและการทําวิทยานิพนธจนเสร็จสมบูรณ 

อรรถวุฒิ กันทะวงศ 

พฤษภาคม 2548

สารบัญ 

์ 

สารบัญ 

หนา 

(1) 

สารบัญตาราง (3) 

สารบัญภาพ (5) 

คํานํา 1 

การตรวจเอกสาร 3 

1. ไคติน 3 

2. เอนไซมไคติเนส 5 

3. ปจจัยที่มีผลตอการผลิตเอนไซมไคติเนส 

10 

4. คุณสมบัติของเอนไซมไคติเนส 12 

5. ประโยชนของเอนไซมไคติเนส 12 

อุปกรณและวิธีการ 16 

อุปกรณ 16 

วิธีการ 19 

ผลและวิจารณ 26 

1. การคัดแยกแบคทีเรียทางทะเลที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

2. การคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิต 

26 

เอนไซมไคติเนสบนอาหารแข็ง 

3. การคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิต 

30 

เอนไซมไคติเนสในอาหารเหลว 36 

4. การจัดจําแนกสายพันธุของแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

5. การศึกษาสภาวะที่เหมาะในการเจริญ 

และการผลิตเอนไซม 

38 

ไคติเนสของ Bacillus circulans SH1.13 

6. การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจาก 

42 

Bacillus circulans SH1.13 

7. การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซมและการทําเอนไซมไคติเนส 

49 

ที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 ใหบริสุทธิ 

55 

สรุป 61 

(1)

สารบัญ (ตอ) 

เอกสารและสิ่งอางอิง 

หนา 

64 

ภาคผนวก 74 

ภาคผนวก ก 75 

ภาคผนวก ข 94 

(2)

สารบัญตาราง 

่ 

์ 

ตารางที 

หนา 

1 ปจจัยที่มีผลตอการผลิตเอนไซมไคติเนสของแบคทีเรียชนิดตางๆ 

11 

2 คุณสมบัติของเอนไซมไคติเนสที่แยกไดจากแบคทีเรีย 

15 

3 รอยละของจํานวนโคโลนีแบคทีเรียที่เกิดโซนใสรอบโคโลนี 

27 

4 การทดสอบการติดสีแกรม รูปราง และอัตราสวนเฉลี่ยระหวางเสน 

ผานศูนยกลางของโซนใสตอขนาดของเสนผานศูนยกลางโคโลนี 31 

5 กิจกรรมของเอนไซมไคติเนสในการคัดเลือกแบคทีเรีย 

ที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมในอาหารเหลว 

36 

6 คุณสมบัติทางชีวเคมี ของแบคทีเรียรหัส SH1.13 40 

7 สรุปสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซมไคติเนสของ 

Bacillus circulans SH1.13 และสภาวะที่เหมาะสมใน 

การทํางานของเอนไซมไคติเนส 55 

8 ขั้นตอนการทําเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.1 ใหบริสุทธิ 

58 

่ 

่ 

่ 

่ 

ตารางผนวกที 

ก1 การเตรียมสารละลาย GlcNAc สําหรับทํากราฟมาตรฐาน 80 

ก2 การเตรียมสารละลาย BSA สําหรับทํากราฟโปรตีนมาตรฐาน 

โดยวิธีของ Bradford 82 

ก3 การเตรียมสารละลายโปรตีนมาตรฐานโดยใช Low Molecular Weight 

สําหรับ gel filtration chromatography 83 

ก4 การเตรียม Separating gel และ Stacking gel สําหรับทํา 

SDS-PAGE 88 

ก5 สารละลายโปรตีนมาตรฐานโดยใช Protein Molecular Weight Marker 

สําหรับการทํา SDS-PAGE 89 

ก6 การเตรียมสารละลาย McIlvaine buffer ที pH ตางๆ 90 

ก7 การเตรียมสารละลาย Tris-HCl buffer ที pH ตางๆ 91 

ก8 การเตรียมสารละลาย Glycine-NaOH buffer ที pH ตางๆ 92 

(3)

สารบัญตาราง (ตอ) 

่ ตารางผนวกที 

หนา 

ก9 ปริมาณแอมโมเนียมซัลเฟต ที่ใชในการตกตะกอนโปรตีน 

93 

ข1 ขนาดเสนผานศูนยกลางโซนใส ขนาดเสนผานศูนยกลาง 

โซนใสโคโลนี และอัตราสวนระหวางกลางขนาดเสนผานศูนยกลาง 

โซนใสกับขนาดเสนผานศูนยกลางโซนใสโคโลนี 95 

ข2 การเคลื่อนที่สัมพัทธ 

ของโปรตีนจากสารสกัดเอนไซมไคติเนส 


Bacillus circulans SH1.13 และ 

น้ําหนักโมเลกุลของโปรตีนที่ปรากฏบนแผน 

gel acrylamide 106 

(4)

สารบัญภาพ 

่ 

 

ภาพที 

หนา 

1 โครงสรางของไคติน 3 

2 รูปแบบโครงสรางไคติน 5 

3 การแตกพันธะไกลโคซิดิกของเอนไซมไคติเนส 5 

4 ลําดับขั้นของการยอยไคตินของเอนไซมยอยไคติน 

8 

5 รอยละของจํานวนโคโลนีที่เกิดโซนใสใน 

ปลาวัว (FH) หอยแมลงภู (PE) 

กุงุกลาดํา 

(SH) กุงแชบวย 

(PR) ปูมา (CR) และหมึกสาย (SQ) 28 

6 การสรางโซนใสในอาหาร chitin agar ของแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

29 

7 ลักษณะรูปรางของแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมไคติเนสรหัส 

SH1.13 

โดยการยอมสีแกรมและสองดูภายใตกลองจุลทรรศน ที่กําลังขยาย 

100 เทา 39 

8 pH เริ่มตนที่เหมาะสมในการเจริญ 

และการผลิตเอนไซมไคติเนส 

ของ Bacillus circulans SH1.13 44 

9 อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเจริญ 



10 ระยะเวลาที่เหมาะสมในการเจริญ 



11 ความเปนกรด-ดางที่เหมาะสมตอกิจกรรมของเอนไซมไคติเนส 


Bacillus circulans SH1.13 ณ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 51 

12 ผลของความเปนกรด-ดาง ตอความคงตัวเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 ณ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 51 

13 อุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมของเอนไซมไคติเนส 


Bacillus circulans SH1.13 54 

14 ผลของอุณหภูมิตอความคงตัวเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 54 

15 การทําเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจาก 


ใหบริสุทธิ์โดยวิธี 

gel filtration chromatography 57 

16 แถบหนวยยอยโปรตีนของสารสกัดเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 โดยวิธี SDS-PAGE 60 

(5)

สารบัญภาพ (ตอ) 

่ 

่ 

่ 

ภาพผนวกที 

หนา 

ก1 กราฟมาตรฐานของ GlcNAc แสดงคาระหวาง ความเขมขน 

ของ GlcNAc และคาการดูดกลืนแสงที 420 นาโนเมตร 80 

ก2 กราฟมาตรฐานของโปรตีน โดยวิธี Bradford แสดงคาระหวาง 

ความเขมขนของ BSA และคาการดูดกลืนแสงที 595 นาโนเมตร 82 

ก3 กราฟมาตรฐานของโปรตีนของ gel filtration chromatography 

แสดงคาระหวางคา Kav กับคา Log Mw 84 

ก4 กราฟมาตรฐานของโปรตีนของ ในการหาน้ําหนักโมเลกุล 

โดยวิธี SDS-PAGE แสดงคาระหวาง Rf กับ คา Log Mw 89 

(6)

การแยกและคัดเลือกแบคทีเรียทางทะเลที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

Isolation and Selection of Marine Bacteria Producing Chitinase 

คํานํา 

อุตสาหกรรมกุงแชเยือกแข็งเปนอุตสาหกรรมทางการประมงหลัก 

มีการขยายตัวสูง นําราย 

ไดเขาประเทศจํานวนมาก อยางไรก็ตามของเหลือทิ้งจากอุตสาหกรรม 

เชน สวนหัว เปลือก และ 

น้ําลาง 

สวนใหญถูกกําจัดโดยการนําไปทิ้งในทะเล 

เผา ฝงกลบ และใชเปนอาหารสัตว กอใหเกิด 

ปญหาทางดานมลพิษและคาใชจายในการกําจัดสูง จึงมีการนําของเหลือทิ้งเหลานี้มาใชประโยชน 

เพื่อเพิ่มมูลคา 

โดยการผลิตเปนไคติน ไคโตซาน และการนําผลิตภัณฑดังกลาวมาประยุกตใช 

ไคตินเปนโพลิแซคคาไรดของ N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) มีคุณสมบัติไมละลายน้ํา 

และตัวทําละลายอินทรีย พบมากในสัตวทะเลโดยเฉพาะพวก ครัสเตเชียน (crustacean) เชน เปลือก 

กุง 

และเปลือกปู (Park et al., 1997; Yu et al., 1991) นอกจากนี้ 

ยังพบในผนังเซลลของราและ 

เปลือกของแมลง (Vyas and Deshpande, 1989) ไคตินในธรรมชาติโดยสวนใหญจะถูกยอยสลาย 

โดยแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมยอยไคติน 

ไคติเนสเปนเอนไซมยอยไคตินที่ไดจากแบคทีเรียหลายชนิดเชน 

Chromobacterium, 

Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Aeromonas, Beneckea, Acromobacter, 

Alginomonas (Jeuniaux, 1966; Tsujibo et al., 1991; Zhou et al., 1999) เอนไซมไคติเนสที่ผลิตได 

จากแบคทีเรียเหลานี้สามารถนํามาใชประโยชน 

เชน การใชเปนสารควบคุมโรคและแมลงที่เปน 

ศัตรูพืชและสัตวน้ํา 

การนําไปผลิต chito-oligosaccharide การใชเตรียมโปรโตพลาสตจากราและ 

ยีสต นอกจากนี้ 

ยังมีการนําแบคทีเรียที่ผลิตไคติเนสไปใชในการยอยหัวกุงและเปลือกกุงโดยตรง 

เพื่อผลิต 

Single-Cell Protein (SCP) โดย SCP จะถูกนํามาใชเปนอาหารสัตว (Shaikh and 

Deshpande, 1993) และปจจุบันไดมีการศึกษาทางดานพันธุวิศวกรรมของแบคทีเรีย เพื่อให 

แบคทีเรียผลิตเอนไซมไคติเนสที่มีประสิทธิภาพและปริมาณสูง 

เชน การโคลนยีนสของ Vibrio 

vulnificus ยายไปใสใน Escherichia coli DH1 (ATCC33849) (Wortman et al., 1986) นอกจากนี้ยัง 

1

มีการโคลนยีนสของรา Tricoderma harzianum ยายไปใสในยาสูบและมันฝรั่งเพื่อใหพืชทั้งสอง 

ชนิดมีความตานทานตอโรคและแมลง (Lorito et al., 1998) 

จากประโยชนดังที่กลาวมาแลวนั้น 

ในการศึกษาครั้งนี้จึงไดมุงเนนการแยกและคัดเลือก 

แบคทีเรียที่สามารถผลิตเอนไซมไคติเนสที่มีประสิทธิภาพสูง 

เพื่อนําไปสูการพัฒนาทางดาน 

เทคโนโลยีชีวภาพ และสามารถนําไปประยุกตใชไดอยางกวางขวาง ซึ่งเปนวิธีหนึ่งในการกําจัดและ 

เพิ่มมูลคา 

ของเหลือทิ้งจากอุตสาหกรรม 

วัตถุประสงค 

1. เพื่อแยกแบคทีเรียที่สามารถผลิตเอนไซมไคติเนสจากสัตวทะเล 

ไดแก กุง 

ปู ปลา หอย 

และหมึก 

2. เพื่อคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพสูงในการผลิตเอนไซมไคติเนส 

3. เพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซมไคติเนสของแบคทีเรีย 

4. เพื่อศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการทํางานของเอนไซมไคติเนส 

5. เพื่อศึกษาคุณสมบัติของเอนไซมไคติเนสที่ผลิตได 

2

1. ไคติน 

การตรวจเอกสาร 

ไคตินเปนคารโบไฮเดรต (carbohydrate) ที่ไดจากธรรมชาติ 

จัดอยูในกลุม 

homopolysaccharide ประกอบดวยอนุพันธของ β-N-acetyl-D-glucosamine (2-acetamid-2-deoxy- 

D-glucose) เชื่อมตอกันดวยพันธะไกลโคซิดิก 

(glycosidic bond) ระหวางคารบอนตําแหนงที่ 

1 กับ 

คารบอนตําแหนงที่ 

4 ของโมโนแซคคาไรดตัวถัดไป มีชื่อทางเคมีวา 

Poly (2-acetamino-2-deoxy- 

D-glucose) หรือ Poly (N-acetylglucosamine) ไคตินเปนสารที่ไมละลายในน้ํา 

และตัวทําละลาย 

อินทรีย (สุวลี, 2542; Cottrell et al., 1999) 

ภาพที่ 

1 โครงสรางของไคติน 

ที่มา: 

Gooday (1994) 

ไคตินเปนสารที่พบมากเปนอันดับสองในธรรมชาติรองจากเซลลูโลส 

(Shaikh and 

Deshpande, 1993; Wang and Chang, 1997) เปนทรัพยากรที่สําคัญของสิ่งแวดลอมทั้งในทะเลและ 

บนบก (Tsujibo et al., 1991) โดยเปนสวนหนึ่งของโครงสรางของผนังเซลลของสิ่งมีชีวิต 

มี 

ลักษณะเปนเสนใยยึดสารตาง ๆ ใหเปนแผนและเปนเสน ทําหนาที่หอหุมอวัยวะและสรางความ 

แข็งแรงใหกับผนังเซลล (ปยะบุตร และ สุวลี, 2542) 

ไคตินพบในสิ 

่งมีชีวิตในทะเลหลายชนิด โดยเปนองคประกอบของโครงสรางภายนอก 

ของแพลงกตอนสัตว (zooplankton) และตัวออนของสัตวไมมีกระดูกสันหลัง (invertebrate larvae) 

3

เปนผนังเซลลของ chlorophytes บางชนิด และ เปนโครงสรางภายนอก (extracellular material) ของ 

ไดอะตอมบางชนิด และ prymnesiophytes (Cottrell et al., 1999) นอกจากนี้ 

ยังพบไคตินในสัตวที่มี 

ปลอง (arthropoda) เชน กุง 

ปู และแมลง ในหอยฝาเดียว หอยสองฝา หมึก (สุวลี, 2542) ผนังเซลล 

ของรา (Flach et al., 1992) 

Muzzarelli (1977) รายงานวาไคตินที่ไดจากสิ่งมีชีวิตตางชนิดกัน 

ก็จะมีรูปแบบแตกตางกัน 

ดวย ดังนั้นจึงไดเสนอรูปแบบผลึกของไคติน 

โดยใชความแตกตางของการเกิดระบบของผลึก และ 

ปจจัยการเกิดแลตติชผลึก ของหนวยเซลลภายในโครงสรางผลึก ซึ่งความแตกตางเปนผลมาจาก 

รูปแบบการเรียงตัวของโมเลกุลที่อยูตรงขามกันในแลตติชผลึก 

สายโซโมเลกุลที่ยาวของไคตินเกิด 

มาจากการรวมตัวเปนแผนซอนทับกันในแลตติชผลึกของหนวยเซลล ซึ่งเรียงตัวไดเปน 

2 แบบ คือ 

แบบขนานที่มุงไปในทิศทางเดียวกัน 

(parallel pattern) และแบบที่โครงสรางเรียงตัวสวนทางกัน 

(anti-parallel pattern) จากความแตกตางดังกลาวสามารถจําแนกไคตินไดเปน 3 ชนิดคือ เบตาไคติน 

(β-chitin) แอลฟาไคติน (α-chitin) และแกมมาไคติน (γ-chitin) ดังภาพที่ 

2 

1. เบตาไคติน เปนไคตินที่มีโครงสรางแบบขนานมุงไปในทิศทางเดียวกัน 

รูปแบบนี้มี 

โอกาสที่จะเปลี่ยนรูปแบบโครงสรางไปเปนแอลฟาไคตินไดในสารละลายกรดแก 

เชน กรดเกลือ 

(HCl) เนื่องจากเบตาไคตินมีความเสถียรนอยกวาแอลฟาไคติน 

สิ่งมีชีวิตที่มีโครงสรางเบตาไคติน 

ไดแก สวนหนามของ polychaete สกุล Aphrodite กระดองของหมึกสกุล Loligo สวนที่เปนทอของ 

หนอน สกุล Pogonophora และสวนหนามของไดอะตอมทะเล 

2. แอลฟาไคติน เปนไคตินที่มีโครงสรางแบบเรียงตัวสวนทางกัน 

ซึ่งพบมากที่สุดใน 

ธรรมชาติ ทั้งนี้เพราะแอลฟาไคตินมีคุณลักษณะที่มีความเสถียรมากกวาแบบอื่น 

เพราะมีพันธะ 

ไฮโดรเจน (hydrogen bond) มากกวาแบบอื่น 

สิ่งมีชีวิตที่มีโครงสรางแอลฟาไคตินไดแก 

ในกลุม 

ครัสเตเชียน แมลง และรา 

3. แกมมาไคติน เปนไคตินที่มีโครงสรางแบบผสมทั้ง 

2 ชนิด คือ สองสายเปนแบบที่ 

ขนานไปในทิศทางเดียวกัน และสายสุดทายเปนแบบสวนทาง พบที่ผนังกระเพาะอาหารชั้นในของ 

หมึก สกุล Loligo 

4


2 รูปแบบโครงสรางไคติน 


Esaiassen (1996) 

2. เอนไซมไคติเนส 

ไคติเนสเปนเอนไซมที่แตกพันธะระหวาง 

C1 และ C4 หรือพันธะไกลโคซิดิก (glycosidic 

bond) ของ GlcNAc ที่ตอกันเปนไคตินดังภาพที่ 

3 สิ่งมีชีวิตที่มีไคตินเปนองคประกอบของรางกาย 

จะสรางเอนไซมไคติเนสดวย แตบางชนิดที่ไมมีไคตินเปนองคประกอบก็สามารถสรางเอนไซม 

ไคติเนสได ไดแก แบคทีเรีย และพืชชั้นสูง 

(Flach et al., 1992) 


3 การแตกพันธะไกลโคซิดิกของเอนไซมไคติเนส 


Hara et al. (1989) 

วัตถุประสงคการสรางเอนไซมไคติเนสของสิ 

่งมีชีวิตแตละชนิดจะแตกตางกันไป เชน รา 

และแมลง ใชเอนไซมไคติเนสสําหรับการพัฒนาการและการเจริญของผนังเซลลและเปลือก 

แบคทีเรียใชเอนไซมไคติเนสในระบบการโภชนาการ (nutrition) และในพืชใชเอนไซมไคติเนส 

5

ในการปองกันโรคจากรา แบคทีเรีย และแมลง (Koga et al., 1992; Roberts and Selitrennikoff, 

1988) 

เอนไซมไคติเนสมีบทบาทสําคัญทางดานกายภาพของสัตวในกลุมอารโธพอด 

ซึ่งเกี่ยวของ 

ในการลอกคราบ โดยเอนไซมไคติเนสจะสลาย (hydrolysis) เปลือกที่เกาแลวของกุง 

ปู และแมลง 

และผนังเซลลของรา (Cabib, 1987; Tsujibo et al., 1991) 

Shaikh and Deshpande (1993) ไดแบงประเภทของเอนไซมยอยไคตินไว 2 ชนิดหลัก คือ 

endo-chitinase (EC 3.2.1.14) และ N-acetylglucosaminidase (Chitobiase: EC 3.2.1.30 หรือ 

N-acetylhexosaminidase: EC 3.2.1.52) ตอมามีเพิ่มมาคือ 

exo-chitinase 

1. endo-chitinase เปนเอนไซมที่ยอยแบบสุมในสายโซของ 

N-acetylglucosamine 

(GlcNAc) ซึ่งจะได 

diacetylchitobiose เปนผลผลิตหลักและได triacetylchitotriose บางเล็กนอย 

2. N-acetylglucosaminidase เปนเอนไซมที่ยอย 

dimer (diacetylchitobiose) โดยที่บางครั้ง 

เอนไซมจะยอยหนวยของ GlcNAc จากปลายดาน non-reducing ของสายโซไคติน 

3. exo-chitinase เปนเอนไซมที่กระตุนทําใหเกิดการแตกตัวของ 

diacetylchitobiose จาก 

ปลาย non-reducing ของสายไคติน 

Flach et al. (1992) ไดแบงประเภทของเอนไซมยอยไคตินไว 4 ชนิด คือ endochitinase, 

exochitinase (EC 3.2.1.14), β-N-acetylglucosaminidase และ chitobiase 

1. endochitinase เปนเอนไซมที่ทําใหสายโพลิเมอรของไคตินแยกออกจากกัน 

2. exochitinase เปนเอนไซมที่ยอยไคตินแลวได 

chitobiose 

3. chitobiase เปนเอนไซมที่ยอย 

chitobiose ได GlcNAc 

4. N-acetylglucosaminidase เปนเอนไซมที่ยอยภายในสายไคตินได 

GlcNAc 

6

Jeuniaux (1966) รายงานวาการยอยไคตินโดยเอนไซมเพื่อใหได 

GlcNAc เกิดขึ้นจากการ 

ยอย 2 กระบวนการที่ตอเนื่องกัน 

โดยเอนไซม 2 ชนิด คือ ชนิดแรก chitinase (poly-β-1,4-(2acetamido-2-deoxy)-D-glucoside 

glycanohydrolase) จะยอยไคตินหรือ โพลีเมอร ของ N-acetyl-Dglucosamine 

รวมทั้ง 

tetramers ใหไดเปนผลิตผลที่มีขนาดเล็กกวา 

trimer และชนิดที่สอง 

chitobiase 

(chitobiose acetamidodeoxy-glucohydrolase) ซึ่งจะยอย 

chitobiose (GlcNAc2) และ chitotriose 

(GlcNAc3) แลวได GlcNAc 

Schomburg and Salzmann (1991) รายงานวาในการจัดระบบเอนไซมมีเอนไซมยอยไคติน 

เพียง 2 ชนิดเทานั้น 

คือ chitinase และ N-acetyl-β-glucosaminidase 

1. chitinase (poly (1,4-(N-acetyl-β-D-glucosaminide) )glycanohydrolase: EC 3.2.1.14) มี 

ชื่อเรียกอื่นๆ 

เชน endochitinase, chitodextrinase, poly-β-glucosaminidase, 1,4-β-poly-Nacetylglucosaminidase, 

β-1,4-poly-N-acetylglucosaminidase ซึ่งจะยอยไคตินแบบสุมที่พันธะไกล 

โคซิดิกของไคตินได oligomer ของ GlcNAc ไดแก chitooligosaccharide, GlcNAc3 และ 

chitotetraose (GlcNAc4) และ GlcNAc ถาบมไวนาน ๆ 

2. N-acetyl-β-glucosaminidase (N-acetyl-β-D-glucosaminide Nacetylglucosaminohydrolase: 

EC 3.2.1.30) มีชื่อเรียกอื่น 

ๆ เชน chitobiase, exochitinase และ 

β-N-acetylglucosaminidase เอนไซมนี้จะยอยปลาย 

non-reducing ของสาย N-acetyl-β-Dglucosamine 

สวนที่เหลือจากการยอยดวยเอนไซมไคติเนสคือ 

chitobiose และ oligomer อื่น 

ๆ ได 

ผลผลิตเปน N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine และ ρ-nitrophenol 

Roberts and Cabib (1982) รายงานวาเชื้อแบคทีเรียชนิด 

Serratia marcescens ผลิต 

extracellular chitinase ซึ่งผลิตผลที่ไดจากการยอยคือ 

chitobiose และถาใชเวลาในการบมนานก็จะ 

ได GlcNAc ในขณะที่ 

Flach et al. (1992) รายงานวาเอนไซมยอยไคตินที่พบในราจะตางกันไป 

คือ 

Aspergillus nidulan ผลิต β-N-acetylglucosaminidase และ endochitinase และ Mucor rouxii ผลิต 

exochitinase 

7

(GlcNAc) 2 Chitosan 

GlcNAc (GlcN) 2 

GlcN 


4 ลําดับขั้นของการยอยไคตินของเอนไซมยอยไคติน 


Ferguson and Gooday (1996) 

2.1 แหลงของเอนไซมไคติเนส 

2.1.1 สัตว 

Chitin 

Chitinase Chitin Deacetylase 

N-acetylglucosaminidase Chitiosanase 

Deacetylase 

Glucosaminidase 

Jeuniaux (1961) พบเอนไซมไคติเนสในสัตวไมมีกระดูกสันหลังครั้งแรกใน 

หอยทาก ตอมาพบในโปรโตซัว และตอมในเนื้อเยื่อระบบยอยอาหารของ 

coelenterates, 

nematodes, polychaets, oligochates, molluscs และ arthropods สําหรับในสัตว ไคตินที่กินเขาไปจะ 

ถูกยอยเปน GlcNAc กอน จึงจะดูดซึมไปใช เอนไซมยอยไคตินในระบบยอยอาหารมาจาก 3 แหลง 

คือ เอนไซมที่รางกายผลิตขึ้นมาเอง 

เอนไซมจากจุลชีพในลําไสและทางเดินอาหาร และจากอาหาร 

ที่กินเขาไป 

(Place, 1996) นอกจากนี้ 

สิ่งมีชีวิตในกลุมนีมาโทด 

เอนไซมไคติเนสจะหลั่งออกมาจาก 

เนื้อเยื่อชั้นอีพิเดอรมิส 

ระหวางที่มีการฟกไข 

ในพวกอารโธรพอด เอนไซมไคติเนสจะหลั่งจาก 

เนื้อเยื่อชั้นอีพิเดอรมิส 

ขณะที่มีการลอกคราบ 

ในปลา สัตวเลื้อยคลาน 

สัตวครึ่งบกครึ่งน้ํา 

และนกที่ 

กินแมลงเปนอาหาร เอนไซมไคติเนสจะหลั่งออกมาจากตับออน 

(pancreas) และเนื้อเยื่อชั้นในของ 

กระเพาะอาหาร (gastric mucosa) เพื่อยอยอาหารที่กินเขาไป 

สวนในสัตวที่เลี้ยงลูกดวยนม 

เอนไซม 

ไคติเนสจะหลั่งออกมาจากเนื้อเยื่อชั้นในกระเพาะอาหาร 

(Jeuniaux, 1966) เอนไซมไคติเนสใน 

8

เลือดของปลา turbot (Scophthalmus maximus) มีบทบาทในการปองกันโรคจากรา และปองกัน 

ปรสิต (Manson et al., 1992) 

2.1.2 พืช 

พบวาในพืชมีสารยับยั้งการเจริญของราซึ่งไดแก 

เอนไซมไคติเนส และβ-1,3glucanaseโดยการสรางเอนไซมไคติเนส 

และβ-1,3-glucanase ในพืชจะถูกกระตุนโดยฮอรโมน 

เอธีลีน หรือเมื่อถูกรุกรานจากเชื้อโรคและแมลง 

(Schlumbaum et al., 1986; Verburg and Huynh, 

1991) เอนไซมไคติเนส และβ-1,3-glucanase จาก pea pods มีคุณสมบัติในการยอยผนังเซลลของรา 

โดยเอนไซมไคติเนสที่สกัดไดสามารถยับยั้งเชื้อราชนิด 

Trichoderma viride (Mauch et al., 1988) 

นอกจากนี้ 

ยังมีการศึกษาเอนไซมไคติเนสในพืชและเมล็ดพืช เชน เมล็ดขาวบารเลย (Leah et al., 

1991) มะเขือเทศ (Lycopersicon esculentum) (Pegg, 1988) ในใบถั่ว 

(bean leaves) (Mauch and 

Staehelin, 1989) 

2.1.3 จุลินทรีย 

ในสิ่งแวดลอมทางทะเล 

มีโพลิเมอรตาง ๆ คือ แปงจากสาหราย เซลลูโลสจาก 

สาหรายและพืช ไคตินจากสิ่งมีชีวิตในกลุมครัสเตเชียน 

และผนังเซลลของพืช โพลิเมอรเหลานี้จะมี 

การยอยสลายอยางชา ๆ และมีการสะสมในทะเลนอยมาก ยกเวนในเขตชายฝง 

(neritic sea) โดยการ 

ยอยสวนใหญเกิดจากจุลินทรียที่อยูในทะเล 

(Tsujibo et al., 1991) จุลินทรียจึงเปนแหลงผลิต 

เอนไซมไคติเนสที่สําคัญ 

และจุลินทรียที่สามารถผลิตเอนไซมนี้พบไดทั้งในแบคทีเรีย 

รา และยีสต 

ไคติเนสที่ผลิตไดจากแบคทีเรียหลายๆ 

สายพันธุ 

พบวามีทั้งชนิดที่ผลิตแลวเก็บไวใชภายในเซลล 

(intracellular chitinase) และชนิดที่ผลิตแลวหลั่งออกมาภายนอกเซลล 

(extracellular chitinase) โดย 

สวนใหญมักพบแบบ extracellular chitinase มากกวา 

เอนไซมไคติเนสที่ไดจาก 

Streptomyces จะพบทั้ง 

exochitinase และ endochitinase 

เชน ใน Streptomyces sp. (Reynolds, 1954; Ueno et al., 1990) และ S. plicatus (Robbins 

et al., 1988) S. erythraeus (Hara et al., 1989) S. griseus (Berger and Reynolds, 1958) และยีสตที่ 

ผลิตเอนไซมไคติเนสไดเชน Saccharomyces cereviseae (Cabib et al., 1992; Kuranda and 

Robbins, 1991) 

9

ราสวนใหญจะสามารถผลิตเอนไซมไคติเนสได เนื่องจากสวนของผนังเซลล 

ของรามีไคตินเปนองคประกอบ ตัวอยาง เชน Mucor rouxii ( Pedraza-Reyes and Lopez-Romero, 

1989) Candida albicans (Dickinson et al., 1989) Myrothecium verrucaria (Vyas and Deshpande, 

1989) 

แบคทีเรียในสกุล Aeromonas, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Beneckea, 

Acromobactor และ Alginomonas เปน แบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมไคติเนสซึ่งคัดแยกไดจากโคลนและ 

น้ําทะเล 

และกระเพาะอาหารของปลา (Tsujibo et al., 1991; Zhou et al., 1999) ซึ่งแบคทีเรียที่แยก 

ไดจากลําไส และกระเพาะอาหารของปลาทะเล เปนพวกที่อยูรวมกับปลาในแบบพึ่งพากัน 

(symbiosis) ไดแก Vibrio Photobacterium และ Enterobacteriaceae (Place, 1996) 

3. ปจจัยที่มีผลตอการผลิตเอนไซมไคติเนสของแบคทีเรีย 

ปจจัยที่มีผลตอการผลิตเอนไซมไคติเนสมีหลายประการ 

เชน ความเปนกรด-ดาง เริ่มตน 

อุณหภูมิ ระยะเวลาในการผลิต ปริมาณและชนิดของซับสเตรท ทั้งนี้ปจจัยเหลานี้จะแตกตางกันไป 

ขึ้นอยูกับชนิดของจุลินทรีย 

ดังตารางที่ 

1 

Zobell and Rittenberg (1938) รายงานวาแบคทีเรียที่แยกไดจากทะเล 

นอกจากจะเจริญไดดี 

ในน้ําทะเลแลว 

การผลิตเอนไซมไคติเนสและหลั่งออกมาภายนอกเซลล 

จะเกิดขึ้นเมื่อไดรับอาหาร 

ที่มีแหลงคารบอน 

และไนโตรเจนที่พอเหมาะ 

แหลงคารบอนที่สําคัญคือ 

ไคติน 

เมื่อนําแบคทีเรียทางทะเลชนิด 

Vibrio harveyi มาเลี้ยงในอาหารที่มีเบตาไคตินเปน 

ซับสเตรท พบวาแบคทีเรียชนิดนี้มีอัตราการเจริญสูงสุดและใหกิจกรรมของเอนไซมสูงกวาอาหาร 

ที่มีแอลฟาไคติน 

ทั้งนี้เนื่องจากเบตาไคตินเปนโครงสรางที่มีลักษณะเปดมากกวาแอลฟาไคติน 

จึงทําใหเอนไซมยอยไดงายกวา (Svitil et al., 1997) Pseudomonas aeruginosa K-187 สามารถใช 

Shrimp Crab Shell Powder (SCSP) เปนแหลงคารบอนไดดีกวาไคตินในการผลิตเอนไซมไคติเนส 

(Wang et al., 1995) 

10

Chen and Chen (1991) รายงานการคัดแยกแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมยอยไคติน 

พบวารอย 

ละ 7.4 ของแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมยอยไคตินจะไมสราง 

gelatinase และ caseinase โดยสวนใหญ 

คัดแยกจากดิน ไมพบในกุง 

ไมเจริญในอาหาร nutrient broth หรือ tryptic soy broth แตเจริญไดใน 

อาหาร Salt Pectin Broth ซึ่งแบคทีเรียที่แยกไดทั้งหมดสามารถเจริญไดในอาหารชนิดนี้ 

Tsujibo et al. (1991) รายงานวาที่ความเขมขนของซับเสตรท 

(colloidal chitin) รอยละ 

0.5 กิจกรรมของเอนไซมไคติเนสที่ไดจากแบคที่เรียสกุล 

Alteromonas sp. เพิ่มขึ้นเมื่อเวลาเพิ่มขึ้น 

แตหลังจากเวลา 24 ชั่วโมง 

กิจกรรมของเอนไซมไคติเนสจะลดลง และไมพบกิจกรรมของไคติเนส 

ในอาหารที่ไมมีไคติน 

ตารางที่ 

1 ปจจัยที่มีผลตอการผลิตเอนไซมไคติเนสของแบคทีเรียชนิดตางๆ 

ชนิดและ 

ปริมาณ 

ซับสเตรท 

สภาวะที่เหมาะสม 

ชนิดของแบคทีเรีย 

pH 

อุณหภูมิ 

( oC) เวลา 

(วัน) 

เอกสารอางอิง 

Pseudomonas aeruginosa 3% SCSP 

K-187 

1 9.0 45 2 Wang and Hwang 

(2001) 

Serratia marcescens 1.5% chitin 7.5 30 4-6 Monreal and Reese 

(1969) 

Vibrio sp. 11211 0.5% colloid 

chitin 

7.5 28 7 Zhou et al. (1999) 

Bacillus licheniformis 0.5% colloid 7.0 50 2 Takayanagi et al. 

X-7u 

chitin 

(1991) 

Alteromonas sp. D-7 0.5% colloid 

chitin 

7.6-7.8 27 7 Tsujibo et al. (1991) 

1 SCSP– Shrimp Crab Shell Powder 

11

4. คุณสมบัติของเอนไซมไคติเนส 

เอนไซมไคติเนสที่ผลิตจากแบคทีเรียตางสายพันธุกันจะมีคุณสมบัติตางกัน 


2 

Park et al. (1997) รายงานวาเอนไซมไคติเนสที่ไดจากการเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียชนิด 

Enterobacter sp. G-1 ในอาหารเลี้ยง 

จะสามารถยอยไดเฉพาะไคตินที่มีขนาดเล็กคือ 

colloidal 

chitin และ ethyleneglycol chitin แตไมสามารถที่จะยอย 

Carboxymethyl Cellulose (CMC) ได และ 

เมื่อนําเอนไซมไคติเนสที่ทําใหบริสุทธิ์มายอย 

colloidal chitin จะได GlcNAc2, GlcNAc3 และ 

GlcNAc 4 

5. ประโยชนของเอนไซมไคติเนส 

5.1 เปนสารควบคุมทางชีวภาพ (biocontrol agent) 

Rojas-Avelizapa et al. (1999) ศึกษาแบคทีเรียชนิด Bacillus thuringiensis โดยให 

ความสําคัญในการศึกษา 2 ประการ คือ ประการแรก คัดเลือกสายพันธุที่สามารถผลิตเอนไซม 

ไคติเนสที่มีคุณสมบัติเปน 

bioinsecticide ใหไดปริมาณมาก ประการที่สอง 

คัดเลือกสายพันธุที่มี 

กิจกรรมของเอนไซมสูงสุด หรือใหผลผลิตสูงเมื่อนํามายอยของเหลือทิ้งจากอุตสาหกรรม 

และพบ 

วาสายพันธุ 

Bt-112 (B. thuringiensis serovar tolworthi) ผลิตเอนไซมไคติเนสที่มีความเปนพิษตอ 

แมลงในสกุล Manduca sexta, Aedes aegypti และ Leptinotarsa texana และยังเปนพิษตอตัวออน 

ของ Manduca sexta ในระยะ Instar I นอกจากนี้ 

Lorito et al. (1998) ไดโคลนยีนสของเชื้อราชนิด 

Trichoderma harzianum ยายไปใสในตนใบยาสูบ และมันฝรั่ง 

เพื่อใหพืชทั้ง 

2 ชนิดมีคุณสมบัติใน 

การตอตานโรคจากรา เพราะเชื้อราชนิดนี้สามารถผลิต 

endochitinase ที่มีคุณสมบัติเปนสารยับยั้ง 

เชื้อรา 

12

5.2 ใชในการเตรียม Chitooligosaccharide 

เอนไซมไคติเนสเปนเอนไซมที่แตกพันธะของไคตินแลวไดผลิตภัณฑที่มีขนาด 

จําเพาะแตกตางกันไปตามชนิดของเอนไซมเชน โมโนเมอร ไดเมอร ไตรเมอร และโอลิโกแซก 

คาไรด อื่นๆ 

โดยที่สายไคตินที่มีขนาดตางกันนี้จะมีคุณสมบัติทางกายภาพ 

และชีวภาพตางกัน ซึ่ง 

สามารถนําไปใชประยุกตใชในอุตสาหกรรมอาหาร อาหารเสริมสุขภาพ การแพทย และการเกษตร 

(รัฐ, 2542) Shaikh and Deshpande (1993) รายงานวา chitooligosaccharide เชน chitohexaose และ 

chitoheptaose เปนสารพวก biologically active oligosaccharide ซึ่งมีคุณสมบัติในการตานการเกิด 

เนื้องอก 

(anti-tumour) นอกจากนี้ 

Murao et al. (1992) รายงานวาเอนไซมไคติเนสจาก Vibrio 

alginolyticus เมื่อนํามายอย 

colloidal chitin จะได chitotriose และ chitopentaose 

5.3 ใชเอนไซมไคติเนสในการเตรียมโปรโตพลาสตของเชื้อรา 

เนื่องจากไคตินเปนโครงสรางสวนใหญของผนังเซลลของรา 

เอนไซมยอยไคตินจึงมี 

ความสําคัญในการเตรียมโปรโตพลาสต (Koga et al., 1988; Vyas and Deshpande, 1989) การ 

เตรียมโปรโตพลาสตจากรา มีความสําคัญมากในการนําไปใชประโยชนในดานเทคโนโลยีชีวภาพ 

โดยจะใชโปรโตพลาสตในการศึกษา การสรางผนังเซลล การสรางเอนไซม, steroid transformation 

และ mutagenesis (Kelkar et al., 1990) 

Yanagi and Takebe (1984) ใชเอนไซมหลายชนิดเพื่อที่จะเตรียมโปรโตพลาสตจาก 

Coprinus macrorhizus และราในกลุม 

Bacidiomycete อื่น 

ๆ พบวากิจกรรมของเอนไซมไคติเนส 

สามารถเตรียมโปรโตพลาสได และบอยครั้งการยอย 

mycelial ของราในการเตรียมโปรโตพลาสต 

จะชา ดังนั้นจึงมีการผสมเอนไซมยอย 

mycelium กับเอนไซมไคติเนสเขาดวยกัน 

5.4 ใชในการเตรียม Single-cell protein (SCP) 

การผลิต SCP เปนการนําของเสียที่มีไคตินอยู 

เชน เปลือกกุง 

กระดองปู และกระดอง 

หมึก (Corroad and Tom, 1978) โดยในขั้นแรกเปนการดึงเอาสวนที่เปนโปรตีนและสารอื่นๆที่ไม 

ตองการออกเพื่อใหไดเฉพาะไคติน 

จากนั้นจึงนําจุลินทรียที่สามารถยอยไคตินไดมาทําการยอยจะ 

13

ไดเปน monomer ของ N-acetylglucosamine ซึ่ง 

N-acetylglucosamine ที่ไดจะนํามาเปนอาหารให 

กับยีสตสายพันธที่สามารถผลิต 

SCP ไดตอไป (Wilke et al., 1976) 

Revah-Moiseev and Carroad (1981) ศึกษาการใชเอนไซมในการแปรรูปของเสียจาก 

อุตสาหกรรมสัตวน้ําพวกหอย 

กุง 

และปู ซึ่งสวนใหญ 

คือไคติน เพื่อใหได 

Single-Cell Protein 

(SCP) จากยีสตโดย SCP จะนําไปใชเปนอาหารเสริมในการเลี้ยงสัตวและการเพาะเลี้ยงสัตวน้ํา 

ไคติเนสจากแบคทีเรียชนิด Serratia marcescens เมื่อนํามายอย 

SCSP สามารถใหผลผลิตที่เหมาะ 

สมในการเจริญของยีสตสายพันธุ 

Pichia kudriavezevii พบวาสามารถผลิต SCP ที่มีปริมาณ 

โปรตีนสูงถึงรอยละ 45 และกรดนิวคลีอิกรอยละ 8-11 

14


2 คุณสมบัติของเอนไซมไคติเนสที่แยกไดจากแบคทีเรีย 

ชนิดของแบคทีเรีย 

Bacillus alvei E1 (FB1) 

B. sphaericus J1 (FB2) 

B. cereus J1-1 (FB3) 

Pseudomonas aeruginosa K-187 

F Ι 

F ΙΙ 

Vibrio sp. 11211 

Aeromonas hydrophila H-2330 

Enterobacter sp. G-1 (ChiA) 

Aeromonas sp. 10S-24 

I 

II 

1 ρCMB- ρ-chloromercuribenzoate 

2EDTA- ethylenediaminetetraacetate 

ND-Not determined 

Molecular สภาวะที่เหมาะสม 

ความคงตัวของ 

weight ของเอนไซม เอนไซม 

[kDa] pH อุณหภูมิ (°C) pH อุณหภูมิ(°C) 

71 9 50 7-10 70 

71 9 60 5-9 70 

65 7 50 5-9 60 

30 

32 

30 

62 

60 

112 

115 

8 

7 

6.5 

5-8 

7 

4 

4 

50 

40 

50 

40 

40 

50 

60 

6-9 

5-10 

4-9 

ND 

5-10 

4-9 

5-7 

50 

60 

1. อาหารเลี้ยงเชื้อ 

- Tryptic Soy Broth (Merck) 

- Tryptic Soy Agar (Merck) 

2. สารเคมี 

อุปกรณและวิธีการ 

อุปกรณ 

- Chitin powder (T.C. union food Co., Ltd.) 

- Peptone (Difco) 

- Sodium chloride (NaCl, Univar) 

- Sodium carbonate (Na 2CO 3, Merck) 

- Potassium ferricyanide (K 3Fe(CN) 6 , Sigma) 

- Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad ) 

- Sodium dodecyl sulfate (SDS, Bio-Rad) 

- N,N,N,N′-Tetra-methyl-ethylenediamine (TEMED, Bio-Rad) 

- Ammonium persulfate (Bio-Rad) 

- Glycerol (Univar) 

- Bromophenol blue (USB) 

- Coomassie brilliant blue R-250 (Labchem) 

- 2-Mercaptoethanol (Bio-Rad) 

- Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris-base, Merck ) 

- Glycine (Fluka) 

- Bovine serum albumin (Fluka) 

- N-acetyl-D-glucosamine (Fluka) 

- LMW Gel Filtration Calibration kit (Amersham Pharmacia Biotech) 

- Protein molecular weight marker (MBI Fermentas) 

16

- Ammonium sulfate (Merck) 

- Sephacryl S-200HR (Amersham Pharmacia Biotech) 

- Acetic acid (CH 3COOH, Labscan) 

- Citric acid (C 6H 8O 7.H 2O, Merck) 

- Hydrochloric acid (HCl, Labscan) 

- Sodium hydroxide (NaOH, Univar) 

- Disodium hydrogen phosphate (Na 2HPO 4.2H 2O, Merck) 

- Hydrogen peroxide (H 2O 2, Fluka) 

- ชุดจัดจําแนกจุลินทรีย เอ พี ไอ (Biomérieux 50 CHB) 

3. เครื่องมือ 

- เครื่องปน 

(blender) 

- ตูบมเชื้อ 

(incubator ) Termaks: B8000 และ Memmert: BE500 

- หมอนึ่งฆาเชื้อ 

(autoclave) Tommy: B8000 

- อางน้ําควบคุมอุณหภูมิ 

(waterbath) Memmert: WB45 

- เครื่องผสม 

(vortex mixture) Vortex-Genie2 

- เครื่องเหวี่ยงหนีศูนยกลางชนิดควบคุมอุณหภูมิ 

(centrifuge) Hettich: Universal 32R 

- เครื่องเหวี่ยงหนีศูนยกลาง 

(micro-centrifuge) Hettich: Mikro 12-24 

- เครื่องวัดความเปนกรด-ดาง 

(pH meter) Hach: Sension3 

- เครื่องนับจํานวนโคโลนี 

(colony counter) Stuart scientific 

- กลองจุลทรรศน (microscope) Olympus: BX51 

- เครื่องวัดคาการดูดกลืนแสง 

(spectrophotometer) Heλios γ: Thermo Spectronic 

- เครื่องเขยา 

(shaker) Ika: Vibrax-VXR 

- ชุดคอลัมนโครมาโตกราฟ (colum chromatography) Amersham Pharmacia Biotech 

- ปมดูดจายสาร 

(peristaltic pump) Eyela: MP-3 

- เครื่องเก็บตัวอยาง 

(fraction collecter) Waters fraction collector 

- ชุดอีเล็กโตรโฟรีซีส (electrophoresis) Bio-Rad: Mini-gel protien II 

- เครื่องชั่ง 

3 ตําแหนง Sartorius: CP323S 

- เครื่องชั่ง 

4 ตําแหนง Sartorius: CP224S 

17

- ตูแชแข็ง 

(freezer) Heto 

- ตูอบ 

(hot air oven) Binder: FD115/E2 

- Hot plate (Ika: ceramagMidi) 

- Adjustable volume pipette (25 µl, 100 µl, 1,000µl) Hamilton 

- Dialysis tube (Mw cut off: 6,000-8,000 dalton) Spectrum/Por membrane 

- Glass wool 

- เครื่องแกวที่จําเปนในการวิเคราะห 

18

1. ขั้นตอนการศึกษา 

วิธีการ 

ตัวอยางสัตวทะเล 

Spread plate ลงบน Chitin agar 

คัดเลือกเฉพาะโคโลนีที่เกิดโซนใส 

ทําเชื้อใหบริสุทธิ์ 

คัดเลือกในอาหารแข็ง 

คัดเลือกในอาหารเหลว 

จําแนกชนิด 

- ศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซมไคติเนส 

- ศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการทํางานของสารสกัดเอนไซมไคติเนส 

- ศึกษาคุณสมบัติและการทําเอนไซมไคติเนสใหบริสุทธิ์ 

2. การแยกแบคทีเรียทางทะเลที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

เก็บตัวอยางสัตวทะเลไดแก ปลาวัว (กระเพาะอาหาร) หอยแมลงภู 

(ทั้งตัว) 

กุงกุลาดํา 

และ 

กุงแชบวย 

(สวนหัวกุง) 

ปู (อวัยวะภายใน) และหมึก (อวัยวะภายในยกเวนถุงหมึก) ชั่งตัวอยาง 

25 กรัม หรือตวงตัวอยางปริมาตร 25 มิลลิลิตร ใสลงใน สารละลายอัลคาไลนเปปโตน ปริมาตร 

225 มิลลิลิตร นําไปตีใหเขากันดวยเครื่องตีปนอาหาร 

บมที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 

1 ชั่วโมง 

นํามาเจือจางตั้งแต 

10 เทาจนถึง 10 -6 - 10 -8 เทา ดูดตัวอยางที่ระดับความเจือจางตาง 

ๆ 0.1 

มิลลิลิตร ลงบนอาหาร chitin agar (CHA) ทําการ spread ดวยแทงแกวรูปตัวแอล (L- rod) นําไปบม 

19

ที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 3-5 วัน (ดัดแปลงจาก Frändberg and SchnÜrer, 1994) นับ 

โคโลนีที่เกิดขึ้นทั้งหมดและนับเฉพาะโคโลนีที่เกิดโซนใส 

(clear zone) คํานวณหาอัตราสวน 

ระหวางจํานวนของแบคทีเรียที่เกิดโซนใส 

กับจํานวนของแบคทีเรียทั้งหมด 

(Chen and Chen, 

1991) เพื่อเปรียบเทียบปริมาณของแบคทีเรียที่สามารถผลิตเอนไซมไคติเนสในสัตวแตละชนิด 

ถายโคโลนีที่เกิดโซนใสลงบนอาหาร 

tryptic soy agar (TSA) ที่มี 

NaCl รอยละ 3 โดยการ 

cross streak ทําซ้ํา 

2 ครั้ง 

เพื่อใหไดเชื้อบริสุทธิ์ 

การคัดเลือกแบคทีเรียที่เกิดโซนใสในขั้นตอนนี้จะ 

ทําการคัดเลือกเฉพาะโคโลนีที่ขึ้นเปนโคโลนีเดี่ยว 

และเกิดโซนใสไดชัดเจน ตรวจสอบแบคทีเรีย 

บริสุทธิ์เบื้องตนจากสมบัติการติดสีแกรม 

และสันฐานวิทยาของเซลล เก็บรักษาเชื้อแบคทีเรียใน 

tryptic soy broth (TSB) ที่มี 

NaCl รอยละ 3 และมีกลีเซอรอล (glycerol) รอยละ 40 ที่อุณหภูมิ 

– 40 

องศาเซลเซียส (จินตลา, 2544) เพื่อนําไปคัดเลือกเพื่อใหไดไอโซเลทที่มีประสิทธิภาพดีที่สุดในการ 

ผลิตเอนไซมไคติเนส 

3. การคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมไคติเนสในอาหารแข็ง 

เพาะเลี้ยงแบคทีเรียผลิตเอนไซมไคติเนสที่คัดเลือกไดในขอ 

1 ลงบนอาหาร chitin agar 

(CHA) โดยการ point inoculate บมที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 5 วัน วัดเสนผานศูนย 

กลางโคโลนีและโซนใสที่เกิดขึ้น 

คํานวณหาอัตราสวนระหวางขนาดของโซนใสกับขนาดของโค 

โลนี (Wang et al., 1995) คัดเลือกเฉพาะไอโซเลทที่มีอัตราสวนดังกลาวตั้งแต 

6 มิลลิเมตรขึ้นไป 

ทั้งนี้เพราะแบคทีเรียบางไอโซเลทสามารถสรางโซนใสขนาดใหญ 

แตมีขนาดของโคโลนีใหญดวย 

นั่นแสดงวาตองใชปริมาณของแบคทีเรียเปนจํานวนมากในการสรางโซนใสขนาดใหญ 

ในขณะที่ 

บางไอโซเลทสามารถสรางโซนใสขนาดใหญเชนเดียวกันแตมีขนาดของโคโลนีเล็ก นั่นแสดงวา 

ปริมาณของแบคทีเรียนอยกวาแตสรางโซนใสขนาดใหญไดเหมือนกัน ไอโซเลทที่มีขนาดของโค 

โลนีเล็กจึงมีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมสูงกวาไอโซเลทที่มีขนาดของโคโลนีใหญ 

20

4. การคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมไคติเนสในอาหารเหลว 

นําแบคทีเรียที่คัดเลือกไดจากอาหารแข็งมาศึกษาความสามารถในการผลิตเอนไซมใน 

อาหารเหลว สําหรับผลิตเอนไซม chitin broth (CHB) ทําการเลี้ยงกลาแบคทีเรียโดยใชอาหาร 

TSA 

บมที่ 

37 องศาเซลเซียส 24-48 ชั่วโมง 

ถายลงในอาหาร TSB บมที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส โดย 

ใชเครื่องเขยา 

200 รอบตอนาที เปนเวลา 24-48 ชั่วโมง 

นํากลาแบคทีเรีย 1 มิลลิลิตร ที่ไดมา 

inoculate ลงไปใน หลอดทดลอง ที่มี 

CHB อยู 

10 มิลลิลิตร นําไปบมที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส 

เขยาดวยความเร็ว 200 รอบตอนาที เปนเวลา 5 วัน เหวี่ยงแยกเอาเซลลและไคตินออกโดยใช 

ความเร็ว 9,000 รอบตอนาที เปนเวลา 20 นาที เก็บสวนใสไปวิเคราะหหากิจกรรมของเอนไซม 

ดังภาคผนวก ก ขอ 9 (Wang et al., 1995) 

5. การจัดจําแนกชนิดแบคทีเรียที่คัดเลือกได 

การจัดจําแนกชนิดแบคทีเรียใชลักษณะทางสัณฐานวิทยา สรีระวิทยา และ ชีวภาพ ตาม 

หลักการของ Bergey's manual of determinative bacteriology (Sneath, 1984) และใชชุดจัดจําแนก 

ชนิดจุลินทรีย เอ พี ไอ (Biomérieux 50 CHB) 

6. การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการเจริญ 

และการผลิตเอนไซมไคติเนสของแบคทีเรียที่ 

คัดเลือกได 

6.1 ศึกษาความเปนกรด-ดาง เริ่มตนที่เหมาะสมในการเจริญ 


การศึกษาระดับความเปนกรด-ดาง ของอาหารเริ่มตนที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซม 

เตรียมอาหาร CHB ที่มีระดับความเปนกรด-ดาง 

เริ่มตนดังนี้ 

4.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0, 12.0 โดยใช 

0.1 M NaOH และ 0.1 N HCl เปนตัวปรับคาความเปนกรด-ดาง ถายกลาแบคทีเรียที่คัดเลือกได 

ลง 

ไปในอาหารนําไปบมที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส เขยาที่ความเร็ว 

200 รอบตอนาที เก็บตัวอยาง 

ทุก 6 ชั่วโมง 

นํามาศึกษาการเจริญของแบคทีเรีย และวิเคราะหหากิจกรรมของเอนไซม (Wang et 

al., 1995) 

21

6.2 ศึกษาอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเจริญ 


การศึกษาอุณหภูมิที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซม 

เตรียมอาหาร CHB (ความเปนกรด- 

ดาง ที่เหมาะสมในขอ 

6.1) ถายกลาแบคทีเรียที่คัดเลือกได 

ใสลงในอาหาร CHB นําไปบมที่ 

อุณหภูมิดังนี้ 

20, 30, 37, 40, 50, 60 องศาเซลเซียส เขยาที่ความเร็ว 

200 รอบตอนาที เก็บตัวอยาง 

ทุก 6 ชั่วโมง 

นํามาศึกษาการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย และวิเคราะหหากิจกรรมของเอนไซม 

(Wang et al., 1995) 

6.3 ศึกษาระยะเวลาที่เหมาะสมในการเจริญเติบโต 


การศึกษาระยะเวลาที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซมไคติเนส 

เตรียมอาหารที่ความเปน 

กรด-ดาง ที่เหมาะสมในขอ 

6.1 และบมที่อุณหภูมิ 

ที่เหมาะสมในขอ 

6.2 เขยาที่ความเร็ว 

200 รอบ 

ตอนาที เก็บตัวอยางทุก 6 ชั่วโมง 

นํามาศึกษาการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย และวิเคราะหหา 

กิจกรรมของเอนไซม (Wang et al., 1995) 

7. การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการทํางานของเอนไซมไคติเนส 

ถายกลาแบคทีเรีย ใสลงในอาหาร CHB (ความเปนกรด-ดาง ที่เหมาะสมในขอ 

6.1) 

ปริมาตร 250 มิลลิลิตร ในขวดรูปชมพู 

ขนาด 500 มิลลิลิตร เขยาที่ความเร็ว 

150 รอบตอนาที บมที่ 

อุณหภูมิ ที่เหมาะสมในขอ 

6.2 และเวลาที่เหมาะสมในขอ 

6.3 หลังจากนั้นนําเอาอาหารเลี้ยง 

แบคทีเรียดังกลาว มาเหวี่ยงแยกตะกอนที่ความเร็ว 

9,000 รอบตอนาที อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส 

เวลา 20 นาที เก็บสวนที่เปนสารละลายดานบน 

(supernatant culture broth) ไวเพื่อนําไปศึกษาคุณ 

สมบัติของเอนไซม 

7.1 การศึกษาความเปนกรด-ดาง ที่เหมาะสมตอกิจกรรมของเอนไซมไคติเนส 

ผสม supernatant culture broth ลงใน substrate buffer (0.3 % colloidal chitin) ที่ความ 

เปนกรด-ดาง ดังนี้ 

2.0, 4.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0 โดยใช buffer ดังนี้ 

ความเปนกรด-ดาง 2.0-7.0 ใช 0.1 

M McIlvaine buffer, ความเปนกรด-ดาง 8.0 ใช 0.1 M Tris-HCl buffer และความเปนกรด-ดาง 9.0- 

10.0 ใช 0.2 M Glycine-NaOH buffer ดังภาคผนวก ก ขอ 13 บมที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส นาน 

22

60 นาที เขยาที่ความเร็ว 

200 รอบตอนาที หลังจากนั้นนําไปวิเคราะหหาปริมาณของ 

GlcNAc ดัง 

ภาคผนวก ก ขอ 8 (Wiwat et al., 1999) 

7.2 การศึกษาความคงตัวของเอนไซมไคติเนสที่ความเปนกรด-ดาง 

ตางๆ 

เตรียมสารละลาย buffer ที่ความเปนกรด-ดาง 

ตางๆคือ 2.0, 4.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0, 

11.0, 12.0 โดยใช buffer ดังนี้ 

ความเปนกรด-ดาง 2.0-7.0 ใช 0.1 M McIlvaine buffer ความเปน 

กรด-ดาง 8.0 ใช 0.1 M Tris-HCl buffer ความเปนกรด-ดาง 9.0-12.0 ใช 0.2 M Glycine-NaOH 

buffer นํา supernatant culture broth ปริมาตร 2 มิลลิลิตร ผสมกับสารละลาย buffer ตาม ความเปน 

กรด-ดาง ที่ตองการ 

2 มิลลิลิตร นําไปบมที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส นาน 10 นาที เขยาที่ความเร็ว 

200 รอบตอนาที จากนั้นนําไปวิเคราะหหากิจกรรมของเอนไซม 

(Wang et al.,1995) 

7.3 การศึกษาอุณหภูมิที่เหมาะสม 

ตอกิจกรรมของเอนไซมไคติเนส 

ผสม supernatant culture broth ลงใน ซับเสตรท (0.3% colliodal chitin 0.1 M 

McIlvaine buffer pH 4.0 ) นําไปบมที่อุณหภูมิ 

20, 30, 37, 40, 50, 60, 70 องศาเซลเซียส นาน 60 

นาที เขยาที่ความเร็ว 

200 รอบตอนาที หลังจากนั้นนําไปวิเคราะหหาปริมาณของ 

GlcNAc (ดัด 

แปลงจาก: Wiwat et al., 1999) 

7.4 การศึกษาความคงตัวของเอนไซมไคติเนสที่ 

อุณหภูมิ ตางๆ 

ผสม supernatant culture broth 2 มิลลิลิตร ลงในสารละลาย 0.1 M McIlvaine buffer 

pH 4.0 ปริมาตร 2 มิลลิลิตร บมที่อุณหภูมิ 

20, 30, 37, 40, 50, 60 องศาเซลเซียส เปนเวลา 10 นาที 

ในเครื่องเขยาที่ความเร็ว 

200 รอบตอนาที เสร็จแลวใหนํามาแชน้ําเย็นทันที 

จากนั้นนําไปวิเคราะห 

หากิจกรรมของเอนไซม (Wang et al.,1995) 

23

8. การศึกษาคุณสมบัติและการทําเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจากแบคทีเรียใหบริสุทธิ์ 

ถายกลาเชื้อ 

5 มิลลิลิตรใสลงในอาหาร chitin broth ปริมาตร 260 มิลลิลิตร ใน flask ขนาด 

500 มิลลิลิตร เลี้ยงในเครื่องเขยาที่ความเร็ว 

150 รอบตอนาที อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 48 

ชั่วโมง 

หลังจากนั้นนําเอาอาหารดังกลาว 

มาเหวี่ยงแยกตะกอนที่ความเร็ว 

9,000 รอบตอนาที 

อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เวลา 20 นาที เก็บสวนที่เปนสารละลายดานบนไปหาปริมาณโปรตีนโดย 

วิธี Bradford ดังภาคผนวก ก ขอ 10 กิจกรรมของเอนไซม และ นําไปทําใหบริสุทธิ์ดังขั้นตอนดังนี้ 

8.1 การเตรียมสารสกัดเอนไซม และการตกตะกอนเอนไซมไคติเนส ดวยแอมโมเนียม 

ซัลเฟต 

นําสารละลายสวนใสมาตกตะกอนดวยแอมโมเนียมซัลเฟต ที่ความเขมขนรอยละ 

0-40, 40-60, 60-80, 80-90 ดังตารางผนวกที่ 

ก ขอ 9 คนดวยความเร็วปานกลางเปนเวลา 2 ชั่วโมง 

นําไปเหวี่ยงแยกตะกอนที่ความเร็ว 

9,000 รอบตอนาที อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที นํา 

ตะกอนที่ไดมาละลายดวย 

20 mM Tris-HCl buffer ความเปนกรด-ดาง 7.0 จากนั้นนําสารละลายมา 

ทํา dialysis โดยใชถุง dialyze ที่มี 

molecular weight cut off 6,000-8,000 dalton ใน 20 mM Tris- 

HCl buffer ความเปนกรด-ดาง 7.0 อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เปนเวลา 24 ชั่วโมง 

โดยเปลี่ยนสาร 

ละลาย 20 mM Tris-HCl buffer ความเปนกรด-ดาง 7.0 4 ครั้ง 

นําสารละลายที่ไดมาหาปริมาณ 

โปรตีน และ กิจกรรมของเอนไซม นําไปทําใหแหงโดยวิธี lyophylization เพื่อลดปริมาตรและเพิ่ม 

ความเขมขนของสารละลาย 

8.2 การทําเอนไซมไคติเนสใหบริสุทธิ์โดยวิธี 

gel filtration chromatography 

การทํา gel filtration chromatography เปนวิธีการทําใหโปรตีนบริสุทธิ์ 

โดยอาศัยการ 

แยกขนาดของโปรตีน หลักการ คือ การใหโมเลกุลของโปรตีนเคลื่อนที่ผานรูพรุนของตัว 

stationary phase ภายในคอลัมน โดยโปรตีนที่มีขนาดใหญสามารถเคลื่อนที่ผานชองวางระหวาง 

เม็ดเจลของตัว stationary phase และออกจากคอลัมนไดกอน สวนโปรตีนที่มีขนาดเล็กจะสามารถ 

เขาไปในรูพรุนของตัว stationary phase จึงออกจากคอลัมนภายหลัง 

24

นําสารสกัดเอนไซม 30 มิลลิกรัม มาละลายใน 20 mM Tris-HCl buffer ที่คาความเปน 

กรด-ดาง 8.0 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร แลวผานลงในคอลัมน gel filtration chromatography ที่ใช 

stationary phase คือ Sephacryl S-200 HR ซึ่งมีขนาด 

25-75 ไมโครเมตร สามารถแยกโปรตีน 

5,000-250,000 ดาลตัน คอลัมนที่ใชมีขนาด 

1.6 x 70 เซนติเมตร ควบคุมที่อุณหภูมิ 


จากนั้นชะดวย 

20 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 อัตราการไหล 0.5 มิลลิลิตรตอนาที และทําการเก็บ 

สารละลายที่ออกมาจากคอลัมนหลอดละ 

3 มิลลิลิตร นําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 

280 นาโนเมตร (Takayanagi et al., 1991) เขียนกราฟระหวางคาการดูดกลืนแสงและปริมาตรของ 

สารละลายที่เก็บ 

เลือกหลอดที่มีคาการดูดกลืนแสงสูงกวาคาการดูดกลืนแสงของตัวทําละลาย 

แลว 

จึงหาปริมาณโปรตีน และกิจกรรมของเอนไซมของสารละลายจากหลอดที่เลือกไว 

8.3 การหาน้ําหนักโมเลกุลยอยของเอนไซมไคติเนส 

ดวยวิธี Sodiumdodecylsulphate 

polyacrylamide gel electrophoresis (SDS –PAGE) 

หาน้ําหนักโมเลกุลของสารสกัดเอนไซมดวยวิธี 

SDS-PAGE ตามวิธีของ Gallagher 

and Smith (1991) โดยผสมสารสกัดเอนไซมความเขมขน 20 ไมโครกรัมตอมิลลิลิตร และสาร 

ละลายโปรตีนมาตรฐาน กับสารผสมของ น้ํากลั 

่น, 0.5 M Tris-HCl, 10% SDS, glycerol และ 

Bromphenol blue ในอัตราสวน 1:1 แลวบรรจุสารละลายตัวอยาง 10 ไมโครลิตรลงบนเจล 

polyacrylamide ที่มี 

stacking gel รอยละ 4.0 และ separating gel รอยละ 12 และใช 0.025 MTris- 

HCl, 0.192 M glycine และ 0.1% (W/V) SDS เปน running buffer ผานกระแสไฟ 120 โวลท เปน 

เวลาประมาณ 1.5 ชั่วโมง 

แลวจึงยอมแผนเจลดวย 0.1% Coomassie brilliant blue R250, 40% 

methanol และ 10% acetic acid เปนเวลา 30 นาที แลวจึงลางออกดวยสารละลาย acetic acid และ 

methanol จนกวาแผนเจลจะใสและเห็นแถบโปรตีนชัดเจน จากนั้นจึงลางดวยน้ํากลั่น 

2-3 ครั้ง 

นําแถบของโปรตีนที่แยกไดมาหาคา 

Rf และนําไปเปรียบเทียบกับกราฟมาตรฐาน 

ดังภาพผนวกที่ 

ก ขอ 4 เพื่อหาน้ําหนักโมเลกุลของแถบโปรตีนตัวอยางที่ปรากฎบนแผนเจล 

25

ผลและวิจารณ 

1. การคัดแยกแบคทีเรียทางทะเลที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

จากการทดลองคัดแยกแบคทีเรียโดยใชอาหาร CHA จากแหลงตัวอยางตางๆดังนี้ 

ปลาวัว 

หางพัด (Monocanthus chinensis) หอยแมลงภู 

(Perna viridis) กุงกุลาดํา 

(Penaeus monodon) 


(Penaeus merguiensis) ปูมา (Portunus pelagicus) และหมึกสาย (Octopus sp.) จํานวน 

โคโลนีแบคทีเรียที่เกิดขึ้นทั้งหมดอยูระหวาง 

1.5 x 10 5 – 76 x 10 5 โคโลนี (CFU) ตอกรัมตัวอยาง 

และจํานวนโคโลนีของแบคทีเรียที่เกิดโซนใสรอบโคโลนีอยูระหวาง 

0.26 x 10 5 – 23 x 10 5 CFU 

และคิดเปนอัตราสวนเฉลี่ยของจํานวนโคโลนีแบคทีเรียที่เกิดขึ้นทั้งหมดตอจํานวนโคโลนีของ 

แบคทีเรียที่เกิดโซนใสอยูระหวาง 

3.64 : 1 – 7.83 : 1 และมีจํานวนโคโลนีที่เกิดโซนใสรอยละ 

12.33 - 27.47 ในขณะที่หมึกมีจํานวนโคโลนีที่เกิดโซนใสมากที่สุดคือรอยละ 

27.47 ปลาวัวมีนอยที่ 

สุดคือรอยละ 12.33 ดังตารางที่ 

3 และภาพที่ 

5 

แบคทีเรียในหมึกสวนใหญเปนแบคทีเรียที่สามารถผลิตเอนไซมไคติเนส 

เมื่อเทียบกับสัตว 

ชนิดอื่น 

ไดแก กุงแชบวย 

ปูมา กุงกุลาดํา 

หอยแมลงภู 

และปลาวัว ซึ่งพบรองลงมาตามลําดับ 

ทั้งนี้ 

หมึก กุง 

และ ปู เปนสัตวที่มีไคตินเปนองคประกอบในโครงรางของรางกาย 

เมื่อนํามาคัดแยกหา 

แบคทีเรียที่สามารถยอยไคตินไดจึงมักพบในปริมาณสูงกวาสัตวชนิดอื่น 

ซึ่งจะพบไดทั้งจากเปลือก 

และในระบบทางเดินอาหาร ซึ่งสอดคลองกับการรายงานของ 

Chen and Chen(1991) พบวา 

Aeromonas caviae D1 เปนแบคทีเรียที่คัดแยกไดจาก 

กุงกุลาดํา 

(P. monodon) ที่ไดจากบอเลี้ยง 

สามารถผลิตเอนไซมยอยไคติน 

เมื่อนําแบคทีเรียที่สามารถสรางโซนใสไดมาทําใหบริสุทธิ์ 

โดยการเขี่ยเชื้อลงบนอาหาร 

TSA ที่มี 

NaCl รอยละ 3 และแยกโคโลนีเดี่ยวเก็บไว 

ไดแบคทีเรียทั้งหมด 

99 ไอโซเลท จากปลาวัว 

13 ไอโซเลท หอยแมลงภู10 

ไอโซเลท กุงกุลาดํา 

20 ไอโซเลท ปูมา 17 ไอโซเลท กุงแชบวย 

19 

ไอโซเลท และหมึกสาย 20 ไอโซเลท ดังตารางที่ 

4 

26


3 รอยละของจํานวนโคโลนีแบคทีเรียที่เกิดโซนใสรอบโคโลนี 

ชนิดของ 

ตัวอยาง 

จํานวนโคโลนี 

ทั้งหมด 

(CFU) 

ปลาวัว 5.0 x 105 1.5 x 105 หอยแมลงภู 

9.6 x 105 4.3 x 105 กุงกุลาดํา 

76 x 105 16 x 105 กุงแชบวย 

10 x 105 8.8 x 105 ปูมา 8.0 x 105 2.3 x 105 หมึกสาย 54 x 105 72 x 10 5 

จํานวนโคโลนี 

ที่เกิดโซนใส 

(CFU) 

0.45 x 105 0.33 x 105 1.4 x 105 0.90 x 105 18 x 105 3.7 x 105 3.6 x 105 1.7 x 105 2.6 x 105 0.52 x 105 13 x 105 23 x 105 ่ 

อัตราสวนของจํานวน 

โคโลนีทั้งหมดตอจํานวน 

โคโลนีที่เกิดโซนใส 

11.11 : 1 

อัตราสวน 

เฉลี่ย 

รอยละของ 

โคโลนีที 

เกิดโซนใส 

4.55 : 1 

6.86 : 1 

7.83 : 1 12.33 

4.78 : 1 

4.22 : 1 

5.82 : 1 17.18 

4.32 : 1 

2.78 : 1 

4.27 : 1 23.42 

5.18 : 1 

3.08 : 1 

3.98 : 1 25.13 

4.42 : 1 

4.15 : 1 

3.75 : 1 26.67 

3.13 : 1 3.64 : 1 27.47 

27

รอยละของจํานวนโคโลนีที่เกิดโซนใส 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

FH PE SH PR CR SQ 


5 รอยละของจํานวนโคโลนีที่เกิดโซนใสใน 

ปลาวัว (FH) หอยแมลงภู 

(PE) กุงกุลาดํา 

(SH) 


(PR) ปูมา (CR) และหมึกสาย (SQ) 

28


6 การสรางโซนใสในอาหาร chitin agar ของแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

29

2. การคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมไคติเนสบนอาหารแข็ง 

เมื่อนําแบคทีเรียที่คัดแยกไดในขอ 

1 มาเพาะเลี้ยงในอาหาร 

CHA โดยเลี้ยงแบบ 

point 

inoculation เปนเวลา 5 วัน ซึ่งจะปรากฏเห็นเปนโซนใส 

ดังภาพที่ 

6 วัดขนาดเสนผานศูนยกลาง 

ของโคโลนีและโซนใสรอบโคโลนี พบวา แบคทีเรีย ที่มีอัตราสวนระหวางขนาดเสนผานศูนยกลาง 

ของโคโลนีตอโซนใสรอบโคโลนี มากกวา 6 มิลลิเมตร มีทั้งหมด 

27 ไอโซเลท จาก ปลาวัว (FH) 

1 ไอโซเลท กุงกุลาดํา 

(SH) 4 ไอโซเลท กุงแชบวย 

(PR) 9 ไอโซเลท ปูมา (CR) 4 ไอโซเลท และ 

หมึกสาย (SQ) 9 ไอโซเลท ไดแก FH1.17, SH1.8, SH1.9, SH1.13, SH1.14, PR1.13, PR1.15, 

PR1.16 , PR1.17, PR1.18, PR1.19, PR1.20, PR1.21, PR1.23, CR1.8, CR1.10, CR1.11, CR2.1, 

SQ1.8, SQ1.9, SQ1.10, SQ1.11, SQ1.12, SQ2.1, SQ2.2, SQ2.9 และ SQ2.10 และนอยกวา 6 

มิลลิเมตร มีทั้งหมด 

72 ไอโซเลท โดยแบคทีเรียรหัส CR2.1 ซึ่งคัดแยกไดจากปูมา 

มีอัตราสวนดัง 

กลาวสูงที่สุดคือ 

10.67 ดังตารางที่ 

4 

การคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมไคติเนสในอาหารแข็ง 

(CHA) 

โดยการวัดขนาดเสนผานศูนยกลางของโคโลนีและโซนใสรอบโคโลนีของเชื้อแบคทีเรีย 

พบวา 

แบคทีเรียบางไอโซเลทเจริญไดดีบนอาหาร แตสรางโซนใสขนาดเล็ก นั่นแสดงวามีประสิทธิภาพ 

ในการสรางเอนไซมต่ํา 

สวนแบคทีเรียที่เจริญไดดีบนอาหาร 

และสรางโซนใสขนาดใหญ แสดงวามี 

ประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมสูง อยางไรก็ตามการคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการ 

ผลิตเอนไซมไคติเนสบนอาหารแข็ง เปนการทดสอบในขั้นตนเทานั้น 

เนื่องจากในการนําแบคทีเรีย 

ไปใชเพื่อผลิตเอนไซมตองนําไปเลี้ยงในอาหารเหลว 

จึงตองมีการทดสอบประสิทธิภาพในการผลิต 

เอนไซมในอาหารเหลวในขั้นตอนตอไป 

30


4 การทดสอบการยอมแกรม รูปราง และอัตราสวนเฉลี่ยระหวางเสนผานศูนยกลางของ 

โซนใสตอขนาดของเสนผานศูนยกลางโคโลนี 

รหัส 

แบคทีเรีย 

แกรม รูปราง 

อัตราสวนเฉลี่ยระหวางเสนผานศูนยกลางของ 


FH1.1 บวก แทงสั้น 

3.040 


5.003 


4.813 


5.000 


0.000 


3.792 


0.000 


3.625 


4.330 


4.500 


5.835 


8.479 


5.625 

PE1.1 บวก แทงสั้น 

3.521 


4.625 


1.742 


2.164 


3.375 


5.583 


3.993 


5.208 

หมายเหตุ FH = ปลาวัว PE = หอยแมลงภู 

SH = กุงกุลาดํา 

PR = กุงแชบวย 

CR = ปูมา 

SQ = หมึกสาย 

31


4 (ตอ) 

รหัส 






1.688 


2.313 

SH1.1 บวก กลม 4.000 

SH1.2 บวก แทงสั้น 

3.415 


3.271 


5.000 


0.000 

SH1.6 บวก แทงยาว 0.000 


2.625 


7.665 


6.313 


4.375 


5.165 


9.418 


6.670 


2.750 


3.188 


4.250 


4.063 


1.170 


3.668 

SH1.22 บวก แทงสั ้น 4.750 






32


4 (ตอ) 

รหัส 





PR1.2 บวก แทงสั้น 

3.438 


3.938 


3.958 


4.670 


2.500 


5.123 


3.330 


5.125 


6.625 


5.750 


9.980 


7.938 


8.250 


7.125 


9.000 


6.168 


7.000 


2.825 


7.438 

CR1.3 บวก แทงสั้น 

3.125 


3.375 






33


4 (ตอ) 

รหัส 






1.980 


3.438 


7.938 


4.050 


7.937 


6.667 


10.670 

CR2.2 ลบ กลม 0.000 


3.833 


4.063 

CR2.5 บวก แทงยาว 0.000 


0.000 


4.063 



SQ1.1 บวก แทงสั้น 

5.167 


4.021 


3.438 


4.308 


1.265 


8.412 


7.537 






34


4 (ตอ) 

รหัส 






7.688 


6.093 


8.000 

SQ2.1 บวก แทงยาว 6.042 

SQ2.2 บวก แทงยาว 8.729 

SQ2.3 บวก กลม 0.000 


4.250 


4.750 


1.748 


1.363 


4.333 


8.582 


8.125 






35

3. การคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมไคติเนสในอาหารเหลว 

การคัดเลือกเชื้อแบคทีเรียที่มีความสามารถในการผลิตเอนไซมไคติเนสในอาหารเหลว 

CHB โดยนําแบคทีเรียที่คัดเลือกไดจากอาหารแข็ง 

จํานวน 27 ไอโซเลท มาเลี้ยงในอาหารเหลว 

เขยาที่ความเร็ว 

200 รอบ ตอนาที อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เวลา 5 วัน พบวาแบคทีเรียรหัส 

SH1.13 ซึ่งแยกไดจากกุงกุลาดํา 

มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมสูงสุด มีคากิจกรรมเอนไซม 

ไคติเนส 2.150 หนวยตอมิลลิลิตร ดังตารางที่ 

5 

จากการทดลอง แบคทีเรียไอโซเลทที่สามารถสรางโซนใสไดดี 

คือมีอัตราสวนระหวางเสน 

ผานศูนยกลางของโซนใสตอขนาดของเสนผานศูนยกลางโคโลนีสูง เมื่อนํามาเลี้ยงในอาหารเหลว 

กิจกรรมของเอนไซมก็ไมไดสูงตามดวย นั่นแสดงวาความสามารถในการเจริญ 

และการสราง 

เอนไซมไคติเนส ของแบคทีเรียแตละไอโซเลทในอาหารแข็งและอาหารเหลวตางกัน ดังนั้นในการ 

คัดเลือกแบคทีเรียที่มีความสามารถในการผลิตเอนไซมไคติเนส 

จึงตองทดสอบทั้งในอาหารแข็ง 

และอาหารเหลว 


5 กิจกรรมของเอนไซมไคติเนสในการคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพในการผลิต 

เอนไซมในอาหารเหลว 

รหัส 



กิจกรรมเอนไซมไคติเนส 

(หนวยตอมิลลิลิตร) 

FH1.17 8.479 1.863 

SH1.8 7.665 1.078 

SH1.9 6.313 1.732 

SH1.13 9.418 2.150 

SH1.14 6.670 1.450 

PR1.13 6.625 1.628 

PR1.15 9.98 1.864 

หมายเหตุ FH = ปลาวัว SH = กุงกุลาดํา 


CR = ปูมา SQ = หมึกสาย 

36


5 (ตอ) 

รหัส 





PR1.16 7.938 1.034 

PR1.17 8.250 1.756 

PR1.18 7.125 1.230 

PR1.19 9.000 1.786 

PR1.20 6.168 1.612 

PR1.21 7.000 1.680 

PR1.23 7.438 1.710 

CR1.8 7.938 1.280 

CR1.10 7.937 1.740 

CR1.11 6.667 1.634 

CR2.1 10.670 1.985 

SQ1.8 8.412 1.800 

SQ1.9 7.537 1.749 

SQ1.10 7.688 1.768 

SQ1.11 6.093 1.690 

SQ1.12 8.000 1.735 

SQ2.1 6.042 1.702 

SQ2.2 8.729 1.762 

SQ2.9 8.582 1.802 

SQ2.10 8.125 1.756 

หมายเหตุ FH = ปลาวัว SH = กุงกุลาดํา 


CR = ปูมา SQ = หมึกสาย 

37

4. การจัดจําแนกสายพันธุของแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

นําแบคทีเรียที่คัดเลือกไดจากการคัดเลือกในอาหารเหลว 

รหัส SH1.13 มาจัดจําแนก 

โดยวิธีการเบื้องตนของ 

Bergey's manual of determinative bacteriology พบวาไดแบคทีเรียในกลุม 

aerobic bacteria แกรมบวก รูปทอน ดังภาพที่ 

7 และใหผลคะตะเลสเปนบวก จากนั้นจึงนํามามาจัด 

จําแนกสายพันธุ 

ดวยชุดตรวจสําเร็จ เอ พี ไอ (Biomérieux 50 CHB) จากคุณสมบัติดังตาราง 

สามารถสรุปผลไดวาแบคทีเรียรหัส SH1.13 เปน Bacillus circulans ดังตารางที่ 

6 ซึ่งสอดคลองกับ 

การศึกษาของ Cody (1989) ศึกษาความสามารถในการยอยไคตินของแบคทีเรียในกลุม 

Bacillus ทั้ง 

หมด 60 สายพันธุ 

29 ชนิด โดยสังเกตจากการสรางโซนใสในอาหารที่มีไคตินอยู 

พบวา มี 17 สาย 

พันธุ 

10 ชนิดที่สามารถยอยไคตินได 

นอกจากนี้ 

ยังมีการศึกษาการผลิตเอนไซมไคติเนสจาก 

แบคทีเรียในสกุล Bacillus ชนิดอื่นๆไดแก 

แบคทีเรียชนิด Bacillus circulans No.4.1 สามารถผลิต 

เอนไซม ไคติเนส และพบวาสามารถผลิตเอนไซมไดในปริมาณมาก (Wiwat et al., 1999) นอก 

จากนี้ 

Wang and Hwang (2001) คัดแยกแบคทีเรียที่สามารถยอยเปลือกกุงและกระดองหมึก 

ได 

แบคทีเรียในสกุล Bacillus 3 ไอโซเลท คือ B. alvei E1, B. sphaericus J1 และ B. cereus J1–1 และ 

Frändberg and Schnürer (1994) คัดแยกแบคทีเรียทีสามารถยอยไคตินพบแบคทีเรียในกลุมของ 

Bacillus ซึ่งสวนใหญคัดแยกไดจาก 

เปลือกกุงไดแก 

Bacillus spp. สายพันธุ 

K9, K14 และK20 

ในการเลี้ยง 

Bacillus circulans ในอาหารที่มีไคตินอยู 

พบวาในขณะที่เลี้ยงอยูปริมาณของ 

ไคตินในอาหารลดลงแสดงวาแบคทีเรียมีการผลิตเอนไซมไคติเนสและปลอยออกมาภายนอกเซลล 

(extracellular enzyme) จึงมีเอนไซมไคติเนสอยูในสารละลายสวนใส 

และยังไมพบวา Bacillus 

circulans กอใหเกิดโรคในคน สัตว และพืช จึงเปนที่นาสนใจอยางยิ่งในการนําแบคทีเรียชนิดนี้ไป 

ใชประโยชน ทั้งในดานการเกษตรโดยการนําไปใชเปน 

ตัวควบคุมทางชีวภาพ (biocontrol) เชนการ 

นําไปใชเปนตัวยับยั้งการเกิดโรคพืชที่เกิดจากเชื้อรา 

และแมลง การนําไปใชประโยชนโดยการนํา 

ไปยอยไคตินซึ่งเปนเศษเหลือทิ้งจากโรงงานอุตสาหกรรม 

และสามารถนําผลผลิตที่ไดจากการยอย 

มาใชประโยชน เชนการนําไปใชเปนอาหารสัตว 

Cody et al. (1990) รายงานวาแบคทีเรียหลายชนิดสามารถยอยไคตินได ไดแก Serratia 

Aeromonas Vibrio และ Bacillus และพบวาแบคทีเรียในกลุม 

Serratia Vibrio และ Bacillus มีความ 

สามารถในการยอย ไคตินไดดีกวาแบคทีเรียในกลุมอื่นๆ 

38


7 ลักษณะรูปรางของเชื้อแบคทีเรียที่ผลิตเอนไซมไคติเนส 

รหัส SH1.13 โดยการยอม 

สีแกรมและสองดูภายใตกลองจุลทรรศน ที่กําลังขยาย 

100 เทา 

39


6 คุณสมบัติทางชีวเคมี ของแบคทีเรียรหัส SH1.13 

คุณสมบัติ ผล 

glycerol + 

erythritol - 

D-arabinose - 

L-arabinose + 

ribose + 

D-xylose + 

L-xylose - 

adonitol - 

β-methyl-D-xyloside + 

galactose + 

D-glucose + 

D-fructose + 

D-mannose + 

L-sorbose - 

rhamnose - 

dulcitol - 

inositol - 

mannitol - 

sorbitol - 

α-methyl-D-mannoside + 

α-methyl-D-glucoside + 

N-acetyl-glucosamine + 

amygdaline + 

arbutine + 

esculine + 

40


6 (ตอ) 

คุณสมบัติ ผล 

salicine + 

cellobiose + 

maltose + 

lactose + 

melibiose + 

sucrose + 

trehalose + 

inuline - 

melizitose - 

D-raffinose - 

starch + 

glycogene + 

xylitol - 

β-gentiobiose + 

D-turanose + 

D-lyxose + 

D-tagatose - 

D-fucose - 

L-fucose - 

D-arabitol - 

L-arabitol - 

gluconate + 

2-keto-gluconate - 

5-keto-gluconate + 

หมายเหตุ + = Positive reaction 

- = Negative reaction 

41

5. การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการเจริญ 

และการผลิตเอนไซมไคติเนสของ 


การศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการเจริญ 

และการผลิตเอนไซมไคติเนสของ Bacillus 

circulans SH1.13 เพื่อหาสภาวะที่ดีที่สุดในการนําแบคทีเรียดังกลาวไปเลี้ยงเพื่อผลิตเอนไซม 

ไคติเนส ใหไดทั้งปริมาณและมีประสิทธิภาพสูง 

ผลการศึกษามีดังตอไปนี้ 

5.1 ศึกษาความเปนกรด-ดาง เริ่มตนที่เหมาะสมในในการเจริญ 


ไคติเนส 

การศึกษาความเปนกรด-ดาง เริ่มตนที่เหมาะสมในการเจริญ 


ไคติเนสของ Bacillus circulans SH1.13 ในอาหารเหลว CHB ที่มีระดับของความเปนกรด-ดาง 

ตางๆ กันคือ 4.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0 และ12.0 โดยเลี้ยงแบคทีเรีย 

เขยาดวยความเร็ว 200 รอบ ตอ 

นาที และควบคุมอุณหภูมิที่ 

37 องศาเซลเซียส พบวาลักษณะของการเจริญจะมีการเจริญอยางรวด 

เร็ว หลังจากถายหัวเชื้อลงไปในอาหารและมีการเจริญ 

2 ชวง คือชวงแรกระหวาง 0-12 ชั่วโมง 

ชวง 

นี้จะมีการเจริญนอย 

และในชวงที่ 

2 คือหลังจากที่แบคทีเรียปรับสภาวะการเจริญเติบโตได 

แบคทีเรียสามารถที่จะเจริญเติบโตไดอยางรวดเร็วตั้งแตชั่วโมงที่ 

12 – 30 และมีกิจกรรมของ 

เอนไซม พบวาเพิ่มขึ้นเมื่อปริมาณเซลลเพิ่มขึ้น 

และมีปริมาณสูงหลังจากที่แบคทีเรียเขาสูระยะตาย 

(death phase) ดังภาพที่ 

8 

จากการศึกษาพบวาที่ความเปนกรด-ดาง 

8.0, 10.0 และ 12.0 Bacillus circulans 

SH1.13 เจริญในอาหารที่ความเปนกรด-ดาง 

ดังกลาวไดไมดี โดยเฉพาะที่ความเปนกรด-ดาง 

12.0 

แบคทีเรียไมสามารถที่จะเจริญได 

และไมสามารถตรวจวัดกิจกรรมของเอนไซมได แสดงใหเห็นวา 

ในอาหารที่มีความเปนเบส 

ไมเหมาะสมตอการเจริญของแบคทีเรียชนิดนี้ 

และที่ความเปนกรด-ดาง 

4.0, 6.0 และ7.0 แบคทีเรียสามารถที่จะเจริญไดและสามารถผลิตเอนไซมได 

โดยที่ความเปนกรด- 

ดาง 6.0 และ7.0 แบคทีเรียสามารถเจริญไดดี และมีกิจกรรมของเอนไซม คือ 5.46 และ 6.55 หนวย 

ตอมิลลิลิตรในชั่วโมงที่ 

48 ตามลําดับ 

42

ดังนั้นความเปนกรด-ดาง 

เริ่มตนที่เหมาะสมในในการเจริญของ 

Bacillus circulans 

SH1.13 คือ 6.0-7.0 แตที่ความเปนกรด-ดาง 

7.0 แบคทีเรียมีกิจกรรมเอนไซมสูงกวาที่ 

ความเปน 

กรด-ดาง 6.0 ดังนั้น 

ความเปนกรด-ดาง เริ่มตนที่เหมาะสมในในการเจริญ 


คือ 7.0 ซึ่งสอดคลองกับการศึกษาความเปนกรด-ดาง 

ที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซม 

ไคติเนส 

ในแบคทีเรียหลายชนิดไดแก Bacillus circulans No.4.1 ความเปนกรด-ดาง 7.0 (Wiwat et al.,1999) 

B. cereus J1-1 ความเปนกรด-ดาง 7.0 (Wang and Hwang, 2001) B. licheniformis X-7u ความเปน 

กรด-ดาง 7.0 (Takiguchi and Shimahara, 1989) Bacillus sp. 13.26 ความเปนกรด-ดาง 7.0-8.0 

(Yuli et al., 2004) และ Aeromonas sp. No.10S-24 ความเปนกรด-ดาง 7.5 (Ueda and Arai, 1992) 

43

จํานวนโคโลนี x 10 5 

(CFU/ml) 


(หนวย/มิลลิลิตร) 

1400 

1200 

1000 

800 

600 

400 

200 

0 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 

ข 

ก 

เวลา(ชั่วโมง) 

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 

เวลา (ชั่วโมง) 

pH 4 pH 6 pH 7 pH 8 pH 10 pH 12 


8 ความเปนกรด-ดาง เริ่มตนที่เหมาะสมในการเจริญ 

และการผลิตเอนไซมไคติเนส ของ 

Bacillus circulans SH1.13 (ก) การเจริญ (ข) กิจกรรมของเอนไซม 

44

5.2 การศึกษาอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเจริญ 


จากการเลี้ยง 

Bacillus circulans SH1.13 ในอาหาร CHB ความเปนกรด-ดาง 7.0 ที่ 

อุณหภูมิตางกันคือ 20, 30, 37, 40, 50, 60 และ 70 องศาเซลเซียส เขยาที่ความเร็วรอบ 

200 รอบตอ 

นาที พบวาลักษณะการเจริญของแบคทีเรีย จะมีการเจริญ 2 ชวง ที่ 

อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส หลัง 

จากถายหัวเชื้อลงในอาหาร 

การเจริญของแบคทีเรียมีลักษณะคงที่มีการเพิ่มจํานวนเซลล 

และกิจ 

กรรมของเอนไซมนอย สวนที ่อุณหภูมิ 50, 60 และ70 องศาเซลเซียส พบวาแบคทีเรียมีการเจริญได 

นอย โดยเฉพาะที่อุณหภูมิ 

70 องศาเซลเซียส แบคทีเรียไมสามารถเจริญไดเลย สวนที่ 

อุณหภูมิ 50 

และ60 องศาเซลเซียส แบคทีเรียจะมีการเจริญในชวง 0 – 18 ชั่วโมงเทานั้น 


30, 37 และ 

40 องศาเซลเซียส แบคทีเรียสามารถเจริญไดดี สามารถผลิตเอนไซมได โดยที่อุณหภูมิ 

37 องศา 

เซลเซียส การเจริญของแบคทีเรียมีปริมาณสูงสุด คือ 943 x 10 5 CFU ในชั่วโมงที่ 

18 และมีกิจกรรม 

ของเอนไซม สูงสุด 5.38 หนวยตอมิลลิลิตร ในชั่วโมงที่ 

48 สวนกิจกรรมของเอนไซมจะเพิ่มขึ้น 

เมื่อปริมาณเซลลเพิ่มขึ้น 

และมีปริมาณสูงเมื่อเซลลของแบคทีเรียเขาสูระยะตาย 


9 

ดังนั้น 


37 องศาเซลเซียส จึงเปนอุณหภูมิที่เหมาะสมในในการเจริญ 

และ 

การผลิตเอนไซมของ Bacillus circulans SH1.13 ซึ่งมีรายงานวาที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส ยัง 

เปนอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเลี้ยงแบคทีเรีย 

Bacillus circulans No.4.1 (Wiwat et al.,1999) 

B. sphaericus J1 และ B. cereus J1-1 (Wang and Hwang,2001) และ Pseudomonas aeruginosa 

K-187 (Wang and Chang,1997) 

45

จํานวนโคโลนี x 10 5 

(CFU/ml) 



1200 

1000 

800 

600 

400 

200 

0 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 

ข 

ก 


0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 


20 องศาเซลเซียส 30 องศาเซลเซียส 37 องศาเซลเซียส 

40 องศาเซลเซียส 50 องศาเซลเซียส 60 องศาเซลเซียส 



9 อุณหภูมิที่เหมาะสมในการเจริญ 


Bacillus circulans SH1.13 (ก) การเจริญ (ข) กิจกรรมของเอนไซม 

46

5.3 ศึกษาระยะเวลาที่เหมาะสมในการเจริญ 



Bacillus circulans SH1.13 ในอาหาร CHB ที่ความเปนกรด-ดาง 

7.0 

อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เขยาที่ความเร็ว 

200 รอบตอนาที หลังจากถายกลาเชื้อลงในอาหารมีการ 

เพิ่มปริมาณขึ้นอยางรวดเร็ว 

และแบคทีเรียเจริญเติบโตมีปริมาณสูงที่สุดคือ 

20 x 10 9 CFUในชั่วโมง 

ที่ 

30 หลังจากนั้นจึงเขาสูระยะตาย 

ในขณะที่กิจกรรมของเอนไซมเพิ่มขึ้นเมื่อเวลาเพิ่มขึ้นและ 

ปริมาณเซลลเพิ่มขึ้น 

และมีคาสูงสุด คือ 13 หนวยตอมิลลิลิตร ในชั่วโมงที่ 

48 ซึ่งอยูในระยะตาย 

ของแบคทีเรีย สวนการเปลี่ยนแปลงของความเปนกรด-ดาง 

พบวา ความเปนกรด-ดาง มีคาลดลง 

เมื่อปริมาณของเอนไซมเพิ่มขึ้น 

คือลดลงจาก 7.0 เปน 6.0 ตั้งแตชั่วโมงที่ 

0 ถึง 48 จากนั้นจึงมีคา 

เพิ ่มเมื่อเอนไซมมีกิจกรรมลดลง 


9 

ดังนั้นเพื่อใหไดเอนไซมไคติเนส 

ปริมาณมากจึงควรทีจะเก็บเกี่ยวเอนไซมที่ผลิตได 



7.0 และอุณหภูมิ 37 

องศาเซลเซียส ในชั่วโมงที่ 

48 หรือหลังจากที่แบคทีเรียเขาสูระยะตาย 

สอดคลองกับการศึกษาของ 

Wang and Hwang(2001) ไดศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซมของ 

Bacillus cereus J1-1 

พบวาแบคทีเรียดังกลาวผลิตเอนไซมไดดีที่ความเปนกรด-ดาง 

7.0 อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปน 

เวลา 48 ชั่วโมง 

นอกจากนี้ยังศึกษาใน 

B. alvei E1 และ B. sphaericus J1 ซึ่งผลิตเอนไซมไดดีที่ 

ความเปนกรด-ดาง 9.0 อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 48 ชั่วโมง 

และ Pseudomonas 

aeruginosa K-187 ซึ่งผลิตเอนไซมไดดีที่ความเปนกรด-ดาง 

9.0 อุณหภูมิ 45 องศาเซลเซียส เปน 

เวลา 48 ชั่วโมง 

47

จํานวนโคโลนี (x10 9 CFU) 

25 

20 

15 

10 

5 

0 

กิจกรรมเอนไซม (หนวย/มิลลิลิตร), pH 

14 

12 

10 

8 

6 

4 

2 

0 

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 


เวลา vs กิจกรรมเอนไซม 

เวลา vs pH 

เวลา vs การเจริญ 


10 ระยะเวลาที่เหมาะสมในการเจริญเติบโต 



48

6. การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจาก 


สารสกัดเอนไซม (supernatant culture broth) ที่ผลิตไดจากการเลี้ยง 


SH1.13 ในอาหาร CHB ที่ 

ความเปนกรด-ดาง 7.0 อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 48 ชั่วโมง 

เขยาที่ 

ความเร็ว 200 รอบตอนาที จากนั้นจึงนํามาเหวี่ยงแยกเซลลและไคตินที่เหลือออกจากสารละลาย 

ทั้งนี้การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม 

เพื่อเปนแนวทางในการนํามาใชประโยชนไดอยางมีประสิทธิ 

ภาพ ผลการศึกษามีดังตอไปนี้ 

6.1 การศึกษาความเปนกรด-ดาง ที่เหมาะสมในการทํางานของเอนไซมไคติเนส 

ความเปนกรด-ดาง ที่เหมาะสมในการทํางานของเอนไซมไคติเนส 

ศึกษาโดยการ 

ทดลองใน substrate buffer ที่ความเปนกรด-ดาง 

ตางๆ คือ 2.0, 4.0, 6.0, 7.0, 8.0 และ 10.0 ที่ 

อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส โดยที่ความเปนกรด-ดาง 

2.0 มีกิจกรรมเอนไซม 1.86 หนวยตอมิลลิลิตร 

และกิจกรรมของเอนไซมจะเพิ่มขึ้นเมื่อความเปนกรด-ดาง 

เปน 4.0 ซึ่งมีกิจกรรมเอนไซมสูงที่สุดมี 

คา 2.33 หนวยตอมิลลิลิตร จากนั้นกิจกรรมของเอนไซมจะคอยๆลดลงเมื่อความเปนกรด-ดางเปน 

6.0, 7.0, 8.0 และ 10.0 ดังภาพที่ 

11 

ดังนั้นความเปนกรด-ดาง 

ที่เหมาะสมในการทํางานของเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 คือ ความเปนกรด-ดาง 4 ซึ่งแสดงใหเห็นวา 

ความเปนกรด-ดาง ที่เหมาะ 

สมตอกิจกรรมของเอนไซมจะอยูในชวงที่เปนกรด 

สอดคลองกับการศึกษาของ Koga et al. (1999) 

กลาววาความเปนกรด-ดาง ที่เหมาะสมในการทํางานของเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจากจุลินทรียจะ 

อยูในชวง 

3.5 – 8.0 ขึ้นอยูกับชนิดของจุลินทรียและปจจัยอื่นๆที่เกี่ยวของในการทํางานของ 

เอนไซม Sakai et al. (1998) รายงานวา Bacillus circulans WL-12 และ Bacillus sp. MH-1 มี ความ 

เปนกรด-ดาง ที่เหมาะสมในการทํางานในชวงที่เปนกรด 

Watanabe et al. (1990) ไดศึกษาความเปน 

กรด-ดาง ที่เหมาะสมในการทํางานของเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

B. circulans WL-12 คือ 5.0 

และเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Serratia marcescens สามารถทํางานไดดีที่ความเปนกรด-ดาง 

4.0 และ 7.0 (Cabib, 1988) สวน Aeromonas sp. No. 10S-24 มีคาความเปนกรด-ดาง ที่เหมาะสมใน 

การทํางานที่ 

4.0 (Ueda and Arai, 1992) นอกจากนี้ 

ความเปนกรด-ดางที่เหมาะสมในการทํางาน 

ของเอนไซม ที่มีคาใกลเคียงหรือเทากับ 

4.0 ยังผลิตไดจากราชนิด Pycnoporus cinnabarinus 

49

(Ohtakara, 1988) และ Aspergillus carneus มีความเปนกรด-ดาง ที่เหมาะสมในการทํางานอยูที่ 

4.5 

(Sherief et al., 1991) 

6.2 การศึกษาความคงตัวของเอนไซมไคติเนส ที่ความเปนกรด-ดาง 

ตางๆ 

การศึกษาความคงตัวของเอนไซมไคติเนสที่ความเปนกรด-ดาง 

ตางๆ คือ 2.0, 4.0, 6.0, 

7.0, 8.0 และ 10.0 ที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส พบวาที่ความเปนกรด-ดาง 

2.0 มีกิจกรรมเอนไซม 

เพียง 1.01 หนวยตอมิลลิลิตร และเพิ่มขึ้นสูงสุดที่ความเปนกรด-ดางเปน 

4.0 คือ 3.35 หนวยตอ 

มิลลิลิตร จากนั้นจึงลดลง 

เมื่อความเปนกรด-ดาง 

เปน 6.0, 7.0, 8.0 และ 10.0 ตามลําดับ จากการ 

ทดลองจะเห็นไดวาเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 มีความคงตัวที่คา 

ความเปนกรด-ดางในชวงที่แคบ 


12 

ความคงตัวเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 คือ ความเปน 

กรด-ดาง 4.0 ดังนั้นเพื่อการปองกันไมใหเอนไซมเสียสภาพ 

และมีประสิทธิภาพคงเดิมจึงควรเก็บ 

รักษาเอนไซมไคติเนสที่ผลิตได 

ที่ความเปนกรด-ดาง 

4.0 มีการศึกษาความคงตัวของเอนไซมใน 

แบคทีเรียชนิดอื่นๆที่สอดคลองกับผลการทดลองครั้งนี้คือ 

Aeromonas sp. No. 10S-24 มีความคง 

ตัวในความเปนกรด-ดาง ตั้งแต 

4.0 – 9.0 (Ueda and Arai, 1992) ในแบคทีเรียชนิด Serratia 

marcescens มีความคงตัวในความเปนกรด-ดาง ตั้งแต 

4.8 – 7.2 (Monreal and Reese, 1969) และ 

Saccharomyces cerevisiae จะมีความคงตัวที่ 

3.0 (Correa et al., 1982) 

50




11 ความเปนกรด-ดางที่เหมาะสมตอกิจกรรมของสารสกัดเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 ณ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 



4.50 

4.00 

3.50 

3.00 

2.50 

2.00 

1.50 

1.00 

0.50 

0.00 

4.50 

4.00 

3.50 

3.00 

2.50 

2.00 

1.50 

1.00 

0.50 

0.00 

0 2 4 6 8 10 12 

pH 

0 2 4 6 8 10 12 

pH 


12 ผลของความเปนกรด-ดาง ตอความคงตัวของสารสกัดเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 ณ อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส 

51

6.3 อุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมของเอนไซมไคติเนส 

จากการศึกษา อุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมของเอนไซมไคติเนส 

ที่อุณหภูมิตางๆ 

คือ 20, 30, 37, 40, 50, 60 องศาเซลเซียส ณ ความเปนกรด-ดาง 4.0 พบวาที่อุณหภูมิ 

20 

องศาเซลเซียส กิจกรรมของเอนไซม 2.09 หนวยตอมิลลิลิตร และกิจกรรมของเอนไซมจะเพิ่มขิ้น 

เมื่ออุณหภูมิเพิ่มขึ้นจนถึงที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส มีคากิจกรรมของเอนไซมสูงสุดคือ 3.24 

หนวยตอมิลลิลิตร และเริ ่มลดลงเมื่ออุณหภูมิ 

40, 50 และ 60 ตามลําดับ ดังภาพที่ 

13 

ดังนั้นอุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมของเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus 

circulans SH1.13 คือ 37 องศาเซลเซียส โดยทั่วไปอุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมของเอนไซมไคติ 

เนสที่ไดจากแบคทีเรียจะอยูในชวง 

40-50 องศาเซลเซียส ซึ่งสอดคลองกับการศึกษาคุณสมบัติของ 

เอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจากแบคทีเรียชนิด 

Bacillus circulans No.4.1 (40 °C) (Wiwat et al., 

1999) ของ B. circulans WL-12 (60 °C) (Watanabe et al., 1990) ของ Vibrio sp. (40 °C) (Ohtakara 

et al., 1979) ของ Pseudomonas aeruginosa K-187 (40 °C) (Wang et al., 1995) ของ Aeromonas 

hydrophila H-2330 (Hiraga et al.,1997) ของ Aeromonas sp. No.10S-24 (50 °C) (Ueda and Arai, 

1992) ของ Bacillus alvei E1 และ B. cereus J1-1 (50 °C) (Wang and Hwang, 2001) นอกจากนี้ยังมี 

เอนไซมไคติเนสที่สามารถทํากิจกรรมไดดีเมื่ออุณหภูมิสูง 

และผลิตจากแบคทีเรียในกลุมที่ทนรอน 

(thermophilic bacterium) ไดแก Bacillus licheniformis X-7u มีอุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมของ 

เอนไซมที่ 

70-80 องศาเซลเซียส (Takayanagi et al., 1991) 

52

6.4 ความคงตัวของเอนไซมไคติเนส ที่อุณหภูมิตาง 

ๆ 

ในการศึกษาความคงตัวของเอนไซมไคติเนสที่อุณหภูมิตางๆคือ 

20, 30, 37, 40, 50 

และ 60 องศาเซลเซียส ในสารละลายบัฟเฟอรที่มีคาความเปนกรด-ดาง 

4.0 นาน 10 นาที พบวาที่ 

อุณหภูมิ 20, 30 และ 37 องศาเซลเซียส มีกิจกรรมของเอนไซมคือ 4.34, 4.36 และ 4.55 หนวยตอ 

มิลลิลิตร ตามลําดับ และลดลงเมื่ออุณหภูมิ 

40, 50 และ 60 องศาเซลเซียส โดยมีกิจกรรมของ 

เอนไซม 4.03, 3.73 และ 3.19 หนวยตอมิลลิลิตร ตามลําดับ แสดงวาเอนไซมที่ผลิตไดจากแบคทีเรีย 

รหัส SH1.13 เปนเอนไซมที่ไมทนรอนสลายตัวหรือเสียสภาพเมื่ออุณหภูมิสูงกวา 



14 

ดังนั้นเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 มีความคงตัวที่ 

อุณหภูมิ 20-37 องศาเซลเซียส สอดคลองกับการศึกษาอื่นที่มีรายงานวาเอนไซมไคติเนส 

FI และ 

FII ซึ่งผลิตไดจากแบคทีเรีย 

Pseudomonas aeruginosa K-187 มีความคงตัวที่อุณหภูมิ 

20-50 องศา 

เซลเซียส (Wang and Chang, 1997) นอกจากนี้ 

เอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

P. saccharophila 6-1 

มีความคงตัวที่อุณหภูมิ 

20-40 องศาเซลเซียส (วาสนา, 2539) และเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Vibrio sp. มีความคงตัวที่อุณหภูมิต่ํากวา 

40 องศาเซลเซียส (Zhou et al., 1999) 

53




13 อุณหภูมิที่เหมาะสมตอกิจกรรมของสารสกัดเอนไซมไคติเนส 





5.00 

4.50 

4.00 

3.50 

3.00 

2.50 

2.00 

1.50 

1.00 

0.50 

0.00 

5.00 

4.50 

4.00 

3.50 

3.00 

2.50 

2.00 

1.50 

1.00 

0.50 

0.00 

0 10 20 30 40 50 60 70 

อุณหภูมิ(องศาเซลเซียส) 

0 10 20 30 40 50 60 70 

อุณหภูมิ (องศาเซลเซียส) 


14 ผลของอุณหภูมิตอความคงตัวของสารสกัดเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจาก 


54

7. การศึกษาคุณสมบัติของสารสกัดเอนไซมและการทําเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 ใหบริสุทธิ์ 

7.1 การเตรียมสารสกัดเอนไซมไคติเนส 

สารสกัดเอนไซม (supernatant culture broth) ที่ผลิตไดจากการเลี้ยง 


7.0 บมที่อุณหภูมิ 

37 องศา 

เซลเซียส เขยาที่ความเร็ว 

200 รอบตอนาที นาน 48 ชั่วโมง 

จากนั้นจึงนํามาเหวี่ยงแยกเซลลและ 

ไคตินที่เหลือออกจากสารสกัดเอนไซม 

นําสารสกัดเอนไซมมาทําใหแหงโดยวิธี lyophilization 

มีปริมาณโปรตีนทั้งหมดเทากับ 

3,310.14 ไมโครกรัม มีกิจกรรมของเอนไซมทั้งหมดเทากับ 

1,238.43 หนวย มี specific activity 0.37 หนวยตอไมโครกรัม ดังตารางที่ 

7 

นําสารสกัดเอนไซมที่ไดมาตกตะกอนโปรตีนดวยแอมโมเนียมซัลเฟต 

ที่ความเขมขน 

รอยละ 0-40, 40-60, 60-80 และ 80-90 นําไปเหวี่ยงตกตะกอนที่ความเร็ว 

9,000 รอบตอนาที 

อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส นาน 30 นาที พบวาที่ความเขมขนของแอมโมเนียมซัลเฟตรอยละ 

0-80 

ไมไดตะกอนของโปรตีนเลย และตรวจหากิจกรรมของเอนไซมในสารละลายพบวายังมีอยู 

แตเมื่อ 

ใชความเขมขนของแอมโมเนียมซัลเฟตรอยละ 90 พบตะกอนของโปรตีนมีลักษณะเปนผงละเอียด 

สีขาวอมเหลือง 

หลังจาก dialysis สารละลายที่ไดจากการตกตะกอนดวยแอมโมเนียมซัลเฟต 

15 

มิลลิลิตร แลวไดสารละลายมีปริมาตรทั้งหมด 

25 มิลลิลิตร มีปริมาณโปรตีนทั้งหมด 

188.20 

ไมโครกรัม มีกิจกรรมของเอนไซมทั้งหมด 

77.27 หนวย คิดเปน specific activity 0.41 หนวยตอ 

ไมโครกรัม มีคาความบริสุทธิ์เปน 

1.10 เทา ดังตารางที่ 

7 นําสารละลายที่ไดไปทําใหแหงโดยวิธี 

lyophilization เพื่อใหสารมีความเขมขนเพิ่มขึ้น 

หลังจากที่ทําใหแหงโดยวิธี 

lyophilization แลวจะ 

ไดสารสกัดทั้งหมด 

76 มิลลิกรัม 

55

7.2 การทําเอนไซมไคติเนส ใหบริสุทธิ์โดยใช 

วิธี gel filtration chromatography 

หลังจากที่นําสารสกัดเอนไซมมาผานลงในคอลัมน 


ชะดวย 20 mM Tris-HCl buffer ความเปนกรด-ดาง 8.0 อัตราการไหล 0.5 มิลลิลิตรตอนาที นําไป 

วัดหาปริมาณโปรตีนที่ความยาวคลื่น 

280 นาโนเมตร พบวาสารละลายในหลอดที่ 

15-19 มีคาการ 

ดูดกลืนแสงที่ 

280 นาโนเมตร สูงกวาหลอดอื่นๆ 

โดยมีคาสูงที่สุดในหลอดที่ 

16 ปริมาตรทั้งหมด 

15 มิลลิลิตร ดังภาพที่ 

15 

ปริมาณโปรตีนทั้งหมด 

63.45 ไมโครกรัม และมีกิจกรรมของเอนไซมทั้งหมด 

30.40 

หนวย คิดเปน specific activity 0.48 หนวยตอไมโครกรัม มีคาความบริสุทธิ์เปน 

1.28 เทา ดังตาราง 

ที่ 

7 

56

คาการดูดกลืนแสง (280 นาโนเมตร) 

0.12 

0.1 

0.08 

0.06 

0.04 

0.02 

0 

0 

10 

20 

30 

40 

50 

60 

70 

80 

90 

100 

110 

120 

130 

140 

150 

160 

170 

180 

190 

200 

210 

220 

230 

240 

250 

260 

270 

280 

290 

ปริมาตร (มิลลิลิตร) 


15 การทําเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 


โดยใชวิธี 

gel filtration chromatography (ผานลงในคอลัมน ที่มี 

Sephacryl S-200 HR ชะดวย 20 

mM Tris-HCl buffer pH 8 อัตราการไหล 0.5 มิลลิลิตรตอนาที) 

57


7 ขั้นตอนการทําเอนไซมไคติเนส 



Step 

Volume 

(ml) 

Total 

protein 

(µg) 

Total 

activity 

(unit) 

Specific 

activity 

(unit/µg) 

Yield 

(%) 

Purification 

fold 

Culture supernatant 500 3,310.14 1,238.43 0.37 100.00 1.00 

Dialysis 25 188.20 77.27 0.41 6.24 1.10 

Sephacryl S-200HR 15 63.45 30.40 0.48 2.45 1.28 

7.5 การหาน้ําหนักโมเลกุลยอยของเอนไซมไคติเนส 



SH1.13 ดวยวิธี SDS – PAGE 

วิธี SDS-PAGE การศึกษาโดยการวัดระยะทางในการเคลื่อนที่ของโปรตีนแตละชนิด 

ในสนามไฟฟา เพื่อหาน้ําหนักโมเลกุลของเอนไซมไคติเนส 

นอกจากนี้ยังสามารถบงชี้วาเอนไซมที่ 

แยกไดในแตละขั้นตอนมีความบริสุทธิ์หรือไม 

จากการทดลองพบวาแถวของโปรตีนทั้งหมด 

4 แถว โดยแถวแรกเปนโปรตีนมาตรฐาน แถวที่ 

2 เปนสารสกัดมีแถบโปรตีนที่เห็นชัดเจนเพียง 

1 

แถบ และจะเห็นไดวาแถบของโปรตีนที่ปรากฏขึ้นมีลักษณะเปนปน 

และไมชัดเจนนักแสดงใหเห็น 

วาเอนไซมไคติเนสที่ไดยังมี 

GlcNAc ซึ่งเปนน้ําตาลที่ไดจากการยอยไคตินของเอนไซมไคติเนส 

ปนอยูมีผลทําใหโปรตีนเคลื่อนที่ผาน 

acrylamide ไดยาก (เชาวนีพร, 2539) ในแถวที่ 

3 เปนสาร 

ละลายเอนไซมที่ตกตะกอนดวยแอมโมเนียมซัลเฟต 

และ dialysis มีแถบของโปรตีนปรากฏเห็น 

ชัดเจนขึ้นเมื่อเทียบกับในแถวที่ 

2 ซึ่งมีแถบของโปรตีนที่เห็นชัดเจน 

2 แถบ ทั้งนี้เพราะไดทําการ 

แยกเอา GlcNAc ออกไปแลวบางสวนดวยการตกตะกอน และ dialysis แตแถบของของโปรตีนยัง 

เห็นไมชัดเจนและแยกกันไมออก อาจเปนเพราะวา GlcNAc ยังมีเหลืออยูในสารละลาย 

ในแถวที่ 

4 

สามารถเห็นแถบของโปรตีนไดทั้งหมด 

6 แถบแยกกันอยางชัดเจน ดังภาพที่ 

16 ทั้งนี้เพราะในการ 

ผานสารละลายเอนไซมลงไปในคอลัมน มีสวนชวยในการลดปริมาณ GlcNAc คอนขางมาก 

(เชาวนีพร, 2539) 

58

แถบโปรตีนที่ปรากฏใหเห็นทั้ง 

6 แถบในแถวที่ 

4 แสดงใหเห็นวาในการทําเอนไซม 

ใหบริสุทธิ์ดังขั้นตอนที่กลาวมาขางตนยังไมสามารถทําใหเอนไซมบริสุทธิ์ได 

และเปนไปไดวา 

แถบโปรตีนทั้งหมดเปนสวนหนึ่ง 

หรือชนิดหนึ่งของเอนไซมไคติเนสเทานั้น 

และเนื่องจากวิธี 

SDS-PAGE เปนวิธีที่ทําใหสารละลายเอนไซมเสียสภาพธรรมชาติไป 

และไมสามารถตรวจสอบ 

กิจกรรมของเอนไซมได ดังนั้นถาศึกษาความบริสุทธิ์ของเอนไซมจึงควรทําดวยวิธีอื่นที่ไมทําให 

โปรตีนเสียสภาพธรรมชาติไปเชน Native-PAGE วิธีนี้สารละลายยังคงสภาพธรรมชาติอยู 

จึง 

สามารถตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซมได แตในการศึกษาครั้งนี้ไมไดทําวิธีดังกลาวเนื่องจาก 

ปริมาณของสารละลายเอนไซมไคติเนสที่แยกบริสุทธิ์ไมเพียงพอสําหรับการตรวจสอบ 

น้ําหนักโมเลกุลของแถบหนวยยอยของเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus 

circulans SH1.13 ซึ่งมีทั้งหมด 

6 แถบ คือ a, b, c, d, e และ f มาหาน้ําหนักโมเลกุล 

โดยเปรียบเทียบ 

กับกราฟมาตรฐานดังภาพผนวกที่ 

5ก จะไดน้ําหนักโมเลกุลดังตารางที่ 

8 คือ ประมาณ 107,000, 

89,000, 62,000, 42,000, 24,000 และ 17,000 ดาลตัน ตามลําดับ ซึ่งสอดคลองกับรายงานของ 

Wang 

and Chang (1997) กลาววาน้ําหนักโมเลกุลของเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจากจุลินทรียจะอยูในชวง 

ระหวาง 20,000 – 120,000 ดาลตัน เอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจากแบคทีเรียจะอยูในชวง 

60,000 – 

110,000 ดาลตัน Watanabe et al. (1990) รายงานวา แบคทีเรียชนิด Bacillus circulans WL – 12 

ผลิตเอนไซมไคติเนสทั้งหมด 

6 ชนิดโดยมีน้ําหนักโมเลกุลดังนี้ 

74,000 (A1), 69,000(A2), 52,000 

(D), 39,000(C), 38,000(B1) และ 38,000 (B2) ดาลตัน แบคทีเรียชนิด B. circulans No. 4.1 ผลิต 

เอนไซมไคติเนสที่มีน้ําหนักโมเลกุล 

45,000 ดาลตัน (Wiwat et al., 1999) แบคทีเรียชนิด 

B. licheniformis X-7u ผลิตเอนไซมไคติเนสทั้งหมด 

4 ชนิด มีน้ําหนักโมเลกุลดังนี้ 

89,000(I), 

76,000(II), 66,000(III) และ 59,000(IV) ดาลตัน (Takayanagi et al., 1991) แบคทีเรียชนิด 

Pseudomonas aeruginosa K-187 ผลิตเอนไซมไคติเนส 2 ชนิด คือ FI และ FII เมื่อนํามาหาน้ําหนัก 

โมเลกุลโดยวิธี SDS-PAGE 30,000 และ 32,000 ดาลตัน และน้ําหนักโมเลกุลที่ไดจาก 

gel filtration 

คือ 60,000 และ 30,000 ดาลตัน (Wang and Chang, 1997) 

59


16 แถบหนวยยอยโปรตีนของสารสกัดเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 โดยวิธี SDS-PAGE 

แถวที่ 

1 โปรตีนมาตรฐาน มีน้ําหนักโมเลกุลระหวาง 

14 – 116 กิโลดาลตัน (kDa) 

(รายละเอียดดังตาราง ผนวกที่ 

ก(5)) 


2 สารสกัดเอนไซมไคติเนส ที่ไดจากการเลี้ยง 



3 สารละลายเอนไซมที่ตกตะกอนดวยแอมโมเนียมซัลเฟตรอยละ 

90 และ dialysis 


4 สารละลายเอนไซมหลังจากผานลง คอลัมน Sephacryl S-200HR 

60

สรุป 

1. ผลการแยกและคัดเลือกแบคทีเรียทางทะเลที่ผลิตเอนไซมไคติเนสจากสัตวทะเล 

จํานวน 6 ชนิด 12 ตัวอยาง พบแบคทีเรียที่สามารถสรางโซนใสบนอาหาร 

CHA ทั้งหมด 

0.26 x 10 5 

– 23 x 10 5 โคโลนีตอกรัม หมึกสายมีรอยละของจํานวนโคโลนีที่เกิดโซนใสมากที่สุดแสดงวา 

สามารถพบแบคทีเรียที่สามารถยอยไคตินในหมึกมากกวาสัตวทะเลชนิดอื่น 

นอกจากนี้ยังพบวา 

สัตวทะเลที่มีไคตินเปนองคประกอบโครงสรางของรางกายมีรอยละของจํานวนโคโลนีที่เกิด 

โซนใสดังกลาว มากกวาในสัตวทะเลที่ไมมีไคตินเปนองคประกอบ 

2. สามารถคัดแยกแบคทีเรียที่สรางโซนใสไดทั้งหมด 

99 ไอโซเลท และเมื่อนําทั้ง 

99 

ไอโซเลทมาเลี้ยงในอาหาร 

CHA โดยวิธี point inoculate เพื่อคัดเลือกแบคทีเรียที่มีประสิทธิภาพ 

ใน 

การยอยไคตินโดยการหาอัตราสวนระหวาง ขนาดเสนผานศูนยกลางของโซนใส กับขนาดเสนผาน 

ศูนยกลางของโคโลนี พบแบคทีเรียที่มีอัตราสวนดังกลาวมากกวา 

6 เซนติเมตร จํานวนทั้งหมด 

27 

ไอโซเลท จากนั้นนํามาเลี้ยงในอาหาร 

CHB พบวาแบคทีเรียรหัส SH1.13 เปนแบคทีเรียที่มีประ 

สิทธิภาพสูงสุดในการผลิตเอนไซมไคติเนส 

3. การจัดจําแนกแบคทีเรียรหัส SH1.13 พบวาเปนชนิด Bacillus circulans เปนแบคทีเรีย 

แกรมบวก รูปทอน ซึ่งผลิตเอนไซมประเภท 

extracellular enzyme 

4. สภาวะที่เหมาะสมในการเลี้ยง 

Bacillus circulans SH1.13 เชื้อดังกลาวสามารถเจริญเติบ 

โตและมีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซมคือที่ความเปนกรด-ดาง 

เริ่มตนในอาหารคือ 

ความเปน 

กรด-ดาง 7.0 และอุณหภูมิที่ใชในการเลี้ยงคือ 

37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 48 ชั่วโมง 


8 

5. สารสกัดเอนไซมไคติเนส ที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 มีกิจกรรมของ 

เอนไซมสูงสุดเมื่อความเปนกรด-ดาง 

4.0 อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส และสามารถคงสภาพไดดีเมื่อ 

เก็บที่ 

ความเปนกรด-ดาง 4.0 และที่อุณหภูมิในชวง 

20 – 37 องศาเซลเซียส ดังตารางที่ 

8 

61


8 สภาวะที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซมไคติเนสของ 


และสภาวะที่เหมาะในการทํางานของเอนไซมไคติเนส 

Organism 

pH 

Culture condition 

Temp. 

(°C) 

Time 

(hours) 

Chitinase 

Optimum Stable 

pH 

Temp. 

(°C) 

pH 

Temp. 

(°C) 

Bacillus circulans 7.0 37 48 4.0 37 4.0 20-37 

6. เมื่อนําสารสกัดเอนไซมไคติเนสที่ไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 มาทําใหบริสุทธิ์ 

โดยเริ่มจากนําสารสกัดเอนไซม 

มีกิจกรรมของเอนไซมทั้งหมด 

1238.43 หนวย มี specific activity 

0.37 หนวยตอไมโครกรัมโปรตีน จากนั้นนําสารสกัดเอนไซมมาตกตะกอนดวยแอมโมเนียมซัลเฟต 

ที่ความเขมขนรอยละ 

90 นําตะกอนที่ไดมาทํา 

dialysis มีกิจกรรมของเอนไซมทั้งหมด 

77.27 หนวย 

มี specific activity 0.41 หนวยตอไมโครกรัมโปรตีน ไดเอนไซมทั้งหมด 

6.24 เปอรเซ็นต มีคา 

ความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 

1.10 เทา เมื ่อนํามาแยกโดยการผานลงในคอลัมน sephacryl S-200HR มีกิจ 

กรรมของเอนไซมทั้งหมด 

30.40 หนวย มี specific activity 0.48 หนวยตอไมโครกรัมโปรตีน ได 

เอนไซมทั้งหมดรอยละ 

2.45 มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 

1.28 เทา 

7. แถบหนวยยอยของโปรตีนที่ปรากฏแสดงใหเห็นวาในการทําเอนไซมใหบริสุทธิ์ดังขั้น 

ตอนที่กลาวมาขางตนยังไมสามารถทําใหเอนไซมบริสุทธิ์ได 

จึงตองอาศัยขั้นตอนอื่นซึ่งเหมาะสม 

กวา และละเอียดกวา โปรตีนที่ผลิตไดจาก 

Bacillus circulans SH1.13 มีทั้งหมด 

6 หนวยยอย และมี 

น้ําหนักโมเลกุล 

ดังนี้ 

107,000(a) , 89,000(b) , 62,000(c) , 42,000(d) , 24,000(e) และ 17,000(f) 

ดาลตัน 

62

ขอเสนอแนะ 

1. ควรศึกษาวิธีการทําเอนไซมที่ผลิตไดใหบริสุทธิ์ 

เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการทํางานของ 

เอนไซม 

2. เนื่องจากยังไมมีรายงานวา 

Bacillus circulans เปนแบคทีเรียที่กอใหเกิดโรคในคน 

สัตว 

และพืช จึงควรศึกษาความเปนไปไดในการนําแบคทีเรียดังกลาวไปใชประโยชนโดยตรง 

3. เอนไซมไคติเนสที่ผลิตได 

ควรไปศึกษาในการนําไปใชประโยชนทั้งในดานการนําไป 

ใชเปนสารชีวภาพ ในการควบคุมแมลง และเชื้อราที่เปนศัตรูของพืช 

นอกจากนี้ยังพบวาผลิตผลที่ 

ไดจากการยอยของเอนไซมไคติเนส คือ GlcNAc สามารถนําไปใชประโยชนไดเชน การนําไปเปน 

อาหารสําหรับเลี้ยงเชื้อจุลินทรีย 

เพื่อผลิต 

single cell protein 

63

เอกสารและสิ่งอางอิง 

จินตลา ลิ้มภักดี. 

2544. การคัดเลือกและศึกษาลักษณะเฉพาะของแบคทีเรียแล็กติกที่ผลิตสารยับยั้ง 

จุลชีพจากผลิตภัณฑแปรรูปโดยกระบวนการหมัก และการนําไปใชประโยชน. วิทยานิพนธ 

ปริญญาโท, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร. 

เชาวนีพร บุญชวย. 2539. ปจจัยที่มีผลตอการสังเคราะหเอนไซมไคติเนสใน 

Aeromonas sp. CS- 

34 และการศึกษาลักษณะของเอนไซมที่แยกบริสุทธิ์. 

วิทยานิพนธปริญญาโท, มหาวิทยาลัย 

สงขลานครินทร. 

ปยะบุตร วานิชพงษพันธุ 

และ สุวลี จันทรกระจาง. 2542. การพัฒนาแผนบางไคโตซานเพื่อการ 

กรองแยกชีวสาร, น. 28-59. ใน การสัมมนาวิชาการเรื่อง 

ความรวมมือของภาครัฐ และเอก 

ชนในการพัฒนาการผลิต และการใชสารไคติน ไคโตซานแบบครบวงจร, 2-3 เมษายน 2542. 

โรงแรมไอเฟล, ระนอง. 

รัฐ พิชญางกูร. 2542. เอนไซมไคติเนส: การคัดเลือก และการทําพันธุวิศวกรรม และวิศวกรรม 

โปรตีน, น. 68. ใน การสัมมนาวิชาการเรื่อง 

ความรวมมือของภาครัฐ และเอกชนในการ 

พัฒนาการผลิต และการใชสารไคติน ไคโตซานแบบครบวงจร, 2-3 เมษายน 2542. โรงแรม 

ไอเฟล, ระนอง. 

วาสนา ฉัตรดํารง. 2539. การคัดเลือกจุลินทรียเพื่อผลิตเอนไซมยอยไคติน. 

วิทยานิพนธปริญญา 

โท, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร. 

สุวลี จันทรกระจาง. 2542. สารไคติน และไคโตซาน ผลิตภัณฑจากธรรมชาติ และการประยุกตใช 

ประโยชน, น. 1-17. ใน การสัมมนาวิชาการเรื่อง 

ความรวมมือของภาครัฐ และเอกชนในการ 

พัฒนาการผลิต และการใชสารไคติน ไคโตซานแบบครบวงจร, 2-3 เมษายน 2542. โรงแรม 

ไอเฟล, ระนอง. 

Berger, L. R. and D. M. Reynolds. 1958. The chitinase system of a strain of Streptomyces 

griseus. Biochim. Biophys. Acta. 29: 522-534. 

64

Cabib, E. 1987. The synthesis and degradation of chitin. Advances in Enzymol. 59: 59-101. 

. 1988. Chitinase from Serratia marcescens, pp. 460 – 462. In W. A. Wood and S. T. 

Kellogg, eds. Methods in Enzymology, Vol. 161, Biomass, Part B: Lignin, Pectin, and 

Chitin. Academic Press, Inc., San Diego. 

, S. J. Silverman and J. A. Shaw. 1992. Chitinase and chitin synthase 1: Counterbalancing 

activities in cell separation of Saccharomyces cerevisiae. J. Gen. Microbiol. 138: 97- 

102. 

Carroad, P.A. and R. A. Tom. 1978. Bioconversation of shellfish chitin waste : process 

conception and selection of microorganism. J. Food. Sci. 43: 1153-1161. 

Chen, H. and K. Chen. 1991. Isolation of chitinolytic bacteria and their hydrolytic activity on 

shrimp shells. Proc. Natl. Sci. Counc., ROC. Part B: Life Sci. 15: 233-239. 

Cody, R.M. 1989. Distribution of chitinase and chitobiase in Bacillus. Curr. Microbiol. 19: 

201-205. 

, N.D. Davis, J. Lin and D. Shaw. 1990. Screening microorganisms for chitin 

hydrolysis and production of ethanol from amino sugar. Biomass. 21: 285-295. 

Correa, J.U., N. Elano, I. Polacheck and E. Cabib. 1982. Endochitinase, a mannan associated 

enzyme from Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 257: 1392-1397. 

Cottrell, M. T., J. A. Moore and D. L. Kirchman. 1999. Chitinase from uncultured marine 

microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 65: 2553-2557. 

Dickinson, K., V. Keer, C. A. Hitchcock and D. J. Adums. 1989. Chitinase activity from 

Candida albicans and its inhibition by allosamidin. J. Gen. Microbiol. 135: 1417-1421. 

65

Deutscher, M. P. 1990. Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification. 

Academic Press, Inc., San Diego. 

Esaiassen, M. 1996. Chitinolytic Enzymes from Northern Shrimp Pandalus borealis. Dr. 

Scient Dissertation, Tromsø Univ., Norway. 

Ferguson, M. J. L. and G. W. Gooday. 1996. Environmental recycling of chitin, pp. 393-396. In 

R. A. A. Muzzarelli, ed. Chitin Enzymology, Vol. 2, Proceeding of the 2 nd 

International Symposium on Chitin Enzymology, May 8-11, 1996, Senigellia, Italy. 

Flach, J., P.E. Pilet and P. Jolles. 1992. What's new in chitinase research?. Experientia. 48: 

701-716. 

Frändberg, E. and J. Schnürer. 1994. Evalution of a chromogenic chito-oligosaccharide 

analogue, p-nitrophenyl-β-D-N,N′-diacetylchitobiose, for the measurement of the 

chitinolytic activity of bacteria. J. Appl. Bacteriol. 76: 259-263. 

Gallagher, S. R. and J. A. Smith. 1991. Electrophoretic separation of proteins. In F. M.Ausubel, 

R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl, eds. 

1993. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., USA. 

Gooday, G. W. 1994. Physiology of microbial degradation of chitin and chitosan, pp. 279-312. 

In C. Ratledge, ed. Biochemistry of Microbial Degradation. Kluwer Acad., 

Netherlands. 

Hara, S., Y. Yamamura, Y. Fujii, T. Mega and T. Ikenaka. 1989. Purification and 

characterization of chitinase produced by Streptomyces erythraeus. J. Biochem. 105: 

484-489. 

66

Hiraga, K., L. Shou, M. Kitazawa, S. Takahashi, M. Shimada, R. Sato and K. Oda. 1997. 

Isolation and characterization of chitinase from a flake-chitin degrading marine bacterium, 

Aeromonas hydrophila H – 2330. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61: 174-176. 

Imoto, T. and K. Yagishita. 1971. A simple activity measurement of lysozyme. Agric. Biol. 

Chem. 35: 1154-1156. 

Jeuniaux, C. 1961. Chitinase: An addition to the list of hydrolase in the digestive tract of 

vertebrates. Nature. 192: 135-136. 

Jeuniaux, C. 1966. Chitinase. Method Enzymol. 8: 644-650. 

Kelkar, H. S., V. Shankar and M. V. Deshpande. 1990. Rapid isolation and regeneration of 

Sclerotium rolfsii protoplasts and their potential application for starch hydrolysis. Enz. 

Microb. Technol. 12: 510-514. 

Koga, D., T. Hirata, N. Sueshige, S. Tanaka and A. Ide. 1992. Induction patterns of chitinases in 

yam callus by inoculation with autoclaved Fusarium oxysporum, ethylene, and chitin and 

chitosan oligosaccharides. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56: 280-285. 

, M. Mitsutomi, M. Kono and M. Matsumiya. 1999. Biochemistry of chitinase, pp.111 

– 123. In P. Jollès and R. A. A. Muzzarelli, eds. Chitin and Chitinase, Birkhäuser 

Verlag Basel, Switzerland. 

, N. Sueshige, K. Orikono, T. Utsumi, S. Tanaka, Y. Yamada and A. Ide. 1988. 

Efficiency of chitinolytic enzymes in the formation of Tricholomer matsutake protoplasts. 

Agric. Biol. Chem. 52: 2091-2093. 

Kuranda, J. M. and P. W. Robbins. 1991. Chitinase is required for cell separation during growth 

of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266: 19758-19767. 

67

Leah, R., H. Tommerup, I. Svendsen and J. Mandy. 1991. Biochemical and molecular 

characterization of three barley seed proteins with antifungal properties. J. Biol. Chem. 

266: 1564-1573. 

Lorito, M., S. L. Woo, I. G. Fernandez, G. Colucci, G. E. Harman, J. A. Pintor-Toro, 

E. Filippone, S. Muccifora, C. B. Lawrence, A. Zoina, S. Tuzun and F. Scala. 1998. Gene 

from mycoparasitic fungi as a source for improving plant resistance to fungal pathogens. 

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 7860-7865. 

Manson, F. D. C., T. C. Fletcher and G. W. Gooday. 1992. Location of chitinolytic enzymes in 

blood of turbot, Scophthalmus maximus , and their possible roles in defence. J. Fish. Biol. 

40: 919-927. 

Mauch, F., L. A. Hadwiger and T. Boller. 1988. Antifungal hydrolases in pea tissue : Π 

purification and characterization of two chitinases and two β-1, 3-glucanases differentially 

regulated during development and in response to fungal infection. Plant Physiol. 87: 325- 

333. 

and L. A. Staehelin. 1989. Functional implications of the subcellular localization of 

ethelene-induced chitinase and β -1,3-glucanase in bean leaves. Plant Cell. 1: 447-457. 

McIlvaine. 1921. McIlvaine Buffer formulae. Chemie. De. Available Source: http://forum. 

Chemie.de/HyperNews/get/forums/chemstarter-1999/709/1.html?nogifs, July 27, 2004. 

Monreal, J. and E. T. Reese. 1969. The chitinase of Serratia marcascens. Can. J. Microbiol. 

15: 689-696. 

Murao, S., T. Kawada, H. Itoh, H. Oyama and T. Shin. 1992. Purification and characterization of 

a novel type of chitinase from Vibrio alginolyticus TK-22. Biosci. Biotechnol. Biochem. 

56: 368-369. 

68

Muzzarelli, R. A. A. 1977. Chitin. Pergamon Press, New York. 

Ohtakara, A. 1988. Chitinase and β-N-Acetylhexosaminidase from Pycnoporus cinnabarinus, 

pp. 462 – 470. In W. A. Wood and S. T. Kellogg, eds. Methods in Enzymology, Vol. 

161, Biomass, Part B: Lignin, Pectin, and Chitin. Academic Press, Inc., San Diego. 

, M. Matsutomi and Y. Uchida. 1979. Purification and some properties of chitinase 

from vibrio sp. J. Ferment. Technol. 57: 169-177. 

Park, J. K., K. Morita, I. Fukumoto, Y. Yamasaki, T. Nakagawa, M. Kawamukai and 

H. Matsuda. 1997. Purification and characterization of chitinase (ChiA) from 

Enterobacter sp. G – 1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61: 684-689. 

Pedraza-Reyes, M. and E. Lopez-Romero. 1989. Purification and some properties of two forms 

of chitinase from mycelial cells of Mucor rouxii. J. Gen. Microbiol. 135: 211-218. 

Pegg, G.F. 1988. Chitinase from Verticillium albo-atrum, pp. 474-479. In W. A. Wood and 

S. T. Kellogg, eds. Methods in Enzymology, Vol. 161, Biomass, Part B: Lignin, Pectin, 

and Chitin. Academic Press, Inc., San Diego. 

Place, R. A. 1996. The biochemical basis and ecological significance of chitin digestion, pp.39- 

54. In R. A. A. Muzzarelli, ed. Chitin Enzymology, Vol. 2, Proceeding of the 2 nd 

International Symposium on Chitin Enzymology, May 8-11, 1996, Senigallia, Italy. 

Revah-Moiseev, S and P.A. Carroad. 1981. Conversion of the enzymatic hydrolysate of shellfish 

waste chitin to single-cell protein. Biotechnol. Bioeng. 23: 1067-1078. 

Reynolds, D.M. 1954. Exocellular chitinase from a Streptomyces sp. J. Gen. Microbiol. 

11: 150-159. 

69

Robbins, P. W., C. Albright and B. Benfield. 1988. Cloning and expression of a Streptomyces 

plicatus chitinase (chitinase-63) in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263: 443-447. 

Roberts, R. L. and E. Cabib. 1982. Serratia marcescens chitinase: One-step purification and use 

for the determination of chitin. Anal. Biochem. 127: 402-412. 

Roberts, W. K. and C. P. Selitrennikoff. 1988. Plant and bacterial chitinases differ in antifungal 

activity. J. Gen. Microbiol. 134: 169-176. 

Rojas-Avelizapa, L.I., R. Cruz-Camarillo, M.I. Guerrero, R. Rodriguez-Vazquez and J.E. Ibarra. 

1999. Selection and characterization of a proteo-chitinolytic strain of Bacillus 

thuringiensis, able to grow in shrimp waste media. World J. Microbiol. Biotechnol. 15: 

261-268. 

Sakai, K., A. Yakota, H. Kurokawa, M. Wakayama and M. Moriguchi. 1998. Purification and 

characterization of three thermostable endochitinases of Bacillus noble strain MH-1 

isolated from chitin containing compost. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3340-3397. 

Schlumbaum, A., F. Mauch, U. VÖgeli and T. Boller. 1986. Plant chitinases are potent inhibitors 

of fungal growth. Nature. 324: 365-367. 

Schomburg, D. and M. Salzmann. 1991. Enzyme Handbook vol. 4. Springer Verlag, New 

York. 

Shaikh, S.A. and M.V. Deshpande. 1993. Chitinolytic Enzymes: Their contribution to basic and 

applied research. World J. Microbiol. Biotechnol. 9: 468-475. 

Sherief, A.A., M.M.A. El-Sawah and M.A.A. El-Naby. 1991. Some poperties of chitinase 

produced by potent Aspergillus carneus strain. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35: 228- 

230. 

70

Shimahara, K. and Y. Takiguchi. 1988. Preparation of Chitin, pp. 417-423. In W. A. Wood and 

S. T. Kellogg, eds. Methods in Enzymology, vol. 161, Biomass, Part B: Lignin, Pectin, 

and Chitin. Academic Press, Inc., San Diego. 

Smith, J. A. 1987. Quantitation of proteins. In F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. 

Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith and K. Struhl, eds. 1993. Current Protocols in 

Molecular Biology vol. 2. John Wiley and Sons, Inc., USA. 

Sneath, P. H. A. 1984. Endospore-forming Gram-Positive Rods and Cocci, pp. 1104-1122. In 

P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe and J. G. Holt, eds. Bergey , s Manual of 

Systematic Bacteriology vol. 2. The Williams and Wilkins co., Baltimore.,USA. 

Stoll, V. S. and J. S. Blanchard. 1990. Buffer: Principles and Practice, pp. 24-38. In M. P. 

Deutscher, ed. Methods in Enzymology vol. 182, Guide to Protein Purification. 

Academic Press, Inc., San Diego. 

Svitil, A. L., S. M. N. Chadhain, J. A. Moore and D. L. Kirchman. 1997. Chitin degradation 

proteins produced by the marine bacterium Vibrio harveyi growing on different forms of 

chitin. Appl. Environ. Microbiol. 63: 408-413. 

Takayanagi, T., K. Ajisaka, Y. Takiguchi and K. Shimahara. 1991. Isolation and 

characterization of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7u. Biochim. 

Biophys. Acta. 1078: 404-410. 

Takiguchi, Y. and K. Shimahara. 1989. Isolation and identification of a thermophilic bacterium 

producing N,N′ - Diacetylchitobiose from chitin. Agric. Biol. Chem. 53: 1537-1541. 

Tsujibo, H., Y. Yishida, C. Imada, Y. Okami, K. Miyamoto and Y. Inamori. 1991. Isolation and 

characterization of a chitin degrading marine bacterium belonging to the genus 

Alteromonas. Nippon Suisan Gakkaishi. 57: 2127-2131. 

71

Ueda, M. and M. Arai. 1992. Purification and some properties of chitinases from 

Aeromonas sp. No. 10S-24. Biosci. Biotechnol. Biochem. 56: 460-464. 

Ueno, H., K. Miyashita, Y. Sawado and Y. Oba. 1990. Purification and some properties of 

extracellular chitinases from Streptomyces. J. Gen. Appl. Microbiol. 36: 377-392. 

Verburg, J. G. and Q. K. Huynh. 1991. Purification and characterization of an antifungal 

chitinase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 95: 450-455. 

Vyas, P. and M. V. Deshpande. 1989. Chitinase production Myrothecium verrucaria and its 

significance for fungal mycelia degradation. J. Gen. Appl. Microbiol. 35: 343-350. 

Wang, S. and W. Chang. 1997. Purification and characterzation of two bifunctional 

chitinase/lysozymes extracellularly produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a 

shrimp and crab shell powder medium. Appl. Environ. Microbiol. 63: 380-386. 

, and M. Lu. 1995. Production of chitinase by Pseudomonas aeruginosa K- 

187 using shrimp and crab shell powder as a carbon source. Proc. Nat. Sci. Counc., ROC 

Pt. B: Life Sci. 19: 105-112. 

and J. Hwang. 2001. Microbial reclamation of shellfish wastes for the production of 

chitinase. Enz. Microbiol. Technol. 28: 376-382. 

Watanabe, T., W. Oyanagi, K. Suzuki and H. Tanaka. 1990. Chitinase system of Bacillus 

circulans WL-12 and importance of chitinase A1 in chitin degradation. J. Bacteriol. 172: 

4017-4022. 

Wilke, C.R., R.D. Yang and U. Stockar. 1976. Preliminary cost analyses for enzymatic 

hydrolysis of newsprint. Biotech. Bioen. 6: 155. 

72

Wiwat, C., P. Siwayaprahm and A. Bhumiratana. 1999. Purification and characterization of 

chitinase from Bacillus circulans No.4.1. Curr. Microbiol. 39: 134-140. 

Wortman, A.T., C.C. Someruille and R.R. Colwell. 1986. Chitinase determinants of Vibrio 

vulnificus: gene cloning and applications of a chitin probe. J. Appl. Environ. Microbiol. 

52: 142-145. 

Yanagi, S.O. and I. Takebe. 1984. An efficient method for the isolation of mycelial protoplasts 

from Coprinus macrorhizus and other basidiomyces. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 19: 

58-60. 

Yu, C., A. M. Lee, B. L. Bassler and S. Roseman. 1991. Chitin utilization by marine bacteria : 

A physiological function for bacterial adhesion to immobilized carbohydrates. J. Biol. 

Chem. 266: 24260-24267. 

Yuli, P.E., M.T. Suhartono, Y. Rukayadi, J. K. Hwang and Y. R. Pyun. 2004. Characteristics of 

thermostable chitinase enzymes from the indonesian Bacillus sp. 13.26. Enz. Microbiol. 

Technol. 35: 147-153. 

Zhou, S.N., C.Y. Yang, Y.J. Lu, L. Huang, C.H. Cai and Y.C. Lin. 1999. Isolation and 

characterization of chitinase from a marine bacterium Vibrio sp. World J. Microbiol. 

Biotechnol. 15: 745-746. 

Zobell, E.C. and S.C. Rittenberg. 1938. The occurrence and characterization of chitinolytic 

bacteria in the sea. J. Bacteriol. 35: 275-287. 

73

ภาคผนวก 

74

ภาคผนวก ก 

75

1. Colloidal Chitin 

วิธีการเตรียมสารเคมี 

chitin powder (0.08 มิลลิเมตร) 20 กรัม 

HCl 800 มิลลิลิตร 

เทผงไคตินลงใน flask ขนาด 2000 มิลลิลิตร คอยๆ เทลงกรดไฮโดรคลอลิกเขมขนที่แช 

เย็น(5 องศาเซลเซียส) ไวลงไป คนสารละลายอยางแรงตลอดเวลา เมื่อสารละลายเขากัน 

ใหลด 

ความแรงการคนลงใหอยูในระดับปานกลาง 

สังเกตเมื่อสารละลายใส 

นํามากรองดวยใยแกว (glass wool) นําสารละลายที่ได 

(filtrate) 

มาเทใสในน้ํากลั่นที่แชเย็นไวจํานวน 

8 ลิตร คนใหเขากัน 30 นาที ทิ้งไว 

ขามคืนโดยแชไวในตูเย็น 

(5 องศาเซลเซียส) หลังจากนั้นนํามาเหวี่ยงตกตะกอนที่ความเร็วรอบ 

9,000 รอบตอนาที นําตะกอน 

ที่ไดมาลางน้ําเพื่อปรับ 

pH ใหได 7 เก็บไวในขวดสีชา ที่อุณหภูมิต่ํากวา 

5 องศาเซลเซียส (ดัดแปลง 

จาก Shimahara and Takiguchi, 1988) 

2. Chitin agar 

3. Chitin Broth 

colloidal chitin 5 มิลลิลิตร 

agar 15 กรัม 

น้ําทะเลที่ความเค็ม~30 

ppt 1 ลิตร 

ความเปนกรด-ดาง 6.8-7.0 (ปรับ pH ดวย 0.1 N HCl และ 0.1 M NaOH) 

colloidal chitin 10 มิลลิลิตร 

น้ําทะเลที่ความเค็ม~30 

ppt 1 ลิตร 

ความเปนกรด-ดาง 6.8-7.0 (ปรับ pH ดวย 0.1 N HCl และ 0.1 M NaOH) 

76

4. Alkaline peptone water 

เปปโตน (peptone) 10 กรัม 

โซเดียมคลอไรด (NaCl) 10 กรัม 

ความเปนกรด-ดาง 8.5 

5. Normal saline solution (0.85% sodium chloride) 

โซเดียมคลอไรด (NaCl) 8.5 กรัม 

เติมน้ํากลั่นจนครบปริมาตร 

1 ลิตร 

6. Catalase test reagent 

Hydrogen peroxide (H2O2 : 30%) 10 มิลลิลิตร 

น้ํากลั่น 

90 มิลลิลิตร 

7. Gram’s stain solution 

7.1 Hucke’s ammonium oxalate crystal violet stain 

สารละลาย A 

crystal violet 3 กรัม 

95% ethanol 20 มิลลิลิตร 

สารละลาย B 

ammonium oxalate 0.8 กรัม 



77

ผสมสารละลาย A และสารละลาย B เขาดวยกัน กรองดวยกระดาษกรอง บรรจุใสขวด 

สีชา เก็บไวในที่มืด 

7.2 Gram’s iodine solution 

Iodine 1 กรัม 

Potassium iodide 2 กรัม 



บด iodine และ potassium iodide ใหผสมกันจนเปนผงละเอียด ละลายสารผสมทั้งสอง 

ดวยน้ํากลั่น 

300 มิลลิลิตร ใสไวในขวดสีชา เก็บไวในที่มืด 

7.3 Acetone alcohol 


Acetone 300 มิลลิลิตร 

7.4 Safranine staining solution 

Safranine 0.25 กรัม 




ละลาย safranine ดวย ethanol กอน แลวจึงเติมน้ํากลั่นลงไปกวนใหผสมกันกรองดวย 

กระดาษกรอง บรรจุใสขวดสีชา เก็บไวในที่มืด 

78

8. การวิเคราะหหาปริมาณ N-acetylglucosamine 

Imoto and Yagishita (1971) ไดเสนอวิธีการหาปริมาณ N-acetylglucosamine ไวดังนี้ 

8.1 การเตรียมสารละลาย Schales reagent 

ละลายโซเดียมคารบอเนต (Na2CO3) 5.2995 กรัม ในน้ํากลั่น 

90 มิลลิลิตร เติมโปแทส 

เซียมเฟอริกไซยาไนด (K3Fe(CN) 6) 0.05 กรัม แลวเติม น้ํากลั่นจนครบ 

100 มิลลิลิตร เก็บไวในขวด 

สีชา (30 วัน) 

8.2 วิธีการวิเคราะหหาปริมาณ N-acetyl –D-glucosamine (GlcNAc) 

ปเปตสารละลาย Schales reagent 2 มิลลิลิตร ใสลงในหลอดทดลองที่มีสารละลายตัว 

อยาง 1.5 มิลลิลิตร หุมหลอดดวย 

aluminum foil ผสมใหเขากัน นําไปตมในน้ําเดือดนาน 

15 นาที 

หลังจากนั้นปลอยทิ้งไวใหเย็น 

วัดคาการดูดกลืนแสงที่ 

420 นาโนเมตร 

8.3 การทํากราฟมาตรฐานของ N-acetyl –D-glucosamine (GlcNAc) 

เตรียมสารละลาย GlcNAc ความเขมขนตางๆ ดังตารางผนวกที่ 

ก1 นําไปหาปริมาณ 

GlcNAc ดังวิธีขางตน นําไปเขียนกราฟมาตรฐานระหวาง คาการดูดกลืนแสงที่ 

420 นาโนเมตร และ 

ความเขมขนของ GlcNAc 

79

ตารางผนวกที่ 

ก1 การเตรียมสารละลาย GlcNAc สําหรับทํากราฟมาตรฐาน 

ความเขมขน GlcNAc (GlcNAc 0.5 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) น้ํากลั่น 

(มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) 

(ไมโครลิตร) 


0 0 1,500 

0.10 300 1,200 

0.15 450 1,050 

0.20 600 900 

0.25 750 750 

0.30 900 600 

0.35 1,050 450 

0.40 1,200 300 


0.14 

0.12 

0.1 

0.08 

0.06 

0.04 

0.02 

0 

Y = 0.4071X – 0.0355 

R 2 = 0.9948 

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 

ความเขมขนของ GlcNAc (มิลลิกรัม/มิลลิลิตร) 

ภาพผนวกที่ 

ก1 กราฟมาตรฐานของ GlcNAc แสดงคาระหวาง ความเขมขนของ GlcNAc และคา 

การดูดกลืนแสงที่ 


80

9. วิธีการวิเคราะหหากิจกรรมของเอนไซมไคติเนส 

ปเปตสารละลายเอนไซม 1 มิลลิลิตร ใสลงในหลอดทดลองที่มีซับเสตรท 

2 มิลลิลิตร มี 

รอยละ 3 ของ colloidal chitin ใน 0.2 M McIlvaine buffer pH 4 นําไปบม และเขยาดวยความเร็ว 

200 รอบ/นาที ที่อุณหภูมิ 

37 องศาเซลเซียส นาน 60 นาที หลังจากนั้นนํามาเหวี่ยงตกตะกอนที่ 

9000 รอบ/นาที นําสารละลายสวนใสไปวิเคราะหหาปริมาณ GlcNAc (ดัดแปลงจาก Ueda and 

Arai, 1992) 

1 หนวยของกิจกรรมเอนไซม คือ ปริมาณเอนไซม 1 มิลลิลิตร ที่ทําใหเกิด 

GlcNAc 1 

ไมโครกรัม ในเวลา 1 นาที ณ สภาวะที่ทดสอบ 

10. การวิเคราะหหาปริมาณโปรตีนโดยวิธี Bradford 

10.1 การวิเคราะหหาปริมาณโปรตีน 

ปเปตตัวอยาง 800 ไมโครลิตร ใสลงใน dye reagent 200 ไมโครลิตร ผสมใหเขากัน 

ตั้งทิ้งไวที่อุณหภูมิหองนาน 

5 นาที (ไมควรเกิน 1 ชั่วโมง) 

นําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ 

595 

นาโนเมตร (Smith, 1987) 

10.2 การทํากราฟมาตรฐานของ Bovine serum albumin (BSA) 

เตรียมสารละลาย BSA ความเขมขนตางๆ ดังตาราง นําไปหาปริมาณโปรตีน ดังวิธี 

ขางตน นําไปเขียนกราฟมาตรฐานระหวาง คาการดูดกลืนแสงที่ 

595 นาโนเมตร และความเขมขน 

ของ BSA 

81


ก2 การเตรียมสารละลาย BSA สําหรับทํากราฟโปรตีนมาตรฐาน โดยวิธีของ 

Bradford 

ความเขมขน BSA (100 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) น้ํากลั่น 

(ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) 



0 0 800 

2 16 784 

4 32 768 

6 48 752 

8 64 730 

10 80 720 


0.8 

0.7 

0.6 

0.5 

0.4 

0.3 

0.2 

0.1 

0 

Y = 0.0661X + 0.0444 

R 2 = 0.9926 

0 2 4 6 8 10 12 

ความเขมขนของ BSA (ไมโครกรัม/มิลลิลิตร) 


ก2 กราฟมาตรฐานของโปรตีน โดยวิธี Bradford แสดงคาระหวาง ความเขมขนของ 

BSA และคาการดูดกลืนแสงที่ 


82

11. วิธีการทํา gel filtration chromatography 

11.1 การเตรียมคอลัมน 

ทําความสะอาดคอลัมน ดวยน้ําสบู 

ลางใหสะอาดแลวกลั้วดวยน้ํากลั่น 

ทิ้งไวใหแหง 

นํา Sephacryl S – 200 HR ที่เก็บอยูใน 

20 % ethanol มาลางดวยน้ํากลั่น 

2 ครั้ง 

และลางดวย Tris- 

HCl buffer pH 8.0 นําคอลัมนที่ทําความสะอาดแลว 

ใสไวในตูบมที่อุณหภูมิ 

4 องศาเซลเซียส เท 

Tris-HCl buffer pH 8.0 ลงในคอลัมนใหไดปริมาตร 1 ใน 4 หลังจากนั้นนํา 

Sephacryl S – 200 HR 

ที่เตรียมไวมาเทใสลงในคอลัมน 

โดยคนใหเจล กระจายอยูตลอดเวลาจนเทเสร็จ 

ระหวางการเทให 

เปด peristaltic pump โดยปรับอัตราการไหล ที่ 

60 มิลลิลิตรตอชั่วโมง 

11.2 การเตรียมโปรตีนมาตรฐาน 


ก3 การเตรียมสารละลายโปรตีนมาตรฐานชนิด Low Molecular Weight สําหรับ 


ชนิดของโปรตีน น้ําหนักโมเลกุล 

ความเขมขน (มิลลิกรัมตอมิลลิลิตร) 

Ribonuclease A 13,700 7 

Chymotrypsinogen A 25,000 10 

Ovalbumin 43,000 7 

Albumin 67,000 7 

Blue Dextran 2000 - 1 

บรรจุสารละลายโปรตีนมาตรฐานดังตาราง ในคอลัมน ชนิดละ 1 มิลลิลิตรโดยเรียง 

ลําดับดังนี้ 

Blue dextran 2000, Albumin, Chymotrypsinogen A, Ovalbumin และRibonuclease A 

ตามลําดับ ปรับอัตราการไหล 0.5 มิลลิลิตรตอนาที เก็บหลอดละ 3 มิลลิลิตร นําไปวัดคาการดูด 

กลืนแสง ที่ 

280 นาโนเมตร นําคาที่ไดมาเขียนกราฟระหวาง 

Log ของน้ําหนักโมเลกุลของโปรตีน 

มาตรฐาน (Log Mw) กับ คา Kav โดยคา Kav คํา นวณไดจากสูตร ดังนี้ 

83

Log Mw 

Kav = Ve – Vo 

Vt – Vo 

เมื่อ 

Vo = column void volume 

Ve = elution volume 

Vt = total bed volume 

4.90 

4.80 

4.70 

4.60 

4.50 

4.40 

4.30 

4.20 

4.10 

Y = (-0.834)X + 4.9007 

R 2 = 0.9519 

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 

Kav 


ก3 กราฟมาตรฐานของโปรตีนของ gel filtration chromatography แสดงคาระหวางคา 

Kav กับคา Log Mw 

84

12. การหาน้ําหนักโมเลกุลของโปรตีนดวยวิธี 

SDS – PAGE 

Gallagher and Smith (1991) ไดเสนอวิธีการทํา SDS – PAGE gel electrophoresis ไวดังนี้ 

12.1 30% Acrylamide/ 0.8% bisacrylamide 

Acrylamide 30.0 กรัม 

N’-N’-bis-methyline-acrylamide 0.8 กรัม 

ละลายสารทั้งสองชนิดในน้ํากลั่นแลวปรับใหไดปริมาตร 

100 มิลลิลิตร กรองดวย 

กระดาษกรอง 0.45ไมโครเมตร ใสขวดสีชาและเก็บไวในตูเย็น 

เก็บไดนาน 1 เดือน กอนใชควรไล 

อากาศออกกอน 

12.2 0.5 M Tris-HCl/SDS pH 6.8 (0.5M Tris-HCl containing 0.4% SDS) 

ละลาย Tris-base 6.05 กรัม ในน้ํากลั่นประมาณ 

40 มิลลิลิตร ใช 1 N HCl ปรับpH ให 

ไดประมาณ 6.8 แลวเติมน้ํากลั 

่นจนไดปริมาตร 100 มิลลิลิตร 

12.3 0.5 M Tris-HCl/SDS, pH8.8 

ละลาย Tris-base 91 กรัม ในน้ํากลั่นประมาณ 

300 มิลลิลิตร ใช 1 N HCl ปรับ pH ไห 

ไดประมาณ 8.8 แลวเติมน้ํากลั่นจนไดปริมาตร 

500 มิลลิลิตร กรองดวยกระดาษกรอง 0.45 

ไมโครเมตร 

12.4 10 % SDS 

ละลาย SDS 10 กรัม ในน้ํา 

100 มิลลิลิตร เก็บไวที่อุณหภูมิหอง 

85

ทุกครั้งที่ใช 

12.5 Catalyst 

12.5.1 10% แอมโมเนียมเพอรซัลเฟต (ammonium persulphate) 

ละลาย แอมโมเนียมเพอรซัลเฟต10 กรัม ในน้ํากลั่น 

100 มิลลิลิตร เตรียมใหม 

12.5.2 TEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl ethylenediamine) 

ใช TEMED โดยตรงโดยไมตองทําใหเจือจางกอน 

12.6 2xSDS/sample buffer 

4xTris-HCl/SDS, pH 6.8 1.2 มิลลิลิตร 

Glycerol 1.0 มิลลิลิตร 

10 % SDS 2.0 มิลลิลิตร 

0.5 % Bromophenol Blue 0.5 มิลลิลิตร 


4.8 มิลลิลิตร 

ผสมตัวอยางกับ sample buffer ในอัตราสวน 1 ตอ 4 แลวนําไปตมในน้ําเดือด 

4 นาที 

12.7 5xSDS/electrophoresis buffer 

Tris-base 3.03 กรัม 

Glycine 14.4 กรัม 

SDS 10.0 กรัม 

ละลายสารทั้งหมดในน้ํากลั่น 

1,000 มิลลิลิตร 

86

12.8 การเตรียมสารละลายสําหรับสียอม (staining solution) 

Coomassie brilliant blue R-250 10.0 กรัม 

Methanol 400.0 มิลลิลิตร 

Acetic acid 100.0 มิลลิลิตร 

ผสม Methanol และ Acetic acid เขาดวยกันแลวเติม Coomassie brilliant blue R-250 

ลงไปแลวเติมน้ํากลั่นจนมีปริมาตร 

1,000 มิลลิลิตร 

12.9 การเตรียมสารละลายสําหรับลางสี (Destain) 

Methanol 800 มิลลิลิตร 

Acetic acid 200 มิลลิลิตร 

ผสมสารทั้งหมดใหเขากันเติมน้ํากลั่นจนครบ 

2 ลิตร 

12.10 การหาน้ําหนักโมเลกุล 

น้ําหนักโมเลกุลของโปรตีนหาไดโดยการเปรียบเทียบการเคลื่อนที่ 

ของโปรตีนนั้นๆ 

กับการเคลื่อนที่ 

ของโปรตีนมาตรฐานที่ทราบน้ําหนักโมเลกุลที่ทําอิเลคโตรโฟริซีสไปพรอมๆกัน 

เมื่อเสร็จขั้นตอนในการทําอิเลคโตรโฟริซีสโดย 

Power supply กอนที่จะนํามายอมสี 

ใหทําเครื่องหมายตําแหนงของ 

tracking dye bromphenol blue ไว เมื่อยอมสีและกําจัดสีสวนเกิน 

ออกไปแลวใหวัดระยะทาง (migration distance) จากขอบของ separating gel ถึงสวนกลางของ 

โปรตีนแตละแถบ และวัดระยะทางของ tracking dye โดยวัดจากขอบของ separating gel ถึงสวน 

กลางของ tracking dye ที่ทําเครื่องหมายไว 

87

หาคา Rf (Relative mobilities) โดยการนําระยะทางของโปรตีนแตละตัวที่เคลื่อนที่ 

หารดวยระยะทางที่ 

tracking dye เคลื่อนที่ 

และเขียนกราฟระหวาง คา Rf กับ Log ของน้ําหนัก 

โมเลกุลของโปรตีนมาตรฐาน (LogMw) 

Rf = ระยะทางที่ตัวอยางเคลื่อนที่ 

ระยะทางที่ตัวทําละลายเคลื่อนที่ 


ก4 การเตรียม Separating gel และ Stacking gel สําหรับทํา SDS-PAGE 

Stock solutions Stacking gel (4%) Separating gel (12%) 

30% Acrylamide/Bis 0.33 ml 4 ml 

0.5 M Tris – HCl, pH 6.8 0.63 ml - 

1.5 M Tris – HCl, pH 8.8 - 0.25 ml 

10% SDS 25 µl 0.1 ml 

Distilled deionized water 1.5 ml 3.35 ml 

TEMED 2.5 µl 5 µl 

10%Ammonium persulfate 25 µl 50 µl 

Total volume 2.52 ml 7.70 ml 

88


ก5 สารละลายโปรตีนมาตรฐานโดยใช Protein Molecular Weight Marker สําหรับ 

การทํา SDS-PAGE 

ชนิดของโปรตีน น้ําหนักโมเลกุล 

(ดาลตัน) 

β - galactosidase, E. coli 116,000 

Bovine serum albumin, bovine plasma 66,000 

Ovalbumin, chicken egg white 45,000 

Lactate dehydrogenase, porcine muscle 35,000 

Restriction endonuclease Bsp981, E. coli 25,000 

β - lactoglobulin, bovine milk 18,400 

Lysozyme, chicken egg white 14,400 

Log Mw 

5.2 

5 

4.8 

4.6 

4.4 

4.2 

4 

0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 

Y = (- 0.9946)x + 5.0971 

R 2 = 0.9511 

R f 


ก4 กราฟมาตรฐานของโปรตีน ในการหาน้ําหนักโมเลกุลโดยวิธี 

SDS-PAGE แสดง 

คาระหวาง Rf กับ Log Mw 

89

13. Buffer 

1 ลิตร) 

13.1 0.1 M McIlvaine buffer 

สารละลาย A 0.1 M citric acid (21 กรัม ของ C6H8O7.H2O ตอน้ํา 

1 ลิตร) 

สารละลาย B 0.2 M disodium hydrogen phosphate (35.6 กรัม Na2HPO4.2H2O ตอน้ํา 

ผสมสารละลาย A ปริมาตร X มิลลิลิตร และสารละลาย B ปริมาตร 100-X มิลลิลิตร 

เพื่อใหได 

pH ตามตองการ 


ก6 การเตรียมสารละลาย McIlvaine buffer ที่ความเปนกรด-ดาง 

ตางๆ 

pH X pH X pH X pH X pH 

2.20 98.00 3.40 71.50 4.60 53.26 5.80 39.55 7.00 

2.40 93.80 3.60 67.80 4.80 50.70 6.00 36.85 7.20 

2.60 89.10 3.80 64.50 5.00 48.50 6.20 33.90 7.40 

2.80 84.15 4.00 61.45 5.20 46.40 6.40 30.75 7.60 

3.00 79.45 4.20 58.60 5.40 44.25 6.60 27.25 7.80 

3.20 75.30 4.40 55.90 5.60 42.00 6.80 22.75 8.00 


McIlvaine (1921) 

90

13.2 0.1 M Tris-HCl buffer 

สารละลาย A 0.1 N HCl 

สารละลาย B 0.1 M Tris (hydroxymethyl)aminomethane (Tris base) 

ผสมสารละลาย A ปริมาตร X มิลลิลิตร ลงในสารละลาย B 50 มิลลิลิตร แลวปรับ 

ปริมาตรใหได 100 มิลลิลิตร ดวยน้ํากลั่น 


ก7 การเตรียมสารละลาย Tris-HCl buffer ที่ความเปนกรด-ดาง 

ตางๆ 

pH X pH X pH X pH X 

7.1 45.7 7.7 36.6 8.3 19.9 8.9 7.0 

7.2 44.7 7.8 34.5 8.4 17.2 

7.3 43.4 7.9 32.0 8.5 14.7 

7.4 42.0 8.0 29.2 8.6 12.4 

7.5 40.3 8.1 26.2 8.7 10.3 

7.6 38.5 8.2 22.9 8.8 8.5 


Stoll and Blanchard (1990) 

91

13.3 0.2 M Glycine - NaOH buffer 

สารละลาย A 0.2 M Solution of glycine (15.01 กรัม ใน 1000 มิลลิลิตร) 

สารละลาย B 0.2 M NaOH 

ผสมสารละลาย A ปริมาตร 50 มิลลิลิตร กับสารละลาย B ปริมาตร X มิลลิลิตร ปรับ 

ปริมาตรดวยน้ํากลั่นใหได 



ก8 การเตรียมสารละลาย Glycine- NaOH buffer ที่ความเปนกรด-ดาง 

ตางๆ 

pH X pH X 

8.6 4.0 9.6 22.4 

8.8 6.0 9.8 27.2 

9.0 8.8 10.0 32.0 

9.2 12.0 10.2 38.6 

9.4 16.8 10.4 45.5 


Stoll and Blanchard (1990) 

92


ก9 ปริมาณแอมโมเนียมซัลเฟต ที่ใชในการตกตะกอนโปรตีน 

Initial concentration of ammonium sulfate 

(percentage saturation at o°) 

Final concentration of Ammonium Sulfate : Percentage Saturation at 0 ° 

Percentage saturation at o° 

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 

Solid ammonium sulfate (grams) to be added to 1 liter of solution 

0 106 134 164 194 226 258 291 326 361 398 436 476 516 559 603 650 697 

5 79 108 137 166 197 229 262 296 331 368 405 444 484 526 570 615 662 

10 53 81 109 139 169 200 233 266 301 337 374 412 452 493 536 581 627 

15 26 54 82 111 141 172 204 237 271 306 343 381 420 460 503 547 592 

20 0 27 55 83 113 143 175 207 241 276 312 349 387 427 469 512 557 

25 0 27 56 84 115 146 179 211 245 280 317 355 395 436 478 522 

30 0 28 56 86 117 148 181 214 249 285 323 362 402 445 488 

35 0 28 57 87 118 151 184 218 254 291 329 369 410 453 

40 0 29 58 89 120 153 187 222 258 296 335 376 418 

45 0 29 59 90 123 156 190 226 263 302 342 383 

50 0 30 60 92 125 159 194 230 268 308 348 

55 0 30 61 93 127 161 197 235 273 313 

60 0 31 62 95 129 164 201 239 279 

65 0 31 63 97 132 168 205 244 

70 0 32 65 99 134 171 209 

75 0 32 66 101 137 174 

80 0 33 67 103 139 

85 0 34 68 105 

90 0 34 70 

95 0 35 

100 0 

ทีมา : Deutscher (1990) 

93

ภาคผนวก ข 

94


ข1 ขนาดเสนผานศูนยกลางโซนใส ขนาดเสนผานศูนยกลางโซนโคโลนี และอัตราสวนระหวางกลางขนาดเสนผานศูนยกลางโซนใสกับ 

ขนาดเสนผานศูนยกลางโซนใสโคโลนี 

รหัส 

1 2 3 4 

4 

DZ1 DC2 DZ/DC3 DZ DC DZ/DC DZ DC DZ/DC DZ DC DZ/DC 

FH1.1 0.60 0.20 3.00 0.50 0.15 3.33 0.50 0.20 2.50 0.50 0.15 3.33 

FH1.2 0.75 0.15 5.00 0.85 0.15 5.67 0.70 0.15 4.67 0.70 0.15 4.67 

FH1.3 0.65 0.20 3.25 0.60 0.15 4.00 0.60 0.10 6.00 0.60 0.10 6.00 

FH1.4 0.50 0.10 5.00 0.50 0.10 5.00 0.50 0.10 5.00 0.50 0.10 5.00 

FH1.5 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 

FH1.7 0.55 0.15 3.67 0.40 0.10 4.00 0.40 0.10 4.00 0.35 0.10 3.50 

FH1.8 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 

FH1.10 0.70 0.20 3.50 0.70 0.20 3.50 0.80 0.20 4.00 0.70 0.20 3.50 

FH1.13 0.65 0.15 4.33 0.65 0.15 4.33 0.65 0.15 4.33 0.65 0.15 4.33 

1 DZ=Diameter of Clear Zone 

2 DC=Diameter of Colony 

3 

DZ/DC=Diameter of Clear Zone/ Diameter of Colony 

4 FH=ปลาวัว, PE=หอยแมลงภู, 

SH=กุงกุลาดํา, 

PR=กุงแชบวย, 

CR=ปูมา, SQ=หมึกสาย 

95


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


FH1.15 0.90 0.20 4.50 0.90 0.20 4.50 0.90 0.20 4.50 0.90 0.20 4.50 

FH1.16 0.90 0.15 6.00 0.85 0.15 5.67 0.85 0.15 5.67 0.90 0.15 6.00 

FH1.17 1.60 0.15 10.67 1.55 0.20 7.75 1.55 0.20 7.75 1.55 0.20 7.75 

FH1.18 0.50 0.10 5.00 0.60 0.10 6.00 0.60 0.10 6.00 0.55 0.10 5.50 

PE1.1 0.60 0.20 3.00 0.65 0.15 4.33 0.75 0.20 3.75 0.60 0.20 3.00 

PE1.2 0.85 0.15 5.67 0.70 0.15 4.67 0.70 0.20 3.50 0.70 0.15 4.67 

PE1.3 0.45 0.25 1.80 0.50 0.25 2.00 0.45 0.30 1.50 0.50 0.30 1.67 

PE1.4 0.25 0.15 1.67 0.30 0.15 2.00 0.30 0.10 3.00 0.30 0.15 2.00 

PE1.5 0.70 0.20 3.50 0.60 0.20 3.00 0.70 0.20 3.50 0.70 0.20 3.50 

1 

DZ=Diameter of Clear Zone 


3 


4 

FH=ปลาวัว, PE=หอยแมลงภู, 




96


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


PE1.6 0.60 0.10 6.00 0.50 0.10 5.00 0.70 0.10 7.00 0.65 0.15 4.33 

PE1.7 0.60 0.15 4.00 0.60 0.15 4.00 0.55 0.15 3.67 0.65 0.15 4.30 

PE1.8 0.70 0.10 7.00 0.65 0.15 4.33 0.60 0.10 6.00 0.70 0.20 3.50 

PE1.10 0.35 0.20 1.75 0.35 0.20 1.75 0.30 0.20 1.50 0.35 0.20 1.75 

PE1.11 0.50 0.20 2.50 0.45 0.20 2.25 0.50 0.20 2.50 0.40 0.20 2.00 

SH1.1 0.40 0.10 4.00 0.45 0.10 4.50 0.45 0.15 3.00 0.45 0.10 4.50 

SH1.2 0.50 0.15 3.33 0.50 0.15 3.33 0.60 0.15 4.00 0.60 0.20 3.00 

SH1.3 0.50 0.20 2.50 0.65 0.20 3.25 0.65 0.15 4.33 0.60 0.20 3.00 

SH1.4 0.50 0.10 5.00 0.60 0.15 4.00 0.60 0.15 4.00 0.70 0.10 7.00 

1 



3 


4 





97


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


SH1.5 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 

SH1.6 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 

SH1.7 0.50 0.20 2.50 0.50 0.20 2.50 0.60 0.20 3.00 0.50 0.20 2.50 

SH1.8 1.10 0.15 7.33 1.10 0.15 7.33 1.20 0.15 8.00 1.20 0.15 8.00 

SH1.9 1.20 0.20 6.00 1.25 0.20 6.25 1.40 0.20 7.00 1.20 0.20 6.00 

SH1.10 0.85 0.20 4.25 0.95 0.20 4.75 0.85 0.20 4.25 0.85 0.20 4.25 

SH1.11 0.70 0.15 4.67 0.80 0.15 5.33 0.85 0.15 5.33 0.80 0.15 5.33 

SH1.13 1.50 0.15 10.00 1.45 0.15 9.67 1.40 0.15 9.33 1.30 0.15 8.67 

SH1.14 0.85 0.15 6.67 0.85 0.15 6.67 0.85 0.15 6.67 0.85 0.15 6.67 

1 



3 


4 





98


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


SH1.15 0.55 0.20 2.75 0.60 0.20 3.00 0.55 0.20 2.75 0.50 0.20 2.50 

SH1.16 0.75 0.20 3.75 0.60 0.20 3.00 0.60 0.20 3.00 0.60 0.20 3.00 

SH1.17 0.85 0.20 4.25 0.80 0.20 4.00 0.90 0.20 4.50 0.85 0.20 4.25 

SH1.18 0.70 0.20 3.50 0.70 0.20 3.50 0.90 0.20 4.50 0.95 0.20 4.75 

SH1.19 0.70 0.60 1.17 0.35 0.30 1.17 0.70 0.60 1.17 0.70 0.60 1.17 

SH1.20 0.50 0.15 3.33 0.60 0.15 4.00 0.55 0.15 3.67 0.55 0.15 3.67 

SH1.22 0.50 0.10 5.00 0.50 0.10 5.00 0.45 0.10 4.50 0.45 0.10 4.50 

PR1.2 0.70 0.20 3.50 0.70 0.20 3.50 0.65 0.20 3.25 0.70 0.20 3.50 

PR1.5 0.85 0.20 4.25 0.75 0.20 3.75 0.85 0.20 4.25 0.70 0.20 3.50 

1 



3 


4 





99


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


PR1.6 0.60 0.20 3.00 0.60 0.20 3.00 0.55 0.10 5.50 0.65 0.15 4.33 

PR1.7 0.70 0.15 4.67 0.70 0.15 4.67 0.70 0.15 4.67 0.70 0.15 4.67 

PR1.9 0.50 0.20 25.00 0.50 0.20 2.50 0.50 0.20 2.50 0.50 0.20 2.50 

PR1.10 0.90 0.20 4.50 0.80 0.15 5.33 0.80 0.15 5.33 0.85 0.15 5.33 

PR1.11 0.50 0.15 3.33 0.50 0.15 3.33 0.50 0.15 3.33 0.50 0.15 3.33 

PR1.12 1.00 0.20 5.00 1.00 0.20 5.00 1.05 0.20 5.25 1.05 0.20 5.25 

PR1.13 1.30 0.20 6.50 1.30 0.20 6.50 1.40 0.20 7.00 1.30 0.20 6.50 

PR1.14 1.40 0.25 5.60 1.40 0.25 5.60 1.50 0.25 6.00 1.50 0.25 5.80 

PR1.15 1.65 0.20 8.25 1.65 0.15 11.00 1.60 0.15 10.67 1.50 0.15 10.00 

1 



3 


4 





100


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


PR1.16 1.60 0.20 8.00 1.55 0.20 7.75 1.60 0.20 8.00 1.60 0.20 8.00 

PR1.17 1.60 0.20 8.00 1.70 0.20 8.50 1.60 0.20 8.00 1.70 0.20 8.50 

PR1.18 1.40 0.20 7.00 1.40 0.20 7.00 1.40 0.20 7.00 1.50 0.20 7.50 

PR1.19 1.35 0.15 9.00 1.35 0.15 9.00 1.35 0.15 9.00 1.35 0.15 9.00 

PR1.20 1.00 0.15 6.67 0.90 0.15 6.00 0.90 0.15 6.00 0.90 0.15 6.00 

PR1.21 1.40 0.20 7.00 1.40 0.20 7.00 1.40 0.20 7.00 1.40 0.20 7.00 

PR1.22 0.50 0.20 2.50 0.50 0.20 2.50 0.70 0.20 3.50 0.70 0.25 2.80 

PR1.23 1.50 0.20 7.50 1.45 0.20 7.25 1.50 0.20 7.50 1.50 0.20 7.50 

CR1.3 0.55 0.20 2.75 0.70 0.20 3.50 0.55 0.20 2.75 0.70 0.20 3.50 

1 



3 


4 





101


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


CR1.4 0.60 0.20 3.00 0.70 0.20 3.50 0.70 0.20 3.50 0.70 0.20 3.50 

CR1.5 0.55 0.20 2.75 0.50 0.20 2.50 0.40 0.15 2.67 0.00 0.00 0.00 

CR1.7 0.65 0.20 3.25 0.70 0.20 3.50 0.75 0.20 3.75 0.65 0.20 3.25 

CR1.8 1.55 0.20 7.75 1.60 0.20 8.00 1.60 0.20 8.00 1.60 0.20 8.00 

CR1.9 0.90 0.20 3.60 0.90 0.20 3.60 0.90 0.20 4.50 0.90 0.20 4.50 

CR1.10 1.60 0.20 8.00 1.60 0.20 8.00 1.60 0.20 8.00 1.55 0.20 7.75 

CR1.11 1.00 0.15 6.67 1.00 0.15 6.67 1.00 0.15 6.67 1.00 0.15 6.67 

CR2.1 1.60 0.15 10.67 1.60 0.15 10.67 1.60 0.15 10.67 0.00 0.00 0.00 

CR2.2 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 

1 



3 

DZ/DCDiameter of Clear Zone/ Diameter of Colony 

4 





102


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


CR2.3 0.55 0.15 3.67 0.60 0.15 4.00 0.60 0.15 4.00 0.55 0.15 3.67 

CR2.4 0.80 0.20 4.00 0.75 0.20 3.75 0.90 0.20 4.50 0.80 0.20 4.00 

CR2.5 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 

CR2.6 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 

CR2.7 0.90 0.20 4.50 0.80 0.20 4.00 0.85 0.20 4.25 0.70 0.20 3.50 

CR2.8 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 0.00 0.20 0.00 

CR2.9 0.50 0.15 3.33 0.45 0.10 4.50 0.25 0.05 5.00 0.30 0.10 3.00 

SQ1.1 0.60 0.15 4.00 0.60 0.10 6.00 0.60 0.10 6.00 0.70 0.15 4.67 

SQ1.3 0.70 0.20 3.50 0.65 0.20 3.25 0.50 0.10 5.00 0.65 0.15 4.33 

1 



3 


4 





103


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


SQ1.4 0.65 0.20 3.25 0.50 0.20 2.50 0.45 0.15 3.00 0.50 0.10 5.00 

SQ1.5 0.90 0.20 4.50 0.70 0.15 4.67 0.70 0.15 4.67 0.85 0.25 3.40 

SQ1.7 0.75 0.55 1.36 0.70 0.65 1.08 0.90 0.70 1.29 0.80 0.60 1.33 

SQ1.8 1.70 0.20 8.50 1.80 0.15 9.00 1.75 0.20 8.75 1.85 0.25 7.40 

SQ1.9 1.60 0.25 6.40 1.55 0.20 7.75 1.60 0.20 8.00 1.60 0.20 8.00 

SQ1.10 1.00 0.15 6.67 1.10 0.15 7.33 1.10 0.10 11.00 1.15 0.20 5.75 

SQ1.11 1.00 0.15 6.70 0.90 0.15 6.00 1.00 0.15 6.67 1.00 0.20 5.00 

SQ1.12 1.55 0.20 7.75 1.55 0.20 7.75 1.65 0.20 8.25 1.65 0.20 8.25 

SQ2.1 1.55 0.15 7.67 1.10 0.20 5.50 1.10 0.20 5.50 1.10 0.20 5.50 

1 



3 


4 





104


ข1 (ตอ) 

รหัส 

1 2 3 4 

4 


SQ2.2 1.60 0.15 10.67 1.65 0.20 8.25 1.60 0.20 8.00 1.60 0.20 8.00 

SQ2.3 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 0.00 0.10 0.00 

SQ2.4 0.50 0.15 3.33 0.50 0.10 5.00 0.50 0.10 5.00 0.55 0.15 3.67 

SQ2.5 0.70 0.15 4.67 0.80 0.15 5.33 0.70 0.15 4.67 0.65 0.15 4.33 

SQ2.6 0.45 0.40 1.13 0.40 0.25 1.60 0.40 0.25 1.60 0.40 0.15 2.67 

SQ2.7 0.35 0.30 1.17 0.40 0.30 1.33 0.35 0.20 1.75 0.30 0.25 1.20 

SQ2.8 0.70 0.15 4.67 0.80 0.20 4.00 0.70 0.15 4.67 0.80 0.20 4.00 

SQ2.9 1.45 0.20 7.25 1.40 0.15 9.33 1.50 0.15 10.00 1.55 0.20 7.75 

SQ2.10 1.60 0.20 8.00 1.60 0.20 8.00 1.65 0.20 8.25 1.65 0.27 8.25 

1 



3 


4 




CR=ปูมา, SQ=หมึก 

105


ข2 การเคลื่อนที่สัมพัทธ 

ของโปรตีนจากสารสกัดเอนไซมไคติเนสที่ผลิตไดจาก 

เชื้อแบคทีเรีย 

Bacillus circulans SH1.13 และน้ําหนักโมเลกุล 

ของโปรตีนที่ 

ปรากฏบนแผน gel acrylamide 

แถบ R f Log Mw Mw (ดาลตัน) 

a 0.07 5.03 107,152 

b 0.15 4.95 89,125 

c 0.31 4.79 61,660 

d 0.48 4.62 41,687 

e 0.72 4.38 23,988 

f 0.87 4.24 17,378 

106

ประวัติการศึกษา และการทํางาน 

่ 

ชื่อ 

นายอรรถวุฒิ กันทะวงศ 

เกิดวันที 

9 เดือนสิงหาคม พ.ศ. 2520 

สถานที่เกิด 

อําเภอสวรรคโลก จังหวัดสุโขทัย 

ประวัติการศึกษา วท.บ. (วิทยาศาสตรทางทะเล) มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร 

ตําแหนงปจจุบัน - 

สถานที่ทํางานปจจุบัน 

- 

ผลงานดีเดน - 

ทุนการศึกษาที่ไดรับ 

ศูนยเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร 

วิทยาเขตกําแพงแสน นครปฐม 

107

cache

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?