学位論文要旨 - 松井一裕

内 分 泌 撹 乱 化 学 物 質 等 の 新 規 探 索 ツールの 構 築 と 評 価
Development and evaluation of novel screening tools
for potential endocrine disrupting chemicals
氏 名 松 井 一 裕 指 導 教 員 青 山 由 利
SYNOPSIS
For developing novel screening tools for potential endocrine disrupting chemicals (EDCs), the
ligand-binding domains of human estrogen receptor a (hERα) and androgen receptor (hAR) fused
with maltose-binding protein were constructed and their efficacy as the screening tools for potential
EDCs were evaluated. Potency of a given compound as EDC could be estimated by competition
assay with these tools by using radio-labeled estradiol or mibolerone. These tools were useful for
simultaneous assays of potent EDCs to these two receptors. Modification of the hERα domain of
the fused protein at the ligand binding site was effective for the discrimination of ERα agonists and
antagonists. A novel screening method for aromatase (CYP19) inhibitors by using ELISA for rapid
and convenient determination of the activity of recombinant human CYP19 was developed.
Advantages of these newly developed tools for screening of large numbers of potential EDCs were
confirmed through the evaluation of wide variety of known EDCs. These approaches can be
extended to evaluate chemicals interacting with other nuclear receptors and P450 enzymes.
Key words: Nuclear receptors, Aromatase, Endocrine disrupting chemical, Screening, Binding assay
1. 緒 言
内 分 泌 攪 乱 化 学 物 質 (EDCs)を 含 む 全 ての 化 学 物 質 は、
毒 性 を 発 揮 する 可 能 性 があり、 環 境 や 生 物 に 与 える 影 響
は 予 測 しきれない。 個 体 としての 生 命 への 急 性 毒 性 や 慢
性 毒 性 は 一 通 り 調 査 されるが、 工 業 的 発 展 と 経 済 性 を 優
先 させるため、 個 体 から 新 個 体 への 連 続 性 、すなわち 種
の 存 続 に 関 する 毒 性 の 調 査 は、 極 めておろそかにされて
きた。しかし 野 生 動 物 などに 生 じた 多 くの 異 常 現 象 に 触
発 され、 生 殖 毒 性 に 関 する 認 識 は 近 年 改 まりつつある。
EDCs いわゆる 環 境 ホルモンと 呼 ばれる 化 学 物 質 は、 生 体
の 内 分 泌 系 を 攪 乱 し、 主 としてこの 生 殖 毒 性 を 発 揮 する
化 学 物 質 であり、 脊 椎 動 物 以 上 の 高 等 動 物 が 有 する、 生
殖 現 象 の 中 心 に 位 置 する 核 内 受 容 体 や 性 ホルモンの 合
成 ・ 代 謝 酵 素 などの 蛋 白 質 を 標 的 とし、 個 体 形 質 を 次 世
代 に 正 しく 伝 えることを 妨 害 する。
EDCs の 標 的 蛋 白 質 は、 核 内 レセプターであるエストロ
ゲンレセプターやアンドロゲンレセプターと、エストロ
ゲン 合 成 酵 素 のアロマテース 等 である。これらの 標 的 蛋
白 質 に 対 する 影 響 を 調 査 するため、 数 年 前 より、 各 国 政
府 は 膨 大 な 種 類 の 化 学 物 質 の 評 価 に 乗 り 出 している。し
かし 化 学 物 質 の 種 類 は 膨 大 であり、 迅 速 かつより 効 率 的
に 評 価 できる 方 法 が 求 められている。また 従 来 の 評 価 法
では、 動 物 組 織 由 来 のものが 用 いられているが、 各 種 の
影 響 因 子 が 混 入 するため、 一 定 の 条 件 下 での 評 価 が 困 難
であった。このためより 安 定 で 操 作 性 のよいツールも 望
まれていた。
本 研 究 では、EDCs の 新 規 探 索 および 評 価 ツールとして、
ヒトエストロゲンレセプターαリガンド 結 合 部 (hERα
LBD)とヒトアンドロゲンレセプターリガンド 結 合 部 (hAR
LBD)を 用 い、マルトース 結 合 蛋 白 質 (MBP)との 融 合 蛋 白 質
として、MBP-hERα LBD と MBP-hAR LBD を 大 腸 菌 で 作 製 し
た。これらを 用 いて 基 本 評 価 系 を 確 立 後 、 両 レセプター
を 用 いた 同 時 評 価 や、 各 種 の 癌 において 見 出 されるhERα
や hAR のアミノ 酸 置 換 変 異 体 や 特 定 人 種 の 集 団 に 見 出 さ
れた SNP 変 異 体 を 用 いた 解 析 、および 人 工 的 にデザイン
した hERα アミノ 酸 置 換 変 異 体 を 用 いたアゴニストとア
ンタゴニストの 分 別 について 解 析 した[1,2,3]。さらにも
うひとつの EDCs の 標 的 となるアロマテース(P450arom)
に 対 する 阻 害 化 合 物 の 評 価 システムとして、ヒト
P450arom(hP450arom)の 組 換 え 体 を 用 いた 反 応 に 阻 害 化
合 物 を 添 加 し、 生 成 物 を 競 合 ELISA で 測 定 する 評 価 シス
テムを 構 築 し、 各 種 化 学 物 質 を 解 析 した[4]。
2. 実 験 材 料 と 方 法
2-1 MBP-hERαLBD と MBP-hAR LBD 発 現 系 の
構 築 と 調 製
発 現 に 用 いる hERα LBD cDNA(1029bp: 253-595aa)
と hAR LBD cDNA (1341bp: 471-917aa)は、PCR-Ready
Human cDNAs (Maxim Biotec) を 鋳 型 として Pfu turbo DNA
polymerase (Stratagene) を 用 いて、PCR で、5’ 側 に Bam
HI および 3’ 側 に Sal I を 付 けて 単 離 した。 取 得 した
cDNA クローンは、 各 々pMalc2e の MBPcDNA 下 流 の Bam HI
-Sal I サイトに 導 入 し、 発 現 ベクターを 構 築 した。プロ
テアーゼ 耐 性 付 与 のため、これら 発 現 ベクターの MBP と
hERα LBD または MBP と hAR LBD 間 のリンカー 配 列
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Val-Pro-Glu-Phe のLysをGluに、

変 異 導 入 用 プライマーと QuickChange TM Site-directed
Mutagenesis Kit (Stratagene)を 用 いて 変 換 した。 発 現
ベクター 中 の hERα cDNA、hARcDNA、リンカー 部 の 塩 基 配
列 は、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing
Kit を 用 いて、ABI PRISM Model 310 シーケンサーで 2
回 以 上 確 認 した。
各 発 現 ベクターで 大 腸 菌 JM109 株 を 形 質 転 換 し、 得 た
コロニーを 100μg/L アンピシリン、20mM グルコースを
含 む SB 培 地 (20g/L 酵 母 エキス、30g/L バクトトリプト
ン、10g/L NaCl)500 mL に 植 え 継 ぎ 37℃で 培 養 し、OD600
が 0.8-1.2 となった 時 点 で、0.1mM isopropyl-1-thio
-β-D-galactopyranoside を 添 加 後 、30℃で 3 時 間 培 養
を 行 った。 菌 体 を 集 菌 後 、1mM EDTA、10% グリセロール、
1mM バナジン 酸 Na、150mM NaCl、1μg/mL ロイペプチン、
1μg/mL ペプスタチン、1mM DTT を 含 む 50mM PIPES 緩 衝
液 pH 7.4 (PEGV buffer)で 懸 濁 し、0.1% (w/v)リゾチー
ムで 菌 体 を 破 砕 、0.004%(w/v) ポリエチレンイミン 溶 液
添 加 とガラスフィルター 濾 過 にて 除 核 酸 を 行 なった。
Debris を 遠 心 で 除 去 後 、40% 硫 安 飽 和 の 塩 析 による 沈 殿
物 を PEGV buffer で 懸 濁 し、5000×g、20 分 間 の 遠 心 に
かけ、 上 清 にレセプターの 部 分 精 製 標 品 を 回 収 した。
各 種 hERα と hAR 変 異 体 の 作 製 は、 前 述 の
Site-directed Mutagenesis Kit と 変 異 導 入 用 各 種 プラ
イマーを 用 いて 行 なった。
2-2 レセプターバインディングアッセイ
MBP-hERα LBD と MBP-hAR LBD は、0.2% (w/v)ゼラチン
を 含 むPEGV bufferで 希 釈 し、 結 合 アッセイに 使 用 した。
MBP-hERα LBD を 用 いたバインディングアッセイは、3nM
[ 3 H]-17β-エストラジオール( 放 射 性 E2)(NET-317A:NEN
Life Science)を、レセプター 溶 液 200μL と 混 ぜ 合 わせ、
非 標 識 評 価 化 学 物 質 をさらに 添 加 して 250μL として、
4℃で 3 時 間 静 置 で 競 合 反 応 を 行 った。5% (w/v) 活 性 炭
と 0.5% (w/v) dextran T70 を 含 むが、バナジン 酸 Na を
除 いた PEGV buffer 50μL で 反 応 を 停 止 し、1000×g、1
分 間 の 遠 心 で 活 性 炭 を 沈 降 させた 後 、 上 清 200μL をシン
チレーションカクテル(Clear-SolⅡ:ナカライテスク)
2mL に 混 和 し、 液 体 シンチレーションカウンター1900TR
(パッカード)で、 放 射 性 E2 のカウント(CPM) を 測 定 した。
バックグランドとして100 倍 濃 度 の 非 放 射 性 E2を 添 加 し
た 場 合 の CPM を 測 定 した。
MBP-hAR LBD を 用 いたアッセイでは、3nM [ 3 H]-ミボレ
ロン( 放 射 性 MIB)(NET-919:NEN Life Science)を 用 い
て 行 い、CPM 算 出 のバックグランドも 100 倍 濃 度 の 非 放
射 性 MIB を 用 いる 以 外 は、 同 様 の 方 法 で 行 った。
MBP-hERα LBD とMBP-hAR LBD の 両 方 を 用 いて 同 時 評 価
アッセイを 行 なう 場 合 は、 放 射 性 E2 と 放 射 性 MIB を 同 時
に 用 いたが、 相 互 の 放 射 性 ラベル 化 合 物 が 影 響 しない 反
応 条 件 を 設 定 した。
2-3 hP450arom 阻 害 アッセイ
hP450arom の 酵 素 反 応 で 生 じた E2 を 測 定 する ELISA
に 用 いるマイクロプレートを 作 製 するために、20mM 炭 酸
緩 衝 液 pH9.0 で 希 釈 した 抗 E2-3 モノクロナル 抗 体
(Fitzgerald)を 96 ウェルマイクロプレートに 分 注 し、 常
法 にて 抗 体 固 定 化 プレートを 作 製 した。また 酵 素 反 応 に
用 いる R1 液 (0.1% BSA、3.3mM NADP、0.8mM グルコース
6-リン 酸 、62.5nM テストステロンを 含 む 50mM リン 酸 緩
衝 液 pH7.2)、R2 液 (0.1% BSA、8.3mM MgCl 2 、1U/mL
Glucose-6-P dehydrogenase を 含 む 50mM リン 酸 緩 衝 液
pH7.2)および DMSOに 溶 解 した 評 価 化 学 物 質 を0.1% BSA、
50mM リン 酸 緩 衝 液 pH7.2 溶 液 で 10 倍 に 希 釈 した 溶 液 を
調 製 した。
1ng/mL hP450arom ( 還 元 酵 素 含 有 :BD Science)を、 直
前 に 1000 倍 希 釈 し 10μL ずつ 分 注 したポリプロピレン 製
マイクロプレートに、 別 の 氷 上 マイクロプレートの 各 ウ
ェルで R1 溶 液 50μL、R2 溶 液 50μL、 各 種 各 濃 度 の 化 学 物
質 溶 液 10μL を 混 合 した 液 から 取 った 90μL を 加 えて 混 合
した。 反 応 を 37℃で 20 分 間 行 なった 後 、500μM α−ナフ
トフラボン(αNF)、0.1% BSA を 含 む 50mM リン 酸 緩 衝 液
pH7.2,10μL を 添 加 して 反 応 を 停 止 した。この 混 液 50μL
と E2-3-CMO-ペルオキシダーゼ ( 神 戸 川 研 究 所 ) 50μLを
先 に 作 製 した 抗 体 固 定 化 プレートで 混 合 し、4℃,1 時 間
反 応 させた。150mM NaCl を 含 む 10mM リン 酸 緩 衝 液 pH7.2
で 3 回 洗 浄 後 、ペルオキシダーゼの 基 質 であるテトラメ
チルベンチジン 100μL を 添 加 して、 発 色 反 応 を 室 温 で 行
った 後 、2N 硫 酸 100μL で 反 応 を 停 止 した。450nm/650nm
の 吸 収 を、プレートリーダーで 測 定 した。
3. 結 果 と 考 察
3-1 MBP-hERαLBD と MBP-hAR LBD の 解 析 と 評 価
新 規 作 成 した MBP-hERα LBD は、 図 1に 示 すように 放
射 性 E2 の 結 合 を 非 放 射 性 E2 が 競 合 阻 害 するので、 内 在
性 E2 が 結 合 することが 明 らかになった。 本 実 験 の 条 件 下
での 50% 阻 害 値 (IC50)は 3.8nM であった。 男 性 ホルモ
ンのテストステロン、MIB、R1881 は、 各 々10nM まで 影 響
を 与 えないことが 確 認 できた。 EDCs として 用 いたジエ
チルスチルベストロール(DES)、オクチルフェノール、
ノニルフェノール(NP)、ビスフェノール A (BisA)と
MBP-hERα LBD との 反 応 性 は、IC50 が、 各 々4.5nM、15μM、
2 μM、2.4μM となった( 図 2)。
MBP-hAR LBD を 用 いた 場 合 、 図 3に 示 すようにアンド
ロゲンのテストステロン、ジヒドロテストステロン、MIB、
R1881 が 特 異 的 に 結 合 し、 女 性 ホルモンである E2 は 20nM
までは 影 響 を 与 えないことが 明 らかとなった。MIB の
IC50 は 1.4nM であった。MBP-hAR LBD の DES、NP、BisA
との 反 応 性 は、IC50 が 各 々 4.6μM、6.2μM、34.9μMとな
った( 図 4)。
このように MBP-hERα LBD と MBP-hAR LBD は、 各 々 内
在 性 エストロゲンやアンドロゲンを 特 異 的 に 結 合 したが、
これらや EDCs の IC50 値 は、 参 考 文 献 5 および 6 に 示 さ
れた 報 告 値 と 類 似 しており、 結 合 性 の 強 さの 順 序 が 一 致
していた。したがって 新 規 作 製 MBP-hERα LBD と MBP-hAR
LBD は、 実 用 性 があることが 明 らかとなった。
本 解 析 で 使 用 した MBP は 大 腸 菌 由 来 の 蛋 白 質 であり、
グルタチオンS-トランスフェラーゼなど 他 の 融 合 蛋 白

と 異 なり、 起 源 が 宿 主 細 胞 と 同 一 であるため 10mg/(1L
培 養 液 ) 以 上 と 発 現 量 は 高 かった。また MBP-hERα LBD、
MBP-hAR LBD はいずれも、4℃、 一 昼 夜 保 存 しても 結 合 活
性 に 変 化 が 認 められず、 安 定 であり 操 作 性 に 関 しても 有
利 であると 考 えられた。
Relative Activity ( % )
125
105
85
65
45
25
5
0 2 4 6 8 10 12
CONC. ( nM )
なお、㈶ 化 学 物 質 評 価 研 究 機 構 の 中 井 ら[7]により、 経
済 協 力 開 発 機 構 の 取 り 組 みの 中 で、MBP-hAR LBD は 現 在
も 種 々の EDCs の 評 価 に 使 用 されている。
3-2 エストロゲンおよびアンドロゲン 様 物 質 の 同 時 評 価
適 量 の MBP-hERα LBD と MBP-hAR LBD とを 共 存 させた 反
応 系 で 3nM 放 射 性 E2 と 放 射 性 MIB を 用 いると、
MBP-hERα LBDとMBP-hAR LBDが 相 互 に 影 響 することなく、
エストロゲンおよびアンドロゲン 様 化 学 物 質 の 測 定 が 可
能 であった( 図 5)。この 方 法 は、 化 学 物 質 を 統 合 的 かつ
1 次 スクリーニング 的 に 評 価 でき、 反 応 性 を 示 した 化 学
物 質 については、その 後 個 別 のレセプターに 対 してさら
に 評 価 を 進 めることが 可 能 である。この 方 法 は、きわめ
て 多 種 類 の 化 学 物 質 を 効 率 よく 評 価 できるため、 薬 剤 探
索 などにも 有 用 と 考 えられた。
Estradiol Mibolerone Teststerone R1881
図 1 MBP-hERαLBD のエストロゲン 及 びアンドロゲンとの 反 応 性
Relative Activity ( %)
12 0
10 0
80
60
40
20
Relative Activity ( % )
120
100
80
60
40
20
0
1 10 100 1000 10000 100000
0
1 10 100 1000 10000 100000 1000000
CONC. ( nM )
Bisphenol A Nonylphenol DES Octylephenol
図 2 MBP-hERαLBD の EDCs との 反 応 性
Cold ligand conc. ( nM )
Bisphenol A Nonylphenol DES
Octylphenol Estradiol
図 5 エストロゲンとアンドロゲン 様 化 学 物 質 の 同 時 評 価
120
Relative Activity ( % )
図 3 MBP-hAR LBD のアンドロゲン 及 びエストロゲンとの 反 応 性
Relat ive Activity ( %)
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60
CONC. ( nM )
Mibolerone R1881 Teststerone
DHT
Estradiol
120
100
80
60
40
20
0
100 1000 10000 100000 1000000
CONC. ( nM )
Bisphenol A Nonylphenol DES
図 4 MBP-hAR LBD の EDCs との 反 応
3-3 hERα LBD 変 異 体 を 用 いたアゴニストとアンタゴニスト
の 分 別
各 種 の 癌 において 見 出 される hERα や hAR のアミノ 酸
置 換 変 異 体 や 特 定 人 種 の 集 団 に 見 出 された SNP 変 異 体 を
用 いた 解 析 では、EDCs との 反 応 性 が 異 なるものが 見 出 さ
れた。
hERα に 対 する 強 いアンタゴニストであるタモキシフ
ェンの 結 合 には、hERα の 351 番 目 のアミノ 酸 残 基 Asp が
関 与 することが 知 られている。そこでこのアミノ 酸 残 基
を 変 異 させた MBP-hERα LBD 変 異 体 ( Asp351Glu 、
Asp351Asn、Asp351Ser、Asp351Gly)を 用 いた 解 析 を 行 っ
た。これら 変 異 体 は、タモキシフェンとの 結 合 性 が 低 下
していた。これら 変 異 体 を 用 いて、hERα のアゴニストや
アンタゴニストとなる 化 学 物 質 の IC50 値 を 求 め、E2 の
IC50 値 に 対 する 相 対 値 RBA(%) を 算 出 すると、 表 1のよ
うな 結 果 が 得 られた。アンタゴニストのタモキシフェン
等 の 化 学 物 質 では、 変 異 体 で RBA がより 小 さくなり、ア
ゴニストとして 考 えられる BisA 等 の 化 学 物 質 では、RBA
がより 大 きくなることが 明 らかとなった。 特 に
Asp351Glu 変 異 体 では、その 化 学 物 質 がアゴニスト 的 な
性 質 を 有 するのか、アンタゴニスト 的 性 質 を 有 するかの
判 別 が 可 能 と 考 えられた。

検 討 した 化 学 物 質 の 種 類 は、 数 的 にまだ 不 十 分 ではあ
るが、X 線 結 晶 構 造 解 析 で 明 らかなレセプターは 増 加 し
ており、 立 体 構 造 からデザインした 変 異 体 を 用 いること
は、 化 学 物 質 の 判 別 に 有 効 であると 考 えられた。
3-4 hP450arom 阻 害 アッセイによる 化 学 物 質 の 評 価
この 測 定 法 は hP450arom の 反 応 に、 阻 害 化 学 物 質 を 添
加 し、 生 成 した E2 を 競 合 ELISA で 定 量 して、 化 学 物 質 の
阻 害 効 果 を 検 出 するものである。これまで P450arom を 阻
害 する 化 学 物 質 と 報 告 されてきた 表 2 中 の 化 合 物 は、 本
測 定 系 でも 濃 度 依 存 的 に 阻 害 作 用 を 示 した。 表 2は、
hP450arom 活 性 を 40% 阻 害 するのに 必 要 な 化 学 物 質 の 濃
度 、 及 び αNF を 1.0 とした 時 の 相 対 値 を 示 したが、 各 化
合 物 の 阻 害 は、 参 考 文 献 8に 報 告 されている 相 対 値 と 比
較 してほぼ 同 様 であり、 競 合 ELISA を 組 合 せた 方 法 が、
適 切 であることを 支 持 していた。
表 2
Chemicals
hP450arom 阻 害 効 果 の 比 較
40% 阻 害
濃 度 (μM)
αNF=1.0 とし
た 相 対 値
文 献 8 で
の 相 対 値
αNF 0.11 1.0 1.0
Chrysin 0.34 3.0 3.9
Ketoconazole 0.75 6.8 5.1
Aminoglutethimide 0.35 3.1 4.3
Androsten-di-one 0.3 2.6 0.5
Triphenyltin 19 172.7 -
本 方 法 での、 基 質 のテストステロン 濃 度 は 重 要 であり、
ELISA での 抗 体 による 交 差 反 応 の 影 響 を 回 避 するため、
できるだけ 低 濃 度 に 設 定 している。 放 射 性 基 質 を 用 いな
い 本 競 合 ELISA 系 を 組 合 せた 方 法 は、 他 の P450 酵 素 にも
拡 張 適 用 できると 考 えられる。
4. 結 論
EDCs を 効 率 よく 探 索 できる MBP-hERα LBD と MBP-hAR
LBD を 新 しく 開 発 し、アンドロゲンとエストロゲン 様 化
学 物 質 の 同 時 評 価 を 行 うことができた。また hERα 変 異
体 を 用 いることにより、これら 化 学 物 質 がアゴニスト 作
用 を 有 するものか、アンタゴニスト 作 用 を 有 するものか
の 分 別 ができる 可 能 性 の 道 を 開 いた。さらに、hP450arom
と 競 合 ELISA を 組 合 せた 放 射 性 基 質 を 用 いない 有 用 な 測
定 系 を 構 築 することができた。
これらの 方 法 は 他 の 核 内 レセプター、 膜 レセプターや
薬 剤 の 代 謝 酵 素 等 に 対 しても 適 用 可 能 性 があり、 薬 剤 探
索 ツールとしても 活 用 できる 方 法 である。
参 考 文 献
1) Matsui, K. et al. (2001) Analytical Sciences,
17 Sup, i781-i784
2) Matsui, K. et al. (2002) Analytical Biochemistry,
307, 147-152
3) Matsui, K. et al. (2005) J. Pharmaceutical and
Biomedical Analysis, 38, 307-312
4) Matsui, K. (2007) J. Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 43, 822-828
5) Matthews, J. et al. (2000) Toxicological Science,
53, 326-339
6) Giwercman, A. et al. (2000) J. Clinical
Endocrinology & Metabolism 85, 2253-2259
7) 化 学 物 質 審 議 会 管 理 部 会 ・ 審 査 部 会 内 分 泌 かく 乱 作 用 検 討
小 委 員 会 中 間 報 告 書 (2006) 71 IV. 試 験 法 開 発 の 概 要
2. 事 業 成 果 の 概 要 と 今 後 の 課 題 2-2 受 容 体 結 合 試 験 法
8) Stresser, D. M. et al. (2001) A Poster Presentation
on Drug Discovery Technology
9) Matsui, K. et al. (1996) Israel Journal of
Chemistry, 36, 195-198
10) Matsui, K. et al. (2001) Japan J. Cancer Research,
92, 1313-1321
表 1
hERα の Asp 351 変 異 体 に 対 する 各 種 化 学 物 質 の RBA(%)
Chemicals Wild Type (Asp351) Asp 351Glu Asp 351 Asn Asp 351 Ser Asp 351 Gly
Estradiol (Ag) 100 100 100 100 100
Tamoxifen (Ant) 44.0 < 27.8 < 29.8 < 23.4 < 17.3
OH-tamoxifen (Ant) 4.75