기획연구 추진체계

Detection ofSingle Nucleotide Polymorphism byAu Nanowire-on-Film SERS SensorCoupled with S1 Nuclease Treatment1

Single Nucleotide polymorphism (SNP)인간염색체에 3 ~ 10 백만개 존재.염기서열 변이의 90% 이상 차지하고 가장 흔한 유전자 변이.이를 발견하는 것은 질병의 조기진단, 예방, 치료에 필수적.S1 nulease + 금 NW-on-Film SERS 센서 시스템의 장점1.잘 정의된 NOF SERS sensor 는 감도가 높고 재현성이 좋은 SERS 신호 제공2.S1 nuclease (단일 염기 불일치를 인식하여 잘라내는 효소)사용하여 검출에러를 최소화:3.여러 개의 나노선 센서를 결합하면 다중검출 가능2

PMthiol 기사용MM선택적인 효소에 의한 절단은 SNP 검출법의 선택성을 높이고에러를 줄이는 핵심적 단계3

S1 nuclease 반응 전후 SERS 신호의 차이를 최대화 시키기 위해 S1 nuclease 의 농도와 반응 시간을 최적화최적화된 20분의 반응시간과 40 U/ml 의 농도 및37도에서 효소 작용전과 후의 SERS 신호4

Bi 는 Ai 하고만 완벽하게 complimentary왼쪽 결과는 이 센서가 전혀 에러없이 우수한SNP 검출능력을 가짐을 보여준다.검출한계는 100 pM5

Wilson 병은 열성, 두 개의 변이된 DNA 가 있어야 질병나타남.3번은 정상 DNA피검사자는 정상유전자 가짐피검사자는 유전자 질병 가짐피검사자는 유전자 하나가 변이되었으나 건강함6

Au Nanowire-on-Film SERRS Sensorfor Ultrasensitive Hg 2+ DetectionChem. Eur. J., 17, 2211 (2011)

1. The central pointUltrasensitive Single Nanowire on a Film SERS Sensor for Hg 2+ Detection (title)2. Summary within 3 sentences우리는 Hg 2+ 검출을 위한 SNOF SERS 센서를 개발하였다. SERS 자체의 고감도와 SNOF 구조의 우수한 신호재현성을 통해, Hg 2+ 를 100 pM의 검출 한계 농도까지 정량적으로 검출 할 수 있었다.1.SNOF 의 novel character 에 집중한다. 이 개념을 이용한 최초의 응용 예다.2.100 pM의 ultrasensitive 한 최고의 SERS sensor 임.3.multiplex sensor 로 만들 수 있다는 점을 강조.3. Description to a colleague in one minute.우리는 매우 민감한 Hg 2+ 검출용 SNOF SERS 센서를 개발하였다. Hg 2+ 는 structure-switching aptamer (T-richDNAs + Cy5 labeled DNAs)와 함께 있을 때, T-rich DNAs와 매우 선택적으로 강하게 결합하여 Cy5 labeledDNAs를 내놓게 된다. 이렇게 생긴 Cy5 labeled DNAs를 SNOF 센서로 검출하여 Hg 2+ 의 농도를 결정 할 수 있다.aptamer를 이용한 Hg 2+ 의 검출법은 그 동안 많이 개발되었지만 우리는 SNOF SERS 센서를 이용함으로써, SERS고유의 고감도성과 SNOF 구조의 우수한 신호 재현성을 동시에 얻을 수 있었다. 그러므로, SNOF SERS 센서를통하여 100 pM의 Hg 2+ 검출 한계 농도를 얻었으며, 이는 매우 인상적인 결과이다. 또한, 사용했던 SNOF 센서를재사용 할 수 있으며 오래 보관하여 사용하여도 안정함을 확인하였다.aptamer 가 크게 보면 분자를 잡는 시퀀스인데, 예를 들면 코케인 또는 아데닌 등을 압타머써서 잡기도 한다.(특정 시퀀스가 있어야 잡는다. 그러나 머큐리는 그런게 아니고 DNA서열 중에 티민만 많이 있으면 순서는상관없이 잡힌다. 머큐리 검출하는 다른 논문 경우에는 꼭 압타머라고는 쓰지않고 반반 정도이다. 머큐리를DNA로 검출하는 논문들은 본문 중에는 압타머라 쓰긴 하나 제목에 직접적으로 압타머라고는 쓰지않았다.) 이논문의 센싱 method는 별로 새롭거나 강점이 없으나1SERS쓴 것은 아직 많이 없고 그 중에도 SNOF 구조는 아무도 없다. 이런 SNOF구조에 SERS 써서 감도가엄청나게 좋아진 건 아니지만 100 pM 정도 달성했는데, 다른 연구는 30pM정도까지 내려온 것도 있으나 3-스텝정도로 복잡한 방법을 쓴 것이고 2우리는 1-스텝 한 것들과 비교해서는 이들이 일반적으로 nM정도 되므로 (잘안되는 것은 10 nM 잘 되는 건 1 nM 인데 우리는 더 내려왔다.) 이정도 sensitivity 비교는 논문에 해도 됨.8

Aptamer1. 그 자체로 안정된 3차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)2. “fitting”의 의미를 가지는 라틴어 “aptus”에서 그 어원이 유래했다.3. 1990년에 Colorado 대학의 Larry Gold 연구팀에 의해 SELEX (SystematicEvolution of Ligands by Exponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후, 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다.4. 압타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특별히 “chemicalantibody”라고도 불리는 만큼 대체항체로서의 가능성도 매우 높다.9

1) 항체는 분자 구조가 크기 때문에 (~150 kDa) 생산이 어렵고 수정(modification)또한 용이하지 못한 반면, 압타머는 약 20~60 mer 정도 길이의 핵산으로 구성되어있는 작은 분자 구조이고, 여러 필요한 수정이 용이.2) 압타머는 항체에 비해 안정성이 매우 높다. 단백질이나 항체 의약품의 경우 실온에서 보관이나 운반이 불가능하지만 압타머는 가능하고, 심지어 멸균 후에도 기능을 유지할 수 있으며, 만약 변성 (denaturation)이 되더라도 다시 짧은 시간에 재생(regeneration)이 가능하기 때문에 특히 장시간 또 반복사용이 요구되는 진단용으로의 응용이 용이.3) 항체의 경우 동물이나 세포를 이용하여 만들기 때문에 생산하는데 많은 시간과비용이 요구되며, 또한 만든 시기에 따라 기능성이 달라질 가능성도 있다(batch to batch variation). 하지만 압타머는 화학적 합성방법을 이용하기 때문에단시간에 적은 비용으로 생산이 가능하고, batch to batch variation이 거의 없으며또한 고순도의 정제과정이 매우 용이하여 생산적인 측면에서 탁월.4) 항체나 다른 의약용 단백질의 경우에 쉽게 나타나는 생체내 면역거부반응이 거의 일어나지 않음. 치료용으로 큰 장점.5) 항체를 만들기 어려운 독소 (toxin), 복잡한 단백질 복합체 또는 당과 단백질 복합체에 대한 압타머를 만들 수 있으며, 또한 새로운 물질에 대한 결합 물질로의 변형이 용이하여 (flexibility) 새로운 압타머 발굴에 활발히 응용될 수 있다.10

항체에 버금가는 표적 친화력을 가지고 있고 항체에 비해 크기가 월등히 작고 또한다양한 표적분자들과 높은 결합력으로 결합할 수 있는 능력을 가지고 있는 압타머는진단 및 분석에 많이 응용됨.1997년 형광표지된 압타머를 이용한 Human-neutrophil elastase 를 광학적으로 검출하는 압타머 센서(aptasensor)가 처음 개발된 이후(i)압타머와 표적분자간의 결합 전후에 나타나는 전자 전달정도를 감응하여 반응하는 전기화학적 (electrochemical) 방식의 센서,(ii) 형광물질등의 형광측정을 통한 광학적 (optical) 방식의 센서, 그리고(iii) 표적 물질과의 결합 전후에 나타나는 질량의 차이를 분석하여 측정하는 질량 분석 (mass-sensitive) 방식의 압타머 센서 들이 개발됨.전기화학적 방식의 예로서 Methylene blue (MB)로 표지된 압타머를 전극에 고정하고 나서 표적물질과 결합을 하게 되면 압타머의 구조 변화를 유발하면서 압타머에표지된 MB가 전극으로부터 멀어지게 되고 결과적으로 MB로부터의 전기화학적 신호가 줄어들게 되어 표적물질 결합 전후의 전기화학적 신호를 감지하면서 압타머와의 결합여부를 진단할 수 있게 된다. 또한 압타머의 hairpin-loop 구조에 chelating되어 있던 MB가 표적물질 결합 후 나타나는 변형구조로인해 MB가 압타머로부터 빠져나가면서 신호의 감소를 주는 label-free 방식도 있다. 또한 전극대신 탄소 나노튜브(CNT-FET)를 사용하는 방식은 표적물질 결합 전후에 나타나는 전기전도도(conductance)의 변화를 감응함으로써 신호를 얻을 수 있는 방식임.11

전기화학적 방식을 이용한 바이오센서표적이 결합하면 MB 가 빠져나감표적이 결합하면 전기전도도 변화함12

Single-Step Multiplex Detection of Toxic Metal Ionsby Au Nanowires-on-Chip Sensor Using ReporterEliminationLab on a Chip., 12, 3077 (2012)15

우리는 다수의 독성 금속 이온을 민감하게 검출할 수 있는 금 NWs-on-chip SERS multiplex센서를 개발하였다.Most importantly, 우리는 reporter elimination 방법을 채용하여 검출과정을 단일 과정으로줄였고, 이는 원격 온라인 환경 모니터링을 가능하게 만든다.이 센서는 여러 주목할만한 특징을 가지고 있다.1) well-defined 단결정 금 나노선에 기반하여 높은 재현성을 보여준다.2) 나노선 하나가 특정 금속 이온을 검출할 수 있기 때문에 이온의 다중 검출에 유용하다.3) 시료 용액을 NWs-on-chip 센서에 떨어트리면 특정 나노선의 SERS 신호가 감소하는 아주간단한 검출과정을 가지고 있다.단결정 금 나노선은 타깃 이온에 특정적인 압타머와 라만 리포터를 가진 그에 상보적 올리고머로이루어진 thiolated dsDNAs로 각각 개질되어 금 필름 chip 위에 정렬시킨다. 시료 용액을 떨어트리면, 금속 이온이 dsDNAs와 결합하면서 금 나노선과 금 필름 사이의 갭으로부터 라만 리포터가 멀어지게 만들어서 SERS 신호를 감소시킨다.그러므로, SERS 신호의 측정에 의해 간단하고, 빠르고, 민감한 금속 이온의 정량적 검출이 가능하다. 우리는 이 센서를 사용하여 단일 용액 안의 Hg 2+ , Ag + , Pb 2+ 를 성공적으로 검출하였다.간단한 반응 스텝을 가지는 제시된 센서는 자동화된 소자를 이용하여실시간 및 원격 on-line 환경 모니터링에 사용가능함16

Hg 2+ , Ag + 초고감도로 검출Pb 2+ 의 감도는 더 좋지는 않음19