人体尿液代谢组NMR 分析 - ä¸­å›½ç§‘å­¦é™¢æ­¦æ±‰ç‰©ç†ä¸Žæ•°å­¦ç ”ç©¶æ‰€

中 国 科 学 B 辑 : 化 学 2008 年 第 38 卷 第 1 期 : 85 ~ 92
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SCIENCE IN CHINA PRESS
人 体 尿 液 代 谢 组 NMR 分 析
杨 为 进 1* 1
1
2
, 王 亚 韡 , 周 群 芳 , 唐 惠 儒
1 环 境 化 学 与 生 态 毒 理 学 国 家 重 点 实 验 室 , 中 国 科 学 院 生 态 环 境 研 究 中 心 , 北 京 100085;
2 中 国 科 学 院 武 汉 物 理 与 数 学 研 究 所 , 武 汉 430071
* 联 系 人 , E-mail: wjyang@cashq.ac.cn
收 稿 日 期 : 2007-07-02; 接 受 日 期 : 2007-08-23
中 国 科 学 院 创 新 项 目 ( 批 准 号 : KZCX2-YW-420-21)、 国 家 863 项 目 ( 批 准 号 : 2006AA06Z424)、 国 家 自 然 科 学 基 金 重 大 项 目 ( 批 准 号 :
40590392) 和 国 家 自 然 科 学 基 金 ( 批 准 号 : 20575074) 资 助
摘 要 利 用 固 相 萃 取 分 离 和 核 磁 共 振 技 术 (nuclear magnetic resonance, NMR) 对 人 体 尿 液 中
的 代 谢 物 进 行 了 较 为 系 统 的 研 究 . 通 过 对 人 体 尿 液 样 品 固 相 萃 取 后 分 离 得 到 的 五 个 组 分
1 H
NMR, 同 核 二 维 氢 谱 (correlation spectroscopy, COSY) 和 全 相 关 谱 (total correlation
spectroscopy, TOCSY), 异 核 相 关 光 谱 (heteronuclear single quantum correlation, HSQC 和
Heteronuclear muptiple bond correlation, HMBC), J- 分 解 谱 (J-resolved spectroscopic, J-RES) 的
谱 图 分 析 , 解 析 出 了 74 种 化 合 物 的
1 H 和
13 C 化 学 位 移 , 并 对 一 维
1 H 谱 的 多 数 谱 峰 进 行 了 有
效 指 认 .
关 键 词
代 谢 物
核 磁 共 振 技 术
尿 液
代 谢 组 学 是 后 基 因 时 代 的 一 门 新 兴 学 科 , 与 基
因 组 学 、 转 录 组 学 和 蛋 白 组 学 比 较 , 具 有 以 下 优 点 :
基 因 和 蛋 白 表 达 的 微 小 变 化 会 在 代 谢 物 水 平 上 得 到
放 大 , 从 而 使 检 测 更 容 易 ; 代 谢 组 学 的 研 究 不 需 建 立
全 基 因 组 测 序 及 大 量 表 达 序 列 标 签 (EST) 的 数 据 库 ;
代 谢 物 的 种 类 要 远 小 于 基 因 和 蛋 白 的 数 目 ; 生 物 体
液 的 代 谢 物 分 析 可 反 映 机 体 系 统 的 生 理 和 病 理 状 态 [1] .
目 前 对 其 理 论 、 概 念 、 方 法 尚 在 研 究 和 完 善 中 [2~6] .
代 谢 物 分 析 一 直 是 生 命 科 学 研 究 和 代 谢 组 学 研
究 中 的 重 要 组 成 部 分 . 传 统 的 代 谢 物 分 析 包 括 繁 杂
的 样 品 准 备 和 处 理 步 骤 , 但 是 往 往 得 到 的 只 是 有 限
的 几 个 化 合 物 分 析 结 果 . 代 谢 组 学 的 快 速 发 展 , 主 要
得 益 于 分 析 技 术 的 发 展 使 得 对 大 量 样 品 和 大 量 代 谢
物 的 快 速 定 量 测 定 成 为 可 能 . 目 前 , 可 用 于 代 谢 组 学
研 究 的 分 析 测 试 技 术 较 多 , 但 是 , 最 为 重 要 的 是 核 磁
共 振 技 术 (NMR) [7, 8] 和 质 谱 技 术 (MS) [9] .
NMR 是 化 学 和 分 子 生 物 学 领 域 广 泛 使 用 的 一 门
分 析 技 术 , 主 要 用 于 分 子 结 构 、 构 象 、 动 态 和 反 应 等
的 分 析 测 试 , 其 检 测 没 有 偏 向 性 , 经 常 使 用 的
1 H
NMR 谱 对 所 有 含 氢 化 合 物 的 灵 敏 度 是 一 样 的 , 单 次
检 测 可 以 得 到 所 有 含 量 在 NMR 检 测 限 以 上 物 质 的
特 征 NMR 谱 , 谱 图 中 谱 峰 的 位 置 对 应 于 样 品 中 不 同
化 合 物 分 子 , 峰 强 度 ( 如 面 积 ) 反 映 相 应 的 化 合 物 分 子
的 相 对 含 量 , 因 此 图 谱 能 够 有 效 表 达 代 谢 物 组 成 及
含 量 信 息 , 可 以 直 接 作 为 代 谢 指 纹 图 谱 进 行 分 析 研
究 . NMR 样 品 的 前 处 理 简 单 , 一 般 为 非 损 伤 性 , 不 会
破 坏 样 品 的 结 构 和 性 质 , 可 在 接 近 生 理 条 件 下 进 行
实 验 . NMR 测 试 手 段 包 括 液 体 高 分 辨 NMR、 高 分 辨
魔 角 旋 转 (HR-MAS)NMR 和 活 体 核 磁 共 振 波 谱
(MRS). 目 前 已 经 有 不 少 将 此 方 法 用 于 肝 脏 , 脑 组 织 ,
[10, 11]
前 列 腺 等 组 织 的 研 究 报 道 以 及 其 他 代 谢 研
[12,
究 13] .
尿 液 是 代 谢 组 学 研 究 中 最 常 用 的 生 物 体 液 之 一 .
尿 样 中 包 含 大 量 的 有 机 酸 、 碱 、 单 糖 、 多 糖 、 杂 环 、
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杨 为 进 等 : 人 体 尿 液 代 谢 组 NMR 分 析
多 元 醇 、 氨 基 酸 、 低 分 子 量 的 蛋 白 质 和 多 肽 以 及 各 种
无 机 盐 Na + , K + , Ca 2+ , Mg 2+ , HCO − 3 , SO 2− 3−
4 , PO 4 等 ,
这 些 化 合 物 的 变 化 情 况 直 接 反 映 了 生 物 体 内 各 种 化
学 变 化 过 程 . 由 于 尿 液 组 分 的 复 杂 性 , 尿 液 用 于 代 谢
研 究 过 程 的 其 中 一 个 非 常 困 难 的 问 题 就 是 谱 图 的 指
认 解 析 , 即 一 张
1 H NMR 谱 图 中 数 百 个 谱 峰 的 归 属 问
题 . 也 可 以 将 尿 样 中 化 合 物 逐 个 分 离 后 测 得 其 NMR
谱 , 然 后 与 整 个 尿 样
1 H NMR 谱 进 行 比 对 , 逐 步 解 析
整 个 尿 样
1 H NMR 谱 图 , 但 这 种 方 法 由 于 其 复 杂 性 和
介 入 性 而 趋 向 于 不 再 使 用 . 目 前 经 常 使 用 的 代 谢 物
指 认 方 法 是 二 维 核 磁 共 振 谱 学 方 法 以 及 标 准 物 质 加
入 法 的 结 合 . 即 使 如 此 , 目 前 能 对 尿 样 中 予 以 指 认 的
代 谢 物 也 不 到 检 测 到 代 谢 物 总 数 的 一 半 . 本 文 拟 通
过 尿 样 固 相 萃 取 预 处 理 (solid phase extraction, SPE),
结 合 多 种 NMR 方 法 , 对 尿 样 中 代 谢 物 质 进 行 分 析 鉴
别 , 解 析 尿 样 的
1 H NMR 谱 图 .
1 实 验 部 分
1.1 试 剂 与 仪 器
固 相 萃 取 柱 选 取 英 国 IST(International Sorbent
Technology) 公 司 的 0.5 g(6 mL) 和 2 g (12 mL) 两 种 不
同 规 格 C18 萃 取 柱 . 洗 脱 溶 剂 为 pH = 2.8 的 甲 酸 - 甲
酸 氨 水 溶 液 中 加 入 不 同 比 例 的 CH 3 CN, 甲 酸 和 甲 酸
氨 均 购 自 Fisons Scientific U.K. Limited , 纯 度 分 别 为
98% 和 99.3%, CH 3 CN 购 自 BDH Laboratory Supplies,
纯 度 为 99.9%. D 2 O: 99.9% 购 自 Goss Scientific Instruments
Ltd, TSP: 纯 度 98% 购 自 Cambridge Isotope
Laboratory, Inc.
1.2 样 品 前 处 理
尿 液 处 理 : 健 康 成 年 男 子 上 午 和 下 午 尿 样 各
6 mL, 用 甲 酸 调 节 至 pH = 3 左 右 后 , 各 加 入 0.12 mL
的 CH 3 CN, 得 到 含 有 2%CH 3 CN pH=3 的 尿 样 .
柱 前 处 理 : 2 g C18 柱 中 加 入 24 mL CH 3 CN, 流
出 速 率 6 mL/min, 用 25 mL 上 述 缓 冲 液 冲 洗 , 冲 洗 速
率 为 6 mL/min.
萃 取 分 离 : 将 pH = 3 的 上 午 尿 样 加 入 C18 柱 中 ,
收 集 洗 脱 液 . 15 mL 2%CH 3 CN 的 甲 酸 - 甲 酸 铵 缓 冲 液
冲 洗 , 作 为 馏 分 1(Fraction1); 用 15%CH 3 CN 15 mL
的 甲 酸 - 甲 酸 铵 缓 冲 液 继 续 冲 洗 萃 取 柱 作 为 馏 分 2;
用 35%CH 3 CN 15 mL 的 甲 酸 - 甲 酸 铵 缓 冲 液 冲 洗 萃 取
柱 作 为 馏 分 3; 用 50%CH 3 CN 15 mL 的 甲 酸 - 甲 酸 铵
缓 冲 液 冲 洗 萃 取 柱 作 为 馏 分 4; 用 75%CH 3 CN 20 mL
的 甲 酸 - 甲 酸 铵 缓 冲 液 冲 洗 萃 取 柱 作 为 馏 分 5. 然 后 将
上 述 获 得 的 馏 分 放 置 在 通 风 柜 中 挥 发 掉 CH 3 CN 后 进
行 冷 冻 干 燥 , 每 个 馏 分 中 加 入 适 量 重 水 溶 解 , 离 心 除
去 沉 淀 后 , 进 行 NMR 实 验 .
1.3 SPE 馏 分 的 一 维 1 H NMR 实 验
本 实 验 及 后 续 的 二 维 实 验 均 采 用 英 国 帝 国 理 工
学 院 生 物 医 药 系 生 物 化 学 部 配 备 超 低 温 探 头 的
Bruker avance 600M HPLC-NMR 谱 仪 . 1 H NMR 实 验
脉 冲 序 列 为 标 准 noesypr1d 序 列 :
RD - 90° - t 1 - 90° - t m - 90° - acquire FID.
参 数 t 1 设 置 为 3 µs, 混 合 时 间 t m =100 ms, 谱 宽
16×10 −6 , 累 加 次 数 为 64, 在 弛 豫 等 待 (RD) 以 及 混 合
期 (t m ) 中 采 用 在 水 的 共 振 频 率 附 近 选 择 性 射 频 辐 照 方
式 压 制 水 峰 , 数 据 处 理 采 用 指 数 窗 函 数 , 展 宽 因 子
LB = 0.3, 变 换 点 数 为 64k.
2 结 果 与 讨 论
2.1 SPE 的 5 个 组 分
1 H NMR 谱 图
采 用 上 述 实 验 参 数 , 获 得 了 每 个 尿 样 5 个 SPE 馏
分 的 高 质 量
1 H NMR 谱 图 . 如 图 1 所 示 , 5 个 谱 图 差 异
非 常 明 显 , 去 除 污 染 物 杂 峰 ( 如 CH 3 CN), 谱 图 的 信 号
强 度 随 着 馏 分 1 至 馏 分 5 依 次 减 弱 , 最 强 的 馏 分 1 的
NMR 信 号 多 分 布 于 δ (2.5−4.5)×10 −6 之 间 , 属 于 各 种
糖 类 和 氨 基 酸 谱 α 1 H 化 学 位 移 区 , 馏 分 2 出 现 了
δ (6.5∼8)×10 −6 较 强 的 芳 香 区 的 信 号 , 馏 分 3 信 号 强 度
较 弱 , δ (0.7∼2)×10 −6 的 长 链 脂 肪 酸 信 号 相 对 较 强 , 馏
分 4 和 馏 分 5 的
1 H NMR 谱 图 内 信 号 ( 谱 峰 ) 强 度 非 常
弱 , 说 明 这 两 个 馏 分 内 的 代 谢 物 质 浓 度 已 经 非 常 小 .
由 SPE 过 程 可 以 看 出 , 首 先 出 来 的 馏 分 应 是 水 溶 性
好 、 极 性 较 大 的 代 谢 物 质 , 依 次 类 推 , 最 后 出 来 的 馏
分 是 亲 油 性 较 高 的 代 谢 物 质 . 5 个 馏 分 的
1 H NMR 谱
图 比 较 进 一 步 表 明 , 正 常 人 尿 样 中 的 代 谢 物 质 多 以
极 性 大 、 水 溶 性 好 的 化 合 物 为 主 , 亲 油 性 高 的 代 谢 物
质 含 量 极 少 .
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中 国 科 学 B 辑 : 化 学
2008 年 第 38 卷 第 1 期
图 1 尿 样 五 个 馏 分 的
1 H NMR 谱 图 ( 上 午 尿 液 )
2.2 SPE 馏 分 的 二 维 NMR 实 验
二 维 NMR 实 验 是 20 世 纪 70 年 代 末 80 年 代 初
发 展 起 来 的 NMR 实 验 技 术 , 二 维 NMR 谱 除 了 提 供
一 维 NMR 谱 更 为 丰 富 的 信 息 外 , 还 将 一 维 NMR 谱
中 重 叠 的 信 号 在 二 维 频 率 轴 上 展 开 , 有 助 于 复 杂 的
NMR 的 解 析 , 因 此 , 二 维 MMR 是 化 合 物 确 认 和 结 构
解 析 强 有 力 的 手 段 .
2.2.1 同 核 二 维 氢 谱 和 全 相 关 谱 实 验
Correlation spectroscopy(COSY) 属 于 同 核 二 维 氢
谱 实 验 , 是 利 用 同 核
1 H— 1 H 之 间 的
3 J 耦 合 建 立 核 与
核 之 间 联 系 的 NMR 实 验 , COSY 谱 可 直 接 给 出 通 过
双 键 、 三 键 连 接 的 质 子 间 的 交 叉 峰 , 进 一 步 传 递 可 以
获 得 分 子 中 所 有 相 邻 氢 原 子 之 间 的 关 联 . Total correlation
spectroscopy(TOCSY) 为 全 相 关 谱 , 可 以 提 供 所
有 具 有 “J- 耦 合 ” 关 系 的 氢 核 间 的 关 联 , 直 接 给 出 自 旋
体 系 所 有 质 子 间 的 交 叉 峰 . TOCSY 作 为 COSY 实 验
的 补 充 , 与 COSY 实 验 一 起 可 以 确 认 尿 样 固 相 萃 取 后
馏 分 代 谢 物 分 子 中 氢 核 的 结 构 关 系 .
为 了 节 约 文 章 篇 幅 , 本 文 仅 给 出 SPE 其 中 一 个
馏 分 二 维 谱 图 . 图 2 分 别 为 下 午 尿 样 SPE1 馏 分 的
COSY 和 TOCSY 实 验 结 果 . 两 类 实 验 , 尤 其 是 COSY
实 验 的 灵 敏 度 非 常 高 , 在 5 个 馏 分 COSY 谱 中 , 馏 分
1 和 馏 分 2 的 COSY 谱 存 在 较 强 的 t 1 噪 声 ( 经 过 处 理
后 , 对 谱 图 解 析 影 响 不 大 ), 其 余 谱 图 的 质 量 较 好 ,
TOCSY 实 验 则 在 馏 分 4 和 馏 分 5 中 水 峰 的 压 制 不 够
理 想 , 但 是 由 于 这 两 个 馏 分 中 化 合 物 的 化 学 位 移 靠
近 水 峰 的 并 不 多 , 所 以 对 代 谢 物 解 析 影 响 不 大 . 5 个
馏 分 的 COSY 和 TOCSY 谱 图 均 能 够 分 辨 出 对 应 一 维
1 H NMR 谱 图 难 以 分 辨 的 许 多 谱 峰 的 位 置 . 将 同 一 馏
分 的 TOCSY 和 COSY 谱 进 行 对 照 , 调 整 谱 图 的 强 度
以 及 缩 放 尺 度 , 可 以 逐 步 解 析 出 同 一 馏 分 中 各 化 合
物 分 子
1 H 的 化 学 位 移 中 除 了 单 峰 以 外 的 其 余 各 峰 之
间 的 相 互 关 联 , 从 而 推 知 分 子 中
1 H 的 相 互 靠 近 关 系 ,
为 解 析 化 合 物 提 供 非 常 重 要 的 帮 助 , 部 分 常 见 的 化
合 物 可 以 直 接 依 靠 这 种
1 H 与
1 H 之 间 的 关 系 得 到 确 认 .
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杨 为 进 等 : 人 体 尿 液 代 谢 组 NMR 分 析
图 2 固 相 萃 取 馏 分 1 的 二 维 COSY 谱 (a) 和 TOCSY 谱 (b)( 下 午 尿 液 )
2.2.2 异 核 相 关 谱 实 验
COSY 和 TOCSY 实 验 后 , 样 品 中 各 代 谢 物 分 子
内 邻 近 氢 原 子 之 间 的 化 学 位 移 及 相 互 关 系 可 以 得 到
有 效 的 确 认 , 但 是 在 尿 样 馏 分 这 种 复 杂 混 合 物 中 仅
依 靠 分 子 中 氢 原 子 之 间 的 信 息 远 不 足 以 解 析 代 谢 物
分 子 . Heteronuclear single quantum correlation(HSQC)
和 heteronuclear multipule bond correlation (HMBC) 是
异 核 相 关 谱 , 是 通 过
1 H 间 接 检 测
13 C 谱 以 极 大 提 高
13 C 检 测 灵 敏 度 的 反 向 实 验 方 法 . HSQC 和 HMBC 的
F2 维 代 表 检 测 样 品 的
1 H 的 化 学 位 移 , F1 维 代 表 间 接
检 测 到 的
13 C 的 化 学 位 移 . HSQC 提 供 分 子 中 与
1 H 直
接 相 连 的
13 C 的 化 学 位 移 , 因 此 , HSQC 谱 图 不 仅 可
以 提 供
1 H 和
13 C 的 化 学 位 移 值 , 而 且 还 将
1 H 和
13 C
每 个 峰 准 确 地 对 应 出 来 . 同 时 对 于 一 些 含 有 环 状 结
构 的 或 某 些 具 有 手 性 C 原 子 的 代 谢 物 , 连 在 同 一 碳 上
的 两 个 氢 原 子 , 由 于 所 处 的 化 学 环 境 并 不 相 同 , 其 化
学 位 移 也 不 相 同 , 通 过 HSQC 我 们 可 以 清 楚 地 看 到 两
个 峰 , 他 们 在 谱 图 中
1 H 的 化 学 位 移 不 同 , 但
13 C 的 化
学 位 移 相 同 , 这 是 在
1 H NMR 以 及 COSY 和 TOCSY
中 很 难 辨 认 的 . HMBC 表 示 异 核 的 远 程 相 关 谱 .
HMBC 的 谱 图 提 供 与
1 H 原 子 相 隔 2~4 个 化 学 键 相 连
的
13 C 的 化 学 位 移 , 根 据 HMBC 谱 所 给 出 的 H, C 之
间 的 关 系 , 结 合 HSQC 的 谱 图 , 我 们 就 能 够 解 决 C 原
子 的 连 接 顺 序 问 题 并 确 定 代 谢 物 的 骨 架 结 构 .
馏 分 1 的 异 核 相 关 谱 图 结 果 如 图 3 所 示 . 5 个 馏
分 均 获 得 了 高 质 量 的 HSQC 和 HMBC 谱 图 , 同 一 馏
分 的 两 类 谱 图 相 比 , HSQC 比 HMBC 具 有 更 高 的 灵 敏
度 , HMBC 却 比 HSQC 包 含 了 更 多 的 代 谢 物 的 结 构 信
息 . 比 较 5 个 馏 分 同 类 谱 图 , 可 以 发 现 沿 馏 分 1 至 馏
分 5, HSQC 和 HMBC 谱 图 的 信 号 强 度 逐 步 减 弱 , 尤
其 是 HMBC 谱 , 馏 分 4 和 馏 分 5 的 谱 图 已 经 很 难 保
证 关 联 信 号 的 完 整 性 , 使 谱 图 解 析 难 度 加 大 . 逐 步 调
整 各 馏 分 的 HMBC 谱 图 信 号 强 度 及 缩 放 尺 度 , 既 得
到 了 每 一 馏 分 中 各 代 谢 物 分 子 中 碳 原 子 与 碳 原 子 之
间 相 互 连 接 关 系 又 获 得 氢 原 子 与 氢 原 子 之 间 的 相 互
靠 近 关 系 , 与 COSY 和 TOCSY 获 得 的 结 果 相 互 引 证 、
相 互 补 充 , 再 加 上 HSQC 中 所 表 达 的 碳 原 子 与 氢 原 子
直 接 关 联 , 尿 样 馏 分 中 一 些 重 要 的 代 谢 物 质 结 构 得
到 了 较 为 完 整 的 解 析 , 部 分 在 COSY 和 TOCSY 实 验
过 程 指 认 的 代 谢 物 在 此 也 得 到 了 真 正 的 确 认 .
2.2.3 J- 分 解 谱 实 验
由 于 氢 谱 的 化 学 位 移 范 围 较 窄 , 而
1 H- 1 H 间 的 耦
合 广 泛 存 在 , 导 致 谱 图 重 叠 现 象 仍 十 分 严 重 , 给 辨 认
带 来 很 大 困 难 . J- 分 解 谱 (J-resolved spectroscopic,
J-RES) 实 验 可 以 将 化 学 位 移 与 J 耦 合 分 开 , 使 一 维 谱
上 过 分 拥 挤 的 谱 分 散 在 平 面 上 , 给 上 述 一 维 和 二 维
谱 图 的 解 析 提 供 有 效 的 补 充 . J-RES 谱 图 中 的 F2 维 代
表 是
1 H 的 化 学 位 移 , F1 维 代 表 的 是 耦 合 常 数 的 大 小 ,
代 谢 物 分 子 单 重 峰 直 接 位 于 F1 中 心 轴 , 多 重 峰 则 沿
中 心 轴 向 两 端 作 对 称 分 布 . 由 于 多 数 代 谢 物
1 H 的 化
学 位 移 经 常 随 溶 液 环 境 发 生 变 化 , 而 分 子 中 的 耦 合
常 数 变 化 却 不 是 很 大 , 因 此 J-RES 经 常 是 代 谢 组 学 研
究 中 用 于 复 杂 样 品 环 境 代 谢 物 解 析 的 重 要 参 照 .
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中 国 科 学 B 辑 : 化 学
2008 年 第 38 卷 第 1 期
图 3 固 相 萃 取 馏 分 1 的 二 维 HSQC 谱 (a) 和 HMBC 谱 (b)( 下 午 尿 液 )
图 4 是 馏 分 1 的 J-RES 实 验 结 果 , 可 以 看 出 该 谱
图 具 有 较 强 的 t 1 噪 声 , 但 是 由 于 这 种 噪 声 主 要 发 生 在
强 度 较 大 的 谱 峰 位 置 , 对 实 验 结 果 分 析 影 响 较 小 , 所
以 该 谱 图 仍 然 对 代 谢 物 的 解 析 产 生 较 大 的 帮 助 .
图 4 右 图 为 馏 分 1 的
1 H NMR 和 J-RES 谱 在
δ (1.7−1.1)×10 −6 区 间 的 放 大 图 , 上 方 一 维 谱 图 清 晰 地
出 现 多 个 双 峰 , 在 J-RES 谱 中 得 到 确 认 (10 个 双 峰 , 2
个 单 峰 ); 图 4(b) 为 δ (4.01−3.76)×10 −6 区 间 的 放 大 图 ,
上 方 一 维 谱 图 中 1, 2, 3, 4 看 起 来 像 是 两 个 双 峰 或 四
个 单 峰 , 在 J-RES 上 可 以 清 晰 地 确 认 是 一 个 dd 多 重
峰 , 5 和 6 看 起 来 像 2 个 双 峰 , 实 际 上 也 是 一 个 dd 多
重 峰 , 7 和 8 看 起 来 像 两 个 单 峰 , 实 际 上 是 一 个 双 峰
( 峰 8 可 能 与 其 他 峰 重 叠 而 显 偏 高 ). 这 种 峰 的 分 离 及
多 重 性 的 确 认 对 化 合 物 的 解 析 具 有 重 要 意 义 .
2.3 尿 样 代 谢 物 解 析 结 果
对 上 述 5 种 二 维 NMR 谱 图 进 行 对 照 分 析 , 从 尿
样 组 分 中 共 解 析 出 了 74 种 化 合 物 的
1 H 和
13 C 化 学 位
移 , 这 是 目 前 报 道 直 接 从 生 物 体 液 解 析 出 来 最 多 的
化 合 物 , 说 明 经 过 简 单 的 浓 缩 和 分 离 后 , 尿 样 中 许 多
代 谢 物 质 可 以 直 接 利 用 多 种 二 维 NMR 实 验 联 合 分 析
的 方 法 进 行 解 析 , 与 目 前 多 数 从 事 代 谢 组 学 研 究 的
实 验 室 采 用 测 量 标 准 化 合 物 谱 图 解 析 生 物 体 液 NMR
谱 图 相 比 , 该 方 法 除 可 节 省 大 量 时 间 及 标 准 样 品 的
消 耗 外 , 有 可 能 直 接 获 得 以 前 很 少 见 到 的 代 谢 物 质 .
在 74 种 代 谢 物 中 , 有 49 种 直 接 从 馏 分 1 中 解 析
得 到 , 18 种 从 馏 分 2 中 得 到 . 馏 分 3 至 馏 分 5 三 个 馏
分 仅 解 析 出 了 7 个 代 谢 物 , 算 原 因 一 方 面 是 这 三 个 馏
分 中 代 谢 物 浓 度 较 低 , 另 一 方 面 代 谢 物 结 构 更 加 复
杂 , 给 解 析 带 来 了 困 难 .
从 馏 分 1 中 解 析 出 来 代 谢 物 质 最 多 的 为 各 种 非
芳 香 组 氨 基 酸 及 其 衍 生 物 , 如 组 氨 酸 、3- 甲 基 组 氨 酸 、
1- 甲 基 组 氨 酸 、β- 丙 氨 酰 -1- 甲 基 组 氨 酸 、 亮 氨 酸 、 异
亮 氨 酸 、 天 门 冬 酰 胺 、 缬 氨 酸 、 丙 胺 酸 、 赖 氨 酸 、 甘
氨 酸 、N, N- 二 甲 基 甘 氨 酸 、 肌 氨 酸 、 肌 氨 酸 酐 、β- 氨 基
异 丁 酸 、 谷 氨 酸 、 苏 氨 酸 、3- 甲 胺 基 丙 氨 酸 、 焦 谷 氨 酸 、
图 4 固 相 萃 取 馏 分 1 的 二 维 J-RES 谱 和 局 部 放 大 图 ( 下 午 尿 液 )
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杨 为 进 等 : 人 体 尿 液 代 谢 组 NMR 分 析
等 . 其 次 为 包 含 短 链 脂 肪 酸 在 内 的 各 种 有 机 酸 , 如 甲
酸 、 乙 酸 、 丙 酮 酸 、 柠 檬 酸 、 丙 二 酸 、α- 羟 基 异 丁 酸 、
β- 羟 基 异 丁 酸 、 反 - 乌 头 酸 、 尿 囊 酸 、 羟 基 乙 酸 、 牛
黄 酸 等 . 另 外 还 有 各 种 有 机 碱 及 其 衍 生 物 , 如 三 甲
胺 、 二 甲 胺 、 氧 化 三 甲 胺 、 胆 碱 、 三 甲 铵 乙 内 酯 、 尿
嘧 啶 等 , 单 糖 如 β- 葡 萄 糖 、α- 葡 萄 糖 和 甘 露 醇 等 , 以
图 5 固 相 萃 取 馏 分 1 的 NMR 1D-H 谱 ( 下 午 尿 样 )
(a) δ (0.8∼9.5)×10 −6 ; (b) δ (6.5~9.4)×10 −6 ; (c) δ (4.4∼6.5)×10 −6 ; (d) δ (3.0∼4.4)×10 −6 (A: 鹅 肌 肽 , B: 1- 甲 基 -L- 组 氨 酸 , C: 3- 甲 基 -L- 组 氨 酸 , D:
组 氨 酸 ); (e) δ (0.9∼3.0) ×10 −6
90

中 国 科 学 B 辑 : 化 学
2008 年 第 38 卷 第 1 期
及 几 种 杂 环 化 合 物 , 如 1- 甲 基 尼 克 酰 胺 、1- 甲 基 尼 克
酸 、 尿 囊 素 、 假 尿 苷 等 .
馏 分 2 解 析 出 来 最 多 的 是 各 种 芳 香 组 有 机 酸 及
其 衍 生 物 , 如 马 尿 酸 、 对 羟 基 马 尿 酸 、 对 羟 基 苯 乙 酸 、
3-(3- 羟 基 苯 )-3- 羟 基 丙 酸 、 苯 乙 酸 、 色 氨 酸 、 对 - 甲 基
酚 、1- 甲 基 -2- 吡 咯 酮 -5- 甲 酰 胺 、3-(3- 甲 氧 基 -4- 羟 基 )
丙 烯 酸 , 以 及 7- 甲 基 脲 、 乙 内 酰 脲 等 杂 环 化 合 物 和
β- 羟 基 异 戊 酸 、 巴 豆 酸 、 泛 酸 等 有 机 酸 .
表 1 组 氨 酸 及 其 衍 生 物
1 H 的 化 学 位 移 随 溶 液 pH 值 变 化
情 况
代 谢 物 名 称
酸 性 中 性 酸 性 中 性 酸 性 中 性
环 上 H2 环 上 H4 甲 基
鹅 肌 肽 8.66 7.95 7.32 6.97 3.86 3.72
组 氨 酸 8.72 7.83 7.44 7.08
3- 甲 基 组 氨 酸 8.67 7.63 7.39 7.00 3.91 3.69
1- 甲 基 组 氨 酸 8.74 7.82 7.47 7.01 3.89 3.69
馏 分 3 至 5 中 解 析 出 来 有 3-(3- 甲 氧 基 -4- 羟 基 ) 苯
丙 酸 、3- 乙 酸 基 吲 哚 以 及 长 链 脂 肪 酸 、 癸 二 酸 等 疏 水
较 高 的 化 合 物 . 另 外 , 值 得 注 意 的 是 极 性 大 、 水 溶 性
好 的 乳 酸 出 现 在 馏 分 4 中 , 乳 酸 具 有 较 大 的 水 溶 性 ,
疏 水 性 也 不 大 , 可 能 因 为 形 成 了 分 子 内 氢 键 从 而 增
加 了 疏 水 性 能 , 使 其 没 能 在 馏 分 1 或 馏 分 2 中 析 出 .
为 了 避 免 使 用 缓 冲 液 配 置 NMR 实 验 样 品 带 来 离
子 强 度 增 大 , 从 而 影 响 NMR 实 验 效 果 , 本 次 实 验 均
采 用 将 SPE 馏 分 冷 冻 干 燥 后 直 接 加 入 重 水 的 方 式 配
置 样 品 溶 液 , 获 得 的 样 品 溶 液 均 为 酸 性 , 发 现 个 别 化
合 物
1 H 化 学 位 移 与 其 在 中 性 或 弱 碱 性 环 境 中 的 化 学
位 移 差 距 较 大 , 最 明 显 的 为 组 氨 酸 及 其 衍 生 物 1- 甲 基
组 氨 酸 、3- 甲 基 组 氨 酸 、β- 丙 氨 酰 -1- 甲 基 组 氨 酸 等 ( 见
表 1), 在 以 后 代 谢 组 学 研 究 中 应 特 别 注 意 .
图 5 和 6 是 馏 分 1 和 馏 分 2 的 一 维
1 H 谱 的 解 析
结 果 , 可 以 看 出 谱 图 中 多 数 的 谱 峰 得 到 了 有 效 指 认 .
图 6 SPE 馏 分 2 的 NMR 1D-H 谱 , δ (9~0)×10 −6 ( 下 午 尿 样 )
2.4 结 论
谱 图 的 解 析 是 代 谢 组 学 研 究 中 极 为 重 要 的 一 步 ,
目 前 多 数 从 事 代 谢 组 学 研 究 的 实 验 室 多 采 用 测 量 标
准 化 合 物 谱 图 解 析 生 物 体 液 NMR 谱 图 . 本 文 通 过 对
SPE 和 HPLC-NMR 等 实 验 方 法 简 单 探 索 , 利 用 SPE
加 多 种 二 维 NMR 实 验 技 术 , 成 功 对
1 H NMR 谱 图 进
行 了 解 析 , 获 得 了 74 种 化 合 物 在 酸 性 条 件 下 的
1 H 和
13 C 的 化 学 位 移 , 与 传 统 方 法 相 比 , 该 方 法 简 便 、 快 捷 ,
为 我 们 进 一 步 进 行 代 谢 组 学 的 研 究 奠 定 了 基 础 .
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