Aspergillus 由来のユニークな酵素に関する触媒化学的研究

Aspergilus 由 来 のユニークな 酵 素 に 関 する 触 媒 化 学 的 研 究
Molecular and enzymatic studies of unique enzymes from Aspergillus
03D5502 多 田 羅 洋 太
指 導 教 員 一 島 英 治
SYNOPSIS
A. oryzae pro-tyrosinase (pro-TY) has a unique feature that the proenzyme is activated under condition of pH
3.0. It was indicated that the homotetramer of pro-TY irreversibly dissociates to dimers at pH 3.0, and then the
binuclear copper active center is exposed. It was suggested that the intermolecular disulfide bridge was formed
between the subunits of the acid-activated tyrosinase (acid-TY). Cys108 residue was indicated to be involved in
the disulfide bond. The retention of the dimer of the acid-TY by the disulfide bridge was essential for the
activity. To investigate the catalytic mechanism of A. saitoi 1,2--mannosidase, the seven conserved acidic
amino acids were studied. Glu124 was estimated to be an acid catalyst. Negative charges at position Asp269 and
Glu411 were essential for the activity. It was suggested that each of Glu273, Glu414 and Glu474 is a binding
site of a substrate. Ca 2+ is not required for the activity. The catalytic mechanism of Ca 2+ -independent
1,2--mannosidase may deviate from the typical glycosyl hydrolases. A. saitoi 1,2--mannosidase contains
three conserved cysteines. Cys334 and Cys363 were involved in a disulfide bond, and Cys443 contained a free
thiol group. The cysteines were not essential for the activity. It was demonstrated that Cys334 and Cys363
formed a disulfide bond and the Cys443 was involved in a hydrophobic interaction to stabilize the enzyme.
Key words: Aspergillus oryzae, tyrosinase, acid activation, quaternary structure, A. saitoi, 1,2--mannosidase,
catalytic mechanism, calcium, disulfide bond, thiol group, hydrophobic interaction, site-directed mutagenesis.
1. 緒 言
麴 菌 (Aspergillus oryzae)は 日 本 酒 や 醤 油 、 味 噌 、 味 醂 と
いった 日 本 のバイオ 産 業 の 主 役 となる 微 生 物 である[1]。 麴
菌 と 近 縁 種 である 黒 麴 菌 (A. saitoi)は 焼 酎 や 酢 の 醸 造 に
用 いられている。これらの 菌 の 安 全 性 と 食 に 与 える 高 い 機
能 性 、 嗜 好 性 は、 日 本 のみならず 世 界 で 注 目 されている。
麴 菌 は 日 本 人 が 古 来 より 親 しんでいる 菌 であり、まさに 日 本
の「 国 菌 」と 言 える[2]。
チロシナーゼは 生 体 防 御 に 関 わるメラニンを 生 合 成 する
鍵 酵 素 である。 糸 状 菌 におけるメラニンの 役 割 としては、 器
官 の 分 化 や 胞 子 形 成 、 病 原 性 糸 状 菌 の 毒 性 、 組 織 の 損 傷
に 対 する 防 御 があげられる。チロシナーゼは 日 本 酒 の 醸 造
において、 日 本 酒 を 褐 色 化 してしまうため 嫌 われている 酵
素 である[3]。A. oryzae チロシナーゼは pH 3.0 において 酵
素 が 活 性 化 するという 特 異 的 な 性 質 を 持 つ[4]。 本 酵 素 の 四
次 構 造 はホモ 四 量 体 であり、 活 性 中 心 はサブユニットあたり
2 つの 銅 原 子 である。このような 複 雑 な 構 造 をした 麴 菌 チロ
シナーゼの 活 性 化 機 構 の 解 明 を 目 指 した。
糖 タンパク 質 のアスパラギン 結 合 型 糖 鎖 は 細 胞 内 の 情 報
伝 達 機 能 を 持 つ[5]。1,2--マンノシダーゼは、 糖 タンパク 質
の 糖 鎖 プロセシングに 関 与 している 酵 素 である。 黒 麴 菌 A.
saitoi 由 来 1,2--マンノシダーゼのバイオテクノロジーにお
ける 利 用 としては 2 つ 挙 げられる[6]。 一 つは 高 マンノース 型
糖 鎖 の 構 造 解 析 における 利 用 であり[7]、もう 一 つは 糖 鎖 構
造 の 分 子 設 計 への 利 用 である[8]。
近 年 、 糸 状 菌 P. citrinum 1,2--mannosidase と 阻 害 剤 が 複
合 体 を 形 成 した X 線 結 晶 構 造 が 解 析 された[9]。 阻 害 剤 /
基 質 との 位 置 関 係 から、Glu122 (A. saitoi の 酵 素 では
Glu124)とAsp267 (Asp269)あるいは Glu409 (Glu411)の 2
残 基 が 触 媒 反 応 に 直 接 関 与 しうるアミノ 酸 残 基 であると 推 定
された。しかし、 詳 細 な 酵 素 化 学 的 解 析 は 行 われておらず、
それらの 残 基 の 役 割 は 実 験 的 に 明 らかとなっていない。ま
た Ca 2+ は 1,2--マンノシダーゼ 活 性 に 必 須 であることから、
Ca 2+ は 触 媒 反 応 に 関 与 している 可 能 性 があるとされている。
本 研 究 においては A. saitoi 1,2-α-マンノシダーゼに 保 存
されている 7 つの 酸 性 アミノ 酸 残 基 について 部 位 特 異 的 変
異 を 導 入 し、 変 異 酵 素 の 動 力 学 的 パラメーターの 測 定 から
酵 素 の 触 媒 アミノ 酸 残 基 の 同 定 を 行 う。
システインの 硫 黄 原 子 は 様 々な 酸 化 状 態 をとる。これによ
り、タンパク 質 の 安 定 性 や 金 属 結 合 、 触 媒 活 性 、 求 核 性 な
どといった 広 範 囲 にわたる 化 学 的 、 生 物 化 学 的 性 質 が 見 ら
れる[10]。システインはしばしばジスルフィド 結 合 を 形 成 する。
ジスルフィド 結 合 の 役 割 としては、 酵 素 活 性 や 酸 化 ダメージ
に 対 する 防 御 、タンパク 質 のフォールディングと 安 定 化 、 生
物 学 的 反 応 の 制 御 といったことがあげられる[11]。A. saitoi
1,2--マンノシダーゼは 3 つの 保 存 されたシステイン 残 基 を
持 つ(Csy334, Cys363, Cys443)。これらのシステイン 残 基 の
役 割 を 解 明 するために 部 位 特 異 的 変 異 と 熱 安 定 性 につい
て 調 べた。
2. A. oryzae チロシナーゼの 酸 活 性 化 機 構 の 解 明
pro-TY は pH 3.0 において 著 しい 活 性 化 がおこった。この
酸 活 性 化 の 過 程 は 20 分 間 でほぼ 完 了 した。 他 の 試 薬 など
による 活 性 化 の 有 無 を 調 べた 結 果 、SDS が 0.01%のとき 比
活 性 が acid-TY の 19%となりわずかな 活 性 化 が 見 られたが、
尿 素 やエタノール、アセトニトリル、NaCl、プロテアーゼ
(trypsin とchymotrypsin)による 活 性 化 は 見 られなかった。

Table 1
Determination of molecular mass by the gel-filtration chromatography.
Condition Molecular mass Quaternary structure Relative activity
(kDa) %
Pro-TY 266 Tetramer
Acid-TY 165 Dimer 100
Reduced a 68 Monomer N.D.
Oligo-C108A 380 Oligomer 1.3 b
Mono-C108A 68 Monomer N.D. b
a
The gel-filtration chromatography was performed in the presence of 2% -mercaptoethanol at pH 7.0.
b The mutant enzyme was acid-activated before the enzyme assay.
Fluorescence Fluorescence intensity ( )
( )
0mM
DTT
Cys82
☆
10 20 30 0 40 50 60 70 80
Time (min)
A ( ----- )
230
Fluorescence intensity
100
80
60
40
20
339 nm
346 nm
Fluorescence Fluorescence intensity ( )
( )
1mM
DTT
Cys108
☆
Cys82
☆
A (-----)
230
0
300 350 400 450
Emission Emission wavelength (nm)
(nm)
Fig. 1.
Fluorescence spectra of pro-TY ()
and acid-TY (----) with an excitation
wavelength of 295 nm.
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Time (min)
Fig. 2.
The reverse-phase HPLC of trypsin-digested tyrosinase
in the absence or presence of DTT.
acid-TY の SDS-PAGE を 行 った 結 果 、pro-TY と 分 子 質 量
に 変 化 は 見 られなかった。 混 入 したプロテアーゼによるプロ
セシングなどは 酸 活 性 化 に 関 与 しないと 言 える。
pro-TY とacid-TY をそれぞれ 0.1M EDTA で 処 理 し、 脱 塩
した 後 、 原 子 吸 光 でタンパク 質 あたりの 銅 原 子 濃 度 を 測 定
した。この 結 果 、pro-TY にはサブユニット1mol あたり2mol
の 銅 原 子 が 確 認 され、acid-TY には 銅 原 子 は 含 まれていな
かった。このことから 酸 活 性 化 により 構 造 が 変 化 して 活 性 中
心 が 露 出 したと 考 えられる。
ネイティヴ 状 態 におけるゲルろ 過 から、pro-TY と acid-TY
の 分 子 質 量 はそれぞれ、266kDa と165kDa であった (Table
1)。pro-TYは 四 量 体 で、acid-TYは 二 量 体 であることが 示 唆
された。 四 量 体 の pro-TY が pH 7.0 からpH 3.0 になったとき
二 量 体 に 解 離 し、 活 性 中 心 の 銅 原 子 が 露 出 すると 考 えられ
る。この 酸 性 条 件 、または SDS により 解 離 する 二 量 体 間 の
結 合 には 極 性 相 互 作 用 が 関 与 していると 考 えられる。
CD スペクトルの 解 析 からpro-TY とacid-TY の 二 次 構 造 に
大 きな 変 化 は 見 られなかったが、 三 次 構 造 に 大 きな 変 化 が
あった。またトリプトファン 蛍 光 スペクトルでは 酸 活 性 化 によ
りレッドシフト(339nm→346nm)と 蛍 光 強 度 の 減 少 が 見 られ
た (Fig. 1)。 疎 水 性 アミノ 酸 残 基 に 結 合 する 蛍 光 試 薬
8-anilino-1-naphthalene sulfonic acid (ANS)とpro-TY または
acid-TY を 反 応 させたところ、pro-TY では ANS の 結 合 はほ
とんど 見 られなかったが、acid-TY には ANS が 結 合 した。こ
れらの 結 果 から、 酸 活 性 化 により 三 次 構 造 に 顕 著 な 変 化 が
おき、これに 伴 って 疎 水 性 残 基 が 露 出 することが 示 された。
還 元 状 態 におけるゲルろ 過 では pro-TY は 68kDa となり、
単 量 体 であった (Table 1)。このことから、サブユニット 間 の
結 合 にジスルフィド 結 合 が 関 与 していることが 示 唆 された。
このジスルフィド 結 合 は 活 性 型 の acid-TY の 二 量 体 を 保 持
していると 考 えられる。
シ ス テ イ ン に 特 異 的 に 結 合 す る 蛍 光 試 薬
4-fluoro-7-sulfamoylbenzofurazan (ABD-F) を 用 い て 、
pro-TY のトリプシン 断 片 から 遊 離 システインを 含 むペプチド
を 逆 相 HPLC により 分 取 した。このアミノ 酸 配 列 を 決 定 したと
ころ、このペプチドは Cys82 を 含 む 配 列 であった。Cys82 の
みが 遊 離 システインであることがわかった (Fig. 1)。1mM
DTT 存 在 下 において 同 様 の 実 験 を 行 った 結 果 、Cys82 と
Cys108 をそれぞれ 含 むペプチドが 同 定 された (Fig. 2)。
Cys82 は 銅 原 子 の 配 位 子 の 1 つであることが 報 告 されてい
る[12]。Cys108 とジスルフィド 結 合 の 対 となるシステインが 見
られないことから、Cys108 は 他 のサブユニットのCys108 と 分
子 間 のジスルフィド 結 合 を 形 成 していることが 示 唆 された。
その 他 の6 つのシステイン 残 基 は 分 子 内 のジスルフィド 結 合
に 関 与 していると 考 えられる。C108A 変 異 遺 伝 子 を 作 成 し、
野 生 型 酵 素 と 同 様 に 大 腸 菌 により 発 現 を 行 ったところ、
68kDa の 単 量 体 C108A (mono-C108A)と380kDa の 多 量 体
C108A (oligo-C108A)が 生 産 された。mono-C108A には 酵
素 活 性 がまったくなかったが、oligo-C108A は 酸 活 性 化 を 経
て 活 性 をわずかに 示 した (Table 1)。これらのことからサブユ
ニット 間 のジスルフィド 結 合 を 形 成 する Cys108 は、acid-TY
が 二 量 体 を 保 持 するために 重 要 な 残 基 であり、 活 性 に 必 須
のシステインであることが 示 唆 された。

Table 2
Kinetic parameters of wild type and mutant 1,2--mannosidases.
Table 3
Comparison of kinetic parameters and T m of WT, C334A, C363A and C443A.
Mutant
K m
k cat
k cat
/K m
(mM) (s -1 ) (s -1 ・mM -1 ) (%)
Enzyme K m k cat k cat /K m T m
(mM) (s -1 ) (s -1 ・mM) (C)
Wild type 0.28 2.5 9.04 100
E124Q 0.13 0.0078 0.062 0.7
E124D 0.49 0.022 0.044 0.49
D269N N.D. a N.D. a N.D. a -
D269E 4.8 0.51 0.11 1.2
E273D 7.0 0.37 0.054 0.6
E411Q N.D. a N.D. a N.D. a -
E411D 8.0 1.4 0.18 2.0
E414D 8.6 0.037 0.0043 0.05
E474D 6.4 0.023 0.0036 0.04
WT 0.719 0.013 8.51 0.09 11.8 55.8
C334A 0.296 0.006 3.87 0.12 13.0 49.6
C363A 0.780 0.007 9.48 0.03 12.2 49.6
C443A 0.719 0.007 6.67 0.04 9.3 51.9
a T m is a transition midpoint, which is an apparent value because the thermal denaturation is not reversible.
Table 4 Specific activities, melting temperatures (T m
) of Cys443
variants and amino acid properties.
Standard error in kinetic parameters: K m (±2.6-10.4 %) and k cat (± 1.8-4.8 %).
a : N.D. = not detected.
Relative activity ( (%)
% )
100
80
60
40
20
0
2 3 4 5 6 7 8
pH
Fig. 3. pH-activity profiles of wild type 1,2--mannosidase
(─○─), E124D (- - -□- - -) and E124A (- - ▲ - - ) mutant
enzymes represented as relative activities.
The absolute activity value of the E124A mutant at pH 5.0 corresponds to
about 0.015 % of the wild type enzyme activity.
Amino acids
at position 443
Specific activity T m
Van der Waals
volume a
(m katal / kg) (C) (Å 3 )
Cys (WT) 47.4 55.8 86 +2.5
Thr 44.9 52.8 93 - 0.7
Ala 38.3 51.9 67 +1.8
Gly 44.0 50.2 48 - 0.4
Ser 47.1 50.0 73 - 0.8
Asp 19.8 N.D. c 91 - 3.5
Val 20.7 N.D. 105 +4.2
Leu 11.7 N.D. 124 +3.8
Met 14.5 N.D. 124 +1.9
Asn d 96 - 3.5
Ile 124 +4.5
Phe 135 +2.8
Tyr 141 - 1.3
Hydrophobicity b
a : The data are from: Richards, F. M. (1974) J. Mol. Biol., 82, 1-14.
b : The data are from: Kyte, J. and Doolittle, R. F. (1982) J. Mol. Biol., 157, 105-132.
c : T m values were not determined because the mutant enzymes were
denatured structures.
d : Mutant enzymes were not secreted to culture media.
3. A. saitoi 1,2--マンノシダーゼの 触 媒 中 心 の 決 定 とCa 2+
の 役 割
E124Q、E124D において k cat 値 の 著 しい 減 少 が 見 られた
(Table 2)。これは E124 の 位 置 に 部 位 特 異 的 変 異 によって、
触 媒 反 応 が 大 きな 障 害 を 受 けていることを 意 味 している。
E124Q、E124D の K m 値 は、 野 生 型 酵 素 と 比 較 して 本 質 的
な 変 化 は 見 られなかった。このことから、E124 は 触 媒 反 応 に
直 接 関 与 していると 結 論 できる。さらに、E124D 変 異 酵 素 の
pH− 活 性 プロファイルでは、 至 適 pH が 5.0 から4.0 に 変 化
した(Fig. 3)。この 結 果 は E124 が 直 接 触 媒 反 応 に 関 与 して
いることを 支 持 している。E124A の 変 異 の 導 入 により、pH- 活
性 プロファイルの 塩 基 性 側 の 活 性 が 特 に 大 きな 減 少 が 見 ら
れた。 一 般 的 に 至 適 pH の 塩 基 性 側 の 活 性 は、 酸 触 媒 に 影
響 を 受 ける。このことから、E124 は 触 媒 反 応 時 において、カ
ルボキシル 基 の 状 態 で 存 在 しており、 酸 触 媒 であると 推 定 さ
れる。
通 常 、 糖 質 分 解 酵 素 の 触 媒 反 応 には 2 つの 酸 性 アミノ 酸
残 基 が 関 与 する。P. citrinum の 結 晶 構 造 解 析 から、もう 一 方
の 触 媒 アミノ 酸 残 基 として 最 も 有 力 な 候 補 は D269 と E411
である。D269N とE411Q 変 異 酵 素 はそれぞれ 酵 素 活 性 を
完 全 に 失 っていた(Table 2)。しかし、D269E とE411D 変 異
酵 素 はどちらも 決 定 的 な k cat 値 の 減 少 が 見 られなかった。こ
れらの 残 基 の 位 置 に 酸 性 アミノ 酸 残 基 があることが、 酵 素 の
触 媒 反 応 に 必 須 であるようである。E269N、E411A 変 異 酵
素 に 対 して、 外 来 性 の 求 核 基 NaN 3 は 酵 素 活 性 を 回 復 させ
なかった(data not shown)。もしD269 とE411 のどちらかが 塩
基 触 媒 であったとしたら、これらの 変 異 酵 素 は N 3 - などの 外
来 性 の 求 核 基 により 酵 素 活 性 が 回 復 する 可 能 性 がある。し
かし、 結 果 はそうならなかった。このことからD269 とE411 は
一 般 的 な 意 味 での 塩 基 触 媒 ではないと 考 えられる。1,2-α-
マンノシダーゼの 触 媒 反 応 機 構 は、 従 来 の 典 型 的 な 糖 質
分 解 酵 素 とは 異 なることを 明 らかにした。
E273D、E414D、E474D 変 異 酵 素 は k cat 値 の 減 少 と、K m
値 の 増 加 が 同 時 に 見 られた(Table 2)。このことから E273、
E414、E474 は 基 質 結 合 に 関 与 し、 基 質 をより 反 応 しやすい
構 造 に 変 化 させていると 考 えられる。E273、E414、E474 は
基 質 結 合 に 関 与 する 残 基 である。
一 般 的 には 1,2-α-マンノシダーゼの 酵 素 活 性 には Ca 2+
が 必 須 である。しかし、 原 子 吸 光 による 解 析 から、A. saitoi
1,2-α-マンノシダーゼは Ca 2+ を 結 合 していなかった。EDTA
による 阻 害 の 形 式 を 見 たところ、EDTA は 酵 素 活 性 を 拮 抗
阻 害 することがわかった。 本 酵 素 は 二 価 の 金 属 イオンを 結
合 していないと 言 える。 本 酵 素 に Ca 2+ 処 理 を 行 ったところ、
タンパク 質 1mol 当 たり、およそ 1 mol の Ca 2 が 結 合 するこ
とがわかった。しかし、Ca 2+ を 結 合 した 酵 素 と、Ca 2+ を 結 合 し
ない 酵 素 では 動 力 学 的 パラメーターに 変 化 が 見 られなかっ

た(data not shown)。A. saitoi 1,2-α-マンノシダーゼに Ca 2+
は 必 須 ではないと 言 える。 酵 素 活 性 に Ca 2+ を 要 求 しない
1,2-α-マンノシダーゼが 初 めて 見 出 された[13]。
4. A. saitoi 1,2--マンノシダーゼのシステイン 残 基 の 役 割
ABD-F を 用 いて A. saitoi 1,2--マンノシダーゼのトリプシ
ン 断 片 から 遊 離 システインを 含 むペプチドを 逆 相 HPLC に
より 分 取 した。このアミノ 酸 配 列 を 決 定 したところ、このペプ
チドは Cys443 を 含 む 配 列 であった。Cys334 とCys363 はジ
スルフィド 結 合 に 関 与 し、Cys443 は 遊 離 チオール 基 を 含 む
ことが 明 らかとなった。
C334A とC363A, C443A 変 異 酵 素 の 反 応 動 力 学 的 パラメ
ーターは 野 生 型 酵 素 (WT)とほぼ 同 じであった (Table 3)。
3 つのシステイン 残 基 は 酵 素 活 性 に 関 与 しない。
C334A とC363A の 熱 融 解 温 度 T m はどちらも49.6℃となり
WT より6.2℃ 低 かった。Cys334 とCys363 はジスルフィド 結
合 を 形 成 することにより 酵 素 の 熱 安 定 性 に 大 きく 寄 与 してい
ると 言 える。
Cys443 について12 種 類 の 変 異 酵 素 を 作 成 し 熱 安 定 性 に
ついて 検 討 した (Table 4)。C443I, C443F, C443Y といった
側 鎖 が 大 きなアミノ 酸 のとき 変 異 酵 素 は 生 産 されなかった。
443 の 位 置 の 大 きな 側 鎖 によりタンパク 質 のフォールディン
グが 妨 げられ、 宿 主 の 品 質 管 理 機 構 によりミスフォールディ
ングタンパク 質 として 認 識 され、 除 去 されたものと 考 えられ
る。
アスパラギン 残 基 の 側 鎖 は 比 較 的 小 さいにもかかわらず
C443N も 生 産 されなかった。445 の 位 置 はトレオニンであり、
443 がアスパラギンになったことでアスパラギン 結 合 型 糖 鎖
の 潜 在 的 な 付 加 部 位 がうまれる。C443N の Asn443 はおそ
らくグリコシル 化 を 受 けており、この 糖 鎖 が 酵 素 にとって 好 ま
しくなかったと 考 えられる。
C443D や C443M, C443L, C443V の 比 活 性 は WT の 50%
以 下 であった。CD スペクトルの 解 析 から、これらの 変 異 酵
素 は 部 分 的 に 変 性 した 構 造 をしていることが 示 唆 された。ア
スパラギン 酸 とバリンはそれぞれ C とC に 分 岐 を 持 つ。この
分 岐 の 側 鎖 が 酵 素 の 変 性 を 引 き 起 こしたと 考 えられる。ロイ
シンとイソロイシンは 同 じvan der Waals 体 積 を 持 ち、それぞ
れ C とC に 分 岐 を 持 つ。C443L は 分 泌 されたが C443I はさ
れなかった。C に 分 岐 を 持 つイソロイシンの 側 鎖 は、タンパ
ク 質 が 正 規 のフォールディングをするのにより 大 きな 立 体 障
害 となったと 考 えられる。メチオニンはシステインと 同 じく 硫
黄 を 含 んだアミノ 酸 である。C443M もまた 部 分 的 に 変 性 した
構 造 であった。これはメチオニンの 大 きな van der Waals 体
積 によるものであると 考 えられる。
C443A や C443G, C443S, C443T といった 変 異 酵 素 は WT
と 同 様 の 比 活 性 を 持 ち、CD スペクトルから 正 規 の 構 造 を 取
っていることが 示 唆 された。C443T は 最 も 熱 安 定 性 の 高 い
変 異 酵 素 であった。C443T の T m 値 の 減 少 はトレオニンの 低
い 疎 水 性 度 によるものと 考 えられる。C443A は 2 番 目 に 熱
安 定 性 な 変 異 酵 素 であった。その 次 が C443S であった。
443 の 位 置 の 疎 水 性 度 が 酵 素 の 熱 安 定 性 に 重 要 であること
が 示 唆 された。C443G は 熱 に 対 して 不 安 定 な 変 異 酵 素 であ
った。システインがグリシンに 置 換 することにより 空 隙 がうま
れ、 不 安 定 化 を 引 き 起 こしたと 考 えられる。
以 上 からCys443 に 関 する12 種 類 の 変 異 酵 素 を3 つのグ
ループに 分 類 することができる。 第 1 のグループは C443F と
C443I, C443N, C443Y で、 変 異 酵 素 が 培 地 に 分 泌 されずに
細 胞 内 で 除 去 される。 第 2 のグループは C443D とC443L,
C443M, C443V で、 比 活 性 が WT の 50% 以 下 であり、 部 分
的 に 変 性 した 構 造 を 持 つ。 第 3 のグループは C443A と
C443G, C443S, C443T で、 比 活 性 がWT と 同 程 度 であり、 正
常 にフォールディングしている。これらの 結 果 から、A. saitoi
1,2--マンノシダーゼの Cys443 は 疎 水 性 パッキングを 増 加
させることにより 酵 素 の 熱 安 定 性 を 高 くする 役 割 があること
が 示 唆 された[14]。
5. 参 考 文 献
1. 一 島 英 治 (2002) 発 酵 食 品 への 招 待 − 食 文 明 から 新 展
開 まで−, 裳 華 房 .
2. 一 島 英 治 (2004) 日 本 の 国 菌 コウジキン, 日 本 醸 造 協 会
会 誌 , 99 巻 2 号 , p. 83.
3. Ohba, T., Murakami, H and Hara, S. (1971) J. Ferment.
Technol. 35, 674-81.
4. Ichishima, E., Maeba, H., Amikura, T., and Sakata, H.
(1984) Biochim. Biophys. Acta 786, 25-31.
5. Helenius, A. and Aebi, M. (2001) Science 291, 2364-2369
6. 一 島 英 治 (2001) 酵 素 −ライフサイエンスとバイオテクノロ
ジーの 基 礎 −, 東 海 大 出 版 会 , pp. 199-203.
7. Chiba, Y., Yamagata, Y., Nakajima, T. and Ichishima, E.
(1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56, 1371-1372.
8. Chiba, Y., Suzuki, M., Yoshida, S., Yoshida, A., Ikenaga,
H., Takeuchi, M., Jigami, Y. and Ichishima, E. (1998) J.
Biol. Chem. 273, 26298-26304.
9. Lobsanov, Y. D., Vallee, F., Imberty, A., Yoshida, T., Yip,
P., Herscovics, A. and Howell, P. L. (2002) J. Biol. Chem.
277, 5620-5630.
10. Giles, N. M., Giles, G. I., and Jacob, C. (2003) Biochem.
Biophys. Res. Commun. 300, 1-4.
11. Wedemeyer, W. J., Welker, E., Narayan, M., and
Scheraga, H. A. (2000) Biochemistry 39, 4207-4216.
12. Nakamura, M., Nakajima, T., Ohba, Y., Yamauchi,S. ,
Lee, B. R., and Ichishima, E. (2000) Identification of
copper ligands in Aspergillus oryzae tyrosinase by
site-directed mutagenesis. Biochem. J. 350, 537-545.
13. Tatara, Y., Lee, B. R., Yoshida, T., Takahashi, K., and
Ichishima, E. (2003) J. Biol. Chem. 278, 25289-25294.
14. Tatara, Y., Yoshida, T., and Ichishima, E. (2005) Biosci.
Biotechnol. Biochem., 69, 2101-2108.