腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ） 検査・診断マニュアル - 国立感染症研究所

腸 管 出 血 性 大 腸 菌 (EHEC)
検 査 ・ 診 断 マニュアル
平 成 24 年 6 月 改 訂
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目 次
1. 概 要 ・・・・・・・・・・・・・ 3
2. EHEC の 分 離 と 同 定 ・・・・・・・・・・・・・ 3
(1) 検 体 の 採 取 と 保 存 ・・・・・・・・・・・・・ 4
(2) 糞 便 からの EHEC 分 離 ・・・・・・・・・・・・・ 4
(3) EHEC の 同 定 ・・・・・・・・・・・・・ 8
(4) 血 清 型 別 ・・・・・・・・・・・・・ 14
3. 血 清 学 的 診 断 法 ・・・・・・・・・・・・・ 15
(1) 抗 原 液 の 作 製 と 保 存 ・・・・・・・・・・・・・ 16
(2) 血 清 の 非 働 化 ・・・・・・・・・・・・・ 16
(3) 抗 体 価 測 定 法 ・・・・・・・・・・・・・ 17
(4) 判 定 ・・・・・・・・・・・・・ 18
4. 参 考 文 献 ・・・・・・・・・・・・・ 19
5. 参 考 資 料 1 ・・・・・・・・・・・・・ 20
(1) O 抗 原 合 成 遺 伝 子 の 検 出 ・・・・・・・・・・・・・ 20
(2) 免 疫 磁 気 ビーズの 作 製 方 法 ・・・・・・・・・・・・・ 24
6. 検 査 依 頼 先 ・・・・・・・・・・・・・ 25
7. 執 筆 者 一 覧 ・・・・・・・・・・・・・ 25
参 考 資 料 2・3 ・・・・・・・・・・・・・ 26
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1. 概 要
腸 管 出 血 性 大 腸 菌 (enterohemorrhagic E. coli, EHEC)は、 出 血 性 大 腸 炎 を 惹 起 す
ることからこの 名 称 で 呼 ばれる 一 方 、 産 生 する 毒 素 の 性 状 からベロ 毒 素 (VT) 産 生 性
大 腸 菌 (Vero toxin-producing E. coli, VTEC)あるいは 志 賀 毒 素 産 生 性 大 腸 菌 (Shiga
toxin producing-E. coli, STEC)とも 呼 ばれる。 我 が 国 の 行 政 上 では 菌 の 名 称 として
EHEC が 用 いられ、EHEC は「VT を 産 生 する 大 腸 菌 」と 定 義 されている。EHEC 感 染 症
は、3 類 感 染 症 として 菌 の 分 離 ・ 同 定 と VT の 確 認 により 全 数 届 出 が 義 務 付 けられて
おり、 溶 血 性 尿 毒 症 症 候 群 (Hemolytic uremic syndrome; HUS) 発 症 例 に 限 り、 便 か
らの VT 検 出 あるいは 患 者 血 清 における O 抗 原 凝 集 抗 体 等 の 検 出 によって 診 断 した
場 合 も 届 出 が 必 要 である。EHEC 感 染 症 では、HUS や 脳 症 などの 重 症 合 併 症 を 併 発
する 危 険 があることから、 早 期 の 高 感 度 な 確 定 診 断 が 求 められている。
2. EHEC の 分 離 と 同 定
EHEC 感 染 症 の 診 断 は、 症 状 の 有 無 にかかわらず、 糞 便 から 大 腸 菌 を 分 離 し、 分
離 株 の 毒 素 産 生 性 の 確 認 または 毒 素 遺 伝 子 の 検 出 による( 図 1)。 血 清 型 別 や 毒 素
型 の 判 定 は 求 められていないが、O 抗 原 型 や 毒 素 型 がわかれば 接 触 者 検 便 の 実 施
に 有 用 である。
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1 日 目
糞 便
増 菌 培 養
N-mEC
mEC
CTV-TSB など
分 離 培 養
CT-SMAC
クロモアガーSTEC
DHL など
2 日 目
3 日 目
毒 素 遺 伝 子
検 出
陽 性 の 場 合 は 培 地
の 種 類 や 枚 数 を 増
やすなど 工 夫 する
分 離 培 養
釣 菌
釣 菌
確 認 培 地
(TSI, LIM, CLIG)
TSA 斜 面
毒 素 産 生 用 培 地
大 腸 菌 の 同 定
毒 素 遺 伝 子
または 毒 素 産 生 性 の 確 認
血 清 型 別
分 離 平 板 の 濃 厚 発 育 部 をかきとり、
毒 素 遺 伝 子 または 毒 素 を 検 出
陽 性 の 場 合 は 釣 菌 数
を 増 やす
または 画 線 培 養
毒 素 遺 伝 子 検 出
陽 性 株 を 確 認
培 地 に 接 種
図 1 糞 便 からのEHEC 分 離 の 手 順
(1) 検 体 の 採 取 と 保 存
EHEC 分 離 のための 糞 便 検 体 は、 自 然 排 泄 便 が 望 ましいが、 採 取 できない 場 合 は
直 腸 粘 液 をスワブで 採 取 する。 採 取 後 直 ちに 検 査 できない 場 合 は、Cary-Blair 培 地
等 に 保 存 して 輸 送 する。
激 しい 下 痢 を 呈 している 場 合 は、 下 痢 便 を 遠 心 し 沈 渣 を 検 査 に 供 する。
(2) 糞 便 からの EHEC 分 離
a) 分 離 培 養
日 本 で 分 離 されることの 多 い O 抗 原 型 については、その 特 徴 的 性 状 を 利 用 した 分
離 培 地 が 多 数 市 販 されている( 表 1)。
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表 1 主 なEHEC 検 出 用 選 択 分 離 培 地 の 種 類 と 特 徴
培 地 名 種 類 メーカー 鑑 別 性 状 など
糖 分 解 を 利 用 した 培 地
CT-SMAC a) 粉 末 , 生 培 地 日 水 製 薬 , Merck, ソルビトール 分 解
栄 研 化 学 , Oxoid,
極 東 製 薬 , BD
SIB 寒 天 培 地 粉 末 , 生 培 地 極 東 製 薬 ソルビトール 分 解 , IPA
SIB II 寒 天 培 地 粉 末 極 東 製 薬 ソルビトール 分 解 , IPA, H2S 産 生
DHS 寒 天 培 地 「ダイゴ」 粉 末 日 本 製 薬 ソルビトール 分 解 , H2S 産 生
CT-RMAC 生 培 地 極 東 製 薬 , 栄 研 化 学 ラムノース 分 解
CT-RMAC/CT-SBMAC b) 生 培 地 日 水 製 薬 ラムノース 分 解 ,ソルボース 分 解
a)
MAC 寒 天 基 礎 培 地 粉 末 BD 添 加 した 糖 の 分 解
DHL 寒 天 基 礎 培 地 「ダイゴ」 粉 末 日 本 製 薬 添 加 した 糖 の 分 解 , H2S 産 生
合 成 基 質 培 地
クロモアガー O157 培 地 粉 末 , 生 培 地 関 東 化 学 発 色 基 質
クロモアガーSTEC 粉 末 , 生 培 地 関 東 化 学 発 色 基 質 , 発 光 基 質
BCM O157 寒 天 培 地 粉 末 , 生 培 地 栄 研 化 学 発 色 基 質
a)
Vi RX O26 寒 天 培 地 粉 末 栄 研 化 学 ラムノース 分 解 , 発 色 基 質
Vi EHEC 寒 天 培 地 生 培 地 栄 研 化 学 発 色 基 質
XM-EHEC 寒 天 培 地 生 培 地 日 水 製 薬 発 色 基 質
CIX 寒 天 培 地 生 培 地 極 東 製 薬 発 色 基 質
レインボーアガーO157 培 地 粉 末 カイノス 発 色 基 質
a) 粉 末 培 地 はCT 選 択 剤 を 添 加 する
b) 分 画 培 地
すなわち、O157、O26、O111 はそれぞれソルビトール、ラムノース、ソルボース 非 発
酵 (または 遅 発 酵 )であることから、マッコンキー 寒 天 培 地 (MAC)の 鑑 別 糖 を 置 き 換
え CT 選 択 剤 (セフィキシム 0.05 mg/L および 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg/L)を 加 えた
CT 加 ソルビトール MAC(CT-SMAC)、CT 加 ラムノース MAC(CT-RMAC)、CT 加 ソル
ボース MAC(CT-SBMAC)が 汎 用 されており、 白 色 ( 糖 分 解 陰 性 )のコロニーを 釣 菌
する。CT 選 択 剤 は、SIB 寒 天 培 地 や DHS 寒 天 培 地 には 使 用 できない。β -グルクロ
ニダーゼや β -ガラクトシダーゼに 特 異 的 な 発 色 基 質 を 利 用 する 合 成 基 質 培 地 も 便
利 であるが、コロニーの 密 集 した 部 分 では 説 明 書 どおりの 色 調 を 示 さないことがある
( 図 2)。また、どの 培 地 においても 特 徴 的 な 色 調 のコロニーがすべて EHEC であると
は 限 らない。
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EHEC
O157
クロモアガーSTEC CIX Vi EHEC XM-EHEC
EHEC
O111
藤 色 青 色 〜 青 緑 色 無 色 中 心 部 褐 色 ( 赤 ) 紫 色
EHEC
O26
藤 色 群 青 色 〜 濃 紫 色 えんじ 色 白 濁 した( 赤 ) 紫 色
藤 色 群 青 色 〜 濃 紫 色 緑 色
青 紫 色
図 2 合 成 基 質 培 地 上 のEHECコロニー
集 団 事 例 などで 検 出 対 象 となる EHEC が 特 定 されている 場 合 は、その 株 に 適 した
分 離 培 地 を 使 用 するが、 日 常 検 査 では EHEC 分 離 用 の 培 地 を 数 種 類 準 備 することは
困 難 であり、 最 も 分 離 頻 度 の 高 い O157 検 出 用 培 地 と 一 般 的 な 大 腸 菌 分 離 培 地 の
併 用 が 現 実 的 である。CT 選 択 剤 を 加 えた 培 地 と 合 成 基 質 培 地 は 概 ね 同 程 度 の 選
択 性 を 示 し、O157、O26、O111 のほか O103 や O121、O145 の 多 くは 発 育 することか
ら、O157 検 出 用 培 地 の 濃 厚 発 育 部 位 をかき 取 って VT 遺 伝 子 または VT を 調 べ、 陽
性 の 場 合 は O157 疑 いコロニー 以 外 も 釣 菌 する。O91 や O165 など 選 択 性 の 高 い 培
地 には 発 育 しない 株 もあるため、EHEC 感 染 が 疑 われる 場 合 は、DHL 寒 天 培 地 など
の 一 般 的 な 大 腸 菌 分 離 培 地 から 多 数 のコロニーを 釣 菌 または 画 線 培 養 して、VT 遺
伝 子 または VT を 調 べる。なお、EHEC のスクリーニングに EHEC hemolysin(Ehly) 産
生 性 をみるエンテロヘモリジン 培 地 が 使 用 されることがあるが、あくまでも Ehly 産 生
性 は 指 標 であり、VT 産 生 性 と 一 致 しない。
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) 増 菌 培 養
急 性 期 の 患 者 便 では 増 菌 培 養 は 必 要 ないが、すでに 抗 菌 剤 が 使 用 されている 場
合 や、 下 痢 が 激 しく 糞 便 が 希 釈 されているときには、 増 菌 培 養 を 実 施 する。 増 菌 培 地
には、ノボビオシン( 最 終 濃 度 20 mg/L)を 加 えた modified EC 培 地 や CT 選 択 剤 を 添
加 したトリプトソイブロス(TSB)が 使 用 される。 増 菌 培 養 における 選 択 剤 の 適 否 や 最
適 培 養 条 件 ( 温 度 、 時 間 )についての 検 討 の 多 くは O157 の 検 出 を 目 的 にとしたもの
で、その 他 の O 抗 原 型 についても 有 用 であるかどうかは 不 明 である。
目 的 とする EHEC の 血 清 群 が 明 らかな 場 合 は、 免 疫 磁 気 ビーズを 用 いて 増 菌 培 養
液 から 集 菌 し、 分 離 培 地 に 塗 抹 する。 免 疫 磁 気 ビーズは O157、O26,O111 に 加 えて
O103、O145 が 市 販 されており、これ 以 外 の 血 清 群 については 各 種 抗 体 結 合 用 磁 気
ビーズ( 例 えば 抗 ウサギ IgG 抗 体 結 合 磁 気 ビーズ)と 目 的 とする 血 清 群 の 免 疫 血 清
(ウサギ 血 清 )を 用 いて 自 家 調 整 できる。
EHEC の 耐 酸 性 を 利 用 し、TSB で 6 時 間 培 養 した 増 菌 液 を 等 量 の 0.125N 塩 酸 加
0.5% 食 塩 水 と 混 合 してから 分 離 培 地 に 接 種 する 方 法 が 報 告 されているが、 分 離 培 地
には 選 択 性 の 低 い 培 地 を 併 用 することが 望 ましい。また、pH 3 に 調 整 した TSB に 糞
便 を 加 えて 30 分 間 静 置 した 後 、TYTP( 酵 母 エキス 12 g/L、TRIS 12.5 g/L、ピルビン
酸 ナトリウム 1 g/L を 加 えた TSB、pH 8.7)を 等 量 加 えて 42℃で 増 菌 する 方 法 も 報 告
されている。
c) 確 認 培 養
EHEC が 疑 われるコロニーを TSI 寒 天 培 地 、LIM 培 地 、CLIG 寒 天 培 地 、トリプトソイ
寒 天 斜 面 培 地 などに 釣 菌 する。 他 の 大 腸 菌 と 同 様 に EHEC の 多 くは 乳 糖 分 解 性 で、
リジン 脱 炭 酸 酵 素 陽 性 、 運 動 性 陽 性 、インドール 陽 性 を 示 すが、O111 や O165 はリジ
ン 脱 炭 酸 酵 素 陰 性 、 運 動 性 陰 性 が 多 い( 表 2)。
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表 2 主 なEHECの 鑑 別 性 状
血 清 群
TSI 寒 天 培 地
LIM 培 地
c)
糖 分 解 CT 加 平 板 EHEC
斜 面 高 層 H 2 S ガス リジン IND a) GUD b)
運 動 性 SOR RHAM での 発 育 hemolysin d)
O157 + e) + - + + + (+) - - - + +
O26 + + - + + + (+) + + - + +
O111 + + - + - + (-) + + + + +
O103 + + - + + + + + + d d +
O121 (+) f) + - + + + (+) + + + + +
O145 + + - + + + (-) + + + + +
O165 + + - - - + (-) + (+) - - -
a) インドール
b) β -グルクロニダーゼ
c) 48 時 間 培 養 での 成 績 、SOR:ソルビトール、RHAM:ラムノース
d) 10mM 塩 化 カルシウム 加 洗 浄 羊 赤 血 球 寒 天 培 地 での 溶 血 活 性
e) +; 陽 性 、(+); 殆 どの 株 は 陽 性 、-; 陰 性 、(-); 殆 どの 株 は 陰 性 、d; 株 によって 異 なる
f) ラクトース 陰 性 株 であっても 培 養 中 にラクトース 陽 性 株 を 生 じる
大 腸 菌 の 95%は β -グルクロニダーゼ 陽 性 であるが、EHEC O157 は β -グルクロニダ
ーゼ 陰 性 である。しかし、ドイツなどで 分 離 される EHEC O157:HNM はソルビトール 陽
性 ・β -グルクロニダーゼ 陽 性 を 示 すことが 多 く、 日 本 でも β -グルクロニダーゼ 陽 性
の EHEC O157 が 分 離 されている。
(3) EHEC の 同 定
下 記 に 示 す VT 遺 伝 子 検 出 またはVT 産 生 性 によって 決 定 する。 継 代 培 養 後 は VT
遺 伝 子 を 運 ぶファージが 欠 落 することが 頻 繁 に 報 告 されており、 検 出 は 出 来 るだけ
早 い 段 階 で 行 うのが 望 ましい。
a) VT 遺 伝 子 検 出 法
1) デンマークの 血 清 学 研 究 所 :Statens Serum Institut(SSI)の PCR プロトコール
ベロ 毒 素 は 免 疫 学 的 に 異 なる 2 種 類 の 毒 素 (VT1 [Stx1]と VT2 [Stx2])に 大 別 され、
これらをコードする 遺 伝 子 にはいくつかの 亜 型 (サブタイプ)がそれぞれ 存 在 する。こ
れらのサブタイプには 歴 史 的 な 背 景 から 名 称 が 統 一 されておらず、 混 乱 の 原 因 とな
っていた。デンマークの 血 清 学 研 究 所 :Statens Serum Institut(SSI)では、 新 しい 毒
素 名 として Vtx1 / Vtx2 という 名 称 を 提 案 し、それぞれの 検 出 プライマーがデザインさ
れている。 本 稿 では SSI で 行 われている PCR 法 について 述 べた 後 、それ 以 外 のプラ
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イマーセットについて 概 説 する。 統 一 された 新 しい 名 称 とこれまでの 名 称 との 関 係 に
ついては 添 付 の Vtx サブタイプ 対 応 表 を 参 照 されたい( 参 考 資 料 3)。なお、これらの
新 しい 名 称 についてはサブタイプを 表 記 する 必 要 がある 場 合 にのみ 限 定 し、 単 に 志
賀 (ベロ) 毒 素 1 型 および 2 型 を 表 記 する 場 合 は、これまで 同 様 VT1 / VT2(Stx1 /
Stx2)としていただきたい。なお、 英 文 のオリジナルプロトコールは 参 考 資 料 2, 3 の 通
りである。
・ 本 手 法 で 分 類 可 能 なバリアント
SSI の PCR 検 出 系 では 次 のサブタイプの 検 出 が 可 能 である( 参 考 資 料 3: Vtx サブ
タイプ 対 応 表 参 照 のこと): vtx1a, vtx1c, vtx1d, vtx2a, vtx2b, vtx2c, vtx2d, vtx2e,
vtx2f, vtx2g.
1 Template DNA の 作 製
・イエローチップ 等 の 先 端 でコロニーを 極 微 量 掻 き 取 って 滅 菌 水 50 μ l に 懸 濁 する.
・98℃で 5 分 以 上 加 熱 し, 10,000×g で 1 分 間 遠 心 した 上 清 を 使 用 する( 精 製 DNA を
用 いても 可 ).
・コントロール DNA:vtx 陽 性 株 ( 参 考 資 料 2, Appendix 2 参 照 )
2 Primers
参 考 資 料 2, Appendix 1 を 参 照 のこと.
3 PCR 反 応 液 の 組 成
2.5 μ l 滅 菌 脱 イオン 水 (ミリ Q 水 )
10 μ l master mix (HotStart, Qiagen)
1.25 μ l 5μ M プライマー( 2 種 類 の 場 合 ; 3 種 類 の 場 合 は 水 を 1.25μ l にする)
5 μ l 鋳 型 DNA
20 μ l total
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ただし、vtx1 のサブタイプ 検 出 には 以 下 の 組 成 を 用 いる。
12 μ l master mix (HotStart, Qiagen)
1 μ l 5μ M プライマー (vtx1c および vtx1d の 4 種 類 )
2 μ l 5μ M プライマー(vtx1a の 2 種 類 )
5 μ l 鋳 型 DNA
25 μ l total
4 反 応 条 件
vtx1 および vtx2 ( 共 通 プライマー) の 検 出 用 反 応 条 件
Step1: 95℃, 15 min
Step2: 94℃, 50 sec
Step3: 56℃, 40 sec
Step4: 72℃, 60 sec
Step5: go to step 2 (total 35 cycles)
Step6: 72℃, 3 min
Step7:
4℃ 保 存
vtx1 サブタイプおよび vtx2 サブタイプ 検 出 用 反 応 条 件
Step1: 95℃, 15 min
Step2: 94℃, 50 sec
Step3: 62℃, 40 sec
Step4: 72℃, 60 sec
Step5: go to step 2 (total 35 cycles)
Step6: 72℃, 3 min
Step7:
4℃ 保 存
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5 電 気 泳 動
通 常 のアガロース(1% TaKaRa LO3 in TAE など)ゲル 電 気 泳 動 で 当 該 サイズの 増 幅
産 物 を 確 認 する( 参 考 資 料 2 Figure 1-3).
6 参 考 文 献
参 考 資 料 2, 3 を 参 照 のこと。なお、サブタイプの 陽 性 コントロールについては、 感 染
研 ・ 細 菌 第 一 部 から 分 与 可 能 である。
2) その 他 の PCR プロトコール
SSI のプライマー 以 外 に 下 記 の 文 献 のプライマーおよび TAKARA から 販 売 されて
いるものが 使 用 可 能 である。それらのプライマーによるサブタイプ 検 出 能 については
下 記 の 表 3 ( 各 PCR プライマーによる vtx サブタイプ 検 出 能 の 比 較 ) を 参 照 のこと。
表 3 各 PCRプライマー 及 びLAMP 法 によるvtxサブタイプ 検 出 能 の 比 較
Subtype LAMP a) Linら Cebulaら Takara
up/down LP30/31LP43/44 EVT1/2 EVS1/2
1a + + + - + -
1c + + + - + -
1d (+) b) + - - + -
2a + + - + - +
2b + + - + - +
2c + + - + - +
2d + (+) - + - +
2e + + - + - +
2f - + - - - -
2g (+) (+) - + - +
a) Loopamp 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 検 出 試 薬 キットを 使 用
b) (+); 検 出 感 度 が 低 い
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3) Loop mediated isothermal amplification (LAMP) 法
PCR と 異 なり 反 応 終 了 後 に 電 気 泳 動 を 行 う 必 要 がないため 簡 便 な 遺 伝 子 検 出 法 で
ある。 以 下 のキットが 利 用 できる。
Loopamp 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 検 出 試 薬 キット( 栄 研 化 学 )
Loopamp ベロ 毒 素 (VT)タイピングキット( 栄 研 化 学 ):VT1 と VT2 を 区 別 できる。
対 応 機 種 :Loopamp リアルタイム 濁 度 測 定 装 置 (LA-320C 及 び RT-160C 等 : 栄 研
化 学 販 売 )。その 他 、 同 等 の 機 能 を 有 する 機 器 が 使 用 できる。
4) リアルタイム PCR 法
市 販 の VT 遺 伝 子 検 出 キットまたは 公 表 されている Primer 及 び Probe を 各 試 験 検
査 機 関 で 合 成 ・ 調 製 し 市 販 の Master Mix にて 反 応 を 行 う。これについて 下 記 のもの
が 利 用 できる。
CycleavePCR O-157(VT gene) Screening Kit(タカラバイオ)
対 応 機 種 :Thermal Cycler Dice Real Time System(タカラバイオ)、ABI PRISM 7000、
7300、7500、7700、7900(アプライド・バイオシステムズ ジャパン)、LightCycler Ver.
1.2、1.5、2.0 その 他 、 同 等 の 機 能 を 有 する 機 器 が 使 用 できる。
CycleavePCR O-157(VT gene) Screening Kit Ver. 2.0(タカラバイオ)
CycleavePCR O-157(VT1/VT2) Detection Kit Ver. 2.0(タカラバイオ): 前 述 の2つ
のキットと 異 なり VT1 と VT2 を 区 別 することが 出 来 る。
b) VT 検 出 法
免 疫 学 的 に VT を 検 出 する 方 法 は、イムノクロマト(IC) 法 、 逆 受 身 ラテックス 凝 集 反
応 (RPLA) 法 、 酵 素 抗 体 (EIA) 法 があり、それぞれ Duopath Verotoxins(Merck)、キャ
ピリア VT(タウンズ)、NH イムノクロマト VT1/VT2( 日 本 ハム)、VTEC-RPLA(デンカ
生 研 )、オーソ VT1/VT2(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス)が 市 販 されてい
る( 表 4)。
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表 4 VT 検 出 法 の 比 較
a)
測 定 原 理
IC
RPLA
商 品 名
(メーカー)
キャピリアVT
(タウンズ)
Duopath Verotoxins
(Merck)
NHイムノクロマト
VT1/VT2 d)
( 日 本 ハム)
VTEC-RPLA
(デンカ 生 研 )
(オーソ・クリニカル・
ダイアグノスティック
ス)
VT1, VT2
VT1, VT2
EIA オーソVT1/VT2 VT c)
b)
検 出 毒 素 主 な 操 作 と 判 定 方 法 所 要 時 間
VT c)
VT1, VT2
被 検 液 100μ lを 滴 下
する
ラインの 有 無 で 判 定
被 検 液 160μ lを 滴 下
する
ラインの 有 無 で 判 定
被 検 液 100μ lを 滴 下
する
ラインの 有 無 で 判 定
階 段 希 釈 した 被 検 液
25μ lを 試 薬 と 混 合 す
る
凝 集 価 1:4 以 上 で 陽
性
被 検 液 , 一 次 抗 体 , 二
次 抗 体 , 基 質 液 を 順
次 反 応 させる( 各 反 応
ごとに 洗 浄 操 作 が 必
要 )
測 定 波 長 450nm, 対
照 波 長 630nmで 吸 光
度 を 測 定 し0.150 以 上
で 陽 性
15 分
20 分
15 分
16 時 間
(4〜5 時 間 で
推 定 的 判 定
は 可 能 )
3 時 間
a) RPLA: 逆 受 け 身 ラッテクス 凝 集 反 応 , IC: イムノクロマト 法 , EIA: 酵 素 抗 体 法
b) 被 検 液 調 製 に 必 要 な 時 間 は 含 まない
c) VT1とVT2の 型 別 はできない
d) 食 品 検 査 用 試 薬
必 要 な 器 具
V 型 96 穴 プ
レートが 必
要
2 波 長 測 定
可 能 なマイ
クロプレート
リーダーが
必 要
VT は 志 賀 毒 素 と 同 一 の 抗 原 性 をもつ VT1 と 免 疫 学 的 に 異 なる VT2 があるが、 感 染
症 法 では VT を 産 生 する 大 腸 菌 を EHEC としており、 毒 素 型 の 決 定 までは 求 めていな
い。 上 記 製 品 のうち VTEC-RPLA、Duopath Verotoxins、NH イムノクロマト VT1/VT2
は VT1、VT2 の 型 別 が 可 能 である。
IC 法 は、 試 料 滴 下 部 に 100 または 160μ l の 被 検 液 を 滴 下 後 15〜20 分 後 に 判 定 で
きることから、 迅 速 で 簡 便 な 方 法 として 優 れているが、 検 出 感 度 は RPLA 法 に 比 べ 4
倍 程 度 低 い。RPLA 法 は 安 価 な 上 、 検 出 感 度 は 約 1 ng/mL と 高 いが、 被 検 液 と 試 薬
を 混 合 後 判 定 までに 16 時 間 以 上 静 置 する 必 要 がある。EIA 法 は RPLA 法 と 同 程 度
かやや 高 い 感 度 を 有 し 約 3 時 間 で 判 定 できる。 測 定 波 長 (450 nm)と 対 照 波 長 (630
13

nm)で 測 定 可 能 なマイクロプレートリーダーが 必 要 であるが、 多 検 体 処 理 能 力 に 優 れ
ている。
いずれの 製 品 も 被 検 液 の 調 整 には、BHI や SMAC など 寒 天 培 地 発 育 コロニーをポ
リミキシン B 溶 液 や 検 体 希 釈 液 にかき 取 る 方 法 と、CAYE 培 地 などの 液 体 培 地 を 用
いる 方 法 があり、 製 品 によって 菌 量 や 培 養 条 件 が 多 少 異 なっている。IC 法 や EIA 法
では、 菌 の 濃 度 が 極 端 に 濃 いと 偽 陽 性 を 示 す 場 合 がある。
VT2 バリアントのうち、O157 に 多 い VT2c は VT2 に 比 べ RPLA 法 の 検 出 感 度 が 低
く、IC 法 や EIA 法 では 検 出 されないことがある。ソルビトール 陰 性 ・β -グルクロニダー
ゼ 陰 性 の 典 型 的 な 性 状 を 示 す O157 で VT 陰 性 の 場 合 は VT 遺 伝 子 を 確 認 すること
が 望 ましい。このほかのサブタイプについては、ヒト 由 来 株 での 分 離 頻 度 は 不 明 であ
るが、 免 疫 学 的 に 検 出 できないことも 多 い( 表 5)。
表 5 VT 検 出 法 の 比 較
EIA a) RPLA b) Duopath VT c) NH-VT d)
Subtype
e)
e)
e)
e)
被 検 株 数 陽 性 陰 性 被 検 株 数 陽 性 陰 性 被 検 株 数 陽 性 陰 性 被 検 株 数 陽 性 陰 性
1a 3 3 8 8 4 4 4 4
1c 1 1 3 3 3 3 3 3
1d 5 3 2 3 3 3 3 3 3
2a 3 3 9 9 4 4 4 4
2b 2 2 8 6 2 8 8 6 6
2c 10 4 6 13 12 1 12 7 5 10 1 9
2d 6 6 6 6 6 3 3 6 1 5
2e 7 7 10 10 6 6 6 6
2f 12 12 12 11 1 12 12 12 3 9
2g 2 2 2 1 1 2 1 1 1 1
Total 51 20 31 74 59 15 60 25 35 55 19 36
a) オーソVT1/VT2を 使 用 。TSB 発 育 菌 50μ Lを 検 体 希 釈 液 200μ Lに 加 えて 混 和 後 100μ Lを 被 検 液 とした。
b) VTEC-RPLAを 使 用 。CAYE 培 養 液 をポリミキシンB 処 理 して 被 検 液 とした。
c) Duopath Verotoxinsを 使 用 。CAYE 培 養 液 をポリミキシンB 処 理 して 被 検 液 とした。
d) NHイムノクロマトVT1/VT2を 使 用 。CAYE 培 養 液 をポリミキシンB 処 理 して 被 検 液 とした。
e) 実 施 ごとに 判 定 が 異 なるは 場 合 は 陰 性 とした。
(4) 血 清 型 別
現 在 、 大 腸 菌 の O 抗 原 は O1-O187 まで(このうち、O31, O47, O67, O72, O94, O122
は 欠 番 となっているため、 合 計 181 種 類 ) 定 義 されており、H 抗 原 は H1-H56 まで(こ
のうち、H13, H22, H50 は 欠 番 となっているため、 合 計 53 種 類 ) 定 義 されている。これ
らのフルセットの 抗 血 清 は SSI から 購 入 可 能 である。 一 方 、デンカ 生 研 から 販 売 され
14

ている 抗 大 腸 菌 抗 血 清 は、O 抗 原 が 50 種 類 、H 抗 原 は 22 種 類 のみである。 大 腸 菌
の O 抗 原 は 互 いに 免 疫 学 的 に 交 差 する 場 合 があるため、 稀 な O 抗 原 型 の 場 合 は、
フルセットを 用 いた 確 認 または 定 量 凝 集 反 応 法 による 血 清 型 参 照 株 との 比 較 が 必 要
である。
a) 菌 体 抗 原 (O 抗 原 )
純 培 養 菌 を 生 理 食 塩 水 に 懸 濁 して 100℃で 60 分 または 121℃で 15 分 加 熱 処 理 を
行 った 死 菌 液 を 抗 原 とし、スライド 凝 集 反 応 で 実 施 する。
EHEC の 代 表 的 な 血 清 群 である O157 については、ラテックスに 抗 O157 抗 体 を 感 作
させた 大 腸 菌 O157 検 出 試 薬 UNI(OXOID)があり、 特 異 性 、 感 度 ともに 優 れている。
しかし、O157 抗 原 は Salmonella O30 および 一 部 の Citrobacter freundii と 血 清 学 的
に 一 致 することから、 大 腸 菌 と 同 定 された 菌 株 で 実 施 しなければならない。
b) 鞭 毛 抗 原 (H 抗 原 )
クレイギー 管 を 入 れた 半 流 動 培 地 (SIM 培 地 など)で 3~5 本 継 代 培 養 し、 運 動 性 を
増 強 した 菌 を 液 体 培 地 に 接 種 して 静 置 培 養 後 、 等 量 の 1%ホルマリン 加 生 理 食 塩 水
を 加 えて 抗 原 液 とする。 凝 集 反 応 は 試 験 管 法 で 実 施 し、50℃の 恒 温 水 槽 で 30~60
分 反 応 させて 凝 集 を 観 察 する。
3. 血 清 学 的 診 断 法
EHEC が 分 離 されない HUS 発 症 例 においては、 血 清 中 の O 抗 原 凝 集 抗 体 の 検 出
によって 診 断 された 場 合 も 届 出 の 対 象 となっている。O 抗 原 凝 集 抗 体 価 は 下 痢 発 症
後 2-6 日 目 に 上 昇 することがわかっており( 図 3)、 発 症 直 後 と 数 日 後 のペア 血 清 で
抗 体 価 の 上 昇 を 確 認 することが 望 ましい。HUS 発 症 後 でも 複 数 の 血 清 について 測 定
した 方 が 良 い。HUS と 診 断 される 前 に 採 血 される 症 例 は 少 ないので、 発 症 日 は 重 要
な 情 報 となる。
15

図 3. 病 日 によるO157 抗 体 価 の 変 動 ( 試 験 管 法 による 判 定 )
EHEC O157 陽 性 者 およびHUS 患 者 で、 採 血 病 日 がわかっている 検 体
について、 病 日 ごとの 抗 体 価 の 変 動 をグラフにしたところ、 発 症 から4 病
日 までは 陰 性 - 疑 陽 性 域 であるが、5-6 病 日 には 陽 性 域 に 達 し、40-
45 日 程 度 持 続 することが 確 認 された
小 林 ら
。
O157LPS 抗 体 については、O157 チェック「LPS 抗 体 」( 三 菱 化 学 メディエンス)が 市
販 されており、ラテックス・スライド 凝 集 反 応 により 簡 便 に 検 出 できる。 自 家 調 整 した
加 熱 死 菌 液 を 抗 原 に 用 いた 定 量 菌 体 凝 集 反 応 による 抗 体 価 測 定 法 を 以 下 に 示 す。
(1) 抗 原 液 の 作 製 と 保 存
1) EHEC 感 染 が 疑 われる HUS 患 者 から 分 離 される EHEC のうち、 国 内 で 起 因 菌 と
して 分 離 頻 度 が 高 い 7 種 類 の 大 腸 菌 O 血 清 群 の 分 離 株 (O157, O111, O26,
注
O103, O145, O121, O165)を 用 いる 。 用 いる 菌 株 は、0.5%(W/V)アクリフラビン
に 非 凝 集 性 (もしくは 100℃ 30 分 加 熱 で 非 沈 殿 性 )、または 1 mg/l の TTC(2, 3,
5-triphenyltetrazoliumchloride)を 含 む antibiotic medium 3 平 板 培 地 でスムース
型 集 落 ( 実 体 顕 微 鏡 観 察 で 表 面 に 凹 凸 が 少 なく、TTC の 色 素 でよく 染 まっている
もの)を 選 択 するのが 望 ましい。
2) 深 型 シャーレで 1 cm 以 上 の 厚 さにトリプトソイ 寒 天 (TSA)を 作 製 し(または 大 試
験 管 [19 mm× 160 mm 程 度 の 大 きさのもの] で 作 製 した TSA 斜 面 培 地 に)、
16

菌 を 全 面 塗 布 して 37℃ 一 夜 培 養 する。
3) 2 -5 ml の 生 理 食 塩 水 ( 生 食 水 )または PBS に TSA 発 育 菌 を 全 て 掻 き 取 って 濃
厚 に 懸 濁 し、121℃で 1 時 間 オートクレーブする。
4) 遠 心 分 離 (スイングローター 等 で 1,500-2,000×g, 15 分 間 ) 後 、 上 清 を 捨 て 再 度
2-5 ml 程 度 の 生 食 水 または PBS に 懸 濁 する。 遠 心 洗 浄 をさらに 1-2 回 繰 り 返
し、 最 後 に 200×g, 5 分 間 遠 心 し、 上 清 に 2%ホルマリン 加 生 食 水 (PBS)を 等 量
加 え、37℃で1 時 間 静 置 したものを 抗 原 として 使 用 する。 作 製 した 抗 原 は 4℃で 数
ヶ 月 は 保 存 可 能 である。
抗 原 液 の 標 準 化 : 抗 原 液 は、あらかじめデンカ 生 研 の 抗 血 清 を 用 いて、 凝 集
価 を 測 定 しておく。 新 しく 抗 原 液 を 作 製 した 場 合 は、 同 一 ロットの 抗 血 清 で 同 じ
凝 集 価 を 示 すことを 確 認 してから 使 用 する。
5) 使 用 に 際 しては 生 食 水 または PBS で 遠 心 洗 浄 し、 濁 度 を McFarland No.3.0 とな
るように 調 整 し、 抗 原 液 とする。
(2) 血 清 の 非 働 化
HUS 患 者 血 清 は 56℃ 30 分 で 非 働 化 し、10,000 ×g で 1 分 間 程 度 遠 心 した 後
の 上 清 を 使 用 する。
(3) 抗 体 価 測 定 法
a) 試 験 管 法
1) ガラス 試 験 管 (12 mm × 90 mm)を 使 用 する 抗 原 数 (ここでは 3 種 類 ) × 8
列 並 べ、1 列 の 1 本 目 に 生 食 水 1,080 μ l を、1 列 の 2-8 本 目 に 生 食 水 600 μ l
を 分 注 する。
2) 1 列 の 1 本 目 に 血 清 120 μ l を 加 えて 10 倍 希 釈 液 とし、よく 混 合 した 後 600 μ l
を 2 本 目 へ 移 し、2-8 本 目 まで 2 倍 階 段 希 釈 する。
3) 1 列 目 の 希 釈 液 を 200μ l ずつ 2 列 目 と 3 列 目 に 移 す。
4) 各 列 に、 濃 度 を 調 整 した 抗 原 液 を 各 200 μ l 加 える( 血 清 の 最 終 希 釈 濃 度 は 20
倍 から 2,560 倍 までとなる)。 別 の 試 験 管 に 生 食 水 200 μ l と 抗 原 液 200 μ l を
加 え、 抗 原 液 だけの 対 照 とする。
5) 試 験 管 立 てごと 軽 く 揺 すって 混 合 し、50℃の 恒 温 水 槽 で 一 夜 静 置 する。
17

6) 凝 集 の 有 無 を 観 察 し、 血 清 の 最 終 希 釈 倍 数 を 抗 体 価 とする。
b) 96 穴 プレート 法
1) 血 清 の 希 釈 は 試 験 管 法 と 同 様 に 10 倍 希 釈 から 1,280 倍 希 釈 まで 行 う( 容 量 は
血 清 量 または 検 査 する 抗 原 の 種 類 によって 適 宜 変 更 する)。
2) U 底 または V 底 の 96 穴 プレート(ふた 付 き, コーティングなし)に 抗 原 25 μ l と
希 釈 血 清 25 μ l を 加 え、プレートミキサー 等 で 十 分 混 和 する( 血 清 の 最 終 希 釈
濃 度 は 20 倍 から 2,560 倍 までとなる)。
3) 50℃で 1 時 間 静 置 する。
4) 室 温 に 戻 して 1-2 時 間 後 に 凝 集 の 有 無 を 観 察 し、 血 清 の 最 終 希 釈 倍 数 を 抗
体 価 とする。 最 終 判 定 は 室 温 で 一 夜 放 置 後 、 翌 日 に 行 う。 陽 性 コントロールとし
てデンカ 生 研 のウサギ 抗 血 清 に 各 抗 原 液 を 混 合 したもの、 陰 性 コントロールとし
て 生 食 水 または PBS に 各 抗 原 液 を 混 合 したものをそれぞれ 使 用 し、 凝 集 の 有 無
を 確 認 する。
(4) 判 定
1) 試 験 管 法 : 抗 体 価 陽 性 域 は 最 終 希 釈 倍 率 が 320 倍 以 上 、80-160 倍 は 疑 陽 性
域 、40 倍 以 下 は 陰 性 域 と 判 定 する。
96 穴 プレート 法 : 抗 体 価 陽 性 域 は 最 終 希 釈 倍 率 が 160 倍 以 上 、40-80 倍 は 疑 陽
性 域 、20 倍 以 下 は 陰 性 域 と 判 定 する。
2) 疑 陽 性 域 の 場 合 は、 採 血 日 の 異 なる 血 清 で 再 検 査 をすることが 望 ましい。( 図 3
照 )
3) 陽 性 コントロール、 陰 性 コントロールの 結 果 を 確 認 する。
4) 特 定 の O 血 清 群 に 凝 集 が 見 られることを 確 認 する(ただし、2 種 類 以 上 の O 抗 原
に 対 して 凝 集 が 見 られる 血 清 も 存 在 する)。
5) RPLA 法 と 同 じく「 遅 滞 現 象 」により、 血 清 濃 度 の 高 いところで 陰 性 にみえる 場 合
があるので、 希 釈 倍 率 の 高 いウエルもよく 観 察 する。
注
: 状 況 に 応 じて 使 用 する 抗 原 の 種 類 を 決 定 する。 集 団 発 生 等 ですでに 特 定 の O 血
清 群 の EHEC が 分 離 されている 場 合 などは、 当 該 O 血 清 群 と 代 表 的 な O 血 清 群
18

(O157, O26, O111 など)に 絞 る。 国 内 の HUS 事 例 のおよそ 80%は O157 の EHEC が
原 因 となっており、 O26 と O111 を 併 せた 3 種 類 の EHEC で 全 体 のおよそ 85%を 占
める。 使 用 する 分 離 株 には 指 定 はないが、 検 査 ごとに 陽 性 コントロール(デンカ 血 清
による 凝 集 あり)および 陰 性 コントロール( 生 食 水 または PBS による 凝 集 なし)の 結 果
を 確 認 する。
4. 参 考 文 献
齊 藤 剛 仁 , 他 , 病 原 微 生 物 検 出 情 報 :IASR Vol. 32 p. 141-143: 2011 年 5 月 号 ;IASR
Vol. 31 p. 170-172: 2010 年 6 月 号 ;IASR
Lin Z, Kurazono H, Yamasaki S, Takeda Y.
Detection of various variant verotoxin genes in Escherichia coli by polymerase chain
reaction. Microbiol Immunol. 1993. 37(7): 543-548.
Cebula TA, Payne WL, Feng P.
Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their
Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR. J
Clin Microbiol. 1995. 33(1): 248-250.
小 林 一 寛 , 田 口 真 澄 , 勢 戸 和 子 , 吉 矢 邦 彦 , 村 上 城 子 . 下 痢 患 者 におけるベロ 毒 素
産 生 性 大 腸 菌 血 清 学 的 診 断 法 について. 感 染 症 学 雑 誌 1996, 70(1):80-8
19

5. 参 考 資 料 1
(1) O 抗 原 合 成 遺 伝 子 の 検 出
大 腸 菌 の O-antigen gene cluster は 染 色 体 上 の galF と gnd 遺 伝 子 間 に 存 在 し、
血 清 群 特 異 的 な 配 列 を 標 的 とすることにより 血 清 群 特 異 的 PCR 反 応 系 を 確 立 するこ
とができる 1) 。 血 清 群 特 異 的 な 配 列 としては O-antigen flippase 遺 伝 子 (wzx)と
O-antigen polymerase 遺 伝 子 (wzy)が 用 いられる 場 合 が 多 い。これまでに O15 2) 、O26
3) 、O45 4) 、O55 4) 、O86 5) 、O91 6) 、O103 7) 、O104 8) 、O111 9) 、O113 3) 、O114 10) 、O121 1) 、
O145 11) 、O157 12) 、O172 13) 、O174 14) 、O177 14) 抗 原 検 出 用 PCR が 報 告 されている。
これらのうち、 検 出 頻 度 が 比 較 的 高 い EHEC である O26 3) 、O91 6) 、O103 7) 、O111 9) 、
O121 1) 、O145 11) 、O157 12) 抗 原 検 出 用 PCR のプライマーと 増 幅 断 片 サイズ、 原 報 に
記 載 されているアニーリング 温 度 と 文 献 を 表 6 に 示 す。
一 方 、 大 腸 菌 の H 抗 原 特 異 的 検 出 PCR に 関 する 報 告 15) もみられ、fliC H7 遺 伝 子
を 標 的 とした H7 抗 原 同 定 用 プライマーと 増 幅 断 片 を 表 6 に 示 す。 運 動 性 を 示 さない
大 腸 菌 でも 多 くは fliC 陽 性 であり、PCR 法 で 型 別 できるが、 運 動 性 陽 性 株 と 区 別 する
表 記 ( 例 えば O157:[H7])が 望 ましい。
20

表 6
各 種 O 抗 原 およびH7 抗 原 同 定 用 PCRのプライマーと 増 幅 断 片 サイズ
抗 原 標 的 遺 伝 子 プライマー 名 称 プライマー 配 列 増 幅 断 片 サイズ(bp) アニーリング 温 度 (℃) 文 献
O26 wzx F GCG-CTG-CAA-TTG-CTT-ATG-TA
R TTT-CCC-CGC-AAT-TTA-TTC-AG 152 54 Appl. Environ. Mirobiol. 70 1830 (2004)
wzy F TAA-ATT-GCG-GGG-AAA-GAA-TG
R GAC-TTC-ATG-GGT-ACC-GCC-TA 276 60
O91 wbsD P47B GCT-GAC-CTT-CAT-GAT-CTG-TTG-A
P47C TAA-TTT-AAC-CCG-TAG-AAT-CGC-TGC 291 62 J. Appl. Microbiol. 93 759 (2003)
wzy P50A TCT-GGA-ATG-CTT-GAT-GAA-CCT-GGG-T
P50B ACG-CCG-TGT-TTG-AAA-GAT-AAG-CCC-C 177 65
O103 wzx O103wzxF TTG-GAG-CGT-TAA-CTG-GAC-CT
O103wzxR GCT-CCC-GAG-CAC-GTA-TAA-G 321 57 Can. J. Microbiol. 51 515 (2005)
wzy O103wzyF ATA-CAA-AAT-ATG-GCG-TGG-ATT-GG
O103wzyR GCC-AGT-AAT-TGA-CGT-AAC-TGC-TC 280 57
O111 O111rfb ORF 3.4 O111 F TAG-AGA-AAT-TAT-CAA-GTT-AGT-TCC J. Clin. Microbiol. 36 598 (1998)
O111 R ATA-GTT-ATG-AAC-ATC-TTG-TTT-AGC 406 60
O121 wzx O121wzx1F AGG-CGC-TGT-TTG-GTC-TCT-TA
O121wzx1R TCG-CTA-CCG-CTA-ATG-ATT-CC 310 57 J. Clin. Microbiol. 41 3379 (2003)
wzy O121wzy1F AGC-CGG-TAG-TGT-TGA-AAG-GA
O121wzy1R CTT-CAA-TGA-GTG-CAG-GCA-AA 299 63
O145 wzx wl-2131 CCA-TCA-ACA-GAT-TTA-GGA-GTG
wl-2132 CTA-TCT-AAG-CGC-CAT-CTT-T 610 59 J. Bacteriol. 187 758 (2005)
wzy wl-2135 TGC-CAC-TGA-TGG-GAT-TAG
wl-2136 ATA-GGC-CCG-AAA-GTT-TAA-GT 646 59
O157 rfbO157 O157PF8 CGT-GAT-GAT-GTT-GAG-TTG Appl. Environ. Mirobiol. 65 2954 (1999)
O157PR8 AGA-TTG-GTT-GGC-ATT-ACT-G 420 55
H7 fliCH7 FLICH7-F GCG-CTG-TCG-AGT-TCT-ATC-GAG-C J. Clin. Microbiol. 35 656 (1997)
FLICH7-R CAA-CGG-TGA-CTT-TAT-CGC-CAT-TCC 625 65
21

( 文 献 )
1) Fratamico PM,Briggs CE, Needle D,Chen CY,DebRoy C: Sequence of the
Escherichia coli O121 O-Antigen Gene Cluster and Detection of
Enterohemorrhagic E. coli O121 by PCR Amplification of the wzx and wzy Genes.
J Clin Microbiol 2003;41:3379-83.
2)Beutin L,Tao J,Feng L,Krause G,Zimmermann S,Gleier K,et al.:Sequence
analysis of the Escherichia coli O15 antigen gene cluster and development of a
PCR assay for rapid detection of intestinal and extraintestinal pathogenic E. coli
O15 strains.J Clin Microbiol 2005;43:703-10.
3) DebRoy C,Roberts E,Kundrat J,Davis MA,Briggs CE,Fratamico PM:
Detection of Escherichia coli Serogroups O26 and O113 by PCR Amplification of
the wzx and wzy Genes.Appl Environ Microbiol 2004;70:1830-32.
4)DebRoy C,Fratamico PM,Roberts E,Davis MA,Liu Y:Development of PCR
assays targeting genes in O-antigen gene clusters for detection and identification
of Escherichia coli O45 and O55 serogroups.Appl Environ Microbiol 2005;71:
4919-24.
5)Feng L,Han W,Wang Q,Bastin DA,Wang L:Characterization of Escherichia coli
O86 O-antigen gene cluster and identification of O86-specific genes.Vet
Microbiol 2005;10:241-8.
6)Perelle S,Dilasser F,Grout J,Fach P:Identification of the O-antigen
biosynthesis genes of Escherichia coli O91 and development of a O91 PCR
serotyping test.J Appl Microbiol 2002;93:758-64.
7)Fratamico PM, DebRoy C, Strobaugh TP Jr, Chen CY:DNA sequence of the
Escherichia coli O103 O antigen gene cluster and detection of enterohemorrhagic
E. coli O103 by PCR amplification of the wzx and wzy genes.Can J Microbiol
2005;51:515-22.
8)Wang L,Briggs CE,Rothemund D,Fratamico P,,Luchansky JB,Reeves PR:
Sequence of the E. coli O104 antigen gene cluster and identification of O104
specific genes.Gene 2001;270:231-6.
22

9)Paton AW,Paton JC:Detection and Characterization of Shiga Toxigenic
Escherichia coli by Using Multiplex PCR Assays for stx1, stx2, eaeA,
Enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfbO111, and rfbO157.J Clin Microbiol 1998;36:
598-602.
10)Feng L,Wang W,Tao J,Guo H,Krause G,Beutin L,et al.: Identification of
Escherichia coli O114 O-antigen gene cluster and development of an O114
serogroup-specific PCR assay.J Clin Microbiol 2004;42:3799-804.
11)Feng L,Senchenkova SN,Tao J,Shashkov AS,Liu B, Shevelev SD,et al.:
Structural and Genetic Characterization of Enterohemorrhagic Escherichia coli
O145 O Antigen and Development of an O145 Serogroup-Specific PCR Assay. J
Bacteriol 2005;187:758-64.
12) Maurer JJ , Schmidt D , Petrosko P , Sanchez S , Bolton L , Lee MD :
Development of Primers to O-Antigen Biosynthesis Genes for Specific Detection
of Escherichia coli O157 by PCR. Appl Environ Microbiol 1999;65:2954-60.
13)Guo H,Feng L,Tao J,Zhang C,Wang L:Identification of Escherichia coli O172
O-antigen gene cluster and development of a serogroup-specific PCR assay.J
Appl Microbiol 2004;97:181-90.
14)Beutin L,Kong Q,Feng L,Wang Q,Krause G,Leomil L,et al.: Development of
PCR assays targeting the genes involved in synthesis and assembly of the new
Escherichia coli O 174 and O 177 O antigens.J Clin Microbiol 2005;43:5143-9.
15) Gannon VP,D'Souza S,Graham T,King RK,K Rahn K,Read S:Use of the
flagellar H7 gene as a target in multiplex PCR assays and improved specificity in
identification of enterohemorrhagic Escherichia coli strains.J Clin Microbiol
1997;35:656-62.
23

(2) 免 疫 磁 気 ビーズの 作 製 方 法
ここでは、 大 腸 菌 血 清 O 群 に 対 応 する 免 疫 磁 気 ビーズは、ダイナル 社 の 二 次 抗 体
結 合 ビーズ 処 理 マニュアルに 従 って 作 製 する。
準 備 するもの
Dynabeads R M‐280(Sheep anti-Rabbit IgG,10 4 /ml/beads,10ml
洗 浄 液 PBS/ FCS-NaN 3 (pH7.4)
NaH 2 PO 4 -H 2 O
NaH 2 PO 4 -12H 2 O
NaCl
H 2 O
0.16 g
1.98 g
8.10 g
1,000ml
FCS (ウシ 胎 児 血 清 ) 1.00% (56℃で 30 分 間 非 動 化 してから 使 用 )
NaN 3 0.02%
免 疫 磁 気 ビーズ 保 存 液
洗 浄 液 と 同 じ 組 成 であるが、FCS の 濃 度 を 0.1%とする。
大 腸 菌 O 群 免 疫 血 清 (デンカ 生 研 )
分 離 培 地
ビーズの 感 作 方 法
1.M-280 500 μ l をマイクロチューブに 入 れ、 磁 石 で 集 め、 浮 遊 液 をマイクロピペット
で 除 去 し、 洗 浄 液 を 500 μ l 入 れて 再 浮 遊 させる。これを 3 回 繰 り 返 す。
2.このビーズ 浮 遊 液 に 対 象 とする 大 腸 菌 O 群 の 免 疫 血 清 10 μ l を 加 える。 加 える
免 疫 血 清 量 の 目 安 は 2 μ g antibody/10 7 ビーズである。( 正 常 家 兎 全 血 清 中
の IgG 量 が 約 20 mg/ml であることから、ビーズ 浮 遊 原 液 1 ml (10 8 ビーズ/ml に
対 して 免 疫 血 清 1 μ l で 十 分 と 考 えられる)
3.4℃ 18 時 間 の 条 件 で 穏 やかに 振 とうする。
4. 免 疫 磁 気 ビーズを 磁 石 で 集 め、1 と 同 様 の 操 作 で、 洗 浄 液 で 5~6 回 洗 浄 する。
5. 最 後 に 磁 石 で 集 めたビーズを 保 存 液 に 浮 遊 させ、4℃で 保 管 する。
6. 作 製 したビーズが 対 象 とした O 血 清 群 の 大 腸 菌 を 回 収 できるか、 添 加 回 収 試 験
等 で 検 証 する。
24

7. 保 管 期 限 は 明 らかではないため、 実 際 に 使 用 する 際 には、 必 ず 陽 性 コントロール
をたてる。 陽 性 コントロールには、VT 遺 伝 子 を 保 有 しない 同 一 の O 群 大 腸 菌 を
使 用 する。
6. 検 査 依 頼 先
各 都 道 府 県 の 地 方 衛 生 研 究 所 を 対 象 とする。
7. 執 筆 者 一 覧
地 方 衛 生 研 究 所
八 柳 潤 ( 秋 田 県 健 康 環 境 センター)
横 山 栄 二 ( 千 葉 県 衛 生 研 究 所 )
国 立 感 染 症 研 究 所 細 菌 第 一 部
伊 豫 田 淳
寺 嶋 淳
小 西 典 子 ( 東 京 都 健 康 安 全 研 究 センター)
松 本 昌 門 ( 愛 知 県 衛 生 研 究 所 )
磯 部 順 子 ( 富 山 県 衛 生 研 究 所 )
勢 戸 和 子 ( 大 阪 府 立 公 衆 衛 生 研 究 所 )
横 田 正 春 ( 堺 市 衛 生 研 究 所 )
田 内 敦 子 ( 広 島 市 衛 生 研 究 所 )
堀 川 和 美 ( 福 岡 県 保 健 環 境 研 究 所 )
25

WHO Collaborating Centre for Reference and Research on
Escherichia and Klebsiella
Identification of three vtx1 and seven vtx2 subtypes of
Verocytotoxin encoding genes of Escherichia coli
by conventional PCR amplification
Statens Serum Institut, Artillerivej 5, DK-2300 Copenhagen S, Denmark.
Phone +45 3268 3334 Fax +45 3268 8238 e-mail fsc@ssi.dk

WHO Collaborating Centre for Reference and Research on
Escherichia and Klebsiella
INDEX
1. Aim and field of application
2. Procedure
2.1 Principle of the method
2.2 Template preparation
2.3 Setting up the PCR reaction
2.4 Agarose gel electrophoresis
2.5 Devices/Instruments
2.6 Reagents and media
2.7 Safety and protection devices
2.8 Reference Strains
2.9 Interpretation of the results
Appendix 1
− Primers
Appendix 2
− Reference strains
Appendix 3
− References
Statens Serum Institut, Artillerivej 5, DK-2300 Copenhagen S, Denmark.
Phone +45 3268 3334 Fax +45 3268 8238 e-mail fsc@ssi.dk

WHO Collaborating Centre for Reference and Research on
Escherichia and Klebsiella
1. Aim and field of application
Verocytotoxins (VT), synonymous Shiga toxins, are a toxin family characterized by an
elevated degree of diversity. The VT family is divided into two branches, VT1 and
VT2, based on their antigenic differences. The terms “VT1” and “VT2” were also
used to describe the prototypic toxins first described in each branch. Many toxin
variants have been described in either branch and it has been recommended that VT
family members be classified based on phenotypic differences, biologic activity and
hybridization properties (O'Brien et al. 1994).
Classification of VT variants does not represent only a taxonomic exercise: some of the
variants are clinically relevant in that they are produced by strains isolated from cases
of haemolytic uremic syndrome (HUS), while some others are primarily associated
with milder course of disease or are probably not produced by E. coli strains causing
human disease (Friedrich et al. 2002; Bielaszewská et al. 2006; Persson et al. 2005).
Different systems of nomenclature have been proposed and used for VT variants and
their coding genes (vtx) (O'Brien et al. 1994). A consensus on a comprehensive
proposal of nomenclature has been reached during the 7 th International Symposium
on VTEC held in 2009. This proposal is going to be published and introduces three
levels of designations:
1. Types
The two major branches VT1 and VT2 that share structure and function but that are
not cross neutralized with heterologous antibodies. The terms VT1 and VT2 should
only be used when the subtype is unknown.
2. Subtypes
The antigenically related members of the two main types, which are suffixed with
small Arabic letters (e.g. VT1a).
3. Variants
Variants include the subtype specific prototypic toxins or related toxins within a
subtype (that differ by one or more AAs from the prototype). The variants are
designated by toxin subtype, O group of the host E. coli strain, followed by the strain
name or number from which that toxin was described. (e.g. VT1a-O157-EDL933 or
VT2c-O157-E32511). Nucleotide variants within a given VT subtype are italicised e.g.
vtx2c-O157-E32511 is a nucleotide variant that encodes VT2c-O157-E32511.
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The present method concerns the identification of the three vtx1 subtypes and the
seven vtx2 subtypes of VT encoding (vtx) genes of E. coli by conventional PCR
amplification. It is intended for application on isolated VTEC strains.
The vtx gene subtypes that represent the target of this method are:
For vtx1:
vtx1a, vtx1c, vtx1d
For vtx2:
vtx2a, vtx2b, vtx2c, vtx2d, vtx2e, vtx2f and vtx2g.
2. Procedure
2.1 Principle of the method
The method is based on PCR amplification of specific DNA regions from a template
DNA, with oligonucleotides triggering the start of the PCR reaction.
The procedure includes a first phase of identification of the vtx gene types (vtx1
and/or vtx2) possessed by the strain under examination. The primers for this
preliminary typing step are included in the table in Appendix 1. The second phase
concerns the detection of the vtx gene subtypes and is performed by specific PCR
reactions, using primers designed on the basis of analyses of existing vtx sequences
(reported in Appendix 1).
The method is composed of the following steps:
• Template preparation
• Setting up the PCR reaction
• Determination of the PCR results by agarose gel electrophoresis.
2.2 Template preparation
Isolated strains are streaked onto solid media (e.g. TSA) and incubated over night.
A single bacterial colony is inoculated in TSB and incubated over night.
25 µl of the overnight culture are added to 975 µl Milli Q water in Eppendorf tube and
boiled for 15 minutes. Centrifuge at 18.000 g 5 minutes. Upon transfer to a clean tube,
the supernatant is used directly for PCR and stored at -18ºC for further analyses.
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5.3 Setting up the PCR reaction
PCR assays are set up in a total volume of 20 µl for standard PCR and 25 µl for triplex
PCR as described in Appendix 1 (stock solution of primers is 5 µM) and 5 µl
supernatant of boiled lysate (stock template prepared as described above) and Milli Q
water up to 20 or 25 µl.
Standard PCR in total volume of 20 µl:
2.5 µl H 2 O §
10 µl Mastermix (HotStart, Qiagen),
1.25 µl of each of two primers (STOCK solution of primers is 5 µM) §
5 µl supernatant of boiled lysate (STOCK)
§ If three primers are used (vtx2a or vtx2d if primer vtx2d-O55-R is excluded), H 2 O volume
is reduced to 1.25 µl; If four primers are used (all vtx2d or detection of all vtx2 variants),
H 2 O is NOT added!
Triplex-PCR for subtyping of vtx1
PCR in total volume of 25 µl:
12 µl Mastermix (HotStart, Qiagen),
1 µl of each of the four primers for vtx1c and vtx1d (STOCK solution of primers is 5 µM)
2 µl of each of two primers for vtx1a (STOCK solution of primers is 5 µM)
5 µl supernatant of boiled lysate (STOCK)
The thermo cycler conditions are:
vtx1 and vtx2 detection with primers vtx1-det-F1/ vtx1-det-R1; F4/R1/F4-f/R1-e/f:
95ºC for 15 min (HotStart Taq activation)
35 cycles of 94ºC for 50 sec, 56° for 40 sec and 72ºC for 60 sec, ending with 72ºC for
3 min
vtx1 and vtx2 subtyping – see appendix 1:
95ºC for 15 min (HotStart Taq activation)
35 cycles of 94ºC for 50 sec, 62°C for 40 sec and 72ºC for 60 sec, ending with 72ºC for
3 min. PCR amplicons can be stored at 4°C until loading on agarose gel.
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In each PCR assay, a positive and a negative control must be included. The positive
controls are DNA templates obtained from E. coli strains harbouring the different vtx
subtypes that are the object of the present method (vtx1a, vtx1c, vtx1d, vtx2a, vtx2b,
vtx2c, vtx2d, vtx2e, vtx2f and vtx2g), and the negative control is constituted by a
sample without template added.
2.4 Agarose gel electrophoresis
Prepare agarose gel in 1X Tris/Borate/EDTA (TBE) or Tris/Acetate/EDTA (TAE). Each
well of the gel is loaded with 10 µl of each reaction added with loading dye at 1X final
concentration. Run the samples in 1X running buffer (TBE or TAE) in constant voltage
(100 V). Use a molecular weight marker suitable for assignment of the correct
molecular weights to the amplicons produced (refer to Appendix 1). Consider that a
correct band assignment is a crucial point in the assessment of the presence of the
target genes. Make sure that the bands produced by the reference strains match
exactly the expected molecular weight.
Agarose gels should be added of ethidium bromide to allow the visualisation of DNA.
This reagent is a DNA intercalating agent commonly used as a nucleic acid stain in
molecular biology laboratories. When exposed to ultraviolet light, it will fluoresce with
a red-orange colour. Ethidium bromide should be added to a final concentration of 0.5
µg/ml before pouring the agarose gel in the electrophoresis gel cast. Alternatively the
agarose gel can be stained after electrophoresis in a 0.5 µg/ml ethidium bromide
aqueous solution.
2.7 Safety and protection devices
Some VTEC strains can infect human beings at a very low infectious dose and can
cause severe disease. Laboratory acquired infections have been reported. Therefore,
working with VTEC requires good laboratory practices and the use of protection
devices. Ethidium bromide is a mutagen and toxic agent; therefore it should be used
in compliance with the safety sheet provided and with protection devices (lab-coats
and latex gloves). The U.V. light may cause damage to eyes so it is mandatory the use
of Plexiglas shields and protective glasses.
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2.8 Reference strains
VTEC strains harbouring the different vtx subtypes object of the present method are
listed in Appendix 2 and should be used as positive control. A complete set of strains
harbouring the genes encoding all vtx subtypes (for a total of ten isolates) are
provided in the framework of the collaborative inter-laboratory study. Nonetheless, for
the application of the present method, only the strains harbouring the vtx subtypes
object of the method shall be used as positive controls.
The control templates can be prepared in advance as described for the test strains and
stored at -20°C for eight months.
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Appendix 1.
List of primers to be used for vtx genes detection and subtyping
Primer Sequence (5’ – 3’) Position
Stx/vtx1 §
Detection
vtx1-det-F1
vtx1-det-R1
Subtyping
vtx1a-F1
vtx1a-R2
vtx1c-F1
vtx1c-R1
vtx1d-F1
vtx1d-R1
Vtx2
Detection
F4
R1
F4-f
R1-e/f
Subtyping
vtx2a-F2
vtx2a-R3
vtx2a-R2
vtx2b-F1
vtx2b-R1
GTACGGGGATGCAGATAAATCGC
AGCAGTCATTACATAAGAACGYCCACT
CCTTTCCAGGTACAACAGCGGTT
GGAAACTCATCAGATGCCATTCTGG
CCTTTCCTGGTACAACTGCGGTT
CAAGTGTTGTACGAAATCCCCTCTGA
CAGTTAATGCGATTGCTAAGGAGTTTACC
CTCTTCCTCTGGTTCTAACCCCATGATA
GGCACTGTCTGAAACTGCTCCTGT
ATTAAACTGCACTTCAGCAAATCC
CGCTGTCTGAGGCATCTCCGCT
TAAACTTCACCTGGGCAAAGCC
GCGATACTGRGBACTGTGGCC
CCGKCAACCTTCACTGTAAATGTG
GGCCACCTTCACTGTGAATGTG
AAATATGAAGAAGATATTTGTAGCGGC
CAGCAAATCCTGAACCTGACG
440-462
622-648
362-384
815-839
362-384
588-613
50-78
225-252
606-629
1209-1232
606-629
1209-1230
754-774
1079-1102
1079-1100
968-994
1198-1218
Amplicon
size (bp)
209
478
252
203
627
625
349
347
vtx2c-F1 GAAAGTCACAGTTTTTATATACAACGGGTA 926-955 177
251
All 6 primers can be
used in a triplex PCR
for subtyping of vtx1*.
For detection all 4
primers can be used in
one reaction.
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vtx2c-R2 CCGGCCACYTTTACTGTGAATGTA 1079-1102
vtx2d-F1
vtx2d-R1
vtx2d-R2
**
AAARTCACAGTCTTTATATACAACGGGTG
TTYCCGGCCACTTTTACTGTG
GCCTGATGCACAGGTACTGGAC
927-955
1085-1105
1184-1206
179
280
Some vtx2d strains are
positive for the small
fragment and some for
the larger fragment. The
control strain C165-02
should be positive for
both bands – see Figure 3
vtx2e-F1 CGGAGTATCGGGGAGAGGC
695-713
vtx2e-R2 CTTCCTGACACCTTCACAGTAAAGGT
1080-1105
411
vtx2f-F1 TGGGCGTCATTCACTGGTTG
451-475
vtx2f-R1 TAATGGCCGCCCTGTCTCC
856-874
424
vtx2g-F1 CACCGGGTAGTTATATTTCTGTGGATATC 203-231
vtx2g-R1 GATGGCAATTCAGAATAACCGCT
771-793
573
Wobble bases are shown in bold.
§ These primers will also detect Shiga toxin genes from Shigella dysenteriae type 1 and Shigella sonnei.
* Triplex PCR for vtx1 subtyping: 1 µl of each of the four primers for vtx1c and vtx1d (stock solution of primers is 5 µM)
2 µl of each of two primers for vtx1a (stock solution of primers is 5 µM). See Figure 1 for gel picture of fragment sizes.
** One additional primer has been designed to specifically detect the vtx2d-O55-5905 variant:
vtx2d-O55-R TCAACCGAGCACTTTGCAGTAG 1140-1161 235 Not part if this EQA
All three reverse primers in the same reaction will result in amplicons of 179bp with 9 vtx2d variants, 235bp with variant
vtx2d-O55-5905, 280bp with 5 vtx2d variants, and finally two amplicons of 179bp and 280bp with variant
vtx2d-O73-C165-02.
NOTE on the design of primers: VT2a, VT2c and VT2d are very closely related and the design of primers has been
quite difficult! We have identified thirty vtx2a, twenty-four vtx2c and twenty-six vtx2d nucleotide variants. The primers
that we have designed should be specific for each of their respective variants. However, as we have not tested all these
many variants, our design is based on the fact that the primers match all the desired sequences. Furthermore, we have
noted that cross-reactions occur and are seen as ghost bands – especially between vtx2c and vtx2d positive strains. This
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is illustrated in Figure 3. Thus, only very clearly positive bands should be interpreted as indicative of presence of that
specific subtype.
Note on the choice of Taq polymerase: During our test phase, we have noted that the (conventional) PCR's are Taq
dependent and therefore, the protocol should be followed exactly as described using the Qiagen HotStart.
HotStarTaq Master Mix Kit comes in three different "sizes" 250U, 1000U and 2500U. Cat.No.s 203443, 203445 and
203446.
It's a pre-made mastermix. You just add template, primers and water.
We have no commercial interest in Qiagen and you are of course welcome to test other Taq polymerases – but we
recommend that you do this after you have validated the control strains using the Qiagen HotStart Master Mix Kit.
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Figure 1. Gel picture illustrating five strains each of vtx1a, vtx1c and vtx1d positive strains.
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Figure 2. Gel picture illustrating vtx2a, vtx2b, vtx2c, vtx2d, vtx2e, vtx2f and vtx2g positive strains.
D3435 (strain C165-02) can be positive with both reverse primers resulting in two bands of 179bp and/or 280bp respectively.
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Figure 3. Gel picture illustrating vtx2a, vtx2c and vtx2d positive strains.
D3435 (strain C165-02) is positive with both vtx2d-R1 and vtx2d-R2 resulting in two bands of 179bp and 280bp,
respectively (last lane).
Because of the high degree of similarity between vtx2c and vtx2d some vtx2d positive strains (D3435) also give a
weak vtx2c ghost band. In order to distinguish between a ghost band and a true vtx2c band compare with D2587
(strain 031), which is clearly positive for vtx2c (and vtx2b).
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Appendix 2
List of reference strains harbouring the vtx gene subtypes
Control
SSI
GenBank
for Toxin variant
Results obtained using
collection Strain
accession
toxin designation
the present method
D number
No.
subtype
D2653 EDL933 VT1a VT1a-O157-EDL933 M19473 vtx1a + vtx2a
D3602 DG131/3 VT1c VT1c-O174-DG131-3 Z36901 vtx1c + vtx2b
D3522 MHI813 VT1d Stx1d-O8-MHI813 AY170851 vtx1d
D2435 94C VT2a VT2a-O48-94C Z37725 vtx1a + vtx2a
D3428 EH250 VT2b VT2b-O118-EH250 AF043627 vtx2b
D2587 031 VT2c VT2c-O174-031 L11079 vtx2b + vtx2c
D3435 C165-02 VT2d VT2d-O73-C165-02 DQ059012 vtx2d
D3648 S1191 VT2e VT2e-O139-S1191 M21534 vtx2e
D3546 T4/97 VT2f VT2f-O128-T4-97 AJ010730 vtx2f
D3509 7v VT2g 2g-O2-7v AY286000 vtx2g
* May result in both fragments at 179 bp and 280 bp
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Appendix 3
References
O'Brien, A. D., M. A. Karmali, and S. M. Scotland. 1994. A proposal for
rationalization of the Escherichia coli cytotoxins, p. 147-149. In M. A.
Karmali and A. G. Goglio (eds.), Recent Advances in Verocytotoxinproducing
Escherichia coli Infections. Elsevier Science, B.V., Amsterdam.
Bielaszewská, M., A. W. Friedrich, T. Aldick, R. Schurk-Bulgrin, and H.
Karch. 2006. Shiga toxin activatable by intestinal mucus in Escherichia coli
isolated from humans: Predictor for a severe clinical outcome.
Clin.Infect.Dis. 43:1160-1167
Friedrich, A. W., M. Bielaszewská, W. L. Zhang, M. Pulz, T. Kuczius, A.
Ammon, and H. Karch. 2002. Escherichia coli harboring Shiga toxin 2 gene
variants: frequency and association with clinical symptoms. J.Infect.Dis.
185:74-84
Persson, S., K. E. P. Olsen, S. Ethelberg, and F. Scheutz. 2007. Subtyping
typing method for Escherichia coli Shiga toxin (Verocytotoxin) 2 variants and
correlations to clinical manifestations. J Clin Microbiol 45:2020-2024
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参 考 資 料 3
Vtxサブタイプ 対 応 表 Designations of stx/vtx genes, their products (Stx/VT) a , and their previous designations. Table adapted from (31) and (32).
Toxin
subtype b
stx or vtx
1a h
Toxin gene
Toxin variant designation
Prototype
Serotype of
variant designation
Organisms (reference) prototype organism
stx 1a-S. dysenteriae-60R
stx 1a-S. dysenteriae-3818T
stx 1a-S. sonnei-CB7888
stx 1a-O157-EDL933 /vtx1b-O157-EDL933
stx 1a -O111-PH /vtx1b-O111-PH
stx 1a -O48-94C /vtx1b-O48-94C
stx 1a -O111-CB168 /vtx1b-O111-CB168
1c stx 1c-O174-DG131/3 /
vtx1c-O174-DG131/3
Stx1a-S. dysenteriae-60R
Stx1a-S. dysenteriae-3818T
Stx1a-S. sonnei-CB7888
Stx1b-O157-EDL933/VT1b-O157-EDL933
Stx1b-O111-PH /VT1b-O111-PH
Stx1b-O48-94C/VT1b-O48-94C
Stx1b-O111-CB168/VT1b-O111-CB168
Stx1c-O174-DG131/3/
VT1c-O174-DG131/3
60R (16) S. dysenteriae
3818T (35) S. dysenteriae
CB7888 (3) S. sonnei
EDL933 (23) O157:H7
H-19B (15) O26:H11
H30 (15) O26:H11
PH (26) O111:H-
94C (24) O48:H21
CB168 (24) O111:H-
GenBank Previous designation
or synonym
accession No.
for toxin gene
X07903 stx 1
M19437
AJ132761
M19473 slt-I
M16625
M23980
L04539
Z36899
Z36900
DG131/3 (24,40) O174:H8 Z36901 stx1c
1d stx 1d-ONT-MHI813 /vtx1d-ONT-MHI813 Stx1d-ONT-MHI813/VT1d-ONT-MHI813 MHI813 (4) ONT:H19 AY170851 stx1d
Previous designation or synonym
for toxin
Stx1
SLT-I
VT1
VT1
SltI/PH
SltI/O48
SltI/CB168
2a stx 2a-O157-EDL933 /vtx2a-O157-EDL933 Stx2a-O157-EDL933/VT2a-O157-EDL933 EDL933 (23) O157:H7 X07865 stx2/vtx2 slt-II SLT-II
stx 2a-O48-94C /vtx2a-O48-94C Stx2a-O48-94C/VT2a-O48-94C
94C (25) O48:H21 Z37725
SLT-II/O48
031 (27)
2b stx 2b-O174/a-031 /vtx2b-O174/a-031 Stx2b-O174/a-031/VT2b-O174/a-031
O174:H21 X65949
stx 2b-O118-EH250 /vtx2b-O118-EH250 Stx2b-O118-EH250/VT2b-O118-EH250 c EH250 (30) O118:H12 AF043627
stx 2b-O111-PH /vtx2b-O111-PH Stx2b-O111-PH /VT2b-O111-PH
PH (25) O111:H-
L11078
stx 2vOX392
stx 2vO111
2c stx 2c-O157-E32511 /vtx2c-O157-E32511 Stx2c-O157-E32511/VT2c-O157-E32511 E32511 (34) O157:H- M59432 stx2c/vtx2c Stx2v/VT2v
SLT-II/OX3 / VT2d-OX3a d
SLT-II/O111 / VT2d-O111 d
Stx2d/VT2d-Ount

Toxin
Toxin gene
Toxin variant designation
Prototype
Serotype of
GenBank
Previous designa-
Previous designation or synonym
subtype b
variant designation
Organisms (reference)
prototype or-
accession No.
tion or synonym
for toxin
stx or vtx
ganism
for toxin gene
slt-IIc
SLTIIc
stx 2c-O157-FLY16 /vtx2c-O157-FLY16
Stx2c-O157-FLY16/VT2c-O157-FLY16
FLY16 (11)
O157:H-
AB015057
stx2
stx 2c-O157-C394-03 / vtx2c-O157-C394-
Stx2c-O157-C394-03/ VT2c-O157-C394-03
C394-03 (29)
O157:H-
DQ235774
03
Stx2c-O157-TK-51/VT2c-O157-TK-51
TK-51 (19)
O157:H7
SNS g
VT2v(pKTN1050)
stx 2c-O157-TK-51 /vtx2c-O157-TK-51
=Stx2vhd g
stx 2c-O174/b-031 /vtx2c-O174/b-031
stx 2c-O22-KY-O19 /vtx2c-O22-KY-O19
Stx2c-O174/b-031/VT2c-O174/b-031
Stx2c-O22-KY-O19/VT2c-O22-KY-O19
031 (28)
KY-O19 (19)
O174:H21
O22:H-
L11079
SNS g
stx 2vOX393
SLT-II/OX3/2 / VT2d-OX3/2 d
VT2v(pKTN1054)
= Stx2vhc g
2d d
stx 2d /vtx2d
Stx2d/VT2d
B2F1 (10)
O91:H21
SLT-IIvh
stx 2d-O91/a-B2F1 /vtx2d-O91/a-B2F1
Stx2d-O91/a-B2F1/VT2d-O91/a-B2F1
B2F1 (10)
O91:H21
AF479828
stx2vha/vtx2vha
Stx2vha/VT2vha
stx 2d1 /vtx2d1
Stx2d1/VT2d1
stx2ha
Stx2vh-a/VT2vh-a
VT2v-a
SLT-IIvha
stx 2d-O91/a-B2F1 /vtx2d-O91/b-B2F1
Stx2d-O91/b-B2F1/VT2d-O91/b-B2F1
B2F1 (10)
O91:H21
AF479829
stx2vhb/vtx2vhb
Stx2vhb/VT2vhb
Stx2vh-b/VT2vh-b
stx 2d2 /vtx2d2
Stx2d1/VT2d1
stx2hb
VT2v-b
SLT-IIvhb
stx 2d-O157-7279 /vtx2d-O157-7279
Stx2d-O157-7279/VT2d-O157-7279
7279 (21)
O157:H7
X61283
stx2vhc (vtx2d3)
Stx2vhc
stx 2d-O73-C165-03 / vtx2d-O73-C165-03
Stx2d-O73-C165-03/ VT2d-O73-C165-03
C165-03 (29)
O73:H18
DQ059012
stx 2d-O8- C466-01B / vtx2d-O8- C466-01B
Stx2d-O8-C466-01B/ VT2d-O8-C466-01B
C466-01B (29)
O8:H19
DQ235775

Toxin
subtype b
stx or vtx
2e
2f
f
Toxin gene
Toxin variant designation
Prototype
Serotype of
variant designation
Organisms (reference) prototype organism
stx 2e-O139-412 /vtx2e-O139-412 Stx2e-O139-412/VT2e-O139-412
412 (9)
stx 2e-O139-S1191/ vtx2e-O139-S1191 Stx2e-O139-S1191/ VT2e-O139-S1191 S1191 (38)
stx 2e-ONT-26725-97 /vtx2e-ONT-26725- Stx2e-ONT-26725-97/VT2e-ONT-26725-97 26725-97 (39)
97
stx 2e-O101-E-D43 / vtx2e-O101-E-D43
Stx2e-O101-E-D43/ VT2e-O101-E-D43 E-D43 (6)
stx 2f-O128-H.I.8 / vtx2f-O128-H.I.8 Stx2f-O128-H.I.8/VT2f-O128-H.I.8 H.I.8 (7)
stx 2f-O128-T4/97 / vtx2f-O128-T4/97 Stx2f-O128- T4/97/VT2f-O128- T4/97 T4/97 (33)
O139:K12:H1
O139:H1
ONT:H-
O101:H14
O128:H2
O128:H2
2g stx 2g-O2-7v / vtx2g-O2-7v Stx2g-O2-7v/ VT2g-O2-7v 7v (17) O2:H25 AY286000
2h stx 2h-Out-S-8 / vtx2h-Out-S-8 Stx2h-Out-S-8/ VT2h-Out-S-8 S-8 (1) Out:H25 AB048227
a
b
c
GenBank
accession No.
Previous designation
or synonym
for toxin gene
Previous designation or synonym
for toxin
M36727 slt-IIv
SLT-IIv
M21534 slt-IIva
SLT-IIva e
slt-IIe
SLTIIe/VTe
VT2vp
VT2vp1
AJ567998
X81417
M29153 stx 2ev /vtx2ev Stx2ev/VT2ev
Stx2vp2/VT2vp2
VTev
slt-IIvhc
SLTIIvhc
slt-IId d
SLT-IId/VT2d d
SLTIIva
AJ010730
Data compiled from references (2,4,5,7,10,12-14,18,19,36,37,40)
Toxin types are defined according to antigenic variability, differences in toxicity for tissue culture cells and/or animals, their capacity to be activated by mouse elastase and differences
in DNA or amino acid sequences.
Stx2-O118/VT2-O118 - formerly known as VT2d-Ount (30) - is expected to be non-activatable based on analysis of the nucleotide sequence (Denis Piérard and Angela Melton-
Celsa; unpublished); The original strain has been retyped as O118:H12 (Lothar Beutin and Flemming Scheutz, unpublished)

d
e
f
g
h
There are several toxins suffixed by “d” in the literature: The Stx2d/VT2d toxins of O91:H21 (20), the VT2d (= stx 2-Ogroup/ strain designation and/or year ) variants by Paton et al.(25-27,30)
and the SLT-IId/VT2d (= Stx2f/VT2f) toxin produced by strain H.I.8 (serotype O128:H2) as proposed by Gyles (8). We support the use of the “d” designation for activatable
Stx2/VT2 toxins as proposed by Melton-Celsa et al. (20).
This designation has also been referred to for the Stx2f/VT2f toxin produced by strain H.I.8 (serotype O128:H2).
The nucleotide sequence of the former stx 2ev /vtx2ev of strain H.I.8 (serotype O128:H2) is nearly identical to the recently published stx 2f /vtx2f found in strain T4/97 (serotype
O128:H2) from feral pigeons (33). As its nucleotide sequence is distinctly different from those of the other Stx2/VT2 toxins and variants as well as Stx1/VT1, we support the
proposal of renaming stx 2ev /vtx2ev as stx 2f /vtx2f.
NS: Sequence not submitted to GenBank. Sequence used by Nakao (22) as Stx2vhc( Lin) & Stx2vhd.
Stx1a/stx1a nomenclature is reserved for Shiga toxin from Shigella spp.

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