2007 Analysis.pdf
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酵 素 分 析 方 法<br />
● 蛋 白 質 定 量<br />
● 酵 素 活 性 分 析<br />
● 膠 體 電 泳 法<br />
● 免 疫 轉 印 法<br />
● Proteomics<br />
也 是 根 基 於 分 子 構 造<br />
有 催 化 活 性 的 巨 分 子<br />
SDS vs Native-PAGE<br />
應 用 抗 體 的 專 一 性<br />
解 開 基 因 序 列 之 後
■ 蛋 白 質 構 造 的 骨 架<br />
H<br />
R<br />
C<br />
N<br />
H<br />
+<br />
COO -<br />
H<br />
C<br />
O<br />
O<br />
H<br />
H<br />
N<br />
C<br />
C<br />
N<br />
R<br />
O<br />
C<br />
H N<br />
C C<br />
R<br />
C<br />
O<br />
H<br />
N<br />
O<br />
C<br />
O C<br />
R<br />
C<br />
N<br />
R C<br />
H<br />
H N<br />
R C<br />
C<br />
C<br />
N C<br />
O H<br />
R<br />
H<br />
N<br />
O<br />
R<br />
C<br />
C O<br />
O -<br />
H 3 N<br />
O O O<br />
α α α<br />
+<br />
α H<br />
N-C-C-N-C-C-N-C-C<br />
R group
■<br />
各<br />
種<br />
蛋<br />
白<br />
質<br />
定<br />
量<br />
法<br />
原<br />
理<br />
5<br />
Specific<br />
3<br />
H<br />
Binding<br />
Group<br />
R<br />
C<br />
N<br />
H<br />
+<br />
H<br />
C<br />
O<br />
O<br />
206 nm<br />
(carbonyl)<br />
H<br />
280 nm<br />
(aromatic)<br />
UV<br />
Absorbance<br />
H<br />
Tyr<br />
Heme<br />
N<br />
C<br />
C<br />
N<br />
O<br />
C<br />
R C<br />
MH<br />
N<br />
C C<br />
活 性 區<br />
Cu 2+ Cu +<br />
4<br />
Blue<br />
-N=N- -NH-<br />
-OH -SO<br />
-<br />
3<br />
Phosphomolybdicphosphotungstate<br />
Coomassie Brilliant<br />
G<br />
SO 3<br />
-<br />
SO 3<br />
-<br />
Fe -N=N- -NH-<br />
-OH -SO<br />
-<br />
3<br />
Metal<br />
R<br />
C<br />
OH..<br />
O<br />
Lys<br />
NH 3<br />
+<br />
SO<br />
-<br />
C<br />
3<br />
C C<br />
H<br />
SO<br />
-<br />
CR<br />
3<br />
N<br />
O<br />
C<br />
O C<br />
R<br />
C<br />
R C<br />
N H<br />
H N<br />
R C<br />
C<br />
C<br />
N C<br />
O H<br />
R<br />
1<br />
Biruet Methods<br />
(carbonyl)<br />
Lowry Methods<br />
H<br />
N<br />
O<br />
NH 2<br />
+<br />
C<br />
C C<br />
RC<br />
C<br />
C O<br />
O -<br />
H 2<br />
N<br />
2<br />
Arg<br />
C<br />
HN NH 2<br />
C<br />
O<br />
尿 素<br />
urea<br />
NH 2
■ Bradford Method<br />
Coomassie Brilliant Blue G-250<br />
CBG 是 一 種 指 示 劑<br />
470 nm 595 nm<br />
加 入 蛋 白 質<br />
酸 性 環 境 下 呈 茶 色<br />
與 蛋 白 質 結 合 變 藍 色
■ 不 同 蛋 白 質 的 定 量 差 異<br />
A 600<br />
1.0<br />
BSA<br />
0.8<br />
0.6<br />
IgG<br />
0.4<br />
0.2<br />
20 40 60 80 100 120 140<br />
μg Protein
■ 各 種 蛋 白 質 定 量 法 的 比 較<br />
定 量 方 法<br />
靈 敏 度<br />
準 確 度<br />
其 它 說 明<br />
Biuret<br />
0.05 - 5 mg<br />
高<br />
呈 色 快 速 有 腐 蝕 性<br />
銨 離 子 干 擾 大<br />
Lowry<br />
0.05 - 0.5 mg<br />
中<br />
呈 色 較 慢<br />
多 種 離 子 有 干 擾<br />
Absorbance<br />
280 nm<br />
0.05 - 2 mg<br />
低<br />
樣 本 可 回 收<br />
其 它 物 質 干 擾 大<br />
Absorbance<br />
205 nm<br />
0.01 - 0.05 mg<br />
高<br />
樣 本 可 回 收<br />
氧 分 子 干 擾 極 大<br />
Bradford<br />
Dye-binding<br />
0.01 - 0.05 mg<br />
中 高<br />
呈 色 快 雜 質 干 擾 多<br />
顏 色 不 易 洗 除
精 確<br />
Bradford<br />
Method<br />
精 確 + 準 確<br />
206 nm 吸 光 度<br />
準 確<br />
Lowry Method<br />
Biuret Method<br />
不 精 確 + 不 準 確<br />
280 nm 吸 光 度
■<br />
酵<br />
素<br />
反<br />
應<br />
及<br />
偵<br />
測<br />
方<br />
法<br />
移 除 生 成 物 並<br />
轉 成 可 測 量 者<br />
使 用 大 量 反 應 物<br />
10 x K m<br />
生 成 物 可 能 有<br />
回 饋 抑 制<br />
-<br />
酵 素<br />
NAD +<br />
直 接 測 量<br />
NADH<br />
-<br />
耦<br />
合<br />
反<br />
應<br />
反 應 物<br />
生 成 物<br />
能 否 直 接 測 量 ?<br />
把 生 成 物 再 轉 換 成<br />
可 被 測 量 的 生 成 物
■ 酵 素 活 性 的 測 定<br />
酵 素 量 要 適 中<br />
基 質<br />
要 過 量<br />
10 x Km<br />
E<br />
t<br />
vo = P<br />
t<br />
生 成 物<br />
要 能 測 得<br />
酸 鹼 度<br />
反 應 時 間 恰 當<br />
溫 度
■ 測 定 時 間 內 反 應 速 率 需 成 線 性<br />
Product<br />
正 確 速 率<br />
不 正 確 速 率<br />
p<br />
v =<br />
p<br />
t<br />
t<br />
Time<br />
t
■ GUS 酵 素 活 性 的 測 定<br />
反 應 物<br />
生 成 物<br />
HO<br />
COOH<br />
O<br />
OH<br />
O<br />
NO 2<br />
+ H 2<br />
O<br />
GUS<br />
HO<br />
COOH<br />
O OH<br />
OH<br />
+<br />
HO NO 2<br />
OH<br />
OH<br />
p-Nitrophenyl β-D-glucuronide<br />
(pNPG)<br />
β-D-Glucuronic acid<br />
p-Nitrophenol<br />
(yellow)<br />
415 nm
■<br />
電<br />
泳<br />
形<br />
式<br />
的<br />
演<br />
進<br />
-<br />
濾 紙 電 泳 Cellulose<br />
Protein<br />
Denatured<br />
薄 層 電 泳 (TLE) Cellulose acetate<br />
Partial<br />
Denatured<br />
+<br />
膠 體 電 泳 Starch → Gel
■ 膠 體 的 聚 合 反 應<br />
Ammonium persulfate (free radical initiator)<br />
2-<br />
(O 4S-SO 4)<br />
自 由 基 的 生 成 者<br />
Acrylamide (monomer)<br />
成 膠 的 基 本 單 位<br />
Bis(acrylamide) (bridge)<br />
架 橋 使 聚 合 產 生 分 枝<br />
TEMED (catalyst)<br />
幫 助 傳 遞 自 由 基 的 催 化 劑<br />
SDS (Sodium dodecyl sulfate)<br />
-<br />
2 SO 4<br />
1 1<br />
2<br />
1 2<br />
CH 2 =CH-CO-NH 2<br />
Acrylamide 有 毒 性 !<br />
澱 粉 加 高 熱 會 誘 生 ?
■ 單 體 聚 合 反 應<br />
鑄<br />
膠<br />
反<br />
應<br />
聚 合 反 應<br />
free<br />
radical<br />
架 橋 物 造 成 分 枝<br />
Bis<br />
交 錯 連 結<br />
Bis<br />
端 點 自 由 基<br />
可 再 延 續<br />
自 由 基 形 成
■ SDS 在 蛋 白 質 表 面 均 勻 敷 上 一 層 負 電<br />
SDS<br />
原 態 蛋 白 質<br />
boiling<br />
變 性 蛋 白 質 成 一 線 狀 分 子<br />
並 且 均 勻 帶 上 一 層 負 電 荷<br />
極 性 頭 部<br />
非 極 性 尾 部
■ 電 泳 膠 體 系 統 的 組 成<br />
電 泳 系 統 緩 衝 液 pH 膠 體 濃 度<br />
1<br />
上 層 ( 負 極 ) 緩 衝 液<br />
Tris-glycine<br />
8.3<br />
-<br />
2 樣 本 溶 液<br />
Tris-glycine<br />
8.3<br />
-<br />
3 膠 焦 集 膠 體 Tris-HCl 6.9<br />
4 體 分 離 膠 體 Tris-HCl 8.3<br />
5%<br />
7.5~20%<br />
5 下 層 ( 正 極 ) 緩 衝 液<br />
Tris-glycine<br />
8.3<br />
-<br />
● 膠 體 不 連 續 性 有 焦 聚 樣 本 的 作 用
■<br />
直<br />
立<br />
式<br />
電<br />
泳<br />
裝<br />
置<br />
電 泳 開 始<br />
100~150 V<br />
Upper<br />
chamber<br />
Lower<br />
chamber<br />
-<br />
+<br />
Stacking<br />
Gel<br />
Cooling<br />
Water<br />
Running<br />
Gel<br />
+
■ 焦 集 膠 體 對 蛋 白 質 分 子 的 焦 集 作 用<br />
A B C<br />
樣<br />
本<br />
8.3<br />
焦<br />
集<br />
膠<br />
體<br />
6.9 離 子 缺 乏 空 間<br />
分<br />
離<br />
膠<br />
體<br />
8.9<br />
+ +
■ 三 種 不 同 性 質 蛋 白 質 的 電 泳 比 較<br />
Protein Quaternary<br />
Structure<br />
Molecular<br />
Weight<br />
pI<br />
Native<br />
PAGE<br />
Mobility<br />
SDS-<br />
PAGE<br />
X<br />
Tetramer<br />
(40,000)x4<br />
5.8<br />
Slow<br />
Fast<br />
Y<br />
Z<br />
Monomer 88,000<br />
Monomer 60,000<br />
5.2<br />
9.3<br />
Fast<br />
Upward<br />
Slow<br />
Medium<br />
- - +<br />
X Y Z
Native-PAGE<br />
X Y Z<br />
+ SDS<br />
-<br />
- +<br />
SDS-PAGE<br />
X Y Z<br />
分 子 量 及 淨 電 荷 密 度<br />
均 影 響 泳 動 率<br />
只 有 分 子 量 影 響 泳 動 率
■ 單 元 體 分 子 量 的 測 定 : SDS-PAGE<br />
Mol mass<br />
kD<br />
300<br />
200<br />
kD<br />
330<br />
220<br />
kD<br />
94<br />
100<br />
80<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
67<br />
60<br />
36<br />
67<br />
43<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0.5 1.0<br />
Migration (R f )<br />
18.5<br />
20.1<br />
14.4<br />
Pharmacia: Molecular Markers for electrophoresis
■<br />
各<br />
種<br />
蛋<br />
白<br />
質<br />
染<br />
色<br />
法<br />
機<br />
制<br />
金 屬 銀 沈 澱<br />
Ag<br />
(Cys)<br />
NH<br />
+<br />
2<br />
Glu<br />
NH<br />
C C<br />
C<br />
H<br />
還<br />
原<br />
Lys<br />
RC<br />
C<br />
N<br />
H<br />
+<br />
H<br />
1<br />
C<br />
O<br />
Ammoniacal<br />
silver<br />
H 3 N…Ag…NH 3<br />
H 2 N…Ag<br />
O<br />
H<br />
Glutaraldehyde<br />
H<br />
N<br />
C<br />
C<br />
N<br />
R<br />
O<br />
C<br />
H N<br />
C C<br />
R<br />
C<br />
O<br />
Lys<br />
NH 3<br />
+<br />
Coomassie<br />
Brilliant<br />
Blue R<br />
SO 3<br />
-<br />
SO<br />
-<br />
C<br />
3<br />
SO<br />
-<br />
3<br />
C C<br />
H<br />
SO<br />
-<br />
CR<br />
3<br />
N<br />
O<br />
C<br />
O C<br />
R<br />
C<br />
R C<br />
N H<br />
H N<br />
R C<br />
C<br />
C<br />
N C<br />
O H<br />
R<br />
-N=N- -NH-<br />
-OH -SO<br />
-<br />
3<br />
-N=N- -NH-<br />
-OH -SO<br />
-<br />
3<br />
Arg<br />
H<br />
N<br />
O<br />
2<br />
NH 2<br />
+<br />
C<br />
HN NH 2<br />
C<br />
C C<br />
CR<br />
C<br />
C O<br />
O -
■ 電 泳 槽 及 相 關 設 備<br />
轉 印 三 明 治<br />
轉 印 槽<br />
電 泳 槽<br />
鑄<br />
膠<br />
器<br />
供 電 器
■ 轉 印 及 免 疫 染 色 流 程<br />
A<br />
轉 印 三 明 治<br />
B<br />
免 疫 染 色 流 程 及 結 果<br />
塑 膠 夾 板<br />
Filter Paper<br />
轉 印<br />
E<br />
抗 體<br />
-<br />
+<br />
Gel<br />
Nitrocellulose<br />
海 綿 墊<br />
電 泳 膠 體<br />
Coomassie<br />
Blue<br />
Staining<br />
轉 印 膜<br />
Ponceau<br />
Staining<br />
抗 體 偵 測 呈 色
■ 免 疫 轉 印 的 種 類 與 呈 色 機 制<br />
2<br />
E<br />
S<br />
E<br />
Antigen<br />
Antibody<br />
Second<br />
Antibody<br />
Radioactive<br />
Tracer<br />
1. Horse Radish<br />
Peroxidase (HRP)<br />
2. Alkaline<br />
Phosphatase (AP)<br />
Biotin<br />
Streptavidin<br />
Biotin -HRP<br />
-AP<br />
轉 印 紙<br />
2<br />
2<br />
2<br />
2<br />
E<br />
E<br />
Au<br />
S<br />
E<br />
RIA<br />
EIA<br />
E<br />
P<br />
2<br />
S<br />
S<br />
S<br />
2<br />
2<br />
S S<br />
S<br />
E S<br />
S<br />
S S<br />
S<br />
P<br />
E<br />
P P P P P<br />
P<br />
P<br />
P<br />
P<br />
P<br />
E<br />
P<br />
P<br />
S S<br />
S<br />
P<br />
基<br />
質<br />
生 成 物<br />
S<br />
Au<br />
Colloidal Gold<br />
生 成 物 堆 積
■<br />
擔<br />
體<br />
免<br />
疫<br />
沈<br />
澱<br />
的<br />
原<br />
理<br />
及<br />
應<br />
用<br />
擔<br />
體<br />
免<br />
疫<br />
沈<br />
澱<br />
A<br />
A<br />
A<br />
A<br />
A<br />
離 心 分 離 後<br />
以 SDS-PAGE 電 泳 檢 定<br />
抗 原 有 輕 鏈 及<br />
重 鏈 各 兩 條<br />
抗 原 可 能 有<br />
兩 個 次 體<br />
H<br />
L<br />
A<br />
細<br />
胞<br />
粗<br />
抽<br />
取<br />
液
免 疫 轉 印<br />
Disc-PAGE<br />
■ 澱 粉 磷 解 染 色 方 法 比 較<br />
SDS-PAGE<br />
膠 體 過 濾 法 各 分 劃<br />
硝<br />
酸<br />
銀<br />
活<br />
性<br />
染<br />
色
■<br />
等<br />
電<br />
焦<br />
集<br />
法<br />
的<br />
焦<br />
集<br />
方<br />
式<br />
Ampholyte<br />
3<br />
5<br />
7<br />
9<br />
0<br />
-<br />
+<br />
+<br />
++<br />
-<br />
在 低 pH 處 帶 正 電 被 排 斥<br />
焦 集 在 等 電 點<br />
在 高 pH 處 帶 負 電 被 排 斥<br />
-
3.3.2 等 電 焦 集 法 原 理<br />
樣 本 分 子 在 一 已 知 pH 梯 度 中 焦 集<br />
168<br />
cm<br />
169<br />
cm<br />
167<br />
cm
■<br />
等<br />
電<br />
焦<br />
集<br />
的<br />
雙<br />
性<br />
離<br />
子<br />
構<br />
造<br />
● 組 合 不 同 數 目 胺 基 與 酸 基<br />
可 合 成 多 種 pI 的 混 合 物<br />
R<br />
H–N–C–C–C–N–C–C–C–N–H<br />
R<br />
+<br />
H<br />
+<br />
OH<br />
OH<br />
CH 2 CO 2<br />
-<br />
N–H<br />
C<br />
C<br />
C<br />
R 2 N–C–C–C–N–C–C–C–N–H<br />
OH<br />
CH 2 CO 2<br />
-<br />
H<br />
R<br />
OH<br />
+<br />
C–OH<br />
C<br />
+ +<br />
O<br />
CH 2 CO 2<br />
-
■ 等 電 點 標 準 校 正 線 : IEF<br />
9<br />
pI<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
SS<br />
4<br />
3<br />
0 2 4 6 8 10 12<br />
Migration (cm)
■<br />
二<br />
次<br />
元<br />
電<br />
泳<br />
kD<br />
100<br />
pH<br />
4<br />
Isoelectric focusing<br />
5 6<br />
7<br />
50<br />
25<br />
SDS<br />
PAGE
■ 二 次 元 電 泳 操 作 流 程<br />
(1) IEF<br />
等 電 焦 集 電 泳<br />
pH 3 - - - - - - 10<br />
(2)<br />
SDS-PAGE<br />
分 離 膠 體<br />
Juang RH (2004) Proteomics<br />
(3)<br />
染 色 脫 色
■ 蛋 白 質 體 可 綜 觀 蛋 白 質 的 消 長 與 身 分<br />
Proteolytic<br />
digestion<br />
Sample<br />
2D electrophoresis<br />
Pure protein<br />
Proteolytic fragments<br />
Mass spectrum<br />
MALDI-TOF<br />
Capillary<br />
Electrophoresis<br />
HPLC<br />
GCG<br />
Database<br />
searching<br />
N-<br />
Amino<br />
acid<br />
sequencing
■<br />
質<br />
譜<br />
儀<br />
可<br />
檢<br />
定<br />
蛋<br />
白<br />
質<br />
身<br />
分<br />
Unknown protein<br />
Protease digestion<br />
P1 P2 P3 P4<br />
MALDI-TOF<br />
MW4 MW2 MW3 MW1<br />
m/z<br />
Search Database<br />
Candidate protein<br />
Digestion Simulation<br />
Calculate Mol wt<br />
MW4 MW2 MW3 MW1<br />
● 比 對 各 片 段 分 子 量 可 確 定 該 蛋 白 質 身 分
■<br />
質<br />
譜<br />
儀<br />
可<br />
進<br />
行<br />
蛋<br />
白<br />
質<br />
序<br />
列<br />
分<br />
析<br />
Unknown protein<br />
Protease digestion<br />
P1 P2 P3 P4<br />
LC<br />
P4<br />
ESI-Mass/Mass<br />
G K G S W V R<br />
-GKGSWVR ● 質 譜 儀 可 直 接 定 序<br />
Phosphorylated protein<br />
Protease digestion<br />
P1 P2 P3 P4<br />
LC<br />
ESI-Mass/Mass<br />
P<br />
P4<br />
P<br />
● 也 可 定 出 磷 酸 化 位 置
■ 現 代 蛋 白 質 科 技 的 特 點<br />
● 高 產 能 High-through put<br />
● 快 速<br />
● 微 量<br />
High-speed<br />
Micro-scaled
Change language