学位論文要旨 - 渕脇雄介

分 子 認 識 用 人 工 レセプターを 用 いた 6-chloro-N,N-diethyl-1,3,5-
triazine-2,4-diamine (CAT) 電 気 化 学 センサーシステムの 開 発
Development of an electrochemical sensor system for 6-chloro-N,N-diethyl-1,3,5-
triazine-2,4-diamine (CAT) utilizing molecularly imprinted artificial receptor
04D5503 渕 脇 雄 介
指 導 教 員 久 保 いづみ
SYNOPSIS
CAT has been used as one of the most popular herbicides, and is reported to be an endocrine disrupting chemical.
We aimed to develop a CAT-sensing system based on biomimetic receptor of molecularly imprinted polymer for
CAT (CAT-MIP) and electrochemical determination of CAT. Molecularly imprinted polymer for CAT was prepared
by using methacrylic acid (MAA) as a functional monomer and ethylene glycol dimethacrylate (EDMA) as a
cross-linker. The CAT-MIP prepared with the ratio of these monomers (CAT : MAA : EDMA = 1 : 7.5 : 20) showed
most selective rebinding to CAT. The binding amount of CAT to CAT-MIP was 24 % more than atrazine and 72 %
more than propazine. CAT sensor system was composed of the CAT-MIP packed column and a voltammetry
analyzer. The electrochemical reduction of CAT was investigated by an amalgamated gold electrode, which was
alloyed with mercury. The detection procedure is composed of a solid phase extraction with the CAT-MIP column
and electrochemical determination of CAT in the eluent from the column. Reductive current of CAT depended on
the concentration of CAT up to 30 μM with the system. CAT was detected selectively in aqueous samples by
washing non-specifically adsorbed contaminant from the column with dichloromethane. Fifteen nM of CAT, as
legally regulated in Japan, was detected with the system.
Keywords: CAT; molecularly imprinted polymer (MIP); amalgamated electrode; reductive current; solid phase
extraction (SPE)
1. 緒 言
CAT はイネ 科 及 び 広 葉 の 雑 草 に 有 効 な 塩 化 トリアジ
ン 系 除 草 剤 として、 世 界 中 で 広 く 使 用 されており、 内 分
泌 攪 乱 作 用 がある 事 が 疑 われている。 環 境 中 では 主 に 土
壌 中 や 水 中 に 存 在 し、それらが 周 りに 流 出 及 び 蒸 発 する
事 によって、 環 境 中 に 広 がる 事 が 懸 念 されている 1 。 数
ppb の CAT が 水 道 水 中 へ 混 入 した 場 合 、その 水 道 水 は 有
害 であるが、 一 方 で、 水 中 に 混 入 した CAT を 通 常 の 浄
水 装 置 で 除 去 する 事 は 困 難 である。そこで、 水 中 に 混 入
している 低 濃 度 の CAT を 検 出 できるセンサーや 分 析 シ
ステムの 開 発 が 望 まれている。
CAT に 対 するセンサーの 報 告 は 少 なく、ほとんどは 抗
体 を 用 いた 免 疫 センサーである 2,3 。それら 免 疫 センサー
は 数 ppb~ 数 ppm 程 度 の 検 出 感 度 であるが、 生 体 分 子 の
抗 体 は、 調 製 の 煩 雑 さ、 高 価 格 、 化 学 的 安 定 性 が 乏 しい
という 欠 点 から、センサー 開 発 を 妨 げる 要 因 となってい
る。これらの 問 題 を 解 決 するため、 天 然 の 生 体 分 子 に 代
わる 人 工 レセプターとして、モレキュラーインプリント
ポリマー(MIP)が 注 目 を 集 めている。MIP は、 任 意 の
鋳 型 物 質 の 共 存 下 で 合 成 される 事 により、その 物 質 に 対
する 特 異 結 合 サイトを 担 持 された 合 成 高 分 子 である。
MIP は 生 体 分 子 に 比 べ、 合 成 法 がシンプルで、 低 コスト
かつ 化 学 的 安 定 性 に 優 れており、センサーレセプターと
しての 生 体 分 子 の 欠 点 を 解 決 する。
本 研 究 は、この MIP を 用 いて CAT を 検 出 するセンサ
ーの 開 発 を 目 的 とした。センサーレセプターとして 用 い
る、CAT に 対 する MIP (CAT-MIP) 合 成 はこれまで 報 告 が
無 いため、 構 造 式 の 類 似 した atrazine に 対 する MIP の 合
成 を 参 考 に 4 、CAT-MIP 合 成 の 検 討 を 行 った 5 。
CAT に 対 するセンサーの 検 出 部 に、 装 置 の 小 型 化 と 低
価 格 化 が 可 能 な、 電 気 化 学 検 出 を 行 う 事 とした。 塩 化 ト
リアジン 系 除 草 剤 の 電 気 化 学 反 応 は、 滴 下 水 銀 電 極 を 使
ってポーラログラフィー 法 で、 還 元 電 流 を 検 出 した 報 告
がある 6 。しかし、 滴 下 水 銀 電 極 はセンサーの 検 出 装 置
として 使 用 する 事 が 難 しいため、 本 研 究 では 金 電 極 表 面
に 水 銀 を 合 金 化 させたアマルガム 電 極 を 作 製 し、 検 出 装
置 としての 使 用 を 検 討 した。
CAT-MIP とアマルガム 電 極 を 組 み 合 わせた CAT セン
サーの 構 築 は、CAT-MIP を 充 填 したカラム(CAT-MIP)
を 分 子 認 識 素 子 として 使 い、この CAT-MIP カラムから
R 1
N R 2
N
X
1. R 1 =C 2 H 5 , R 2 = C 2 H 5 , X=Cl
2. R 1 =C 2 H 5 , R 2 =CH(CH 3 ) 2 , X=Cl
3. R 1 =CH(CH 3 ) 2 , R 2 = CH(CH 3 ) 2 , X=Cl
Fig. 1 Structures of 1,3,5-triazine derivatives used
in the study: 1, CAT; 2, Atrazine; and 3, Propazine
N

溶 離 した 液 を 電 気 化 学 測 定 する 事 によって 検 出 を 行 っ
た。CAT に 対 する 選 択 性 評 価 は、CAT と 構 造 式 が 類 似 し
た atrazine と propazine を 用 い(Fig. 1)、それぞれの 検 出 応
答 を 比 較 し 検 討 した。また、 法 律 で 規 制 されている 環 境
基 準 濃 度 の CAT を 検 出 するための 検 討 も 行 った。
2. CAT-MIP
2.1 CAT-MIP の 合 成
CAT-MIP の 合 成 は、 鋳 型 の CAT を 含 む 重 合 溶 媒 の
DMF 中 へ、 機 能 性 モノマーの Methacrylic acid (MAA)を
加 える 事 で、CAT と MAA を 水 素 結 合 させ、 次 に 架 橋 性
モノマーの Ethylene dimethacrylate (EDMA)と 重 合 開 始 剤
の α,α’-Azobisisobutyronitrile (AIBN) を 混 合 し、4 ℃で 一
定 時 間 紫 外 線 照 射 し 重 合 した。ポリマー 内 に 存 在 する
CAT は、メタノール/ 酢 酸 (3:7 v/v)で 除 去 した (Fgi. 2)。
リファレンスポリマー (Non-MIP)は、 鋳 型 の CAT を 加
えず、 同 じ 方 法 により 合 成 した。 鋳 型 CAT を 除 去 した
CAT-MIP 粒 子 10 mg を CAT 溶 液 に 加 え、 一 定 時 間 攪 拌
させて、CAT の 再 結 合 ( 吸 着 ) 実 験 を 行 った。 吸 着 させる
前 後 の CAT 溶 液 の 濃 度 変 化 を、 吸 光 度 測 定 する 事 によ
り CAT-MIP への 吸 着 量 を 求 めた。
CAT
CAT-MIP
Formation of
Hydrogen Bond
UV irradiation, 4℃
Removal of
simazine
Methanol /
Acetic acid
solution
Fig. 2 Preparation procedure of CAT-MIP
2.2 CAT-MIP の 最 適 配 合 成 分 比 率 の 検 討
CAT-MIP に 高 い 選 択 性 能 を 賦 与 するためには、 重 合
溶 媒 中 で CAT と MAA が、 安 定 な 複 合 体 を 形 成 する 事
が 重 要 である。そこで NMR を 用 いて、DMF 中 の CAT
へ MAA を 滴 定 し、CAT のアミノ 基 と、MAA のカルボ
キシル 基 のケミカルシフト 値 の 変 化 を 調 べ、 複 合 体 形 成
の 検 討 を 行 った (Fig. 3)。MAA/CAT が 1 から 7 まで 増
加 するにつれ、CAT のアミノ 基 と MAA のカルボキシル
基 のケミカルシフト 値 が 徐 々に 変 化 し 2/4、それ 以 上
はほとんど 変 化 しなかった。この 事 から、1 分 子 の CAT
に 対 し 7 分 子 の MAA が 相 互 作 用 し 複 合 体 を 形 成 する 事
が 示 唆 された。
また 選 択 性 のある CAT-MIP を 合 成 するため、 各 モノ
マーの 最 適 な 配 合 成 分 比 を 調 べた (Fig. 4)。DMF 溶 媒 中
での、CAT-MIP と Non-MIP に 対 する CAT の 結 合 量 の 差
が 大 きい 程 、CAT が MIP に 特 異 的 結 合 する 割 合 が 大 き
いと 考 えられる。MAA / CAT を 1~15、EDMA/ CAT を
ppm
ppm
Relative amount of CAT
bound to MIP (%)
7.68
7.67
7.66
7.65
7.64
7.63
7.62
11.48
11.47
11.46
11.45
14
12
10
8
6
4
2
0
0 2 4 6 8 10
MAA / CAT
CAT-MIP
Non-MIP
(a)
(b)
11.44
0 2 4 6 8 10
MAA / CAT
Fig. 3 Effect of the MAA ratio to CAT on the chemical
shift of amino protons of CAT (a) and carboxyl protons
of MAA (b) of 1H-NMR in DMF-d7
1 2.5 5.0 7.5 10
MAA / CAT polymer ratio
Fig. 4 The effect of the ratio of MAA / CAT in the
polymerization to CAT binding
20~40 の 間 で、それぞれ CAT-MIP と Non-MIP への 結 合
量 を 比 較 検 討 した。その 結 果 、MAA / CAT が 7.5、EDMA
/ CAT が 20 の 時 、CAT-MIP と Non-MIP の CAT 結 合 量 の
差 が 最 大 になった。 従 って、CAT-MIP は、CAT : MAA :
EDMA = 1 : 7.5 : 20 が 最 適 な 配 合 比 である 事 が 示 された。
2.3 CAT-MIP の 結 合 特 性
CAT-MIP への CAT の 最 大 結 合 量 と 解 離 定 数 を 求 めるた
め、DMF 中 での 結 合 特 性 を Scatchard 分 析 により 検 討 を 行
った。 勾 配 と 横 軸 との 接 点 を、 最 大 結 合 量 と 考 えた。 傾 きの
異 なる 2 つの 直 線 成 分 が 認 められ、この 事 から CAT-MIP は
2 種 類 の 結 合 性 を 有 する 事 が 示 唆 された。それぞれの 直 線
から 求 められた 解 離 定 数 は、25 μM と 120 μM であった。 最
大 結 合 量 は、1.5 μmol / g と 3.0 μmol / g となった。
2.4 水 溶 液 中 での CAT-MIP 結 合 特 性
CAT は 一 般 に 自 然 環 境 下 では 水 溶 液 中 にある。そこで、
異 なる pH の 水 溶 液 中 で CAT-MIP に 対 する CAT の 結 合
量 の 変 化 を 調 べたところ、pH が 7 より 高 くなると、CAT
の 結 合 量 が 大 きく 減 少 した。CAT の pKa は 2 程 度 のた
め、pH7 で CAT のプロトネーションはなく、MAA と
イオン 結 合 はしない。 従 って、CAT の 結 合 量 の 減 少 は

MAA 由 来 のカルボキシル 基 が 解 離 して H + を 放 出 し、 結
果 として CAT と 水 素 結 合 できなくなったために 考 えた
(Fig. 5)。そこで、CAT-MIP を 水 溶 液 中 に 混 入 する 前 と
後 での pH 変 化 を 調 べる 事 で、カルボキシル 基 からの H +
の 解 離 を 調 べたところ、 水 溶 液 の pH が 7 より 高 い 時 、
CAT-MIP 混 入 による pH 減 少 量 が 大 きくなる 事 が 分 かっ
た。この 事 は、MIP のカルボキシル 基 の 解 離 が、pH7 以
上 で 大 きく 起 こっている 事 を 示 す。よって、 高 い pH の
水 溶 液 中 では、CAT は MAA のカルボキシル 基 と 水 素 結
合 出 来 なくなるため、 結 合 実 験 は pH7 以 下 の 水 溶 液 中 で
行 う 事 とした。
Binding
Increasing of pH
Decreasing of pH
No binding
Fig. 5 Schematic diagram the effect of pH on
CAT-MIP – template binding.
2.5 CAT-MIP の 選 択 性
CAT-MIP に 対 する CAT 吸 着 量 を 100%とし、CAT-MIP
と Non-MIP に 対 する atrazine と propazine の 吸 着 量 を 比
較 した 結 果 、CAT-MIP に 対 する CAT の 吸 着 量 は、CAT
と 構 造 式 が 類 似 したアトラジンより 24%、プロパジンよ
り 72% 多 かった。この 事 から、CAT-MIP は CAT を 他 の
トリアジン 系 化 合 物 より 選 択 的 に 結 合 させる 事 が 示 さ
れた。 一 方 、Non-MIP に 対 する 吸 着 量 はプロパジンが 最
も 多 かった。プロパジンの 分 子 量 は 他 の2つの 除 草 剤 よ
り 大 きいため、Non-MIP の 網 目 構 造 に 吸 着 し 易 かったた
めであると 考 えた。
3. CAT の 電 気 化 学 特 性
塩 化 トリアジン 系 除 草 剤 の 電 気 化 学 活 性 は、 滴 下 水 銀
電 極 を 用 いたポーラログラフィー 法 で、 負 電 位 側 に 還 元
電 流 応 答 がある 事 が 報 告 されている。そこでアマルガム
電 極 を 作 製 し CV 法 で、 負 電 位 側 での CAT 還 元 電 流 応 答
を 調 べたところ、-1.02 V 付 近 に CAT 濃 度 に 対 応 した 還
元 電 流 の 増 加 が 観 察 された (Fig. 6)。よって、アマルガ
ム 電 極 で CAT を 測 定 出 来 る 事 がわかった。
CAT 還 元 電 流 応 答 に 対 する pH の 影 響 を、pH 2.0~7.0
の 範 囲 で 調 べた。これらの pH の 中 で、pH 3.0 における
CAT の 還 元 電 流 応 答 が 最 大 であった。 一 方 、pH が 3.0
より 増 加 するにつれ、 電 流 応 答 は 減 少 した。CAT の 電 気
化 学 還 元 反 応 は、Higuera et al 6 によって、 溶 液 中 のプロ
トンが CAT にプロトネーションして 起 こる 事 が 報 告 さ
れている。 従 って CAT 電 気 化 学 還 元 反 応 は、 測 定 溶 液
のプロトン 濃 度 が 高 い 方 が 望 ましい。 結 果 として、 溶 液
の pH が 3 より 低 くなるにつれ、CAT 還 元 電 流 は 小 さく
なったと 考 えられる。また、pH 2.0 における 還 元 電 流 は、
pH 3.0 より 低 くなるが、これは CAT が 強 い 酸 性 条 件 下
で 分 解 するためであると 考 えられる。
Current (µA)
-1.0
-0.5
30 µM
20 µM
10 µM
0 µM
0
-1.15 -1.10 -1.05 -1.00 -0.95 -0.90
Potential (V)
Fig. 6 Cyclic voltamograms in 0.1 M KCl at a scan rate
of 100 mV s -1 for amalgamated gold electrode.
4. CAT 電 気 化 学 センサーシステム
4.1 CAT の 検 出 応 答 の 確 認
CAT-MIP カラムとアマルガム 電 極 を 組 み 合 せて、CAT
電 気 化 学 センサーシステムを 構 築 した。まずサンプル 溶
液 をカラムに 送 液 し、CAT-MIP に 吸 着 させる。 次 に、 吸
着 している 物 質 を 取 り 出 すため、 溶 離 液 として 1 ml の
メタノールを 送 液 し、 溶 離 した 液 は、9 ml の 0.1M KCl
溶 液 を 混 合 し 測 定 する。
CAT が、センサーシステムによって 検 出 できるかどう
か 調 べるため、CAT-MIP カラムへ 送 液 する 前 の CAT 溶
液 の 還 元 電 流 応 答 と、 送 液 した 後 の 電 流 応 答 を、 比 較 し
たところ、それらの 電 流 応 答 は 同 程 度 の 値 であった。こ
の 事 から、 構 築 したセンサーシステムが、CAT を 認 識 し、
検 出 できる 事 が 分 かった。そして、30 µM 以 下 で CAT
濃 度 と 応 答 電 流 に 直 線 関 係 が 得 られた (Fig. 7)。
Current (µA)
-0.9
-0.8
-0.7
-0.6
-0.5
-0.4
-0.3
-0.2
-0.1
0
0 10 20 30
CAT (µM)
Fig. 7 Calibration curve of CAT in eluting solution.
Current differences at –1.02 V in 0.1 M KCl (pH 3.0)
were plotted.
4.2 選 択 的 検 出 方 法 の 検 討
選 択 性 評 価 は、atrazine と propazine の 検 出 応 答 と 比 較
する 事 により 行 った。atrazine と propazine も 電 気 化 学 活
性 があり、CAT と 同 じようにアマルガム 電 極 で 還 元 電 流
応 答 を 検 出 できる。CAT-MIP カラムに 送 液 する 前 は、
propazine の 電 流 応 答 が 最 大 であったが、 溶 離 した 液 の 電
流 応 答 は、CAT が 最 大 になった(Table 1)。この 事 から、
CAT をより 選 択 的 に 認 識 し 検 出 出 来 る 事 が 分 かった。 一
方 で、atrazine と propazine もある 程 度 検 出 されたが、こ

Table 1 Response of the eluent from the CAT-MIP
column to that of loading sample (CAT, atrazine,
propazine : 10 µM)
CAT Atrazine Propazine
Loading
solution (µA)
-0.480 -0.507 -0.521
Eluting
-0.411
-0.352
-0.301
solution (µA)
(±0.031)
(±0.025)
(±0.033)
れは 構 造 式 が 類 似 しているため、 幾 らかは 結 合 サイトへ
結 合 してしまうか、ポリマー 内 の 網 目 構 造 に 非 特 異 的 に
吸 着 したものが、 検 出 されたためであると 考 えた。
一 般 に CAT は、 環 境 中 では 夾 雑 物 を 含 む 水 溶 液 中 に
存 在 するため、 夾 雑 物 を 含 む 水 溶 液 中 から CAT だけを
検 出 する 事 が 重 要 である。そこで、CAT をより 選 択 的 に
検 出 する 方 法 を 考 察 した。Fig. 8 に 示 すこの 方 法 の 原 理
は、 最 初 に CAT と atarazine と propazine を 含 む 混 合 水 溶
液 を、CAT-MIP へ 流 す。この 時 CAT のみが 結 合 サイト
に 特 異 的 に 結 合 する。 次 に、 低 極 性 溶 媒 であるジクロロ
メタンに 切 り 替 え、 水 素 結 合 ベースの 特 異 的 吸 着 を 保 持
しつつ、 疎 水 性 相 互 作 用 によって 網 目 構 造 に 非 特 異 的 吸
着 している atrazine や propazine のような 夾 雑 物 を 洗 い 流
す。 最 後 に、 水 素 結 合 を 解 離 させる 極 性 溶 媒 のメタノー
ルで、CAT を 回 収 する。
ジクロロメタンによる 抽 出 効 果 を 調 べるため、まず、
それぞれ 10 µM の CAT、atrazine、propazine 水 溶 液 を、
ジクロロメタン 洗 浄 有 りと 無 しの 場 合 で、 比 較 検 討 した。
この 結 果 、CAT はジクロロメタン 洗 浄 有 りと 無 しで、 電
流 応 答 にほとんど 差 はなかったが、atrazine と propazine
は、ジクロロメタン 洗 浄 すると、 電 流 応 答 が 見 られなく
なった。これは、atrazine と propzine の CAT-MIP への 疎
水 性 相 互 作 用 による 非 特 異 的 吸 着 が、ジクロロメタン 洗
浄 で 取 り 除 かれた 事 を 示 す。そこで、CAT と 夾 雑 物 から
成 る 混 合 水 溶 液 (1 ml 中 にそれぞれ 10 nmol 溶 解 )と、
CAT を 含 まない atrazine, propazine だけの 混 合 水 溶 液 の、
電 流 応 答 を 比 較 した (Table 2)。 結 果 として、CAT を 含 む
混 合 水 溶 液 は CAT 濃 度 に 対 応 した 電 流 応 答 が 確 認 され
たのに 対 し、 夾 雑 物 だけの 混 合 水 溶 液 の 電 流 応 答 はバッ
クグラウンドと 変 わらなかった。この 事 から、CAT と 構
造 式 が 類 似 し 電 気 化 学 活 性 がある 物 質 が 水 中 にあって
も、CAT を 選 択 的 に 検 出 できる 事 が 示 唆 された。
4.3 環 境 基 準 濃 度 の CAT の 検 出
日 本 での CAT に 対 する 水 質 環 境 基 準 値 は 3 ppb である。
そのような 低 濃 度 の CAT 検 出 を 行 う 事 は 重 要 である。
10 µM で 10 ml の CAT 溶 液 を、 多 量 の 水 溶 媒 で 希 釈 する
事 により、3 ppb の CAT 溶 液 を 調 製 した。 先 の 抽 出 手 順
により 検 出 を 行 ったところ、 予 想 される 還 元 電 流 応 答 値
の、91.2%の 電 流 応 答 が 得 られた。 送 液 する 溶 媒 量 が 増
えた 事 で、 電 流 応 答 が 僅 かに 減 少 したが、3 ppb の CAT
を、 認 識 し 検 出 できる 事 がわかった。
CAT + Contaminants
Air CH 2 Cl 2
1
Waste
2 3
4
Waste
(contaminants)
Methanol
Extract
(CAT)
Fig. 8 The procedure of the solid-phase extraction : 1.
loading of aqueous sample solution; 2. air passage for
drying; 3. washing with dichloromethane; 4. extraction
with methanol.
Table 2 Comparison of the sensor response to mixed
sample solutions
Sample solution
Sensor response (µA)
0.1 M KCl solvent
Atrazine + Propazine
-0.246 ± 0.011
-0.257 ± 0.010
CAT + Atrazine + Propazine -0.534 ± 0.084
5. 結 論
CAT に 対 する 分 子 認 識 人 工 レセプターとして、CAT
を 鋳 型 にした CAT-MIP を 合 成 した。CAT:MAA が 1:
7.5 の 時 、CAT-MIP は CAT を 特 異 的 に 結 合 させるのに 最
適 な 配 合 成 分 比 となった。また CAT-MIP は、 構 造 式 の
類 似 した atrazine や propazine といった 除 草 剤 より、CAT
に 対 して 選 択 性 を 示 した。CAT の 電 気 化 学 応 答 は、アマ
ルガム 電 極 によって 濃 度 に 依 存 した 還 元 電 流 値 を 得 ら
れる 事 が 分 かった。CAT-MIP カラムとアマルガム 電 極 を
組 み 合 わせる 事 で、CAT を 認 識 し 検 出 する、センサーシ
ステムの 構 築 が 可 能 であった。そのセンサーシステムは、
不 純 物 を 含 む 混 合 水 溶 液 から、CAT を 選 択 的 に 検 出 でき、
環 境 基 準 濃 度 の CAT も 検 出 可 能 であった。このように、
CAT-MIP とアマルガム 電 極 を 用 いたセンサーシステム
は、 十 分 な 選 択 性 と 低 濃 度 測 定 が 可 能 である 事 が 示 され
た。また、このセンサーシステムは 簡 易 な 構 成 で 安 定 性
があるため、 原 理 的 にさらなる 小 型 化 、 低 価 格 化 を 実 現
する 事 が 可 能 であり、 今 後 更 なる 応 用 が 期 待 出 来 る。
参 考 文 献
1. M.T. Strandberg and J. J. Scott-Fordsmand, Sci Total
Environ, 296,117 (2002)
2. A. Brecht, B. Drapp, J. Piehler, G. Gauglitz, B. J. Luff, J. S.
Wilkinson, J. Ingenhoff, Sens. Actuators B., 277, 38 (1997)
3. N. F. Starodub, B. B. Dzantiev, V. M. Starodub, A. V.
Zherdev, Anal. Chim. Acta., 424, 37, (2000)
4. J. Matsui, Y. Miyoshi, O. Doblhoff-Dier and T. Takeuchi,
Anal Chem, 67, 4404 (1995)
5. Y. Fuchiwaki, A. Shimizu and I. Kubo, Anal Sci, 23, 49,
(2007)
6. M.J. Higuera, M.R. Montoya, R.M. Galvin, M.J.R.
Rodriguez, J Electroanal Chem, 474, 174, (1999)