HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E)

HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) 

Ref. 4106 

HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) 

Ref. 4126 

2005/03

HYDRAGEL 7 & 15 HEMOGLOBIN(E) - 2005/03 

UTILISATION 

L’HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) et l’HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) sont des gels d’agarose qui permettent la séparation des hémoglobines 

normales (A et A 2 

) et la détection des principales hémoglobines anormales : S ou D et C ou E, par électrophorèse dans le système semi-automatique 

HYDRASYS. L’analyse est réalisée sur l’hémolysat de globules rouges lavés. Le système HYDRASYS permet de réaliser toutes les séquences 

jusqu’à l’obtention du gel prêt pour l’identification des différentes hémoglobines. Les hémoglobines sont séparées en milieu alcalin (pH 8,5) et colorées 

par une solution d’amidoschwarz. L’excès de colorant est éliminé en milieu acide. L’analyse qualitative des hémoglobines normales et anormales peut 

alors être réalisée. La densitométrie donne une quantification relative précise de chaque zone individualisée dont les hémoglobines présentant un 

intérêt particulier, telles que l’hémoglobine A 2 

pour le diagnostic des ß thalassémies. L’électrophorèse sur gel acide, HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E), permet de confirmer l’identification des variants de l’hémoglobine, en particulier, de différencier l’hémoglobine S de l’hémoglobine D 

et l’hémoglobine E de l’hémoglobine C. 

Chaque gel d’agarose est prévu pour l’analyse de : 

• 7 échantillons pour le kit HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), 

• 15 échantillons pour le kit HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

À usage in vitro exclusivement. 

PRINCIPE DU TEST 

L’hémoglobine est une molécule complexe composée de quatre chaînes polypeptidiques, identiques deux à deux, chaque chaîne étant liée à l’hème, 

noyau tétrapyrrolique (porphyrine) lié à un atome de fer. L’hème est commun à toutes les hémoglobines. La partie protéique responsable du type 

d’hémoglobine est appelée globine. On connaît principalement les chaînes polypeptidiques α, β, δ et γ. Chez l'homme, on peut trouver les 

hémoglobines normales suivantes : 

• hémoglobine A ................................... = α 2 β 2 

• hémoglobine A 2 

.................................. = α 2 δ 2 

• hémoglobine fœtale F ........................ = α 2 γ 2 

La chaîne α est commune à ces trois hémoglobines. 

La structure spatiale de l’hémoglobine (comme celle de toutes les protéines) dépend de la nature et de la séquence des acides aminés constituant 

les chaînes. Les liaisons qui se forment entre les différents acides aminés sont responsables de la forme de la molécule, de sa stabilité et de ses 

propriétés. Placées dans un champ électrique, les hémoglobines se déplacent en fonction de leur charge, de la taille de la molécule, de la force 

ionique, du pH du tampon et de la nature du support. Les variants de l’hémoglobine sont dus à des mutations de certains acides aminés entraînant 

des charges de surface différentes et donc des mobilités différentes en électrophorèse. 

Les anomalies de l’hémoglobine sont de deux sortes : 

• anomalies qualitatives ou de structure constituant le groupe des hémoglobinopathies ; 

• anomalies quantitatives ou de régulation constituant le groupe des thalassémies. 

RÉACTIFS FOURNIS DANS LES KITS HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) ET HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) 

COMPOSANTS RÉF. N° 4106 RÉF. N° 4126 Gels d’agarose (prêts à l’emploi) 10 gels 10 gels Mèches tamponnées (prêtes à l’emploi) 10 sachets de 2 10 sachets de 2 Diluant colorant (solution concentrée) 1 fl. de 60 ml 1 fl. de 60 ml Colorant amidoschwarz (solution concentrée) 1 fl. de 20 ml 1 fl. de 20 ml Solution hémolysante (prête à l’emploi) 1 fl. de 20 ml 1 fl. de 20 ml Applicateurs (prêts à l’emploi) 1 boîte de 10 (7 dents) 1 boîte de 10 (15 dents) 

| Papiers-filtres fins | 1 sachet de 10 | 1 sachet de 10 | 

POUR DES RÉSULTATS OPTIMUMS 

Les éléments d’un même kit doivent être utilisés ensemble et selon les instructions de la notice. 

LIRE ATTENTIVEMENT LA NOTICE D’UTILISATION. 

1. GELS D’AGAROSE 

Préparation 

Les gels d’agarose sont prêts à l’emploi. Chaque gel contient : agarose, 8 g/l ; tampon alcalin, pH 8,5 ± 0,1 ; composants sans danger aux 

concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales. 

Utilisation 

Support pour l’électrophorèse des hémoglobines. 

Conservation, stabilité et signes de détérioration 

Les gels doivent être conservés à température ambiante (de 15 à 30 °C) ou au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). Ils sont stables jusqu’à la date 

d’expiration indiquée sur le kit ou sur le sachet du gel. Les gels doivent être conservés horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur 

le devant du kit doit être pointée vers le haut). Ne pas stocker les gels à proximité d’une fenêtre ou d’une source de chaleur. Éviter toute variation 

brutale de température. 

NE PAS CONGELER. 

Éliminer le gel dans les cas suivants : 

(I) apparition de cristaux, de précipité en surface du gel ou texture du gel très molle (indiquant que le gel a gelé) ; 

(II) apparition de bactéries ou de moisissures ; 

(III) présence anormale de liquide dans la boîte du gel (indiquant une exsudation du gel liée à de mauvaises conditions de conservation). 

- 1 - 

NOTICE D’UTILISATION SEBIA - Français

2. MÈCHES TAMPONNÉES 

Préparation 


Les mèches en éponge tamponnées sont prêtes à l’emploi. Chaque mèche tamponnée contient : tampon alcalin pH 9,2 ± 0,2 ; composants sans 

danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales. 

Utilisation 

Les mèches en éponge tamponnées jouent un rôle de réservoir de tampon pour l’électrophorèse et assurent le contact entre le gel et les électrodes. 


Les mèches tamponnées peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur. 

Elles doivent être conservées horizontalement dans leur sachet de protection (la flèche sur le devant du kit doit être pointée vers le haut). 

Elles sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur le sachet des mèches tamponnées. NE PAS CONGELER. 

Éliminer les mèches tamponnées si le sachet est ouvert ou si les mèches sont sèches. 

3. DILUANT COLORANT 

Préparation 

Le diluant colorant concentré doit être utilisé comme décrit dans le paragrahe " COLORANT AMIDOSCHWARZ ". Il contient une solution acide. 

Utilisation 

Pour la préparation du colorant amidoschwarz. 


Le diluant colorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le 

kit ou sur l’étiquette du flacon de diluant. NE PAS CONGELER. 

Ne pas ajouter d’azoture de sodium. 

4. COLORANT AMIDOSCHWARZ 

Préparation 

Le colorant amidoschwarz concentré est une solution visqueuse qui peut éventuellement gélifier, ce qui n’affecte absolument pas la qualité de la 

solution finale et son pouvoir de coloration. 

Dans tous les cas, pour obtenir une parfaite reconstitution du colorant, il faut respecter le protocole suivant : 

1. Ajouter environ 15 mL de diluant colorant au flacon d’amidoschwarz concentré. 

2. Refermer soigneusement le flacon. 

3. Agiter très vigoureusement le flacon pendant au minimum 5 secondes. 

4. Verser la solution obtenue dans le récipient de préparation de la solution de coloration. 

5. Renouveler cette opération deux fois, trois fois, si nécessaire. 

6. Verser le reste du diluant dans le récipient de préparation de la solution de coloration. 

7. Compléter à 300 mL avec de l’eau distillée ou déminéralisée. 

8. Agiter parfaitement cette solution pendant 5 à 10 minutes. 

Le colorant est prêt à l’emploi. 

Après dilution, la solution colorante contient : solution acide pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; éthylène-glycol, 6,7 % ; composants sans danger aux 

concentrations utilisées, nécessaires pour des performances optimales. 

ATTENTION : Nocif en cas d’ingestion. 

Utilisation 

Pour la coloration des gels après séparation électrophorétique des protéines. 

IMPORTANT : Le colorant est uniquement destiné à la coloration de 10 gels. Renouveler le colorant après 10 utilisations. 


Les solutions de colorant concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés pour éviter 

l’évaporation. La solution concentrée est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de colorant. 

La solution diluée est stable pendant 1 mois. 

Ne pas stocker la solution de colorant diluée à proximité d’une source de chaleur. 

5. SOLUTION HÉMOLYSANTE 

Préparation 

La solution hémolysante est prête à l’emploi. C’est un tampon avec des composants sans danger aux concentrations utilisées, nécessaires pour des 

performances optimales. 

Utilisation 

Pour l’hémolyse des globules rouges. 


La solution hémolysante peut être conservée à température ambiante ou au réfrigérateur. Elle est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le 

kit ou sur l’étiquette du flacon de solution hémolysante. 

Éliminer la solution hémolysante s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. 

6. APPLICATEURS 

Utilisation 

Applicateurs prédécoupés, à usage unique pour le dépôt des échantillons. 

Conservation 

Les applicateurs doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur. 

- 2 -

7. PAPIERS-FILTRES FINS 


Utilisation 

Feuilles de papier-filtre, à usage unique pour l’absorption de l’excès de liquide à la surface du gel avant l’application des échantillons. 

Conservation 

Les papiers-filtres fins doivent être conservés dans un endroit sec à température ambiante ou au réfrigérateur. 

RÉACTIFS NÉCESSAIRES NON FOURNIS 

1. DÉCOLORANT 

Préparation 

Chaque flacon de décolorant concentré (SEBIA, référence N° 4540 : 10 flacons de 100 ml chacun) doit être dilué au 1/1000 avec de l’eau distillée ou 

déminéralisée, il permet d'obtenir 100 litres de solution décolorante. 

Prélever par quantité de 5 ml et compléter à 5 litres avec de l’eau distillée ou déminéralisée. 

Après dilution, la solution décolorante contient : acide citrique, 0,5 g/l. 

Utilisation 

Pour la décoloration, c’est-à-dire l’élimination de l’excès de colorant, après coloration du gel. 

Pour le rinçage de la cuve de coloration après lavage. 

Pour neutraliser l’acidité du décolorant, mettre dans le flacon de vidange vide, 15 ml de soude à 50 % (solution du commerce). 


Le décolorant concentré peut être conservé à température ambiante ou au réfrigérateur. Il est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le kit ou 

sur l’étiquette du flacon de décolorant. 

Le décolorant dilué est stable pendant 1 semaine à température ambiante, en flacon fermé. 

Éliminer le décolorant dilué s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. 

Ne pas ajouter d’azoture de sodium. 

En cas de conservation prolongée (au delà d’une semaine) de la solution diluée, ajouter 50 µl/l de ProClin 300 pour prévenir toute prolifération microbienne. 

Le décolorant dilué contenant du ProClin est stable en flacon fermé à température ambiante ou au réfrigérateur jusqu’à la date d’expiration indiquée 

sur le kit ou sur l’étiquette du flacon de décolorant. 

2. SOLUTION DE LAVAGE HYDRASYS 

Préparation 

Chaque flacon de solution de lavage HYDRASYS concentrée (SEBIA, référence N° 4541 : 10 flacons de 80 ml chacun) doit être complété à 5 litres 

avec de l’eau distillée ou déminéralisée. 

Après dilution, la solution de lavage contient : tampon alcalin, pH 8,8 ± 0,3 ; azoture de sodium. 

ATTENTION : La solution de lavage concentrée contient 0,625 % d'azoture de sodium. Ne pas avaler ! En cas d’ingestion, consulter 

immédiatement un médecin ! L'azoture de sodium peut former des complexes explosifs ou toxiques en cas de contact avec des acides, du 

plomb ou du cuivre. Au moment de l’élimination des solutions, laver abondamment avec une grande quantité d’eau. 

Utilisation 

Pour le lavage périodique de la cuve de coloration de l’HYDRASYS : Par exemple, pour une utilisation journalière, effectuer un lavage hebdomadaire 

de la cuve de coloration. 

Voir la notice de la solution de lavage pour les instructions d’utilisation. 


Les solutions de lavage concentrée et diluée peuvent être conservées à température ambiante ou au réfrigérateur en flacons fermés. Elles sont stables 

jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette du flacon de solution de lavage. 

Éliminer la solution de lavage diluée s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. 

3. EAU PHYSIOLOGIQUE 

Préparation 

Solution de NaCl 0,15 M (9 g/l) dans l’eau distillée ou déminéralisée. 

Utilisation 

Pour le lavage des globules rouges. 


La solution d’eau physiologique peut être conservée à température ambiante ou au réfrigérateur. 

Éliminer la solution après 3 mois ou s’il y a un changement d’aspect ou apparition d’un trouble dû à une contamination microbienne. Pour une 

conservation prolongée, ajouter 1 g/l d’azoture de sodium. 

ÉQUIPEMENT ET ACCESSOIRES NÉCESSAIRES 

1. Système HYDRASYS SEBIA, référence N° 1210 ou N° 1211. 

2. Micropipetteur, manuel ou automatique, tel que HYDRAPLUS SEBIA, référence N° 1215, pour le chargement des applicateurs. 

3. Chambre humide, référence N° 1270, fournie avec le système HYDRASYS. 

4. Bidons plastiques fournis avec le système HYDRASYS. 

5. Pipettes de 10 µl et 200 µl. 

6. Densitomètre / scanner capable de lire un film de 82 x 51 mm ou 82 x 102 mm à 570 nm (filtre jaune) : HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA ou scanner 

équipé du logiciel PHORESIS SEBIA. Se reporter aux instructions de chaque appareil pour son utilisation et sa calibration. 

7. Porte-film pour le traitement des demi-gels SEBIA, référence N° 10043110. 

- 3 -


ÉCHANTILLONS À ANALYSER 

Prélèvement et conservation des échantillons 

L’analyse se fait sur sangs frais, prélevés sur anticoagulant (EDTA, citrate ou héparine). Éviter les anticoagulants contenant de l'iodoacétate. Les 

sangs doivent être prélevés selon la procédure utilisée pour tout test de laboratoire d’analyses cliniques. 

Les sangs peuvent être conservés moins de cinq jours au réfrigérateur (entre 2 et 8 °C). 

Préparation des échantillons (méthode standard) 

• Agiter le tube primaire avant de prélever le volume de sang total à traiter. 

• Centrifuger le sang total, pendant 5 minutes à 5 000 tr/min. 

• Éliminer le plasma. 

• Laver 2 fois les globules rouges par 10 volumes d’eau physiologique. Les volumes de globules rouges inférieurs à 10 µl doivent être manipulés 

avec précaution. 

• Éliminer l’excès d’eau physiologique à la surface du culot globulaire lavé, les agiter au vortex avant de prélever les 10 µL à hémolyser. 

• Hémolyser 10 µl de globules rouges par 130 µl de solution hémolysante. 

• Agiter au vortex pendant 10 secondes puis incuber 5 minutes à température ambiante. 

NOTES : 

- Pour des sujets anémiés, la quantité de globules rouges hémolysés peut-être augmentée : 

- 15 µl pour des sujets moyennement anémiés (environ 0,1 g/ml Hb) ; 

- 20 µl pour des sujets fortement anémiés (moins de 0,07 g/ml Hb) ; 

et 130 µl de solution hémolysante. 

L’intensité des fractions sera augmentée sans modifier la proportion de chaque fraction. 

- Il n’est pas nécessaire de filtrer ni de centrifuger les hémolysats. 

- La solution hémolysante n’affecte pas l’hémoglobine instable Bart. 

Préparation des échantillons pour la détection de l’hémoglobine H 

- Agiter le tube primaire avant de prélever le volume de sang total à traiter. 

- Centrifuger le sang total, pendant 5 minutes à 5 000 tr/min. 

- Éliminer le plasma. 

- Laver 2 fois les globules rouges par 10 volumes d’eau physiologique. Les volumes de globules rouges inférieurs à 10 µl doivent être manipulés 

avec précaution. 

- Éliminer l’excès d’eau physiologique à la surface du culot globulaire lavé, les agiter au vortex avant de prélever les 40 µL à hémolyser. 

- Hémolyser 40 µl de globules rouges par 100 µl de solution hémolysante. 

- Agiter au vortex pendant 10 secondes puis incuber 5 minutes à température ambiante. 

- Centrifuger l’hémolysat pendant 5 minutes à 10 000 tr/min. 

- L’analyse est réalisée sur le surnageant de cet hémolysat avec le programme de migration «7 / 15 Hb». 

TECHNIQUE 

Le système HYDRASYS est un instrument multiparamétrique semi-automatique qui assure le traitement des HYDRAGEL selon les étapes suivantes : 

application des échantillons, migration électrophorétique, séchage, coloration, décoloration et séchage final. 

Les étapes manuelles sont les suivantes : préparation des échantillons et du gel et lancement des séquences automatiques. 

LIRE ATTENTIVEMENT LE MANUEL D’INSTRUCTIONS D’HYDRASYS. 

I. PRÉPARATION DE LA MIGRATION 

1. Mettre HYDRASYS sous tension. 

2. Poser un applicateur à plat sur la paillasse, numérotations (puits) vers le haut (Fig. 1). 

- Déposer 10 µl d’échantillon hémolysé dans chaque puits ; le chargement de l'applicateur ne doit pas excéder 2 minutes. 

- Placer l'applicateur dans la chambre humide, dents vers le haut (en manipulant l’applicateur par la protection en plastique). 

- Laisser diffuser 5 minutes après le dépôt du dernier échantillon. 

Voir la notice de la chambre humide pour les instructions d’utilisation. 

3. Ouvrir le capot du module de migration et relever les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes. 

ATTENTION : Ne pas fermer le capot de l’appareil si les chariots sont relevés ! 

4. Sélectionner le programme de migration «7/15 Hb». 

NOTE : Dans le cas où une meilleure séparation Hb F – Hb S est souhaitée sur gel HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), il est recommandé 

de sélectionner le programme de migration «7/15 Hb F-S». Ce programme est uniquement destiné à une analyse qualitative. 

5. Sortir les mèches tamponnées de leur emballage en les manipulant par les languettes plastiques. 

- Fixer les mèches sur le chariot porte-électrodes à l'aide des languettes perforées. La face de la mèche fixée sur la languette vient en contact 

avec l'électrode (Fig. 2). 

6. Sortir le gel de son emballage. 

- Éliminer rapidement l’excès de liquide en surface, en effleurant le gel avec un papier-filtre fin. 

ATTENTION : Ne surtout pas laisser le papier-filtre en contact prolongé avec le gel pour éviter sa déshydratation. 

- Déposer 120 µl d'eau distillée ou déminéralisée pour HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) ou 200 µl pour HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E), 

sur le plateau de migration dans le tiers inférieur du cadre sérigraphié. 

- Placer le gel (face gel orientée vers le haut) sur le plateau contre la barrette, à l'intérieur du cadre sérigraphié (Fig. 3). 

- Donner une forme concave au gel (Fig. 3) et le dérouler sur le plateau jusqu'au contact de la goutte d'eau qui doit se répartir sur toute la 

largeur du gel. Relever légèrement le gel pour éliminer les bulles d'air éventuellement piégées puis dérouler totalement le gel au contact du 

plateau. La goutte d’eau doit s’étaler sous toute la surface du film. 

7. Abaisser l'ensemble des chariots jusqu'en butée. Dans cette position, les mèches tamponnées ne touchent pas le gel. NE PAS FORCER LA 

DESCENTE DES CHARIOTS. 

- 4 -

8. Sortir l’applicateur de la chambre humide en le manipulant par la protection plastique. 

- Éliminer la protection des dents. 

- Programme de migration «7 / 15 Hb» : Placer l’applicateur en position N° 4 sur le porte-applicateurs. 

- Programme de migration «7 / 15 Hb F-S» : Placer l’applicateur en position N° 3 sur le porte-applicateurs. 

IMPORTANT : Les numérotations de l'applicateur sont toujours dirigées vers l'opérateur (Fig. 4). 

9. Fermer le capot du module de migration. 

10. Démarrer immédiatement la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à gauche du clavier). 

IMPORTANT : Ne rien placer à proximité immédiate de la grille de ventilation (à droite de l'appareil). 


MIGRATION - DESCRIPTION DES SÉQUENCES AUTOMATIQUES 

• Descente des chariots porte-électrodes et porte-applicateurs pour amener les mèches tamponnées et l'applicateur au contact du gel. 

• Remontée du chariot porte-applicateurs. 

• Migration à 340 V constants à 25 °C, température contrôlée par effet Peltier, jusqu’à 65 Vh accumulés (pendant environ 12 minutes, programme 

«7 / 15 Hb») ou jusqu’à 85 Vh accumulés (pendant environ 15 minutes, programme «7 / 15 Hb F-S»). 

• Déconnexion des électrodes par remontée du chariot porte-électrodes. 

• Séchage du film à 50 °C, pendant 15 minutes par montée en température du plateau. 

• Un signal sonore (bip) retentit et la sécurité du capot du module de migration se débloque. Le plateau reste à 50 °C jusqu'à l'ouverture du capot. 

Après ouverture du capot, la température du plateau diminue jusqu’à 25 °C (en moins de 5 minutes). Une nouvelle séquence de migration peut 

alors être lancée. 

NOTE : Pendant toutes les séquences de migration, le capot du module de migration reste verrouillé. 

II. PRÉPARATION DES SÉQUENCES DE TRAITEMENT DU GEL 

1. Ouvrir le capot du module de migration. 

2. Retirer l'applicateur et le jeter. 

3. Relever les chariots porte-applicateurs et porte-électrodes, retirer les mèches par les languettes et les jeter. 

4. Récupérer le film pour le traitement suivant. 

5. Nettoyer très soigneusement les électrodes et le plateau de migration avec un papier ouaté bien imbibé d’eau. 

S’assurer que les électrodes et le plateau soient bien secs pour l’utilisation suivante. 

IMPORTANT : Les électrodes doivent être nettoyées systématiquement après chaque migration. 

6. Placer le film sur le porte-film, face gel vers l'opérateur, en procédant comme suit (Fig. 5): 

- ouvrir le porte-film ; 

- le poser à plat sur la paillasse ; 

- positionner le gel dans les gorges des colonnettes ; 

- refermer le porte-film ; 

- s'assurer que le film soit bien enfoncé dans les gorges des deux colonnettes. 

7. Introduire le porte-film dans le module de traitement/coloration du gel. 

IMPORTANT : Avant de lancer un cycle de coloration, s'assurer que : 

- le flacon de colorant contienne 300 ml de colorant ; 

- le flacon de décolorant contienne 1 litre de décolorant minimum ; 

- le flacon de vidange soit vide. 

Pour le branchement des canaux réactifs : se référer aux instructions affichées sur l’écran de l’appareil (sélectionner la touche : VISU 

CANAUX). 

IMPORTANT : Ne pas oublier d’obturer les canaux non utilisés. 

8. Sélectionner le programme de coloration «PROT./B1-B2/Hb» dans le menu. 

- Démarrer la séquence en appuyant sur «START» (flèche verte à droite du clavier). 

Pendant toutes les séquences de coloration, décoloration et séchage, le système reste verrouillé. 

Après refroidissement de la cuve, un signal sonore (bip) retentit et le système se débloque (la ventilation se maintient jusqu’à la récupération 

du porte-film). 

III. FIN DU TRAITEMENT DU GEL 

1. Sortir le porte-film du compartiment ; ouvrir le porte-film et retirer le gel sec. 

NOTE : Si des taches bleues résiduelles sont observées sur le gel après coloration / décoloration, une étape de lavage supplémentaire avec 

le programme " LAV. ISOENZ/GEL " permet de les éliminer ou de les atténuer fortement (selon leur intensité) avant lecture au densitomètre / 

scanner. 

2. Si nécessaire, nettoyer le dos du gel (support plastique) avec un papier ouaté humide. 

3. Lire au densitomètre / scanner avec un filtre jaune ou à 570 nm : sur les densitomètres HYRYS ou DVSE, positionner la fraction A 2 

sur le 

repère 5 mm du plateau de lecture de façon à placer le zéro sur le point le plus bas entre la fraction anhydrase carbonique et la fraction A 2 

. 

NOTE : Afin d’assurer les résultats les plus exacts et cohérents : 

- Ajuster la longueur de lecture à 30 mm de façon à inclure le profil électrophorétique entier. 

- Positionner les minima de façon à encadrer au plus près la fraction A 2 

. 

Il est recommandé d’analyser les profils électrophorétiques le plus rapidement possible. Les gels conservés à l’obscurité, dans un endroit sec 

et à l’abri de toute source de chaleur peuvent être interprétés qualitativement dans un délai de trois mois. 

RÉSULTATS 

Contrôle Qualité 

Pour chaque série d’analyses, il est recommandé d’inclure un sang de contrôle ou un échantillon de contrôle contenant des hémoglobines A, F, S et C. 

- 5 -


Valeurs 

La lecture à 570 nm par densitométrie permet de définir les concentrations relatives (pourcentages) de chaque fraction. 

Les valeurs normales (moyennes) pour chaque fraction sur gel HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), ont été établies à partir d’une population de 

200 adultes (hommes et femmes), en bonne santé : 

Hémoglobine A ≥ 96,5 % 

Hémoglobine F < 2,0 % (*) 

Hémoglobine A 2 

≤ 3,5 % 

(*) cf Interférences et limites 

Il est recommandé à chaque laboratoire d’établir ses propres valeurs normales. 

Interprétation 

1. Anomalies qualitatives : Hémoglobinopathies 

La plupart sont des anomalies de structure, dues au remplacement par mutation d'un acide aminé par un autre sur l'une ou l'autre chaîne. Les 

conséquences de la mutation varient suivant la position de l'acide aminé muté et de celui qui le remplace, l'intégrité de certaines parties de la molécule 

étant plus particulièrement nécessaire à sa viabilité et à son bon fonctionnement. 

Plus de 200 variants de l'hémoglobine adulte sont actuellement définis et décrits. Les premières hémoglobines anormales étudiées, et les plus 

nombreuses, sont dues à une modification de la charge électrique globale de la molécule, entraînant une détection facile par électrophorèse. 

Quatre hémoglobines anormales principales présentent un intérêt particulier, d'un point de vue anthropologique et médical : S, C, E et D. 

Le kit HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) est destiné à la détection des hémoglobinopathies et des thalassémies. Dès qu’une anomalie est détectée, 

il est conseillé de la confirmer à l’aide de tests complémentaires tels que l’électrophorèse sur gels acides. 

Hémoglobine S 

La plus fréquente, due à une mutation d’un acide glutamique de la chaîne ß (acide aminé acide) par une valine (acide aminé neutre) : la mobilité est 

dans ce cas diminuée. Sur HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), en tampon alcalin, l'hémoglobine S migre en position centrale entre les fractions A 

et A 2 

. 

Hémoglobine C 

La mutation est due à un acide glutamique de la chaîne ß, remplacé par une Iysine (acide aminé basique), la mobilité est dans ce cas très réduite. 

Sur HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), les hémoglobines C et E se trouvent parfaitement superposées à la fraction A 2 

. Quand cette fraction est 

supérieure à 15 %, la présence d’hémoglobines C et E peut alors être suspectée. 

Hémoglobine E 

Un acide glutamique de la chaîne ß est remplacé par une Iysine. Sur HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), cette hémoglobine migre exactement 

comme l'hémoglobine C. En tampon acide [HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)], elle ne se sépare pas des hémoglobines A et A 2 

, ce qui 

permet de la différencier de l’hémoglobine C. 

Hémoglobine D 

Un acide glutamique de la chaîne ß est remplacé par une glutamine. Sur HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), cette hémoglobine migre exactement 

comme l'hémoglobine S. En tampon acide [HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)], elle ne se sépare pas des hémoglobines A et A 2 

, ce qui 

permet de la différencier de l’hémoglobine S. 

2. Anomalies quantitatives : Thalassémies 

Elles constituent un groupe assez hétérogène d'affections génétiques caractérisées par la réduction du taux de synthèse d'une ou de plusieurs 

chaînes de l'hémoglobine. Le mécanisme de cette réduction à l'échelon moléculaire est encore mal connu. 

Il existe différents syndromes thalassémiques : 

Les alpha thalassémies 

Caractérisées par la diminution de synthèse des chaînes α, affectant par conséquent la synthèse des 3 hémoglobines physiologiques. L'excès de 

synthèse des chaînes ß et γ par rapport aux chaînes α provoque la formation de tétramères sans chaîne α : 

• hémoglobine Bart = γ 4, 

• hémoglobine H = ß 4. 

Les bêta thalassémies 

Caractérisées par la diminution de synthèse des chaînes ß. Seule la synthèse de l'hémoglobine A est affectée. 

Les pourcentages des hémoglobines F et A 2 

sont donc augmentés par rapport à l’hémoglobine A. 

3. Profils électrophorétiques 

Migration des 

hémoglobines normales 

A(A 0 

+ A 1 

) A (A 0 

+ A 1 

) 

F 

S - D 

A 2 

A 2 

- C - E 

Migration des hémoglobines 

anormales majeures 

anhydrase 

anhydrase 

point d’application 

A 0 

: fraction non glyquée de l’hémoglobine adulte normale A. 

A 1 

: fraction glyquée de l’hémoglobine adulte normale A. 

Interférences et limites 

• Ne pas utiliser d’échantillon hémolysé. 

• Lorsque la présence d’une hémoglobine anormale, présentant une mobilité électrophorétique différente de celle des variants majeurs de 

l’hémoglobine S, C, D et E, est détectée, il est recommandé d’utiliser d’autres techniques d’identification (par exemple, électrophorèse des chaînes 

de globine) ou de consulter un laboratoire spécialisé. 

• La mesure quantitative de l’hémoglobine F (Hb F) ou de toute autre hémoglobine mineure migrant à proximité des fractions majeures, est 

approximative quand leur concentration représente moins de 2 à 3 % de l’hémoglobine totale. 

- 6 -


• Les échantillons de certains patients ayant une hémoglobine S homozygote et traités à l’Hydrea® (hydroxycarbamide) peuvent présenter une 

hémoglobine F dont la synthèse a été induite par ce traitement. Sur quelques cas observés, cette hémoglobine F induite a une mobilité sur les gels 

HYDRAGEL 7 & 15 HEMOGLOBIN(E) légèrement différente de celle de l’hémoglobine F native. 

• Sur certains échantillons conservés plus de 7 jours, il peut être observé une focalisation de la traînée située derrière la fraction Hb A, cette 

focalisation ne doit pas être confondue avec un variant de l’hémoglobine (tel que les hémoglobines H ou Bart). 

Assistance technique 

Contacter le Service Technique SEBIA en cas de test défectueux. 

Les fiches de données de sécurité des différents réactifs du kit ainsi que les informations relatives à l’élimination des déchets sont disponibles auprès 

du Service Technique SEBIA. 

PERFORMANCES 

Toutes les mesures densitométriques ont été effectuées à l’aide du densitomètre HYRYS SEBIA. De plus, les profils électrophorétiques ont été 

interprétés qualitativement à l’oeil nu. Les résultats suivants obtenus par analyse quantitative (avec le programme de migration «7 / 15 Hb») indiquent 

une très bonne répétabilité et reproductibilité de la technique HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) pour tous les aspects testés, avec un coefficient 

de variation moyen de 2,4 %. Les résultats sont similaires pour la technique HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) avec le programme de migration 

«7 / 15 Hb F-S». 

Reproductibilté intra-essai 

Trois échantillons de sang (un échantillon normal, un échantillon à Hb A 2 

augmentée et un échantillon à Hb C) ont été analysés en répétabilité dans 

la technique HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E), à raison de 15 dépôts par gel, sur des gels d’un même lot. Les profils électrophorétiques ont été 

analysés par densitométrie et le tableau suivant présente les valeurs moyennes (en %), écart-types (ET) et coefficients de variation (CV) obtenus pour 

chaque fraction de l’hémoglobine de ces 3 échantillons. 

NOTE : Quel que soit l’échantillon, aucune discordance n’a été mise en évidence : 

- Échantillon à taux normal en Hb A 2 

: toutes les valeurs sont normales ; 

- Échantillons à taux augmentés en Hb A 2 

et Hb C : toutes les valeurs sont augmentées. 

| FRACTION Hb | MOYENNE (%) | ET | CV (%) | 

Sang normal Hb A 97,6 0,2 0,2 | Hb A 2 

| 2,4 | 0,2 | 7,7 | 

| Sang à Hb A 2 

augmentée Hb A 95,3 0,2 0,2 | Hb A 2 

| 4,7 | 0,2 | 5,0 | 

Sang à Hb C élevée Hb A 57,8 0,4 0,7 | Hb C | 42,2 | 0,4 | 0,9 | 

Reproductibilté inter-essai 

Quinze échantillons de sang ont été analysés sur 10 gels HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) d’un même lot. 

Parmi les échantillons analysés, se trouvaient 9 échantillons avec hémoglobines anormales (Hb S, Hb F ou Hb C) et 5 échantillons avec un taux 

d’Hb A 2 

augmenté. Les valeurs moyennes (en %), écart-types (ET) et coefficients de variation (CV) ont été déterminés pour chaque fraction de 

l’hémoglobine des échantillons. Le tableau suivant présente les limites des valeurs moyennes, ET et CV, ainsi que le CV moyen représentant 

l’ensemble de chaque fraction. 

NOTE : Quel que soit l’échantillon, aucune discordance n’a été mise en évidence : 

- Échantillons à taux normal en Hb A 2 

: toutes les valeurs sont normales ; 

- Échantillons à taux augmentés en Hb A 2 

: toutes les valeurs sont augmentées. 

FRACTION Hb MOYENNE (%) ET CV (%) CV MOYEN (%) Hb A 21,6 – 98,0 0,1 – 0,6 0,1 – 2,4 0,7 Hb F 14,1 – 73,0 0,5 0,7 – 3,4 1,6 Hb C/E 20,0 – 42,4 0,3 0,7 – 1,3 1,0 Hb S/D 8,8 – 83,6 0,2 – 0,6 0,7 – 2,1 1,1 

| Hb A 2 

| 2,0 – 5,4 | 0,1 – 0,2 | 1,3 – 9,9 | 4,8 | 

Exactitude - Détection d’hémoglobines anormales 

Soixante trois échantillons de sang ont été analysés sur gels HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) et sur un autre système en gel d’agarose disponible 

dans le commerce. Ces échantillons, accompagnés de leur diagnostic clinique établi par électrophorèses sur gel alcalin et sur gel acide et/ou par 

HPLC, ont été fournis par un centre hospitalier. 

Les résultats obtenus ont montré une parfaite corrélation entre les deux systèmes avec, pour la détection des hémoglobines anormales, une sensibilité 

de 100 % et une spécificité de 100 % par rapport à la technique de référence, calculées selon la méthode recommandée (Wendling, 1986). 

En effet, toutes les hémoglobines anormales ainsi que les taux normaux d’hémoglobines normales ont été détectés sur gels HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E) en accord avec le second système de comparaison sur gel, les résultats hospitaliers et le diagnostic clinique. Quel que soit 

l’échantillon, aucune discordance entre les techniques n’a été mise en évidence, telle que la présence de faux positifs (détection d’une Hb anormale 

inexistante ou d’une Hb à taux normal détectée à un taux anormal). 

Exactitude - Détermination quantitative d’Hb A 2 

Cinquante et un échantillons de sang présentant des taux normaux ou élevés d’Hb A 2 

ont été analysés en parallèle sur gels HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E) et sur un autre système en gel d’agarose disponible dans le commerce, avec densitométrie des profils électrophorétiques 

obtenus. 

- 7 -


La corrélation entre ces deux techniques sur le taux d’Hb A 2 

a été déterminée à l’aide d’outils statistiques : moyenne et coefficient de régression 

linéaire. Les paramètres de corrélation entre ces 2 systèmes d’analyse (y = HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E)) sont présentés dans le tableau cidessous. 

| Coefficient de Corrélation | Intersection-y | Pente | Limites des valeurs de % | 

| | | | (système SEBIA) | 

| 0,981 | 0,103 | 0,906 | 1,7 - 5,6 | 

Linéarité 

L’analyse d’un mélange de deux échantillons différents a montré que le pourcentage de chaque fraction de l’hémoglobine étudiée est parfaitement 

corrélé à la proportion de chacune des fractions dans ce mélange et que toute variation est détectée de manière linéaire dans la technique 

HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

BIBLIOGRAPHIE 

(1) V.F. Fairbanks, ed. (1980) Hemoglobinopathies and thalassemia: Laboratory methods and case studies. Brian C. Decker, New York. 

(2) F. Galacteros (1986) Thalassémie, drépanocytose et autres hémoglobinopathies. Techniques et Biologie, 3, 174-178. 

(3) T.H.J. Huisman and J.H.P. Jonxis (1977) The hemoglobinopathies: techniques of identification. Marcel Dekker, New York. 

(4) J.S. Krauss, P.A. Drew, M.H. Jonah, M. Trinh, S. Shell, L. Black and C.R. Baisden (1986) Densitometry and microchromatography compared for 

determination of the hemoglobin C and A 2 

proportions in hemoglobin C and hemoglobin SC disease and in hemoglobin C trait. Clin. Chem. 32, 5, 

860-863. 

(5) C. Livingstone (1986) The hemoglobinopathies. Edit. London. 

(6) M. Maier-Redelsberger, R. Girot (1989) Diagnostic biologique des maladies de l’hémoglobine. Feuillets de biologie 170. 

(7) R.G. Schneider (1978) Methods for detection of hemoglobin variants and hemoglobinopathies in the routine clinical laboratory. CRC Crit. Rev. Clin. 

Lab. Sci. 9, 243-271. 

(8) L. Vovan, D. Lara-Russo, A. Orsini (1985) Diagnostic biologique des hémoglobinoses. Ann. Pédiat. 32, 9, 780-789. 

(9) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. 

Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97. 

- 8 -


INTENDED USE 

The HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) and HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) kits are designed for separation of the normal hemoglobins (A and A 2 

) 

and for the detection of the major hemoglobin variants: S or D and C or E, by electrophoresis on alkaline agarose gels (pH 8.5). They are used in 

conjunction with the semi-automated HYDRASYS system. The resulting electrophoregrams are evaluated visually for pattern abnormalities. 

Densitometry can serve as an aid in the interpretation by providing relative concentrations of individual fractions. Electrophoresis on acidic gel, e.g. 

HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E), should follow to confirm the identification of hemoglobin variants, in particular, to diferentiate 

hemoglobins S from D and E from C. 

Each agarose gel is intended to run: 

• 7 samples in the HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) kit, 

• 15 samples in the HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) kit. 

For In Vitro Diagnostic Use. 

PRINCIPLE OF THE TEST 1-8 

Hemoglobin is a complex molecule composed of two pairs of polypeptide chains. Each chain is linked to the heme, a tetrapyrrolic nucleus (porphyrin) 

which chelates an iron atom. The heme part is common to all hemoglobins and their variants. The type of hemoglobin is determined by the protein 

part called globin. Polypeptide chains α, β, δ and γ constitute the normal human hemoglobins: 

• hemoglobin A ..................................... = α 2 β 2 

• hemoglobin A 2 

.................................... = α 2 δ 2 

• fetal hemoglobin F ............................. = α 2 γ 2 

The α-chain is common to these three hemoglobins. 

The hemoglobin spatial structure and other molecular properties (as that of all proteins) depend on the nature and the sequence of the amino acids 

forming the chains. Substitution of amino acids by mutation is responsible for formation of hemoglobin variants which have different surface charge 

and consequently different electrophoretic mobilities, which also depend on the pH and ionic strength of the buffer. 

The resulting qualitative (or structural) abnormalities are called hemoglobinopathies. Decreased synthesis of one of the hemoglobin chains leads to 

quantitative (or regulation) abnormalities, called thalassemias. 

The assay is performed on the hemolyzate from washed red blood cells. The hemoglobins are separated by electrophoresis on alkaline gels and the 

fractions are visualized by staining with amidoblack. The dried gels are ready for interpretation. 

REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED IN THE HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) AND HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) KITS 

ITEMS PN 4106 PN 4126 Agarose Gels (ready to use) 10 gels 10 gels Buffered Strips (ready to use) 10 packs of 2 10 packs of 2 Staining solution diluent (stock solution) 1 vial, 60 mL 1 vial, 60 mL Amidoblack Stain (stock solution) 1 vial, 20 mL 1 vial, 20 mL Hemolysing Solution (ready to use) 1 vial, 20 mL 1 vial, 20 mL Applicators (ready to use) 1 pack of 10 (7 teeth) 1 pack of 10 (15 teeth) 

| Filter Papers | 1 pack of 10 | 1 pack of 10 | 

FOR OPTIMAL RESULTS 

All reagents from the same kit must be always used together and according to the package insert instructions. 

PLEASE READ THE PACKAGE INSERT CAREFULLY. 

1. AGAROSE GELS 

Preparation 

Agarose gels are ready to use. Each gel contains: agarose, 0.8 g/dL ; alkaline buffer pH 8.5 ± 0.1 ; additives, nonhazardous at concentrations used, 

necessary for optimum performance. 

Use 

Support medium for hemoglobin electrophoresis. 

Storage, stability and signs of deterioration 

Store the gels horizontally in the original protective packaging at room temperature (15 to 30 °C) or refrigerated (2 to 8 °C). (The arrow on the front of 

the kit box must be pointing upwards). 

Avoid obvious temperature fluctuations during storage (e.g., do not store close to a window or a heat source). The gels are stable until the expiration 

date indicated on the kit package or the gel package labels. 

DO NOT FREEZE. 

Discard gel when: 

(i) crystals or precipitate form on the gel surface or the gel texture becomes very soft (all these result from freezing the gel), 

(ii) bacterial or mold growth is indicated, 

(iii) abnormal liquid quantity is present in the gel box (as a result of buffer exudation from the gel due to improper storage conditions). 

2. BUFFERED STRIPS 

Preparation 

Buffered sponge strips are ready to use. Each contains: alkaline buffer pH 9.2 ± 0.2 ; additives, nonhazardous at concentrations used, necessary for 

optimum performance. 

- 9 - 

SEBIA INSTRUCTIONS - English

Use 

Buffered strips function as electrophoresis buffer reservoir and ensure contact between the gel and electrodes. 



Store the buffered strips horizontally in the original protective packaging at room temperature or refrigerated. (The arrow on the front of the kit box 

must be pointing upwards). 

They are stable until the expiration date indicated on the kit package or buffered strips package label. 

DO NOT FREEZE. 

Discard buffered strips if the package is opened and the strips dry out. 

3. STAINING SOLUTION DILUENT 

Preparation 

The stock staining solution diluent must be used as described in paragraph " AMIDOBLACK STAIN ". 

It contains an acidic solution. 

Use 

For the preparation of the amidoblack staining solution. 


Store the stock staining solution diluent at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining 

solution diluent vial labels. DO NOT FREEZE. 

Do not add any sodium azide. 

4. AMIDOBLACK STAIN 

Preparation 

The amidoblack concentrated stain is a visquous solution which may gelify. The integrity of the stock staining solution is not altered by the increase in 

viscosity or solidification. 

In all cases, to obtain a perfect reconstitution of the stain, we advise you to respect the following procedure: 

1. Add 15 mL of stain diluent to the concentrated amidoblack vial. 

2. Close carefully the vial. 

3. Shake very vigorously the vial during approximately 5 seconds. 

4. Pour this solution in the container for staining solution processing. 

5. Repeat this step twice, three times if necessary. 

6. Pour the remaining diluent in the container and complete the volume to 300 mL with distilled or deionized water. 

7. Mix contents of stain cubitainer well for 5 to 10 minutes. 

The staining solution is ready to use. 

After dilution, the working staining solution contains: acid solution pH ≈ 2 ; amidoblack, 0.4 g/dL ; ethylene-glycol, 6.7 % ; additives, nonhazardous at 

concentrations used, necessary for optimum performance. 

WARNING: Harmful if swallowed. 

Use 

For staining gels with electrophoretic protein separations. 

IMPORTANT : The staining solution is designed to stain only 10 gels. Change the solution after 10 staining steps. 


Store both stock and working staining solutions at room temperature or refrigerated in closed containers to prevent evaporation. Stock staining solution 

is stable until the expiration date indicated on the kit package or staining vial labels. 

Working staining solution is stable for 1 month. 

Do not store the working staining solution close to a heat source. 

5. HEMOLYSING SOLUTION 

Preparation 

Hemolysing Solution is ready to use. It is a buffer with additives, nonhazardous at the concentration used, necessary for optimum performance. 

Use 

To hemolyze red blood cells. 


Store Hemolysing Solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or Hemolysing Solution 

vial label. 

Discard Hemolysing Solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination. 

6. APPLICATORS 

Use 

Precut, single use applicators for sample application. 


Store the applicators in a dry place at room temperature or refrigerated. 

7. FILTER PAPERS 

Use 

Precut, single use, thin absorbent paper pads for blotting excessive moisture off the gel surface before sample application. 

Storage 

Store the thin filter papers in a dry place at room temperature or refrigerated. 

- 10 -


REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 

1. DESTAINING SOLUTION 

Preparation 

Each vial of stock Destaining Solution (SEBIA, PN 4540, 10 vials, 100 mL each) to be diluted up to 100 liters with distilled or deionized water. It is 

convenient to dilute only 5 mL of the stock solution to 5 liters, the volume of the destaining solution container. After dilution, the working destaining 

solution contains: citric acid, 0.05 g/dL. 

Use 

For destaining, that is removal of excess and background stain from the gels. 

For rinsing of the staining compartment after wash step. 

To neutralize the acidity of the destaining solution, pour 15 mL of a 50 % solution of Sodium Hydroxide, into the empty waste container. 


Store the stock destaining solution at room temperature or refrigerated. It is stable until the expiration date indicated on the kit package or destaining 

solution vial label. Working destaining solution is stable for one week at room temperature in a closed bottle. Do not add any sodium azide. 

Discard working destaining solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination. 

To prevent microbial proliferation in the diluted destaining solution to be stored more than one week, add 5 µl/dL of ProClin 300. 

Working destaining solution added with ProClin is stable in a closed bottle at room temperature or refrigerated until the expiration date indicated on the 

kit package or destaining solution vial labels. 

2. HYDRASYS WASH SOLUTION 

Preparation 

Each vial of the stock HYDRASYS Wash Solution (SEBIA, PN 4541, 10 vials, 80 mL each) to be diluted up to 5 liters with distilled or deionized water. 

After dilution, the working wash solution contains: alkaline buffer pH 8.8 ± 0.3 ; sodium azide. 

WARNING: The stock wash solution contains 0.625 % sodium azide. Do not ingest ! If ingested, consult physician immediately ! Sodium 

azide may lead to formation of explosive or toxic compounds when in contact with acids, lead or copper. Always flush with a large quantity 

of water when disposing. 

Use 

It serves for cleaning of the HYDRASYS Staining Compartment. Use periodically, e.g., if the instrument is used daily, wash the staining compartment weekly. 

See the package insert for directions to use. 


Store the stock and working wash solutions in closed containers at room temperature or refrigerated. They are stable until the expiration date indicated 

on the wash solution vial label. 

Discard working wash solution if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial contamination. 

3. SALINE 

Preparation 

Make 0.15 M (0.9 g/dL) NaCl solution in distilled or deionized water. 

Use 

To wash red blood cells. 


Store saline at room temperature or refrigerated. Discard after 3 months or if it changes its appearance, e.g., becomes cloudy due to microbial 

contamination. For longer storage periods, add sodium azide, 0.1 g/dL. 

EQUIPMENT AND ACCESSORIES REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 

1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 or PN 1211. 

2. Micropipettor, either manual or automated, such as HYDRAPLUS SEBIA, PN 1215, for an alternative way of loading the sample applicators. 

3. Wet Storage Chamber, PN 1270, supplied with HYDRASYS. 

4. Container Kit supplied with HYDRASYS. 

5. Pipettes: 10 µl and 200 µl. 

6. Densitometer / scanner capable of scanning 82 x 51 mm or 82 x 102 mm gel plates at 570 nm or with a yellow filter : HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA 

or PHORESIS software for flat-bed scanner. Refer to manufacturer’s instructions for operation and calibration procedures. 

7. Gel holder for half gels, SEBIA, PN 10043110. 

SAMPLES FOR ANALYSIS 

Sample collection and storage 

Fresh anticoagulated blood samples are recommended for analysis. Common anticoagulants such as those containing EDTA, citrate or heparin are 

acceptable ; avoid those with iodoacetate. Blood must be collected according to established procedures used in clinical laboratory testing. If needed, 

store samples at 2 to 8 °C for up to 5 days. 

Sample preparation (standard procedure) 

• Mix the collection tube before taking the blood to prepare. 

• Centrifuge anticoagulated blood at 5 000 rpm for 5 minutes. 

• Discard the plasma. 

• Wash the red blood cells (RBC) 2 times with 10 volumes of saline ; great care must be taken when processing volumes of red blood cells smaller 

than 10 µl. 

• Discard the excess of saline over the red blood cells pellet and vortex them before taking 10 µL to hemolyze. 

• Hemolyze 10 µl packed red cells with 130 µl Hemolysing Solution. 

• Vortex for 10 seconds and incubate 5 minutes at room temperature. 

- 11 -


NOTES: 

- To prepare hemolysate from subjects, mildly anemic (approximately 10 g/dL Hb) or severely anemic (< 7 g/dL Hb), the volume of packed RBC 

may be increased to 15 µl and 20 µl, respectively. The staining intensity will thus increase but relative concentrations of individual fractions will not 

change. 

- The hemolyzate need not be filtered or centrifuged. 

- The SEBIA’s hemolysing solution does not affect the unstable hemoglobin Bart’s. 

Sample preparation for hemoglobin H detection 

- Mix the collection tube before taking the blood to prepare. 

- Centrifuge anticoagulated blood at 5 000 rpm for 5 minutes. 

- Discard the plasma. 

- Wash the red blood cells 2 times with 10 volumes of saline ; great care must be taken when processing volumes of red blood cells smaller than 

10 µl. 

- Discard the excess of saline over the red blood cells pellet and vortex them before taking 40 µL to hemolyze. 

- Hemolyze 40 µl packed red cells with 100 µl Hemolysing Solution. 

- Vortex for 10 seconds and incubate 5 minutes at room temperature. 

- Centrifuge hemolyzate at 10 000 rpm for 5 minutes. 

- The analysis is performed on the supernatant of this hemolyzate ; then, follow the procedure with «7 / 15 Hb» migration program. 

PROCEDURE 

The HYDRASYS system is a semi-automated multi-parameter instrument. The automated steps include processing of HYDRAGEL agarose gels in 

the following sequence: sample application, electrophoretic migration, drying, staining, destaining and final drying. The manual steps include handling 

samples and gels, and setting up the instrument for operation. 

READ CAREFULLY HYDRASYS INSTRUCTION MANUAL. 

I. MIGRATION SET UP 

1. Switch on HYDRASYS instrument. 

2. Place one applicator on a flat surface with the well numbers in the right-side-up position (Fig. 1). 

- Apply 10 µl hemolyzed sample in each well. Load the applicator within 2 minutes. 

- Place the applicator into the wet storage chamber with the teeth up (handle it by the plastic tooth protection frame). 

- Let the samples diffuse into the teeth for 5 minutes after the last sample application. 

See wet chamber package insert for further details. 

3. Open the lid of the Migration Module and raise the electrode and applicator carriers. 

WARNING: Never close the lid while the carriers are raised ! 

4. Select «7/15 Hb» migration program. 

NOTE: When greater separation between Hb F and Hb S is expected on HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) gels, it is recommended to 

select the «7/15 Hb F-S» migration program. This program is intended only for qualitative analysis. 

5. Remove buffered strips from the package ; handle them by the plastic ends. Engage the punched ends of the strip's plastic backing to the pins 

on the electrode carrier ; the strip's plastic backing must face the carrier (Fig. 2). 

6. Unpack the HYDRAGEL plate. 

- Roll quickly and uniformly one thin filter paper onto the gel surface to absorb the excess of liquid. Remove the paper immediately. 

WARNING: Do not leave the filter paper for a too long contact with the gel to avoid its dehydration. 

- Pool 120 µl distilled or deionized water for HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), or 200 µl for HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E), on the lower 

third of the frame printed on the Temperature Control Plate of the migration module. 

- Place the gel plate (the gel side up) with its edge against the stop at the bottom of the printed frame (Fig. 3). 

- Bend the gel and ease it down onto the water pool (Fig. 3). Ensure that no air bubbles are trapped, water is spread underneath the entire 

gel plate and the gel is lined up with the printed frame. 

7. Lower both carriers down. In this position the buffered strips do not touch the gel. DO NOT FORCE THE CARRIERS ALL THE WAY DOWN. 

8. Remove the applicator from the wet chamber. Handle it by the protection frame. 

- Snap off the applicator teeth's protection frame. 

- «7 / 15 Hb» migration program: Place the applicator into position No 4 on the carrier. 

- «7 / 15 Hb F-S» migration program: Place the applicator into position No 3 on the carrier. 

IMPORTANT: The numbers printed on the applicator must face the operator (Fig. 4). 

9. Close the lid of the migration module. 

10. Start the procedure immediately by pressing the green arrow «START» key on the left side of the keyboard. 

IMPORTANT: Make sure that the ventilation air inlet on the right side of the instrument is not blocked. 

MIGRATION - DESCRIPTION OF THE AUTOMATED STEPS 

• The two carriers are lowered so that buffered strips and applicator contact the gel surface. 

• Sample applicator carrier rises up. 

• Migration is carried out under 340 V constant at 25 °C, controlled by Peltier effect, until 65 Vh have accumulated (for about 12 minutes, «7 / 15 Hb» 

migration program) or until 85 Vh have accumulated (for about 15 minutes, «7 / 15 Hb F-S» migration program). 

• The electrode carrier rises to disconnect the electrodes. 

• The temperature of the control plate rises to 50 °C for 15 minutes to dry the gel. 

• An audible beep signals that the migration module lid unlocks. The plate temperature remains at 50 °C until the lid is opened. Then, the temperature 

keeps decreasing until it reaches 25 °C (in less than 5 minutes) after which a new migration run may start. 

NOTE: The migration module lid remains closed during all migration steps. 

- 12 -


II. GEL PROCESSING SET-UP 

1. Open the lid. 

2. Remove the applicator and discard. 

3. Raise both carriers, remove the buffered strips by their plastic ends and discard. 

4. Remove the dried gel film for further processing. 

5. Wipe very carefully the electrodes and the temperature control plate with a soft tissue well soaked with water. 

Make sure that the electrodes and the plate are well dried before re-use. 

IMPORTANT : The electrodes have to be cleaned systematically after each use. 

6. Open the Gel Holder. Lay it flat and position the dried gel (with gel side facing up) into the grooves of the two rods and close the holder. Make 

sure that the film is correctly positionned inside the holder (Fig. 5). 

7. Place the gel holder into the Gel Processing / Staining Module. 

IMPORTANT: Before starting the gel processing / staining program check the following: 

- the staining container is filled with 300 mL of staining solution ; 

- the destaining container contains at least 1 liter of destaining solution ; 

- the waste container is empty. 

For reagent line connection: refer to the information displayed on the screen of the instrument (select key: REAGENT LINES). 

IMPORTANT: Do not forget to block up the unused lines. 

8. Select «PROT./B1-B2/Hb» staining program from the instrument menu and start the run by pressing the «START» key (green arrow on the 

right side of the keyboard). 

During staining, destaining and drying steps, the compartment remains locked. 

After cooling step, an audible beep signals that the compartment unlocks (the ventilation is maintained until the gel holder is removed). 

III. GEL PROCESSING COMPLETION 

1. Remove the gel holder from the compartment, open it and remove the dried gel. 

NOTE : After gel staining / destaining and before densitometry / scanning, a gel may be put through an additional wash step, if needed, to 

further clarify the gel background and to remove any residual stain that may appear as blue spots. Wash the gel using the " WASH 

ISOENZ/GEL " program. 

2. If needed, clean the back side (the plastic support side) of the dry film with a damp soft paper. 

3. Scan using a densitometer / scanner at 570 nm or with a yellow filter. When using HYRYS or DVSE densitometers, position the A 2 

fraction on 

the 5 mm mark of the scanning plate: the background zero is made between the A 2 

and carbonic anhydrase fractions at the lowest point. 

NOTE: To assure the most accurate and consistent results, do the following: 

- Adjust the scan length to include the entire electrophoretic pattern (≈ 30 mm). 

- Make sure the minima on both sides of A 2 

fraction are positioned at the very feet of the A 2 

peak. 

It is a good practice to read the stained gels without delay. For future reference, they can be stored in a protective cover in a dry, dark place 

away from sources of heat and visually interpreted within at least 3 months. 

RESULTS 

Quality Control 

It is advised to include an assayed control blood or assayed blood sample containing hemoglobins A, F, C and S into each run of samples. 

Values 

Densitometer scanning of stained electrophoregrams yields relative concentrations (percentages) of individual hemoglobin zones. 

Normal values (mean ± 2 SD) on HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) gels have been established from a healthy population of 200 adults (men and 

women): 

Hemoglobin A ≥ 96.5 % 

Hemoglobin F < 2.0 % (*) 

Hemoglobin A 2 

≤ 3.5 % 

(*) see Interference and Limitations 

It is recommended each laboratory establishes its own normal values. 

Interpretation 

1. Qualitative abnormalities: Hemoglobinopathies 

Most hemoglobinopathies are due to substitution by mutation of a single amino acid in one of the four types of polypeptide chains. The clinical 

significance of such a change depends on the type of amino acid and the site involved. In clinically significant disease, either the α-chain or the 

ß-chain is affected. 

More than 200 variants of adult hemoglobin have been described. The first abnormal hemoglobins studied and the most frequently occuring have an 

altered net electric charge, leading to an easy detection by electrophoresis. 

There are four main abnormal hemoglobins which present a particular clinical interest: S, C, E and D. 

The HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) kits are intended for the preliminary identification of hemoglobinopathies and thalassemias. Once an 

abnormal pattern is indicated, its identity should be confirmed by appropriate discriminatory tests (e.g., electrophoresis on acidic agarose gels). 

Hemoglobin S 

Hemoglobin S is the most frequent. It is due to the replacement of one glutamic acid (an acidic amino acid) of the ß-chain by valine (a neutral amino 

acid). Its electrophoretic mobility is therefore slowed down. On alkaline buffered HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), hemoglobin S migrates 

between A and A 2 

fractions. 

Hemoglobin C 

One glutamic acid of the ß-chain is replaced by lysine (a basic amino acid): its mobility is strongly reduced. On HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), 

C, E and A 2 

are superimposed. When this fraction is > 15 %, hemoglobins C and E must be suspected. 

- 13 -


Hemoglobin E 

One glutamic acid of the ß-chain is replaced by lysine: hemoglobin E migrates exactly like hemoglobin C on HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E). 

Unlike hemoglobin C, it does not separate from hemoglobin A in acidic buffer [HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)]. This property allows to 

differentiate E and C. 

Hemoglobin D 

One glutamic acid of the ß-chain is replaced by glutamine. On HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), this hemoglobin migrates exactly like 

hemoglobin S. Unlike hemoglobin S, hemoglobin D does not separate from hemoglobin A in acidic buffer [HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E)] ; this property allows to differenciate S and D. 

2. Quantitative abnormalities: Thalassemias 

Thalassemias constitute a quite heterogeneous group of genetic disorders characterized by decreased synthesis of one type of the polypeptide chains. 

The molecular mechanism of this decrease has not been fully described. 

There are two types of thalassemia syndromes: 

Alpha-thalassemias 

They are characterized by the decrease of synthesis of the α-chains, consequently affecting the synthesis of all normal hemoglobins. 

The excess of synthesis of the ß- and γ-chains in relation to α-chains induces the formation of tetrameres without any α-chain : 

• hemoglobin Bart = γ 4, 

• hemoglobin H = ß 4. 

Beta-thalassemias 

They are characterized by the decrease of synthesis of the ß-chains. Only hemoglobin A synthesis is affected. 

Therefore hemoglobin F and hemoglobin A 2 

percentages are increased with respect to hemoglobin A. 

3. Migration patterns 

Migration of normal 

hemoglobins 

A(A 0 

+ A 1 

) A (A 0 

+ A 1 

) 

F 

S - D 

A 2 

anhydrase 

application point 

A 2 

- C - E 

anhydrase 

Migration of major abnormal 

hemoglobins 

A 0 

: The non-glycated fraction of the normal adult hemoglobin A. 

A 1 

: The glycated fraction of the normal adult hemoglobin A. 

In the above patterns, the cathode is at the bottom the anode at the top. 

Interference and Limitations 

• Do not use hemolyzed blood samples. 

• When an abnormal hemoglobin is detected, which behaves differently than the major hemoglobin variants S, C, D and E, use other means of 

identification (e.g., isoelectric focusing, globin chain electrophoresis), or consult or send sample to a specialized laboratory. 

• The densitometric assay of Hb F (or of any other minor hemoglobin that migrates in the proximity of major fractions) is semi-quantitative as the 

values become inaccurate at below 2 % - 3 % of the total hemoglobin. 

• Some homozygous "S" subjects receive a "Hydrea"® (hydroxyurea) treatment that can induce synthesis of foetal hemoglobin. The mobility of the 

induced hemoglobin F on HYDRAGEL 7 & 15 HEMOGLOBIN(E) has been observed in some cases slightly different from the physiological 

hemoglobin F. 

• On samples stored more than 7 days, the smear located behind the Hb A fraction may become a concentrated fraction, do not interpret this fraction 

as an hemoglobin variant, e.g., H or Bart hemoglobins. 

Troubleshooting 

Call Technical Service of the supplier when the test fails to perform while the instruction for the preparation and storage of materials, and for the 

procedure were carefully followed. 

Kit reagent Safety Data Sheets and informations on waste products elimination are available from the Technical Service of the supplier. 

PERFORMANCE DATA 

All performance data are based on a study that included SEBIA HYDRAGEL materials and instruments and comparable, commercially available 

agarose gel system. In addition, concordance studies were performed where the identity of hemoglobins and their values were established by other 

recognized methodologies. 

All electrophoregrams were interpreted visually. SEBIA’s HYRYS densitometer was used for all densitometric evaluations to complement the visual 

data as appropriate. 

The results of representative examples of the performance studies are presented here. The individual values, means SD and CV are shown below. In 

overall, the results indicate a very good reproducibility for all the tested aspects: 2.4 % being the mean CV value with «7 / 15 Hb» migration program. 

The results where similar with «7 / 15 Hb F-S» migration program. 

Reproducibility Within Run 

Three blood samples were electrophoresed on HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) gels from the same lot. Each sample was run in all the 15 tracks of 

a single gel. The following table shows the means, SD and CV for each individual hemoglobin component in the three samples calculated from the 

densitometric per cent values for each track. In addition, none of the repeats showed false positive or false negative values. 

- 14 -


| COMPONENT | MEAN (%) | SD | CV (%) | 

| Normal blood | 

| Hb A | 97.6 | 0.2 | 0.2 | 

| Hb A 2 

| 2.4 | 0.2 | 7.7 | 

| Elevated Hb A 2 | 

| Hb A | 95.3 | 0.2 | 0.2 | 

| Hb A 2 

| 4.7 | 0.2 | 5.0 | 

| Elevated Hb C | 

| Hb A | 57.8 | 0.4 | 0.7 | 

| Hb C | 42.2 | 0.4 | 0.9 | 

Reproducibility In Between Runs 

Fifteen (15) blood samples were electrophoresed on HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) gels from a single lot. The samples analyzed included nine 

samples with an abnormal hemoglobin (Hb S, Hb F or Hb C) and five samples with elevated Hb A 2 

. The means, SD and CV were calculated from the 

data obtained for each component in each sample. Ranges of the means, SD and CV, and the mean CV representing the pool of individual components 

are tabulated below. In addition, none of the repeats showed false positive or false negative values. 

COMPONENT MEAN (%) SD CV (%) MEAN CV (%) Hb A 21.6 – 98.0 0.1 – 0.6 0.1 – 2.4 0.7 Hb F 14.1 – 73.0 0.5 0.7 – 3.4 1.6 Hb C/E 20.0 – 42.4 0.3 0.7 – 1.3 1.0 Hb S/D 8.8 – 83.6 0.2 – 0.6 0.7 – 2.1 1.1 

| Hb A 2 

| 2.0 – 5.4 | 0.1 – 0.2 | 1.3 – 9.9 | 4.8 | 

Accuracy - Detection of Hemoglobin Abnormalities 

Sixty three (63) different blood samples were analyzed using HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) procedure and another commercially available 

agarose gel system. The blood samples and their diagnostic assessment were provided by a hospital. The diagnosis was based on a routine alkaline 

gel and acid gel electrophoresis and/or HPLC. All abnormal hemoglobins or abnormal levels of normal hemoglobins detected with HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E) procedure were in agreement with the comparative gel system, hospital results and clinical diagnosis. There were no case 

observed of false positive, i.e., detection of an abnormal band or abnormal level of a normal band where no such abnormality existed. 

Accuracy - Quantitative Determination of Hb A 2 

The levels of Hb A 2 

were measured in 51 blood samples with normal and elevated levels of Hb A 2 

both by densitometry of the electrophoretic 

separations obtained on HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) gels. The measured values from both procedures were analyzed by a linear regression 

statistical procedure. The results of linear regression analysis are tabulated below (y = HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E)). 

| Correlation Coefficient | y-Intercept | Slope | Range of % Values | 

| | | | (SEBIA’s system) | 

| 0.981 | 0.103 | 0.906 | 1.7 – 5.6 | 

Linearity 

Two blood samples were mixed within different proportions and the dilutions were electrophoresed on HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) gel. 

The test was determined to be linear within the entire range studied. 

BIBLIOGRAPHY 







860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


- 15 -


ANWENDUNGSBEREICH 

Die Kits HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) und HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) dienen zur Trennung der normalen Hämoglobine (A und A 2 

) und zum 

Nachweis der wichtigsten Hämoglobinvarianten, S oder D und C oder E, mittels Elektrophorese auf Agarosegelen in alkalischem Puffer 

(pH-Wert 8,5). Sie werden auf dem halbautomatischen Elektrophoresegerät HYDRASYS verwendet. Die Elektrophorese erfolgt am Hämolysat 

gewaschener Erythrozyten. Die Hämoglobine werden getrennt und mit Amidoschwarz-Färbelösung gefärbt. Überschüssige Färbelösung wird durch 

eine saure Lösung entfernt. Die sich ergebenden Elektropherogramme auf den getrockneten Gelen können visuell auf Anomalien in den Mustern 

untersucht werden. Die Densitometrie ist ein praktisches Hilfsmittel zur Erleichterung der Interpretation von Elektrophoresemustern sowie zur exakten 

Quantifizierung (%) bestimmter Hämoglobine, wie zum Beispiel Hämoglobin A 2 

, das für die Diagnose von ß-Thalassämie bedeutsam ist. Anschließend 

sollte die Elektrophorese auf sauerem Gel, wie HYDRAGEL 7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E), erfolgen, um die Identifikation der Hämoglobinvarianten 

zu bestätigen, und insbesondere, um zwischen Hb S und Hb D sowie zwischen Hb E und Hb C zu unterscheiden. 

Pro Agarosegel 

• des HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) Kits können 7 Proben, 

• des HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) Kits 15 Proben, 

analysiert werden. 

In-vitro-Diagnostikum. 

TESTPRINZIP 

Hämoglobin ist ein komplexes Molekül, das aus zwei Polypeptidkettenpaaren besteht. Jede Kette ist an ein Häm, einen Tetrapyrrolkern (Porphyrin), 

gebunden, der mit einem Eisenatom eine Chelatbindung eingeht. Der Hämanteil ist bei allen Hämoglobinen und ihren Varianten gleich. Die jeweilige 

Art des Hämoglobins wird durch den Proteinanteil, der als Globin bezeichnet wird, bestimmt. Die Polypeptidketten α, β, δ und γ sind Bestandteil der 

normalen humanen Hämoglobine: 

• Hämoglobin A..................................... = α 2 β 2 

• Hämoglobin A 2 

................................... = α 2 δ 2 

• Fötales Hämoglobin F........................ = α 2 γ 2 

Die α-Kette kommt in allen drei Hämoglobinen vor. 

Die räumliche Struktur des Hämoglobins hängt (wie bei allen Proteinen) vom Aufbau und der Reihenfolge der Aminosäuren ab, aus denen die Ketten 

bestehen. 

Durch mutationsbedingte Substitution von Aminosäuren kommt es zur Bildung der Hämoglobinvarianten, die eine abweichende elektrische Ladung 

und folglich eine unterschiedliche elektrophoretische Mobilität aufweisen, die auch vom pH-Wert und der Ionenstärke des Puffers abhängt. 

Die resultierenden qualitativen (oder strukturellen Anomalien) werden als Hämoglobinopathien bezeichnet. Eine verminderte Synthese einer der 

Hämoglobinketten führt zu quantitativen (oder regulatorischen) Anomalien, die als Thalassämien bezeichnet werden. 

IN DEN KITS HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) UND HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) ENTHALTENE REAGENZIEN UND MATERIALIEN 

BEZEICHNUNG BESTELL-NR. 4106 BESTELL-NR. 4126 Agarosegele (gebrauchsfertig) 10 Gele 10 Gele Pufferstreifen (gebrauchsfertig) 10 Pack zu 2 Stück 10 Pack zu 2 Stück Verdünnungslösung (konzentriert) 1 Fläschchen, 60 ml 1 Fläschchen, 60 ml Amidoschwarz-Färbelösung (konzentriert) 1 Fläschchen, 20 ml 1 Fläschchen, 20 ml Hämolyselösung (gebrauchsfertig) 1 Fläschchen, 20 ml 1 Fläschchen, 20 ml Applikatoren (gebrauchsfertig) 1 Pack zu 10 Stück (7 zähnen) | 1 Pack zu 10 Stück (15 zähnen) Filterpapier | 1 Pack zu 10 Stück | 1 Pack zu 10 Stück | 

FÜR OPTIMALE ERGEBNISSE 

Alle Reagenzien eines Kits müssen immer zusammen, gemäß den Instruktionen der Packungsbeilage benutzt werden. 

BITTE DIE PACKUNGSBEILAGE SORGFÄLTIG LESEN. 

1. AGAROSEGELE 

Vorbereitung 

Agarosegele sind gebrauchsfertig. Jedes Gel enthält: Agarose, 8 g/l ; alkalischen Puffer, pH-Wert 8,5 ± 0,1 ; Additiva zur Optimierung der Leistung, in 

den verwendeten Konzentrationen unschädlich. 

Gebrauch 

Hilfsmedium für die Hämoglobinelektrophorese. 

Lagerung, Stabilität und Anzeichen für Verfall 

Gele waagerecht in der Originalverpackung bei Raumtemperatur (15 bis 30 °C) oder im Kühlschrank (2 bis 8 °C) aufbewahren. Sie bleiben bis zum 

Verfalldatum stabil, das auf der Kit- oder Gelverpackung angegeben ist. (Der Pfeil auf der Vorderseite der Kit-Schachtel muß nach oben zeigen.) Sie 

bleiben bis zum Verfalldatum stabil, das auf der Kit- oder Gelverpackung angegeben ist. NICHT EINFRIEREN. 

Das Gel ist zu verwerfen bei: 

(i) Kristallen oder Niederschlag auf der Geloberfläche oder sehr weicher Gelstruktur (was darauf hindeutet, daß das Gel gefroren war) ; 

(ii) Bakterien- oder Schimmelpilzbildung ; 

(iii) einer ungewöhnlich stark ausgeprägten Flüssigkeitsansammlung in der Gel-Box (was auf einen Austritt von Puffer aus dem Gel aufgrund 

unsachgemäßer Lagerung hindeutet). 

- 16 - 

SEBIA ARBEITSANLEITUNG - Deutsch


2. PUFFERSTREIFEN 

Vorbereitung 

Die als Streifen vorliegenden Pufferschwämme sind gebrauchsfertig. Jeder Pufferstreifen enthält: Puffer, pH-Wert 9,2 ± 0,2 ; Natriumazid ; Additiva zur 

Optimierung der Leistung, in den verwendeten Konzentrationen unschäd-lich. 

Gebrauch 

Die Pufferstreifen fungieren als Elektrophoresepufferreservoir und gewährleisten den Kontakt zwischen dem Gel und den Elektroden. 


Bewahren Sie die Pufferstreifen waagerecht liegend in der Original-Schutzverpackung bei Zimmertemperatur oder gekühlt auf. (Der Pfeil auf der 

Verpackungsschachtel muss nach oben zeigen.) Die Pufferstreifen sind bis zum angegebenen Verfallsdatum auf der Schachtel oder auf dem Etikett 

der Streifen stabil. 

NICHT EINFRIEREN! 

Verwerfen Sie die Pufferstreifen, wenn die Verpackung geöffnet ist und die Streifen ausgetrocknet sind. 

3. VERDÜNNUNGSLÖSUNG 

Vorbereitung 

Die Amidoschwarz-Verdünnungslösung ist wie im Abschnitt “Amidoschwarz-Färbelösung” beschrieben zu verwenden. 

Die Lösung enthält Zitronensäure. 

Gebrauch 

Zum Herstellen der Amidoschwarz-Färbelösung. 


Konzentrierte Verdünnungslösung im Kühlschrank oder bei Raumtemperatur aufbewahren. Die Lösung ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem 

Kit oder auf dem Flaschenetikett) haltbar. NICHT EINFRIEREN! 

Geben Sie kein Natriumazid zu. 

4. AMIDOSCHWARZ FÄRBELÖSUNG 

Vorbereitung 

Das Amidoschwarz Färbekonzentrat ist eine hochviskose Flüssigkeit deren Viskosität sich durch Lagerung verändern kann. Die Qualität des 

Färbekonzentrats wird durch höhere Viskosität nicht beeinträchtigt. 

Bitte beachten Sie die folgende Anleitung zum Herstellen der Färbelösung : 

1. 15 ml der Verdünnungslösung zu dem Amidoschwarz Färbekonzentrat geben. 

2. Die Färbekonzentrat Flasche fest verschließen. 

3. Die Flasche für etwa 5 Sekunden kräftig schütteln. 

4. Den Inhalt der Flasche in den Färbecontainer des HYDRASYS überführen. 

5. Schritt 1 – 4 zwei- bis dreimal wiederholen. 

6. Die restliche Verdünnungslösung in den Färbecontainer überführen und mit destilliertem oder deionisiertem Wasser auf 300 ml Gesamtvolumen 

auffüllen. 

7. Den Inhalt des Färbecontainers 5 – 10 Minuten mischen. 

Im Anschluss daran ist die Färbelösung gebrauchsfertig. 

Nach der Verdünnung enthält die Färbelösung: Zitronensäurelösung pH ≈ 2 ; 0,4 g/dl Amidoschwarz ; 6,7% Ethylenglycol ; zusätzliche Additive zur 

Optimierung (ungiftig in den verwendeten Konzentrationen). 

WARNUNG: Nicht verschlucken! Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen! 

Gebrauch 

Zum Färben der Agarose Gele nach elektrophoretischer Trennung. 

WICHTIG: Die Färbelösung ist für maximal 10 Färbungen konzipiert. Wechseln Sie deshalb die Färbelösung nach 10 Färbungen aus. 


Amidoschwarz- Konzentrat und verdünnte Färbelösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank verschlossen aufbewahren um Flüssigkeitsverlust 

durch Verdunstung zu vermeiden. Das Amidoschwarz-Konzentrat ist bis zum Verfallsdatum (aufgedruckt auf dem Kit oder auf dem Flaschenetikett) 

haltbar. 

Verdünnte Färbelösung ist einen Monat haltbar. 

Die gebrauchsfertige Färbelösung nicht neben einer Wärmequelle aufbewahren. 

5. HÄMOLYSELÖSUNG 

Vorbereitung 

Hämolyselösung ist gebrauchsfertig. Es handelt sich um ein Puffer mit Additiva zur Optimierung der Leistung, die in den verwendeten Konzentrationen 

unschädlich sind. 

Gebrauch 

Zur Hämolyse von roten Blutkörperchen. 


Hämolyselösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum Verfalldatum stabil, das auf der Kit-Verpackung oder auf 

dem Fläschchenetikett der Hämolyselösung angegeben ist. 

Hämolyselösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist. 

6. APPLIKATOREN 

Gebrauch 

Einmalapplikatoren für den Probenauftrag mit Sollbruchstellen. 

Lagerung 

Applikatoren bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank trocken aufbewahren. 

- 17 -

7. FILTERPAPIER 


Gebrauch 

Dünnes, perforiertes Filterpapier zum Einmalgebrauch für das Abblotten überschüssiger Feuchtigkeit von der Geloberfläche vor der Probenapplikation. 

Lagerung 

Dünnes Filterpapier, vor Feuchtigkeit geschützt, bei Zimmertemperatur oder im Kühlschrank lagern. 

ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE REAGENZIEN (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 

1. ENTFÄRBELÖSUNG 

Vorbereitung 

Den Inhalt eines Fläschchens konzentrierte Entfärbelösung (SEBIA, Bestell-Nr. 4540, 10 Fläschchen zu je 100 ml) mit destilliertem oder entionisiertem 

Wasser auf 100 Liter auffüllen. Es empfiehlt sich, nur 5 ml konzentrierte Lösung auf 5 Liter, dem Fassungsvermögen des Behälters für Entfärbelösung, 

aufzufüllen. Verdünnte Entfärbelösung enthält: Zitronensäure, 0,5 g/l. 

Gebrauch 

Zum Entfärben, d.h. Auswaschen von überschüssiger Farbe und zur Entfernung der Gelhintergrundfärbung. 

Zum Spülen der Färbekammer nach dem Waschen. 

Zur Neutralisation der sauren Entfärbelösung können 15 ml einer 50 % Natronlauge (NaOH) in den leeren Abfallbehälter gefüllt werden. 


Konzentrierte Entfärbelösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum Verfalldatum stabil, das auf der Kit- 

Verpackung oder auf dem Fläschchenetikett der Entfärbelösung angegeben ist. Verdünnte Entfärbelösung bleibt bei Raumtemperatur in einem 

verschlossenen Behälter eine Woche stabil. Kein Natriumazid zugeben. 

Verdünnte Entfärbelösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist. 

Um mikrobielles Wachstum in der verdünnten Entfärbelösung zu verhindern, wenn sie länger als 1 Woche aufgehoben wird, sollten 50 µl/l ProClin 300 

zugesetzt werden. 

Die mit ProClin versetzte, gebrauchsfertige Entfärbelösung ist in der verschlossenen Flasche bei Zimmertemperatur oder gekühlt bis zum Verfallsdatum 

stabil, das auf der Verpackung oder auf den Flaschenetiketten angegeben ist. 

2. HYDRASYS WASCHLÖSUNG 

Vorbereitung 

Den Inhalt eines Fläschchens konzentrierte HYDRASYS-Waschlösung (SEBIA, Bestell-Nr. 4541, 10 Fläschchen mit je 80 ml) mit destilliertem oder 

entionisiertem Wasser auf 5 Liter auffüllen. Verdünnte Waschlösung enthält: alkalischen Puffer, pH-Wert 8,8 ± 0,3 ; Natriumazid. 

WARNHINWEIS: Konzentrierte Waschlösung enthält 0,625 % Natriumazid. Nicht einnehmen! Nach dem versehentlichen Einnehmen sofort 

den Arzt aufsuchen! Natriumazid kann bei Kontakt mit Säuren, Blei oder Kupfer zu explosiven bzw. toxischen Verbindungen reagieren. Bei 

der Entsorgung stets mit reichlich Wasser nachspülen. 

Gebrauch 

Zum Reinigen des Färbemoduls des HYDRASYS Systems. Die Reinigung in regelmäßigen Abständen durchführen: Wird das Gerät zum Beispiel 

täglich genutzt, sollte das Färbemodul einmal pro Woche gereinigt werden. 

Hinweise zum Gebrauch finden Sie auf der Packungsbeilage. 


Konzentrierte und verdünnte Waschlösung in geschlossenen Behältern bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Sie bleibt bis zum 

Verfalldatum stabil, das auf dem Fläschchenetikett der Waschlösung angegeben ist. 

Verdünnte Waschlösung verwerfen, wenn sich ihr Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist. 

3. KOCHSALZLÖSUNG 

Vorbereitung 

Mit destilliertem oder entionisiertem Wasser eine 0,15 M (9 g/l) -NaCl-Lösung herstellen. 

Gebrauch 

Zum Waschen der Erythrozyten. 


Kochsalzlösung bei Raumtemperatur oder im Kühlschrank aufbewahren. Die Lösung muß nach 3 Monaten verworfen werden oder wenn sich ihr 

Aussehen verändert hat, z.B. wenn sie infolge mikrobieller Kontamination trübe geworden ist. Bei längerer Lagerung Natriumazid zugeben, 1 g/l. 

ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE AUSSTATTUNG (NICHT IM KIT ENTHALTEN) 

1. HYDRASYS System, SEBIA, Bestell-Nr. 1210 oder Nr. 1211. 

2. Für das Beladen der Applikatoren kann alternativ eine manuelle Mikropipette oder der Pipettierautomat HYDRAPLUS SEBIA, Bestell.-Nr. 1215, 

verwendet werden. 

3. Feuchte Kammer, Bestell-Nr. 1270, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten. 

4. Behälter-Kit, im Lieferumfang des HYDRASYS Systems enthalten. 

5. Pipetten: 10 µl und 200 µl. 

6. Densitometer / Scanner für das Scannen von 82 x 51 mm oder 82 x 102 mm großen Gelen bei einer Wellenlänge von 570 nm oder mit einem 

Gelbfilter : HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA oder PHORESIS Software für Flachbettscanner. Hinweise zur Bedienung und Kalibration entnehmen Sie 

bitte der Bedienungsanleitung des Herstellers. 

7. Gelhalter für halbe SEBIA-Gele, Art. Nr. 10043110. 

- 18 -


PROBEN FÜR DIE ANALYSE 

Für die Analyse werden frische, antikoagulierte Blutproben empfohlen. Es können die gebräuchlichen EDTA-, Citrat- oder Heparin-haltigen 

Antikoagulanzien verwendet werden. Jodazetat-haltige Antikoagulanzien sind dagegen zu vermeiden. Die Blutabnahme nach einem gebräuchlichen 

Verfahren für klinische Labortests durchführen. Falls erforderlich, kann das Blut bis zu 5 Tage bei 2 bis 8 °C gelagert werden. 

Probenvorbereitung 

• Das Probenröhrchen vor der Entnahme der Blutprobe mischen. 

• Das antikoagulierte Blut 5 Minuten bei 5000 U/min zentrifugieren. 

• Das Plasma verwerfen. 

• Die Erythrozyten zweimal mit dem 10fachen Volumen an Kochsalzlösung waschen. Beträgt das zur Verfügung stehende Volumen an Erythrozyten 

weniger als 10 µl, besonders vorsichtig vorgehen. 

• Die überschüssige Salzlösung von den roten Blutkörperchen entfernen. Die Blutzellen mischen und 10 µl für die Hämolyse abnehmen. 

• 10 µl Erythrozytenkonzentrat mit 130 µl Hämolyselösung hämolysieren. 

• Im Rotationsmischer 10 Sekunden mischen, und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 

HINWEISE: 

- Zur Herstellung des Hämolysats von Patienten mit leichter und starker Anämie (0.1 g/ml, bzw. unter 0.07 g/ml Hb), kann das Volumen des RBC 

auf 15 µl bzw. auf 20 µl erhöht werden. Die Intensität des Färbung wird dardurch stäker aber das Verhältnis der Fraktionen bleibt unverändert. 

- Das Hämolysat braucht nicht gefiltert oder zentrifugiert werden. 

- Instabiles Hämoglobin-Bart wird durch die SEBIA Hämolyselösung nicht beeinträchtigt. 

Probenvorbereitung für den Hämoglobin H Nachweis 

- Das Probenröhrchen vor der Entnahme der Blutprobe mischen. 

- Das antikoagulierte Blut 5 Minuten bei 5000 U/min zentrifugieren. 

- Das Plasma verwerfen. 

- Die Erythrozyten zweimal mit dem 10fachen Volumen an Kochsalzlösung waschen. Beträgt das zur Verfügung stehende Volumen an Erythrozyten 

weniger als 10 µl, besonders vorsichtig vorgehen. 

- Die überschüssige Salzlösung von den roten Blutkörperchen entfernen. Die Blutzellen mischen und 40 µl für die Hämolyse abnehmen. 

- 40 µl Erythrozytenkonzentrat mit 100 µl Hämolyselösung hämolysieren. 

- Im Rotationsmischer 10 Sekunden mischen, und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. 

- Die Analyse erfolgt danach mit dem Überstand des Hämolysats und dem Trennprogram «7 / 15 Hb». 

DURCHFÜHRUNG 

Das HYDRASYS System ist ein halbautomatisches Multiparameter-Gerät, das eine automatische Bearbeitung der HYDRAGEL Agarosegele in der 

nachstehenden Reihenfolge durchführt: Probenapplikation, elektrophoretische Migration, Trocknen, Färben, Entfärben und Endtrocknen. Zu den 

manuellen Schritten gehört das Handling der Proben und Gele sowie die Bedienung des Geräts. 

DIE BEDIENUNGSANLEITUNG ZUM HYDRASYS SYSTEM AUFMERKSAM DURCHLESEN. 

I. VORBEREITUNG DER MIGRATION 

1. HYDRASYS einschalten. 

2. Einen Probenapplikator so auf eine ebene Unterlage legen, daß die Nummern (Vertiefungen) nach oben zeigen (siehe Abb. 1). 

- In jede Vertiefung 10 µl hämolysierte Probenflüssigkeit auftragen. Das Füllen des Applikators darf höchstens 2 Minuten dauern. 

- Den Applikator mit den Zähnen nach oben in die feuchte Kammer legen (nur am Schutzrahmen für die Zähne anfassen). 

- Die Proben nach dem Aufbringen der letzten Probe 5 Minuten lang in die Zähne einziehen lassen. 

Weitere Hinweise entnehmen Sie bitte der Packungsbeilage zur feuchten Kammer. 

3. Die Abdeckung des Migrationsmoduls öffnen, und die Elektroden-/Applikatoren-Halter nach oben klappen. 

WARNHINWEIS: Die Abdeckung bei hochgestellten Elektroden-Applikatoren-Haltern nicht schließen! 

4. Im Gerätemenü das Migrationsprogramm «7/15 Hb». 

HINWEIS: Um eine größere Separation zwischen Hb F und Hb S auf den Gelen HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) zu erhalten, wird die 

Verwendung des Trennprogramms «7/15 Hb F-S » empfohlen. Dieses Programm ist nur zum qualitativen Nachweis konzipiert. 

5. Die Pufferstreifen an den Kunststoffenden aus der Packung nehmen. Die Perforation des Plastikfilms in die Stifte des Elektroden-Halters 

einführen. Der Plastikfilm muß dabei zum Applikator-Halter zeigen (siehe Abb. 2). 

6. Das Gel aus der Verpackung nehmen. 

- Ein dünnes Filterpapier schnell und gleichmäßig auf die Oberfläche rollen, um die überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen. Anschließend 

das Filterpapier sofort wieder entfernen. 

WARNUNG: Das Filterpapier nicht zu lange mit dem Gel in Kontakt lassen, um ein Austrocknen des Gels zu vermeiden. 

- Für HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) 120 µl und für HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) 200 µl destilliertes oder entionisiertes Wasser in das 

untere Drittel des Rahmens geben, der auf der Peltier-Platte des Migrationsmoduls aufgedruckt ist. 

- Das Gel (mit dem Gel nach oben) an die untere Kante des aufgedruckten Rahmens anlegen (siehe Abb. 3). 

- Das Gel biegen und auf dem Wasser abrollen (siehe Abb. 3). Darauf achten, daß keine Luftblasen eingeschlossen werden, das Wasser 

unter der gesamten Gelplatte verteilt ist und das Gel am aufgedruckten Rahmen anliegt. 

7. Beide Halter nach unten klappen. In dieser Position dürfen die Pufferstreifen keinen Kontakt mit dem Gel haben. DIE HALTER NICHT MIT 

GEWALT BIS GANZ NACH UNTEN DRÜCKEN. 

8. Den Applikator aus der feuchten Kammer nehmen. Dabei nur am Schutzrahmen anfassen. 

- Den Schutzrahmen für die Zähne entfernen. 

- «7 / 15 Hb» Trennprogramm: Den Applikator an Position 4 auf dem Halter einsetzen. 

- «7 / 15 Hb F-S» Trennprogramm: Den Applikator an Position 3 auf dem Halter einsetzen. 

WICHTIG: Die auf dem Applikator aufgedruckten Ziffern müssen immer zum Bediener zeigen (siehe Abb. 4). 

9. Die Abdeckung des Migrationsmoduls schließen. 

10. Die Migration sofort starten. Dazu die grüne Pfeiltaste «START» auf der linken Seite der Tastatur drücken. 

WICHTIG: Darauf achten, daß die Lüftungsschlitze an der rechten Geräteseite nicht verdeckt sind. 

- 19 -


MIGRATION - BESCHREIBUNG DER AUTOMATISCHEN ABLÄUFE 

• Die beiden Halter werden soweit gesenkt, daß die Pufferstreifen und der Applikator in Kontakt mit der Geloberfläche kommen. 

• Der Probenapplikator-Halter wird angehoben. 

• Die Migration erfolgt unter Anlegen einer Gleichspannung von 340 V Gleichstroms bei einer Temperatur von 25 °C, die durch den Peltier-Effekt 

aufrechterhalten wird, bis 65 Vh erreicht sind (nach etwa 12 Minuten, «7 / 15 Hb» Trennprogramm) bzw. bis 85 Vh erreicht sind (nach etwa 

15 Minuten, «7 / 15 Hb F-S» Trennprogramm). 

• Der Elektroden-Halter wird angehoben und unterbricht dabei den Kontakt der Elektroden. 

• Zum Trocknen des Gels wird die Temperatur der Peltier-Platte für 15 Minuten auf 50 °C erhöht. 

• Ein akustisches Signal ertönt, und die Abdeckung des Migrationsmoduls wird entriegelt. Bis zum Öffnen der Abdeckung wird die Temperatur auf 

50 °C gehalten. Anschließend sinkt die Temperatur (innerhalb von 5 Minuten) auf 25 °C. Nun kann eine weitere Migration durchgeführt werden. 

HINWEIS: Während der Migration bleibt die Abdeckung des Migrationsmoduls arretiert. 

II. VORBEREITUNG DER GELBEARBEITUNG 

1. Die Abdeckung öffnen. 

2. Den Applikator herausnehmen und verwerfen. 

3. Beide Halter nach oben klappen, die Pufferstreifen an den Kunststoffenden herausnehmen und verwerfen. 

4. Die getrocknete Gelfolie für die weitere Bearbeitung herausnehmen. 

5. Die Elektroden und die Peltier-Platte gründlich mit einem feuchten Papiertuch abwischen. 

Sicherstellen, dass die Elektroden und die Peltier-Platte vor dem nächsten Gebrauch trocken sind. 

HINWEIS: Die Elektroden sollten systematisch nach jedem Gebrauch gereinigt werden. 

6. Den Gel-Halter öffnen und flach hinlegen. Das Gel (mit der Gelseite nach oben) in die Ausfräsung des Gel-Halters einsetzen, und den Gel- 

Halter schließen. Darauf achten, daß die Folie im Halter korrekt positioniert ist (siehe Abb. 5). 

7. Den Gel-Halter in das Gelbearbeitungs-/Färbemodul einsetzen. 

WICHTIG: Vor dem Start des Gelbearbeitungs-/Färbeprogramms überprüfen, daß: 

- der Behälter mit der Färbelösung 300 ml enthält ; 

- der Behälter mit der Entfärbelösung mindestens 1 Liter enthält ; 

- der Abfallbehälter leer ist. 

Hinweise zum Anschluß an die Reagenzkanäle werden am Monitor des Gerätes angezeigt (drücken Sie dazu die Taste KANAELE). 

WICHTIG: Nicht vergessen, die nicht benötigten Kanäle zu blockieren. 

8. Im Gerätemenü das Färbeprogramm «PROT./B1-B2/Hb» wählen, und den Vorgang durch Drücken der «START»-Taste (grüner Pfeil auf der 

rechten Seite der Tastatur) starten. 

Während der Färbe-, Entfärbe- und Trocknungsschritte bleibt das Färbemodul verriegelt. 

Nach einer Abkühlphase des Moduls ertönt ein akustisches Signal, und das Färbemodul entriegelt sich (die Luftkühlung erfolgt solange, bis 

der Gel-Halter entnommen wird). 

III. ABSCHLUSS DER GELBEARBEITUNG 

1. Den Gel-Halter aus dem Färbemodul nehmen, die Bügel nach oben klappen und die getrocknete Gelfolie entnehmen. 

ZU BEACHTEN: Nach der Färbung / Entfärbung des Gels und vor der Densitometrie / dem Scannen kann mit dem Gel ein zusätzlicher 

Waschschritt durchgeführt werden, um den Hintergrund des Gels klarer zu machen und überschüssige Farbe, die als blaue Punkte erscheinen 

kann, zu entfernen. Zu diesem Zweck das Gel mit dem Programm " WASC. ISOENZ/GEL " waschen. 

2. Falls erforderlich, die Rückseite der trockenen Folie mit einem weichen, feuchten Papiertuch reinigen. 

3. Das Gel in einem Densitometer / Scanner unter Verwendung eines Gelbfilters bzw. bei einer Wellenlänge von 570 nm scannen. Bei 

Verwendung eines HYRYS oder DVSE Densitometers die A 2 

-Fraktion an die 5-mm-Markierung auf der Leseplatte anlegen: Die Nullzone muß 

an der tiefsten Stelle zwischen der A 2 

-Fraktion und der Carboanhydrase-Fraktion positioniert werden. 

HINWEIS: Zur Ermittlung genauer Ergebnisse in gleichmäßiger Qualität wie folgt vorgehen: 

- Die Leselänge so einstellen, daß das gesamte elektrophoretische Muster erfaßt wird (≈ 30 mm). 

- Darauf achten, daß die Minima beiderseits der A 2 

-Fraktion an der niedrigsten Stelle der Ausläufer des A 2 

-Peaks positioniert werden. 

Es empfiehlt sich, die gefärbten Gele sofort zu lesen. Zu Dokumentationszwecken können sie in einer Schutzhülle trocken sowie vor Licht und 

Wärmequellen geschützt aufbewahrt werden. Unter diesen Bedingungen bleiben sie mindestens drei Monate für die visuelle Auswertung stabil. 

ERGEBNISSE 

Qualitätskontrolle 

Es empfiehlt sich, bei jeder Analysenserie ein getestetes Kontrollblut oder eine getestete Blutprobe mitzuführen, die Hämoglobin A, F, C oder S 

enthalten. 

Werte 

Das Lesen der gefärbten Elektropherogramme mit dem Densitometer bei 570 nm ergibt relative Konzentrationen (Prozentangaben) für die einzelnen 

Fraktionen. 

Mit HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) Gelen wurden bei einer Gruppe von 200 gesunden Erwachsenen (Frauen und Männer) folgende Normalwerte 

(Mittelwert) ermittelt: 

Hämoglobin A ≥ 96,5 % 

Hämoglobin F < 2,0 % (*) 

Hämoglobin A 2 

≤ 3,5 % 

(*) siehe Interferenzen und Einschränkungen 

Jedes Labor sollte eigene Normalwerte ermitteln. 

- 20 -

Interpretation 


1. Qualitative Anomalien: Hämoglobinopathien 

Die meisten Hämoglobinopathien sind auf eine mutationsbedingte Substitution einer einzelnen Aminosäure in einem der vier Polypeptidkettentypen 

zurückzuführen. Die klinische Bedeutung einer solchen Änderung hängt vom Typ der Aminosäure und vom betroffenen Locus ab. Bei klinisch 

signifikanten Erkrankungen ist entweder die α-Kette oder die ß-Kette betroffen. 

Bei reifem Hämoglobin werden mehr als 200 Varianten beschrieben. Die zuerst untersuchten und am häufigsten auftretenden atypischen Hämoglobine 

weisen eine abweichende elektrische Ladung auf, die sich durch Elektrophorese einfach nachweisen läßt. 

Vier wichtige Hämoglobinvarianten sind von besonderem klinischen Interesse: S, C, E und D. 

Mit den Kits HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) können Hämoglobinopathien und Thalassämien vorläufig identifiziert werden. Im Falle anomaler 

Muster sollten zur Bestätigung geeignete Differenzierungstests, wie die Elektrophorese auf sauerem Agarosegel, durchgeführt werden. 

Hämoglobin S 

Hämoglobin S kommt am häufigsten vor. Es wird durch die Substitution einer Glutaminsäure (einer sauren Aminosäure) der ß-Kette durch Valin (einer 

neutralen Aminosäure) hervorgerufen. Es besitzt daher eine verringerte elektrophoretische Mobilität. Auf dem alkalisch gepufferten HYDRAGEL 

7/15 HEMOGLOBIN(E) kommt es zur Migration zwischen der A- und der A 2 

-Fraktion. 

Hämoglobin C 

Eine Glutaminsäure der ß-Kette ist durch Lysin (eine basische Aminosäure) ersetzt. Die elektrophoretische Mobilität ist daher stark verringert. Auf 

HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) kommt es zur Überlagerung von C, E und A 2 

. Macht diese Fraktion mehr als 15 % aus, muß mit dem 

Vorhandensein von Hämoglobin C und E gerechnet werden. 

Hämoglobin E 

Eine Glutaminsäure der ß-Kette ist durch Lysin ersetzt. Auf HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) entspricht die Migration von Hämoglobin E exakt der 

von Hämoglobin C. Im Gegensatz zu Hämoglobin C erfolgt in einem sauren Puffer [HYDRAGEL 7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)] keine Trennung von 

Hämoglobin A. Aufgrund dieser Eigenschaften ist eine Differenzierung zwischen E und C möglich. 

Hämoglobin D 

Eine Glutaminsäure der ß-Kette wurde durch Glutamin ersetzt. Auf HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) entspricht die Migration von Hämoglobin E 

exakt der von Hämoglobin S. Im Gegensatz zu Hämoglobin S erfolgt in einem sauren Puffer [HYDRAGEL 7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)] keine 

Trennung zwischen Hämoglobin D und A. Aufgrund dieser Eigenschaften ist eine Differenzierung zwischen S und D möglich. 

2. Quantitative Anomalien: Thalassämien 

Thalassämien stellen eine verhältnismäßig heterogene Gruppe von genetischen Störungen dar, die durch eine verminderte Synthese eines Typs der 

Polypeptidketten hervorgerufen werden. Der molekulargenetische Mechanismus dieser verminderten Bildung ist noch nicht vollständig geklärt. 

Es gibt zwei Arten des Thalassämie-Syndroms: 

Alpha-Thalassämien 

Alpha-Thalassämien sind durch eine verminderte Synthese der α-Ketten charakterisiert, wovon folglich die Synthese aller normalen Hämoglobine 

betroffen ist. 

Die im Verhältnis zur Synthese der α-Ketten vermehrte Synthese der ß- und γ-Ketten führt zur Bildung von Tetrameren ohne α-Ketten: 

• Hämoglobin Bart = γ 4, 

• Hämoglobin H = ß 4. 

Beta-Thalassämien 

Beta-Thalassämien sind durch eine verminderte Synthese der ß-Ketten charakterisiert. Davon ist nur die Synthese von Hämoglobin A betroffen. 

Im Verhältnis zu Hämoglobin A ist der prozentuale Anteil von Hämoglobin F und Hämoglobin A 2 

daher erhöht. 

3. Migrationsmuster 

Migration bei normalen 

Hämoglobinen 

A(A 0 

+ A 1 

) A (A 0 

+ A 1 

) 

F 

S - D 

A 2 

anhydrase 

Auftragsstelle 

A 2 

- C - E 

anhydrase 

Migration der wichtigsten 

anomalen Hämoglobine 

A 0 

: Nicht glykosylierte Fraktion von normalem adultem Hämoglobin A. 

A 1 

: Glykosylierte Fraktion von normalem adultem Hämoglobin A. 

Interferenzen und Einschränkungen 

• Keine hämolysierten Blutproben verwenden. 

• Wird ein anomales Hämoglobin festgestellt, das sich in seiner Wanderungsgeschwindigkeit von den umfangreicheren Hämoglobinvarianten S, C, D 

und E unterscheidet, sollte die Identifikation mit einer anderen Methode erfolgen (z.B. Globinketten-Elektrophorese) oder ein Speziallabor konsultiert 

bzw. die Proben an ein Speziallabor eingeschickt werden. 

• Beim densitometrischen Assay zum Nachweis von HbF (oder anderen kleineren Hämoglobinvarianten, die nahe der größeren Fraktionen wandern) 

handelt es sich um einen semiquantitativen Test, da die Werte bei einem Anteil von weniger als 2 bis 3 % am Gesamthämoglobin ungenau werden. 

• Einige homozygote „S“ Patienten erhalten eine Behandlung mit Hydrea® (Hydroxyharnstoff), die zur Induktion der Synthese von fetalem 

Hämoglobin führen kann. In einigen Fällen wurde beobachtet, dass die Mobilität des induzierten Hämoglobin F auf HYDRAGEL 7 & 

15 HEMOGLOBIN(E) im Vergleich zu physiologischem Hämoglobin F leicht unterschiedlich ist. 

• Bei längerer Lagerung der Proben (über 7 Tage), kann sich der Hintergrund hinter der Hb A Fraktion als distinkte Fraktion darstellen. Interpretieren 

sie diese Fraktion nicht als Hämoglobin-Variante, z.B. als Hämoglobin H oder Bart. 

Fehlersuche 

Kommt es trotz sachgerechter Lagerung und Vorbereitung der Materialien und Beachtung der Verfahrensbeschreibung zum Versagen des Tests, 

wenden Sie sich bitte an den SEBIA Kundendienst. 

Datensicherheitsblätter sowie Informationen zur Abfallentsorgung sind bei SEBIA GmbH, Fulda zu erfragen. 

- 21 -


LEISTUNGSDATEN 

Alle Leistungstests wurden auf SEBIA HYDRAGEL Material und Geräten, sowie einem weiteren kommerziell erhältlichen Agarose-Gelsystem 

durchgeführt. Zusätzlich wurden Vergleichsstudien mit anderen anerkannten Testsystemen zur Identifikation der Hämoglobinfraktionen durchgeführt. 

Für alle densitometrischen Auswertungen wurde ein SEBIA HYRYS Densitometer verwendet. Zusätzlich wurden alle Elektropherogramme visuell 

ausgewertet. 

Die Ergebnisse repräsentativer Beispiele der Leistungsdaten werden im Folgenden dargestellt. Die individuellen Werte, Mittelwerte, 

Standardabweichung (SD) und Variationskoeffizient (VK) sind dargestellt. Insgesamt zeigen die Ergebnisse eine sehr gute Reproduzierbarkeit für alle 

getesteten Aspekte: Mittlererer VK von 2,4 % mit dem «7 / 15 Hb» Trennprogramm. Mit dem «7 / 15 Hb F-S» Trennprogramm ergaben sich gleiche 

Ergebnisse. 

Intra-Assay-Reproduzierbarkeit 

Drei Blutproben wurden auf HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) Gelen einer Charge in allen 15 Spuren der Gele aufgetrennt. Die folgende Tabelle zeigt 

die Mittelwerte, Standardabweichung (SD) und Variationskoeffizient (VK) für jede individuelle Hämoglobin-Komponente in den drei Proben aus den 

aus der Densitometrie erhaltenen prozentualen Werten der Spuren. Keine der durchgeführten Wiederholungen zeigte falsch positive oder falsch 

negative Werte. 

| KOMPONENTE | MITTELWERT (%) | SD | VK (%) | 

normales Blut Hb A 97,6 0,2 0,2 | Hb A 2 

| 2,4 | 0,2 | 7,7 | 

| erhöhtes Hb A 2 | 

Hb A 95,3 0,2 0,2 | Hb A 2 

| 4,7 | 0,2 | 5,0 | 

| erhöhtes Hb C | 

| Hb A | 57,8 | 0,4 | 0,7 | 

| Hb C | 42,2 | 0,4 | 0,9 | 

Inter-Assay-Reproduzierbarkeit 

Fünfzehn (15) Blutproben wurden auf HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) Gelen einer Charge aufgetrennt. Von den analysierten Proben enthielten 

neun ein abnormales Hämoglobin (Hb S, Hb F oder Hb C) und fünf mit erhöhtem Hb A 2 

. Die Mittelwerte, Standardabweichungen (SD) und 

Variationskoeffizienten (VK) wurden aus den Daten jeder Komponente jeder Probe ermittelt. Die nachfolgend dargestellten Bereiche der Mittelwerte, 

SD und der mittleren VK repräsentieren den Pool der individuellen Komponenten. 

KOMPONENTE MITTELWERT (%) SD VK (%) MITTLERER VK (%) Hb A 21,6 – 98,0 0,1 – 0,6 0,1 – 2,4 0,7 Hb F 14,1 – 73,0 0,5 0,7 – 3,4 1,6 Hb C/E 20,0 – 42,4 0,3 0,7 – 1,3 1,0 Hb S/D 8,8 – 83,6 0,2 – 0,6 0,7 – 2,1 1,1 

| Hb A 2 

| 2,0 – 5,4 | 0,1 – 0,2 | 1,3 – 9,9 | 4,8 | 

Richtigkeit - Nachweis von Hämoglobinanomalien 

Dreiundsechzig (63) verschiedene Blutproben wurden auf HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) Gelen und einem anderen handelsüblichen 

Agarosegelsystem analysiert. Die Blutproben und ihre diagnostische Beurteilung wurden von einem Krankenhaus zur Verfügung gestellt. Die 

Diagnose basierte auf Routine-Elektrophoresen mit einem alkalischen und einem sauren Gel und/oder HPLC. Alle mit HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E) ermittelten atypischen Hämoglobine oder atypischen Konzentrationen der normalen Hämoglobine stimmten mit dem anderen 

Agarosegelsystem, den durch das Krankenhaus ermittelten Ergebnissen und der klinischen Diagnose überein. Es wurde in keinem Fall ein falsch 

positives Ergebnis ermittelt, d.h. eine atypische Bande oder eine atypische Konzentration einer normalen Bande in Proben ohne Anomalie gefunden. 

Richtigkeit - Quantitative Hb A 2 

-Bestimmung 

Die Hb A 2 

-Werte von 51 Blutproben mit normaler und erhöhter Hb A 2 

-Konzentration wurden mittels Densitometrie der auf HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E) Gelen gewonnenen elektrophoretischen Trennungen sowie mit einem HPLC-Verfahren gemessen. Die mit beiden Methoden 

ermittelten Meßwerte wurden anschließend durch ein statistisches Verfahren unter Verwendung der linearen Regression analysiert. Die Ergebnisse 

der linearen Regressionsanalyse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt (y = HYDRAGEL). 

| Korrelationskoeffizient | y-Schnittpunkt | Anstieg | Wertebereich in % | 

| | | | (SEBIA System) | 

| 0,981 | 0,103 | 0,906 | 1,7 – 5,6 | 

Linearität 

Zwei Blutproben wurden in verschiedenen Verhältnissen gemischt und die Gemischen auf einem HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) Gel aufgterennt. 

Der Test zeigte im gesamten gemessenen Bereich Linearität. 

- 22 -


LITERATUR 




(4) J.S. Krauss, P.A. Drew, M.H. Jonah, M. Trinh, S. Shell, L. Black and C.R. Baisden (1986) Densitometry and microchromatography compared for determination 

of the hemoglobin C and A 2 

proportions in hemoglobin C and hemoglobin SC disease and in hemoglobin C trait. Clin. Chem. 32, 5, 860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


- 23 -


GEBRUIKSAANWIJZING 

HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) en HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) zijn agarose-gels ontwikkeld voor de scheiding van normale hemoglobinen 

(A en A 2 

) en voor de detectie van de belangrijkste hemoglobinevarianten: S of D en C of E, door middel van elektroforese. De hemoglobinen worden 

gescheiden in een alkalische bufferoplossing (pH 8,5). Zij worden samen met het HYDRASYS systeem gebruikt. De elektroforese wordt uitgevoerd 

op het hemolysaat van gespoelde rode bloedcellen. De hemoglobinen worden gescheiden en gekleurd met een amidozwart-oplossing. Het teveel aan 

zwarte kleurstof wordt verwijderd met een zuuroplossing. De resulterende elektroforegrammen op gedroogde gels kunnen visueel op afwijkingen 

gecontroleerd worden. Densitometrie is een hulpmiddel bij de interpretatie van elektroforetische patronen en levert een nauwkeurige relatieve 

kwantificatie van de belangrijke hemoglobinen zoals hemoglobine A 2 

bij de diagnose van ß-thalassemie. Elektroforese op zure gel, bijvoorbeeld 

HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E), volgt ter bevestiging van de identificatie van hemoglobinevarianten, in het bijzonder om een 

onderscheid te maken tussen Hb S en Hb D of Hb E en Hb C. 

Iedere agarose-gel is bedoeld voor de analyse van: 

• 7 monsters in de HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) kit, 

• 15 monsters in de HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) kit. 

Voor gebruik bij in vitro diagnostiek. 

PRINCIPE VAN DE TEST 

Hemoglobine is een complex molecule dat is samengesteld uit twee paar polypeptidenketens. Elke keten is verbonden aan het haem, een 

tetrapyrollische kern (porfyrine) die een ijzeratoom cheleert. Het haemdeel komt bij alle hemoglobinen en hun varianten voor. Het type hemoglobine 

wordt vastgesteld op basis van het proteïnedeel globine. Het normale menselijke hemoglobine wordt samengesteld uit de polypeptidenketens α, β, δ 

en γ : 

• hemoglobine A ................................... = α 2 β 2 

• hemoglobine A 2 

.................................. = α 2 δ 2 

• foetaal hemoglobine F ....................... = α 2 γ 2 

Deze drie hemoglobinen hebben de α-keten gemeenschappelijk. 

De ruimtelijke structuur van hemoglobine (zoals bij alle proteïnen) hangt samen met de soort en de volgorde van de aminozuren die de ketens vormen. 

De verbindingen tussen de verschillende aminozuren zijn verantwoordelijk voor de vorm van het molecule, zijn stabiliteit en eigenschappen. De 

hemoglobinevarianten worden bepaald door mutaties van bepaalde aminozuren hetgeen leidt tot modificaties van de oppervlaktespanning en zo tot 

verschillende elektroforetische mobiliteit. 

Er zijn twee soorten hemoglobine-abnormaliteiten: 

• kwalitatieve of structurele abnormaliteiten: hemoglobinopathie, 

• kwantitatieve of reguleringsabnormaliteiten: thalassemie. 

In een elektrisch veld scheiden de hemoglobinen naar lading, de moleculaire afmeting, de ionische sterkte, de buffer pH en de aard van de drager. 

DE HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) KIT EN DE HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) BEVATTEN DE VOLGENDE REAGENTIA 

EN ANDERE MATERIALEN 

BESTANDDELEN PN 4106 PN 4126 Agarose-gels (klaar voor gebruik) 10 gels 10 gels Gebufferde strips (klaar voor gebruik) 10 pakjes van 2 st. 10 pakjes van 2 st. Verdunner voor de kleuroplossing (geconcentreerde oplossing) 1 flesje van 60 ml 1 flesje van 60 ml Amidozwart kleurstof (geconcentreerde oplossing) 1 flesje van 20 ml 1 flesje van 20 ml Hemolyserende oplossing (klaar voor gebruik) 1 flesje, 20 ml 1 flesje, 20 ml Applicators 

| 1 pakje van 10 stuks (7 strips) 1 pakje van 10 stuks (15 strips) Filterpapier | 1 pakje van 10 stuks | 1 pakje van 10 stuks | 

VOOR OPTIMALE RESULTATEN 

Onderdelen uit dezelfde kit dienen altijd samen te worden gebruikt en in overeenstemming met de instructies op de bijsluiter. 

LEES DE GEBRUIKSAANWIJZING ALTIJD ZORGVULDIG DOOR. 

1. AGAROSE-GELS 

Voorbereiding 

De Agarose-gels zijn klaar voor gebruik. Iedere gel bevat: agarose, 8 g/l ; alkalische buffer pH 8,5 ± 0,1 ; additieven, in de gebruikte concentraties niet 

schadelijke toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking. 

Gebruik 

Hulpmedium voor hemoglobine-elektroforese. 

Opslag, stabiliteit en tekenen van verval 

De gels moeten horizontaal worden opgeslagen in de originele beschermende verpakking bij kamertemperatuur (15 tot 30 °C) of gekoeld (2 tot 8 °C). 

De gels zijn stabiel tot de houdbaarheidsdatum die op de verpakking, of op het verpakkingslabel van de gel, staat aangegeven. (De pijl op de voorzijde 

van de verpakking moet naar boven wijzen.) Vermijd opslag dicht bij een raam of een warmtebron. Vermijd belangrijke temperatuurwisselingen tijdens 

de opslag. 

NIET INVRIEZEN. 

Verwijder de gel wanneer: 

(i) 

zich kristallen of neerslag op het oppervlak van de gel vormen, of wanneer de textuur van de oppervlakte van de gel erg zacht wordt (dit geeft 

aan dat de gel bevroren is geweest) ; 

(ii) bacteriële of schimmelgroei wordt waargenomen ; 

(iii) er een abnormale hoeveelheid vloeistof in de gelbox aanwezig is (wijst erop dat afscheiding van buffer uit de gel heeft plaatsgevonden tijdens 

onjuiste opslagomstandigheden). 

- 24 - 

SEBIA INSTRUCTIEBLAD - Nederlands


2. GEBUFFERDE STRIPS 

Voorbereiding 

De sponsige gebufferde strips zijn gebruiksklaar. Elke strip bevat: alkalische buffer pH 9.2 ± 0.2 ; additieven, in de gebruikte concentraties niet 

schadelijke toevoegingen die noodzakelijk zijn voor een optimale werking. 

Gebruik 

Gebufferde strips fungeren als elektroforese buffer reservoir en verzekeren contact tussen gel en elektrodes. 


Bewaar de gebufferde strips horizontaal in de originele beschermende verpakking bij kamertemperatuur of in de koeling. (De pijl aan de voorkant van 

de kitdoos dient omhoog te wijzen.) 

De strips blijven stabiel tot aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of de etiketten van de verpakking van 

de gebufferde strips. NIET INVRIEZEN. 

Gooi de gebufferde strips weg als de verpakking geopend is en de strips uitdrogen. 

3. VERDUNNER VOOR DE KLEUROPLOSSING 

Bereiding 

De voorraad verdunner voor de kleuroplossing moet toegepast worden volgens de beschrijving in de paragraaf "AMIDOZWART KLEUROPLOSSING". 

Het bevat een zure oplossing. 

Toepassing 

Bij de preparatie van de amidozwart kleuroplossing. 


De voorraad verdunner voor de kleuroplossing wordt bewaard bij kamertemperatuur of gekoeld. De verdunner is stabiel tot de houdbaarheidsdatum 

zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op de labels van de flesjes met verdunner voor de kleuroplossing. DIT PRODUCT NIET 

INVRIEZEN! 

Geen natriumazide toevoegen. 

4. AMIDOZWART KLEUROPLOSSING 

Bereiding 

De geconcentreerde amidozwart kleuringoplossing is een viskeuze oplossing die kan geleren. De integriteit van de basisoplossing wordt niet beïnvloed 

door de toename van de viscositeit of de hardwording. 

In alle gevallen adviseren wij u de hieronder beschreven procedure te volgen om de perfecte kleuring te behouden: 

1. Voeg 15 ml verdunningsmiddel aan het flesje met geconcerteerd amidozwart toe. 

2. Sluit het flesje zorgvuldig. 

3. Schut het flesje nu stevig gedurende ongeveer 5 seconden. 

4. Giet de oplossing in de houder van waaruit de kleuroplossing verwerkt wordt. 

5. Herhaal deze stap tweemaal, zo nodig driemaal. 

6. Giet de resterende verdunner in de houder en vul het volume aan tot 300 ml met gedestilleerd of gedeioniseerd water. 

7. Meng de inhoud van de cubitainer stevig gedurende 5 tot 10 minuten. 

De kleuringoplossing is nu gereed voor gebruik. 

Na verdunning bevat de werkzame verdunde kleuroplossing: zuuroplossing pH ≈ 2 ; amidozwart, 0.4 g/dl ; ethyleenglycol, 6.7 % ; additieven, 

ongevaarlijk bij te toegepaste concentraties die nodig zijn voor optimale werking. 

WAARSCHUWING: Schadelijk bij inname. 

Toepassing 

Bij het kleuren van gels tijdens elektroforetische proteïneseparatie. 

BELANGRIJK : De kleuroplossing is ontwikkeld voor het kleuren van een maximum van 10 gels. Na het kleuren van 10 gels dient u de oplossing te 

vervangen. 


Zowel de standaard als de gebruiksoplossingen dienen bij kamertemperatuur of gekoeld bewaard te worden in gesloten containers om verdamping 

te voorkomen. De standaard kleuroplossing is stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals deze is aangegeven op de verpakking van de kit of op het 

label van de flesjes met kleuroplossing. 

De gebruiksoplossing is gedurende 1 maand stabiel. 

De verdunde oplossing kleurstof niet in de buurt van een warmtebron bewaren. 

5. HEMOLYSERENDE OPLOSSING 

Voorbereiding 

De hemolyserende oplossing is gebruiksklaar. Dit is een buffer met toevoegingen, niet schadelijk in de gebruikte concentratie, doch noodzakelijk voor 

een optimale werking. 

Gebruik 

Voor de hemolyse van rode bloedcellen. 


Bewaar de hemolyserende oplossing gekoeld of bij kamertemperatuur. Deze oplossing is stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de 

verpakking of de labels op de flesjes met hemolyserende oplossing. 

Verwijder de hemolyserende oplossing zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld troebeling als gevolg van microbiologische vervuiling. 

6. APPLICATORS 

Gebruik 

Voorgesneden strips, voor eenmalig gebruik, voor het deponeren van het monster op het geloppervlak. 


Bewaar de applicators bij kamertemperatuur of gekoeld op een droge plaats. 

- 25 -

7. FILTERSTRIPS 


Gebruik 

Voorgesneden, absorberende strips, voor eenmalig gebruik, voor het opnemen van overtollige vloeistof van het geloppervlak vóór toepassing of 

overtollig monster van de malplaatspleetjes ná toepassing. 

Opslag 

Bewaar de dunne velletjes filterpapier op een droge plaats bij kamertemperatuur of in de koeling. 

VEREISTE, MAAR NIET BIJGELEVERDE REAGENTIA 

1. ONTKLEURINGSOPLOSSING 

Voorbereiding 

Elk flesje van het ontkleuringsconcentraat (Sebia, PN 4540, 10 flesjes, 100 ml elk) wordt verdund tot 100 liter met gedestilleerd of gedeïoniseerd water. 

Het is praktisch een verdunning van een klein deel van het concentraat aan te maken, bijvoorbeeld 5 ml concentraat te verdunnen tot 5 liter. Na 

verdunning bevat de werkzame ontkleuringsoplossing: citroenzuur, 0,5 g/l. 

Gebruik 

Voor het ontkleuren van gels, d.w.z. het verwijderen van overtollige en achtergrondkleur uit de gels. 

Voor het spoelen van het kleurcompartiment na de wasstap. 

Giet om de zuurgraad van de vlekkenoplosser te neutraliseren 15 ml van een 50 % Sodium Hydroxyde-oplossing in de lege afvalbak. 


De concentraat ontkleuringsoplossing is stabiel bij kamertemperatuur of gekoeld tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de verpakking of 

de labels op de flesjes met ontkleuringsoplossing. De werkzame ontkleuringsoplossing is, in een afgesloten fles en bij kamertemperatuur, gedurende 

1 maand stabiel. Voeg geen natriumazide toe. 

Verwijder de verdunde ontkleuringsoplossing zodra er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld troebeling als gevolg van microbiologische vervuiling. 

Om te voorkomen dat micro-organismen zich kunnen verspreiden in de verdunde ontkleuringsoplossing wanneer deze langer dan een week bewaard 

moet worden, kunt u er 5 µl/dL ProClin 300 aan toevoegen. 

De verdunde, ProClin bevattende ontkleuringsoplossing blijft, indien bewaard in een afgesloten fles bij kamertemperatuur of in de koeling, stabiel tot 

aan de uiterste houdbaarheidsdatum die vermeld staat op de verpakking van de kit of op de etiketten van de flesjes ontkleuringsoplossing. 

2. HYDRASYS WASOPLOSSING 

Voorbereiding 

Ieder flesje geconcentreerde HYDRASYS Wasoplossing (SEBIA, PN 4541, 10 flesjes, 80 ml elk) wordt verdund tot 5 liter met gedestilleerd of 

gedeïoniseerd water. 

Na verdunning bevat de werkzame wasoplossing: alkalische buffer pH 8,8 ± 0,3 ; natriumazide. 

WAARSCHUWING: De geconcentreerde wasoplossing bevat 0,625 % natriumazide. Niet voor inwendig gebruik! Bij abusievelijke inname 

dient onmiddellijk een arts gewaarschuwd te worden! Bij verwijdering contact met zuren, lood of koper vermijden aangezien deze 

explosieve of giftige verbindingen vormen met natriumazide. Altijd met grote hoeveelheden water spoelen. 

Gebruik 

Voor het wassen van het HYDRASYS Kleuringscompartiment. Gebruik deze oplossing periodiek, d.w.z. als het instrument dagelijks gebruikt wordt, 

was het kleuringscompartiment dan wekelijks. 

Voor verdere instructies met betrekking tot het gebruik wordt u verwezen naar de bijsluiter in de verpakking. 


De geconcentreerde oplossing en de werkzame oplossing in gesloten containers bewaren bij kamertemperatuur of gekoeld. De oplossingen blijven 

stabiel tot de houdbaarheidsdatum zoals aangegeven op de verpakking van de kit of de labels op de flesjes met wasoplossing. Ruim de werkzame 

wasoplossing op zodra het van uiterlijk verandert, bijvoorbeeld wanner hÿ troebel wordt als gevolg van microbiologische verontreiniging. 

3. FYSIOLOGISCHE ZOUTOPLOSSING 

Voorbereiding 

Maak een 0,15 M (9 g/l) NaCl oplossing met gedestilleeerd of gedeïoniseerd water. 

Gebruik 

Voor het wassen van rode bloedcellen. 


Bij kamertemperatuur of gekoeld opslaan. Na 3 maanden verwijderen, of wanneer er uiterlijke veranderingen optreden, bijvoorbeeld troebeling als 

gevolg van microbiologische vervuiling. Voor langere perioden van opslag moet natriumazide worden toegevoegd, 1 g/l. 

VEREISTE, MAAR NIET BIJGELEVERDE UITRUSTING EN ACCESSIRES 

1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 of PN 1211. 

2. Micro-pipet, voor handmatig dan wel automatisch gebruik, zoals bijvoorbeeld de HYDRAPLUS SEBIA, PN 1215, als extra keuzemogelijkheid voor 

het vullen van de monsterapplicators. 

3. Natte Opslagkamer, PN 1270, geleverd met HYDRASYS. 

4. Container Kit geleverd met HYDRASYS. 

5. Pipetten: 10 µl en 200 µl. 

6. Densitometer / scanner in staat tot scannen van 82 x 51 mm of 82 x 102 mm gelplaten bij 570 nm of met geel filter: HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA 

of FORESE software voor de scanner met vlakke papier doorvoer (PN 1110). Zie voor gebruiks- en kalibratieprocedures de instructies van de 

fabrikant. 

7. Gelhouder voor halve gels SEBIA, PN 10043110. 

- 26 -


MONSTERS VOOR ANALYSE 

Verzameling en opslag van monsters 

Verse bloedmonsters verdienen de voorkeur bij analyse. Algemene anticoaguleermiddelen waarin EDTA, citraat of heparine voorkomen zijn geschikt: 

vermijd jodiumacetaathoudende anticoaguleermiddelen. Het bloed moet volgens vastgestelde procedures, zoals toegepast bij testen in klinische 

laboratoria, verzameld worden. Indien nodig de monsters bij 2 tot 8 °C opslaan gedurende 5 dagen. 

Voorbereiding van het monster 

• Het primaire buisje schudden voor u de totale hoeveelheid te behandelen bloed afneemt ; 

• Centrifugeer bloed met anticoaguleermiddel gedurende 5 minuten bij 5000 rpm ; 

• Verwijder het plasma ; 

• Spoel de rode bloedcellen 2 maal met 10 volumes fysiologische zoutoplossing ; extra aandacht is vereist bij verwerking van volumes rode 

bloedcellen kleiner dan 10 µl ; 

• Verwijder het surplus aan saline (fysiologische zoutoplossing) over de rode bloedcellen pellet en vortex deze alvorens 10 µL te nemen voor de 

hemolyse. 

• Hemolyse van 10 µl rode bloedcellen met 130 µl hemolyserende oplossing ; 

• Roer om gedurende 10 seconden alvorens bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten te incuberen. 

OPMERKINGEN: 

- Om hemolysaat te prepareren van proefpersonen met lichte anemie (ongeveer 0.1 g/ml Hb) of ernstige anemie (< 0.07 g/ml Hb), kan het volume 

volle RBC respectievelijk worden verhoogd tot 15 µl en 20 µl. De kleuringsintensiteit zal dan sterker worden, maar de relatieve concentraties van 

afzonderlijke fracties zullen geen verandering ondergaan. 

- Het hemolysaat hoeft niet gefilterd of gecentrifugeerd te worden. 

- De hemolyserende oplossing van SEBIA heeft geen invloed op het onstabiele hemoglobine Bart. 

Voorbereiding van het monster voor de detectie van hemoglobine H: 

- Het primaire buisje schudden voor u de totale hoeveelheid te behandelen bloed afneemt ; 

- Centrifugeer bloed met anticoaguleermiddel gedurende 5 minuten bij 5000 rpm ; 

- Verwijder het plasma ; 

- Spoel de rode bloedcellen 2 maal met 10 volumedelen fysiologische zoutoplossing ; zeer omzichtig dient men te werk te gaan bij de verwerking van 

volumedelen met rode bloedcellen kleiner dan 10 µl ; 

- Verwijder het surplus aan saline (fysiologische zoutoplossing) over de rode bloedcellen pellet en vortex deze alvorens 40 µL te nemen voor de 

hemolyse. 

- Hemolyseer 40 µl rode bloedcellen met 100 µl hemolyserende oplossing ; 

- Meng dit gedurende 10 seconden in de vortexmixer, en laat het dan bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten incuberen. 

- De analyse wordt uitgevoerd op het er bovenstaande vloeibare hemolysaat ; hierna volgt u de procedure als beschreven in het migratieprogramma 

van «7 / 15 Hb» . 

PROCEDURE 

Het HYDRASYS systeem is een multiparameter instrument. Tot de geautomatiseerde stappen behoort bewerking van HYDRAGEL agarose-gels in de 

volgende volgorde: applicatie van het monster, elektroforetische migratie, drogen, kleuren, ontkleuren en definitief drogen. Tot de handmatige stappen 

behoren de manipulatie van monsters en gels, en het opstellen van het instrument. 

LEES HET HYDRASYS-INSTRUCTIEHANDBOEK NAUWKEURIG. 

I. MIGRATIE 

1. Schakel het HYDRASYS instrument in. 

2. Plaats een applicator vlak op het tafelblad, met de genummerde applicatieholtes naar boven gericht (Fig. 1). 

- Breng 10 µl gehemolyseerd monster aan in elk gat. Vul elke applicator binnen 2 minuten. 

- Plaats de applicator in de natte opslagkamer, met de strips omhoog. Manipuleer deze aan het plastic beschermframe van de strips. Laat de 

monsters gedurende 5 minuten, na de applicatie van het laatste monster, in de strips trekken. 

3. Open het deksel van de Migratiemodule en til de dragers van de elektroden en de applicators op. 

WAARSCHUWING: Sluit het deksel niet als de dragers nog omhoog staan. 

4. Selecteer het «7/15 Hb» migratieprogramma. 

OPMERKING: Als er een grotere scheiding tussen de Hb F en de Hb S wordt verwacht op HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) gels, dan wordt 

aangeraden om het «7/15 Hb F-S» migratieprogramma te selecteren. Dit programma is uitsluitend bedoeld voor de kwalitatieve analyse. 

5. Neem de gebufferde strips uit de verpakking ; manipuleer deze aan de plastic uiteinden. Verbind de geperforeerde einden van de plastic 

achterzijde van de strips aan de pinnen op de elektrodedrager ; de plastic achterzijde van de strips moet in de richting van de drager 

liggen (Fig. 2). 

6. Pak de HYDRAGEL agarose-gel uit. 

- Rol het dunne filterpapier snel en gelijkmatig uit over het oppervlak van de gel zodat het teveel aan vloeistof geabsorbeerd kan worden. 

Verwijder het filter papier direct. 

WAARSCHUWING : Laat het filterpapier niet te lang in contact met de gel om dehydratatie te voorkomen! 

- Giet 120 µl gedestilleerd of gedeïoniseerd water voor HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) of 200 µl gedestilleerd of gedeïoniseerd water voor 

HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E), op het migratieframe dat afgedrukt is op de temperatuurcontroleplaat van de migratiemodule. 

- Plaats de gelplaat (de gelzijde omhoog) met de rand tegen de begrenzer aan de onderzijde van het afgedrukte frame (Fig. 3). 

- Buig de gel en breng deze naar beneden in het water (Fig. 3). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden ingesloten en dat het water zich 

onder de gehele gelplaat verspreidt (Fig. 3) en tevens dat de gel parallel met het afgedrukte frame ligt. 

7. Breng beide dragers omlaag. In deze positie raken de gebufferde strips de gel niet. FORCEER DE DRAGERS NIET HELEMAAL NAAR BENEDEN. 

8. Haal de applicator uit de natte kamer. Manipuleer deze aan het beschermframe. 

- Klik het beschermframe los van de strips van de applicator(s). 

- «7 / 15 Hb» migratieprogramma: Plaats de applicator in positie Nr. 4 op de drager. 

- «7 / 15 Hb F-S» migratieprogramma: Plaats de applicator in positie Nr. 3 op de drager. 

BELANGRIJK: De nummers die op de applicator zijn geprint moeten door de bediener gelezen kunnen worden (Fig. 4). 

9. Sluit het deksel van de migratiemodule. 

10. Start de procedure ogenblikkelijk door het indrukken van de «START»-knop met groene pijl aan de linkerzijde van het toetsenbord. 

- 27 -

BELANGRIJK: Zorg ervoor dat de ventilatieopening aan de rechterzijde van het instrument niet geblokkeerd is. 

MIGRATIE - BESCHRIJVING VAN DE GEAUTOMATISEERDE STAPPEN 


• De beide dragers worden omlaag gebracht zodat de gebufferde strips en applicator contact hebben met de gel. 

• De drager van de monsterapplicator komt omhoog. 

• Migratie wordt uitgevoerd bij een constant voltage van 340 V en bij 25 °C, gecontroleerd door het Peltier-effect, totdat 65 Vh is geaccumuleerd 

(gedurende ongeveer 12 minuten, «7 / 15 Hb» migratieprogramma) of totdat 85 Vh is geaccumuleerd (gedurende ongeveer 15 minuten, 

«7 / 15 Hb F-S» migratieprogramma). 

• De elektrodedrager komt omhoog zodat de elektroden uitgeschakeld worden. 

• De temperatuur van de controleplaat stijgt tot 50 °C gedurende 15 minuten om de gel te drogen. 

• Een hoorbaar piepsignaal klinkt dat aangeeft dat het deksel van de module ontsloten wordt. De temperatuur blijft 50 °C totdat het deksel geopend 

wordt. De temperatuur blijft dan afnemen tot deze 25 °C bereikt (in minder dan 5 minuten) waarna een nieuwe migratiecyclus kan beginnen. 

OPMERKING: Gedurende alle migratiestappen blijft het deksel van de migratiemodule gesloten. 

II. GELVERWERKING SET-UP 

1. Open het deksel. 

2. Verwijder de monsterapplicator en doe deze weg. 

3. Breng beide dragers omhoog, verwijder de gebufferde strips aan hun plastic einden en doe deze weg. 

4. Neem de gedroogde gelfilm eruit voor verdere bewerking. 

5. Maak de elektroden en de temperatuurcontroleplaat voorzichtig schoon met een zacht tissue dat volledig doordrenkt is met water. 

Zorg er voor dat de elektroden en de plaat voor gebruik helemaal droog zijn. 

BELANGRIJK: De elektroden dienen systematisch na elk gebruik gereinigd te worden! 

6. Open de gelhouder. Leg deze plat en plaats de gedroogde gel (met de gelkant naar boven gericht) in de spleten van de beide stangen en sluit 

de houder. Zorg ervoor dat de film op de juiste wijze in de houder geplaatst is (Fig. 5). 

7. Plaats de gelhouder in de Gel Processing / Staining Module. 

BELANGRIJK: Alvorens te beginnen met het gelverwerkings-/ kleuringsprogramma moet het volgende gecontroleerd worden: 

- de kleuringscontainer is gevuld met 300 ml kleuringsoplossing ; 

- de ontkleuringscontainer bevat ten minste 1 liter ontkleuringsoplossing ; 

- de afvalcontainer is leeg. 

Voor de aansluiting van reagent lines: u wordt verwezen naar de informatie op het scherm op het instrument (keuzetoets: REAGENT LINES). 

BELANGRIJK: Vergeet niet de ongebruikte lijnen te blokkeren. 

8. Selecteer «PROT./B1-B2/Hb» kleuringsprogramma in het menu op het instrument. Begin de procedure met het indrukken van de «START»- 

knop (groene pijl op de rechterzijde van het toetsenbord). 

Gedurende de kleur-, ontkleuren droogstappen blijft het compartiment gesloten. 

Na de koelstap geeft een audiosignaal aan dat het compartiment ontsloten wordt (de ventilatie wordt doorgezet totdat de gelhouder 

verwijderd is). 

III. AFRONDING VAN DE GELVERWERKING 

1. Verwijder de gelhouder uit het compartiment ; open de clips en verwijder de gedroogde gel. 

LET OP: Na het kleuren of ontkleuren van gels en voorafgaand aan densitometrie of scannen, kunt u een extra spoelfase van de gel 

toevoegen om de achtergrond nog duidelijker te maken en eventueel resterende kleurstof in de vorm van blauwe vlekjes, te verwijderen. Spoel 

de gel met behulp van het ‘WASH ISOENZ/GEL’-programma. 

2. Indien nodig wordt de achterzijde (de zijde van de plastic steun) van de droge film met een vochtig doekje schooongemaakt. 

3. Scan de droge gel met een densitometer / scanner met een geel filter of bij 570 nm. Bij toepassing van HYRYS of DVSE densitometers plaatst 

de A 2 

fractie op de 5-mm markering van de scanning-plaat: de nul wordt vastgesteld tussen de A 2 

en de koolstofanhydrasefracties bij het 

laagste punt. 

OPMERKING: Om zeker te zijn van het meest nauwkeurige en consistente resultaat het volgende: 

- Stel de scan-lengte af zodat het gehele elektroforetische patroon bestreken wordt (≈ 30 mm). 

- Zorg ervoor dat de minima aan beide zijden van de A 2 

fractie gepositioneerd zijn, direct onder aan de A 2 

piek. 

Het is verstandig de gekleurde gels direct te 'lezen'. Voor later gebruik kunnen de gels in een beschermende container, droog en donker en 

niet in de buurt van een warmtebron, gedurende 3 maanden opgeslagen worden. 

RESULTATEN 

Kwaliteitscontrole 

Het wordt aanbevolen een gekeurd controlebloedserum of een gekeurd bloedmonster dat de hemoglobinen A, F, C en S bevat, te gebruiken bij elke 

serie monsters. 

Waarden 

Scannen van gekleurde elektroforegrammen levert de relatieve concentraties (percentages) van de afzonderlijke hemoglobinezones op. 

Normale waarden (gemiddeld) op HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) gels zijn vastgesteld op basis van een gezonde populatie van 200 volwassenen 

(mannen en vrouwen): 

Hemoglobine A ≥ 96,5 % 

Hemoglobine F < 2,0 % (*) 

Hemoglobine A 2 

≤ 3,5 % 

(*) zie Interferentie en Begrenzingen 

Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium zijn eigen normale bereik vaststelt. 

- 28 -


Interpretatie 

1. Kwantitatieve abnormaliteiten: hemoglobinopathieën 

De meeste hemoglobinopathieën worden veroorzaakt door substitutie door mutatie van een enkel aminozuur in een van de vier typen 

polypeptidenketens. De klinische betekenis van dergelijke veranderingen hangt af van het type aminozuur en de betrokken locatie. Bij een klinisch 

belangrijke ziekte wordt of de α- of de ß-keten aangetast. 

Er zijn inmiddels meer dan 200 varianten van (volwassenen)hemoglobine beschreven. De eerste abnormale hemoglobinen die werden bestudeerd en 

die het meest frequent voorkomen, hebben een gewijzigde elektrische lading hetgeen detectie door middel van elektroforese eenvoudig maakt. 

De vier belangrijkste abnormale hemoglobinen die een bepaald klinisch belang vertegenwoordigen zijn: S, C, E en D. 

De HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) kits zijn bedoeld voor de voorlopige identificatie van hemoglobinopathieën en thalassemieën. Als eenmaal 

een afwijkend patroon is aangetoond, dan wordt de identiteit hiervan bevestigd door middel van de geschikte tests ter onderscheiding zoals 

elektroforese op zure agarose-gels. 

Hemoglobine S 

Hemoglobine S is het meest frequent. Het komt voort uit de vervanging van een glutaminezuur (een zuur aminozuur) van de ß-keten door valine (een 

neutraal aminozuur). Zijn elektroforetische mobiliteit wordt hierdoor geringer. Op een alkalisch gebufferde HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) 

migreert hemoglobine S tussen de A en A 2 

fracties. 

Hemoglobine C 

Een glutaminezuur van de ß-keten wordt vervangen door lysine (een basisch aminozuur): de mobiliteit hiervan wordt sterk verminderd. Op een 

HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) vallen C en A 2 

samen. Als deze fractie > 15 % is dan kunnen de hemoglobinen C en E verwacht worden. 

Hemoglobine E 

Een glutaminezuur van de ß-keten wordt vervangen door lysine (een basisch aminozuur): hemoglobine E migreert op exact dezelfde wijze als 

hemoglobine C op een HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E). Het scheidt niet van hemoglobine A in een zure buffer [HYDRAGEL 7/15 ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E)]. Deze eigenschap maakt onderscheid van E en C mogelijk. 

Hemoglobine D 

Een glutaminezuur van de ß-keten wordt vervangen door glutamine. Dit hemoglobine migreert op exact dezelfde wijze als hemoglobine S op een 

HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E). Het hemoglobine D scheidt niet van hemoglobine A in een zure buffer [HYDRAGEL 7/15 ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E)]. Deze eigenschap maakt onderscheid van S en D mogelijk. 

2. Kwantitatieve abnormaliteiten: thalassemie 

Thalassemie omvat een nogal heterogene groep genetische afwijkingen die gekarakteriseerd worden door een afgenomen synthese van een type van 

de polypeptidenketens. Het moleculaire mechanisme achter deze afname is nog niet geheel beschreven. 

Er zijn twee typen thalassemiesyndroom bekend: 

Alfa-thalassemie 

Deze worden gekarakteriseerd door een afname van de synthese van de α-ketens, hetgeen vervolgens de synthese van de 3 fysiologische 

hemoglobinen beïnuloedt. Het exces aan synthese van ß- en γ-ketens ten opzichte van α-ketens zorgt voor de vorming van tetrameren zonder α-keten. 

• hemoglobine Bart = γ 4, 

• hemoglobine H = ß 4. 

Beta-thalassemie 

Deze worden gekarakteriseerd door de afname van de synthese van de ß-ketens. Alleen de synthese van hemoglobine A wordt beïnvloed. Daarom 

zijn de percentages hemoglobine F en hemoglobine A 2 

hoger ten opzichte van hemoglobine A. 

3. Migratiepatronen 

Migratie van normale 

hemoglobinen 

A(A 0 

+ A 1 

) A (A 0 

+ A 1 

) 

F 

S - D 

A 2 

anhydrase 

applicatiepunt 

A 2 

- C - E 

anhydrase 

Migratie van belangrijke 

afwijkende hemoglobinen 

A 0 

: De niet-geglyceerde fractie van het normaal volwassenen hemoglobine A. 

A 1 

: De geglyceerde fractie van het normaal volwassenen hemoglobine A. 

Interferentie en begrenzingen 

• Gebruik geen gehemolyseerde bloedmonsters. 

• Als er een afwijkende hemoglobine wordt gedetecteerd, die zich anders gedraagt dan de belangrijke hemoglobinevarianten S, C, D en E, gebruik 

dan andere identificatiemiddelen (bijvoorbeeld, globineketen-elektroforese), of consulteer, of zend een monster naar, een gespecialiseerd 

laboratorium. 

• De densitometrische bepaling van Hb F (of enig ander minder belangrijk hemoglobine dat in de nabijheid van de belangrijke fracties migreert) is 

semi-kwantitatief omdat de waarden onnauwkeurig worden onder de 2 % - 3 % van het totale hemoglobine. 

• De monsters van bepaalde patiënten met een homozygote hemoglobine S, die behandeld zijn met Hydrea® (hydroxycarbamide) kunnen een 

hemoglobine F vertonen die door deze behandeling is gesynthetiseerd. Bij enkele gevallen heeft men kunnen waarnemen dat deze geïnduceerde 

hemoglobine F een mobiliteit heeft op de HYDRAGEL 7 & 15 HEMOGLOBIN(E)-gels die licht verschilt van die van de natuurlijke hemoglobine F. 

• Soms, wanneer monsters langer dan zeven dagen bewaard worden, kan er een geconcentreerde fractie worden waargenomen door de vlek die 

zich achter de Hb A-fractie bevindt. Deze fractie mag niet worden verward met een hemoglobinevariant, zoals bijvoorbeeld hemoglobine H of Bart. 

Troubleshooting 

Bel de technische dienst van de leverancier als de test mislukt terwijl u de instructies voor voorbereiding en opslag van materialen, en voor de 

procedure, nauwkeurig hebt gevolgd. 

De veiligheidsbladen behorend bij de reagentia in de Kit als ook informatie over de verwerking van afval of restproducten kunt u verkrijgen bij de 

Technische Dienst van de leverancier. 

- 29 -


UITVOERINGSGEGEVENS 

Alle uitslaggegevens zijn gebaseerd op een studie waarbij de HYDRAGEL materialen en instrumenten van SEBIA en een ander, vergelijkbaar, op de 

markt verkrijgbaar agarose gelsysteem werd toegepast. In aanvulling hierop werden concordantiestudies uitgevoerd waarbij de identiteit van de 

hemoglobinen en hun waarden werden vastgesteld met behulp van andere, geaccepteerde, methoden. De resultaten van representatieve voorbeelden 

van de studies worden hier gepresenteerd. 

Alle electroforegrammen zijn visueel geïnterpreteerd. SEBIA’s HYRYS densitometer werd bij alle densitometrische evaluaties toegepast om waar 

nodig de visuele informatie aan te vullen. 

De resultaten van representatieve voorbeelden van de studies worden hier gepresenteerd. De afzonderlijke waarden, gemiddelde SD en CV worden 

hieronder weergegeven. Over het algemeen zijn de resultaten een indicatie voor een uitstekende reproduceerbaarheid voor alle geteste aspecten: 

2,4 % is de gemiddelde CV-waarde in het «7 / 15 Hb» migratieprogramma. De resultaten voor het «7 / 15 Hb F-S» migratieprogramma zijn 

vergelijkbaar. 

Reproduceerbaarheid binnen een serie 

Er werd elektroforese uitgevoerd op drie bloedmonsters, op een enkele partij gels gebruikmakend van de HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) gels. Elk 

van de monsters werd getest in alle 15 tracks van een enkele gel. De onderstaande tabel toont de gemiddelden, SD en CV voor ieder afzonderlijk 

hemoglobinecomponent in de drie monsters, berekend aan de hand van de densitometrische percentage waarden voor ieder track. Verder zijn bij 

geen van de herhalingen valse negatieve of valse positieve waarden geconstateerd. 

| COMPONENT | GEMIDDELDE (%) | SD | CV (%) | 

Normaal bloed | Hb A 97.6 0.2 0.2 | 

| Hb A 2 

| 2.4 | 0.2 | 7,7 | 

Verhoogd Hb A 2 | Hb A 95.3 0.2 0.2 | 

| Hb A 2 

| 4.7 | 0.2 | 5.0 | 

Verhoogd Hb C Hb A 57.8 0.4 0.7 | Hb C | 42.2 | 0.4 | 0.9 | 

Reproduceerbaarheid tussen series 

Er werd elektroforese uitgevoerd op vijftien (15) bloedmonsters, gebruikmakend van de HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) gels uit een enkele partij. 

Onder de geanalyseerde monsters bevonden zich negen (9) monsters met een afwijkend hemoglobine (Hb S, Hb F of Hb C) en vijf (5) monsters met 

een verhoogd Hb A 2 

. De gemiddelden, SD en CV werden berekend aan de hand van de gegevens die verkregen waren voor iedere component in elk 

monster. De spreiding van de gemiddelden, SD en CV, en de gemiddelde CV die de verzamelde afzonderlijke componenten vertegenwoordigt, zijn in 

onderstaande tabel weergegeven. Verder zijn bij geen van de herhalingen valse negatieve of valse positieve waarden geconstateerd. 

COMPONENT GEMIDDELDE (%) SD CV (%) GEMIDDELDE CV (%) Hb A 21.6 – 98.0 0.1 – 0.6 0.1 – 2.4 0.7 Hb F 14.1 – 73.0 0.5 0.7 – 3.4 1.6 Hb C/E 20.0 – 42.4 0.3 0.7 – 1.3 1.0 Hb S/D 8.8 – 83.6 0.2 – 0.6 0.7 – 2.1 1.1 

| Hb A 2 

| 2.0 – 5.4 | 0.1 – 0.2 | 1.3 – 9.9 | 4.8 | 

Nauwkeurigheid - detectie van hemoglobineafwijkingen 

Drieënzestig (63) verschillende bloedmonsters werden geanalyseerd met behulp van de HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) procedure en een ander 

op de markt verkrijgbaar agarose gelsysteem. De bloedmonsters en hun diagnostische beoordeling werden geleverd door een ziekenhuis. De 

diagnose was gebaseerd op een routine alkalische gel en zure gel elektroforese en/of HPLC. Alle afwijkende hemoglobinen of afwijkende niveaus van 

normale hemoglobinen die met de HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) procedure werden gedetecteerd, kwamen overeen met het vergelijkende 

gelsysteem, de ziekenhuisresultaten en de klinische diagnose. Er werden geen gevallen aangetroffen van incorrecte positieven, d.w.z. detectie van 

een afwijkende band of een afwijkend niveau van een normale band waar een dergelijke afwijking niet bestond in de realiteit. 

Nauwkeurigheid - kwantitatieve determinering van Hb A 2 

De Hb A 2 

niveaus werden gemeten bij 51 bloedmonsters met normale en verhoogde Hb A 2 

niveaus door middel van densitometrie van de 

elektroforetische scheidingen verkregen met de HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) gels. De gemeten waarden uit de procedure werden geanalyseerd 

met een statistische lineaire regressie procedure.De resultaten van de lineaire regressie analyse worden in onderstaande tabel weergegeven 

(y = HYDRAGEL). 

| Correlatie | y-Intercept | Helling | Spreiding van % waarden | 

| coëfficiënt | | | (SEBIA-systeem) | 

| 0.981 | 0.103 | 0.906 | 1.7 – 5.6 | 

Lineariteit 

Twee bloedmonsters werden gemengd in verschillende verhoudingen en de verdunningen ondergingen elektroforese op HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E) gels. 

Het werd vastgesteld dat de resultaten van de test lineair waren over het gehele bereik dat werd onderzocht. 

- 30 -


BIBLIOGRAFIE 







860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


- 31 -


UTILIZZO 

I kits HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) e HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) sono stati progettati per la separazione delle emoglobine normali (A e A 2 

) 

e per la rivelazione delle maggiori varianti della emoglobina: S o D e C o E, mediante elettroforesi su gel di agarosio tamponato in mezzo alcalino 

(pH 8.5). I kits sono usati in combinazione con il sistema semi-automatico HYDRASYS. L’elettroforesi è eseguita con emolisato di globuli rossi lavati. 

Le emoglobine separate sono colorate con una soluzione di amidoschwarz. L’eccesso di colorante viene rimosso con una soluzione acida. 

L’elettroforegramma risultante su gel essiccato può essere interpretato visivamente per la valutazione dei quadri anormali. La densitometria trova 

applicazione pratica nell’aiuto all’interpretazione dei quadri elettroforetici o per ottenere una accurata quantificazione relativa delle emoglobine di 

interesse, come l’emoglobina A 2 

, per la diagnosi delle ß-talassemie. Per confermare l’identificazione delle emoglobine varianti, in particolare per 

differenziare Hb S da Hb D e Hb E da Hb C, deve essere eseguita l’elettroforesi su gel acido, per esempio HYDRAGEL 7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E). 

Ogni gel di agarosio permette di processare: 

• 7 campioni con il kit HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), 

• 15 campioni con il kit HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

Per uso diagnostico in vitro. 

PRINCIPIO DEL METODO 

L’emoglobina è una molecola complessa composta da due coppie di catene polipeptidiche, con ogni catena collegata all’eme, un nucleo tetrapirrolico 

(porfirina) chelato ad un atomo di ferro. L’eme è comune a tutte le emoglobine e alle loro varianti. Il tipo di emoglobina e’ determinato dalla parte 

proteica chiamata globina. Le catene polipeptidiche α, β, δ e γ costituiscono le emoglobine umane normali: 

• emoglobina A ..................................... = α 2 β 2 

• emoglobina A 2 

.................................... = α 2 δ 2 

• emoglobina fetale F ........................... = α 2 γ 2 

La catena α è comune a queste tre emoglobine. 

La struttura spaziale e le altre proprietà molecolari dell’emoglobina (come quelle di tutte le proteine), dipendono dalla natura e dalla sequenza degli 

aminoacidi che formano le catene. La sostituzione, per mutazione, di un aminoacido è responsabile della formazione di emoglobine varianti che hanno 

differenti cariche superficiali e quindi diversa mobilità elettroforetica, in funzione anche del pH e della forza ionica del tampone. 

Le risultanti anomalie qualitative (o strutturali) sono chiamate emoglobinopatie. La diminuzione di sintesi di una delle catene emoglobiniche, comporta 

anormalità di tipo quantitativo (o di regolazione), denominate talassemie. 

REAGENTI E MATERIALI FORNITI NEI KITS HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) E HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) 

COMPONENTI PN 4106 PN 4126 Gels di Agarosio (pronti all’uso) 10 gels 10 gels Strisce tamponate (pronte all’uso) 10 confezioni da 2 10 confezioni da 2 Diluente per la soluzione colorante (soluzione concentrata) 1 flacone da 60 ml 1 flacone da 60 ml Colorante Amidoschwarz (soluzione concentrata) 1 flacone da 20 ml 1 flacone da 20 ml Soluzione emolizzante (pronta all’uso) 1 flacone da 20 ml 1 flacone da 20 ml Applicatori (pronti all’uso) 

| 1 confezione da 10 (7 dentini) 1 confezione da 10 (15 dentini) Cartine da filtro | 1 confezione da 10 | 1 confezione da 10 | 

PER RISULTATI OTTIMALI 

I componenti di uno stesso kit devono sempre essere utilizzati insieme, in accordo con le istruzioni contenute nel kit. 

LEGGERE ATTENTAMENTE LE ISTRUZIONI PER L’USO. 

1. GELS DI AGAROSIO 

Preparazione 

I gels di agarosio sono pronti all’uso. Ogni gels di agarosio contiene: agarosio, 8 g/l ; tampone alcalino pH 8.5 ± 0.1 ; additivi, non rischiosi alle 

concentrazioni usate, necessari per ottimizzare l’analisi. 

Utilizzo 

Mezzo di supporto per elettroforesi emoglobiniche. 

Conservazione, stabilità e segni di deterioramento 

Conservare i gels orizzontalmente, nella confezione originale protettiva, a temperatura ambiente (15 - 30 °C) o in frigorifero (2 - 8 °C). I gels sono 

stabili fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sulla confezione del gel. (La freccia sulla scatola del kit deve essere rivolta verso l’alto). 

Evitare la conservazione nelle seguenti condizioni: in prossimità di fenestre ; in prossimità di sorgenti di calore ; in presenza di brusche e/o significative 

variazioni di temperatura. NON CONGELARE. 

Non utilizzare il gel quando: 

(i) sono presenti cristalli o precipitati sulla superficie del gel oppure la struttura del gel è divenuta molto molle (entrambe conseguenze del 

congelamento del gel), 

(ii) è presente muffa o flora batterica, 

(iii) è presente, nella scatola che contiene il gel, una quantità anormale di liquido (risultato di una fuoriuscita del tampone dal gel dovuta a condizioni 

di conservazione improprie). 

2. STRISCE TAMPONATE 

Preparazione 

Le strisce di spugna tamponate sono pronte all’uso. Ogni striscia contiene: tampone alcalino pH 9.2 ± 0.2 ; additivi, non rischiosi alle concentrazioni 

usate, necessari per ottimizzare l’analisi. 

- 32 - 

FOGLIO DI ISTRUZIONI SEBIA - Italiano


Utilizzo 

Le strisce di spugna tamponate funzionano da riserva di tampone per l’elettroforesi ed assicurano il contatto tra il gel e gli elettrodi. 


Conservare le strisce tamponate orizzontalmente nella loro confezione protettiva, a temperatura ambiente o in frigorifero. (La freccia sulla scatola del 

kit deve essere rivolta verso l’alto). 

Le strisce sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla confezione del kit o sull’etichetta della confezione delle strisce. 

NON CONGELARE. 

Non utilizzare le strisce se la confezione è aperta e le strisce sono asciutte. 

3. DILUENTE PER LA SOLUZIONE COLORANTE 

Preparazione 

Il diluente per il colorante deve essere utilizzato come descritto nel paragrafo "COLORANTE AMIDOSCHWARZ". 

Contiene una soluzione acida. 

Utilizzo 

Per la preparazione della soluzione colorante amidoschwarz. 


Conservare il diluente concentrato per il colorante a temperatura ambiente o in frigorifero. E’ stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola 

del kit o sull’etichetta del diluente. NON CONGELARE. 

Non aggiungere sodio azide. 

4. COLORANTE AMIDOSCHWARZ 

Preparazione 

Il colorante amidoschwarz concentrato è una soluzione viscosa, che può eventualmente gelificare, senza che la qualità della soluzione finale e del 

suo potere colorante siano minimamente alterati. 

Per ottenere una perfetta ricostituzione del colorante, bisogna rispettare il seguente protocollo. 

1. Aggiungere circa 15 mL di diluente del colorante al flacone di amidoschwarz concentrato. 

2. Chiudere accuratamente il flacone. 

3. Agitare con molto vigore il flacone per almeno 5 secondi. 

4. Versare la soluzione ottenuta nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione. 

5. Ripetere questa operazione due o tre volte se necessario. 

6. Versare il resto del diluente nel recipiente di preparazione della soluzione di colorazione. 

7. Completare a 300 mL con acqua distillata o demineralizzata. 

8. Agitare perfettamente questa soluzione per 5 - 10 minuti. 

Il colorante è pronto all’uso. 

Dopo la diluizione, la soluzione di colorante contiene: soluzione acida pH ≈ 2 ; amidoschwarz, 4 g/L ; Etilen-glicol, 6,7 % ; componenti, non pericolosi 

alle concentrazioni utilizzate, necessarie per i risultati ottimali. 

AVVERTENZA: Nocivo in caso di ingestione. 

Utilizzo 

Per la colorazione dei gels dopo la separazione elettroforetica delle proteine. 

IMPORTANTE: La soluzione colorante è destinata alla colorazione di solamente 10 gels. Sostituire la soluzione colorante dopo 10 cicli di colorazione. 


Conservare sia la soluzione concentrata del colorante sia quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero, in contenitore chiuso per prevenire 

l’evaporazione. La soluzione concentrata del colorante è stabile fino alla data di scadenza indicata sulla scatola del kit o sull’etichetta del colorante. 

Il colorante diluito è stabile 1 mese. 

Non conservare la soluzione di colorante diluita in prossimità di una sorgente di calore. 

5. SOLUZIONE EMOLIZZANTE 

Preparazione 

La soluzione emolizzante è pronta all’uso. E’ costituita da un tampone con additivi, non rischiosi alle concentrazioni usate, necessari per ottimizzare 

l’analisi. 

Utilizzo 

Per emolizzare i globuli rossi. 

Conservazione 

Conservare la soluzione emolizzante a temperatura ambiente o in frigorifero. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza indicata 

sulla scatola del kit o sulla etichetta del flacone della soluzione emolizzante. 

Gettare la soluzione emolizzante se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche. 

6. APPLICATORI 

Utilizzo 

Applicatori monouso, pretagliati, per l’applicazione dei campioni. 

Conservazione 

Conservare gli applicatori lontano dall’umidità a temperatura ambiente o in frigorifero. 

7. CARTINE DA FILTRO 

Utilizzo 

Cartine assorbenti fini, monouso, pretagliate, per l’eliminazione dell’eccesso di liquido dalla superficie del gel prima dell’applicazione dei campioni. 

Conservazione 

Conservare le cartine da filtro sottili in luogo secco a temperatura ambiente o in frigorifero. 

- 33 -


REAGENTI RICHIESTI MA NON FORNITI 

1. SOLUZIONE DECOLORANTE 

Preparazione 

Ogni flacone di Soluzione Decolorante concentrata (SEBIA, PN 4540, 10 flaconi da 100 ml ciascuno) deve essere diluito a 100 litri con acqua 

deionizzata o distillata. Per convenienza diluire solo 5 ml di soluzione concentrata a 5 litri, ossia al volume della tanica della soluzione decolorante. 

Dopo la diluizione la soluzione decolorante contiene: acido citrico, 0.5 g/l. 

Utilizzo 

Come decolorante, ossia per rimuovere l’eccesso di colorante e la colorazione di fondo dal gel. 

Per il risciacquo del compartimento di colorazione dopo la fase di lavaggio. 

Per neutralizzare l’acidità della soluzione decolorante versare, nella tanica vuota dei liquidi reflui, 15 ml di una soluzione al 50 % di Idrossido di Sodio. 


Conservare la soluzione decolorante concentrata a temperatura ambiente o in frigorifero. La soluzione concentrata è stabile fino alla data di scadenza 

indicata sulla scatola del kit o sulla etichetta del decolorante. La soluzione diluita del decolorante è stabile per una settimana a temperatura ambiente 

in flacone chiuso. Non aggiungere sodio azide. 

Eliminare la soluzione decolorante diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche. 

Per prevenire le proliferazioni microbiche nella soluzione decolorante diluita, da conservare oltre una settimana, aggiungere 5 µl/dL di ProClin 300. 

La soluzione decolorante diluita addizionata con ProClin e conservata a temperatura ambiente o in frigorifero in bottiglia chiusa, è stabile fino alla data 

di scadenza indicata sulla confezione o sull’etichetta del flacone di decolorante. 

2. SOLUZIONE DI LAVAGGIO HYDRASYS 

Preparazione 

Ogni flacone di Soluzione di Lavaggio concentrata HYDRASYS (SEBIA, PN 4541, 10 flaconi da 80 ml ciascuno) deve essere diluito a 5 litri con acqua 

distillata o deionizzata. Dopo la diluizione la soluzione di lavaggio contiene: tampone alcalino pH 8.8 ± 0.3 ; sodio azide. 

AVVERTENZA: La soluzione di lavaggio concentrata contiene 0.625 % di sodio azide. Non ingerire! Se ingerita consultare immediatamente 

un medico! La sodio azide può portare alla formazione di composti tossici o esplosivi se posta a contatto con acidi, piombo o rame. Quando 

smaltita fare scorrere un’abbondante quantità’ di acqua. 

Utilizzo 

Serve per lavare il compartimento di colorazione di HYDRASYS. Usare periodicamente ; per esempio, se lo strumento è usato giornalmente lavare il 

compartimento di colorazione settimanalmente. 

Consultare l’inserto nella confezione per la procedura di utilizzo. 


Conservare sia la soluzione di lavaggio concentrata che quella diluita a temperatura ambiente o in frigorifero in contenitore chiuso. Entrambe le 

soluzioni sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla etichetta del flacone della soluzione di lavaggio. 

Eliminare la soluzione di lavaggio diluita se muta di aspetto, per esempio, diviene torbida a causa di contaminazioni batteriche. 

3. SOLUZIONE FISIOLOGICA 

Preparazione 

Preparare una soluzione 0.15 M (9 g/l) di NaCl in acqua distillata o deionizzata. 

Utilizzo 

Per il lavaggio dei globuli rossi. 


Conservare a temperatura ambiente o in frigorifero. Eliminare comunque dopo 3 mesi oppure se muta di aspetto (diviene torbida a causa di 

contaminazione batterica). Per una conservazione più lunga aggiungere sodio azide, 1 g/l. 

APPARECCHIATURE ED ACCESSORI RICHIESTI MA NON FORNITI 

1. Sistema HYDRASYS SEBIA, PN 1210 o PN 1211. 

2. Dispensatore manuale, o in alternativa, per il caricamento degli applicatori dei campioni, campionatore automatico HYDRAPLUS SEBIA, PN 1215. 

3. Camera umida, PN 1270, fornita con HYDRASYS. 

4. Kit di taniche fornito con HYDRASYS. 

5. Pipette: 10 µl e 200 µl. 

6. Densitometro / scanner in grado di effettuare la scansione di gels 82 x 51 mm o 82 x 102 mm a 570 nm o con filtro giallo: HYRYS SEBIA, DVSE 

SEBIA o programma PHORESIS per Scanner a piano fisso. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per le procedure di lavoro e di 

calibrazione. 

7. Telaio porta gel per gels da 7, SEBIA, PN 10043110. 

CAMPIONI PER L’ANALISI 

Raccolta e conservazione del campione 

Per l’analisi sono consigliati campioni di sangue freschi trattati con anticoagulante. Sono utilizzabili i comuni anticoagulanti, come quelli contenenti 

EDTA, citrato o eparina ; evitare gli anticoagulanti con iodoacetato. I campioni di sangue devono essere prelevati seguendo la procedura 

convenzionale per i tests clinici di laboratorio. Se necessario conservare i campioni, a 2 - 8 °C, fino a 5 giorni. 

Preparazione del campione 

• Agitare la provetta primaria prima di prelevare il volume di sangue totale da trattare. 

• Centrifugare il sangue con anticoagulante a 5000 rpm per 5 minuti. 

• Eliminare il plasma. 

• Lavare i globuli rossi 2 volte con 10 volumi di soluzione fisiologica ; grande cura deve essere posta quando si trattano volumi di globuli rossi inferiori 

a 10 µl. 

- 34 -


• Eliminare l’eccesso di soluzione fisiologica sovranatante ai globuli rossi impaccati, quindi agitare con vortex prima di prelevare i 10 µL da emolisare. 

• Emolizzare 10 µl di globuli rossi impaccati con 130 µl di soluzione emolizzante. 

• Agitare per 10 secondi ed incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. 

NOTA: 

- Per preparare emolisati di soggetti lievemente anemici (approssimativament 0,1 g/ml di Hb) o gravemente anemici (< 0,07 g/ml), il volume di 

globuli rossi impaccati deve essere incrementato rispettivamente a 15 µl e 20 µl. L’intensità della colorazione risulterà aumentata, ma le 

concentrazioni relative delle singole frazioni non cambieranno. 

- L’emolisato non deve essere filtrato o centrifugato. 

- La Soluzione Emolizzante SEBIA non ha effetti sulla stabilità dell’emoglobina Bart’s. 

Preparazione del campione per il rilevamento dell’emoglobina H 

- Agitare la provetta primaria prima di prelevare il volume di sangue totale da trattare. 

- Centrifugare il sangue con anticoagulante a 5000 rpm per 5 minuti. 

- Eliminare il plasma. 

- Lavare i globuli rossi 2 volte con 10 volumi di soluzione fisiologica ; deve essere posta molta attenzione quando si trattano volumi di globuli rossi 

inferiori a 10 µl. 

- Eliminare l’eccesso di soluzione fisiologica sovranatante ai globuli rossi impaccati, quindi agitare con vortex prima di prelevare i 40 µL da emolisare. 

- Emolizzare 40 µl di globuli rossi impaccati con 100 µl di Soluzione Emolizzante. 

- Agitare per 10 secondi ed incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. 

- Centrifugare l’emolisato a 10000 rpm per 5 minuti. 

- L’analisi è eseguita sul sovranatante di questo emolisato ; quindi seguire la procedura utilizzando il programma di migrazione «7/15 Hb». 

PROCEDURA 

Il sistema HYDRASYS è uno strumento multiparametrico semi-automatico. Le fasi automatiche includono il trattamento dei gels di agarosio 

HYDRAGEL nella seguente sequenza: applicazione del campione, migrazione elettroforetica, essiccazione, colorazione, decolorazione ed 

essiccazione finale. Le fasi manuali includono, la manipolazione dei campioni e dei gels e la preparazione dello strumento per l’uso. 

LEGGERE ATTENTAMENTE IL MANUALE DI ISTRUZIONE HYDRASYS. 

I. MIGRAZIONE 

1. Accendere lo strumento HYDRASYS. 

2. Posizionare un applicatore su di una superficie piana con i numeri dei pozzetti orientati correttamente verso l’alto (Fig. 1). 

- Applicare 10 µl di campione emolisato in ogni pozzetto. Caricare ciascun applicatore entro 2 minuti. 

- Inserire l’applicatore nella camera umida di conservazione con i dentini rivolti verso l’alto (maneggiare i depositori mediante la cornice 

protettiva in plastica). 

- Lasciare che i campioni diffondano nei dentini per 5 minuti dall’applicazione dell’ultimo campione. 

Consultare l’inserto all’interno della confezione della camera umida per ulteriori dettagli. 

3. Aprire lo sportello del modulo di migrazione ed alzare le cornici mobili porta elettrodi e porta applicatori 

AVVERTENZA: Non chiudere mai lo sportello se le cornici mobili sono alzate. 

4. Selezionare dal menù dello strumento (lato sinistro della tastiera) il programma di migrazione «7/15 Hb». 

NOTA: Quando, sui gels HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E), è richiesta una maggiore separazione tra le emoglobine F e S, si raccomanda 

l’uso del programma di migrazione «7/15 Hb F-S». L’uso di questo programma consente la sola analisi qualitativa. 

5. Estrarre le strisce tamponate dalla confezione ; maneggiarle mediante le estremità in plastica. Agganciare le estremità in plastica forate agli 

spinotti della cornice porta elettrodi ; le estremità in plastica della striscia devono essere rivolte verso la cornice mobile (Fig. 2). 

6. Estrarre il gel dalla confezione. 

- Eliminare rapidamente l’eccesso di liquido in superficie, tamponando il gel con una carta assorbente sottile 

ATTENZIONE : Fate attenzione a non lasciare la carta da filtro troppo a lungo a contatto con il gel per evitarne la disidratazione. 

- Dispensare, sul terzo inferiore del riquadro stampato sulla Piastra di Controllo Temperatura del modulo di migrazione, 120 µl di acqua 

distillata o deionizzata per HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) o 200 µl per HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

- Posizionare la lastrina del gel (gel rivolto verso l’alto) con l’estremità inferiore a ridosso dello scalino alla base del riquadro (Fig. 3). 

- Curvare il gel ed adagiarlo sulla goccia di acqua (Fig. 3). Assicurarsi che non siano rimaste intrappolate bolle d’aria. L’acqua deve essere 

uniformemente stratificata al di sotto della lastrina di gel e questa deve essere allineata all’interno del riquadro stampato. 

7. Abbassare entrambe le cornici mobili. In questa posizione le strisce tamponate non toccano il gel. NON FORZARE LE CORNICI MOBILI AD 

ABBASSARSI ULTERIORMENTE. 

8. Estrarre l’applicatore o gli applicatori dalla camera di umidificazione. Maneggiare gli applicatori mediante la cornice di protezione. 

- Staccare la cornice di protezione dei dentini dell’applicatore. 

- Programma di migrazione «7/15 Hb»: Inserire l’applicatore, sul carrello, in posizione No 4. 

- Programma di migrazione «7/15 Hb F-S» Inserire l’applicatore, sul carrello, in posizione No 3. 

IMPORTANTE: I numeri stampati sugli applicatori devono essere rivolti verso l’operatore (Fig. 4). 

9. Chiudere lo sportello del modulo di migrazione. 

10. Avviare la procedura immediatamente premendo la freccia verde «START» sul lato sinistro della tastiera. 

IMPORTANTE: Assicurarsi che la griglia di ventilazione sul lato destro dello strumento non sia ostruita. 

MIGRAZIONE - DESCRIZIONE DELLE FASI AUTOMATICHE 

• Le due cornici mobili vengono abbassate in modo che le strisce tamponate e gli applicatori entrino in contatto con il gel. 

• La cornice mobile porta applicatori si alza. 

• La migrazione ha luogo in condizioni di tensione costante (340 V) a 25 °C, controllati mediante effetto Peltier, fino ad accumulare 65 Vh (per circa 

12 minuti, programma di migrazione «7/15 Hb») o 85 Vh (per circa 15 minuti, programma di migrazione «7/15 Hb F-S »). 

• La cornice mobile porta elettrodi si alza interrompendo il contatto. 

- 35 -


• La temperatura della piastra sale fino a 50 °C, tale temperatura è mantenuta 15 minuti per essiccare il gel. 

• Un segnale acustico avverte che lo sportello del modulo di migrazione è stato sbloccato. La temperatura della piastra rimane a 50 °C finché lo 

sportello non viene alzato. La temperatura viene poi diminuita fino a quando raggiunge i 25 °C (in meno di 5 minuti) dopodiché una nuova migrazione 

può partire. 

NOTA: Lo sportello del modulo di migrazione rimane bloccato durante tutte le fasi della migrazione. 

II. TRATTAMENTO DEL GEL 

1. Aprire lo sportello. 

2. Rimuovere e gettare gli applicatori. 

3. Alzare entrambe le cornici mobili, togliere le strisce tamponate mediante le estremità in plastica e gettarle. 

4. Estrarre il gel essiccato pronto per le fasi successive. 

5. Pulire con molta cura gli elettrodi e il piano di controllo della temperatura, utilizzando carta soffice ben imbevuta di acqua. 

Prima dell’uso, accertarsi che gli elettrodi e il piano siano perfettamente asciutti. 

IMPORTANTE: Pulire sistematicamente gli elettrodi dopo ogni migrazione. 

6. Aprire il telaio porta gel. Metterlo in posizione piana ed inserire la lastrina (con il gel rivolto verso l’operatore) nelle scanalature delle due guide, 

quindi chiudere il telaio. Assicurarsi che il gel sia correttamente posizionato all’interno del telaio (Fig. 5). 

7. Inserire il telaio porta gel nel Modulo di trattamento/colorazione del gel. 

IMPORTANTE: Prima di avviare il programma di trattamento/colorazione del gel controllare che: 

- la tanica del colorante sia riempita con 300 ml di soluzione colorante. 

- la tanica del decolorante contenga almeno 1 litro di soluzione decolorante. 

- la tanica dei liquidi reflui sia vuota. 

Per la connessione dei reagenti: riferirsi alle informazioni mostrate sul visore dello strumento (premere il tasto: VISUAL CANALI). 

IMPORTANTE: Non dimenticare di chiudere gli ingressi dei reagenti non utilizzati. 

8. Selezionare il programma di colorazione «PROT./B1-B2/Hb» dal menù dello strumento ed avviare la procedura premendo il tasto «START» 

(freccia verde sul lato destro dello strumento). 

Durante i cicli di colorazione, decolorazione e asciugatura, il compartimento rimane bloccato. 

Dopo il ciclo di raffreddamento, un segnale acustico indica che il compartimento è sbloccato (la ventilazione è mantenuta fino a quando il 

supporto del gel viene rimosso) 

III. COMPLETAMENTO DEL TRATTAMENTO DEL GEL 

1. Rimuovere il telaio porta gel dal compartimento, aprirlo e rimuovere il gel essiccato. 

NOTA: Se dopo la fase di colorazione/decolorazione sul gel sono visibili macchie blu residuali, una fase addizionale di lavaggio con il 

programma "LAV. ISOENZ/GEL", prima della lettura densitometrica, permette di eliminarle o di attenuarle fortemente. 

2. Se necessario pulire il retro della lastrina di gel (la faccia con la plastica di supporto) con una carta soffice inumidita. 

3. Effettuare la scansione usando un densitometro / scanner a 570 nm o con filtro giallo. Utilizzando i densitometri HYRYS o DVSE, posizionare 

la frazione A 2 

sul segno 5 mm della piastra di lettura: lo zero è effettuato, nel punto più basso, fra le frazioni A 2 

e anidrasi carbonica. 

NOTA: Per assicurare la maggiore accuratezza e precisione dei risultati, attenzione a: 

- Regolare la lunghezza di scansione per includere l’intero quadro elettroforetico (≈ 30 mm). 

- Assicurarsi che i minimi su ambedue i lati della frazione A 2 

siano posizionati ai piedi del picco della A 2 

. 

E’ buona prassi leggere i gels colorati senza ritardi. Per consultazioni successive, possono essere conservati in un astuccio protettivo, 

all’asciutto, protetti dalla luce e lontani da fonti di calore ed interpretati visivamente entro 3 mesi. 

RISULTATI 

Controllo Qualità 

Si consiglia di includere in ogni gruppo di campioni processati un sangue di controllo o un campione di sangue noto, contenenti emoglobine A, F, C ed S. 

Valori 

La lettura densitometrica degli elettroforegrammi colorati, fornisce le concentrazioni relative (percentuali) delle singole zone emoglobiniche. 

I valori normali (media) su gels HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) sono stati determinati su una popolazione sana di 200 adulti (uomini e donne): 

Emoglobina A ≥ 96,5 % 

Emoglobina F < 2,0 % (*) 

Emoglobina A 2 

≤ 3,5 % 

(*) vedi Interferenze e Limitazioni. 

Si raccomanda ad ogni laboratorio di stabilire i propri valori normali. 

Interpretazione 

1. Anomalie qualitative: Emoglobinopatie 

La maggior parte delle emoglobinopatie sono dovute alla sostituzione, per mutazione, di un aminoacido, in uno dei quattro tipi di catene polipeptidiche. 

Il significato clinico della mutazione varia in funzione del tipo di aminoacido sostituito e della posizione. 

Nelle malattie clinicamente significative, è affetta o la catena α o la catena ß. 

Più di 200 varietà di emoglobine adulte sono già state descritte. Le prime emoglobine anomale studiate, nonché le più frequenti, presentano una 

alterata carica elettrica netta e ciò ne consente una semplice individuazione attraverso l’elettroforesi. 

Le principali emoglobine anomale, che presentano un particolare interesse clinico, sono quattro: S, C, E e D. 

I kits HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E), sono destinati alla identificazione preliminare delle emoglobinopatie e delle talassemie. Quando si evidenzia 

un quadro anormale, l’identificazione deve essere confermata da un test discriminatorio appropriato come l’elettroforesi su gel di agarosio acido. 

Emoglobina S 

L’emoglobina S è la più frequente. E’ dovuta alla sostituzione di un acido glutammico (aminoacido acido) della catena ß, con valina (aminoacido 

neutro). La sua mobilità elettroforetica è comunque rallentata. Su HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) tamponato in mezzo alcalino, l’emoglobina S 

migra fra le frazioni A e A 2 

. 

- 36 -


Emoglobina C 

Un acido glutammico della catena ß è sostituito dalla lisina (aminoacido basico): la sua mobilità e’ fortemente ridotta. Sul gel HYDRAGEL 

7/15 HEMOGLOBIN(E), C, E ed A 2 

sono sovrapposte. Quando questa frazione è >15 %, deve essere sospettata la presenza di emoglobine C ed E. 

Emoglobina E 

Un acido glutammico della catena ß è sostituito dalla lisina: l’emoglobina E migra, sul gel HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E), esattamente come 

l’emoglobina C. Diversamente dalla C, non si separa, in tampone acido (HYDRAGEL 7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)), dalla emoglobina A ; questa 

proprietà permette di differenziare E e C. 

Emoglobina D 

Un acido glutammico della catena ß è sostituito dalla glutammina. Su HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E), questa emoglobina migra esattamente 

come la S. Diversamente dall’emoglobina S, la D non si separa dalla A in tampone acido (HYDRAGEL 7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)). Questa 

proprietà permette di differenziare S e D. 

2. Anomalie quantitative: Talassemie 

Le talassemie costituiscono un gruppo pressoché eterogeneo di affezioni genetiche caratterizzate dalla riduzione di sintesi di un tipo di catena 

polipeptidica. Il meccanismo molecolare di questa riduzione non è stato ancora completamente spiegato. 

Ci sono due tipi di sindromi talassemiche: 

Alfa-talassemie 

Sono caratterizzate da una riduzione di sintesi delle catene α che, quindi, condiziona la sintesi di tutte le emoglobine normali. L’eccesso di sintesi delle 

catene ß e γ rispetto alla catena α, induce la formazione di tetrameri senza catena α: 

• emoglobina Bart = γ 4, 

• emoglobina H = ß 4. 

Beta-talassemie 

Sono caratterizzate da una riduzione di sintesi della catena ß. Solo la sintesi della emoglobina A e’ compromessa. 

Quindi le percentuali di emoglobine F e A 2 

sono incrementate rispetto alla emoglobina A. 

3. Quadri di migrazione 

Migrazione di 

emoglobine normali 

A(A 0 

+ A 1 

) A (A 0 

+ A 1 

) 

F 

S - D 

A 2 

anidrasi 

punto di applicazione 

A 2 

- C - E 

anidrasi 

Migrazione delle principali 

emoglobine anormali 

A 0 

: La frazione non glicata della emoglobina adulta normale A. 

A 1 

: La frazione glicata della emoglobina adulta normale A. 

Interferenze e limitazioni 

• Non utilizzare campioni di sangue emolizzati. 

• Quando viene rilevata una emoglobina anomala, che migra differentemente dalle principali emoglobine varianti S, C, D ed E, utilizzare un metodo 

di identificazione diverso (es., elettroforesi delle catene globiniche) e consultare o inviare il campione ad un laboratorio specializzato. 

• Il dosaggio densitometrico della Hb F (o di qualunque altra emoglobina minore che migra in prossimità di una frazione maggiore) è semi-quantitativo 

poiché il valore diventa inaccurato al disotto del 2 % - 3 % dell’emoglobina totale. 

• I campioni di alcuni pazienti con emoglobina omozigote “S”, trattati con Hydrea® (idrossiurea), possono presentare una emoglobina F dovuta alla 

sintesi indotta dal trattamento. Su HYDRAGEL 7 & 15 HEMOGLOBIN(E), in alcuni casi, è stata osservata una mobilità dell’emoglobina F indotta 

leggermente diversa da quella dell’emoglobina F fisiologica. 

• In campioni conservati per più di 7 giorni, può essere osservata una focalizzazione dell’addensamento localizzato dietro alla frazione Hb A, che non 

deve essere interpretato come una variante emoglobinica, es., emoglobine H o Bart. 

Eliminazione errori 

Contattare il Servizio di Assistenza Tecnica del fornitore quando, nonostante siano state seguite accuratamente le istruzioni per la preparazione e la 

conservazione dei materiali e per la procedura di impiego, i risultati del test non rispettino le caratteristiche. 

Le Schede di Sicurezza dei componenti del kit e le informazioni per lo smaltimento dei rifiuti sono disponibili presso il Servizio di Assistenza Tecnica 

SEBIA. 

DATI SULLE PRESTAZIONI 

Tutti i dati sono basati su uno studio che comprende materiali e strumenti SEBIA HYDRAGEL ed un comparabile sistema su gel di agarosio, reperibile 

in commercio. Inoltre, studi di concordanza sono stati eseguiti identificando le emoglobine ed i loro valori con una diversa metodologia di 

riconoscimento. 

Tutti gli elettroforegrammi sono stati interpretati visivamente. Per le valutazioni densitometriche, a completamento dell’interpretazione visiva, è stato 

utilizzato il densitometro HYRYS SEBIA. 

Qui riportiamo esempi rappresentativi dei risultati ottenuti nello studio sulle prestazioni. Di seguito sono mostrati i valori singoli e le medie di SD e CV. 

Complessivamente i risultati indicano una riproducibilità molto buona per tutti gli aspetti studiati: 2,4 % è stato il valore medio del CV per il programma 

di migrazione «7/15 Hb ». Risultati simili sono stati ottenuti per il programma di migrazione «7/15 Hb F-S». 

Riproducibilità nella serie 

Tre campioni di sangue sono stati processati su gels HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) dello stesso lotto. Ogni campione è stato processato in tutte 

le 15 piste dei singoli gel. La tabella seguente riporta medie, SD e CV di ogni singola componente emoglobinica dei tre campioni, calcolati dai valori 

percentuali densitometrici delle singole piste. Nessuna delle ripetizioni ha mostrato valori falsamente positivi o negativi. 

- 37 -


| COMPONENTE | MEDIA (%) | SD | CV (%) | 

Campione normale Hb A 97.6 0.2 0.2 Hb A 2 

| 2.4 | 0.2 | 7.7 Hb A2 Elevata Hb A 95.3 0.2 0.2 Hb A 2 

| 4.7 | 0.2 | 5.0 Hb C Elevata Hb A 57.8 0.4 0.7 | Hb C | 42.2 | 0.4 | 0.9 | 

Riproducibilità tra le serie 

Quindici (15) campioni di sangue sono stati processati elettroforeticamente sui gels di un singolo lotto di HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). I campioni 

analizzati ne includono nove con un’emoglobina anomala (S, F o C) e cinque con una elevata Hb A 2 

. Le medie, SD e CV sono stati ottenuti dai valori 

di ogni componente di ciascun campione. Nella tabella seguente sono riportate: oscillazioni di media, SD, CV e CV medio relativi ai dati aggregati 

delle singole frazioni. Nessuna delle ripetizioni ha mostrato valori falsamente positivi o negativi. 

COMPONENTE MEDIA (%) SD CV (%) CV MEDIO (%) Hb A 21.6 – 98.0 0.1 – 0.6 0.1 – 2.4 0.7 Hb F 14.1 – 73.0 0.5 0.7 – 3.4 1.6 Hb C/E 20.0 – 42.4 0.3 0.7 – 1.3 1.0 Hb S/D 8.8 – 83.6 0.2 – 0.6 0.7 – 2.1 1.1 

| Hb A 2 

| 2.0 – 5.4 | 0.1 – 0.2 | 1.3 – 9.9 | 4.8 | 

Accuratezza - Rilevamento delle anomalie emoglobiniche 

Utilizzando HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) ed un diverso sistema su gel di agarosio, reperibile in commercio, sono stati analizzati sessantatré (63) 

campioni di sangue. I campioni di sangue e la loro valutazione diagnostica è stata fornita da un ospedale. Le diagnosi erano basate sui dati ottenuti 

da elettroforesi eseguite su gels acidi ed alcalini e/o da HPLC. Tutte le emoglobine anomale o i livelli alterati di emoglobine normali, rilevate con 

HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E), sono risultati concordi con il sistema di comparazione su gel, con i risultati dell’ospedale e con le diagnosi cliniche. 

Non sono stati osservati casi di falsa positività, per esempio, il rilevamento di una frazione anomala o di un livello alterato di una frazione normale in 

campioni normali. 

Accuratezza - Determinazione quantitativa della Hb A 2 

Sono stati misurati densitometricamente i livelli di Hb A 2 

di 51 campioni di sangue, con livelli di Hb A 2 

normale ed elevata, processati utilizzando 

HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) ed un diverso sistema su gel di agarosio, reperibile in commercio. I valori misurati con le due tecniche, sono stati 

analizzati con una procedura statistica di regressione lineare. I risultati dell’analisi di regressione lineare sono riportati in tabella (y = HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E)). 

| Coefficiente di correlazione | y- Intercetta | Pendenza | Oscillazione dei valori % | 

| | | | (sistema SEBIA) | 

| 0.981 | 0.103 | 0.906 | 1.7 - 5.6 | 

Linearità 

Due campioni di sangue sono stati miscelati in proporzioni diverse e le diluizioni sono state processate su gels HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

I test hanno mostrato la linearità dell’intero campo studiato. 

BIBLIOGRAFIA 







860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


- 38 -


ESPECIFICACIONES DE USO 

Los kits HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) e HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) están indicados para la separación de las hemoglobinas normales (A 

y A 2 

) y para la detección de las principales variantes de hemoglobina: S ó D y C ó E, mediante electroforesis en geles de agarosa tamponados 

alcalinos (pH 8.5). Se utilizan junto con el instrumento semiautomático HYDRASYS. La electroforesis se realiza usando como muestra el hemolisado 

obtenido a partir de glóbulos rojos lavados. Las hemoglobinas son separadas y teñidas con negro amido. El exceso de colorante se elimina con una 

solución ácida. Las separaciones electroforéticas resultantes en geles secados pueden evaluarse visualmente para la detección de anormalidades 

en el patrón de migración. La densitometría tiene una aplicación práctica como ayuda en la interpretación de los patrones electroforéticos o para 

obtener una cuantificación relativa precisa de las hemoglobinas de interés, tales como la hemoglobina A 2 

en el diagnóstico de la ß-talasemia. A 

continuación debería efectuarse una electroforesis en gel ácido, por ejemplo HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E), para confirmar la 

identificación de las variantes de la hemoglobina y, en particular, para diferenciar la Hb S de la Hb D y la Hb E de la Hb C. 

Cada gel de agarosa está destinado para analizar : 

• 7 muestras en el kit HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), 

• 15 muestras en el kit HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

Para Uso Diagnóstico In Vitro. 

PRINCIPIO DEL TEST 

La hemoglobina es una molécula compleja integrada por dos pares de cadenas polipeptídicas. Cada cadena está ligada a un hemo, un núcleo 

tetrapirrólico (porfirina) al que está coordinado un átomo de hierro. La estructura hemo es común a todas las hemoglobinas y sus variantes. El tipo 

de hemoglobina está determinado por la fracción proteica, llamada globina. Las cadenas polipeptídicas α, β, δ y γ constituyen las hemoglobinas 

humanas normales: 

• hemoglobina A ................................... = α 2 β 2 

• hemoglobina A 2 

.................................. = α 2 δ 2 

• hemoglobina fetal F ........................... = α 2 γ 2 

La cadena α es común a estas tres hemoglobinas. 

La estructura espacial de la hemoglobina y otras de sus propiedades moleculares (así como las de todas las proteínas) dependen de la naturaleza y 

la secuencia de los aminoácidos que constituyen las cadenas. La substitución de aminoácidos por mutación es la causa de la formación de 

hemoglobinas variantes las cuales tienen una carga superficial distinta y, por tanto, movilidades electroforéticas distintas, que también dependen del 

pH y la fuerza iónica del tampón. 

Las anormalidades cualitativas (o estructurales) resultantes se llaman hemoglobinopatías. La disminución en la síntesis de una de las cadenas de 

hemoglobina conlleva anormalidades cuantitativas (o de regulación), denominadas talasemias. 

REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS EN LOS KITS HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) E HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) 

ARTÍCULO PN 4106 PN 4126 Geles de agarosa (listos para su uso) 10 geles 10 geles Esponjas tamponadas (listas para su uso) 10 bolsas de 2 10 bolsas de 2 Diluyente del colorante (solución stock) 1 vial, 60 ml 1 vial, 60 ml Colorante Negro Amido (solución stock) 1 vial, 20 ml 1 vial, 20 ml Solución hemolizante (lista para su uso) 1 vial, 20 ml 1 vial, 20 ml Aplicadores (listos para su uso) 1 caja de 10 (7 peine) 1 caja de 10 (15 peine) 

| Papeles de filtro | 1 bolsa de 10 | 1 bolsa de 10 | 

PARA OBTENER RESULTADOS ÓPTIMOS 

Los elementos de un mismo kit deben utilizarse conjuntamente y según las instrucciones incluidas. 

LEER ATENTAMENTE LAS INSTRUCCIONES. 

1. GELES DE AGAROSA 

Preparación 

Los geles de agarosa están listos para su uso. Cada gel contiene: agarosa, 8 g/l ; tampón alcalino pH 8.5 ± 0.1 ; aditivos, inocuos a las 

concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo. 

Uso 

Medio de soporte para la electroforesis de hemoglobinas. 

Almacenamiento, estabilidad y señales de deterioro 

Almacenar los geles horizontalmente en sus recipientes protectores originales a temperatura ambiente (15 a 30 °C) o refrigerados (2 a 8 °C). Son 

estables hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en sus recipientes protectores. (La flecha situada en la cara frontal de la caja del 

kit debe apuntar hacia arriba). Evitar su almacenamiento cerca de una ventana o de una fuente de calor. Evitar variaciones importantes de 

temperatura durante su almacenamiento. NO CONGELAR. 

Desechar cuando: 

(i) haya cristales o precipitados en la superficie del gel o su textura sea muy blanda (consecuencias de la congelación del gel) ; 

(ii) se observe crecimiento bacteriano o fúngico ; 

(iii) haya una cantidad excesiva de líquido en el recipiente del gel (consecuencia de la exudación del tampón debida a un almacenamiento 

inadecuado). 

- 39 - 

INSTRUCCIONES SEBIA - Español

2. ESPONJAS TAMPONADAS 


Preparación 

Las esponjas tamponadas están listas para sus uso. Cada una contiene: tampón alcalino pH 9.2 ± 0.2 ; aditivos, inocuos a las concentraciones 

usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo. 

Uso 

Las esponjas tamponadas funcionan como reservorio de tampón de electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos. 


Las esponjas tamponadas pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera. 

Deben ser conservadas horizontalmente en su bolsa protectora (la flecha situada en la parte frontal del kit debe apuntar hacia arriba). 

Son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en su bolsa protectora. NO LAS CONGELE. 

Deseche las esponjas tamponadas si la bolsa está abierta o si las esponjas están secas. 

3. DILUYENTE DEL COLORANTE 

Preparación 

El diluyente del colorante concentrado debe ser usado como se ha descrito en el párrafo "COLORANTE NEGRO AMIDO". Contiene una solución 

ácida. 

Uso 

Para la preparación del colorante negro amido. 

Conservación, estabilidad y señales de deterioro 

El diluyente del colorante concentrado puede conservarse a temperatura ambiente o en la nevera. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada 

en el kit o en la etiqueta del vial de diluyente. NO LO CONGELE. 

No le añada azida sódica. 

4. COLORANTE NEGRO AMIDO 

Preparación 

El colorante negro amido concentrado es una solución viscosa que puede gelificarse, lo que no afecta de ningún modo a la calidad de la solución 

final y su capacidad de coloración. 

Para obtener una perfecta reconstitución del colorante, siempre hay que prepararlo como se indica a continuación : 

1. Añada unos 15 mL de diluyente del colorante en el vial de negro amido concentrado. 

2. Cierre el vial con cuidado. 

3. Agite el vial intensamente durante un mínimo de 5 segundos. 

4. Vierta la solución obtenida en el recipiente de preparación de la solución de coloración. 

5. Repita esta operación dos veces, o tres veces si es necesario. 

6. Vierta el resto de diluyente en el recipiente de preparación de la solución de coloración. 

7. Complete hasta 300 mL con agua destilada o desionizada. 

8. Agite esta solución de 5 a 10 minutos. 

El colorante está listo para usar. 

Después de la dilución, la solución colorante contiene: solución ácida pH ≈ 2 ; negro amido, 4 g/L ; etilén-glicol, 6,7 % ; aditivos inocuos a las 

concentraciones usadas, necesarios para un funcionamiento óptimo. 

ATENCIÓN: Nocivo en caso de ingestión. 

Uso 

Para la coloración de los geles después de la separación electroforética de las proteínas. 

IMPORTANTE: El colorante está destinado para colorear sólo 10 geles. Cambie el colorante después de 10 usos. 

Conservación, estabilidad y señales de deterioro 

Las soluciones de colorante concentrada y diluida pueden conservarse a temperatura ambiente o en la nevera, en contenedores cerrados para evitar 

la evaporación. La solución concentrada es estable hasta la fecha de caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de colorante. 

La solución diluida es estable durante 1 mes. 

No almacene la solución de colorante diluida cerca de una fuente de calor. 

5. SOLUCIÓN HEMOLIZANTE 

Preparación 

La Solución Hemolizante está lista para su uso. Es un tampón con aditivos, inocuos a la concentración utilizada, necesarios para un funcionamiento 

óptimo. 

Uso 

Para la hemólisis de los glóbulos rojos. 


Almacenar la Solución Hemolizante a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o en las 

etiquetas del vial. 

Descartar la solución hemolizante si cambia su apariencia, p. ej., si se vuelve turbia debido a contaminación microbiana. 

6. APLICADORES 

Uso 

Aplicadores precortados, de un solo uso, para la aplicación de la muestra. 


Almacenar los aplicadores en un lugar seco a temperatura ambiente o refrigerados. 

- 40 -


7. PAPELES DE FILTRO 

Uso 

Papeles finos absorbentes precortados, de un solo uso, para secar el exceso de humedad de la superficie del gel antes de la aplicación de la muestra. 

Conservación 

Conserve los papeles de filtro finos en un lugar seco a temperatura ambiente o en nevera. 

REACTIVOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 

1. SOLUCIÓN DECOLORANTE 

Preparación 

Cada vial de Solución Decolorante stock (SEBIA, PN 4540, 10 viales de 100 ml) se diluye hasta 100 litros con agua destilada o desionizada. Es 

conveniente diluir sólo 5 ml de la solución stock hasta 5 litros, volumen del contenedor de la solución decolorante. Después de la dilución, la solución 

decolorante de trabajo contiene: ácido cítrico, 0.5 g/l. 

Uso 

Para decolorar, ésto es, la eliminación del exceso de colorante y de la coloración de fondo de los geles. 

Para el lavado del compartimento de coloración. 

Para neutralizar la acidez del decolorante, introduzca dentro del contenedor de desechos vacío 15 ml de sosa al 50 % (solución comercial). 


Almacenar la solución decolorante stock a temperatura ambiente o refrigerada. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del kit o 

en las etiquetas del vial. La solución decolorante de trabajo es estable una semana a temperatura ambiente en un contenedor cerrado. No añadir 

azida sódica. 

Desechar la solución decolorante de trabajo si cambia su apariencia, p. ej., si se vuelve turbia debido a contaminación bacteriana. 

Para evitar la proliferación microbiana en la solución decolorante diluida que se vaya a almacenar durante más de una semana, añada 5 µl/dL de ProClin 300. 

El decolorante diluido al que se ha añadido ProClin es estable en un contenedor cerrado a temperatura ambiente o en la nevera hasta la fecha de 

caducidad indicada en el kit o en la etiqueta del vial de decolorante. 

2. SOLUCIÓN DE LAVADO HYDRASYS 

Preparación 

Cada vial de la Solución de Lavado HYDRASYS stock (SEBIA, PN 4541, 10 viales de 80 ml) se diluye hasta 5 litros con agua destilada o desionizada. 

Después de la dilución, la solución de lavado de trabajo contiene: tampón alcalino pH 8.8 ± 0.3 ; azida sódica. 

ATENCIÓN: La solución de lavado stock contiene azida sódica 0.625 %. ¡No ingerir! ¡En caso de ingestión accidental, consultar 

inmediatamente al médico! La azida sódica puede llevar a la formación de compuestos explosivos o tóxicos al entrar en contacto con 

ácidos, plomo o cobre. Lavar siempre con gran cantidad de agua al desechar. 

Uso 

Sirve para limpiar el Compartimento de Tinción del HYDRASYS. Usar periódicamente, p. ej., si el instrumento se usa a diario, lavar el compartimento 

de tinción semanalmente. 

Ver la hoja de instrucciones para las indicaciones de uso. 


Almacenar ambas soluciones de lavado, stock y de trabajo, a temperatura ambiente o refrigeradas en contenedores cerrados. Son estables hasta la 

fecha de caducidad indicada en las etiquetas del vial. 

Desechar la solución de lavado de trabajo si cambia su apariencia, p. ej., si se vuelve turbia debido a contaminación microbiana. 

3. SOLUCIÓN SALINA 

Preparación 

Preparar una solución de NaCl 0.15 M (9 g/l) en agua destilada o desionizada. 

Uso 

Para el lavado de los glóbulos rojos. 


Almacenar la solución salina a temperatura ambiente o refrigerada. Descartar después de 3 meses o si cambia su apariencia, p. ej., se vuelve turbia 

debido a contaminación microbiana. Para una estabilidad más elevada, añadir azida sódica 1 g/l. 

EQUIPAMIENTO Y ACCESORIOS NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 

1. Sistema HYDRASYS SEBIA, PN 1210 o PN 1211. 

2. Micropipeteador, manual o automatico, como el HYDRAPLUS SEBIA, PN 1215, para cargar los aplicadores de muestra de una forma alternativa. 

3. Cámara Húmeda, PN 1270, suministrada con el HYDRASYS. 

4. Kit de Contenedores suministrado con el HYDRASYS. 

5. Pipetas: 10 µl y 200 µl. 

6. Densitómetro / escáner capaz de leer geles de 82 x 51 mm ó 82 x 102 mm a 570 nm o con un filtro amarillo, p. ej., HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA 

o el programa PHORESIS para escáner de sobremesa. Observar las indicaciones del fabricante para los procedimientos de operación y 

calibración. 

7. Soporte para geles pequeñios, SEBIA PN 10043110. 

MUESTRAS PARA ANALISIS 

Extracción y almacenamiento de las muestras 

Es recomendable analizar muestras frescas de sangre no coagulada. Los anticoagulantes comunes como los que contienen EDTA, citrato o heparina 

son aceptables, evitar los que contengan iodoacetato. La sangre debe obtenerse de acuerdo con los procedimientos establecidos de uso en los 

laboratorios clínicos. Si es necesario, almacenar las muestras entre 2 y 8 °C hasta 5 días. 

- 41 -


Preparación de las muestras 

• Agite el tubo primario antes de tomar el volumen de sangre total que se va a tratar. 

• Centrifugar la sangre no coagulada a 5 000 r.p.m. durante 5 minutos. 

• Descartar el plasma. 

• Lavar los glóbulos rojos 2 veces con 10 volúmenes de solución salina ; debe tenerse mucho cuidado al procesar volúmenes de glóbulos rojos 

inferiores a 10 µl. 

• Elimine el exceso de solución salina que hay en la superficie del coágulo de glóbulos rojos lavados, y agítelo en el vórtex antes de pipetear los 

10 µL que se van a hemolizar. 

• Hemolizar 10 µl de glóbulos rojos empaquetados con 130 µl de Solución Hemolizante. 

• Agitar en el vórtex durante 10 segundos e incubar 5 minutos a temperatura ambiente. 

NOTAS: 

- Para preparar el hemolizado de individuos levemente anémicos (aproximadamente 0,1 g/ml de Hb) o gravemente anémicos (< 0,07 g/ml de Hb), 

el volumen de glóbulos rojos empaquetados puede aumentarse hasta 15 µl y 20 µl, respectivamente. La intensidad de tinción aumentará por 

consiguiente, pero las concentraciones relativas de las fracciones individuales no cambiarán. 

- El hemolizado no necesita ser filtrado o centrifugado. 

- La solución hemolizante de SEBIA no afecta a la inestable hemoglobina de Bart. 

Preparación de la muestra para la detección de hemoglobina H 

- Agite el tubo primario antes de tomar el volumen de sangre total que se va a tratar. 

- Centrifugue la sangre con anticoagulante a 5 000 r.p.m. durante 5 minutos. 

- Deseche el plasma. 

- Lave los glóbulos rojos 2 veces con 10 volúmenes de salina ; hay que tener mucho cuidado al procesar volúmenes de glóbulos rojos inferiores a 

10 µl. 

- Elimine el exceso de solución salina que hay en la superficie del coágulo de glóbulos rojos lavados, y agítelo en el vórtex antes de pipetear los 

40 µL que se van a hemolizar. 

- Hemolice 40 µl de glóbulos rojos empaquetados con 100 µl de Solución Hemolizante. 

- Agite la mezcla en el vórtex durante 10 segundos e incube 5 minutos a temperatura ambiente. 

- Centrifugue el hemolizado a 10 000 r.p.m. durante 5 minutos. 

- El análisis se realiza con el sobrenadante de este hemolizado ; después, siga el procedimiento con el programa de migración «7 / 15 Hb». 

PROCEDIMIENTO 

El sistema HYDRASYS es un instrumento semiautomático multiparamétrico. Las etapas automáticas incluyen el procesado de los geles de agarosa 

HYDRAGEL en la siguiente secuencia: aplicación de la muestra, migración electroforética, secado, tinción, destinción y secado final. Las etapas 

manuales incluyen el manejo de las muestras y los geles, y la puesta en marcha del instrumento para la operación. 

LEER CUIDADOSAMENTE EL MANUAL DE INSTRUCCIONES DEL HYDRASYS. 

I. PUESTA EN MARCHA DE LA MIGRACIÓN 

1. Encender el HYDRASYS. 

2. Colocar un aplicador en una superficie plana con los números de los pocillos en la cara superior (Fig. 1). 

- Aplicar 10 µl de muestra hemolisada en cada pocillo. Cargar el aplicador en el plazo máximo de 2 minutos. 

- Colocar el aplicador en la cámara húmeda con el peine hacia arriba (asirlo por el plástico protector del peine). 

- Dejar difundir las muestras a través de los papeles del peine durante 5 minutos, después de la aplicación de la última muestra. 

Ver la hoja de instrucciones de la cámara húmeda para más detalles. 

3. Abrir la puerta del Módulo de migración y elevar los soportes de los electrodos y los aplicadores. 

ATENCIÓN: ¡Nunca cerrar la puerta cuando los soportes están elevados! 

4. Seleccionar el programa de migración «7/15 Hb». 

NOTA: Si se desea una mayor separación entre Hb F y Hb S con los geles HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), se recomienda seleccionar 

el programa de migración «7/15 Hb F-S». Este programa está pensado para realizar un análisis cualitativo únicamente. 

5. Extraer las esponjas tamponadas de su envoltorio ; asirlas por los extremos de plástico. Engarzar los extremos de plástico agujereados con 

las puntas metálicas del soporte de los electrodos ; los extremos de plástico deben quedar encarados al soporte (Fig. 2). 

6. Abrir el contenedor del HYDRAGEL. 

- Extienda un papel de filtro fino de manera rápida y uniforme sobre la superficie del gel para absorber el exceso de líquido. Retire el papel 

inmediatamente. 

ADVERTENCIA: Para evitar que se deshidrate, no deje que el papel de filtro contacte con el gel durante mucho tiempo. 

- Dispensar 120 µl de agua destilada o desionizada para el HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), o 200 µl para el HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E), en el tercio inferior del marco serigrafiado en la Superficie de Control de Temperatura del módulo de migración. 

- Colocar el gel (la cara de agarosa hacia arriba) con su lado inferior en contacto con el tope inferior del marco serigrafiado (Fig. 3). 

- Aplicar el gel en la superficie, haciéndolo contactar con el agua (Fig. 3). Asegurarse que no queden burbujas, que el agua esté extendida 

bajo toda la superficie del gel y que éste esté alineado con el marco serigrafiado. 

7. Devolver ambos soportes a su posición original. En esta posición las esponjas tamponadas no deben tocar el gel. NO FORZAR LOS 

SOPORTES HACIA ABAJO. 

8. Extraer el aplicador de la cámara húmeda. Asirlo por el plástico protector. 

- Romper el plástico protector precortado del peine. 

- Programa de migración «7 / 15 Hb» : Ponga el aplicador en la posición No 4 del soporte. 

- Programa de migración «7 / 15 Hb F-S» : Ponga el aplicador en la posición No 3 del soporte. 

IMPORTANTE: Los números impresos en el aplicador deben quedar de cara al usuario (Fig. 4). 

9. Cerrar la puerta del módulo de migración. 

10. Iniciar el procedimiento inmediatamente, presionando la tecla «START» (flecha verde) en el lado izquierdo del teclado. 

IMPORTANTE: Asegurarse que la toma de aire en el lado derecho del instrumento no está bloqueada. 

- 42 -

MIGRACIÓN - DESCRIPCIÓN DE LAS ETAPAS AUTOMÁTICAS 


• Los dos soportes descienden, con lo cual esponjas tamponadas y el aplicador entran en contacto con la superficie del gel. 

• El soporte del aplicador se eleva. 

• La migración se realiza a voltaje constante de 340 V a 25 °C, controlados por efecto Peltier, hasta que se hayan acumulado 65 Vh (durante unos 

12 minutos, en el programa de migración «7 / 15 Hb») o hasta que se hayan acumulado 85 Vh (durante unos 15 minutos, en el programa de 

migración «7 / 15 Hb F-S»). 

• El soporte de los electrodos se eleva para desconectar los electrodos. 

• La temperatura de la Superficie de Control de Temperatura se eleva a 50 °C durante 15 minutos para secar el gel. 

• Un pitido audible indica que la puerta del módulo de migración queda desbloqueada. La temperatura permanece a 50 °C hasta que se abre la 

puerta. Luego, la temperatura desciende hasta los 25 °C (en menos de 5 minutos) después de lo cual puede iniciarse una nueva migración. 

NOTA: La puerta del módulo de migración permanece bloqueada durante todas las etapas de la migración. 

II. PUESTA EN MARCHA DEL PROCESADO DEL GEL 

1. Abrir la puerta del módulo de migración. 

2. Extraer el aplicador y desechar. 

3. Elevar ambos soportes, extraer las esponjas tamponadas por sus extremos de plástico y desechar. 

4. Extraer el gel seco para su procesado posterior. 

5. Limpie con cuidado los electrodos y la placa de control de la temperatura con un pañuelo de papel suave empapado en agua destilada o 

desionizada. 

Asegúrese de que los electrodos y la placa estén secos antes de volver a usarlos. 

IMPORTANTE : Los electrodos deben limpiarse sistemáticamente después de cada uso. 

6. Abrir el Soporte del Gel. Dejarlo en una superficie plana y encajar el gel seco (con la superficie de agarosa hacia arriba) en las muescas de 

los dos cilindros y cerrar el soporte. Asegurarse que el gel está posicionado correctamente en su soporte (Fig. 5). 

7. Colocar el soporte del gel en el Módulo de Tinción / Procesado. 

IMPORTANTE: Antes de iniciar el programa de tinción / procesado del gel, comprobar lo siguiente: 

- el contenedor de colorante contiene 300 ml de solución de tinción ; 

- el contenedor de decolorante contiene al menos 1 litro de solución decolorante ; 

- el contenedor de desechos está vacío. 

Para conocer en qué posiciones conectar los reactivos : consultar la información que aparece en la pantalla del instrumento (seleccionar la 

tecla : VER CANALES). 

IMPORTANTE : No olvidar bloquear los canales no utilizados. 

8. Seleccionar el programa de tinción «PROT./B1-B2/Hb» en el menú del instrumento e iniciar el ciclo presionando la tecla «START» (flecha 

verde de la parte derecha del teclado). 

Durante todas las secuencias de coloración, decoloración y secado, el sistema permanece bloqueado. 

Después del enfriamiento de la cubeta, una señal sonora (bip) suena y el sistema se desbloquea (la ventilación se mantiene hasta la 

recuperación del porta-films). 

III. FINALIZACIÓN DEL PROCESADO DEL GEL 

1. Extraer el soporte del gel de su compartimento, abrirlo y extraer el gel seco. 

NOTA : Si se observan manchas azules residuales en los geles después de la coloración / decoloración, una etapa de lavado suplementario 

con el programa " LAV. ISOENZ/GEL " permite eliminarlas o atenuarlas (según su intensidad) antes de su lectura en densitómetro o escáner. 

2. Si es necesario, limpiar la superficie trasera (la cara del soporte plástico) del gel seco con un papel suave humedecido. 

3. Realizar la densitometría a 570 nm o con un filtro amarillo. Cuando se usen los densitómetros HYRYS o DVSE, posicionar la fracción A 2 

en 

la marca de 5 mm de la placa de barrido: el cero de lectura se realiza entre las bandas de A 2 

y de anhidrasa carbónica, en el punto más bajo. 

NOTA: Para asegurar unos resultados exactos y consistentes, realizar lo siguiente: 

- Ajustar la longitud de barrido con tal de incluir el patrón electroforético completo (≈ 30 mm). 

- Asegurarse que los mínimos en ambos lados de la fracción A 2 

están situados en los valles del pico A 2 

. 

Es una buena práctica efectuar la lectura densitométrica de los geles teñidos sin dilación. Para futuras consultas, se pueden almacenar en 

una cubierta protectora en un lugar seco y oscuro, alejado de fuentes de calor e interpretar visualmente en el plazo de 3 meses. 

RESULTADOS 

Control de calidad 

Se aconseja incluir una sangre control valorada o una muestra de sangre valorada que contengan hemoglobinas A, F, C y S en cada análisis de 

muestras. 

Valores 

El barrido densitométrico de los electroforetogramas teñidos proporciona las concentraciones relativas (porcentajes) de las fracciones individuales de 

hemoglobina. 

Los valores normales (media) en los geles HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) han sido establecidos a partir de una población sana de 200 adultos 

(hombres y mujeres): 

Hemoglobina A ≥ 96.5 % 

Hemoglobina F < 2.0 % (*) 

Hemoglobina A 2 

≤ 3.5 % 

(*) ver Interferencias y Limitaciones. 

Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de normalidad. 

- 43 -


Interpretación 

1. Anormalidades cualitativas : Hemoglobinopatías 

La mayoría de hemoglobinopatías son debidas a la sustitución por mutación de un solo aminoácido en uno de los cuatro tipos de cadenas 

polipeptídicas. El significado clínico de tales cambios depende del tipo de aminoácido involucrado y de su posición. En enfermedades clínicamente 

significativas, pueden estar afectadas las cadenas α o ß. 

Se han descrito más de 200 variantes de hemoglobina en adultos. Las primeras hemoglobinas anormales estudiadas y de aparición más frecuente 

tienen una carga eléctrica neta alterada, lo que facilita su detección mediante electroforesis. 

Existen cuatro hemoglobinas anormales principales que presentan un interés clínico particular: S, C, E y D. 

Los kits HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) están destinados a la identificación preliminar de las hemoglobinopatías y talasemias. Una vez que se 

observe un patrón anormal, su identidad debería ser confirmada mediante las pruebas discriminatorias apropiadas, tales como la electroforesis en 

geles de agarosa ácidos. 

Hemoglobina S 

La hemoglobina S es la más frecuente. Se produce por la sustitución de un ácido glutámico (aminoácido ácido) de la cadena ß por una valina 

(aminoácido neutro). Su movilidad electroforética se ve, por tanto, disminuida. En los HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) tamponados alcalinamente, 

la hemoglobina S migra entre las fracciones A y A 2 

. 

Hemoglobina C 

Un ácido glutámico de la cadena ß está sustituido por una lisina (aminoácido básico): su movilidad se ve fuertemente reducida. En los HYDRAGEL 

7/15 HEMOGLOBIN(E), C, E y A 2 

se superponen. Cuando esta fracción es > 15 %, debe sospecharse la presencia de hemoglobinas C y E. 

Hemoglobina E 

Un ácido glutámico de la cadena ß está sustituido por lisina: la hemoglobina E migra exactamente igual que la hemoglobina C en los 

HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E). Al contrario de la hemoglobina C, no se separa de la hemoglobina A en tampón ácido [HYDRAGEL 

7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)]. Esta propiedad permite diferenciar E y C. 

Hemoglobina D 

Un ácido glutámico de la cadena ß está sustituido por glutamina. En los HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E), esta hemoglobina migra exactamente 

igual que la hemoglobina S. Al contrario de la hemoglobina S, la hemoglobina D no se separa de la hemoglobina A en tampón ácido [HYDRAGEL 

7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)]. Esta propiedad permite diferenciar S y D. 

2. Anormalidades cuantitativas: Talasemias 

Las talasemias constituyen un grupo bastante heterogéneo de enfermedades genéticas caracterizadas por la disminución en la síntesis de un tipo de 

cadena polipeptídica. El mecanismo molecular de este descenso sigue sin estar, hoy día, completamente descrito. 

Hay dos tipos de síndromes talasémicos: 

Talasemias Alfa 

Se caracterizan por una disminución en la síntesis de las cadenas α, que afecta por consiguiente a la síntesis de todas las hemoglobinas normales. 

El exceso de síntesis de las cadenas ß y γ en relación con la de las cadenas α induce la formación de tetrámeros sin cadena α: 

• hemoglobina Bart = γ 4, 

• hemoglobina H = ß 4. 

Talasemias Beta 

Se caracterizan por un descenso en la síntesis de las cadenas ß. Sólo la síntesis de hemoglobina A se ve afectada. 

Por tanto, los porcentajes de hemoglobina F y hemoglobina A 2 

se incrementan con respecto a la hemoglobina A. 

3. Patrones de migración 

Migración de 

hemoglobinas normales 

A(A 0 

+ A 1 

) A (A 0 

+ A 1 

) 

F 

S - D 

A 2 

A 2 

- C - E 

Migración de las hemoglobinas 

anormales principales 

anhidrasa 

anhidrasa 

punto applicación 

A 0 

: fracción no glicada de la hemoglobina A normal del adulto. 

A 1 

: fracción glicada de la hemoglobina A normal del adulto. 

Interferencias y Limitaciones 

• No usar muestras de sangre hemolisadas 

• Cuando se detecte una hemoglobina anormal que se comporte de forma distinta a como lo hacen las variantes de la hemoglobina principales S, 

C, D y E, usar otros métodos de identificación (por ejemplo, la electroforesis de las cadenas de globina), o consultar o enviar la muestra a un 

laboratorio especializado. 

• La valoración densitométrica de la Hb F (o de cualquier otra hemoglobina minoritaria que migre en la proximidad de las fracciones principales) es 

semicuantitativa en la medida que los valores se vuelven imprecisos cuando están por debajo de un 2 % - 3 % de la hemoglobina total. 

• Las muestras de ciertos pacientes con una hemoglobina S homocigota y tratados con Hydrea® (hydroxycarbamida) pueden presentar una 

hemoglobina F, cuya síntesis ha sido inducida por el tratamiento. En algunos casos se ha observado que esta hemoglobina F inducida tiene una 

movilidad, en los geles HYDRAGEL 7 & 15 HEMOGLOBIN(E), ligeramente diferente a la de la hemoglobina F nativa. 

• En algunas muestras que hayan sido conservadas más de 7 días, el rastro situado detrás de la fracción Hb A puede concentrarse, aunque esta 

fracción no debe confundirse con una variante de la hemoglobina, por ejemplo, las hemoglobinas H o Bart. 

Resolución de problemas 

Avisar al Servicio de Atención Técnica del distribuidor cuando la prueba falla a pesar de haber seguido cuidadosamente las instrucciones para la 

preparación y almacenaje de los materiales, y para el procedimiento a seguir. 

Las hojas de seguridad de los diferentes reactivos del kit, así como las informaciones relativas a la eliminación de los desechos, están disponibles 

en el Servicio de Asistencia Técnica de su distribuidor. 

- 44 -


CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS 

Todos los datos de funcionamiento están basados en un estudio que incluyó materiales e instrumentos SEBIA HYDRAGEL y un sistema comercial 

comparable de geles de agarosa. Además, se hicieron unos estudios de concordancia en los que la identidad de las hemoglobinas y sus valores 

fueron establecidos mediante otros métodos reconocidos. 

Todas las separaciones electroforéticas fueron interpretadas visualmente. Se usó el densitómetro HYRYS de SEBIA en todas las evaluaciones 

densitométricas para complementar los datos visuales. 

Los resultados de los ejemplos representativos de los estudios de funcionamiento se presentan aquí. Los valores, medias, SD y CV individuales se 

muestran más abajo. Globalmente, los resultados indican una muy buena reproducibilidad en todos los aspectos probados, siendo 2.4 % el valor 

medio de CV con el programa de migración «7 / 15 Hb» . Los resultados fueron parecidos con el programa de migración «7 / 15 Hb F-S» . 

Reproducibilidad Intraserial 

Tres muestras de sangre se sometieron a electroforesis en geles HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) del mismo lote. Cada muestra se analizó en los 

15 carriles de un único gel. La tabla siguiente muestra las medias, SD y CV de cada componente individual de la hemoglobina en las tres muestras, 

que fueron calculados a partir de los valores densitométricos en tanto por ciento de cada carril. Además, ninguna de las réplicas mostró valores falsos 

positivos o falsos negativos. 

| COMPONENTE | MEDIA (%) | SD | CV (%) | 

Sangre normal Hb A 97.6 0.2 0.2 | 

| Hb A 2 

| 2.4 | 0.2 | 7.7 

| 

| Hb A 2 

elevada | Hb A 95.3 0.2 0.2 | 

| Hb A 2 

| 4.7 | 0.2 | 5.0 

| 

| Hb C elevada | Hb A 57.8 0.4 0.7 | Hb C | 42.2 | 0.4 | 0.9 | 

Reproducibilidad Interserial 

Se sometieron a electroforesis quince (15) muestras de sangre en geles HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) de un solo lote. Las muestras analizadas 

incluían nueve muestras con una hemoglobina anormal (Hb S, Hb F o Hb C) y cinco muestras con la Hb A 2 

elevada. Las medias, SD y CV se 

calcularon a partir de los datos obtenidos de cada componente en cada muestra. Las gamas de las medias, SD y CV, y el CV medio que representa 

el conjunto de componentes individuales están tabulados más abajo. Además, ninguna de las réplicas mostró valores falsos positivos o falsos 

negativos. 

COMPONENTE MEDIA (%) SD CV (%) CV MEDIO (%) Hb A 21.6 – 98.0 0.1 – 0.6 0.1 – 2.4 0.7 Hb F 14.1 – 73.0 0.5 0.7 – 3.4 1.6 Hb C/E 20.0 – 42.4 0.3 0.7 – 1.3 1.0 Hb S/D 8.8 – 83.6 0.2 – 0.6 0.7 – 2.1 1.1 

| Hb A 2 

| 2.0 – 5.4 | 0.1 – 0.2 | 1.3 – 9.9 | 4.8 | 

Exactitud – Detección de Anomalías de la Hemoglobina 

Se analizaron sesenta y tres (63) muestras de sangre diferentes usando el procedimiento HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) y otro sistema comercial 

de geles de agarosa. Las muestras de sangre y su evaluación diagnóstica fueron proporcionados por un hospital. El diagnóstico estaba basado en 

una electroforesis de rutina en gel alcalino o en gel ácido y/o HPLC. Todas las hemoglobinas anormales o los niveles anormales de hemoglobinas 

normales detectados con el procedimiento HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) coincidieron con los obtenidos con el sistema de geles comparado, los 

resultados del hospital y el diagnóstico clínico. No se observó ningún caso de falso positivo, es decir, la detección de una banda anormal o de un nivel 

anormal de una banda normal cuando no existe tal anomalía. 

Exactitud – Determinación cuantitativa de la Hb A 2 

Los niveles de Hb A 2 

se midieron en 51 muestras de sangre con niveles de Hb A 2 

normales y elevados mediante densitometría de las separaciones 

electroforéticas obtenidas en los geles HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). Los valores medidos obtenidos con ambos procedimientos se analizaron 

mediante un procedimiento estadístico de regresión lineal. Los resultados del análisis de regresión lineal están tabulados más abajo (y = HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E)). 

| Coeficiente de Correlación | Intersección en y | Pendiente | Gama de valores en % | 

| | | | (sistema de SEBIA) | 

| 0.981 | 0.103 | 0.906 | 1.7 – 5.6 | 

Linealidad 

Se mezclaron dos muestras de sangre en diferentes proporciones y las diluciones fueron sometidas a electroforesis en un gel HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E). 

Se determinó que la prueba fue lineal en todo el rango estudiado. 

- 45 -


BIBLIOGRAFÍA 







860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


- 46 -


UTILIZAÇÃO 

Os kits HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) e HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) destinam-se à separação das hemoglobinas normais (A e A 2 

) e à 

detecção das principais hemoglobinas anómalas: S ou D e C ou E, por electroforese em geles de agarose no aparelho semi-automático HYDRASYS. 

A electroforese é feita no hemolisado da lavagem dos glóbulos vermelhos. O sistema HYDRASIS permite realizar todas as sequências até à obtenção 

do gel para identificação das diferentes hemoglobinas. As hemoglobinas são separadas em meio alcalino (pH 8,5) e coradas com uma solução de 

negro de amido. O excesso de corante é eliminado com uma solução ácida. As electroforeses resultantes podem ser analisadas visualmente ou ser 

avaliadas por densitómetria, o que dá uma quantificação relativa e precisa das hemoglobinas com interesse particular, tais como a hemoglobina A 2 

no diagnóstico da ß-talassémia. A electroforese em meio ácido, como por exemplo o HYDRAGEL 7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E), permite confirmar 

a identificação das variantes da hemoglobina, em especial para diferenciar a Hb S da Hb D e a Hb E da Hb C. 

Cada gel de agarose poderá analisar: 

• 7 amostras no kit HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), 

• 15 amostras no kit HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

Para diagnóstico in vitro. Registado no INFARMED. 

PRINCÍPIO DO TESTE (1,3,7) 

A hemoglobina é uma molécula complexa composta por dois pares de cadeias polipeptídicas, idênticas duas a duas. Cada cadeia está ligada ao 

heme, um núcleo tetrapirrólico (porfirina), ligado a um átomo de ferro. A parte do heme é comum a todas as hemoglobinas e suas variantes. O tipo 

de hemoglobina é determinado pela parte da proteína, chamada globina. As cadeias polipeptídicas α, ß, d e γ constituem as hemoglobinas humanas 

normais: 

• hemoglobina A………………………… = α 2 ß 2 

• hemoglobina A 2 

……………………… = α 2 δ 2 

• hemoglobina fetal F ………………… = α 2 γ 2 

A cadeia α é comum a estas três hemoglobinas. 

A estrutura espacial da hemoglobina e outras propriedades moleculares (como as de todas as proteínas) depende da natureza e da sequência dos 

aminoácidos que formam as cadeias. A substituição dos aminoácidos por mutação é responsável pela formação de variantes de hemoglobina, que 

têm diferentes cargas superficiais e, consequentemente, diferentes mobilidades electroforéticas, também dependentes do pH, da força iónica do 

tampão e da natureza do suporte. 

As anomalias das hemoglobinas são de dois tipos: 

• anomalias qualitativas (ou estruturais) resultantes são designadas por hemoglobinopatias ; 

• anomalias quantitativas (ou de regulação), provocadas por diminuição da síntese de uma das cadeias de hemoglobina, são designadas por 

talassémias. 

REAGENTES E MATERIAIS FORNECIDOS NOS KITS HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) E HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) 

ITEM REF. N° 4106 REF. N° 4126 Geles de agarose (prontos a usar) 10 geles 10 geles Tiras de tampão (prontas a usar) 10 pacotes de 2 10 pacotes de 2 Diluente da solução corante (solução concentrada) 1 frasco, 60 ml 1 frasco, 60 ml Negro de amido (solução concentrada) 1 frasco, 20 ml 1 frasco, 20 ml Solução hemolisante (pronto a usar) 1 frasco, 20 ml 1 frasco, 20 ml Aplicadores (prontos a usar) 1 caixa de 10 (7 dentes) 1 caixa de 10 (15 dentes) 

| Papéis de filtro finos | 1 pacote de 10 | 1 pacote de 10 | 

PARA OPTIMIZAÇÃO DOS RESULTADOS 

Os elementos de um mesmo kit devem ser utilizados em conjunto, e de acordo com as instruções de utilização. 

LER ATENTAMENTE AS INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO. 

1. GELES DE AGAROSE 

Preparação 

Os geles de agarose estão prontos a usar. Cada gel contém: agarose, 8 g/l ; tampão alcalino pH 8,5 ± 0,1 ; aditivos, não perigosos nas concentrações 

usadas, necessários para optimizar o ensaio. 

Utilização 

Meio de suporte para a electroforese das hemoglobinas. 

Armazenamento, estabilidade e sinais de deterioração 

Armazenar os geles horizontalmente, na embalagem protectora de origem, à temperatura ambiente (15 - 30 °C) ou no frigorífico (2 - 8 °C). (A seta 

existente na parte da frente da caixa do kit deve estar voltada para cima). São estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit e nos rótulos 

das embalagens dos geles. Evitar variações da temperatura durante o armazenamento (ex: não armazenar perto de uma janela ou de uma fonte de 

calor). 

NÃO CONGELAR! 

Deitar fora o gel quando: 

(i) houver cristais ou precipitados na superfície do gel ou quando a textura do mesmo fôr muito macia (isto sucede se o gel for congelado) ; 

(ii) há desenvolvimento de bactérias ou fungos ; 

(iii) estiver presente uma quantidade anormal de líquido na embalagem do gel (resultante da exsudação do gel devido a condições de 

armazenamento inadequadas). 

- 47 - 

INSTRUÇÕES DE USO SEBIA - Português


2. TIRAS DE TAMPÃO 

Preparação 

As tiras de esponja com tampão estão prontas a usar. Cada uma contém: tampão tris-barbital pH 9,2 ± 0,2 ; azida de sódio ; aditivos, não perigosos 

nas concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio. 

Utilização 

As tiras de tampão funcionam como reservatório de tampão da electroforese e asseguram o contacto entre o gel e os eléctrodos. 


As tiras de tampão podem ser conservadas à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C). 

As tiras de tampão devem ser conservadas horizontalmente dentro da embalagem protectora (a seta na parte da frente da caixa deve permanecer 

apontada para cima). 

As tiras são estáveis até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou na embalagem protectora das tiras. NÃO CONGELAR. 

3. DILUENTE DA SOLUÇÃO CORANTE 

Preparação 

O diluente da solução corante deverá ser utilizado como está descrito no parágrafo " SOLUÇÃO CORANTE NEGRO DE AMIDO ". 

Contém uma solução ácida. 

Utilização 

Para a preparação das soluções de corante negro de amido. 


Armazenar o diluente à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco. NÃO 

CONGELAR. 

Não adicionar azida de sódio. 

4. CORANTE NEGRO DE AMIDO 

Preparação 

O corante negro de amido concentrado, é uma solução viscosa que pode eventualmente gelificar, o que não afecta nada a qualidade da solução final 

e o seu poder de coloração. 

Em qualquer caso, para obter uma perfeita reconstituição do corante, é necessário que seja respeitado o procedimento seguinte: 

1. Adicionar cerca de 15 ml do diluente do corante ao frasco do negro de amido concentrado. 

2. Fechar cuidadosamente o frasco. 

3. Agitar muito vigorosamente o frasco durante pelo menos 5 segundos. 

4. Transferir esta solução para o recipiente de preparação da solução de coloração. 

5. Repetir esta etapa duas vezes ou se necessário 3 vezes. 

6. Transferir o diluente restante para o recipiente de preparação da solução de coloração. 

7. Completar o volume para 300 ml com água destilada ou desmineralizada. 

8. Agitar muito bem esta solução durante 5 a 10 minutos. 

A solução corante está pronta a utilizar. 

Após diluição, a solução de corante contém: solução ácida pH ≈ 2 ; negro de amido, 4 g/l ; etilenoglicol, 6,7% ; aditivos, não perigosos nas 

concentrações usadas, necessários para optimizar o ensaio. 

AVISO: Nocivo em caso de ingestão. 

Utilização 

Para corar geles depois da electroforese das proteínas. 

IMPORTANTE : A solução corante é unicamente destinada à coloração de 10 geles. Recomenda-se a renovação da solução após as 10 utilizações. 


Armazenar a solução de corante concentrada e a solução diluída à temperatura ambiente ou no frigorífico em frascos fechados para evitar a evaporação. 

A solução concentrada é estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou nos rótulos dos frascos. 

A solução diluída de corante é estável por um mês. 

Não guardar a solução de trabalho do corante próximo de uma fonte de calor. 

5. SOLUÇÃO HEMOLISANTE 

Preparação 

A solução hemolisante vem pronta a ser utilizada. Trata-se de um tampão com aditivos, não perigosos nas concentrações utilizadas, necessários para 

optimizar o ensaio. 

Utilização 

Para hemolisar os glóbulos vermelhos do sangue. 


Armazenar a solução hemolisante à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do 

frasco da solução hemolisante. 

Deitar fora a solução hemolisante se o seu aspecto se alterar, isto é, se ficar turva devido a contaminação microbiana. 

6. APLICADORES 

Utilização 

Aplicadores pré-cortados, de utilização única, para aplicação das amostras. 


Armazenar os aplicadores em local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico. 

7. PAPEL DE FILTRO 

Utilização 

Pré-cortados, de utilização única, estes finos papéis absorventes destinam-se à absorção do excesso de líquido da superfície do gel antes da 

aplicação da amostra. 

Armazenamento 

Armazenar os papéis de filtro finos num local seco à temperatura ambiente ou no frigorífico. 

- 48 -


REAGENTES NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 

1. SOLUÇÃO DESCORANTE 

Preparação 

Cada frasco de solução descorante concentrada (SEBIA, ref. n° 4540, 10 frascos de 100 ml cada) deve ser diluída a 1/1000 com água destilada ou 

desmineralizada e permite obter 100 litros de solução total. É conveniente diluir apenas 5 ml da solução concentrada de cada vez, para o volume 

final de 5 litros (a capacidade do recipiente onde se vai colocar a solução descorante). Após diluição, a solução descorante contém: ácido cítrico ; 

0,5 g/l. 

Utilização 

Na descoloração, isto é, remoção do excesso de corante do gel. No enxaguamento da câmara de coloração, após lavagem. Para neutralizar a acidez 

do descorante, colocar no frasco de despejo 15 ml de soda a 50 % (solução disponível comercialmente). 


Armazenar a solução descorante concentrada à temperatura ambiente ou no frigorífico. É estável até ao fim da validade indicada na caixa do kit ou 

nos rótulos dos frascos da solução descorante. A solução descorante diluída é estável por uma semana à temperatura ambiente, quando conservada 

em recipiente fechado. Não adicionar azida de sódio. 

Deitar fora a solução diluída se se notarem alterações no seu aspecto, por exemplo, se se tornar turva devido a contaminação microbiana. 

Em caso de conservação mais prolongada da solução diluída (superior a uma semana), adicionar 50 µl/l de ProClin 300 para evitar qualquer 

proliferação microbiana. 

A solução descorante diluída contendo ProClin é estável à temperatura ambiente (de 15 a 30 °C) ou no frigorífico (entre 2 e 8 °C). É estável até ao 

fim da validade indicada na caixa do kit ou no rótulo do frasco do descolorante. 

2. SOLUÇÃO DE LAVAGEM HYDRASYS 

Preparação 

Cada frasco de solução de lavagem concentrada HYDRASYS (SEBIA, ref. n° 4541, 10 frascos de 80 ml cada) deve ser diluído para a obtenção do 

volume final de 5 litros com água destilada ou desmineralizada. Após diluição, a solução de lavagem contém: tampão alcalino pH 8,8 ± 0,3 ; azida de 

sódio. 

AVISO: A solução de lavagem contem 0,625 % de azida de sódio. Não ingerir! Se ingerida, consultar imediatamente um médico! Quando em 

contacto com ácidos, chumbo ou cobre a azida de sódio pode levar à formação de compostos explosivos ou tóxicos. Quando deitar fora 

lavar abundantemente com grandes quantidades de água. 

Utilização 

Para a lavagem da câmara de coloração do HYDRASYS. Utilizar periodicamente. Por exemplo, se o aparelho for utilizado diariamente, fazer a 

lavagem da câmara de coloração uma vez por semana. 

Ver as instruções de utilização incluídas na embalagem. 


Armazenar a solução concentrada e a solução diluída em recipientes fechados à temperatura ambiente ou no frigorífico. A solução concentrada é 

estável até ao fim da validade indicada no rótulo do frasco da solução de lavagem. 

Deitar fora a solução de lavagem diluída se se notarem alterações no seu aspecto, por exemplo, se se tornar turva devido a contaminação microbiana. 

3. SORO FISIOLÓGICO 

Preparação 

Preparar uma solução a 0,15 M (9 g/l) de NaCl em água destilada ou desmineralizada. 

Utilização 

Para lavar os glóbulos vermelhos. 


Armazenar à temperatura ambiente ou no frigorífico. Deitar fora após 3 meses ou se notar alterações no seu aspecto, por exemplo, se se tornar turva 

devido a contaminação microbiana. Para conservar por períodos de tempo mais alargado, adicionar azida de sódio (1 g/l). 

EQUIPAMENTO E ACESSÓRIOS NECESSÁRIOS 

1. Sistema SEBIA HYDRASYS, ref. n° 1210 ou ref. n° 1211. 

2. HYDRAPLUS SEBIA, ref. n° 1215, micropipetador, manual ou automático, como alternativa na pipetagem das amostras para os aplicadores 

respectivos. 

3. Câmara húmida fornecida com o sistema HYDRASYS, ref. n° 1270. 

4. Frascos de plástico fornecidos com o HYDRASYS. 

5. Pipetas: 10 µl e 200 µl. 

6. Densitómetro / scanner capaz de ler geles de 82 x 51 mm ou 82 x 102 mm a 570 nm ou com filtro amarelo ; ex: HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA ou 

scanner PHORESIS SEBIA. Para a sua utilização e calibração seguir as instruções de cada aparelho. 

7. Suporte de gel para meios geles, SEBIA, ref. n° 10043110. 

AMOSTRAS 

Colheita e conservação de amostras 

É recomendada a utilização de amostras de sangue frescas colhidas com anticoagulante. Podem ser usados tubos de colheita contendo como 

anticoagulante EDTA, citratos ou heparina ; evitar os que contenham iodoacetatos. O sangue deve ser colhido de acordo com os métodos utilizados 

nos laboratórios de análises clínicas. Se necessário, armazenar entre 2 - 8 °C até cinco dias. 

Preparação das amostras 

• Homogeneize o tubo de colheita antes de retirar o sangue total a preparar. 

• Centrifugar o sangue anticoagulado a 5000 rpm durante 5 minutos. 

• Deitar fora o plasma. 

- 49 -


• Lavar as células vermelhas 2 vezes com 10 volumes de soro fisiológico ; deve ser tomado o maior cuidado quando se estiver a manipular volumes 

de glóbulos vermelhos inferiores a 10 µl. 

• Elimine o excesso de solução salina que se encontra como sobrenadante dos glóbulos vermelhos e agite-os no vórtex antes de extrair 10 µL para 

hemólise. 

• Hemolisar 10 µl de glóbulos vermelhos compactados com 130 µl de solução hemolisante. 

• Agitar no vortex durante 10 segundos e incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 

NOTAS: 

- Para preparar um hemolisado de indivíduos levemente anémicos (aproximadamente 0,1 g/ml de Hb) ou muito anémicos (< 0,07 g/ml de Hb), o 

volume de glóbulos vermelhos (obtidos após centrifugação), pode ser aumentado para 15 µl e 20 µl, respectivamente. Como consequência, a 

intensidade da coloração vai aumentar, mas as concentrações relativas das fracções individuais mantém-se inalteradas. 

- O hemolisado não precisa de ser filtrado ou centrifugado. 

- A solução hemolisante SEBIA não afecta a hemoglobina instável de Bart. 

Preparação das amostras para a detecção de hemoglobina H 

- Homogeneize o tubo de colheita antes de retirar o sangue total a preparar. 

- Centrifugar o sangue total durante 5 minutos a 5000 rpm. 

- Eliminar o plasma 

- Lavar os glóbulos vermelhos duas vezes em 10 volumes de soro fisiológico. Os volumes de glóbulos vermelhos inferiores a 10 µl devem ser 

manipulados com precaução. 

- Elimine o excesso de solução salina que se encontra como sobrenadante dos glóbulos vermelhos e agite-os no vórtex antes de extrair 40 µL para 

hemólise. 

- Hemolisar 40 µl de glóbulos vermelhos com 100 µl de solução hemolisante. 

- Agitar no vórtex durante 10 segundos, depois incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 

- Centrifugar o hemolisado durante 5 minutos a 10000 rpm. 

- A análise é efectuada com o sobrenadante deste hemolisado com o programa de migração “7/15 Hb”. 

TÉCNICA 

O sistema HYDRASYS é um aparelho semi-automático multi-paramétrico. Os passos automáticos incluem o tratamento dos geles de agarose 

HYDRAGEL segundo as etapas seguintes: aplicação da amostra, migração electroforética, secagem, coloração, descoloração e secagem final. Os 

passos manuais são os seguintes: preparação das amostras e dos geles e lançamento das sequências automáticas. 

LER ATENTAMENTE O MANUAL DE INSTRUÇÕES DO HYDRASYS. 

I. PREPARAÇÃO DA MIGRAÇÃO 

1. Ligar o aparelho HYDRASYS. 

2. Colocar um aplicador numa superfície plana com os números dos poços voltados para cima (Fig. 1): 

- Aplicar 10 µl de amostra hemolisada em cada poço. A pipetagem das amostras não deve ultrapassar o tempo de dois minutos. 

- Colocar o aplicador na câmara húmida com os dentes voltados para cima. (Segure-o pela estrutura de protecção de plástico). Deixar as 

amostras difundirem-se pelos dentes durante cinco minutos após a aplicação da última amostra. 

Ver instruções da câmara húmida para mais informações. 

3. Abrir a tampa da câmara de migração e levantar os suportes do aplicador e dos eléctrodos. 

AVISO: Nunca fechar a tampa quando os suportes estão levantados! 

4. Seleccionar o programa de migração “7/15 Hb” no menu apresentado pelo aparelho (lado esquerdo do teclado). 

Nota: Nos casos em que é necessária uma melhor separação de Hb F – Hb S no gel HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E), recomenda-se a 

selecção do programa de migração “7/15 Hb F-S”. Este programa destina-se apenas a uma análise qualitativa. 

5. Retirar as tiras de tampão da embalagem ; colocar as tiras de tampão sobre os eléctrodos fixando as extremidades de plástico perfuradas aos 

pinos do suporte dos eléctrodos. A face das tiras de tampão onde estão fixadas as partes de plástico fica em contacto com os eléctrodos (Fig. 2). 

6. Desempacotar a placa HYDRAGEL. 

- Eliminar rapidamente o excesso de líquido da superfície do gel com a ajuda de um papel de filtro fino. 

ATENÇÃO: Não deixar o papel de filtro em contacto prolongado com o gel, para evitar a sua desidratação. 

- Aplicar 120 µl de água destilada ou desmineralizada para o HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) ou 200 µl para o HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E) no terço inferior do quadro impresso na placa de migração. 

- Colocar o gel virado para cima, contra a parte inferior do quadro impresso na placa de migração (Fig. 3). 

- Dar uma forma côncava ao gel (Fig. 3) e baixá-lo lentamente até contacto com a gota de água. A gota deve repartir-se por toda a largura 

do gel. Ajustar ligeiramente o gel de modo a eliminar as bolhas de ar que se tenham formado. Baixar o gel até ficar na horizontal. 

7. Baixar os dois suportes. Nesta posição as tiras de tampão não tocam no gel. NÃO FORÇAR A DESCIDA DOS SUPORTES MANUALMENTE. 

8. Retirar o(s) aplicador(es) da câmara húmida. Segurá-lo(s) pela estrutura de protecção plástica. 

- Quebrar e retirar a protecção dos dentes. 

- Colocar o aplicador na posição n° 4 do suporte dos aplicadores para o programa de migração “7/15 Hb”ou na posição n° 3 para o programa 

de migração “7/15 Hb F-S”. 

IMPORTANTE: Os números impressos nos aplicadores devem ficar virados para o operador (Fig. 4). 

9. Fechar a tampa da câmara de migração. 

10. Dar início imediatamente ao processo apoiando em "START" (flecha verde situada no lado esquerdo do teclado). 

IMPORTANTE: Assegure-se de que a grelha de ventilação não está bloqueada (à direita do aparelho). 

- 50 -


MIGRAÇÃO - DESCRIÇÃO DOS PASSOS AUTOMÁTICOS 

• Descida dos suportes do aplicador e dos eléctrodos de forma a que as tiras de tampão e o aplicador contactem com a superfície do gel. 

• Subida do aplicador de amostras. 

• A migração é feita à potência constante de 340 V, a 25 °C, controlada por efeito de Peltier, até que tenham sido atingidos 65 Vh (durante cerca de 

12 minutos, programa “7/15 Hb”) ou até 85 Vh (durante 15 minutos, programa “7/15 Hb F-S”). 

• Os eléctrodos são desligados com a subida do suporte. 

• Secagem do gel a 50 °C durante cerca de 15 minutos. 

• Ouve-se um sinal sonoro que indica que a tampa da câmara de migração foi desbloqueada. A temperatura da placa permanece a 50 °C até que a 

tampa seja aberta. Depois, a temperatura continua a decrescer até chegar aos 25 °C (em menos de 5 minutos). Pode dar-se início a um novo 

processo de migração. 

NOTA: A tampa da câmara de migração permanece fechada durante todos os passos da migração. 

II. PREPARAÇÃO DO SISTEMA DE TRATAMENTO DO GEL 

1. Abrir a tampa. 

2. Remover o aplicador e deitá-lo fora. 

3. Levantar os suportes, retirar as tiras de tampão pegando-lhes pelas suas extremidades de plástico e deitá-las fora. 

4. Retirar o gel para tratamento posterior. 

5. Limpar cuidadosamente os eléctrodos e a placa de migração com um papel macio embebido em água. 

Vertifique-se que os eléctrodos e a placa estão bem secos antes de os voltar a utilizar. 

IMPORTANTE: Os eléctrodos devem ser limpos sistematicamente após cada migração. 

6. Colocar o gel no suporte da câmara de coloração (gel virado para cima) da seguinte maneira (Fig. 5): 

- Abrir o suporte. 

- Colocá-lo na bancada. 

- Encaixar o gel nas ranhuras existentes. 

- Fechar o suporte. 

- Verificar se o gel está bem encaixado. 

7. Colocar o suporte do gel na câmara de coloração. 

IMPORTANTE: Antes de dar início ao programa de coloração do gel, verificar o seguinte: 

- se o frasco do corante está cheio com 300 ml de solução corante ; 

- se o frasco de descorante contem pelo menos 1 litro de solução descorante ; 

- se o frasco de despejo está vazio. 

Para seleccionar os canais de entrada dos reagentes: consultar a informação indicada no ecrã do aparelho (premir a tecla: "VER CANAIS"). 

IMPORTANTE: Não esquecer de tapar os canais não utilizados. 

8. Seleccionar o programa de coloração "PROT./B1-B2/Hb" no menu do aparelho. Iniciar a operação premindo a tecla "START" (flecha verde 

no lado direito do teclado). 

Durante as sequências de coloração, descoloração e secagem, o sistema permanece fechado. Após arrefecimento da câmara, ouve-se um 

sinal sonoro e o sistema desbloqueia (a ventilação mantém-se até que se retire o suporte do gel). 

III. FINALIZAÇÃO DO TRATAMENTO DO GEL 

1. Retirar o suporte da câmara, abrir e remover o gel seco. 

NOTA: Caso se observem manchas azuis residuais no gel após coloração / descoloração, pode-se realizar uma etapa de lavagem 

suplementar com o programa " LAV. ISOENZ/GEL ", que permite eliminar ou atenuar grandemente as manchas (em termos de intensidade) 

antes da leitura com o densitómetro / scanner. 

2. Se necessário, limpar a parte de trás (o lado do plástico) do gel seco com um papel macio e húmido. 

3. Ler num densitómetro/scanner a 570 nm ou com filtro amarelo. 

Se utilizar os densitómetros HYRYS ou DVSE, posicione a fracção A 2 

na marca de 5 mm da placa de leitura, de modo a colocar o zero no 

ponto mais baixo entre a fracção A 2 

e a fracção anidrase carbónica. 

NOTA: Para garantir resultados mais precisos e coerentes: 

- Regular o comprimento de leitura a 30 mm, de forma a incluir todo o perfil electroforético. 

- Posicionar os mínimos de modo a rodear o valor do A 2 

. 

Recomenda-se analisar os perfis electroforéticos o mais rapidamente possível. Os geles, conservados no escuro, em ambiente seco e ao 

abrigo de todas as fontes de calor, podem ser interpretados qualitativamente num período de 3 meses. 

RESULTADOS (1-8) 

Controlo de qualidade 

É aconselhável incluir uma amostra de sangue de controlo contendo as hemoglobinas A, F, C e S, em cada série de amostras. 

Valores 

A leitura a 570 nm por densitómetria permite definir as concentrações relativas (percentagens) de cada fracção. 

Os valores normais (médios) para cada fracção nos geles HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) foram estabelecidos a partir de uma população 

saudável de 200 adultos (homens e mulheres): 

Hemoglobina A ≥ 96,5 % 

Hemoglobina F < 2,0 % (*) 

Hemoglobina A 2 

≤ 3,5 % 

(*) Ver Interferências e Limitações 

Recomenda-se que cada laboratório estabeleça os seus próprios valores normais. 

- 51 -


Interpretação 

1. Anomalias qualitativas: hemoglobinopatias 

A maioria das hemoglobinopatias deve-se à substituição por mutação de um único aminoácido num dos quatro tipos de cadeias polipeptídicas. O 

significado clínico de tal alteração depende do tipo de aminoácido e do local envolvidos. Em doenças clinicamente significativas, a cadeia α ou a 

cadeia ß estão afectadas. 

Foram descritas mais de 200 variantes de hemoglobina no adulto. As primeiras hemoglobinas anómalas estudadas e as que ocorrem mais 

frequentemente têm a sua carga eléctrica alterada, o que leva a uma fácil detecção por electroforese. 

Existem quatro hemoglobinas anómalas principais que apresentam um interesse clínico particular, do ponto de vista antropológico e médico: S, C, E 

e D. 

O kit HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) destina-se à detecção das hemoglobinopatias e talassémias. Uma vez detectado um perfil electroforético 

anómalo, este deve ser confirmado por electroforese em meio ácido, em geles de agarose. 

Hemoglobina S 

A hemoglobina S é a mais frequente. Deve-se à substituição de um ácido glutâmico da cadeia ß (um aminoácido ácido) por uma valina (aminoácido 

neutro): a sua mobilidade electroforética vai diminuir. Nos geles HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) em meio alcalino, a hemoglobina S migra em 

posição central, entre as fracções A e A 2 

. 

Hemoglobina C 

Um ácido glutâmico da cadeia ß é substituído por uma lisina (aminoácido básico): a sua mobilidade vai diminuir muito. No HYDRAGEL 

7/15 HEMOGLOBIN(E) as fracções C e E ficam sobrepostas à fracção A 2 

. Quando esta fracção é superior a 15 %, deve-se suspeitar das 

hemoglobinas C e E. 

Hemoglobina E 

Um ácido glutâmico da cadeia ß é substituído por uma lisina: a hemoglobina E migra exactamente como a hemoglobina C no HYDRAGEL 

7/15 HEMOGLOBIN(E). Ao contrário do que sucede com a hemoglobina C, não se separa das hemoglobinas A e A 2 

em meio ácido [HYDRAGEL 

7/15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)]. Esta propriedade permite diferenciar as hemoglobinas E e C. 

Hemoglobina D 

Um ácido glutâmico da cadeia ß é substituído por uma glutamina. No HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) esta hemoglobina migra exactamente como 

a hemoglobina S. Ao contrário da hemoglobina S, a hemoglobina D não se separa das hemoglobinas A e A 2 

em meio ácido [HYDRAGEL 7/15 ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E)] ; esta propriedade permite diferenciar as hemoglobinas S e D. 

2. Anomalias quantitativas: Talassémias 

As talassémias constituem um grupo bastante heterogéneo de distúrbios genéticos, caracterizadas por uma diminuição da síntese de um dos tipos 

de cadeias polipeptídicas. O mecanismo molecular desta diminuição ainda está mal conhecido. 

Existem dois tipos de síndromes talassémicos: 

Alfa-talassémias 

Caracterizam-se pela diminuição da síntese das cadeias α, afectando consequentemente a síntese das 3 hemoglobinas fisiológicas. O excesso de 

síntese das cadeias ß e γ em relação às cadeias α leva à formação de tetrâmeros sem cadeia α: 

• hemoglobina Bart = γ 4 

• hemoglobina H = ß 4 

Beta-talassémias 

Caracterizam-se pela diminuição da síntese de cadeias ß. Apenas a síntese da hemoglobina A é afectada. As percentagens de hemoglobina F e A 2 

aumentam em relação à da hemoglobina A. 

3. Perfis electroforéticos 

Migração das 

hemoglobinas normais 

A(A 0 

+ A 1 

) A (A 0 

+ A 1 

) 

F 

S - D 

A 2 

anidrase 

A 2 

- C - E 

anidrase 

Migração das principais 

hemoblobinas anómalas 

ponto de aplicação 

A 0 

: fracção não glicosilada da hemoglobina A normal do adulto. 

A 1 

: fracção glicosilada da hemoglobina A normal do adulto. 

Interferências e limitações 

• Não usar amostras de sangue hemolisadas. 

• Quando uma hemoglobina anómala é detectada, apresentando uma mobilidade electroforética diferente da das principais variantes de 

hemoglobinas S, C, D e E, deve-se utilizar outros meios de identificação (ex: electroforese das cadeias de globinas), ou consultar um laboratório 

especializado. 

• O doseamento de hemoglobina Fetal (Hb F), ou de qualquer outra hemoglobina menor que migre na proximidade de fracções principais, é 

aproximado quando a sua concentração representa menos de 2 a 3 % da total hemoglobina total. 

• As amostras de certos doentes apresentam uma hemoglobina S homozigótica; quando tratadas com Hydrea® (hidroxicarbamida) podem 

apresentar uma hemoglobina F, cuja síntese foi induzida por este tratamento. Em alguns dos casos observados, esta hemoglobina F induzida 

apresentou uma mobilidade nos geles HYDRAGEL 7 & 15 HEMOGLOBIN(E) ligeiramente diferente da apresentada pela hemoglobina F fisiológica. 

• Nas amostras armazenadas há mais de 7 dias, pode observar-se uma banda concentrada em frente à fracção Hb A. Esta banda concentrada não 

deverá ser confundida e interpretada como uma variante da hemoglobina (por exemplo, Hemoglobinas H ou Bart). 

Assistência técnica 

Em caso de maus resultados contactar os serviços técnicos do fornecedor ainda que tenham sido seguidas, escrupulosamente, as instruções para 

a preparação e armazenamento dos reagentes, assim como as instruções de utilização da técnica. 

Estão disponíveis nos Serviços Técnicos da SEBIA fichas de dados de segurança dos diversos reagentes do kit, bem como informação relativa à 

eliminação dos desperdícios. 

- 52 -


CARACTERÍSTICAS DO ENSAIO 

Todas as leituras densitométricas foram efectuadas com o densitómetro HYRYS da SEBIA. Os perfis electroforéticos foram interpretados a olho nú. 

Os resultados obtidos por análise quantitativa (com o programa de migração “7/15 Hb”) indicam uma boa repetibilidade e reproductibilidade da técnica 

HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) em relação a todos os aspectos testados, com um coeficiente de variação médio de 2,4 %. Os resultados são 

semelhantes para a técnica HYDRAGEL 7/15 HEMOGLOBIN(E) com o programa de migração “7/15 Hb F-S”. 

Reprodutibilidade intra-ensaio 

Três amostras de sangue (uma normal, uma com valores elevados de Hb A 2 

e uma amostra com Hb C) foram analisadas repetidamente, à razão de 

15 aplicações por gel, em dois lotes diferentes de geles HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). Os perfis electroforéticos foram analisados por 

densitómetria e a tabela seguinte apresenta os valores médios (em %), DP e CV, obtidos para cada fracção de hemoglobina de cada uma das 

3 amostras. 

NOTA : Os resultados foram concordantes para todas as amostras: 

- Amostras com valores normais de Hb A 2 

apresentaram todos os valores normais. 

- Amostras com valores elevados de Hb C e Hb A 2 

apresentaram todos os valores elevados. 

| FRACÇÃO DE Hb | MÉDIA (%) | DP | CV (%) | 

Sangue normal | Hb A 97,6 0,2 0,2 | 

Hb A 2 

| 2,4 | 0,2 | 7,7 Sangue com Hb A 2 

elevado | Hb A 95,3 0,2 0,2 | 

Hb A 2 

| 4,7 | 0,2 | 5,0 Sangue com Hb C elevado Hb A 57,8 0,4 0,7 | Hb C | 42,2 | 0,4 | 0,9 | 

Reprodutibilidade inter-ensaio 

Quinze amostras de sangue foram sujeitas a electroforese, diariamente, em 10 geles HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) de um mesmo lote. As 

amostras ensaiadas incluíam 9 amostras com uma hemoglobina anormal (Hb S, Hb F ou Hb C) e 5 amostras com um nível elevado de Hb A 2 

. Os 

valores médios (em %), DP e CV, foram calculados, para cada fracção de hemoglobina das amostras. Os limites dos valores médios, DP e CV, e a 

média dos CV representando o conjunto de cada fracção, estão indicados na tabela abaixo. 

NOTA : Os resultados foram concordantes para todas as amostras: 

- Amostras com valores normais de Hb A 2 

apresentaram todos os valores normais. 

- Amostras com valores elevados de Hb A 2 

apresentaram todos os valores elevados. 

FRACÇÃO Hb MÉDIA (%) DP CV (%) MÉDIA CV (%) Hb A 21,6 – 98,0 0,1 – 0,6 0,1 – 2,4 0,7 Hb F 14,1 – 73,0 0,5 0,7 – 3,4 1,6 Hb C/E 20,0 – 42,4 0,3 0,7 – 1,3 1,0 Hb S/D 8,8 – 83,6 0,2 – 0,6 0,7 – 2,1 1,1 

| Hb A 2 

| 2,0 – 5,4 | 0,1 – 0,2 | 1,3 – 9,9 | 4,8 | 

Precisão - Detecção das anomalias da hemoglobina 

Foram analisadas 63 amostras de sangue com o kit HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) e com outro sistema em gel de agarose disponível 

comercialmente. As amostras de sangue e o respectivo diagnóstico clinico, estabelecido por electroforese em geles alcalino e ácido e/ou HPLC, foram 

fornecidas por um hospital. 

Os resultados obtidos mostraram uma correlação perfeita entre os dois sistemas com, para a detecção de hemoglobinas normais, uma sensibilidade 

de 100 % e uma especificidade de 100 % em relação à técnica de referência, calculados segundo o método recomendado (Wendling, 1986). 

Todas as hemoglobinas anómalas detectadas com o HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) estavam de acordo com o sistema de geles comparativo, com 

os resultados do hospital e com o diagnóstico clínico. Não foram observados casos de falsos positivos, isto é, detecção de fracções anómalas quando 

não existia a anomalia inerente. Também não se observaram casos de falsos positivos (detecção de uma Hb anómala inexistente ou de uma Hb de 

valor normal detectada numa taxa anormal). 

Precisão - Determinação quantitativa de Hb A 2 

51 amostras de sangue com níveis normais e elevados de Hb A 2 

foram analisadas em paralelo por densitómetria dos perfis electroforéticos, obtidos 

em geles HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E), e obtidos com outro gel disponível comercialmente. 

A correlação entre as duas técnicas foi analisada por regressão linear e outros métodos estatísticos (análise da variância, teste do X2 e teste-t de 

Student de aceitação e rejeição). Estes mostraram que a diferença entre as médias das duas técnicas era nula, por consequência, a hipótese nula 

(nenhuma diferença entre as médias) foi aceite com um nível de confiança de 95 %. 

| Coeficiente | Intersecção em Y | Declive | Gama de valores % | 

| de correlação | | | (sistema SEBIA) | 

| 0.981 | 0.103 | 0.906 | 1.7 – 5.6 | 

Linearidade 

A análise de uma mistura de duas amostras diferentes demonstrou que a percentagem de cada fracção de hemoglobina estudada está correlacionada 

com a proporção de cada fracção na mistura e que as variações são detectadas de modo linear na técnica HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

- 53 -


BIBLIOGRAFIA 







860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


(9) Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d’un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. 

Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97. 

- 54 -


ANVÄNDNINGSOMRÅDE 

HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) och HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) kiten är avsedda för separation av normalt hemoglobin (A och A 2 

), och för 

detektering av huvudhemoglobin-varianterna : S eller D och C eller E genom elektrofores på alkaliska agaros geler (pH 8,5). De används tillsammans 

med det halvautomatiska HYDRASYS systemet. Elektroforesogrammen utvärderas visuellt för mönsteravvikelser. Densitometri kan användas som ett 

hjälpmedel vid tolkning då metoden ger relativa koncentrationer för inviduella fraktioner. Vid elektrofores på sur gel dvs. HYDRAGEL 7/15 ACID(E) 

HEMOGLOBIN(E) är det av vikt att bekräfta identifieringen av hemoglobinvarianter och i synnerhet att särskilja hemoglobinerna S från D och E från C. 

Varje agarosgel är avsedd för körning: 

• 7 prov i HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) kit, 

• 15 prov i HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) kit. 

Endast för in vitro diagnostik. 

TESTPRINCIPER 1-8 

Hemoglobin är en komplex molekyl bestående av två par av polypeptidkedjor. Varje kedja är kopplad till hemet, en tetrapyrrolisk kärna (porfyrin) vilken 

kelaterar en järnatom. Hemdelen är gemensam för alla hemoglobiner och deras varianter. Typen av hemoglobin bestäms av proteindelen kallad globin. 

Polypeptidkedjorna α, ß, δ och γ utgör de normala mänskliga hemoglobinerna: 

• hemoglobin A .............................................. = α 2 ß 2 

• hemoglobin A 2 

............................................. = α 2 δ 2 

• fetal hemoglobin F ...................................... = α 2 γ 2 

α-kedjan är gemensam för dessa tre hemoglobiner. 

Hemoglobinets spatiella struktur och andra molekylära egenskaper (som hos alla proteiner) beror på beskaffenheten hos aminosyrorna samt 

sekvensen av aminosyrorna som formar kedjorna. Utbyte av aminosyror genom mutationer har gett bildning av hemoglobinvarianter med annorlunda 

ytladdningar och således annan elektroforetisk rörlighet, vilket också beror på pH och jonstyrkan hos bufferten. 

De resulterande kvalitativa (eller strukturella) abnormaliteterna kallas hemoglobinpatier. Minskad syntes hos en av hemoglobinkedjorna leder till 

kvantitativa (eller regulerings-) abnormaliteter, kallade thalassemier. 

Metoden utförs på hemolysat från tvättade röda blodkroppar. Hemoglobinerna separeras genom elektrofores på alkaliska geler och fraktionerna 

visualiseras genom färgning med amidosvart. De torkade gelerna är redo för utvärdering. 

MEDFÖLJANDE REAGENSER OCH MATERIAL I HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) OCH HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) KITEN 

OBJEKT PN 4106 PN 4126 Agaros geler (färdiga att anv.) 10 geler 10 geler Buffrade strips (färdiga att anv.) 10 förp. med 2 10 förp. med 2 Färgningslösnings diluent (stamlösning) 1 flaska, 60 mL 1 flaska, 60 mL Amidosvart färg (stamlösning) 1 flaska, 20 mL 1 flaska, 20 mL Hemolyserande lösning (färdig att anv.) 1 flaska, 20 mL 1 flaska, 20 mL Applikatorer (färdiga att anv.) 1 förp. med 10 (7 tänder) 1 förp. med 10 (15 tänder) 

| Filterpapper | 1 förp. med 10 | 1 förp. med 10 | 

FÖR OPTIMALA RESULTAT 

Reagenser från samma kit måste alltid användas tillsammans och enligt de instruktioner som anges på förpackningens insticksblad. 

LÄS NOGGRANNT FÖRPACKNINGENS INSTICKSBLAD 

1. AGAROS GELER 

Förberedelse 

Agaros geler är färdiga att använda. Varje gel innehåller: agaros, 0.8 g/dL ; alkalisk buffert pH 8.5 ± 0.1 ; tillsatser, ofarliga vid använda koncentrationer 

men nödvändiga för optimala prestanda. 

Användning 

Hjälpmedel för hemoglobin elektrofores. 

Lagring, stabilitet och tecken på förändring 

Förvara gelerna liggande i originalförpackningen, vid rumstemperatur (15 till 30 °C) eller i kylskåp (2 till 8 °C). (Pilen på förpackningens framsida måste 

peka uppåt). 

Undvik större temperaturvariationer under lagring. (t.ex.förvaring nära fönster eller värmekälla). Gelerna är hållbara fram till angivet utgångsdatum på 

förpackningen eller på gelförpackningens etiketter. 

FRYS INTE IN GELEN. 

Släng gelen om: 

(i) kristaller eller fällning bildats på gelytan eller om gelkonsistensen blivit väldigt mjuk (inträffar när gelen varit fryst), 

(ii) bakteriell tillväxt eller mögeltillväxt påvisas, 

(iii) onormal mängd vätska är närvarande i påsförpackningen (som ett resultat av buffertutsöndring från gelen på grund av felaktiga 

lagringsförhållanden). 

- 55 - 

SEBIA INSTRUKTIONER - Svenska


2. BUFFRADE STRIPS 

Förberedelse 

Buffrade svampstrips är färdiga att använda. Varje strips innehåller: alkalisk buffert pH 9.2 ± 0.2 ; tillsatser, ofarliga vid använda koncentrationer, men 

nödvändiga för optimala prestanda. 

Användning 

Buffrade strips fungerar som en elektroforetisk buffertreservoar och säkerställer kontakt mellan gelen och elektroderna. 


Förvara de buffrade stripsen liggande och i originalförpackningen vid rumstemperatur eller i kylskåp. (Pilen för förpackningens framsida måste peka 

uppåt). 

De är hållbara fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på stripsens förpackningsetikett. 

FRYS INTE STRIPSEN. 

Kasta! om förpackningen är öppen eller om stripsen är uttorkade. 

3. FÄRGNINGSLÖSNINGS DILUENT 

Förberedelse 

Stamfärglösnings diluent måste användas enligt beskrivning i paragraf « AMIDOSVART FÄRG ». 

Den innehåller en sur lösning. 

Användning 

För förberedelse av amidosvart färglösning. 


Lagra stamfärglösnings diluent vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar framtill angivet utgångsdatum på förpackningen eller på eller på 

stamfärglösningens flasketiketter. 

FRYS INTE IN. 

Tillsätt inte natriumazid. 

4. AMIDOSVART FÄRG 

Förberedelse 

Amidosvart koncentratet är visköst och kan bli trögflytande. Egenskaperna hos stamlösningen påverkas ej av ökad viskositet eller löslighet. 

För att uppnå en perfekt rekonstituering av färgen, vänligen respektera nedansående procedur: 

1. Tillsätt 15 ml färgdiluent till vialen amidosvartkoncentrat. 

2. Stäng vialen omsorgsfullt. 

3. Skaka vialen kraftigt i c:a 5 sekunder. 

4. Häll lösningen i behållaren för färgprocessning. 

5. Repetera dessa steg 2 eller 3 gånger om nödvändigt. 

6. Överför återstående diluent till behållaren och fyll upp till 300 ml med destillerat eller avjoniserat vatten. 

7. Blanda innehållet i behållaren noga 5 till 10 minuter. Färglösningen är nu redo att användas. 

Efter spädning innehåller arbetsfärglösningen : sur lösning pH ≈ 2 ; amidosvart, 0.4 g/dL ; etylen-glykol, 6.7 % ; tillsatser, ofarliga vid använda 

koncentrationer men nödvändiga för optimala prestanda. 

VARNING: Farligt att svälja. 

Användning 

För färgning av geler med elektroforetisk proteinseparering. 

VIKTIGT : Färglösningen är avsedd för färgning av endast 10 geler. Byt lösning efter 10 färgningsprocedurer. 


Lagra både stam- och arbetsfärglösningarna vid rumstemperatur eller i kylskåp i stängda behållare för att förhindra avdunstning. Stamfärglösningen 

är hållbar fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på färgflaskornas etiketter. 

Arbetsfärglösningen är hållbar i 1 månad. 

Förvara inte arbetsfärglösningen i närheten av en värmekälla. 

5. HEMOLYSERANDE LÖSNING 

Förberedelse 

Hemolyserande lösning är färdig att använda. Det är en buffert med tillsatser, ofarliga vid använda koncentrationer, men nödvändiga för optimala 

prestanda. 

Användning 

För att hemolysera röda blodkroppar. 


Lagra hemolyserande lösning vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar fram till angivet utgångsdatum på förpackningen eller på lösningens 

flasketikett. 

Kassera hemolyserande lösning om den förändras i utseende t.ex., blir grumlig p.g.a. mikrobiell kontaminering. 

6. APPLIKATORER 

Användning 

Tillskurna applikatorer för engångsbruk. För provapplicering. 


Förvara applikatorerna på en torr plats, rumstempererat eller i kylskåp. 

7. FILTERPAPPER 

Användning 

Tunnt tillskurna och absorberande pappersbitar för engångsbruk. Används för borttagning av fukt på gelytan innan provapplicering. 

Förvaring 

Förvara filterpappren på ett torrt ställe vid rumstemperatur eller i kylskåp. 

- 56 -


ERFORDERLIGA REAGENSER MEN INTE MEDLEVERERADE 

1. AVFÄRGNINGSLÖSNING 

Förberedelse 

Varje flaska med stamlösning av (SEBIA, PN 4540, 10 flaskor 100 mL i varje) skall spädas upp till 100 liter med destillerat eller avjoniserat vatten. Det 

är lämpligt att endast späda 5 mL av stamlösningen till 5 liter, som är volymen hos behållaren för avfärgningslösningen. Efter spädning innehåller den 

bruksfärdiga avfärgningslösningen: citronsyra, 0.05 g/dL. 

Användning 

För avfärgning, vilket innebär borttagning av överflödig färg samt bakgrundsfärg från gelerna. 

För avsköljning av färgfacket efter tvättsteget. 

För att neutralisera den sura avfärgningslösningen, häll 15 mL av en 50 % natrium-hydroxidlösning, in i den tomma avfallsbehållaren. 


Förvara stamavfärgningslösningen vid rumstemperatur eller i kylskåp. Den är hållbar till angivet utgångsdatum på förpackning eller på 

avfärgninglösningens flasketiketter. Bruks-avfärgningsslösning är hållbar i en vecka under förutsättning att den förvaras i en stängd flaska vid 

rumstemperatur. Tillsätt ej natriumazid. 

Kassera den färdigspädda avfärgningslösningen om den förändras i utseende t.ex., blir grumlig p.g.a. mikrobiell kontaminering. 

För att förhindra mikrobiell tillväxt i den spädda avfärgningslösningen (vid lagring mer än 1 vecka) tillsätt 5 µl/dL av ProClin 300. 

Bruksavfärgningslösning tillsatt med ProClin är hållbar i stängd flaska, förvarad vid rumstemperatur eller i kylskåp till angivet utgångsdatum på 

förpackningen eller på avfärgninglösningens flasketiketter. 

2. HYDRASYS TVÄTTLÖSNING 

Förberedelse 

Varje flaska av HYDRASYS stamtvättlösning (SEBIA, PN 4541, 10 flaskor, 80 mL i varje) skall spädes upp till 5 liter med destillerat eller avjoniserat 

vatten. Efter spädning innehåller brukstvättlösningen : alkalisk buffert pH 8.8 ± 0.3 ; natriumazid. 

VARNING: Brukstvättlösning innehåller 0.625 % natriumazid. Farligt att förtära ! Om så skulle ske, kontakta läkare omedelbart ! Natriumazid 

kan leda till bildning av explosiva eller giftiga ämnen vid kontakt med syror, bly eller koppar. Spola alltid med en stor mängd vatten vid 

avyttring. 

Användning 

HYDRASYS tvättlösning används för rengöring av HYDRASYS färgfack. Använd regelbundet, t.ex. om instrumentet används dagligen, tvätta 

färgfacket varje vecka. 

Se förpackningens insticksblad för användarinstruktioner. 


Förvara bruks- och arbetstvättlösningarna i stängda behållare vid rumstemperatur eller i kylskåp. Lösningarna är hållbara fram till angivet 

utgångsdatum på tvättlösningsflaskornas etiketter. 

Kassera brukstvättlösningen om den förändras i utseende, t.ex. blir grumlig på grund av mikrobiell kontaminering. 

3. SALTLÖSNING 

Förberedelse 

Förbered 0.15 M (0.9 g/dL) NaCl lösning i destillerat eller avjoniserat vatten. 

Användning 

För att tvätta röda blodkroppar. 


Lagra saltlösningen vid rumstemperatur eller i kylskåp. Avyttra efter 3 månader om lösningen ändrar utseende, t.ex., blir grumlig på grund av mikrobiell 

kontaminering. För längre förvaringstid, tillsätt natriumazid, 0.1 g/dL. 

UTRUSTNING OCH NÖDVÄNDIGA TILLBEHÖR MEN INTE MEDLEVERERADE 

1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 eller PN 1211. 

2. Mikropipett, manuell eller automatisk, som t.ex. HYDRAPLUS SEBIA, PN 1215, ett alternativt sätt att ladda provapplikatorerna. 

3. Fuktkammare, PN 1270, levererad med HYDRASYS. 

4. Behållarsats levererad med HYDRASYS. 

5. Pipetter: 10 µl och 200 µl. 

6. Densitometer / scanner kapabel att scanna 82 x 51 mm eller 82 x 102 mm gelplattor vid 570 nm eller med ett gult filter: HYRYS SEBIA, DVSE 

SEBIA eller PHORESIS mjukvara anpassat för en flat-bed scanner. Se tillverkarens instruktioner för åtgärder och kalibreringsrutiner. 

7. Gelhållare för halva geler, SEBIA, PN 10043110. 

PROV FÖR ANALYS 

Provinsamling och förvaring 

Färska icke-koagulerade blodprover rekommenderas för analys. Vanliga antikoagulantia t.ex. de som innehåller EDTA, citrat eller heparin är lämpliga ; 

undvik rör med jodacetat. Blod måste insamlas enligt etablerade rutiner, vid klinisk laboratorieprovtagning. Vid behov ; lagra prov vid 2 till 8 °C upp till 

5 dagar. 

Förberedelse av prov (standard procedur) 

• Blanda primärröret innan blod tas ut för preparering. 

• Centrifugera icke-koagulerat blod vid 5 000 rpm i 5 minuter. 

• Avlägsna plasman. 

• Tvätta de röda blodkropparna (RBC) 2 gånger med 10 volymer saltlösning ; stor försiktighet måste iaktagas vid behandling av röda blodkroppar vid 

volymer mindre än 10 µL. 

- 57 -


• Avlägsna överskottet av salin över de röda blodkropparna och vortexa innan 10 µL tas ut för hemolysering. 

• Hemolysera 10 µL packade röda blodkroppar med 130 µL hemolyserande lösning. 

• Vortexa under 10 sekunder och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. 

NOTERA: 

- För att förbereda hemolysat från patienter, lätt amemisk (ca. 10 g/dL Hb) eller gravt anemisk (< 7 g/dL Hb), kan volymen av packade röda 

blodkroppar (RBC) ökas till respektive 15 µL och 20 µL. Färgningsintensiteten ökar, men relativa koncentrationer för inviduella fraktioner ändras inte. 

- Hemolysatet behöver inte filtreras eller centrifugeras. 

- SEBIA’s hemolyserande lösning påverkar inte det instabila hemoglobinet Bart’s. 

Provförberedelse för detektering av hemoglobin H 

- Blanda primärröret innan blod tas ut för preparering. 

- Centrifugera icke-koagulerat blod vid 5 000 rpm i 5 minuter. 

- Avlägsna plasman. 

- Tvätta de röda blodkropparna (RBC) 2 gånger med 10 volymer saltlösning ; stor försiktighet måste iaktagas vid behandling av röda blodkroppar vid 

volymer mindre än 10 µL. 

- Avlägsna överskottet av salin över de röda blodkropparna och vortexa innan 40 µL tas ut för hemolysering. 

- Hemolysera 40 µl packade röda blodkroppar med 100 µl hemolyserande lösning. 

- Vortexa under 10 sekunder och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. 

- Centrifugera hemolysatet vid 10 000 rpm i 5 minuter. 

- Analysen utförs på supernatanten av detta hemolysat ; följ sedan proceduren med «7 / 15 Hb» migrationsprogram. 

TILLVÄGAGÅNGSSÄTT 

HYDRASYS-systemet är ett halvautomatiskt multi-parameter instrument. De automatiska stegen inkluderar bearbetning av HYDRAGEL agarosgeler 

i följande ordning: provapplicering : elektroforetisk migrering, torkning, färgning, avfärgning och slutligen torkning av gelen. De manuella stegen 

inkluderar hantering av prov och geler, applicering av reagenser samt att förbereda instrumentet för arbete. 

LÄS NOGGRANT HYDRASYS INSTRUKTIONSMANUAL. 

I. MIGRERING 

1. Starta HYDRASYS instrumentet. 

2. Placera en applikator på en slät yta med brunnarnas nummer (angivna på höger sida) vända uppåt (Fig. 1). 

- Applicera 10 µl hemolyserande prov i varje brunn. Ladda applikatorerna inom 2 minuter. 

- Placera applikatorn i fuktkammaren med tänderna uppåt (håll i den skyddande plastramen). 

- Låt proverna diffundera in i tänderna i 5 minuter efter den sista provappliceringen. 

Se insticksbladet för fuktkammaren för ytterligare detaljer. 

3. Öppna luckan till Migrationsmodulen, och lyft upp elektrod- och applikatorhållarna. 

VARNING: Stäng aldrig luckan när hållarna är i höjt läge! 

4. Välj «7/15 Hb» migrationsprogram. 

NOTERA: När större separation mellan Hb F och Hb S förväntas på HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) geler, rekommenderas att välja 

«7/15 Hb F-S» migrationsprogram. Detta program är endast avsett för kvalitativ analys. 

5. Ta ur de buffrade stripsen ur förpackningen ; ta dem i plaständarna. Sätt de hålstansade ändarna på elektrodhållarens pinnar ; stripsens 

plaststöd måste vara vända mot elektrodhållaren (Fig. 2). 

6. Ta ur HYDRAGEL plattan. 

- Rulla snabbt och jämt med ett tunt filterpapper på gelytan för bortagning av överflödig vätska.Ta bort pappret direkt. 

VARNING: För att undvika uttorkning : låt inte filterpappret vara i kontakt med gelen under längre tid. 

- Pipettera 120 µL destillerat eller avjoniserat vatten för HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), eller 200 µl för HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E), 

på den lägre tredjedelen av ramen som är tryckt på migrationmodulens temperatur-kontrollplatta 

- Placera gelplattan (gelsidan uppåt) med kanten mot stoppet i botten på den tryckta ramen (Fig. 3). 

- Böj gelen och släpp den försiktigt ned i vattendroppen (Fig. 3). Förvissa dig om att inga luftbubblor finns kvar, att vattnet fördelar sig under 

hela gelplattan och att gelen är i linje med den tryckta ramen. 

7. Tryck ned bägge hållarna. I detta läge berör inte de buffrade stripsen gelen. TRYCK INTE NED HÅLLARNA HELT. 

8. Avlägsna applikatorn från fuktkammaren. Håll i den skyddande plastramen. 

- Avlägsna applikatorns tandskyddsram. 

- «7 / 15 Hb» migrationsprogram : Placera applikatorn i position Nr. 4 på hållaren. 

- «7 / 15 Hb F-S» migrationsprogram : Placera applikatorn i position Nr. 3 på hållaren. 

VIKTIGT: De tryckta numren på applikatorn måste vara vända mot operatören (Fig. 4). 

9. Stäng luckan till migrationsmodulen. 

10. Starta proceduren direkt genom att trycka på den gröna piltangenten «START» på tangentbordets vänstra sida. 

VIKTIGT: Förvissa dig om att ventilationsintaget på instrumentets högra sida inte är blockerat. 

MIGRERING – BESKRIVNING AV AUTOMATISKA STEG 

• De två hållarna sänker sig så att de buffrade stripsen och applikatorn får kontakt med gelytan. 

• Provapplikatorn höjer sig. 

• Migrering sker under 340 V konstant strömstyrka vid 25 °C, kontrollerat av Peltiereffekten, tills 65 Vh har ackumulerats (under ca. 12 minuter, 

«7 / 5 Hb» migrationsprogram) eller tills 85 Vh har ackumulerats (under ca. 15 minuter, «7 / 15 Hb F-S» migrationsprogram). 

• Elektrodhållaren höjer sig för att koppla ur elektroderna. 

• Kontrollplattans temperatur ökar till 50 °C under 15 minuter för att torka gelen. 

• En ljudsignal hörs och luckan till migrationsmodulen öppnas. Plattans temperatur stannar vid 50 °C tills luckan öppnas. Därefter minskar 

temperaturen tills den når 25 °C (på mindre än 5 minuter). Därefter kan en ny migrartionskörning startas. 

NOTERA : Luckan till migrationsmodulen förblir stängd under alla migrationsstegen. 

- 58 -


II. GELBEARBETNING 

1. Öppna luckan. 

2. Avlägsna och släng applikatorn. 

3. Lyft upp båda hållarna, ta tag i de buffrade stripsens plaständar och kasta dem. 

4. Avlägsna den torkade gelfilmen för vidare användning. 

5. Torka försiktigt av elektroderna och temperaturkontrollplattan med en mjuk servett fuktad med vatten. 

Förvissa dig om att elektroderna och plattan är helt torra innan återanvändning. 

VIKTIGT : Elektroderna måste systematiskt rengöras efter varje användning. 

6. Öppna Gelhållaren. Lägg den platt och lägg sedan den torkade gelen (med gelsidan uppåt) i fördjupningarna på de två listerna och stäng 

hållaren. Förvissa dig om att filmen är korrekt placerad inuti hållaren (Fig. 5). 

7. Placera gelhållaren i modulen för gelbearbetning / färgning. 

VIKTIGT : Innan start av gelbearbetning- /färgningsprogrammet, kontrollera följande: 

- att färgningsbehållaren är fylld med 300 mL färgningslösning ; 

- att avfärgningsbehållaren innehåller minst 1 liter avfärgningslösning ; 

- att avfallsbehållaren är tom. 

För reagenslinjeförbindelse: Se visad information på instrumentets skärm (välj tangent: REAGENT LINES). 

VIKTIGT : Glöm inte att spärra oanvända linjer. 

8. Välj «PROT./B1-B2/Hb» färgningsprogram på instrumentmenyn och starta körningen genom att trycka på tangenten “START” (grön pil på 

tangentbordets högra sida). 

Under färgning-, avfärgning-, och torkningsstegen, förblir facket låst. 

Efter kylningssteget, hörs en ljudsignal när facket öppnas (ventilation upprätthålls tills gelhållaren avlägsnas). 

III. SLUTGILTIG GELBEARBETNING 

1. Avlägsna gelhållaren från facket, öppna och ta ur den torkade gelen. 

NOTERA : Efter gelfärgning/avfärgning och innan densitometri/scanning, kan en gel genomgå ett ytterligare tvättsteg, om nödvändigt, för att 

ytterligare klargöra gelbakgrunden och avlägsna eventuella färgrester som kan framträda som blåa fläckar. Tvätta gelen med användning av 

programmet " WASH ISOENZ/GEL". 

2. Vid behov, rengör den torra filmens baksida (stödsidan av plast) med ett fuktat mjukt papper. 

3. Scanna med en densitometer / scanner vid 570 nm eller med ett gult filter. Vid användning av HYRYS eller DVSE densitometrar, placera A 2 

fraktionen vid 5 mm markören hos scannerplattan: bakgrundsnollan sätts mellan fraktionerna A 2 

och karboniskt anhydras vid den lägsta 

punkten. 

NOTERA: För att försäkra dig om de mest tillförlitliga och överensstämmande resultat, gå till väga enligt nedan : 

- Justera scanlängden för att inkludera hela det elektroforetiska mönstet (≈ 30 mm). 

- Försäkra dig om att minimum på båda sidor om A 2 

fraktionen är placerade vid basen av A 2 

toppen. 

Det är en god vana att avläsa färgade geler utan fördröjning. För framtida referens, kan de lagras i ett skyddande omslag på en torr mörk 

plats. De får ej förvaras nära värmekälla och skall tolkas visuellt inom 3 månader. 

RESULTAT 

Kvalitetskontroll 

Det rekommenderas att inkludera ett analyserat blodprov som innehåller hemoglobinerna A, F, C och S i varje provkörning. 

Värden 

Scanning med densitometer på färgade elektroforesogram ger relativa koncentrationer (i procent) för invididuella hemoglobinzoner. 

Normalvärden (medel ± 2 SD) på HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) geler har fastställts för en frisk population på 200 vuxna (män och kvinnor): 

Hemoglobin A ≥ 96.5 % 

Hemoglobin F < 2.0 % (*) 

Hemoglobin A2 ≤ 3.5 % 

(*) se Interferens och begränsningar 

Det rekommenderas att varje laboratorium fastställer sina egna normalvärden. 

Tolkning 

1. Kvalitativa abnormaliteter: Hemoglobinopatier 

De flesta hemopatier är beroende på substituering eller mutation av en enkel aminosyra hos en av de fyra polypeptidkedjorna « polypeptide chains ». 

Den kliniska innebörden för en sådan ändring är beroende på typ av aminosyra och plats. Vid klinisk signifikant sjukdom är antingen « α-chain » eller 

« ß-chain » påverkad. 

Det finns fler än 200 beskrivna varianter av hemoglobiner hos vuxna. De första studerade abnormala hemoglobinerna och de flest förekommande har 

en förändrad negativ elektrisk laddning, vilket möjliggör lätt detektering med elektrofores. 

Det finns fyra huvydtyper av abnormala hemoglobiner, vilka är av särskilt kliniskt intresse: S, C, E och D. 

HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) kiten är avsedda för preliminär identifikation av hemoglobinpatier och thalassemier. När ett abnormalt mönster 

väl har indikerats, skall dess identitet bekräftas genom lämpliga urskiljande tester (t.ex. elektrofores på sura agarosgeler). 

Hemoglobin S 

Hemoglobin S är den mest frekventa. Den beror att en glutamat (en sur aminosyra) hos ß-kedjan byts ut mot en valin (en neutral aminosyra). Dess 

elektroforetiska rörlighet minskar därmed. På alkaliskt buffrad HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), migrerar hemoglobin S mellan fraktionerna A och 

A 2 

. 

Hemoglobin C 

En glutamat hos ß-kedjan byts ut mot en lysin (en basisk aminosyra): dess rörlighet minskar kraftigt. Hos HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), 

kommer fraktionerna C, E och A 2 

hamna ovanpå varandra. När denna fraktionen är > 15 %, måste hemoglobinerna C och E misstänkas. 

- 59 -


Hemoglobin E 

En glutamat hos ß-kedjan byts ut mot en lysin: hemoglobin E migrerar exakt som hemoglobin C på HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E). Till skillnad 

från hemoglobin C, separerar den ej från hemoglobin A i sur buffert [HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)]. Denna egenskap tillåter 

särskiljning mellan E och C. 

Hemoglobin D 

En glutamat hos ß-kedjan byts ut mot en glutamin. På HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), migrerar denna hemoglobin exakt som hemoglobin S. 

Till skillnad från hemoglobin S, separerar inte hemoglobin D från hemoglobin A i sur buffert [HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)] ; denna 

egenskap tillåter särskiljning mellan S och D. 

2. Kvantitativa abnormaliteter: thalassemier 

Thalassemier utgör en ganska heterogen grupp av genetiska sjukdomar karaktäriserade av minskad syntes av en typ av polypeptidkedjorna. Den 

molekylära mekanismen hos denna minskning har inte blivit fullständigt beskriven. 

Det finns två typer av thalassemier: 

Alfa-thalassemier 

Dessa karaktäriseras av minskad syntes av α-kedjorna, vilket medför påverkan på syntesen av alla normala hemoglobiner. 

Överskottet av syntes av ß- och g-kedjorna i relation till α-kedjorna inducerar bildning av tetramerer utan någon α-kedja: 

• hemoglobin Bart = γ 4, 

• hemoglobin H = ß 4. 

Beta-thalassemier 

Dessa karaktäriseras av minskad syntes av ß-kedjorna. Endast syntes av hemoglobin A påverkas. 

Detta medför att procentandelen hemoglobin F och hemoglobin A 2 

ökar i förhållande till hemoglobin A. 

3. Migrationsmönster 

Migrering av normala 

hemoglobiner 

A(A 0 

+ A 1 

) A (A 0 

+ A 1 

) 

F 

S - D 

A 2 

anhydras 

appliceringspunkt 

A 2 

- C - E 

anhydras 

Migrering av de viktigaste 

abnormala hemoglobinerna 

A 0 

: Icke-glykoserad fraktion hos normalt hemoglobin A hos vuxna. 

A 1 

: Glykoserad fraktion i normalt hemoglobin A hos vuxna. 

I migrationsmönstret ovan är katoden nederst och anoden överst. 

Interferens och begränsningar 

• Använd inte hemolyserande blodprov. 

• När ett abnormalt hemoglobin detekteras, vilket migrerar annorlunda än hemoglobinvarianterna S, C, D och E, använd andra identifikationssätt 

(t.ex. isoelektrisk fokusering, globinkedjeelektrofores), konsultera eller sänd provet till ett specialiserat laboratorium. 

• Den densitometriska analysen av Hb F (eller av någon annan mindre hemoglobinfraktion som migrerar i närheten större fraktioner) är semikvantitativ 

då värdena blir inexakta vid under 2 % - 3 % av totalt hemoglobin 

• Vissa patienter som är homozygota för “S” genomgår behandling med “Hydrea”® (hydroxyurea) vilken kan inducera syntes av fetalt (foster) 

hemoglobin. Mobiliteten hos detta inducerade hemoglobin F på HYDRAGEL 7 & 15 HEMOGLOBIN(E) har i vissa fall visats sig vara lätt skiljd från 

fysiologiskt hemoglobin F. 

• På prov lagrade mer än 7 dagar, kan bandet bakom Hb A fraktionen bli en koncentrerad fraktion. Tolka inte denna fraktion som en hemoglobin 

variant, t.ex., H eller Bart hemoglobiner. 

Felsökning 

Ring leverantörens tekniska support om testet misslyckas trots att manualen och givna instruktioner för materialförvaring och förberedelse av test följts. 

Varuinformationsblad för reagenserna i kiten och information för avfallshantering finns tillgängliga hos leverantörens tekniska service. 

PRESTANDADATA 

Alla prestandadata är baserade på en studie som inkluderar SEBIA HYDRAGEL material, instrument och andra jämförbara, komersiellt tillgängliga 

agaros gelsystem. Dessutom genomfördes överensstämmande studier där hemoglobinernas identitet och deras värden fastställdes med andra 

erkända metoder. 

Alla elektroforetogram blev visuellt tolkade. SEBIA’s HYRYS densitometer användes vid alla densitometriska utvärderingar för att komplementera 

visuella data vid behov. 

Resultat för typiska prov och prestandastudier presenteras nedan. 

Individuella värden, medelvärden, SD och CV visas nedan. Generellt visar resultaten på en mycket god reproducerbarhet hos alla testade aspekter: 

2.4 % var medel CV värde med «7 / 15 Hb» migrationsprogram. Resultaten var liknande med «7 / 15 Hb F-S» migrationsprogram 

Reproducerbarhet inom serie 

Tre blodprov genomgick elektrofores på HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) geler från samma gelbatch. Varje prov kördes i alla 15 spår på en gel. 

Följande tabell visar medelvärden, SD och CV för varje inviduell hemoglobin-komponent hos de tre proven. De är beräknade från densitometriska 

procentvärden för varje spår. Dessutom visade ingen av replikaten några falska positiva eller falska negativa värden. 

- 60 -


| KOMPONENT | MEDEL (%) | SD | CV (%) | 

Normalt blod | Hb A 97.6 0.2 0.2 | 

Hb A 2 

| 2.4 | 0.2 | 7.7 Förhöjt Hb A2 | Hb A 95.3 0.2 0.2 | 

Hb A 2 

| 4.7 | 0.2 | 5.0 Förhöjt Hb C Hb A 57.8 0.4 0.7 | Hb C | 42.2 | 0.4 | 0.9 | 

Reproducerbarhet utom serie 

Femton (15) blodprov genomgick elektrofores på HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) geler från en gelbatch. De analyserade proven inkluderade nio 

prov med abnormalt hemoglobin (Hb S, Hb F eller Hb C) och fem prov med förhöjt Hb A 2 

. Medelvärden, SD och CV beräknades från erhållna data för 

varje komponent i varje prov. Dataområden för medelvärden, SD och CV, och medel CV representerande en pool av inviduella komponenter visas i 

tabellform nedan. Dessutom visade ingen av replikaten några falska positiva eller falska negativa värden. 

KOMPONENT MEDEL (%) SD CV (%) MEDEL CV (%) Hb A 21.6 – 98.0 0.1 – 0.6 0.1 – 2.4 0.7 Hb F 14.1 – 73.0 0.5 0.7 – 3.4 1.6 Hb C/E 20.0 – 42.4 0.3 0.7 – 1.3 1.0 Hb S/D 8.8 – 83.6 0.2 – 0.6 0.7 – 2.1 1.1 

| Hb A 2 

| 2.0 – 5.4 | 0.1 – 0.2 | 1.3 – 9.9 | 4.8 | 

Nogrannhet - Detektering av abnormaliteter hos hemoglobulin 

Sextiotre (63) olika blodprov analyserades med HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) proceduren och andra kommersiellt tillgängliga agaros gelsystem. 

Blodproven och deras diagnostiska utvärdering erhölls från ett sjukhus. Diagnosen baserades på elektrofores rutinmässigt analyserade på alkaliska 

och sura geler, och/eller HPLC. Alla abnormala hemoglobiner eller abnormala nivåer av normalt hemoglobulin som blev detekterade med HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E), visade sig vara i full överensstämmelse med jämförbara gelsystem, resultat från sjukhus och klinisk diagnos. Det observerades 

inga fall av falskt positiva resultat, dvs. detektering av abnormala band eller abnormal nivå hos ett normalt band där inga sådana band existerar. 

Tillförlitlighet - Kvantitativ bestämning av Hb A 2 

Nivåerna hos Hb A 2 

blev uppmätta i 51 blodprov med normala eller förhöjda nivåer för Hb A 2 

både med densitometri hos de elektroforetiska 

separationer som uppnåtts på HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) geler. De uppmätta värdena från de bägge metoderna analyserades med statistisk 

linjär regressionanalys. Resultaten för linjär regressionsanalys visas i tabellform nedan (y = HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

| Korrelationskoefficient | y-brytpunkt | Kurva | Område för % värden | 

| | | | (SEBIA’s system) | 

| 0.981 | 0.103 | 0.906 | 1.7 – 5.6 | 

Linearitet 

Två blodprov blandades inom olika proportioner och spädningarna genomgick elektrofores på HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) geler. 

Testet fastställdes vara linjärt inom det hela studerade området. 

BIBLIOGRAFI 







860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


- 61 -


ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ 

Τα κιτ HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) και HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) είναι σχεδιασµένα για το διαχωρισµό των φυσιολογικών 

αιµοσφαιρινών (A και A2) και για την ανίχνευση των κύριων παραλλαγών της αιµοσφαιρίνης: S ή D και C ή E και της εµβρυϊκής 

αιµοσφαιρίνης F, µε ηλεκτροφόρηση σε αλκαλική γέλη αγαρόζης (pH 8.5). Χρησιµοποιούνται µε την ηµι-αυτοµατοποιηµένη συσκευή 

ηλεκτροφόρησης HYDRASYS. Τα προκύπτοντα ηλεκτροφορήµατα αξιολογούνται οπτικά. Η πυκνοµέτρηση προσφέρει σχετική 

ποσοτικοποίηση των επιµέρους ζωνών. 

Θα πρέπει να ακολουθήσει ηλεκτροφόρηση σε όξινο gel, π.χ. HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E), για την επιβεβαίωση της 

ταυτοποίησης του τύπου της αιµοσφαιρίνης, ειδικά για τη διαφοροποίηση της αιµοσφαιρίνης S από την D και της E από την C. 

Κάθε gel αγαρόζης προορίζεται για την ανάλυση : 

• 7 δειγµάτων στο κιτ HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), 

• 15 δειγµάτων στο κιτ HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E). 

Για In Vitro διαγνωστική χρήση. 

ΑΡΧΗ ΤΗΣ ∆ΟΚΙΜΑΣΙΑΣ 1-8 

Η αιµοσφαιρίνη είναι ένα σύµπλοκο µόριο αποτελούµενο από δύο ζεύγη πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Κάθε αλυσίδα συνδέεται µε την αίµη, 

έναν τετραπυρρολικό πυρήνα (πορφυρίνη) που συνδέεται χηλικά µε ένα άτοµο σιδήρου. Το µόριο αίµης είναι κοινό για όλες τις 

αιµοσφαιρίνες και τις ποικιλίες τους. Ο τύπος της αιµοσφαιρίνης προσδιορίζεται από το πρωτεϊνικό τµήµα που ονοµάζεται σφαιρίνη. Οι 

πολυπεπτιδικές αλυσίδες, α, β, γ και δ συγκροτούν τις φυσιολογικές ανθρώπινες αιµοσφαιρίνες: 

• αιµοσφαιρίνη A............................................. = α 2 β 2 

• αιµοσφαιρίνη A2........................................... = α 2 δ 2 

• εµβρυϊκή αιµοσφαιρίνη F............................ = α 2 γ 2 

Η αλυσίδα α είναι κοινή στις τρεις αυτές αιµοσφαιρίνες. 

Η τρισδιάστατη δοµή της αιµοσφαιρίνης και οι άλλες µοριακές της ιδιότητες (όπως όλων των πρωτεϊνών) εξαρτώνται από τη φύση και την 

ακολουθία των αµινοξέων που συγκροτούν τις αλυσίδες. Η αντικατάσταση αµινοξέων µε µετάλλαξη είναι υπεύθυνη για το σχηµατισµό 

µορίων αιµοσφαιρίνης µε διαφορετικό επιφανειακό φορτίο και συνεπώς διαφορετική ηλεκτροφορητική κινητικότητα, η οποία επίσης 

εξαρτάται από το pH και την ιοντική ισχύ του ρυθµιστικού διαλύµατος. Σε όξινο pH, η κινητικότητα επηρεάζεται επίσης από την 

ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση µεταξύ των θετικά φορτισµένων µορίων αιµοσφαιρίνης και των αρνητικά φορτισµένων οµάδων στο άγαρ. 

Οι προκύπτουσες ποιοτικές (ή δοµικές) ανωµαλίες ονοµάζονται αιµοσφαιρινοπάθειες. Η µειωµένη σύνθεση κάποιας από τις αλυσίδες της 

αιµοσφαιρίνης οδηγεί σε ποσοτικές ανωµαλίες, που ονοµάζονται θαλασσαιµίες. 

Η ανάλυση πραγµατοποιείται σε αιµόλυµα από πλυµένα ερυθροκύτταρα. Οι αιµοσφαιρίνες διαχωρίζονται µε ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικά 

gel και τα κλάσµατα γίνονται ορατά µε χρώση µε amidoblack. Τα στεγνωµένα gel είναι έτοιµα για ερµηνεία. 

ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΜΕ ΤΑ ΚΙΤ HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) ΚΑΙ HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E) 

ΕΙ∆ΟΣ PN 4106 PN 4126 Gel αγαρόζης (έτοιµα προς χρήση) 10 gel 10 gel Ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος (έτοιµες προς χρ.) 10 συσκ. των 2 10 συσκ. των 2 Μέσο αραίωσης διαλύµατος χρώσης (πυκνό διάλυµα) 1 φιαλίδιο, 60 mL 1 φιαλίδιο, 60 mL Χρωστική amidoblack (πυκνό διάλυµα) 1 φιαλίδιο, 20 mL 1 φιαλίδιο, 20 mL Αιµολυτικό διάλυµα (έτοιµο προς χρήση) 1 φιαλίδιο, 20 mL 1 φιαλίδιο, 20 mL Εφαρµογείς (έτοιµοι προς χρήση) 1 συσκ. των 10 (7 δόντια) 1 συσκ. των 10 (15 δόντια) 

| ∆ιηθητικά χαρτιά | 1 συσκ. των 10 | 1 συσκ. των 10 | 

ΓΙΑ ΑΡΙΣΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 

Όλα τα αντιδραστήρια από ίδιο κιτ πρέπει να χρησιµοποιούνται πάντα µαζί και σύµφωνα µε τις οδηγίες χρήσης. 

ΠΑΡΑΚΑΛΟΥΜΕ ∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ ΤΟ ΦΥΛΛΟ Ο∆ΗΓΙΩΝ. 

1. GEL ΑΓΑΡΟΖΗΣ 

Προετοιµασία 

Τα gel αγαρόζης είναι έτοιµα προς χρήση. Κάθε gel περιέχει: αγαρόζη, 0.8 g/dL, αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα pH 8.5 ± 0.1, πρόσθετα, µη 

επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση. 

Χρήση 

Μέσο για ηλεκτροφόρηση αιµοσφαιρίνης. 

Φύλαξη, σταθερότητα και σηµεία αλλοίωσης 

Φυλάσσετε τα gel οριζόντια εντός της συσκευασίας τους σε θερµοκρασία δωµατίου (15 έως 30 °C) ή στη συντήρηση (2 έως 8 °C). (Το βέλος 

στην πρόσθια επιφάνεια του κουτιού του κιτ πρέπει να δείχνει προς τα άνω). Αποφύγετε την αποθήκευση κοντά σε παράθυρο ή σε πηγή 

θερµότητας. Αποφύγετε τις µεγάλες διακυµάνσεις θερµοκρασίας κατά τη φύλαξη. Τα gel είναι σταθερά µέχρι την ηµεροµηνία λήξης που 

αναγράφεται στη συσκευασία του κιτ ή των gel. 

ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ. 

Πετάξτε τα gel όταν: 

(i) σχηµατιστούν κρύσταλλοι ή ίζηµα στην επιφάνεια του gel ή αν η υφή του gel γίνει πολύ µαλακή (όλα αυτά προκύπτουν αν το gel 

καταψυχθεί), 

(ii) αναπτυχθούν βακτήρια ή µούχλα, 

(iii) υπάρχει µεγαλύτερη από το φυσιολογικό ποσότητα στο κουτί του gel (αποτέλεσµα της εξίδρωσης του ρυθµιστικού διαλύµατος από το 

gel λόγω ακατάλληλων συνθηκών φύλαξης). 

- 62 - 

Ο∆ΗΓΙΕΣ SEBIA - Ελληνικά

2. ΤΑΙΝΙΕΣ ΜΕ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ 



Σπογγώδεις ταινίες µε ρυθµιστικό διάλυµα έτοιµες προς χρήση. Καθεµιά περιέχει: αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα pH 9.2 ± 0.2, πρόσθετα, 

µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση. 

Χρήση 

Οι ταινίες µε ρυθµιστικό διάλυµα λειτουργούν ως δεξαµενή ρυθµιστικού διαλύµατος για την ηλεκτροφόρηση και εξασφαλίζουν επαφή 

µεταξύ του gel και των ηλεκτροδίων. 


Φυλάσσετε τις ταινίες σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Παραµένουν σταθερές µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται 

στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και της συσκευασίας των ταινιών. 

ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ. 

Πετάξτε τις ταινίες αν η συσκευασία τους έχει ανοιχθεί και οι ταινίες έχουν στεγνώσει. 

3. ΜΕΣΟ ΑΡΑΙΩΣΗΣ ∆ΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΧΡΩΣΗΣ 


Το πυκνό µέσο αραίωσης διαλύµατος χρωστικής πρέπει να χρησιµοποιείται όπως περιγράφεται στην παράγραφο “ΧΡΩΣΤΙΚΗ 

AMIDOBLACK“. 

Περιέχει όξινο διάλυµα. 

Χρήση 

Για την παρασκευή του διαλύµατος χρωστικής amidoblack. 


Φυλάσσετε το πυκνό µέσο αραίωσης διαλύµατος χρωστικής σε θερµοκρασία δωµατίου ή στοψυγείο. Είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία 

λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων. ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ. 

Μην προσθέτετε αζίδιο του νατρίου. 

4. ΧΡΩΣΤΙΚΗ AMIDOBLACK 


Η πυκνή χρωστική amidoblack είναι ένα ιξώδες διάλυµα το οποίο ενδέχεται να µετατραπεί σε γέλη. Η καταλληλότητα του πυκνού 

διαλύµατος χρωστικής δεν επηρεάζεται από την αύξηση της γλοιότητάς του ή τη στερεοποίησή του. 

Σε όλες τις περιπτώσεις, για να επιτύχετε τέλεια ανασύσταση της χρωστικής, σας συνιστούµε να ακολουθήσετε την εξής διαδικασία : 

1. Προσθέστε 15 mL του µέσου αραίωσης χρωστικής στο φιαλίδιο του πυκνού διαλύµατος. 

2. Κλείστε προσεκτικά το φιαλίδιο. 

3. Ανακινήστε έντονα το φιαλίδιο για περίπου 5 δευτερόλεπτα. 

4. Αδειάστε αυτό το διάλυµα στο δοχείο που προορίζεται για την επεξεργασία του διαλύµατος χρωστικής. 

5. Επαναλάβετε αυτό το βήµα δύο φορές, ή τρεις αν χρειάζεται. 

6. Αδειάστε το υπόλοιπο µέσο αραίωσης στο δοχείο και συµπληρώστε µε απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ έως όγκου 300 mL. 

7. Ανακινήστε καλά τα περιεχόµενα του δοχείου για 5 - 10 λεπτά. 

Το διάλυµα χρωστικής είναι έτοιµο προς χρήση. 

Μετά την αραίωση, το διάλυµα εργασίας της χρωστικής περιέχει: όξινο διάλυµα pH ≈ 2, amidoblack, 0.4 g/dL, αιθυλενογλυκόλη, 6.7 %, 

πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες συγκεντρώσεις, αναγκαία για άριστη απόδοση. 

ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Επιβλαβές αν καταποθεί. 

Χρήση 

Για τη χρώση των gel µετά από ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό πρωτεϊνών. 

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Το διάλυµα χρωστικής είναι σχεδιασµένο για χρώση µόνο 10 gel. Αλλάξτε το διάλυµα µετά από 10 διαδικασίες χρώσης. 


Φυλάσσετε τα διαλύµατα προ και µετά την αραίωση σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο σε κλειστούς περιέκτες για να αποτραπεί η 

εξάτµιση. Το πυκνό διάλυµα χρωστικής είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας 

του κιτ και των φιαλιδίων. 

Το διάλυµα εργασίας είναι σταθερό για 1 µήνα. 

Μην αποθηκεύετε το διάλυµα χρώσης κοντά σε πηγή θερµότητας. 

5. ΑΙΜΟΛΥΤΙΚΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ 


Το αιµολυτικό διάλυµα είναι έτοιµο προς χρήση. Είναι ένα ρυθµιστικό διάλυµα µε πρόσθετα, µη επιβλαβή στις χρησιµοποιούµενες 

συγκεντρώσεις, απαραίτητα για άριστη απόδοση. 

Χρήση 

Για την αιµόλυση των ερυθροκυττάρων. 


Φυλάσσετε το αιµολυτικό διάλυµα σε θερµοκρασία δωµατίου (15 έως 30 °C) ή στη συντήρηση (2 έως 8 °C). Παραµένει σταθερό µέχρι την 

ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και της συσκευασίας του διαλύµατος. 

Πετάξτε το αιµολυτικό διάλυµα αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. θόλωση λόγω µικροβιακής επιµόλυνσης. 

6. ΕΦΑΡΜΟΓΕΙΣ 

Χρήση 

Έτοιµοι, εφαρµογείς µιας χρήσης για τοποθέτηση των δειγµάτων. 

Φύλαξη 

Φυλάσσετε τους εφαρµογείς σε ξηρό µέρος σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. 

- 63 -


7. ∆ΙΗΘΗΤΙΚΑ ΧΑΡΤΙΑ - ΛΕΠΤΑ 

Χρήση 

Μιας χρήσης απορροφητικά χαρτιά για στύπωµα της υγρασίας από την επιφάνεια του gel πριν την τοποθέτηση των δειγµάτων. 

Αποθήκευση 

Τα λεπτά διηθητικά χαρτιά αποθηκεύονται σε στεγνό µέρος, σε θερµοκρασία δωµατίου ή σε ψύξη. 

ΑΝΤΙ∆ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ 

1. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΣΜΟΥ 


Κάθε φιαλίδιο ∆ιαλύµατος Αποχρωµατισµού (SEBIA, PN 4540, 10 φιαλίδια, 100 mL το καθένα) αραιώνεται µε έως 100 λίτρα απεσταγµένου 

ύδατος. Είναι ευχερές να αραιώνονται µόνο 5 mL του διαλύµατος σε 5 λίτρα, τον όγκο του περιέκτη του διαλύµατος αποχρωµατισµού. 

Μετά την αραίωση το διάλυµα αποχρωµατισµού περιέχει: κιτρικό οξύ 0.05 g/dL. 

Χρήση 

Για αποχρωµατισµό, δηλαδή αφαίρεση της περίσσειας χρωστικής από τη γέλη. 

Για καθαρισµό του τµήµατος χρώσης. 

Για την εξουδετέρωση της οξύτητας του διαλύµατος αποχρωµατισµού, προσθέστε 15 mL διαλύµατος 50 % υδροξειδίου του νατρίου, στο 

κενό δοχείο αχρήστων. 


Φυλάσσετε το διάλυµα προ της αραίωσης σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Το πυκνό διάλυµα είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία 

λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων του διαλύµατος. 

ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ. Το αραιωµένο διάλυµα είναι σταθερό για µια εβδοµάδα σε θερµοκρασία δωµατίου σε κλειστό δοχείο. Μην προσθέτετε 

αζίδιο του νατρίου. 

Πετάξτε το διάλυµα αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. θόλωση λόγω µικροβιακής επιµόλυνσης. 

Για να αποτρέψετε πολλαπλασιασµό µικροβίων στο αραιωµένο διάλυµα αποχρωµατισµού αν πρόκειται να το φυλάξετε για περισσότερο 

από µια εβδοµάδα, προσθέστε 5 µL/dL ProClin 300. 

Το διάλυµα εργασίας στο οποίο έχει προστεθεί ProClin είναι σταθερό σε κλειστό δοχείο σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο µέχρι την 

ηµεροµηνία λήξης η οποία σηµειώνεται στις ετικέττες της συσκευασίας του κιτ και των φιαλιδίων. 

2. ∆ΙΑΛΥΜΑ ΕΚΠΛΥΝΣΗΣ HYDRASYS 


Κάθε φιαλίδιο του πυκνού διαλύµατος έκπλυνσης HYDRASYS (SEBIA, PN 4541, 10 φιαλίδια, 80 mL το καθένα) αραιώνεται µε έως 5 λίτρα, 

µε απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ. Μετά την αραίωση το διάλυµα εργασίας περιέχει:αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα pH 8.8 ± 0.3, αζίδιο 

του νατρίου. 

ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Το πυκνό διάλυµα περιέχει 0.625 % αζίδιο του νατρίου. Μην το πίνετε! Αν το πιείτε, συµβουλευτείτε αµέσως ιατρό! Το 

αζίδιο του νατρίου µπορεί να οδηγήσει σε σχηµατισµό εκρηκτικών ή τοξικών ουσιών όταν έρχεται σε επαφή µε οξέα, µόλυβδο ή χαλκό. 

Πάντοτε ξεπλένετε µε άφθονο νερό όταν το πετάτε. 

Χρήση 

Το διάλυµα έκπλυνσης χρησιµεύει για την αποµάκρυνση των µη κακατακρηµνισθεισών πρωτεϊνών από τα gel. Χρησιµεύει επίσης για 

καθαρισµό του θαλάµου χρώσης του HYDRASYS. Χρησιµοποιείτε το περιοδικά, π.χ. αν το όργανο λειτουργεί καθηµερινά, πλένετε το 

θάλαµο χρώσης κάθε εβδοµάδα. 

∆είτε το φύλλο οδηγιών για οδηγίες χρήσης. 


Φυλάσσετε το πυκνό διάλυµα σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Το πυκνό διάλυµα είναι σταθερό µέχρι την ηµεροµηνία λήξης η 

οποία σηµειώνεται στις ετικέττες των φιαλιδίων του διαλύµατος. 

Πετάξτε το διάλυµα αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. θόλωση λόγω µικροβιακής επιµόλυνσης. 

3. ΧΛΩΡΙΟΝΑΤΡΙΟΥΧΟ ∆ΙΑΛΥΜΑ 


Προετοιµάστε διάλυµα 0.15 M (0.9 g/dL) NaCl σε απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ. 

Χρήση 

Για την έκπλυνση ερυθροκυττάρων και αραίωση των αιµολυµάτων. 


Φυλάσσεται σε θερµοκρασία δωµατίου ή στο ψυγείο. Πετάξτε το διάλυµα µετά 3 µήνες ή αν µεταβληθεί η όψη του, π.χ. θόλωση λόγω 

µικροβιακής επιµόλυνσης. Για µεγαλύτερη περίοδο διατήρησης προσθέστε αζίδιο του νατρίου, 0.1 g/dL. 

ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ ΕΞΑΡΤΗΜΑΤΑ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ 

1. HYDRASYS System SEBIA, PN 1210 ή PN 1211. 

2. Σύστηµα µικροπιπεττών, χειροκίνητο ή αυτόµατο, όπως το HYDRAPLUS SEBIA, PN 1215, ως εναλλακτικός τρόπος φόρτωσης των 

εφαρµογέων δειγµάτων ή των εφαρµογέων αντιορών. 

3. Θάλαµος Υγρής Φύλαξης, PN 1270, παρεχόµενος µε το HYDRASYS. 

4. Κιτ περιεκτών παρεχόµενο µε το HYDRASYS. 

5. Πιπέττες: 10 µL και 200 µL. 

6. Πυκνόµετρο / σαρωτής µε δυνατότητα σάρωσης gel 82 x 51 mm ή 82 x 102 mm στα 570 nm ή µε κίτρινο φίλτρο, π.χ. HYRYS SEBIA, 

DVSE SEBIA ή PHORESIS. Ανατρέξτε στις οδηγίες χρήσης και βαθµονόµησης του κατασκευαστή. 

7. Στατήρας gel για µισά gel, SEBIA, PN 10043110. 

- 64 -


∆ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗ 

Λήψη και διατήρηση δειγµάτων 

Συνιστάται να χρησιµοποιούνται δείγµατα φρέσκου αίµατος µε αντιπηκτικό. Τα κοινά αντιπηκτικά όπως EDTA, κιτρικό ή ηπαρίνη είναι 

αποδεκτά. Αποφύγετε εκείνα που περιέχουν ιωδοξεικό οξύ. Το αίµα πρέπει να συλλέγεται σύµφωνα µε τις καθιερωµένες διαδικασίες 

κλινικής εργαστηριακής πρακτική. Αν χρειάζεται, διατηρήστε τα δείγµατα στους 2 ως 8 °C για έως 5 ηµέρες. 

Προετοιµασία των δειγµάτων 

• Ανακινήστε το σωλήνα συλλογής πριν τη µεταφορά του αίµατος για προετοιµασία. 

• Φυγοκεντρήστε αίµα µε αντιπηκτικό στις 5 000 rpm για 5 min. 

• Πετάξτε το πλάσµα. 

• Πλύνετε τα ερυθροκύτταρα 2 φορές µε 10 όγκους φυσιολογικού ορού. Ιδιαίτερη φροντίδα χρειάζεται όταν επεξεργάζεστε όγκους 

ερυθροκυττάρων µικρότερους των 10 µL. 

• Απορρίψτε την περίσσεια του διαλύµατος φυσιολογικού ορρού πάνω από το σφαιρίδιο των ερυθρών αιµοσφαιρίων και ανακινήστε τα, 

πριν από την λήψη 10 µL για αιµόλυση. 

• Αιµολύστε 10 µL συµπυκνωµένων ερυθρών µε 130 µL αιµολυτικού διαλύµατος. 

• Περιδινήστε στο vortex για 10 sec και επωάστε για 5 min σε θερµοκρασία δωµατίου. 

ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ: 

- Για να ετοιµάσετε αιµόλυµα από άτοµα, ελαφρά αναιµικά (περίπου 10 g/dL Hb) ή βαριά αναιµικά (< 7 g/dL Hb), ο όγκος των 

συµπυκνωµένων ερυθρών µπορεί να αυξηθεί στα 15 µL και 20 µL αντίστοιχα. Η ένταση της χρώσης θα αυξηθεί έτσι αλλά οι 

σχετικές συγκεντρώσεις των επιµέρους κλασµάτων δεν θα αλλάξουν. 

- Το αιµόλυµα δεν χρειάζεται διήθηση ή φυγοκέντρηση. 

- Το αιµολυτικό διάλυµα της SEBIA δεν επηρεάζει την ασταθή αιµοσφαιρίνη Bart’s. 

Προετοιµασία δειγµάτων για ανίχνευση αιµοσφαιρίνης H 

- Ανακινήστε το σωλήνα συλλογής πριν τη µεταφορά του αίµατος για προετοιµασία. 

- Φυγοκεντρήστε αίµα µε αντιπηκτικό στις 5 000 rpm για 5 min. 

- Πετάξτε το πλάσµα. 

- Πλύνετε τα ερυθροκύτταρα 2 φορές µε 10 όγκους φυσιολογικού ορού. Ιδιαίτερη φροντίδα χρειάζεται όταν επεξεργάζεστε όγκους 

ερυθροκυττάρων µικρότερους των 10 µL. 

- Απορρίψτε την περίσσεια του διαλύµατος φυσιολογικού ορρού πάνω από το σφαιρίδιο των ερυθρών αιµοσφαιρίων και ανακινήστε τα, 

πριν από την λήψη 40 µL για αιµόλυση. 

- Αιµολύστε 40 µL συµπυκνωµένων ερυθρών µε 100 µL αιµολυτικού διαλύµατος. 

- Περιδινήστε στο vortex για 10 sec και επωάστε για 5 min σε θερµοκρασία δωµατίου. 

- Φυγοκεντρήστε το αιµόλυµα στις 10 000 rpm για 5 min. 

- Η ανάλυση γίνεται στο υπερκείµενο αυτού του αιµολύµατος. Στη συνέχεια ακολουθήστε τη διαδικασία µε το πρόγραµµα 

ηλεκτροφόρησης «7 / 15 Hb». 

∆ΙΑ∆ΙΚΑΣΙΑ 

Το σύστηµα HYDRASYS είναι ένα ηµι-αυτοµατοποιηµένο πολυπαραµετρικό όργανο. Τα αυτοµατοποιηµένα στάδια λειτουργίας 

περιλαµβάνουν την επεξεργασία των gel αγαρόζης HYDRAGEL µε την ακόλουθη σειρά: εφαρµογή δειγµάτων, ηλεκτροφόρηση, στέγνωµα, 

χρώση, αποχρωµατισµός και τελικό στέγνωµα. Τα χειροκίνητα στάδια περιλαµβάνουν το χειρισµό των δειγµάτων και των gel καθώς και την 

προετοιµασία του οργάνου για λειτουργία. ∆ΙΑΒΑΣΤΕ ΠΡΟΣΕΚΤΙΚΑ ΤΟ ΕΓΧΕΙΡΙ∆ΙΟ Ο∆ΗΓΙΩΝ ΤΟΥ HYDRASYS. 

I. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ 

1. Θέστε το HYDRASYS σε λειτουργία. 

2. Τοποθετήστε έναν εφαρµογέα σε µια επίπεδη επιφάνεια µε τους αριθµούς των βοθρίων στη δεξιά πλευρά (Εικ. 1). 

- Τοποθετήστε 10 µL από τα αιµολυµένα δείγµατα στα βοθρία του εφαρµογέα. Φορτώστε τον εφαρµογέα εντός 2 min. 

- Τοποθετήστε τον εφαρµογέα στο θάλαµο υγρής φύλαξης µε τα δόντια προς τα άνω (κρατήστε τον από το πλαστικό 

προστατευτικό κάλυµµα των δοντιών). 

- Αφήστε τα δείγµατα να διαχυθούν στα δόντια για 5 min µετά την τοποθέτηση του τελευταίου δείγµατος. 

Βλέπε το φύλλο οδηγιών του θαλάµου υγρής φύλαξης για περισσότερες λεπτοµέρειες. 

3. Ανοίξτε το καπάκι της Μονάδας Ηλεκτροφόρησης και σηκώστε τους φορείς των ηλεκτροδίων και του εφαρµογέα. 

ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Ποτέ µην κλείνετε το καπάκι ενώ οι φορείς είναι σηκωµένοι! 

4. Επιλέξτε το πρόγραµµα ηλεκτροφόρησης «7/15 Hb». 

ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ: Όταν είναι επιθυµητός µεγαλύτερος διαχωρισµός µεταξύ Hb F και Hb S στα gel HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), 

συνιστάται να επιλέγεται το πρόγραµµα ηλεκτροφόρησης «7/15 Hb F-S. Το πρόγραµµα αυτό προορίζεται µόνο για ποιοτική 

ανάλυση. 

5. Αφαιρέστε τις ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος από τη συσκευασία τους. Κρατήστε τις από την πλαστική άκρη τους. Προσαρµόστε 

την τρυπηµένη άκρη των ταινιών στις ακίδες του φορέα ηλεκτροδίων, το πλαστικό κάλυµµα της ταινίας πρέπει να είναι στραµµένο 

προς το φορέα (Εικ. 2). 

6. Ανοίξτε τη συσκευασία του HYDRAGEL. 

- Περάστε γρήγορα και οµοιόµορφα ένα διηθητικό χαρτί στην επιφάνεια του gel για να απορροφήσει την περίσσεια υγρού. 

Αφαιρέστε το χαρτί αµέσως. 

ΠΡΟΕΙ∆ΟΠΟΙΗΣΗ: Μην αφήνετε το διηθητικό χαρτί σε επαφή µε το gel επί µακρόν για να µην αφυδατωθεί. 

- Εισαγάγετε 120 µL απεσταγµένο ή απιονισµένο ύδωρ για το HYDRAGEL 7 HEMOGLOBIN(E), ή 200 µL για το HYDRAGEL 

15 HEMOGLOBIN(E), µέχρι το κατώτερο τρίτο της κλίµακας που είναι τυπωµένη στην Πλάκα Ελέγχου Θερµοκρασίας της 

µονάδας ηλεκτροφόρησης. 

- 65 -


- Τοποθετήστε την πλακέτα του gel (µε την επιφάνεια του gel προς τα άνω) µε το άκρο της να αγγίζει το stop στο κάτω τµήµα της 

τυπωµένης κλίµακας (Εικ. 3). 

- Λυγίστε το gel και χαµηλώστε το επί της επιφάνειας του νερού. (Εικ. 3). Βεβαιωθείτε ότι δεν έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα, 

ότι το νερό έχει απλωθεί κάτω από ολόκληρη την πλακέτα του gel και το gel είναι ευθυγραµµισµένο µε την τυπωµένη κλίµακα. 

7. Κατεβάστε και τους δύο φορείς. Σε αυτήν τη θέση, οι ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος δεν αγγίζουν το gel. ΜΗΝ ΠΙΕΖΕΤΕ ΤΟΥΣ 

ΦΟΡΕΙΣ ΤΕΛΕΙΩΣ ΠΡΟΣ ΤΑ ΚΑΤΩ. 

8. Αφαιρέστε τον εφαρµογέα από τον υγρό θάλαµο. Κρατήστε τον από το προστατευτικό κάλυµµα. 

- Αποσπάστε το προστατευτικό κάλυµµα των δοντιών του εφαρµογέα. 

- Πρόγραµµα ηλεκτροφόρησης «7 / 15 Hb»: τοποθετήστε τον εφαρµογέα στη θέση No 4 του φορέα. 

- Πρόγραµµα ηλεκτροφόρησης «7 / 15 Hb F-S»: τοποθετήστε τον εφαρµογέα στη θέση No 3 του φορέα. 

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Οι τυπωµένοι αριθµοί στον εφαρµογέα πρέπει να είναι στραµµένοι προς τον χειριστή (Εικ. 4) 

9. Κλείστε το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης. 

10. Αρχίστε τη διαδικασία αµέσως πιέζοντας το πλήκτρο µε το πράσινο βέλος «START» στην αριστερή πλευρά του πληκτρολογίου. 

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Βεβαιωθείτε ότι η είσοδος αερισµού στη δεξιά πλευρά του οργάνου είναι ελεύθερη. 

ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ – ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΣΤΑ∆ΙΩΝ 

• Οι δύο φορείς χαµηλώνουν ώστε οι ταινίες µε το ρυθµιστικό διάλυµα και ο εφαρµογέας να είναι σε επαφή µε την επιφάνεια του gel. 

• Ο φορέας του εφαρµογέα σηκώνεται. 

• Η ηλεκτροφόρηση πραγµατοποιείται υπό συνεχή τάση 340 V στους 25 °C, µέχρι να συµπληρωθούν 65 Vh (για περίπου 12 min, πρόγραµµα 

ηλεκτροφόρησης «7 / 15 Hb») ή µέχρι να συµπληρωθούν 85 Vh (για περίπου 15 min, πρόγραµµα ηλεκτροφόρησης «7 / 15 Hb F-S»). 

• Ο φορέας ηλεκτροδίων ανυψώνεται για να αποσυνδεθούν τα ηλεκτρόδια. 

• Η θερµοκρασία της πλακέτας ελέγχου αυξάνεται στους 65 °C για 15 min για να στεγνώσει το gel. 

• Η πλακέτα ελέγχου κρυώνει. Όταν φτάσει τους 50 °C, ένας ήχος σηµατοδοτεί το ξεκλείδωµα της µονάδας ηλεκτροφόρησης. Η 

θερµοκρασία της πλακέτας ελέγχου παραµένει στους 50 °C µέχρι να ανοιχθεί το καπάκι. Στη συνέχεια η θερµοκρασία συνεχίζει να 

πέφτει µέχρι τους 20 °C (σε λιγότερο από 5 min) και στη συνέχεια µπορεί να ακολουθήσει νέα ηλεκτροφόρηση. 

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το καπάκι της µονάδας ηλεκτροφόρησης παραµένει κλειστό κατά τη διάρκεια όλων των σταδίων της ηλεκτροφόρησης. 

II. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΩΝ GEL 

1. Ανοίξτε το καπάκι. 

2. Αφαιρέστε τον εφαρµογέα και πετάξτε τον. 

3. Σηκώστε και τους δύο φορείς, αφαιρέστε τις ταινίες ρυθµιστικού διαλύµατος από την πλαστική άκρη τους και πετάξτε τις. 

4. Αφαιρέστε το στεγνωµένο gel για περαιτέρω επεξεργασία. 

5. Μετά από κάθε χρήση, σκουπίστε τα ηλεκτρόδια και την πλάκα ελέγχου θερµοκρασίας µε µαλακό υγρό πανάκι. 

Βεβαιωθείτε ότι τα ηλεκτρόδια και η πλάκα είναι στεγνά µετά από κάθε χρήση. 

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα ηλεκτρόδια πρέπει να καθαρίζονται συστηµατικά µετά από κάθε χρήση. 

6. Ανοίξτε τον στατήρα των gel. Τοποθετήστε το στεγνό gel (µε την επιφάνεια του gel προς τα άνω) στις αύλακες και κλείστε τον 

στατήρα. Βεβαιωθείτε ότι το film είναι σωστά τοποθετηµένο µέσα στον στατήρα (Εικ. 5). 

7. Τοποθετήστε τον στατήρα στη Μονάδα Επεξεργασίας / Χρώσης των gel. 

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Πριν την έναρξη της επεξεργασίας / χρώσης των gel, ελέγξτε τα ακόλουθα: 

- ο περιέκτης χρώσης είναι γεµάτος µε 300 mL χρωστικού διαλύµατος, 

- ο περιέκτης διαλύµατος αποχρωµατισµού περιέχει τουλάχιστον 1 λίτρο διαλύµατος αποχρωµατισµού, 

- ο περιέκτης αχρήστων είναι κενός. 

Για τη σύνδεση των γραµµών των αντιδραστηρίων: ανατρέξτε στις πληροφορίες που εµφανίζονται στην οθόνη του οργάνου 

(επιλέξτε: REAGENT LINES). 

ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: Μην ξεχνάτε να αποφράσσετε τις µη χρησιµοποιούµενες γραµµές. 

8. Επιλέξτε το πρόγραµµα χρώσης «PROT./B1-B2/Hb» από το µενού του οργάνου και αρχίστε τη διαδικασία πατώντας το πλήκτρο 

«START» (πράσινο βέλος στη δεξιά πλευρά του πληκτρολογίου). 

Κατά τα στάδια χρώσης, αποχρωµατισµού και στεγνώµατος, η µονάδα παραµένει κλειδωµένη. 

Μετά το στάδιο ψύξης, ένας ήχος σηµατοδοτεί το ξεκλείδωµα της µονάδας (ο αερισµός διατηρείται µέχρι την αφαίρεση του 

στατήρα των gel). 

III. ΟΛΟΚΛΗΡΩΣΗ ΤΗΣ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΩΝ GEL 

1. Αφαιρέστε τον στατήρα των gel από τη µονάδα, ανοίξτε τον και αφαιρέστε το στεγνό gel. 

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μετά τη χρώση / αποχρωµατισµό και πριν την πυκνοµέτρηση / σάρωση, το gel µπορεί να περάσει από ένα ακόµη στάδιο 

έκπλυνσης, αν χρειάζεται, για τον περαιτέρω καθαρισµό του background και την αποµάκρυνση υπολειπόµενης χρώσης η οποία 

µπορεί να εµφανίζεται µε τη µορφή µπλε κηλίδων. Πλύνετε το gel µε το πρόγραµµα “ WASH ISOENZ/GEL “. 

2. Αν χρειαστεί, καθαρίστε την πίσω (πλαστική) επιφάνεια του στεγνού φιλµ µε υγρό χαρτί. 

3. Σαρώστε µε πυκνόµετρο / σαρωτή στα 570 nm ή µε κίτρινο φίλτρο. Όταν χρησιµοποιείτε πυκνόµετρα HYRYS ή DVSE, τοποθετήστε 

το κλάσµα A2 στο σηµείο των 5 mm της πλάκας σάρωσης: το σηµείο µηδενισµού τοποθετείται ανάµεσα στο κλάσµα A2 και της 

καρβονικής ανυδράσης στο κατώτερο σηµείο. 

ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για να εξασφαλίσετε πιο ακριβή και σταθερά αποτελέσµατα: 

- Προσαρµόστε το µήκος σάρωσης ώστε να περιλάβετε όλο το ηλεκτροφορητικό ίχνος (≈ 30 mm). 

- Βεβαιωθείτε ότι οι περιοριστές στις δύο πλευρές του κλάσµατος A2 είναι τοποθετηµένοι στις ρίζες της αιχµής A2. Καλό είναι 

να διαβάζετε τα χρωµατισµένα gel χωρίς καθυστέρηση. Για µελλοντική αναφορά, µπορούν να διατηρηθούν σε προστατευτικό 

κάλυµµα σε µέρος ξηρό και σκοτεινό, µακριά από πηγές θερµότητας. 

- 66 -


ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 

Ποιοτικός έλεγχος 

Συνιστάται να περιλαµβάνεται ένα δείγµα ελέγχου περιέχον αιµοσφαιρίνες A, F, C και S σε κάθε σειρά δειγµάτων. 

Τιµές 

Η πυκνοµετρική σάρωση κεχρωσµένων ηλεκτροφορηµάτων παρέχει σχετικές συγκεντρώσεις (ποσοστά) των επιµέρους ζωνών της 

αιµοσφαιρίνης. 

Οι φυσιολογικές τιµές (µ.ο. ± 2 SD) στα gel ΗYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) στο σύστηµα HYDRASYS έχουν εξαχθεί από ένα υγιή 

πληθυσµό 200 ενηλίκων (ανδρών και γυναικών): 

Αιµοσφαιρίνη A ≥ 96.5 % 

Αιµοσφαιρίνη F < 2.0 % (*) 

Αιµοσφαιρίνη A2 ≤ 3.5 % 

(*) βλ. Παρεµβολές και Περιορισµοί 

Συνιστάται κάθε εργαστήριο να διαµορφώνει τις δικές του φυσιολογικές τιµές. 

Ερµηνεία 

1. Ποιοτικές διαταραχές: Αιµοσφαιρινοπάθειες 

Οι περισσότερες αιµοσφαιρινοπάθειες οφείλονται σε µετάλλαξη αντικατάστασης ενός αµινοξέος σε µια από τις πολυπεπτιδικές αλυσίδες. 

Η κλινική σηµασία µιας τέτοιας αλλαγής εξαρτάται από τον τύπο του αµινοξέος και τη θέση. Σε κλινικά σηµαντική νόσο, επηρεάζεται είτε 

η α αλυσίδα είτε η β. 

Περισσότερες από 200 ποικιλίες αιµοσφαιρίνης ενηλίκου έχουν περιγραφεί. Οι πρώτες που µελετήθηκαν και οι συχνότερα απαντώµενες 

έχουν αλλαγµένο καθαρό ηλεκτρικό φορτίο, µε αποτέλεσµα την εύκολη ανίχνευσή τους µεηλεκτροφόρηση. 

Υπάρχουν τέσσερις κύριες παθολογικές αιµοσφαιρίνες οι οποίες παρουσιάζουν ειδικό κλινικό ενδιαφέρον: S, C, E και D. 

Τα κιτ HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E) προορίζονται για την προκαταρκτική ταυτοποίηση αιµοσφαιρινοπαθειών και θαλασσαιµιών. Όταν 

διαπιστωθεί παθολογικό ηλεκτροφορητικό προφίλ, θα πρέπει να διερευνάται µε κατάλληλες δοκιµασίες (π.χ. ηλεκτροφόρηση σε όξινη 

γέλη αγαρόζης). 

Αιµοσφαιρίνη S 

Η αιµοσφαιρίνη S είναι η συχνότερη. Οφείλεται σε αντικατάσταση ενός γλουταµικού οξέος (ένα όξινο αµινοξύ) στη ß-αλυσίδα από βαλίνη 

(ένα ουδέτερο αµινοξύ). Η ηλεκτροφορητική της κινητικότητα είναι εποµένως µειωµένη. Στο αλκαλικό HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), 

η αιµοσφαιρίνη S κινείται µεταξύ των κλασµάτων A και A2. 

Αιµοσφαιρίνη C 

Ένα γλουταµικό οξύ της ß-αλυσίδας αντικαθίσταται από λυσίνη (ένα βασικό αµινοξύ): η κινητικότητά της είναι σηµαντικά µειωµένη. Στο 

HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), οι C, E και A2 συµπίπτουν. Όταν το κλάσµα είναι > 15 %, πρέπει να τίθεται υποψία αιµοσφαιρινών C 

και E. 

Αιµοσφαιρίνη E 

Ένα γλουταµικό οξύ της ß-αλυσίδας αντικαθίσταται από λυσίνη: η αιµοσφαιρίνη E κινείται όπως η αιµοσφαιρίνη C στο HYDRAGEL 

7 / 15 HEMOGLOBIN(E). Αντίθετα µε την αιµοσφαιρίνη C, δεν διαχωρίζεται από την αιµοσφαιρίνη A σε όξινο διάλυµα [HYDRAGEL 

7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)]. Αυτή η ιδιότητά της επιτρέπει το διαχωρισµό της E από τη C. 

Αιµοσφαιρίνη D 

Ένα γλουταµικό οξύ της ß-αλυσίδας αντικαθίσταται από γλουταµίνη. Στο HYDRAGEL 7 / 15 HEMOGLOBIN(E), η αιµοσφαιρίνη κινείται 

ακριβώς όπως η αιµοσφαιρίνη S. Αντίθετα µε την αιµοσφαιρίνη S, η αιµοσφαιρίνη D δεν διαχωρίζεται από την αιµοσφαιρίνη A σε όξινο 

διάλυµα [HYDRAGEL 7 / 15 ACID(E) HEMOGLOBIN(E)]. Αυτή η ιδιότητά της επιτρέπει το διαχωρισµό της S από την D. 

2. Ποσοτικές διαταραχές: Θαλασσαιµίες 

Οι θαλασσαιµίες αποτελούν µια ετερογενή οµάδα γενετικών διαταραχών χαρακτηριζόµενων από µειωµένη σύνθεση κάποιας από τις 

πολυπεπτιδικές αλυσίδες της αιµοσφαιρίνης. Ο µοριακός µηχανισµός αυτής της µείωσης δεν έχει πλήρως περιγραφεί. 

Υπάρχουν δύο τύποι θαλασσαιµικών συνδρόµων: 

Άλφα θαλασσαιµίες 

Χαρακτηρίζονται από µείωση της σύνθεσης των α-αλυσίδων, µε αποτέλεσµα επίπτωση στη σύνθεση όλων των φυσιολογικών 

αιµοσφαιρινών. 

Η περίσσεια των ß- και γ- αλυσίδων σε σχέση µε τις α-αλυσίδες οδηγεί στο σχηµατισµό τετραµερών χωρίς α-αλυσίδες : 

• αιµοσφαιρίνη Bart = γ 4, 

• αιµοσφαιρίνη H = ß 4. 

Βήτα θαλασσαιµίες 

Χαρακτηρίζονται από µείωση της σύνθεσης των β-αλυσίδων. Επηρεάζεται µόνο η σύνθεση της αιµοσφαιρίνης A. 

Εποµένως αυξάνονται τα ποσοστά των αιµοσφαιρινών F και A2 σε σχέση µε την αιµοσφαιρίνη A. 

3. Ηλεκτροφορητικά προφίλ 

Ηλεκτροφορητική 

κίνηση φυσιολογικών 

αιµοσφαιρινών 

A(A 0 

+ A 1 

) A (A 0 

+ A 1 

) 

F 

S - D 

A 2 

ανυδράση 

σηµείο εφαρµογής 

A 2 

- C - E 

ανυδράση 

Ηλεκτροφορητική κίνηση 

κύριων παθολογικών 

αιµοσφαιρινών 

A 0 

: Το µη γλυκοζυλιωµένο κλάσµα της φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης του ενηλίκου A. 

A 1 

: Το γλυκοζυλιωµένο κλάσµα της φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης του ενηλίκου A. 

Στα παραπάνω προφίλ, η κάθοδος είναι κάτω και η άνοδος επάνω. 

- 67 -


Παρεµβολές και περιορισµοί. 

• Μην χρησιµοποιείτε αιµολυµένα δείγµατα αίµατος. 

• Όταν ανιχνεύεται µια παθολογική αιµοσφαιρίνη, η οποία κινείται διαφορετικά από τις κύριες παραλλαγές αιµοσφαιρίνης S, C, D και E, 

χρησιµοποιήστε άλλα µέσα ταυτοποίησης (π.χ.ισοηλεκτρική εστίαση, ηλεκτροφόρηση αλυσίδων σφαιρίνης) ή συµβουλευτείτε ή στείλτε 

το δείγµα σε εξειδικευµένο εργαστήριο. 

• Η πυκνοµέτρηση της Hb F (ή οποιασδήποτε άλλης ελάσσονος αιµοσφαιρίνης η οποία κινείται κοντά στα µείζονα κλάσµατα) είναι 

ηµιποσοτική καθώς οι τιµές γίνονται ανακριβής κάτω από το 2 % - 3 % της ολικής αιµοσφαιρίνης. 

• Μερικοί οµόζυγοι “S” λαµβάνουν θεραπεία µε “Hydrea”® (υδροξυουρία) η οποία µπορεί να επάγει παραγωγή εµβρυϊκής αιµοσφαιρίνης. 

Η κινητικότητα της επαγόµενης αιµοσφαιρίνης F στο HYDRAGEL 7 & 15 HEMOGLOBIN(E) έχει σε ορισµένες περιπτώσεις διαπιστωθεί 

διαφορετική από τη φυσιολογική αιµοσφαιρίνη F. 

• Σε δείγµατα τα οποία έχουν φυλαχθεί επί περισσότερες από 7 ηµέρες, το αποχρόν ίχνος πίσω από το κλάσµα HbA µπορεί να µετατραπεί 

σε καλώς εντοπισµένο κλάσµα. Μην ερµηνεύετε το κλάσµα αυτό ως ποικιλία αιµοσφαιρίνης, π.χ. αιµοσφαιρίνες H ή Bart. 

Αντιµετώπιση προβληµάτων 

Καλέστε την Τεχνική Υπηρεσία του προµηθευτή αν η ανάλυση δεν λειτουργεί παρόλο που οι οδηγίες προετοιµασίας και φύλαξης των 

υλικών και οι οδηγίες λειτουργίας τηρούνται προσεκτικά. 

Τα Φύλλα ∆εδοµένων Ασφαλείας των αντιδραστηρίων των κιτ και πληροφορίες για την ασφαλή απόρριψή τους διατίθενται επίσης από την 

Τεχνική Υπηρεσία του προµηθευτή. 

∆Ε∆ΟΜΕΝΑ ΑΠΟ∆ΟΣΗΣ 

Όλα τα δεδοµένα απόδοσης βασίζονται σε µια πολύ-εργαστηριακή µελέτη η οποία περιελάµβανε υλικά και όργανα SEBIA HYDRAGEL και 

άλλο συγκρίσιµο εµπορικά διαθέσιµο σύστηµα µε gel αγαρόζης. Επιπροσθέτως, πραγµατοποιήθηκαν µελέτες συµφωνίας όπου η 

ταυτοποίηση και η ποσοτικοποίηση των αιµοσφαιρινών έγιναν µε HPLC ή άλλες καθιερωµένες µεθόδους. 

Όλα τα ηλεκτροφορήµατα ερµηνεύτηκαν οπτικά. Το πυκνόµετρο SEBIA’s HYRYS χρησιµοποιήθηκε για όλες τις πυκνοµετρήσεις 

συµπληρωµατικά προς τα οπτικά δεδοµένα όπου κρίθηκε απαραίτητο. 

Αντιπροσωπευτικά αποτελέσµατα παρουσιάζονται παρακάτω. Οι µεµονωµένες τιµές, µέσοι όροι, SD και CV παρουσιάζονται παρακάτω. 

Συνολικά, τα αποτελέσµατα δείχνουν πολύ καλή αναπαραγωγιµότητα για όλες τις διερευνηθείσες παραµέτρους: 2.4 % ήταν ο µέσος CV 

µε το πρόγραµµα ηλεκτροφόρησης «7 / 15 Hb». Τα αποτελέσµατα ήταν όµοια µε το πρόγραµµα ηλεκτροφόρησης «7 / 15 Hb F-S». 

Αναπαραγωγιµότητα εντός της σειράς ανάλυσης 

∆ύο δείγµατα αίµατος ηλεκτροφορήθηκαν σε gel HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) από την ίδια παρτίδα. Κάθε δείγµα έτρεξε και στα 

15 ίχνη κάθε gel. Ο ακόλουθος πίνακας δείχνει τις µέσες τιµές, τις SD και τους CV για κάθε αιµοσφαιρινικό κλάσµα στα τρία δείγµατα για 

τις εκατοστιαίες τιµές για κάθε ίχνος. Επιπλέον, καµία από τις επαναλήψεις δεν έδωσε ψευδώς θετικό ή αρνητικό αποτέλεσµα. 

| ΚΛΑΣΜΑ | Μ.Ο. (%) | SD | CV (%) | 

Φυσιολογικό αίµα | Hb A 97.6 0.2 0.2 | 

Hb A 2 

| 2.4 | 0.2 | 7.7 Αυξηµένη Hb A2 | Hb A 95.3 0.2 0.2 | 

Hb A 2 

| 4.7 | 0.2 | 5.0 Αυξηµένη Hb C Hb A 57.8 0.4 0.7 | Hb C | 42.2 | 0.4 | 0.9 | 

Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ σειρών ανάλυσης 

∆εκαπέντε δείγµατα αίµατος ηλεκτροφορήθηκαν σε gel HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) από µια παρτίδα. Τα αναλυθέντα δείγµατα 

περιελάµβαναν εννιά δείγµατα µε µια παθολογική αιµοσφαιρίνη (Hb S ή Hb C) και πέντε δείγµατα µε αυξηµένη Hb A 2 

. Οι µέσες τιµές, SD 

και CV υπολογίστηκαν από τα δεδοµένα για κάθε κλάσµα σε κάθε δείγµα. Το εύρος των µέσων τιµών, SD και CV και ο µέσος CV από τα 

συγκεντρωµένα δεδοµένα για τα επιµέρους κλάσµατα παρουσιάζονται παρακάτω. Επιπλέον, καµία από τις επαναλήψεις δεν έδωσε 

ψευδώς θετικό ή αρνητικό αποτέλεσµα. 

ΚΛΑΣΜΑ Μ.Ο. (%) SD CV (%) ΜΕΣΟΣ CV (%) Hb A 21.6 – 98.0 0.1 – 0.6 0.1 – 2.4 0.7 Hb F 14.1 – 73.0 0.5 0.7 – 3.4 1.6 Hb C/E 20.0 – 42.4 0.3 0.7 – 1.3 1.0 Hb S/D 8.8 – 83.6 0.2 – 0.6 0.7 – 2.1 1.1 

| Hb A 2 

| 2.0 – 5.4 | 0.1 – 0.2 | 1.3 – 9.9 | 4.8 | 

Ακρίβεια – Ανίχνευση ανωµαλιών της αιµοσφαιρίνης 

Εξήντα τρία (63) διαφορετικά δείγµατα αίµατος αναλύθηκαν µε HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) και άλλο συγκρίσιµο εµπορικά διαθέσιµο 

σύστηµα gel αγαρόζης. Τα δείγµατα αίµατος και η διαγνωστική τους αξιολόγηση προσφέρθηκαν από νοσοκοµείο. Η διάγνωση βασιζόταν 

σε ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικό και όξινο gel και/ή HPLC. Όλες οι παθολογικές αιµοσφαιρίνες ή τα παθολογικά επίπεδα φυσιολογικών 

αιµοσφαιρινών που ανιχνεύθηκαν µε το HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) βρίσκονταν σε συµφωνία µε το συγκρίσιµο σύστηµα, τα 

αποτελέσµατα από το νοσοκοµείο και την κλινική διάγνωση. ∆εν υπήρξε περίπτωση ψευδώς θετικού, δηλ. ανίχνευση µιας παθολογικής 

ζώνης εκεί όπου δεν υπήρχε τέτοια ανωµαλία. ∆εν υπήρξε περίπτωση ψευδώς αρνητικού, δηλ. αποτυχία ανίχνευσης µιας παθολογικής 

ζώνης. 

- 68 -


Ακρίβεια – Ποσοτικός προσδιορισµός της Hb A2 

Τα επίπεδα Hb A2 µετρήθηκαν σε 51 δείγµατα αίµατος µε φυσιολογικά και αυξηµένα επίπεδα Hb A2 µετρήθηκαν µε πυκνοµέτρηση των 

ηλεκτροφορηµάτων που ελήφθησαν µε το HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E) και άλλο συγκρίσιµο εµπορικά διαθέσιµο σύστηµα gel 

αγαρόζης. Οι τιµές από τις δύο διαδικασίες αναλύθηκαν µε στατιστική επεξεργασία γραµµικής παλινδρόµησης. Τα αποτελέσµατα της 

ανάλυσης παρουσιάζονται παρακάτω (y = HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E)). 

| Συντελεστής συσχέτισης | Τοµή του y | Κλίση | Εύρος % τιµών | 

| | | | (Σύστηµα της SEBIA) | 

| 0.981 | 0.103 | 0.906 | 1.7 – 5.6 | 

Γραµµικότητα 

∆ύο δείγµατα αίµατος αραιώθηκαν σε διαφορετικές αναλογίες και οι αραιώσεις ηλεκτροφορήθηκαν σε 

15 HEMOGLOBIN(E). 

Η δοκιµασία διαπιστώθηκε γραµµική σε όλο το εύρος που µελετήθηκε. 

gel HYDRAGEL 

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 







860-863. 




Lab. Sci. 9, 243-271. 


- 69 -


For en dansk version af dette pakningsvedlæg, henvend Dem til den danske distributør af produkter fra SEBIA : 

ILS ApS Gydevang 22A DK-3450 Allerød 

Tlf : +45 48 14 18 50 

Fax : +45 48 14 18 60 

e-mail : ils@ilsdk.dk 

- 70 - 

SEBIA INSTRUKTION - Dansk


SCHÉMAS / FIGURES 

Figure 1 Figure 2 

1 2 3 4 567 8 9 10 11 121314 15 

Figure 3 Figure 4 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 

sebia 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 

Figure 5 

HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 

sebia 

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 

HYDRAGEL PROTEIN(E) 15/30 

sebia 

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 

HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) 

sebia 

1 2 3 4 5 6 7 

HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) 

sebia 

1 2 3 4 5 6 7 

- 71 -

Benelux s.a. / n.v. 

Rue de la Fusée, 62 

Raketstraat, 62 

1130 Bruxelles / Brussel 

BELGIQUE / BELGIË 

GmbH 

Michael Henkel Straße 4-6 

36043 Fulda 

DEUTSCHLAND 

Hispania S.A. 

C/Sicilia, 394 

08025 Barcelona 

ESPAÑA 

Parc Technologique Léonard de Vinci 

Rue Léonard de Vinci 

CP 8010 Lisses 

91008 EVRY CEDEX - FRANCE 

ISO 13485 

Italia s.r.l. 

Via Antonio Meucci, 15/a 

Località Ponte a Ema 

50012 Bagno a Ripoli, Firenze 

ITALIA 

Inc. 

400-1705 Corporate Drive 

Norcross, Georgia 30093 

U.S.A.

HYDRAGEL 15 HEMOGLOBIN(E)

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?