hyplex SuperBug ID

Gebrauchsinformation / Instructions for use 

hyplex ® SuperBug ID 

Multiplex-PCR zum Nachweis Carbapenemasen produzierender 

Bakterien 

Multiplex-PCR for the detection of carbapenemases producing 

bacteria 

in vitro Diagnosticum 

 

hyplex ® SuperBug ID PCR-Modul REF: 3900 

hyplex ® SuperBug ID Hybridisierungs-Module REF: 3901 - 3905 

gültig ab / valid from: Oktober 2010 / October 2010

Inhaltsverzeichnis 

Seite 


1. Einleitung 4 

2. Carbapenemasen 4 

3. Aufbau des hyplex ® SuperBug ID - Testsystems 7 

4. Testprinzip 7 

5. Reagenzien 8 

5.3 Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör 9 

6. Warn- und Entsorgungshinweise 9 

7. Hinweise zur Handhabung 9 

8. Probenmaterial 10 

9. Testdurchführung 11 

10. Kurzanleitung der Testdurchführung 14 

11. Auswertung 14 

12. Hinweise zur Interpretation der Testergebnisse 15 

13. Kontrollergebnisse des hyplex ® SuperBug ID-Testsystems 16 

14. Troubleshooting 16 

15. Leistungsdaten 17 

16. Literatur / References 36 

2

Erläuterungen der Symbole auf den Etiketten / Explanation of symbols used in labeling 

Deutsch 

Englisch 

IVD In vitro Diagnostikum For in vitro diagnostic use 

LOT Lot-Nummer Batch code 

REF Bestell-Nummer Catalogue number 

Verwendbar bis 

Lagertemperatur 

Use by 

Temperature limitation 

PRIMER PCR-Primer-Mix PCR primer mixture 

dNTP Nukleotid-Mix Nucleotide mixture 

CONTROL│+ PCR-Positivkontrolle PCR positive control 

CONTROL│- PCR-Negativkontrolle PCR negative control 

MTS│BR│XX 1 Mikrotiterstreifen, abbrechbar Micro well strip, breakable 

MTS│BR│CONTROL│+ 

MTS│BR│BLANK 

Positivkontroll-Mikrotiterstreifen, 

abbrechbar 

Reagenzienkontroll-Mikrotiterstreifen, 

abbrechbar 

Positive control microwell strip, 

breakable 

Reagent control microwell strip, 

breakable 

HYBBUF Hybridisierungspuffer Hybridization buffer 

STRGWASH Stringente Waschlösung Stringent washing solution 

WASHBUF│20 X Waschpuffer, 20x konzentriert Washing buffer, 20x concentrated 

CONJ│100 X Konjugat, 100x konzentriert Conjugate, 100x concentrated 

SUBS│TMB TMB-Substrat TMB substrate 

STOP│H 3 PO 4 │25% Stopplösung Stop solution 

CONT Inhalt, enthält Contains 

H 314 / 290 

P 280 

P 301+330+331 

P 305+351+338 

P 309+311 

Gebrauchsinformation beachten 

Gefährlich 

Consult instructions for use 

Hazardous 

1 Definition der Parameter siehe Tabelle S. 6 / definition of parameters see table p. 20 

Hinweis auf besondere Gefahren und Sicherheitsratschläge (H- und P-Sätze) 

Nature of special risk and safety precautions (H- and P-codes) 

H290: Kann gegenüber Metallen korrosiv sein. / May be corrosive to metals. 

H314: Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. / Causes severe skin 

burns and eye damage. 

P280: Schutzhandschuhe/ Schutzkleidung/ Augenschutz/ Gesichtsschutz tragen. / Wear protective 

gloves/protective clothing/eye protection/face protection. 

P301 + P330 + P331: BEI VERSCHLUCKEN: Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen. / IF 

SWALLOWED: rinse mouth. Do NOT induce vomiting. 

P305 + P351 + P338: BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. 

Vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen, weiter spülen.) / IF IN EYES: Rinse cautiously with 

water for several minutes. Remove contact lenses, if present and easy to do. Continue rinsing 

P309 + P311: Bei Exposition oder Unwohlsein: Giftinformationszentrum oder Arzt anrufen. / IF exposed 

or if you feel unwell: Call a POISON CENTER or doctor/physician. 

3

Gebrauchsinformation 


Multiplex-PCR zum Nachweis Carbapenemasen produzierender Bakterien 

in vitro Diagnostikum 

1. Einleitung 

Das hyplex ® SuperBug ID Testsystem ist ein qualitatives in vitro Diagnostikum zum 

Nachweis von Bakterien, die genetisch in der Lage sind, bestimmte Carbapenemasen 

zu produzieren. 

hyplex ® SuperBug ID erfasst sämtliche bekannten Varianten der MBL vom Typ VIM, 

IMP und NDM sowie alle beschriebenen KPC-Varianten und das OXA-48 Gen. 

Mit dem hyplex ® SuperBug ID PCR-Modul (Bestell-Nr. 3900) werden Amplifikate 

gebildet, die mit den hyplex ® SuperBug ID Hybridisierungsmodulen (Bestell-Nr. 

3901 bis 3905) per reverser Hybridisierung mit spezifischen Oligonukleotidsonden 

visualisiert werden können. 

2. Carbapenemasen 

Hintergrund: 

Der Anstieg von Antibiotika-Resistenzen bei gram-negativen Bakterien ist ein 

bemerkenswertes Beispiel, wie Bakterien neue genetische Informationen, die zur 

Resistenz gegenüber einem oder mehrerer Antibiotika führen, erhalten, nutzen und 

auch weitergeben können. Die festgestellten Resistenzraten variieren. Insgesamt 

gesehen scheint es aber, dass sich Resistenzen gegen Quinolone und Breitspektrum-ß- 

Laktame in der Familie der Enterobacteriaceae und bei Acinetobacter spp. durchsetzen 

und stark verbreiten. Zudem sind die Optionen für die Therapie von Pseudomonas 

aeruginosa Infektionen zunehmend limitiert. 

Obwohl die Einführung der Carbapeneme in den 80er Jahren eine neue, dauerhafte 

Behandlungsoption für schwere bakterielle Infektionen versprach, kann heute eine 

zunehmende Carbapenemresistenz bei Enterobacteriaceae und Acinetobacter spp. 

beobachtet werden. Bei P. aeruginosa ist sie quasi schon alltäglich. 

Gewöhnlich ist eine Carbapenemresistenz durch verringerte Antibiotikaaufnahme durch 

das Bakterium (z.B. durch Mutationen in „outer membran proteins“ (OMP) oder dem 

Vorhandensein von Efflux-Pumpen), der Hyperproduktion von AmpC-Typ ß- 

Laktamasen, und / oder Carbapenem-hydrolysierenden ß-Laktamasen bedingt. 

4

Zwei Arten von Carbapenem-hydrolysierenden Enzymen sind beschrieben: 

Serinenzyme, die ein Serin-Motiv in ihrem aktiven Zentrum besitzen und Metallo-ß- 

Laktamasen (MBLs), die für ihre Aktivität divalente Kationen, normalerweise Zink, als 

Co-Faktoren benötigen. 

Die Serincarbapenemasen gehören ausnahmslos zu Ambler-Schema Klasse A oder 

Klasse D Enzymen und vermitteln Carbapenemresistenz bei Enterobacteriaceae und 

Acinetobacter spp.. Trotz der hohen Affinität dieser Enzyme zu Carbapenemen 

vermitteln sie nicht immer eine „high-level“ Resistenz bzw. werden auch nicht alle durch 

Clavulansäure inhibiert. 

MBL´s können, wie alle ß-Laktamasen, in chromosomal kodierte und solche, die auf 

übertragbaren genetischen Elementen (wie z.B. Transposons) lokalisiert sind, unterteilt 

werden. In den letzten 5 Jahren wurde eine Vielzahl von neuen, übertragbaren MBL´s 

beschrieben, die sich anscheinend sehr schnell verbreiten. In einigen Ländern machen 

MBL-produzierende P. aeruginosa bis zu rund 20 % aller nosokomialen Isolate aus, 

während in anderen Ländern die Anzahl noch vergleichsweise gering ist. In den letzten 

Jahren sind zudem die MBL-Gene von P. aeruginosa auf verschiedene 

Enterobacteriaceae übertragen worden. Ein klinisches Szenario, vergleichbar mit der 

weltweiten Verbreitung von ESBL (extended-spectrum ß-lactamases) scheint sich 

abzuzeichnen. Da MBL´s praktisch alle Klassen von ß-Laktamen hydrolisieren können 

und ein wirksamer therapeutisch einsetzbarer Inhibitor derzeit, und wahrscheinlich auf 

Jahre hinaus, nicht zur Verfügung steht, wäre die weitere und kontinuierliche 

Ausbreitung von MBL´s eine klinische Katastrophe. 

Metallo-ß-Lactamasen (MBL) : 

Alle MBL´s hydrolisieren prinzipiell Imipenem. Ihre Fähigkeit dazu variiert beträchtlich, 

so dass die Hydrolysierungsrate mit der Antibiotikaresistenz des Bakteriums nicht 

immer korreliert. Bei allen Enzymen findet man die gemeinsame Eigenschaft, dass sie 

durch EDTA oder andere chelatbildende Stoffe inhibiert werden; ein wesentliches 

Merkmal aller MBL´s, das mit ihrem Wirkmechanismus zusammenhängt. 

“Acquired” MBLs (also solche, die ein Bakterium durch Transfer von genetischem 

Material (z.B. Plasmid) „erhalten“ hat) sind immer wichtiger werdende 

resistenzbestimmende Faktoren bei Pseudomonas aeruginosa und anderen gramnegativen 

pathogenen Bakterien. Diese Enzyme können praktisch alle ß-Laktame 

inklusive Carbapeneme hydrolisieren. Sie können dem Trägerbakterium somit eine 

Breitspektrum-ß-Laktam-Resistenz verleihen, die nicht mehr durch herkömmliche ß- 

Laktamasen-Inhibitoren zu beeinträchtigen ist. MBL´s sind für gewöhnlich durch Gene 

kodiert, die auf mobilen genetischen Elementen (sog. „integron-borne gene cassettes”) 

lokalisiert sind. Diese können durch horizontalen Transfer an andere Stämme und sogar 

andere Spezies weitergegeben und damit verbreitet werden. Ursprünglich wurden die 

“Acquired” MBLs als selten und auf bestimmte Regionen begrenzt angesehen. Dies 

änderte sich dramatisch. Mindestens vier verschiedene Typen von “Acquired” MBLs 

sind nun bekannt (IMP, VIM, GIM, SPM), wobei VIM und IMP die größte Verbreitung 

zeigen. 

MBL´s des VIM-Types wurden erstmals in Europa entdeckt, wo sie anscheinend im 

Vergleich zu IMP-Typen vorherrschen. Inzwischen wurden sie aber auch in Asien und 

Amerika beschrieben. Sie sind eigentlich in nicht-fermentierenden gram-negativen 

5

Bakterien zu finden, aber in den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass die VIM- 

Typ MBL´s immer häufiger in Vertretern der Familie Enterobacteriaceae zu finden sind. 

Dies lässt auf eine weitere Verbreitung dieser Resistenzfaktoren unter Bakterien mit 

einem höheren Infektionspotential schließen. Tatsächlich mehren sich die Fälle von 

nosokomialen Ausbrüchen mit solchen Keimen. 

MBL´s des IMP-Types wurden in den frühen 90er Jahren erstmals in Japan isoliert. In 

dieser Region scheinen diese Enzyme der am häufigsten zu findende Typ der 

“Acquired” MBLs zu sein, der auch für eine Vielzahl von nosokomialen Ausbrüchen 

verantwortlich war. In Europa spielen diese Enzyme im Vergleich zum VIM-Typ eine 

eher untergeordnete Rolle, obwohl bereits seit den späten 90er Jahren einige IMP- 

Varianten gefunden wurden. 

Zuletzt wurde im Jahr 2008 eine neue Metallo-Beta-Lactamase in K. pneumoniae bei 

einem schwedischen Patienten nach seiner Rückkehr aus Neu-Delhi beschrieben. 

Diese sogenannte New-Delhi Metallo-Beta-Lactamase (NDM-1) ist offenbar 

endemisch in Indien und kommt, wie KPC und OXA-48, überwiegend in bestimmten K. 

pneumoniae- Stämmen vor. Dass auch das bla NDM-1 -Gen auf Plasmiden lokalisiert und 

übertragen wird, zeigen die Berichte über NDM-1 in Enterobacter cloacae und E. coli 

aus den USA. Neueste Untersuchungen in Indien, Pakistan und Großbritannien 

bewiesen sowohl die klonale Verbreitung NDM-1-positiver K.-pneumoniae-Stämme in 

den Endemiegebieten als auch das Vorkommen ganz verschiedener bla NDM-1 -tragender 

Plasmide in K. pneumoniae, E. coli, Morganella morganii, Providencia spp. und 

Citrobacter freundii. 

Klebsiella pneumoniae Carbapenemase (KPC): 

Das erste Auftreten einer KPC-ß-Laktamase, welche fähig ist Carbapeneme, Penicilline, 

Cephalosporine und Aztreonam zu hydrolisieren, wurde bei einem in USA isolierten 

carbapenemresistenen K. pneumoniae – Stamm beschrieben. 

Später wurden KPC – Produzenten auch in anderen Teilen der Welt nachgewiesen. Es 

gibt aktuell neun verschiedene Varianten, wobei KPC-2 und KPC-3 am häufigsten 

vorkommen. Kürzlich wurden KPC-2/-3 – Produzenten auch in europäischen Ländern 

wie Griechenland, UK, Frankreich und Deutschland nachgewiesen. Die Verbreitung von 

KPC – Produzenten wird unterschätzt, weil der Nachweis von KPC und auch MBL - 

produzierenden K. pneumoniae phänotypisch häufig nicht erfolgreich ist, da die 

Carbapenemresistenz nicht immer ausgebildet wird. 

OXA-48 Carbapenemase: 

OXA-48-Carbapenemasen wurden im Jahr 2004 erstmals in K.-pneumoniae-Isolaten 

aus der Türkei beschrieben. Seitdem wurde diese Carbapenemase auch in 

Enterobacteriaceae aus Belgien, Israel, Indien, Großbritannien, Argentinien, Ägypten 

und dem Libanon detektiert. In Deutschland wurden 2008 erstmals OXA-48 positive 

Klebsiella pneumoniae in Südwestdeutschland isoliert. Wie bei KPC-produzierenden 

Bakterien ist es in der Regel schwierig, diese Resistenz phänotypisch zu detektieren. 

6

3. Aufbau des hyplex ® SuperBug ID - Testsystems 

hyplex ® SuperBug ID PCR-Modul (Best. Nr. 3900): 

Herstellung spezifischer PCR-Amplifikate aus Probenmaterial, ausreichend für maximal 

zehn Hybridisierungen pro PCR-Reaktion. 

Verwendbare Hybridisierungsmodule: Best.-Nr. 3901 bis 3905 

hyplex ® SuperBug ID Hybridisierungs-Module (Best. Nr. 3901 bis 3905): 

Einzelkavitäten mit immobilisierten Oligonukleotidsonden zum spezifischen Nachweis 

der fünf relevanten Gene (VE 96 Stück pro Sonde) und Reagenzien zur Durchführung 

von 96 reversen Hybridisierungen 

Probenmaterial: PCR-Amplifikate, die mittels des hyplex ® SuperBug ID PCR-Moduls 

gebildet wurden. 

In der folgenden Tabelle sind die für das hyplex ® SuperBug ID Testsystem separat 

erhältlichen spezifischen Sonden (Hybridisierungsmodule) aufgeführt. 

Hybridisierungsmodule für das hyplex ® SuperBug ID Testsystem 

Symbole Spezifität Kavitätenfarbe Best. Nr. : 

MTS│BR│VIM VIM (alle Varianten VIM-1 bis VIM-13) grün 3901 

MTS│BR│IMP IMP (alle Varianten IMP-1 bis IMP-22) weiß 3902 

MTS│BR│KPC KPC (alle Varianten KPC-1 bis KPC-10) schwarz 3903 

MTS│BR│O48 OXA-48 gelb 3904 

MTS│BR│NDM NDM-1 burgundy 3905 

Mit einem PCR-Amplifikat können 10 Hybridisierungen durchgeführt werden. Damit 

kann eine Probe auf alle 5 Parameter getestet und die verschiedenen Sonden je nach 

Fragestellung ausgewählt werden. 

4. Testprinzip 

hyplex ® SuperBug ID PCR-Module enthalten markierte Oligonukleotidprimer, die die 

simultane, spezifische Amplifikation verschiedener DNS-Bereiche in einer einzigen 

PCR-Reaktion ermöglichen. 

In Anwesenheit von relevanter DNS werden spezifische Amplifikate (aller Varianten) der 

Gene VIM, IMP, NDM-1, OXA-48 und KPC gebildet, die folgend mit den hyplex ® 

SuperBug ID Hybridisierungsmodulen visualisiert werden. 

Dazu werden die Amplifikate aus einer PCR mit dem hyplex ® SuperBug ID PCR- 

Modul hitzedenaturiert und zu einzelsträngigen, spezifischen Sonden gegeben, die an 

der Polystyrol-oberfläche von Mikrotiterplatten immobilisiert sind. Unter Verwendung 

eines Hybridisierungspuffers findet eine Hybridisierung komplementärer Sequenzen 

statt, die nachfolgend mittels ELISA-Prinzip detektiert werden kann. Dazu wird nach 

mehreren stringenten Waschschritten ein Peroxidase(POD)-Konjugat zugegeben. 

Dieses bindet hochspezifisch an die Markierung des an die Oligonukleotidsonde 

gebundenen Einzelstrangs des PCR-Produkts. Nach neuerlichen Waschschritten wird 

TMB-Substratlösung zugesetzt, die nach Umsetzung durch die POD eine blaue Farbe 

erzeugt. Diese Reaktion wird mit Hilfe einer Stopplösung beendet. Dabei ist ein 

7

Farbumschlag nach Gelb zu beobachten. Die Extink-tion der verschiedenen Kavitäten 

wird nun in einem Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. 

Positive Signale zeigen die spezifische Amplifikation bestimmter DNS-Bereiche 

während der hyplex ® SuperBug ID PCR an und damit das Vorhandensein der 

entsprechenden Gene in der zu untersuchenden Probe. 

5. Reagenzien 

5.1 Packungsinhalt der PCR-Module: 

Die Reagenzien einer Packung reichen für 96 Bestimmungen. 

Jeder Reagenziensatz enthält: 

PRIMER 

dNTP 

CONTROL│+ 

CONTROL│- 


Primer-Mix 

(Grüne Verschlusskappe, gebrauchsfertig) 

240 µl 

Enthält markierte Oligonukleotidprimer 

Nukleotid-Mix 

(Gelbe Verschlusskappe, gebrauchsfertig) 

120 µl 

enthält dATP, dCTP, dGTP, dTTP 

Positivkontrolle 

(Rote Verschlusskappe, gebrauchsfertig) 125 µl 

Negativkontrolle 

(Blaue Verschlusskappe, gebrauchsfertig) 100 µl 

Positivkontrollsonden, abbrechbar 

(Farbkodierung: blau) 

16 Kavitäten 

5.2 Packungsinhalt der Hybridisierungs-Module: 

Die Reagenzien einer Packung reichen für 96 Bestimmungen. 

Jeder Reagenziensatz enthält: 

MTS│BR│BLANK Reagenzienkontrolle, abbrechbar 16 Kavitäten 

MTS│BR│XX 

HYBBUF 

STRGWASH 

WASHBUF│20 X 

CONJ│100 X 

SUBS│TMB 

STOP│H 3 PO 4 │25% 

Farbcodierte Mikrotiterstreifen mit spezifischer 

Oligonukleotid-Sonde, abbrechbar 

Hybridisierungslösung (gebrauchsfertig) 

Enthält Standard-Saline-Citrat-Puffer (SSC), 

Natriumdodecylsulfat (SDS) und N-Lauryl-Sarkosin 

Stringente Waschlösung (gebrauchsfertig) 

Enthält SSC und SDS 

Waschpuffer (20x konzentriert) 

Enthält Phosphat-Puffer, NaCl u. Detergens, 

Konservierungsstoffe: Methylisothiazolon u. Oxypyrion 

Konjugat (100x konzentriert, transparente 

Verschlusskappe) 

Konservierungsstoffe: Methylisothiazolon, 

Dimethyaminoantipyrine u. Chloracetamid 

TMB(Tetramethylbenzidin)-Substratlösung 

(gebrauchsfertig) 

Stopplösung (25 %ige Phosphorsäure, 

gebrauchsfertig) 

96 Kavitäten 

10 ml 

100 ml 

12 ml 

120 µl 

12 ml 

12 ml 

8

5.3 Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör 

Reagenzien 

UltraStart Tth - DNA Polymerase inkl. Reaktionspuffer (Best. Nr. 3955) 

steriles H 2 O dd (Aqua bidest) 

hyplex ® Lyse-Puffer (Best.-Nr. 3950) 

Zubehör 

Thermoblock 

PCR-Thermocycler 

PCR-Reaktionsgefäße (empfohlen: 0,2 ml) 

Pipetten mit sterilen Einmalspitzen 

Inkubationsschrank (50° C ± 1° C) 

Mikrotiterplatten-Photometer für Extinktionsmessung bei 450 nm und 620 nm 

6. Warn- und Entsorgungshinweise 

Sämtliche Reagenzien und Materialien, die mit potentiell infektiösen Proben in 

Kontakt kommen, müssen mit geeigneten Desinfektionsmitteln behandelt oder 

autoklaviert werden. 

Während des gesamten Testablaufs müssen geeignete Einmal-Handschuhe 

getragen werden. 

Das Konjugat, die TMB-Substratlösung und der Waschpuffer enthalten 

Konservierungsstoffe. Eine Berührung mit Haut oder Schleimhäuten ist zu 

vermeiden. Sollte es dennoch dazu kommen, betroffene Stellen mit reichlich Wasser 

spülen. 

Phosphorsäure ist reizend. Kontakt mit Haut und Schleimhäuten unbedingt 

vermeiden. Sollte es dennoch dazu kommen, betroffene Stellen mit reichlich Wasser 

spülen. 

7. Hinweise zur Handhabung 

Die Reagenzien des hyplex ® SuperBug ID PCR-Moduls sollten mit Ausnahme der 

Positivkontrollsonden (2...8° C) nach Erhalt bei - 20° C gelagert werden. Häufiges 

Auftauen und Einfrieren der Reagenzien ist zu vermeiden. Nach erstmaligem Gebrauch 

ist eine Lagerung bei 2...8° C zur Vermeidung von Auftau- und Einfrierschritten möglich, 

die Reagenzien sollten dann aber innerhalb von 3 Monaten aufgebraucht werden. 

Die Reagenzien der hyplex ® SuperBug ID Hybridisierungsmodule sollten bei 2...8° C 

gelagert werden. 

9

Vor Testbeginn sind Waschpuffer, TMB-Substratlösung, Stopplösung sowie der 

verschlossene Druckverschlußbeutel mit der darin enthaltenen Mikrotiterplatte des 

hyplex Hybridisierungs-Moduls für mindestens 30 Minuten auf Raumtemperatur 

(18...25° C) zu temperieren. Die stringente Waschlösung muss auf 50° C vorgewärmt 

werden. Hybridisierungspuffer und Konjugat stets kühl halten. 

Die Packungen tragen ein Verfalldatum, nach dessen Erreichen keine Qualitätsgarantie 

mehr übernommen werden kann. 

Um die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Produktbildung zu minimieren, empfiehlt es 

sich, die Amplifizierungsreaktionen auf Eis zu pipettieren und die DNA-Polymerase als 

letztes Reagenz hinzuzufügen. Während der gesamten Testvorbereitung sollten zwecks 

Kontaminationsgefahr geeignete (ungepuderte) Einmal-Handschuhe getragen und 

Pipettenspitzen mit Filtereinsatz verwendet werden. 

8. Probenmaterial 

Das Probenmaterial kann aus extrahierter DNS, reinen Bakterienzellen oder potentiell 

infiziertem Patientenmaterial bestehen. 

Werden als Probenmaterial Zellen verwendet, ist eine einzelne Bakterienkolonie in 300 

µl hyplex ® Lyse-Puffer (Best. Nr. 3950) zu suspendieren. Der Lyse-Puffer wird für 

10 Min im Thermoblock (99° C) inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt (2 Min bei 

10.000 x g) werden 5 µl des Überstandes in die Amplifizierungsreaktion eingesetzt. 

Zur Probenvorbereitung, Isolierung und Aufreinigung der genomischen DNS aus 

Blutkulturen werden Filtrationsfläschchen (Best.-Nr. 3957) und das hyplex ® Prep 

Modul (Best.-Nr. 3951) oder hyplex ® QuickPrep (Best. Nr. 3980) empfohlen. 

Sollen mit diesem System direkt Abstrichtupfer ohne Inhibition getestet werden, so ist 

der Tupfer in 300 µl hyplex ® Lyse-Puffer (Best. Nr. 3950) auszudrücken, sofern es 

sich um einen Tupfer mit Transport-Medium (z.B. Amies-Medium) handelt. 

Ein trockener Tupfer ohne Transportmedium ist in 500 µl hyplex ® Lyse-Puffer (Best. 

Nr. 3950) auszudrücken. 

In beiden Fällen wird der Lyse-Puffer für 10 Min im Thermoblock (99° C) inkubiert. Nach 

einem Zentrifugationsschritt (2 Min bei 10.000 x g) werden 5 µl des Überstandes in die 

Amplifizierungsreaktion eingesetzt. 

Probenart DNS-Präparation Einzusetzendes Probenvolumen 

Nasenabstrich Einfache Zellyse mit Lysepuffer 5 µl Lysat-Überstand 

Rachenabstrich Einfache Zellyse mit Lysepuffer 5 µl Lysat-Überstand 

Hautabstrich Einfache Zellyse mit Lysepuffer 5 µl Lysat-Überstand 

Wundabstrich Einfache Zellyse mit Lysepuffer 5 µl Lysat-Überstand 

(Peri-) Analabstrich DNS-Isolierung mit kommerz. System 1 - 5 µl DNS-Eluat 

Trachealsekret DNS-Isolierung mit kommerz. System 1 - 5 µl DNS-Eluat 

Sputum, Punktat, Urin DNS-Isolierung mit kommerz. System 1 - 5 µl DNS-Eluat 

Blutkultur 

DNS-Isolierung mit hyplex ® PrepModul 5 µl DNS-Eluat 

10

Für die Isolierung genomischer DNS aus Patientenmaterial wie Analabstrichen, 

Trachealsekreten, Punktaten oder extrem eitrigen oder blutigen Wundabstrichen sollten 

kommerziell erhältliche Systeme verwendet werden, z.B.: 

MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche Diagnostics GmbH) 

hyplex ® Prep Modul (Best. Nr. 3951) 

hyplex ® QuickPrep (Best. Nr. 3980) 

Wiederholtes Einfrieren und Auftauen von isolierter DNS sollte vermieden werden. 

9. Testdurchführung 

9.1 Vorbereitung der Amplifizierungsreaktion 

Die Reaktionen werden unter Verwendung des mitgelieferten PCR - Puffer nach 

folgendem Ansatz vorbereitet: 

x µl Probenmaterial (z.B. 5 µl Probe bzw. 5 µl Negativ- und Positivkontrolle) 

1 µl Nukleotid-Mix (Gelbe Verschlusskappe) 

2 µl Primer-Mix (Grüne Verschlusskappe) 

5 µl 10x PCR-Puffer 

1 µl UltraStart Tth - DNA Polymerase (1 U) 

ad 50 µl H 2 O dd 

Wenn als Probenmaterial genomische DNS verwendet wird, ist der Amplifizierungsreaktion 

zwischen 1 und 100 ng DNS zuzugeben. 

Achtung! Zuviel DNS oder Zellmaterial kann die Effizienz einer PCR beträchtlich 

verringern und zu falsch negativen Resultaten führen! 

9.2 Durchführung der Amplifizierungsreaktion 

Programmierung des PCR-Thermocyclers mit folgendem Programm: 

Zyklus Temperatur [° C] Zeit Reaktion 

1x 94 5 Min Anfangsdenaturierung der DNS 

94 25 Sek Denaturierung der DNS 

52 25 Sek Bindung der Primer 

35x 

72 20 Sek + 1 Sek/Zyklus 3´-OH Elongation der Primer 

oder 

45 Sek 

1x 72 3 Min Finale Elongation 

Das Reaktionsgemisch sollte nach Beendigung der PCR bis zur Durchführung der 

reversen Hybridisierung bei -20° C gelagert werden. 

11

9.3 Durchführung der reversen Hybridisierung 

Zur Durchführung der reversen Hybridisierung werden die verschiedenen hyplex ® 

SuperBug ID Hybridisierungs-Module benötigt. Die unten genannten Mengenangaben 

beziehen sich jeweils auf die Bearbeitung einer einzelnen Mikrotiterplattenkavität. 

Beispiele: Vier Proben sollen auf Anwesenheit Carbapenemasen-relevanter Gene 

getestet werden. Dazu werden jeweils 4 Sonden VIM, IMP, KPC, OXA-48 

und NDM-1 für die Proben und jeweils 1 Sondenkavität für die 

Negativkontrolle benötigt. Außerdem werden 1 Positivkontrollkavität und 1 

Reagenzienkontrollkavität benötigt. Die Mengenangaben müssen also mit 

dem Faktor 27 (4+4+4+4+4+5+1+1) multipliziert werden. 

Vor Gebrauch müssen die Stringente Waschlösung auf 50° C vorgewärmt bzw. 

Waschpuffer, TMB-Substratlösung, Stopplösung und die benötigten Mikrotiterplatten auf 

Raumtemperatur (18...25° C) gebracht werden. 

9.3.1 Testplattenzusammenstellung 

Die Kavitäten werden fest in den Rahmen gesteckt. Die nicht benötigten Kavitäten 

werden wieder im Druckverschlussbeutel zusammen mit dem Trockenmittel bei 2...8° C 

gelagert. 

Für jeden Testansatz muss eine der im hyplex Hybridisierungs-Modul enthaltenen 

Reagenzienkontrollen zur Ermittlung des Reagenzienhintergrundsignals mit verwendet 

werden. Sie werden nach anfänglicher Zugabe von 50 µl Hybridisierungspuffer in 

gleicher Weise wie die Proben prozessiert. Zusätzlich muss für jeden Testansatz eine 

Positiv- und eine Negativkontrolle mitgeführt werden. 

Der PCR-Ansatz der Positivkontrolle wird entsprechend Punkt 9.3.2 verdünnt und 50 µl 

der entstandenen Lösung in eine Positivkontrollkavität gegeben und laut Protokoll 

(siehe unten) weiter behandelt. 

Der PCR-Ansatz der Negativkontrolle wird entsprechend Punkt 9.3.2 verdünnt und je 

50 µl der entstandenen Lösung in die verwendeten spezifischen Sondenkavitäten 

pipettiert und laut Protokoll (siehe unten) weiter behandelt. 

9.3.2 Vorbereitung der PCR-Probe und Durchführung der Hybridisierung 

Der Reaktions-Mix der durchgeführten hyplex ® SuperBug ID PCR wird im 

Reaktionsgefäß für 10 Min. bei 95° C denaturiert. Es wird die Durchführung in einem 

Thermocycler mit Deckelheizung empfohlen. 

Es werden umgehend pro Kavität 5 µl des PCR-Ansatzes zu 50 µl kühler (2...8° C) 

Hybridisierungslösung gegeben, gut gemischt und davon 50 µl rasch in die 

entsprechende Kavität pipettiert. Die Mikrotiterplatte wird 30 Min. bei 50° C inkubiert. 

Zur Vermeidung eines hohen Verdunstungsverlusts an Hybridsierungslösung sollte die 

Mikrotiterplatte abgedeckt werden. 

9.3.3 Stringentes Waschen 

Die Kavitäten werden vollständig geleert und dreimal kurz mit je 200 µl der 

vorgewärmten Stringenten Waschlösung gewaschen. 

Es ist darauf zu achten, dass die Stringente Waschlösung zwischen den 

Waschschritten vollständig entfernt wird. Nach Beenden des letzten Waschschrittes 

Platte auf einem Papiertuch ausschlagen, um letzte Flüssigkeitsreste aus den Kavitäten 

zu entfernen. 

12

9.3.4 Herstellung des Waschpuffers 

Das Waschpufferkonzentrat wird 1+19 mit H 2 O deion. verdünnt. Pro Kavität werden 

0,05 ml Konzentrat und 0,95 ml H 2 O deion. gemischt. Der Waschpuffer kann auch in 

größerer Menge hergestellt und für eine spätere Verwendung eine Woche bei 

Raumtemperatur gelagert werden. 

9.3.5 Waschen 

Die Kavitäten werden einmal kurz bei Raumtemperatur mit 200 µl Waschpuffer 

gewaschen. 

9.3.6 Inkubation mit Peroxidase-Konjugat 

Die Konjugatlösung muss stets frisch zubereitet werden. 

Pro Kavität werden 1 µl Konjugat-Konzentrat (Durchsichtige Verschlusskappe) mit 

100 µl Waschpuffer in einem sauberen Gefäß versetzt und gut gemischt (Verdünnung 

1+100). Es werden 100 µl pro Kavität zupipettiert und die Mikrotiterplatte für 30 Min. bei 

Raumtemperatur inkubiert. 

9.3.7 Waschen 

Die Kavitäten werden geleert und dreimal kurz mit je 200 µl Waschpuffer bei 

Raumtemperatur gewaschen. Es ist darauf zu achten, dass die Waschlösung 

zwischen den Waschschritten vollständig entfernt wird. 

9.3.8 Substratreaktion 

Die TMB-Substratlösung ist gebrauchsfertig. Es werden 100 µl pro Kavität pipettiert. Die 

Mikrotiterplatte wird 15 Min bei Raumtemperatur unter Schutz vor direkter 

Sonneneinstrahlung inkubiert. Die Zeit wird ab Pipettieren der ersten Kavität gerechnet. 

9.3.9 Abstoppen der Reaktion 

Zum Abstoppen der Reaktion werden 100 µl Stopplösung pro Kavität zupipettiert. Dabei 

ist dasselbe Pipettierschema wie beim Pipettieren der TMB-Substratlösung einzuhalten. 

9.3.10 Messung der Extinktion 

Die Extinktion der einzelnen Kavitäten wird in einem Mikrotiterplatten-Photometer bei 

450 nm und einer Referenzlänge von 620 - 650 nm gemessen. Der Nullabgleich erfolgt 

gegen Luft. Die Messung sollte innerhalb von 60 Minuten nach Abstoppen der Reaktion 

erfolgen. 

13

10. Kurzanleitung der Testdurchführung 

Verdünnungen: 

Waschpufferverdünnung 1+19 mit H 2 O deion. 0,05 ml + 0,95 ml pro Kavität 

Konjugatverdünnung 1+100 mit verdünntem Waschpuffer 1 µl + 100 µl pro Kavität 

Testschritte: 

Denaturierung PCR-Reaktionsansatz 10 Min. bei 95° C 

Probenverdünnung: 5 µl PCR-Reaktionsansatz zu 50 µl 

Hybridisierungslösung geben 

Hybridisierung: 50 µl pro Kavität 30 Min. bei 50° C ± 1° C 

Stringentes Waschen: 200 µl pro Kavität 3 x kurz 

Waschschritt: 200 µl pro Kavität 1 x kurz 

Konjugatinkubation: 100 µl pro Kavität 30 Min. bei Raumtemperatur 

Waschschritt: 200 µl pro Kavität 3 x kurz 

Substratinkubation: 100 µl pro Kavität 15 Min. bei Raumtemperatur 

Abstoppen: 100 µl pro Kavität mit Stopplösung 

Photometrieren 450 / 620 nm 

11. Auswertung 

Der Test ist unter folgenden Bedingungen auswertbar: 

Extinktion Reagenzienkontrolle ≤ 0,200 

Extinktion Negativkontrolle (ENK) ≤ 0,200 

Extinktion Positivkontrolle ≥ 1,500 

Bei geringeren Signalstärken der Positivkontrolle besteht die Gefahr, schwach-positive 

Proben als negativ zu bewerten. Dies könnte eventuell auf einer zu hohen 

Hybridisierungstemperatur oder auf einer zu hohen Temperatur der Stringenten 

Waschlösung beruhen (siehe auch 14). 

Auswerteschema bei Verwendung von Zellmaterial aus einer Reinkultur oder 

daraus isolierter DNS: 

 

 

 

Proben mit Extinktionswerten größer 0,400 sind als positiv zu bewerten 

Proben mit Extinktionswerten zwischen 0,200 und 0,400 sind grenzwertig. Sie 

sollten erneut getestet werden. 

Proben mit Extinktionswerten kleiner 0,200 sind als negativ zu bewerten 

Auswerteschema bei direkter Verwendung von Patientenmaterial oder daraus 

isolierter DNS: 

Proben mit Extinktionswerten größer als 0,300 sind als positiv zu bewerten 

Proben mit Extinktionswerten größer 3 x ENK und kleiner als 0,300 sind 

grenzwertig. Sie sollten erneut getestet werden. 

Proben mit Extinktionswerten kleiner 3 x ENK oder kleiner als 0,150 sind als negativ 

zu bewerten 

14

12. Hinweise zur Interpretation der Testergebnisse 

Mit dem hyplex ® SuperBug ID -System liegt ein schneller, universell einsetzbarer 

Screening- und Bestätigungstest für den Nachweis von Genen der bedeutendsten, 

medizinisch relevanten Metallo-ß-Laktamasen VIM, IMP und NDM sowie der 

Carbapenemasen des KPC-Typs und OXA-48-Typs vor. 

Positive Ergebnisse des hyplex ® SuperBug ID -Systems weisen das Vorhandensein 

von Carbapenemasen-assoziierten Genen in einer Probe nach. Dies bedeutet nicht, 

dass die Gene auch tatsächlich exprimiert werden. Die in der untersuchten Probe 

gefundenen Keime besitzen aber das genetische Potential dazu. Es lassen sich 

aufgrund dieses Testsystems z. B. auch keine Aussagen über minimale 

Hemmkonzentrationen der Erreger gegenüber bestimmten ß-Laktamantibiotika und 

insbesondere Carbapeneme machen. 

Das Ergebnis des hyplex ® SuperBug ID - Systems ist abhängig von der Quantität und 

Qualität der in der Probe befindlichen DNS. Durch die PCR der hyplex ® SuperBug ID 

PCR-Module werden schon geringe Kopienzahlen (entsprechend 9,3 x 10 3 

Genomkopien / ml) von relevanter DNS in solchen Mengen amplifiziert, dass positive 

Signale zu beobachten sind. 

Ein negatives hyplex ® SuperBug ID -Testresultat kann die Präsenz von 

Carbapenemasen-Produzenten im Probenmaterial nicht vollständig ausschließen. Es 

existieren weitere Enzyme, die die Fähigkeit besitzen, Carbapeneme zu hydrolisieren 

und somit eine Resistenz gegen diese Antibiotika vermitteln, aber nicht zu den beiden 

mittels diesem Testsystem detektierten Enzymen gehören. Diese anderen Enzyme 

(MBL: GIM, SPM) treten bislang nur sporadisch auf und haben zurzeit keine klinische 

Bedeutung oder sind im Falle von Carbapenemasen des OXA-Typs mit dem hyplex ® 

CarbOxa ID nachweisbar. 

Zudem kann die Effizienz der PCR z.B. durch inhibitorische Stoffe im Probenmaterial 

drastisch reduziert werden, was wiederum geringe Signale zur Folge haben kann. Wird 

DNS aus einer Probe isoliert, kann u. U. die DNS fragmentiert sein oder nicht in der 

benötigten Reinheit (Anwesenheit von PCR-Inhibitoren) vorliegen. 

Die Verwendung kommerziell erhältlicher DNS-Isolierungs- und Reinigungskits sowie im 

Zweifelsfalle die Durchführung der Amplifikationskontrolle (siehe 13) werden deshalb 

empfohlen 

Werden in einem auswertbaren Test Resultate im grenzwertigen Bereich (siehe 11) 

erzielt, so ist es wahrscheinlich, dass die Probe positiv ist, aber die Amplifikation der 

DNS durch nicht optimale Bedingungen gemindert wurde. In diesem Fall wird eine 

Wiederholung des Tests (mit neu isolierter DNS oder nach einem Anreicherungsschritt) 

empfohlen. 

15

13. Kontrollergebnisse des hyplex ® SuperBug ID-Testsystems 

Bei der Durchführung der Positivkontrolle wird ein Amplifikationsprodukt gebildet, das 

nach Durchführung der reversen Hybridisierung mit der spezifischen 

Positivkontrollsonde ein positives Signal mit einer OD 450 nm > 1,5 zeigt. 

Die Positivkontrolle ist im Falle von zweifelhaften negativen Ergebnissen auch als 

Amplifikationskontrolle einsetzbar. Durch Zugabe der Positivkontrolle des hyplex ® 

SuperBug ID PCR-Moduls zum PCR-Ansatz der zu untersuchenden Probe kann das 

Vorhandensein von die PCR inhibierenden Stoffen im Probenmaterial überprüft werden. 

Zeigt die Positivkontrollsonde kein Signal, so wurde in diesem Fall die PCR inhibiert und 

es ist keine Aussage über das Vorhandensein von relevanter DNS in der Probe 

möglich. Eine Wiederholung mit frisch gereinigter DNS wird empfohlen. 

Zeigt die Positivkontrollsonde ein positives Signal, so liegt kein systemischer Fehler in 

der PCR und der Hybridisierung vor, die zu untersuchende Probe ist als negativ 

einzustufen. 

Im Fall der Negativkontrolle sollte kein Amplifikationsprodukt und somit kein 

Hybridisierungssignal mit irgendeiner Sonde zu beobachten sein. 

14. Troubleshooting 

Durchweg schwache oder gar keine Signale (inkl. Positivkontrolle) 

Temperatur der Stringenten Waschlösung deutlich über 50° C 

PCR-Produkte vor Hybridisierung nicht (ausreichend) denaturiert bzw. wieder 

renaturieren lassen 

Substrat nicht auf Raumtemperatur äquilibriert 

Falsche Mengen an Konjugat und/oder Substrat eingesetzt 

Schwache oder gar keine Signale mit Ausnahme der Positivkontrolle 

Qualität und/oder Quantität der isolierten DNS lassen keine effiziente Amplifikation 

zu. PCR-Produkte in einem 2%igem Agarosegel überprüfen. Gegebenenfalls DNS- 

Isolierung und –Amplifizierung wiederholen, evtl. andere DNS-Isolierungsmethode 

verwenden 

Bei Verwendung des hyplex Lysepuffers ungenügende thermische Lyse (zu kurz; 

Temperatur nicht 99° C) 

Bei Verwendung von Zell- bzw. Patientenmaterial mit Hilfe der Positivkontrolle die 

Anwesenheit von PCR-inhibierenden Stoffen überprüfen (siehe 13) oder DNS- 

Isolierung durchführen 

Allgemein hohe (Hintergrund)-Signale 

Die Verwendung von nicht ausreichend erwärmter Stringenter Waschlösung bzw. zu 

niedrige Temperatur des Inkubators kann zu unspezifischen Signalen führen. 

Spezifische, positive Signale werden im gleichen Maße verstärkt, so dass der 

Kontrast zwischen unspezifischen und spezifischen Signalen erhalten bleibt. Bei 

Zweifel an der Auswertbarkeit des Testlaufs (siehe 11) wird eine Wiederholung unter 

Verwendung der korrekten Durchführungsparameter empfohlen. 

16

15. Leistungsdaten 

15.1 Sensitivität und Spezifität: 

96 verschiedene Carbapenemasen - negative Stämme folgender Spezies wurden mit 

dem hyplex ® SuperBug ID hinsichtlich der Spezifität des Systems getestet. 

Organismus 

Citrobacter brackii 

Citrobacter freundii 

Enterobacter aerogenes 

Enterobacter amnigenus 

Enterobacter cloacae 

Enterobacter gergoviae 

Enterobacter intermedius 

Enterobacter kobei 

Enterococcus asini 

Enterococcus avium 

Enterococcus casseliflavus 

Enterococcus cecorum 

Enterococcus columbae 

Enterococcus dispar 

Enterococcus durans 

Enterococcus faecalis 

Enterococcus faecium 

Enterococcus flavescens 

Enterococcus gallinarum 

Enterococcus hirae 

Enterococcus malodoratus 

Enterococcus mundtii 

Enterococcus pseudoavium 

Enterococcus raffinosus 

Enterococcus saccharolyticus 

Enterococcus seriolicida 

Enterococcus solitarius 

Enterococcus sulfreus 

Escherichia coli 

Klebsiella oxytoca 

Klebsiella pneumoniae 

Legionella pneumophila 

Morganella morganii 

Mycoplasma genitalium 

Mycoplasma hominis 

Pseudomonas aeruginosa 

Pseudomonas alcaligenes 

Pseudomonas fluorescens 

Serratia liquefaciens 

Serratia marcescens 

Staphylococcus arlettae 

Staphylococcus aureus 

Staphylococcus capitis 

Staphylococcus caprae 

Staphylococcus epidermidis 

Staphylococcus haemolyticus 

Staphylococcus hominis 

Staphylococcus saprophyticus 

Staphylococcus simulans 

Staphylococcus warneri 

Streptococcus agalacticae 

Streptococcus dysgalacticae 

Streptococcus mutans 

Streptococcus oralis 

Streptococcus pyogenes 

Streptococcus salivarius 

Streptococcus sanguinis 

Ureaplasma urealyticum 

Ergebnis: 

Es wurden keinerlei positive Signale mit einem der getesteten Referenzstämme 

beobachtet. 

Spezifität im Rahmen der getesteten Referenzstämme 100 % 

17

26 Carbapenem-resistente, genetisch charakterisierte Stämme wurden mit dem 

hyplex ® SuperBug ID hinsichtlich der Sensitivität des Systems getestet. 

Spezies Stamm-Nr. Quelle Gen-Variante NDM-1 OXA-48 KPC VIM IMP 

Pseudomonas aeruginosa VR-143/97 Siena a VIM-1 - - - +++ - 

Pseudomonas aeruginosa AV-65 Siena a IMP-13 - - - - +++ 

Pseudomonas putida VA-758/00 Siena a IMP-12 - - - - ++ 

Pseudomonas aeruginosa 101/1477 Siena a IMP-1 - - - - +++ 


Acinetobacter baumannii ACX 54/97 Siena a IMP-2 - - - - +++ 

Pseudomonas aeruginosa 2611/04 Warschau b VIM-4 - - - +++ - 




Pseudomonas aeruginosa 060907- 

3147 

München c VIM-2 - - - +++ - 

Klebsiella pneumoniae Kpn 6/100 Athen d VIM-1 - - - +++ - 

Klebsiella pneumoniae Kpn 5866 Athen d VIM-1 - - - +++ - 





Pseudomonas aeruginosa K34-7 Tromsø e VIM-2 - - - +++ - 



Acinetobacter baumannii 65FFC Coimbra f IMP-5 - - - - +++ 

Klebsiella pneumoniae Kp1239 Westmed h IMP-4 - - - - +++ 

Salmonella cubana AM04707 Athen d KPC-2 - - +++ - - 

Klebsiella pneumoniae 375/08 Wernigerode g KPC-3 - - +++ - - 

Klebsiella pneumoniae 238/09 Wernigerode g OXA-48 - +++ - - - 

Escherichia coli 02/10 Wernigerode g NDM-1 +++ - - - - 

a 

freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Rossolini, University of Siena 

b freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Gniadkowski, National Inst. of Public Health, 

Warschau 

c 

freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Bauernfeind, MICOER, München 

d freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Miriagou, Hellenic Pasteur Institute, Athen 

e freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Samuelsen, University Hospital of North Norway, Tromsø 

f freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. da Silva, University of Coimbra 

g freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Pfeiffer, RKI Wernigerode 

h freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Irdell, Westmead Hospital, Australia 

18

Ergebnis: 

Sensitivität im Rahmen der getesteten Referenzstämme 100 % 

15.2 Klinische Evaluierung: 

A) Im Rahmen einer Studie am Institut für Medizinische Mikrobiologie des 

Universitätsklinikum Jena wurden mit freundlicher Unterstützung des Robert-Koch- 

Instituts, Zweigstelle Wernigerode, FG13 Nosokomiale Infektionen, 75 verschiedene 

Stämme mit dem hyplex ® SuperBug ID untersucht (19 E. coli, 37 K. pneumoniae, 7 K. 

oxytoca, 4 E. cloacae, 7 Ps. aeruginosa und 1 A. baumannii). Es wurden folgende 

Daten im Vergleich zu molekularbiologischen Referenzuntersuchungen ermittelt: 

Referenz-PCR- 

Untersuchungen 

VIM 

pos. 

IMP 

pos. 


KPC 

pos. 

OXA-48 

pos. 

NDM-1 

pos. 

Negativ 

Summe 

VIM positiv 10 0 0 0 0 0 10 

IMP positiv 0 2 0 0 0 0 2 

KPC positiv 0 0 5 0 0 0 5 

OXA-48 positiv 0 0 0 4 0 0 4 

NDM-1 positiv 0 0 0 0 1 0 1 

negativ 0 0 0 0 0 53 53 

Summe 10 2 5 4 1 53 75 

Ergebnis: 

Sensitivität und Spezifität im Rahmen der getesteten Stämme: jeweils 100 % 

B) Im Rahmen einer Studie in drei Krankenhäuser in Athen, Griechenland 

(Evangelismos, Geniko Kratiko und Laiko) unter Koordination von Dr. V. Miriagou 

(Hellenic Pasteur Institute) wurden insgesamt 90 positiv gemeldete Blutkulturflaschen 

sowie 236 andere klinische Proben (60 Urine, 91 Wundabstriche und 85 

Trachealsekrete) mikrobiologisch untersucht. Es wurden folgende Daten im Vergleich 

zum direkten Einsatz des hyplex ® MBL ID Systems ermittelt: 

Urinproben, Wundabstriche 

und Trachealsekrete 

hyplex MBL / KPC 

ID positiv (VIM) 

hyplex MBL / KPC 

ID negativ 

Summe 

Mikrobiologie positiv 53 1 54 

Mikrobiologie negativ 5 177 182 

Summe 58 178 236 

Blutkulturen 

Summe 

Mikrobiologie positiv 19 0 19 

Mikrobiologie negativ 0 71 71 

Summe 19 71 90 

19

Folgende Leistungsdaten wurden im Vergleich zur Mikrobiologie als „Standard“ 

ermittelt: 

Blutkulturen: 

Sensitivität: 100 % 

Spezifität: 100 % 

PPV: 100 % 

NPV: 100 % 

Urinproben, Wundabstriche und Trachealsekrete: 

Sensitivität: 98,1 % 

Spezifität: 97,3 % 

PPV: 91,4 % 

NPV: 99,4 % 

20

Instructions for use 


Multiplex-PCR for the detection of carbapenemases producing bacteria 

in vitro diagnosticum 

1. Introduction 

The hyplex ® SuperBug ID test system is a qualitative in vitro diagnostic tool for the 

detection of bacteria that are capable, from a genetic stand point, of producing 

carbapenemases of various types. 

hyplex ® SuperBug ID detects all described variants of metallo-ß-lactamases of the 

VIM- , IMP- and NDM-type as well the OXA-48 gene and all variants of KPC. 

With the hyplex ® SuperBug ID PCR Module (Cat. No. 3900), amplification products 

are generated that can be visualised with the hyplex ® SuperBug ID Hybridisation 

Modules (Cat. Nos. 3901 to 3905) through reversible hybridisation with specific 

oligonucleotide probes. 

2. Carbapenemases 

Background: 

The increase in antibiotic resistance among gram-negative bacteria is a notable 

example of how bacteria can procure, maintain, and express new genetic information 

that can confer resistance to one or several antibiotics. Reports of resistance vary, but a 

general consensus appears to prevail that quinolone and broad-spectrum ß-lactam 

resistance is increasing in members of the family Enterobacteriaceae and Acinetobacter 

spp. and that treatment regimes for the eradication of Pseudomonas aeruginosa 

infections are becoming increasingly limited. While the advent of carbapenems in the 

1980s heralded a new treatment option for serious bacterial infections, carbapenem 

resistance can now be observed in Enterobacteriaceae and Acinetobacter spp. and is 

becoming commonplace in P. aeruginosa. The common form of resistance is either 

through lack of drug penetration (i.e., outer membrane protein (OMP) mutations and 

efflux pumps), hyperproduction of an AmpC-type ß-lactamase, and/or carbapenemhydrolyzing 

ß-lactamases. Two types of carbapenem-hydrolyzing enzymes have been 

21

described: serine enzymes possessing a serine moiety at the active site, and metallo-ßlactamases 

(MBLs), requiring divalent cations, usually zinc, as metal cofactors for 

enzyme activity. The serine carbapenemases are invariably derivatives of class A or 

class D enzymes and usually mediate carbapenem resistance in Enterobacteriaceae or 

Acinetobacter spp. Despite the avidity of these enzymes for carbapenems, they do not 

always mediate high-level resistance and not all are inhibited by clavulanic acid. 

MBLs, like all ß-lactamases, can be divided into those that are normally chromosomally 

mediated and those that are encoded by transferable genes. However, in the past 5 

years many new transferable types of MBLs have been studied and appear to have 

rapidly spread. In some countries, P. aeruginosa possessing MBLs constitute nearly 20 

% of all nosocomial isolates, whereas in other countries the number is still 

comparatively small. In recent years MBL genes have spread from P. aeruginosa to 

Enterobacteriaceae, and a clinical scenario appears to be developing that could 

simulate the global spread of extended-spectrum ß-lactamases. Moreover, given that 

MBLs will hydrolyze virtually all classes of ß-lactams and that we are several years 

away from the implementation of a therapeutic inhibitor, their continued spread would 

be a clinical catastrophe. 

Metallo-ß-lactamases (MBLs): 

All MBLs hydrolyze imipenem, but their ability to achieve this varies considerably and 

the rate of hydrolysis may or may not correlate with the bacterium’s level of resistance 

to carbapenems. However, these enzymes possess the characteristic hallmark of being 

universally inhibited by EDTA as well as other chelating agents of divalent cations, a 

quintessential feature of MBLs that correlates with their mechanistic function. 

Acquired metallo-ß-lactamases (MBLs) are emerging resistance determinants in 

Pseudomonas aeruginosa and other gram-negative pathogens. These enzymes can 

hydrolyze most ß-lactams, including carbapenems, and can confer a broad-spectrum ß- 

lactam resistance phenotype to the bacterial host, which is not reversible by 

conventional ß-lactamase inhibitors. MBLs are commonly encoded by genes carried on 

mobile elements (integron-borne gene cassettes) that can spread horizontally among 

different replicons and strains. 

Originally thought to be uncommon and restricted to some geographical areas, acquired 

MBLs are presently known to be widespread, and at least four different types of these 

enzymes, IMP, VIM, SPM, and GIM, have been identified, with the IMP- and the VIMtypes 

being prevalent. 

The VIM-type MBLs were originally detected in Europe, where these enzymes 

apparently prevail over IMP-type enzymes. Subsequently, VIM-type enzymes were also 

reported in Asia and America. MBLs of the VIM type are more common among 

nonfermenting gram-negative bacteria. However, during the last few years, studies have 

reported on the dissemination of VIM-type MBLs in members of the family 

Enterobacteriaceae, suggesting the ongoing spread of these resistance determinants 

among pathogens with higher infectivities. 

The IMP-type enzymes were originally reported in Japan in the early 1990s. In that 

area, IMP-type enzymes apparently represent the most common type of acquired MBL 

among gram-negative nosocomial pathogens, and IMP producers have been involved in 

22

nosocomial outbreaks. In Europe, although a number of IMP-type variants have been 

detected since the late 1990s, these enzymes appear to be considerably less common 

than VIM-type enzymes. 

NDM-1 was first identified in December 2009 and was named after New Delhi, as it was 

first described by Yong et al. in a Swedish national who fell ill with an antibiotic-resistant 

bacterial infection that he acquired in India. The infection was unsuccessfully treated in 

a New Delhi hospital and after the patient's repatriation to Sweden; a carbapenemresistant 

Klebsiella pneumoniae strain bearing the novel gene was identified. It was 

later detected in bacteria in India, Pakistan, the United Kingdom, the United States, 

Canada, Japan and several European countries. The most common bacteria that make 

this enzyme are Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, but the gene for NDM-1 

can spread from one strain of bacteria to another by horizontal gene transfer and was 

found in Morganella morganii, Providencia spp., Citrobacter freundii and Acinetobacter 

baumannii, too. 

Klebsiella pneumonia carbapenemase (KPC): 

The initial report of a KPC β-lactamase which is capable of hydrolysing carbapenems, 

penicillins, cephalosporins and aztreonam, was from a carbapenem-resistant K. 

pneumoniae strain isolated in USA, and subsequently KPC producers have also been 

detected in other regions all over the world. There are currently nine recognized 

variants, with KPC-2 and KPC-3 being more commonly isolated. 

Recently, isolates producing KPC-2 /-3 enzyme have been detected in European 

countries such as Greece, the UK, France and Germany. In addition, the spread of KPC 

producers may be underestimated, as the detection of KPC- and also MBL-producing K. 

pneumoniae may be unsuccessful because these enzymes do not always confer 

obvious carbapenem resistance. 

OXA-48 carbapenemase: 

The OXA-48-carbapenemase was first described in 2004 in a K.-pneumoniae-isolate 

from Turkey. Recently, isolates producing such carbapenemase were detected in 

various countries like Belgium, Israel, India, UK and Greece. In Germany it was found 

the first time 2008 in the south-western part of the country. Like in KPC-producing 

bacteria, the phenotypic detection of this resistence type seems to be difficult and 

unreliable. 

23

3. Structure of the hyplex ® SuperBug ID test system 

hyplex ® SuperBug ID PCR module (Cat. No. 3900): 

Manufacture of specific PCR amplifications products from sample material, sufficient for 

a maximum of ten hybridisations per PCR reaction. 

Applicable Hyb-modules: Cat. Nos. 3901 to 3905 

hyplex ® SuperBug ID Hybridisation modules (Cat. Nos. 3901 to 3905): 

Single wells with immobilized oligonucleotide probes for the specific detection of the 

three different carbapenemases coding genes (sales unit: 96 wells per probe) and 

reagents to conduct 96 reverse hybridisations. 

Sample material: PCR products formed using the hyplex ® SuperBug ID PCR module. 

The table below lists the specific probes (hybridisation modules) available separately for 

the hyplex ® SuperBug ID test system. 

Hybridisation modules for the hyplex ® SuperBug ID test system 

Symbols Specificity Well colour Cat. No.: 

MTS│BR│VIM VIM (alle variants VIM-1 to VIM-13) green 3901 

MTS│BR│IMP IMP (all variants IMP-1 to IMP-22) white 3902 

MTS│BR│KPC KPC (all variants KPC-1 bis KPC-10) black 3903 

MTS│BR│O48 OXA-48 yellow 3904 

MTS│BR│NDM NDM-1 burgundy 3905 

One PCR amplification may be used to perform ten hybridisations. Thus one sample 

can be tested for the five parameters mentioned and the various probes may be 

selected as required. 

4. Principle of the test 

The hyplex ® SuperBug ID PCR module contains labelled oligonucleotide primers that 

provide the means for the simultaneous, specific amplification of different DNA regions 

in a single PCR reaction. 

In the presence of the relevant DNA, specific amplification products (of all variants) of 

the genes VIM, IMP, NDM-1, KPC and OXA-48 synthesised and are subsequently 

visualised with the hyplex ® SuperBug ID hybridisation modules. 

For that amplification products from one PCR with the hyplex ® SuperBug ID PCR 

modules are added heat-denatured to single-stranded, specific probes which are 

immobilized on the polystyrene surfaces of microtiter plates. Using a hybridisation 

buffer, hybridisation of complementary sequences occurs which can then be detected 

using the ELISA principle. After several stringent wash steps, a peroxidase (POD) 

conjugate is added. This binds highly specifically to the labelling of the single strand of 

the PCR product bound to the oligonucleotide probe. After further wash steps, TMB 

substrate solution is added which produces a blue colour when converted by POD. This 

reaction is stopped using a stop solution. A colour change to yellow is observed. 

Extinction of the various wells is then measured in a photometer at a wavelength of 

450 nm. 

24

Positive signals indicate specific amplification of certain DNA sequences during the 

hyplex ® SuperBug ID PCR and thus the presence of the corresponding genes in the 

sample to be investigated. 

5. Reagents 

5.1 Contents of PCR modules: 

The reagents contained in one kit are sufficient for 96 determinations. 

Each reagent set contains: 

PRIMER 

dNTP 

CONTROL│+ 

CONTROL│- 


Primer Mix 

(green cap, ready for use) 

Contains labelled oligonucleotide primer 

Nucleotide Mix 

(yellow cap, ready for use) 

Contains dATP, dCTP, dGTP, dTTP 

Positive control 

(red cap, ready for use) 

Negative control 

(blue cap, ready for use) 

Positive control probes, breakable 

(colour coding: blue) 

240 µl 

120 µl 

125 µl 

100 µl 

16 wells 

5.2 Contents of Hybridisation modules: 

The reagents contained in one kit are sufficient for 96 determinations. 

Each reagent set contains: 

MTS│BR│BLANK Reagent control, breakable 16 wells 

MTS│BR│XX 

HYBBUF 

STRGWASH 

WASHBUF│20 X 

CONJ│100 X 

SUBS│TMB 

STOP│H 3 PO 4 │25% 

Colour-coded wells with specific oligonucleotide probe, 

breakable 

Hybridisation buffer (ready for use) 

Contains standard saline citrate buffer (SSC), sodium 

dodecyl sulphate (SDS) and N-lauroylsarcosine 

Stringent washing solution (ready for use) 

Contains SSC and SDS 

Washing buffer (concentrated 20 times) 

Contains phosphate buffer, NaCl and detergent, 

preservatives: methylisothiazolone and oxypyrion 

Conjugate (concentrated 100 times, transparent cap) 

Preservatives: methylisothiazolone, dimethyaminoantipyrine 

and chloracetamide 

TMB (tetramethylbenzidine) substrate solution 

(ready for use) 

Stop solution (25 % phosphoric acid, 

ready for use) 

96 wells 

10 ml 

100 ml 

12 ml 

120 µl 

12 ml 

12 ml 

25

5.3 Additional reagents and accessories required 

Reagents 

UltraStart Tth - DNA polymerase incl. reaction buffer (Cat. No. 3955) 

sterile, double-distilled H 2 O 

hyplex ® lysis buffer (Cat. No. 3950) 

Accessories 

Heating block 

PCR thermocycler 

PCR reaction vessels (recommended: 0.2 ml) 

Pipettes with sterile disposable tips 

Incubator (50° C ± 1° C) 

Microtiter plate photometer for measuring extinction at 450 nm and 620 nm 

6. Warnings and precautions 

All reagents and materials which come into contact with potentially infectious 

samples must be treated with suitable disinfectant or autoclaved. 

Suitable disposable gloves must be worn during the entire test. 

The conjugate, the TMB substrate solution and the washing buffer contain 

preservatives. Avoid contact with the skin or mucous membranes. If this does 

happen, rinse affected areas with plenty of water. 

Phosphoric acid is an irritating substance. Avoid contact with the skin and mucous 

membranes. If this does happen, rinse affected areas with plenty of water. 

7. Handling notes 

With the exception of the positive control probes (2...8° C), the reagents of the hyplex ® 

SuperBug ID PCR modules should be stored at - 20° C after receiving them. Avoid 

frequent thawing and freezing of the reagents. After using for the first time, the reagents 

may be stored at 2...8° C to avoid thawing and freezing steps but in this case the 

reagents should be used within three months. 

The reagents of the hyplex ® SuperBug ID hybridisation modules should be stored at 

2...8° C. 

Before beginning the test, the washing buffer, TMB substrate solution, the stop solution 

as well as the closed snap-seal bag with the microtitre wells should be kept at room 

temperature (18...25° C) for at least 30 minutes. The stringent washing solution must be 

preheated to 50° C. Always keep the hybridisation buffer and the conjugate cool. 

The kits have an expiry date. Quality cannot be guaranteed after this date. 

To minimize the probability of nonspecific product formation, it is recommended that the 

amplification reactions be pipetted on ice and that DNA polymerase be the last reagent 

to be added. Due to the danger of contamination, suitable (non-powdered) disposable 

gloves and pipette tips with filter insert should be used when preparing for the test. 

26

8. Sample material 

The sample material may be isolated DNA, pure bacterial cells or potentially infected 

patient specimens. 

If cells are used as sample material, a single bacterial colony is suspended in 300 µl 

hyplex ® Lysis Buffer (Cat. No. 3950). The cell suspension is incubated in a thermal 

block (99° C) for 10 min. After a centrifugation step (2 min at 10,000 x g), 5 µl of the 

supernatant is used for the amplification reaction. 

For sample preparation, isolation and purification of genomic DNA from blood cultures 

the usage of Filtration vials (Cat. No. 3957) and hyplex ® Prep Module (Cat. No. 

3951) or hyplex ® QickPrep (Cat. No. 3980) is recommended. 

To directly test swab specimens without inhibition in this system: A swab that was 

transported in medium (e.g. Amies medium) should be pressed out in 300 µl hyplex ® 

Lysis Buffer (Cat. No. 3950). A dry swab without transport medium should be pressed 

out in 500 µl hyplex ® Lysis Buffer (Cat. No. 3950). 

In both cases, the suspension is then incubated in a heating block (99° C) for 10 min. 

After a centrifugation step (2 min at 10,000 x g), 5 µl of the supernatant is used for the 

amplification reaction. 

Type of sample DNA preparation Sample volume to be used 

Nose swab Simple cell lysis with lysis buffer 5 µl lysate supernatant 

Throat swab Simple cell lysis with lysis buffer 5 µl lysate supernatant 

Skin swab Simple cell lysis with lysis buffer 5 µl lysate supernatant 

Wound swab Simple cell lysis with lysis buffer 5 µl lysate supernatant 

(Peri-) Anal swab 

Tracheal secretion 

Sputum, puncture 

specimen, urine 

DNA isolation using a commercially 

available system 





1 - 5 µl DNA eluate 



Blood cultures DNA isolation using hyplex ® PrepModule 5 µl DNA eluate 

For the isolation of genomic DNA from patient specimens such as anal swabs, tracheal 

secretion, puncture specimens or extremely purulent or sanguineous wound swabs, 

commercially available systems should be used, such as: 

MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I (Roche Diagnostics GmbH) 

hyplex ® Prep Module (Cat. No. 3951) 

hyplex ® QickPrep (Cat. No. 3980) 

Repeated freezing and thawing of isolated DNA should be avoided. 

27

9. Test procedure 

9.1 Preparing the amplification reaction 

The reactions are prepared using the buffer supplied by the DNA polymerase 

manufacturer and using the following batch: 

x µl 

Sample material (e.g. 5 µl sample lysate and 5 µl negative / positive 

control) 

1 µl Nucleotide mix (yellow cap) 

2 µl Primer mix (green cap) 

5 µl 10x PCR buffer 

1 µl UltraStart Tth - DNA polymerase (1 U) 

to 50 µl double-distilled H 2 O 

If genomic DNA is used as sample material, the amplification reaction should be added 

between 1 and 100 ng DNA. 

Caution! Too much DNA or cell material may considerably reduce the 

effectiveness of a PCR and lead to false negative results. 

9.2 Amplification reaction 

The PCR thermocycler should be programmed as follows: 

Cycle Temperature [° C] Time Reaction 

Once 94 5 min Initial denaturation of the DNA 

94 25 sec Denaturation of the DNA 

52 25 sec Binding of the primers 

35 times 

72 20 sec + 1 sec/cycle 3´-OH extension of the primers 

or 

45 sec 

Once 72 3 min Final extension 

After completing the PCR, the reaction mixture should be stored at -20° C until reverse 

hybridisation is conducted with the hyplex ® hybridisation modules. 

9.3 Reverse hybridisation 

The desired hyplex ® SuperBug ID hybridisation modules are required to perform 

reverse hybridisation. The amounts mentioned below each refer to the processing of an 

individual microtiter plate well. 

The hyplex ® SuperBug ID test system offers the user the option of designing the test 

individually to suit his needs and interests. When using several different probes at the 

same time, the indicated amounts must be multiplied by the number of wells needed. 

28

Example: If 4 samples should be tested for the presence of carbapenemases-coding 

genes with the VIM, IMP, NDM-1, OXA-48 and KPC probes, the quantity 

data must be multiplied by a factor of 27 (4 x 5 = 20 wells for the samples, 5 

wells for the negative control, 1 well for the positive control and 1 well for 

the reagent control). 

Before use, the stringent washing solution must be preheated to 50° C and the washing 

buffer, TMB substrate solution, stop solution and the required microtiter plates should 

be brought to room temperature (18...25° C). 

9.3.1 Test plates 

In plastic frames, the different probes in their colour-coded wells may be combined with 

each other as required. To do this, the wells are broken away individually from the 

delivered strips and inserted firmly into the frame. Wells which are not required are 

stored again at 2...8° C in the snap-seal bag together with the desiccant. 

One of the reagent controls contained in the hyplex Hyb-module must be used for every 

test batch to determine the reagent background signal. After initial addition of 50 µl 

hybridisation buffer, they are processed in the same way as the samples. There must 

also be a positive and a negative control for each test batch. 

The PCR batch of the positive control is diluted in accordance with Section 9.3.2 and 

50 µl of the resulting solution is inserted into a positive control well and further treated in 

accordance with the protocol (see below). 

The PCR batch of the negative control is diluted in accordance with Section 9.3.2 and 

50 µl of the resulting solution is pipetted into the used specific probe wells and further 

treated in accordance with the protocol (see below). 

9.3.2 Preparation of the PCR sample and hybridisation procedure 

The 50 µl reaction mix of the hyplex ® SuperBug ID PCR carried out is denatured in the 

reaction vessel for 10 min at 95° C. It is recommended that the procedure is carried out 

in a thermal cycler with a heated lid. 

5 µl of the PCR batch per well is then immediately added to 50 µl cool (2...8° C) 

hybridisation solution, is well mixed, and 50 µl of this is then quickly transferred by 

pipette to the corresponding well. The microtitre plate is incubated for 30 min at 50° C. 

To prevent high evaporation loss of the hybridisation solution, the microtitre plate should 

be covered. 

9.3.3 Stringent washing 

The wells are completely emptied and washed briefly three times with 200 µl of the 

preheated stringent wash solution on each occasion. 

It should be ensured that the stringent wash solution is removed between each washing 

step. After the last washing step, the plate is tapped onto a paper towel to remove any 

last residue of fluid from the wells. 

9.3.4 Manufacture of the washing buffer 

The washing buffer concentrate is diluted 1+19 with deionized H 2 O. Per well, 0.05 ml 

concentrate and 0.95 ml deionized H 2 O are mixed. The wash buffer can also be 

manufactured in greater amounts and stored for later use for a week at room 

temperature. 

29

9.3.5 Washing 

The wells are washed once briefly at room temperature with 200 µl washing buffer. 

9.3.6 Incubation with peroxidase conjugate 

The conjugate solution must always be prepared afresh. 

Per well, 1 µl conjugate concentrate (transparent cap) is added to 100 µl washing buffer 

in a clean vessel and mixed well (dilution 1+100). 100 µl are pipetted into each well and 

the microtiter plate is incubated for 30 min at room temperature. 

9.3.7 Washing 

The wells are emptied and each well is washed three times briefly with 200 µl washing 

buffer at room temperature. Please ensure that the washing solution is removed 

completely between the washing steps. 

9.3.8 Substrate reaction 

The TMB substrate solution is ready for use. Pipette 100 µl per well. Incubate the 

microtiter plate for 15 min at room temperature away from direct sunlight. The time is 

calculated from pipetting of the first well. 

9.3.9 Stopping the reaction 

To stop the reaction, pipette 100 µl of stop solution into each well. Observe the same 

pipetting procedure as for pipetting of the TMB substrate solution. 

9.3.10 Extinction measurement 

Measure the extinction of the individual wells in a microtiter plate photometer at 450 nm 

and a reference length of 620 - 650 nm. Zero comparison is made against air. 

Measurement should take place within 60 minutes of stopping the reaction. 

10. Brief instructions on test procedure 

Dilutions: 

Washing buffer dilution 1+19 with deion. H 2 O 0.05 ml + 0.95 ml per well 

Conjugate dilution 1+100 with diluted washing buffer 1 µl + 100 µl per well 

Test steps: 

Denaturation PCR reaction batch 10 min at 95° C 

Sample dilution: Add 5 µl PCR reaction batch to 50 µl 

hybridisation solution 

Hybridisation: 50 µl per well 30 min at 50°C ± 1° C 

Stringent washing: 200 µl per well 3 times briefly 

Wash step: 200 µl per well Once briefly 

Conjugate incubation: 100 µl per well 30 min at room temperature 

Wash step: 200 µl per well 3 times briefly 

Substrate incubation: 100 µl per well 15 min at room temperature 

Stop: 100 µl per well with stop solution 

Photometric measurement 450 / 620 nm 

30

11. Evaluation 

The test can be evaluated under the following conditions: 

Extinction of reagent control ≤ 0.200 

Extinction of negative control (NCE) ≤ 0.200 

Extinction of positive control ≥ 1.500 

When the signal strength of the positive control is low, weakly positive samples may be 

unintentionally evaluated as negative. The hybridisation temperature or the temperature 

of stringent wash solution may have been too high (see also 14). 

Analytical criteria with use of cellular material from a pure culture or from DNA 

isolated from it: 

 

 

 

Samples with extinction values of greater than 0.400 are treated as positive 

Samples with extinction values of between 0.200 and 0.400 are borderline. They 

should be retested. 

Samples with extinction values of less than 0.200 are treated as negative 

Analytical criteria with directly use of patient material or DNA isolated from it: 

 

 

 

Samples with extinction values of greater than 0.300 are treated as positive 

Samples with extinction values of greater than 3 x NCE and less than 0.300 are 

borderline. They should be retested. 

Samples with extinction values of less than 3 x NCE or less than 0.150 are treated 

as negative 

12. Interpretation of the test results 

The hyplex ® SuperBug ID system is a rapid, universally applicable screening test for 

the detection of genes encoding the most common medically relevant metallo-ßlactamases 

VIM, IMP and NDM-1 as well the carbapenemases of the OXA-48- and 

KPC-type. 

Positive results of the hyplex ® SuperBug ID system demonstrate the presence of 

carbapenemases-associated genes in a sample. This does not mean that the genes are 

also actually expressed. The pathogens found in the tested sample, however, possess 

the potential to express the genes. In addition, no conclusions on, for example, the 

minimal inhibiting concentration of certain β-lactam antibiotics, and in special 

carbapenems, for the pathogen can be made based on the results of this test system. 

The results obtained from the hyplex ® SuperBug ID system are dependent upon the 

quantity and quality of the DNA in the sample. Through the hyplex ® SuperBug ID PCR 

Module, low copy numbers of relevant DNA (corresponding to 9.3 x 10 3 genome copies 

/ ml) are amplified to such an extent that positive signals are observed. 

A negative test result from the hyplex ® SuperBug ID system cannot completely 

exclude the possibility of the presence of carbapenemases producing bacteria in the 

sample material. 

31

For example, further enzymes with the capability of hydrolysing carbapenems do exist, 

confering resistence to that kind of antibiotics, but do not belong to the three types of 

carbapenemases which are detected with this test system. These other enzymes (like 

GIM and SPM) are only found in sporadic cases and have no significant clinical 

importance until now or are detected by the hyplex ® CarbOxa ID in the case of OXAtype 

enzymes. 

Addtionally, the efficiency of the PCR can be drastically reduced by inhibitory 

substances in the sample material, which in turn would lead to lower signals. Under 

certain conditions, DNA isolated from a sample can be fragmented or not be of the 

required purity (presence of PCR inhibitors). 

Therefore, using commercially available DNA isolation and purification kits and, in case 

of doubt, performing an amplification control reaction (see 13) are recommended. 

If in an otherwise valid test, the sample absorbances are in the marginal range (see 11), 

it is probable that the sample is positive, but the amplification of the DNA may have 

been reduced by less than optimal conditions. In this case, repeating the test with 

freshly isolated DNA or after an enrichment step is recommended. 

13. Control results of the hyplex ® SuperBug ID Test System 

After performing the positive control test, an amplification product is generated that, 

after reversible hybridisation with the specific positive control probe, yields a positive 

signal with an OD 450 nm > 1.5. 

In case of questionable negative results, the positive control can also be used as an 

amplification control. The presence of PCR inhibiting substances in a sample can be 

checked by adding the positive control included in the hyplex ® SuperBug ID PCR 

module to the PCR reaction mixture of the sample to be tested. 

If no signal is obtained from the positive control, the PCR was inhibited and a 

conclusion regarding the existence of relevant DNA in the sample cannot be made. 

Repeating the test with freshly purified DNA is recommended. 

If the positive control produces a positive signal, a systematic error in the PCR and the 

hybridisation can be excluded; the test sample is, therefore, negative. 

The negative control should not yield any amplification product and, hence, a 

hybridisation signal should not be observed with any of the probes. 

14. Troubleshooting 

Constantly weak signals or no signals at all (incl. positive control) 

Temperature of the stringent washing solution clearly above 50° C 

PCR products not (sufficiently) denatured or renatured again prior to hybridisation 

Substrate not equilibrated to room temperature 

Wrong amount of conjugate and/or substrate used 

Weak signals or no signals at all with the exception of the positive control 

Quality and/or quantity of the isolated DNA do not allow effective amplification. 

Check PCR products in 2% agarose gel. If necessary, repeat DNA isolation and 

amplification, possibly use another method of DNA isolation 

Insufficient thermal lysis (too short; temperature not 99° C) when using the hyplex 

lysis buffer 

When using cell or patient material, use the positive control to check for the 

presence of PCR-inhibiting substances (see Section 13) or perform DNA isolation 

32

Generally high (background) signals 

The use of insufficiently heated stringent washing solution or an incubation 

temperature which is too low may lead to nonspecific signals. Specific, positive 

signals are potentiated to the same degree, thus maintaining the contrast between 

nonspecific and specific signals. If there is doubt as to the evaluability of the test run 

(see Section 11), repetition with the correct parameters is recommended. 

15. Performance data 

15.1 Specificity and sensitivity: 

96 carbapenemases-negative strains from the following species were used to test the 

specificity of the hyplex ® SuperBug ID system. 

Organism 

Citrobacter brackii 

Citrobacter freundii 

Enterobacter aerogenes 

Enterobacter amnigenus 

Enterobacter cloacae 

Enterobacter gergoviae 

Enterobacter intermedius 

Enterobacter kobei 

Enterococcus asini 

Enterococcus avium 

Enterococcus casseliflavus 

Enterococcus cecorum 

Enterococcus columbae 

Enterococcus dispar 

Enterococcus durans 

Enterococcus faecalis 

Enterococcus faecium 

Enterococcus flavescens 

Enterococcus gallinarum 

Enterococcus hirae 

Enterococcus malodoratus 

Enterococcus mundtii 

Enterococcus pseudoavium 

Enterococcus raffinosus 

Enterococcus saccharolyticus 

Enterococcus seriolicida 

Enterococcus solitarius 

Enterococcus sulfreus 

Escherichia coli 

Klebsiella oxytoca 

Klebsiella pneumoniae 

Legionella pneumophila 

Morganella morganii 

Mycoplasma genitalium 

Mycoplasma hominis 

Pseudomonas aeruginosa 

Pseudomonas alcaligenes 

Pseudomonas fluorescens 

Serratia liquefaciens 

Serratia marcescens 

Staphylococcus arlettae 

Staphylococcus aureus 

Staphylococcus capitis 

Staphylococcus caprae 

Staphylococcus epidermidis 

Staphylococcus haemolyticus 

Staphylococcus hominis 

Staphylococcus saprophyticus 

Staphylococcus simulans 

Staphylococcus warneri 

Streptococcus agalacticae 

Streptococcus dysgalacticae 

Streptococcus mutans 

Streptococcus oralis 

Streptococcus pyogenes 

Streptococcus salivarius 

Streptococcus sanguinis 

Ureaplasma urealyticum 

Results: 

No positive signals in any of the tested reference strains were observed. 

Specificity based on the tested reference strains: 100 % 

33

26 carbapenem resistant, genetically characterized strains were used to test the 

sensitivity of the hyplex ® SuperBug ID system. 

Species Strain-Nr. Source Gene variant NDM-1 OXA-48 KPC VIM IMP 


Pseudomonas aeruginosa AV-65 Siena a IMP-13 - - - - +++ 

Pseudomonas putida VA-758/00 Siena a IMP-12 - - - - ++ 

Pseudomonas aeruginosa 101/1477 Siena a IMP-1 - - - - +++ 


Acinetobacter baumannii ACX 54/97 Siena a IMP-2 - - - - +++ 





Pseudomonas aeruginosa 060907- 

3147 

München c VIM-2 - - - +++ - 










Acinetobacter baumannii 65FFC Coimbra f IMP-5 - - - - +++ 

Klebsiella pneumoniae Kp1239 Westmed h IMP-4 - - - - +++ 

Salmonella cubana AM04707 Athen d KPC-2 - - +++ - - 

Klebsiella pneumoniae 375/08 Wernigerode g KPC-3 - - +++ - - 

Klebsiella pneumoniae 238/09 Wernigerode g OXA-48 - +++ - - - 

Escherichia coli 02/10 Wernigerode g NDM-1 +++ - - - - 

a kindly provided by Prof. Rossolini, University of Siena 

b kindly provided by Prof. Gniadkowski, National Institute of Public Health, Warsaw 

c 

kindly provided by Prof. Bauernfeind, MICOER, Munich 

d kindly provided by Dr. Miriagou, Hellenic Pasteur Institute, Athens 

e kindly provided by Dr. Samuelsen, University Hospital of North Norway, Tromsø 

f kindly provided by Dr. da Silva, University of Coimbra 

g 

kindly provided by Dr. Pfeiffer, RKI Wernigerode 

h 

kindly provided by Prof. Dr. Irdell, Westmead Hospital, Australia 

34

15.2 Clinical evaluation: 

Result: 

Sensitivity based on the tested reference strains: 100 % 

A) During a study at the „Institut für Medizinische Mikrobiologie des Universitätsklinikum 

Jena“ kindly supported by the „Robert-Koch-Institut, Zweigstelle Wernigerode, FG13 

Nosokomiale Infektionen“, 75 different strains (19 E. coli, 37 K. pneumoniae, 7 K. 

oxytoca, 4 E. cloacae, 7 Ps. aeruginosa und 1 A. baumannii) were examined with the 

hyplex ® SuperBug ID. In comparison to reference molecularbiological examinations of 

the two institutes following data were obtained: 

Reference PCRs 

VIM 

pos. 

IMP 

pos. 


KPC 

pos. 

OXA-48 

pos. 

NDM-1 

pos. 

negative 

VIM positive 10 0 0 0 0 0 10 

IMP positive 0 2 0 0 0 0 2 

KPC positive 0 0 5 0 0 0 5 

OXA-48 positive 0 0 0 4 0 0 4 

NDM-1 positive 0 0 0 0 1 0 1 

negative 0 0 0 0 0 53 53 

Sum 10 2 5 4 1 53 75 

Sum 

Result: 

Sensitivity and specificity based on the tested reference strains: 100 % 

B) During a study conducted by three hospitals in Athens, Greece (Evangelismos, 

Geniko Kratiko, Laiko) coordinated by Dr. V. Miriagou (Hellenic Pasteur Institute) a total 

of 90 positive blood culture bottles as well as 236 further clinical samples (60 Urine, 91 

Wound swabs and 85 Tracheal secretions) were microbiological examinated. Following 

results, in comparison to the hyplex ® MBL ID system, were obtained: 

Urine samples, Wound swabs 

and Tracheal secretions 

Microbiological 

result 


result 

hyplex ® MBL 

ID positive 

(VIM) 

hyplex ® MBL 

ID negative 

Total 

positive 53 1 54 

negative 5 177 182 

Total 58 178 236 

Blood cultures 

Total 


result 

positive 19 0 19 


result 

negative 0 71 71 

Total 19 71 90 

35

13. Da Silva GJ, Correia M, Vital C, et al. Molecular characterization of blaIMP-5, a new integron-borne 

metallo-ß-lactamase gene from an Acinetobacter baumannii nosocomial isolate in Portugal. 

FEMSMicrobiol Lett 2002;215:33–39. 

14. Henrichfreise B, Wiegand I, Sherwood KJ, Wiedemann B. Detection of VIM-2 metallo-ß-lactamase in 

Pseudomonas aeruginosa from Germany. Antimicrob Agents Chemother 2005;49:1668–1669. 

15. Tysall L, Stockdale MW, Chadwick PR, et al. IMP-1 carbapenemase detected in an Acinetobacter 

clinical isolate from the UK. J Antimicrob Chemother 2002;49:217–218. 

16. Castanheira M, Toleman MA, Jones RN, Schmidt FJ, Walsh TR. Molecular characterization of a ß- 

lactamase gene, blaGIM-1, encoding a new subclass of metallo-ß-lactamase. Antimicrob Agents 

Chemother 2004;48:4654–4561. 

17. Pagani L, Colinon C, Migliavacca R, et al. Nosocomial outbreak caused by multidrug-resistant 

Pseudomonas aeruginosa producing IMP-13 metallo-ß-lactamase. J Clin Microbiol 2005;43:3824– 

3828. 

18. Kassis-Chikhani N, Decre D, Gautier V, et al. First outbreak of multidrug-resistant Klebsiella 

pneumoniae carrying blaVIM-1 and blaSHV-5 in a French university hospital. J Antimicrob Chemother 

2006;57:142–145. 

19. Walsh TR, Toleman MA, Poirel L, Nordmann P. Metallo-ß-lactamases: the quiet before the storm? 

Clin Microbiol Rev 2005;18:306–325. 

20. Rossolini GM. Acquired metallo-ß-lactamases: an increasing clinical threat. Clin Infect Dis 

2005;41:1557–1558. 

21. Giakkoupi P, Tzouvelekis LS, Daikos GL, et al. Discrepancies and interpretation problems in 

susceptibility testing of VIM-1-producing Klebsiella pneumoniae isolates. J Clin Microbiol 

2005;43:494–496. 

22. Luzzaro F, Docquier JD, Colinon C, et al. Emergence in Klebsiella pneumoniae and Enterobacter 

cloacae clinical isolates of the VIM-4 metallo-ß-lactamase encoded by a conjugative plasmid. 

Antimicrob Agents Chemother 2004;48:648–650. 

23. Peleg AY, Franklin C, Bell J, Spelman DW. Emergence of IMP-4 metallo-ß-lactamase in a clinical 

isolate from Australia. J Antimicrob Chemother 2004;54:699–700. 

24. Crespo MP, Woodford N, Sinclair A, et al. Outbreak of carbapenemresistant Pseudomonas 

aeruginosa producing VIM-8, a novel metallo-ß-lactamase, in a tertiary care center in Cali, Colombia. 

J Clin Microbiol 2004;42:5094–5101. 

25. Li J, Nation RL, Turnidge JD, et al. Colistin: the re-emerging antibiotic for multidrug-resistant Gramnegative 

bacterial infections. Lancet Infect Dis 2006;6:589–601. 

26. Thiolas A, Bollet C, La Scola B, Raoult D, Pages JM. Successive emergence of Enterobacter 

aerogenes strains resistant to imipenem and colistin in a patient. Antimicrob Agents Chemother 

2005;49:1354–1358. 

27. Poirel L, Héritier C, Tolün V, Nordmann P. Emergence of oxacillinase-mediated resistance to 

imipenem in Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 2004 Jan;48(1):15-22. 

28. Carrër A, Poirel L, Yilmaz M, Akan OA, Feriha C, Cuzon G, Matar G, Honderlick P, Nordmann P. 

Spread of OXA-48-encoding plasmid in Turkey and beyond. Antimicrob Agents Chemother. 2010 

Mar;54(3): 1369-73. 

29. Yong D, Toleman MA, Giske CG, Cho HS, Sundman K, Lee K, Walsh TR. Characterization of a new 

metallo-beta-lactamase gene, bla(NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a 

unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob Agents 

Chemother. 2009 Dec;53(12):5046-54. 

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hyplex SuperBug ID

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