NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT STEVIOL GLYCOSIDE TỪ CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana B.)

C H I Ế T C Á C H Ợ P C H Ấ T
S T E V I O L G L Y C O S I D E
vectorstock.com/27117080
Ths Nguyễn Thanh Tú
eBook Collection
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT CÁC HỢP
CHẤT STEVIOL GLYCOSIDE TỪ CỎ NGỌT
(Stevia rebaudiana B.)
WORD VERSION | 2021 EDITION
ORDER NOW / CHUYỂN GIAO QUA EMAIL
TAILIEUCHUANTHAMKHAO@GMAIL.COM
Tài liệu chuẩn tham khảo
Phát triển kênh bởi
Ths Nguyễn Thanh Tú
Đơn vị tài trợ / phát hành / chia sẻ học thuật :
Nguyen Thanh Tu Group
Hỗ trợ trực tuyến
Fb www.facebook.com/DayKemQuyNhon
Mobi/Zalo 0905779594

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT CÁC HỢP CHẤT
STEVIOL GLYCOSIDE TỪ CỎ NGỌT
(Stevia rebaudiana B.)
GVHD: TS. LÊ XUÂN TIẾN
TP. HỒ CHÍ MINH – 12/2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
---------- -----------
Số………/BKDT
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Khoa:
Kỹ thuật Hóa Học
Bộ môn: Kỹ thuật Hóa Hữu Cơ
Họ và tên:
Chuyên ngành: Hóa dược
Lớp: HC13HD
1. Đề tài:
Nghiên cứu quy trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt.
2. Nhiệm vụ:
− Khảo sát quy trình chiết cỏ ngọt với dung môi nước.
− Khảo sát quy trình tinh chế dịch chiết cỏ ngọt bằng phương pháp gia vôi.
− Khảo sát quy trình tính chế dung dịch thu được sau quá trình gia vôi bằng phương
pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion.
3. Ngày giao nhiệm vụ: 03/2016
4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 12/2016
5. Giảng viên hướng dẫn: TS. Lê Xuân Tiến
Luận văn này được thông qua bởi Bộ môn Hóa hữu cơ - Khoa Kỹ thuật hóa học.
Tp. HCM, ngày tháng năm 2017
Trưởng bộ môn Hóa Hữu Cơ Giáo viên phản biện Giáo viên hướng dẫn
(Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký) (Họ tên và chữ ký)
ii

LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cám ơn đến thầy Lê Xuân Tiến đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến
thức trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Xin cám ơn các thầy cô trong bộ môn Kỹ thuật Hữu cơ đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn
em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Xin cảm ơn các bạn cùng thực hiện luận văn tại Phòng thí nghiệm Kỹ thuật Hữu cơ và
Phòng thí nghiệm Hóa dược đã hỗ trợ tôi hoàn thành tốt luận văn.
Xin cảm ơn những lời động viên, hỗ trợ từ gia đình và bạn bè.
iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xây dựng, khảo sát quy trình chiết và tinh chế các
hợp chất ngọt steviol glycoside từ cây cỏ ngọt. Quy trình chiết được xây dựng như sau:
trích ly cỏ ngọt với dung môi nước, loại màu sơ bộ dung dịch thu được bằng phương
pháp gia vôi, sau đó tiến hành tinh chế bằng phương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion.
Đây là “phương pháp sạch” để thu các chất ngọt từ cây cỏ ngọt, không sử dụng các loại
dung môi độc hại. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly được khảo sát bao
gồm: dạng nguyên liệu, tỉ lệ rắn/lỏng, thời gian, nhiệt độ, số lần chiết. Dựa vào hiệu suất
chiết và độ hấp thu UV (λ= 210 nm) để đánh giá chọn ra điều kiện thích hợp ở từng yếu
tố khảo sát. Quy trình loại màu bằng phương pháp gia vôi khảo sát những yếu tố sau:
nồng độ dung dịch, khối lượng Ca(OH)2/khối lượng cao, nhiệt độ, thời gian gia vôi. Tiếp
đến, khảo sát những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế steviol glycoside bằng
phương pháp sắc ký cột nhựa trao đổi ion bao gồm: tốc độ dòng chảy, tỉ lệ thể tích
nhựa/thể tích dịch. Sử dụng phương pháp so sánh màu và độ hấp thu UV (λ= 210 nm)
để xác định điều kiện tinh chế thích hợp nhất. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, điều kiện
trích ly thích hợp là: dạng nguyên liệu lá nguyên, tỉ lệ rắn/lỏng 1/8 g/mL, thời gian chiết
30 phút, nhiệt độ 90 oC, chiết 2 lần với hiệu suất chiết là 37.96%; điều kiện gia vôi thích
hợp nhất: nồng độ dung dịch 90 g/mL, khối lượng Ca(OH)2/khối lượng cao 1/1 g/g,
nhiệt độ 0 oC, thời gian 10 phút; điều kiện trao đổi ion tốt nhất: tốc độ dòng chảy 0.5
mL/phút, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch 1/10 mL/mL với hiệu suất quá trình là 12.22%.
Hiệu suất tổng toàn bộ quá trình chiết và tinh chế steviol glycoside là 4.64%.
iv

ABSTRACT
This study was carried out to develop and investigate the process of extracting and
purifying steviol glycosides from Stevia. The extraction procedure was as follows:
extraction of Stevia with water, preliminary decolorizing of the obtained extraction by
Ca(OH)2, and purification by ion exchange chromatography. This is a "green – method"
for obtaining sweeteners from Stevia, without the use of organic solvents. The factors
influencing the extraction process were investigated including: material type, solid
/liquid ratio, time and temperature of extraction, extraction times. Based on the
extraction efficiency and UV absorption (λ = 210 nm), to determine the appropriate
conditions for each factor. The decolorize process by Ca(OH)2 investigates the
following factors: solution concentration, Ca(OH)2 mass/extract mass, temperature and
time of reaction. Next, investigating the factors that affect the purification of steviol
glycoside by ion exchange chromatography, including: flow rate, plastic volume /extract
volume ratio. Use color difference and UV absorption (λ = 210 nm) to determine the
most suitable refining conditions. The results show that the appropriate extraction
conditions are: raw leaf material, solid /liquid ratio 1/8 g/mL for 30 minutes at
temperature 90 °C, with extract efficiency is 37.96%; the most suitable liming condition:
solution concentration 90 g/mL, Ca(OH)2 mass/extract mass 1/1 g/g at temperature 0 o C
for 10 minutes; the best ion exchange condition: flow rate 0.5 mL/min, plastic
ratio/extract volume 1/10 mL/mL with process efficiency of 12.22%. The total
extraction and purification efficiency of steviol glycoside was 4.64%.
v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. iii
TÓM TẮT LUẬN VĂN .............................................................................................. iv
ABSTRACT .................................................................................................................. v
MỤC LỤC .................................................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... ix
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................................ xii
DANH MỤC PHỤ LỤC ............................................................................................ xiii
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ xiv
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 15
1.1. Giới thiệu về cỏ ngọt ...................................................................................... 15
1.1.1. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................... 15
1.1.2. Mô tả thực vật ........................................................................................... 16
1.1.3. Bảo quản .................................................................................................... 17
1.1.4. Thành phần hóa học .................................................................................. 18
1.1.5. Tác dụng dược lý ....................................................................................... 22
1.1.6. Ứng dụng ................................................................................................... 24
1.2. Các công trình nghiên cứu tách chiết cỏ ngọt ............................................. 25
1.2.1. Nghiên cứu trong nước .............................................................................. 25
1.2.2. Nghiên cứu nước ngoài ............................................................................. 29
CHƯƠNG 2. Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm ..................................... 42
2.1. Mục tiêu nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu ............................................ 42
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 42
2.3. Hóa chất và thiết bị ........................................................................................ 42
vi

2.3.1. Hóa chất..................................................................................................... 42
2.3.2. Thiết bị ...................................................................................................... 42
2.4. Thực nghiệm ................................................................................................... 43
2.4.1. Nguyên liệu ............................................................................................... 43
2.4.2. Phương pháp đo độ ẩm .............................................................................. 43
2.4.3. Khảo sát điều kiện chiết cỏ ngọt với dung môi nước ................................ 43
2.4.4. Khảo sát quy trình tinh chế các hợp chất steviol glycoside ...................... 46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................. 52
3.1. Kết quả khảo sát quá trình chiết nước......................................................... 52
3.1.1. Khảo sát dạng nguyên liệu chiết ............................................................... 52
3.1.2. Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng ............................................................................... 54
3.1.3. Khảo sát thời gian chiết ............................................................................. 56
3.1.4. Khảo sát nhiệt độ ....................................................................................... 57
3.1.5. Khảo sát số lần chiết ................................................................................. 59
3.2. Khảo sát quá trình gia vôi ............................................................................. 61
3.2.1. Khảo sát nồng độ dịch chiết ...................................................................... 61
3.2.2. Khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao ........................................... 63
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ ....................................................................................... 65
3.2.4. Khảo sát thời gian phản ứng ..................................................................... 67
3.3. Khảo sát quá trình sắc ký cột nhựa trao đổi cation và anion .................... 69
3.3.1. Khảo sát tốc độ dòng chảy ........................................................................ 69
3.3.2. Khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch ................................................... 71
3.4. Sản phẩm thu được sau quy trình chiết và tinh chế các chất ngọt steviol
glycoside .................................................................................................................... 73
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.......................................................... 76
vii

4.1. Kết luận ........................................................................................................... 76
4.2. Kiến nghị ......................................................................................................... 76
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 77
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 85
viii

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình ảnh về cỏ ngọt ...................................................................................... 15
Hình 1.2. Khung steviol cơ sở xây dựng nên các glycoside có trong cỏ ngọt .............. 19
Hình 1.3. Quy trình chiết tách chất ngọt từ cỏ ngọt ở Việt Nam [59] ............................. 26
Hình 1.4. Quy trình chiết tách stevioside từ cỏ ngọt .................................................... 27
Hình 1.5. Quy trình chiết cỏ ngọt theo John Donald Payzant ...................................... 36
Hình 2.1. Quy trình tinh chế các chất ngọt trong cỏ ngọt ............................................. 46
Hình 3.1. TLC bột steviol glycoside có hàm lượng > 95% .......................................... 52
Hình 3.2. Nguyên liệu dạng: A – lá nguyên; B – bán nguyên; C – bột mịn. ................ 53
Hình 3.3. Hiệu suất chiết theo dạng nguyên liệu chiết (Phụ lục 1) ............................. 53
Hình 3.4. TLC các dịch chiết trong khảo sát dạng nguyên liệu chiết ........................... 54
Hình 3.5. Hiệu suất chiết theo tỉ lệ rắn/lỏng (Phụ lục 2) ............................................. 55
Hình 3.6. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng ........................... 55
Hình 3.7. Hiệu suất chiết theo thời gian (Phụ lục 3) .................................................... 56
Hình 3.8. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết ......................... 57
Hình 3.9. Hiệu suất chiết theo nhiệt độ (Phụ lục 4) ..................................................... 58
Hình 3.10. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát nhiệt độ chiết ........................ 58
Hình 3.11. Hiệu suất chiết theo số lần chiết (Phụ lục 5).............................................. 59
Hình 3.12. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết ....................... 60
Hình 3.13. TLC hiện màu và đã hiện màu của dịch chiết ban đầu A: là chất tạo màu
vàng nâu của dịch chiết (hệ giải ly EtOAc:EtOH:H2O:AF = 12:4:2.5:0.5) .................. 61
Hình 3.14. Độ khác biệt màu sắc ∆E của các dịch thu được so với dung dịch gốc (Phụ
lục 6) .............................................................................................................................. 62
Hình 3.15. TLC các dung dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ
....................................................................................................................................... 62
ix

Hình 3.16. Các dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ ............... 63
Hình 3.17. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ lượng
Ca(OH)2/khối lượng cao so với dung dịch gốc (Phụ lục 7) ......................................... 64
Hình 3.18. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tỉ lệ lượng
Ca(OH)2/khối lượng cao ................................................................................................ 64
Hình 3.19. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng
cao .................................................................................................................................. 65
Hình 3.20. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát
nhiệt độ so với dung dịch gốc (Phụ lục 8) .................................................................... 66
Hình 3.21. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ .............. 66
Hình 3.22. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ ............................... 67
Hình 3.23. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát thời gian so
với dung dịch gốc (Phụ lục 9) ....................................................................................... 68
Hình 3.24. TLC các dung dịch thu được sau quá trình gia vôi trong khảo sát thời gian
....................................................................................................................................... 68
Hình 3.25. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát thời gian .............................. 69
Hình 3.26. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng
chảy so với dung dịch gốc (Phụ lục 10) ....................................................................... 70
Hình 3.27. TLC các dung dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy .................. 70
Hình 3.28. Các dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy ................................... 71
Hình 3.29. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ thể tích
nhựa/thể tích dịch so với dung dịch gốc (Phụ lục 11) .................................................. 72
Hình 3.30. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tốc độ dòng chảy 72
Hình 3.31. Các dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch ............. 73
Hình 3.32. Dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu; B – Dịch sau quá trình gia vôi; C
– Dịch sau quá trình trao đổi ion. .................................................................................. 73
x

Hình 3.33. TLC của dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu; B – Dịch sau quá trình
gia vôi; C – Dịch sau quá trình trao đổi ion. ................................................................. 74
Hình 3.34. A – Cao chiết thô; B – Cao sau tinh chế. .................................................... 75
xi

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Cấu tạo của một số glycoside chủ yếu trong lá cỏ ngọt. Glc, Xyl, and Rha
tương ứng với glucose, xylose, and rhamnose [19] ........................................................ 20
Bảng 1.2. Tính chất vật lý của các hợp chất steviol glycoside trong cỏ ngọt [26] .......... 21
Bảng 3.1. Hàm lượng chất ngọt thu được sau quá trình chiết và tinh chế .................... 74
xii

DANH MỤC PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo dạng nguyên liệu trong
quá trình chiết ................................................................................................................ 85
Phụ lục 2. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo tỉ lệ rắn/lỏng trong quá
trình chiết ....................................................................................................................... 86
Phụ lục 3. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo thời gian trong quá trình
chiết ............................................................................................................................... 87
Phụ lục 4. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo nhiệt độ trong quá trình
chiết ............................................................................................................................... 89
Phụ lục 5. Bảng số liệu tính hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo số lần chiết trong
quá trình chiết ................................................................................................................ 91
Phụ lục 6. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nồng độ dung dịch trong
quá trình gia vôi ............................................................................................................. 92
Phụ lục 7. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối
lượng cao trong quá trình gia vôi .................................................................................. 93
Phụ lục 8. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nhiệt độ trong quá trình
gia vôi ............................................................................................................................ 95
Phụ lục 9. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo thời gian trong quá trình
gia vôi ............................................................................................................................ 96
Phụ lục 10. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tốc độ dòng chảy trong
quá trình trao đổi ion ..................................................................................................... 97
Phụ lục 11. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ thể tích nhựa/ thể
tích dịch trong quá trình trao đổi ion ............................................................................. 98
xiii

LỜI MỞ ĐẦU
Các nghiên cứu cho thấy mối liên hệ tiềm tàng giữa sử dụng đường ngọt và các vấn đề
sức khỏe, bao gồm béo phì và sâu răng. Sử dụng quá mức đường có liên quan đến bệnh
tiểu đường loại 2, béo phì, gia tăng bệnh tim và làm cho các tế bào ung thư phát triển
nhanh hơn. Theo nhiều nghiên cứu, các hợp chất ngọt chiết xuất từ cây cỏ ngọt có độ
ngọt gấp rất nhiều lần so với đường sucrose và rất tốt đối với sức khỏe con người khi
dùng trong một giới hạn cho phép. Hiện nay, trên thế giới đặc biệt là Nhật bản, Hàn
Quốc đã và đang sử dụng các hợp chất ngọt chiết xuất từ cỏ ngọt này để thay thế dần
cho đường sucrose và đường nhân tạo trong thực phẩm, dược phẩm. Tuy nhiên, ở Việt
Nam cỏ ngọt ít được người dân biết đến do chưa có quy trình chiết xuất các hợp chất
ngọt từ cỏ ngọt nào ứng dụng vào quy mô công nghiệp để sản xuất trong nước, nếu nhập
khẩu thì giá rất cao nên các hợp chất ngọt này chưa được bán nhiều ở nước ta. Nhìn thấy
được điều đó và dựa trên các nghiên cứu, thăm dò về cỏ ngọt, đề tài nghiên cứu quy
trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt hướng định hướng ứng dụng trong
quy mô công nghiệp được đề xuất.
xiv

CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cỏ ngọt
Tên thường gọi: cỏ ngọt hay cỏ đường, cỏ mật, cỏ cúc.
Tên khoa học: Stevia rebaudiana Bertoni
Giới: Plantae
Bộ: Asterales
Họ: Asteraceae
Tông: Eupatorieae
Chi: Stevia
Loài: S. rebaudiana
Hình 1.1. Hình ảnh về cỏ ngọt
1.1.1. Nguồn gốc và phân bố
Cỏ ngọt là cây bụi lâu năm thuộc họ Cúc Asteraceae, có nguồn gốc từ vùng Amambay
và Iguacu thuộc biên giới Brazil và Paraguay [1, 2] . Ngày nay được trồng nhiều ở một số
15

quốc gia trên thế giới như Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan, Thái Lan, Indonesia, Hoa
Kỳ, Brazil, Argentina, Paraguay, Mexico.
Cây cỏ ngọt bắt đầu được du nhập từ Nam Mỹ vào Việt Nam từ năm 1988 [3] . Hiện nay,
đã có khá nhiều giống cỏ ngọt được trồng và phát triển trên nhiều vùng trong cả nước,
từ các tỉnh phía Bắc như Hà Giang, Cao Bằng, Sơn La, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Hòa Bình,
Hà Nội… cho đến các tỉnh phía Nam như Lâm Đồng, Đắc Lắc. Tuy nhiên, mới chỉ có
rất ít nghiên cứu về thành phần cỏ ngọt, cũng như dinh dưỡng của lá cỏ ngọt được trồng
tại Việt Nam.
1.1.2. Mô tả thực vật
Thân cỏ ngọt có thể cao tới 1 m dạng thân bụi tròn nhiều lông, mọc thẳng. Cỏ ngọt phân
nhiều nhánh. Thân non màu xanh, già màu tím nâu, có hệ thân mầm phát triển mạnh. Lá
mọc đối thành từng cặp hình thập tự, mép lá có răng cưa. Lá hầu như không cuống, lá
trưởng thành dài 3-4 cm, rộng 0.6-1 cm, có 3 gân song song, lá màu xanh lục. Cây con
gieo từ hạt có 2 lá mầm tròn tới cặp lá thứ tư mới có răng cưa ở mép lá.
Toàn thân có vị ngọt, nhiều nhất ở lá. Lá già ở dưới thấp chứa nhiều chất ngọt hơn lá
non ở phía trên cao, lá chết khô ở dưới nhưng cuống rất dai nên không rụng (vẫn còn vị
ngọt).
Hoa tự, nhóm dày đặc trên đế hoa, trong đó có 4-7 hoa đơn lưỡng tính. Mỗi hoa đơn
hình chùy có cấu trúc gồm một đế hoa với 5 đài màu xanh, 5 cánh tràng màu trắng
khoảng 5 mm, các lá bắc tiêu giảm, nhị 4-5 dính trên tràng có màu vàng sáng, các chỉ
nhị rời còn bao phấn dính mép với nhau. Bầu hạ 1 ô, 1 noãn, vòi nhụy mảnh chẻ đôi,
các nhánh hình chỉ cao hơn bao phấn do đó mà khả năng tự thụ phấn thấp hoặc không
có. Quả và hạt nhỏ, thuộc loại quả bế, khi chín màu nâu sẫm. Hạt có 2 vỏ hạt, có phôi,
nhưng nội nhũ trần do vậy tỉ lệ này mầm thấp.
Rễ của cây gieo từ hạt ít phát triển hơn so với cành giâm. Hệ rễ chùm lan rộng ở đường
kính 40 cm và có độ sâu từ 20 – 30 cm, hệ rễ phát triển tốt trong điều kiện đất tơi xốp,
đủ ẩm. Là cây lâu năm có thân rễ khỏe, mọc nông từ 0–30 cm tùy thuộc vào độ phì
nhiêu, tơi xốp và mực nước ngầm của đất [4] .
16

Hạt cỏ ngọt có sức sống kém, tỷ lệ nảy mầm thấp nên cần chọn đất màu mỡ, dễ thấm
nước và thoát nước, kín gió và tưới tiêu thuận lợi, được thu hoạch khi đạt độ cao 1m
hoặc hơn [5] . Cỏ ngọt là cây lâu năm, có thể được thu hoạch trong 8 năm mỗi năm 6 lần
thu, khối lượng lá thu được khác nhau từ 15 tới 30 g/cây [6] . Cỏ ngọt chịu được lạnh
không thấp hơn 9 o C. Tốc độ phát triển nhanh nhất ở nhiệt độ 20-24 o C [7] .
Ở nước ta cỏ ngọt sinh trưởng quanh năm, nhưng cho thu hoạch cao nhất từ tháng 4 đến
tháng 11 dương lịch (trừ 3 tháng rét nhất là tháng 12, tháng 1 và tháng 2 ở phía Bắc).
Bởi vậy cỏ ngọt nên được trồng vào tháng 4 đến tháng 9, nhưng để có thu hoạch cao
ngay từ những năm đầu nên trồng vào tháng 4 và 5 Dương lịch, trong điều kiện đất đai
cho phép có thể trồng từ tháng 2-3, nhưng thời gian đầu cây sinh trưởng kém và thu
hoạch thấp, chậm.
Hiện nay trên thế giới và tại Việt Nam, lượng tiêu thụ cỏ ngọt là rất lớn. Vì vậy, ta cần
quan tâm đến những yếu tố ảnh hưởng đến việc trồng cỏ ngọt để cho năng suất cao, hàm
lượng chất ngọt nhiều. Tác giả Nguyễn Văn Tý và nhiều cộng sự [8] đã có nhiều nghiên
cứu ảnh hưởng nồng độ dung dịch đồng sulfat đến một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa và
năng suất cỏ ngọt trồng trên đất vườn đồi Bắc Thái. Sau đó cũng chính tác giả Nguyễn
Văn Tý đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ acid boric đến sinh trưởng và hàm lượng
stevioside của cây cỏ ngọt trồng trên đất Trung Du Việt Bắc.
1.1.3. Bảo quản
Phần lá sau khi thu hoạch đem rửa sạch, phơi nắng hoặc sấy thông gió cho đến khi khô.
Sau khi phơi 1 – 2 ngày thì tuốt lá và bảo quản lá khô trong túi nilông để tránh hút ẩm.
Bảo quản trong nơi khô mát, hàm lượng nước trong lá khô dưới 10%, tạp chất dưới 5%
Trong thời kỳ có mưa phải sấy bằng máy hoặc là sấy ở 30 o C trong 24h. Trong quá trình
phơi sấy phải đảo nhẹ và không xếp lớp.
Để sản phẩm lá khô có chất lượng cao, cần đảm bảo các đặc điểm cơ bản sau:
− Hình dáng bên ngoài: Lá khô có 1 phần cành ngọn
− Màu sắc: Nguyên liệu có màu xanh tự nhiên
− Mùi: Có mùi cỏ khô và mùi thơm đặc trưng của cỏ ngọt.
− Độ ẩm: <12%
17

− Tạp chất: không có lá mốc và đen, các tạp chất khác nhỏ hơn 5% [9] .
1.1.4. Thành phần hóa học
Cây cỏ ngọt (chủ yếu là lá) chứa những diterpene glycoside đặc biệt, tạo ra vị ngọt nhưng
không tạo ra hay tạo ra rất ít năng lượng. Steviol glycoside, tên gọi chung cho các
diterpene glycoside ngọt chiết xuất từ cỏ ngọt, là một hứa hẹn tái tạo những thứ thực
phẩm sống mới trên thị trường thế giới và thực vật không calorie, vị ngọt tự nhiên có
thể được sử dụng như một loại đường thay thế hoặc thay thế cho các chất làm ngọt nhân
tạo [10] .
Hiện nay, cỏ ngọt được biết nhiều đến về nồng độ diterpene ngọt cao khoảng 5-20%
khối lượng lá khô [11] , khoảng 0.9-1% khối lượng trong hoa [12] . Trong 240 loài thuộc chi
Stevia, chỉ có loài rebaudiana và phlebophylla chứa các steviol glycoside [13] . Những
hợp chất ngọt trong lá cỏ ngọt là nhóm các dẫn xuất diterpene glycoside, ngày nay đã
ghi nhận hơn 30 chất trong tài liệu khoa học [14] . Hợp chất chính trong lá cỏ ngọt là
stevioside (4-13% khối lượng lá khô), và tiếp theo có nhiều nhất là rebaudioside A (2-
4%). Một số steviol glycoside khác như dulcoside A (0.3%), rebaudioside B, C (1-2%),
D và F và steviolbioside cũng được xác định nhưng nồng độ thấp [15] . Các glycoside tìm
thấy chủ yếu trong lá của cây, nồng độ lên đến 15% , tùy thuộc vào giống [16] . Nồng độ
của các glycoside ngọt trong lá cỏ ngọt các nguồn khác nhau không giống nhau, nhiều
nghiên cứu [17] cho thấy nồng độ của nó phụ thuộc vào điều kiện phát triển [18] , cũng như
về việc áp dụng các kỹ thuật nông học hiện đại [19, 20] . Đa số các giống cỏ ngọt đều chứa
lượng rebaudioside A ít hơn nhiều so với stevioside [18] . Ở Việt Nam đã có vài nghiên
cứu về nồng độ steviol glycoside trong cây cỏ ngọt Việt Nam. Năm 2001, Nguyễn Kim
Cẩn và Lê Nguyệt Nga đã định lượng stevioside trong lá cỏ ngọt khô là từ 3% đến 6%.
Năm 2009, Phạm Thành Lộc và Lê Ngọc Thạch cũng đã xác được định hàm lượng
stevioside trong lá cỏ ngọt khô là 3,38%. Năm 2014, Trương Hương Lan đã xác định
hàm lượng stevioside trong các giống cỏ ngọt của nước ta dao động từ 2,13% đến 7,72%
và rebaudioside A thay đổi từ 2,05% đến 9,32%, trong đó lá cỏ ngọt S77 của Việt Nam
có hàm lượng steviol glycoside lớn nhất 11,53% [21] .
Tuy nhiên, cũng có một số công bố của các bằng sáng chế nước ngoài cho thấy một số
giống cỏ ngọt có hàm lượng rebaudioside A lớn hơn stevioside. Các giống cỏ ngọt này
18

đã được sử dụng để sản xuất rebaudioside A tinh khiết phục vụ cho chế biến một số loại
thực phẩm phẩm và đồ uống. Chiết xuất tinh khiết lấy từ lá cỏ ngọt và được cung cấp
trên thị trường có chứa chủ yếu là stevioside (> 80%) hoặc rebaudioside A (> 90%) [22] .
Tất cả các glycosides diterpene phân lập từ lá cỏ ngọt có cùng khung steviol (Hình 1.)
và chủ yếu khác nhau về gốc carbohydrate (R1 và R2), mono-, di-, và trisaccharide có
chứa glucose (C6H12O6) và / hoặc rhamnose (C6H12O5) và/ hoặc xylose (C5H10O5) tại
các vị trí C13 và C19 [23] .
Hình 1.2. Khung steviol cơ sở xây dựng nên các glycoside có trong cỏ ngọt
19

Bảng 1.1. Cấu tạo của một số glycoside chủ yếu trong lá cỏ ngọt. Glc, Xyl, and
Rha tương ứng với glucose, xylose, and rhamnose [19] .
Hợp chất R1 R2
Steviol H H
Steviolbioside H β-Glc-β-Glc(2→1)
Stevioside β-Glc β-Glc-β-Glc(2→1)
Rebaudioside A H β-Glc-β-Glc(2→1)
|
β-Glc(3→1)
Rebaudioside B β-Glc β-Glc-β-Glc(2→1)
|
β-Glc(3→1)
Rebaudioside
(Dulcoside B)
C
β-Glc
β-Glc-α- Rha(2→1)
|
β-Glc(3→1)
Rebaudioside D β-Glc-β-Glc(2→1) β-Glc-β-Glc(2→1)
|
β-Glc(3→1)
Rebaudioside E β-Glc-β-Glc(2→1) β-Glc-β-Glc(2→1)
Rebaudioside F β-Glc β-Glc-β-Xyl(2→1)
|
β-Glc(3→1)
Dulcoside A β-Glc β-Glc-α- Rha(2→1)
20

Tích chất hóa lý
Vị ngọt của steviol glycoside tăng với sự gia tăng số lượng các đơn vị đường gắn với
steviol aglycone. Tuy nhiên, nồng độ của chúng trong nguyên liệu thực vật giảm cùng
một lúc [24] . Stevioside tinh khiết thường tạo ra một dư vị đắng đáng kể [25] . Rebaudioside
A có thêm một đơn vị glucose so với stevioside, cả độ ngọt và chất lượng của hương vị
đều tốt hơn, là chất duy nhất trong cỏ ngọt không có dư vị đắng khi sử dụng [17] .
Vị ngọt của bất kỳ hợp chất steviol glycoside đều lớn hơn so với saccharose: stevioside
(250-300 lần), rebaudioside A (250-450 lần); rebaudioside B (300-350 lần); rebaudioside
C (50-120 lần); rebaudioside D (250-450 lần); rebaudioside E (150-300 lần); dulcoside
A (50-120 lần); và steviolbioside (100-125 lần). Tính trung bình, vị ngọt của các hợp
chất steviol glycoside lớn 250-300 lần so với đường saccharose.
Bảng 1.2. Tính chất vật lý của các hợp chất steviol glycoside trong cỏ ngọt [26]
Hợp chất Số CAS Khối lượng
phân tử
Nhiệt độ nóng
chảy ( o C)
Độ tan trong
nước (%)
Stevioside 57817-89-7 804 196–198 0.13
Rebaudioside A 58543-16-1 966 242–244 0.80
Rebaudioside B 58543-17-2 804 193–195 0.10
Rebaudioside C 63550-99-2 958 215–217 0.21
Rebaudioside D 63279-13-0 1128 283–286 1.00
Rebaudioside E 63279-14-1 966 205–207 1.70
Steviolbioside 41093-60-1 642 188–192 0.03
Dulcoside A 64432-06-0 788 193–195 0.58
Stevioside có độ tan trong nước tương đối thấp và nhiệt độ nóng chảy cao [27] . Tuy nhiên,
rebaudioside A lại tan tốt hơn stevioside 6-7 lần trong nước vì nó chứa thêm một đơn vị
21

glucose. Những phân tử này rất ổn định trong dung dịch nước trên phạm vi rộng giá trị
pH và nhiệt độ [28, 29] . Đun nóng trong phạm vi pH 1-10 hơn 2 giờ ở 60 o C, hầu như không
có bất cứ sự phân hủy stevioside nào diễn ra, phân hủy chỉ nhẹ tới 5% (pH 2 và 10) ở
nhiệt độ 80 o C. Trong điều kiện có tính axit mạnh (pH 1.0) sự phân hủy của stevioside
đã được quan sát mà kết quả tổng phân hủy sau khi ủ ở nhiệt độ 80 o C trong 2 giờ [28] .
Kết quả tương tự đã được báo cáo bởi Buckenhuskers và Omran (1997) cho thấy rằng
stevioside có một nhiệt độ ổn định tuyệt vời ở 100 o C trong 1 giờ ở khoảng pH 3-9, ,
không bị hóa nâu hay caramen hóa, nhưng phân hủy nhanh chóng xảy ra ở mức độ pH
lớn hơn 9 dưới điều kiện tương tự hay nhiệt độ quá 140 o C ở điều kiện tương tự [17] .
Ngoài ra, cỏ ngọt còn chứa các hợp chất khác như sterol (stigmasterol, sitosterol,
campesteol), flavonoid (Apigenin 4'-O-glucoside, Kampferol 3-O-rhamnoside, Luteolin
7-O-glucoside, 5,7,3'-Trihydroxy 3,6,4'-trimethoxyflavone), sterebin, cosmosiin, chất
dễ bốc hơi caryophyllenm spathuienol, chlorophyll A, triterpenoid. Tannin, carotennoid,
protein, xơ, cacbonhydrate, rutin… cũng tìm thấy trong cỏ ngọt với hàm lượng thấp. Và
một số thành phần vi lượng như phosphorus, sắt, canxi, kali, magie, kẽm,mangan,…
vitamin A, vitamin B2, vitamin C và axit folic cũng tồn tại trong cây cỏ ngọt [26] .
1.1.5. Tác dụng dược lý
Khả năng kháng khuẩn, kháng nấm
Nhiều nghiên cứu cho thấy lá cây cỏ và chiết xuất callus có thể là một ứng cử viên lý
tưởng để nghiên cứu sâu hơn về sử dụng của chúng trong việc bảo quản thực phẩm và
dược phẩm do các chất chống oxy hoá và các hoạt động kháng khuẩn [30] .
Dịch chiết cỏ ngọt có tính chất ức chế rotavirus [31] , chống vi khuẩn Helicobacter
pylori nên được đề nghị đem dùng trị u khối [32] . Phần chiết hay những hoạt chất của cỏ
ngọt có thể dùng để uống giảm hay chữa viêm tế bào [33] . Những người bị bệnh đái đường
không những có thể dùng stevioside mà chất này có khả năng hạ đường trong máu [34] ,
giảm huyết áp trên chuột [35] , trên chó [36] . Cũng ở trên chuột, nó ức chế sự phát triển ung
thư trên da. Cho trộn trong thuốc đánh răng, nó có tác dụng lên vi khuẩn Streptococcus
mutans kết dính lên răng và cấu thành các mảng răng [37-39] . Nó đã được dùng làm thuốc
kích thích tóc mọc [40, 41] , khử dioxin trong đất [42, 43] . Lá và cành có tính chất chống
histamin nên có thể dùng để kiềm chế những triệu chứng như ngứa ngáy, đau đớn [44] .
22

Khả năng kháng oxi hóa
Dịch chiết cỏ ngọt có khả năng kháng oxi hóa cao. Khả năng kháng oxi hóa của dịch
chiết cỏ ngọt được cho là khử các eletron tự do và superoxide [45] . Một nghiên cứu in
vitro năm 2009, chỉ ra rằng dịch chiết ethanol lá cỏ ngọt có tiềm năng được sử dụng như
một chất kháng oxi hóa tự nhiên [46] .
Độc tính [47]
− Nhiều thí nghiệm tiến hành cho chuột uống stevioside hoặc rebaudioside A tới
liều 2g/kg vẫn không thấy biểu hiện độc tính hay những sai lệch về trọng lượng
cơ thể, cũng như các phủ tạng sau 2 tuần theo dõi.
− Những thí nghiệm ở Nhật và Hàn Quốc cho thấy những chỉ tiêu cân nặng, huyết
học, sinh học và xét nghiệm tế bào mô học gan đều tỏ ra bình thường sau 56 ngày
cho chuột ăn 0.25 hoặc 0.5g stevioside.
− Độc tính với thận: Năm 1988, Panichkul T. thực nghiệm trên chuột, đã thông báo
stevioside có thể gây độc với thận, làm tăng urê và creatinin huyết thanh khi cho
quá liều, gây bại niệu, natri niệu và làm ức chế sự vận chuyển paraaminohippurate
(PAH) trong ống gần thận [48-50] .
− Theo GS Ryan Huxtable- đại học University of Arizona, Tuscon - cho biết
stevioside có thể ảnh hưởng đến hoạt động của chức năng sinh dục, như làm giảm
số lượng tinh trùng ở chuột đực, giảm kích thước tinh nang hoặc có thể dẫn đấn
tình trạng vô sinh.
Nhưng trong những thí nghiệm này người ta đã sử dụng những liều lượng stevioside
khổng lồ, thực tế hằng ngày chúng ta chỉ sử dụng những liều lượng stevioside rất thấp
xa so với những liều lượng đã dùng để thí nghiệm ở trên.
Một số đánh giá an toàn của stevioside và chiết xuất cỏ ngọt đã được thực hiện để xác
định mức độ độc tính, gây đột biến, gây ung thư, độc tính di truyền và các vấn đề sinh
sản, tất cả đều được tìm thấy là âm tính [51-55] . Các kết quả này khẳng định rằng stevioside
và các glycosid khác có trong chiết xuất Stevia có khả năng an toàn đối với người tiêu
dùng và không ngụ ý bất kỳ mối nguy hiểm nào về sức khoẻ khi sử dụng lâu dài.
23

1.1.6. Ứng dụng
Từ những năm đầu của thế kỷ 20, người dân Paraguay đã biết dùng cỏ ngọt như một
loại nước giải khát, cho đến những năm 1960, việc trồng thương mại bắt đầu ở Paraguay
và Nhật Bản, và sau đó ở các nước khác. Stevioside và rebaudioside A là chất chiết xuất
từ lá cỏ ngọt hiện nay được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đông
Nam Á và Nam Mỹ, như chất làm ngọt trong nhiều loại thực phẩm. Kể từ khi có sự chấp
thuận của chất làm ngọt Stevia ở Hoa Kỳ bởi FDA và EU năm 2008, lợi ích công nghiệp
của cỏ ngọt đã tăng lên nhanh chóng [56, 57] .
Năm 2008, Joint Expert Committee on Food Additives (JECFA) đã phát hiện và phản
hồi yêu cầu của European Commission về European Food Safety Authority (EFSA) để
đưa ra những quan điểm khoa học về độ an toàn của steviol glycoside, chất ngọt được
sử dụng trong thực phẩm. Sau khi xem xét tất cả các dữ liệu về độ ổn định, các sản phẩm
xuống cấp, quá trình trao đổi chất và độc tính, EFSA đã thành lập ADI cho các hợp chất
steviol glycoside có độ tinh khiết ≥95% là 4 mg/kg bw/day. Năm 2009, JECFA đã sửa
đổi cho phép rebaudioside D và F được sử dụng như là một phần của hỗn hợp steviol
glycoside với độ tinh khiết ≥ 95% và điều này đã được EFSA phê duyệt.
Năm 2008, FDA đã xem xét các dữ liệu về steviol glycoside và tham khảo ý kiến từ các
cơ quan có thẩm quyền như JECFA và Viện hàn lâm khoa học quốc gia đã chấp nhận
hỗn hợp steviol glycoside có độ tinh khiết cao ≥ 95% được sản xuất phù hợp với FDA
Good Manufacturing Practices được sử dụng trong thực phẩm với lượng ADI như
JECFA đưa ra. [58]
Cỏ ngọt được dùng như một loại trà dành cho những người bị tiểu đường, béo phì hay
cao huyết áp. Trong công nghiệp thực phẩm, cỏ ngọt dùng để pha chế làm tăng độ ngọt
mà không làm tăng năng lượng của thực phẩm. Ngoài ra, cỏ ngọt còn được dùng trong
dược phẩm, mỹ phẩm như sữa làm mượt tóc, kem làm mềm da.
24

1.2. Các công trình nghiên cứu tách chiết cỏ ngọt
1.2.1. Nghiên cứu trong nước
1.2.1.1. Phương pháp chiết và tinh chế
Ở Việt Nam chỉ mới đưa ra quy trình chiết và cô lập stevioside trong phạm vi phòng thí
nghiệm, chưa ứng dụng được vào sản xuất. Đây là quy trình được đưa ra bởi các tác giả
ở Viện dược liệu năm 2006.
Lá cành nhỏ
- Ethanol 80 o , hồi lưu 30 phút, 60 O C.
- Lọc
(4 lần)
Dịch chiết
Cắn
- Cô quay loại dung môi
- Nước nóng
- Khuấy
Bã
Dịch sệt
- Chiết
- Lắc với ether dầu hoả
Pha ether dầu
Pha nước
- Đun cách thuỷ
- Lắc với BuOH
Pha BuOH
- Cô quay loại dung môi
Pha nước
Stevioside thô
- Kết tinh lạnh nhiều lần trong MeOH
- Lọc
Chế phẩm Stevioside
25

Hình 1.3. Quy trình chiết tách chất ngọt từ cỏ ngọt ở Việt Nam [59]
Cỏ ngọt khô được chiết hồi lưu 4 lần mỗi lần 30 phút bằng ethanol 80% ở 60 o C. Tập
trung dịch chiết, cô quay chân không để thu hồi dung môi ethanol cho tới khi dịch cô
đặc hu được cắn. Thêm khoảng 20% nước cất nóng so với lượng dịch ban đầu, tạo thành
dịch sệt. Loại lipid bằng ether dầu hỏa. Dịch sau khi đã loại bỏ lipid đưa đi chưng cách
thủy để tách ether dầu hỏa. Lắc dịch chiết với n-butanol bão hòa nước, cho đến khi dịch
nước không còn stevioside nữa. Cất thu hồi n-butanol và cô đặc. Cuối cùng, kết tinh lại
nhiều lần trong methanol thu được stevioside tinh khiết.
Ưu điểm:
− Stevioside thu được tương đối tinh khiết
Nhược điểm:
− Lượng stevioside thu được ít, dễ ngã màu trong không khí
− Dung môi sử dụng tinh chế đắt tiền, tương đối độc hại
− Quy trình tốn nhiều thời gian, phức tạp.
26

Theo Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Tôn Nữ Liên Hương và đồng nghiệp
đã đưa ra 2 phương pháp chiết tách và tinh chế stevioside từ cỏ ngọt [60] .
- Acid hóa bằng
citric acid với
pH=3
- Khuấy 30 phút
- Lọc với celite
- Ngâm với nước cất (tỉ lệ 25:30 g:ml)
- Trong 2 giờ ở 65 o C.
- Lọc bỏ bã
Cách 1 Cách 2
Dịch dưới lọc
Bột cỏ ngọt khô
Dịch chiết
(2 lần)
- Sắc ký cột với silicagel
- Hệ giải ly chloroform và
methanol với độ phân
cực tăng dần
Phân đoạn chứa stevioside
- Kiềm hóa bằng Ca(OH)2
với pH=10,5
- Khuấy 1 giờ ở 50 o C
- Lọc với celite
- Trung hòa tới pH=7
Cô bớt dung môi
- Chiết với n-butanol
Pha BuOH
- Loại hết dung môi
Rắn
Tinh thể
- Hòa tan trong MeOH nóng
- Làm lạnh 0-5 o C , kết tinh
Hình 1.4. Quy trình chiết tách stevioside từ cỏ ngọt
27

Chiết cỏ ngọt với nước 2 lần mỗi lần trong 2 giờ ở 65 o C. Lọc dịch chiết, đuổi bớt dung
môi còn khoảng 20% dịch so với ban đầu.
Cách 1: Dịch chiết được acid hóa bằng citric acid đến pH gần bằng 3, khuấy nhẹ dung
dịch trong 30 phút. Dung dịch sau khi acid hóa lọc qua cột celite. Dung dịch sau lọc
được kiểm hóa bằng calcium hydroxide tới pH 10.5 ở 50 o C, khuấy đều trong 1 giờ. Lọc
dịch qua cột celite. Trung hòa dịch tới pH 7 bằng citric acid. Cô quay dung dịch loại bớt
nước. Chiết lỏng lỏng với n-butanol để loại phần tạp còn lại, thu lấy lớp n-butanol, cô
quay loại hoàn toàn dung môi. Kết tinh trong methanol, làm lạnh 0-5 o C và để qua đêm,
thu lấy tinh thể.
Cách 2: Tiến hành sắc ký cột (SKC), sử dụng chất hấp phụ là silicagel. Giải ly cột sắc
ký lần lượt với các hệ dung môi là những hỗn hợp chloroform và methanol với độ phân
cực tăng dần. Theo dõi quá trình SKC bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM), với hệ dung môi
giải ly là n–butanol:nước:acid acetic = 4:5:1 (v/v), hiện vết với dung dịch acid
sulfuric:methanol = 1:10 (v/v), sấy bản mỏng ở 110°C trong 2 phút. Thu phân đoạn cao
chứa stevioside và tiếp tục sắc ký cột rồi kết tinh lại trong dung môi thích hợp để thu
được stevioside tinh khiết.
Kiểm tra độ tinh khiết của stevioside : Dùng SKLM, hệ giải ly: n-butanol:nước:acid
acetic tỉ lệ 4:5:1 (v/v).
Ưu điểm
− Cách 1 dung môi tương đối không độc hại, trừ methanol;
− Quy trình đơn giản, ít tốn thời gian.
Nhược điểm
− Hiệu suất chiết không cao;
− Cách 2 khó ứng dụng vào quy mô công nghiệp.
1.2.1.2. Phương pháp định lượng
Tất cả các bài báo nghiên cứu về thành phần và hàm lượng steviol glycoside trong cỏ
ngọt ở nước ta đều dùng phương pháp định lượng bằng HPLC. Theo bài báo của Trương
Hương Lan và đồng nghiệp, điều kiện chạy HPLC của dịch chiết nước cỏ ngọt ban đầu
như sau [21] :
28

− Cột sắc ký: Supelco LC-NH2 250x4.6mm, 5µ
− Pha động: acetonitrile:nước tỉ lệ 10:30
− Tốc độ dòng: 1.5 mL/phút
− Nhiệt độ buồng cột: 30 o C
− Đầu dò: PDA 2996 ở bước sóng 210nm
1.2.2. Nghiên cứu nước ngoài
1.2.2.1. Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết và tinh chế các
hợp chất steviol glycoside
Các kỹ thuật được sử dụng để thu được steviol glycoside có thể phân loại vào những
hạng mục khác nhau, như dựa trên chiết dung môi [61, 62] , hấp phụ sắc ký [63-66] ,trao đổi
ion [67-69] , kết tủa chọn lọc [70] , phương pháp màng [67, 68, 71] và các chất lỏng siêu tới hạn
[72] .
Hầu hết các quy trình chế biến cỏ ngọt được tiến hành ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn
Quốc, Brazil hoặc Paraguay. Quy trình chiết steviol glycoside từ lá cỏ ngọt phổ biến
nhất bao gồm các bước sau:
− Ngâm lá trong nược ấm/nóng để hòa tan steviol glycoside
− Lọc với chất trợ lọc, lấy dịch lọc
− Loại dung môi bằng bay hơi chân không
− Sử dụng nhựa trao đổi để thu được các phân đoạn steviol glycoside có nồng độ
cao
− Tinh chế trao đổi ion (đôi khi)
− Bay hơi và sấy phun hoặc, ít phổ biến hơn, kết tinh để tạo bột/tinh thể.
Một số chế biến thứ cấp được thực hiện tại Nhật để cải thiện chất lượng hương vị. Quy
trình trên giống với quy trình chiết đường thô từ mía [26] .
Phương pháp chiết dung môi
Dung môi hữu cơ thường được sử dụng để chiết xuất hợp chất tự nhiên từ thực vật, do
tính chọn lọc của chúng đối với các thành phần hữu cơ. Các dung môi hòa lẫn vào nước,
methanol, chloroform, n-butanol, ethanol và rượu béo đã được sử dụng để chiết xuất
stevioside từ lá cỏ ngọt (Fumio 1980 [73] , Jackson và cộng sự, 2006 [74] ; Pol và Shigeji
29

1980 [75] , Tadaaki 1976 [76] , Tadashi và Masato 1995 [77] , Toyoshige và Usei 2002 [78] ).
Stevioside và rebaudioside A được tinh chế thêm bởi quá trình kết tinh và kết tinh lại từ
dung môi. Tuy nhiên, nhược điểm chính của các phương pháp này là sử dụng các hóa
chất độc hại có hại cho sức khoẻ. Vì vậy, đa số các nghiên cứu sử dụng nước như một
dung môi để chiết. Việc sử dụng nước và methanol làm phương tiện chiết xuất trong
điều kiện áp suất được nghiên cứu bởi Pol (2007) [75] .
Trong một nghiên cứu, Chhaya [79] đã sử dụng cách tiếp cận có hệ thống để đánh giá các
điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất stevioside từ lá cỏ ngọt bằng phương pháp phản ứng
bề mặt. Các điều kiện tối ưu để chiết là:
− Nhiệt độ 78 ° C
− Thời gian đun nóng 56 phút
− Tỉ lệ lá và nước 1:14 (w / v).
Dưới điều kiện này, chiết xuất stevioside là 10,5g / 100g lá khô Stevia. Cần lưu ý rằng
các điều kiện trên liên quan đến giống cỏ ngọt của Ấn Độ, cần khảo sát lại khi sử dụng
giống cỏ ngọt khác.
Phương pháp chiết siêu âm
Chiết stevioside bằng phương pháp này đầu tiên do Jaunak và cộng sự (2009). Họ đã
tiến hành chiết bột lá cỏ ngọt sử dụng các dung môi khác nhau (nước, methanol, ethanol,
hỗn hợp nhị phân của methanol-nước và ethanol-nước) trong một bồn siêu âm ở 35°C
trong 30 phút. Dịch chiết được lọc và sấy khô thành bột (ở 50°C). Hàm lượng 4,2% đối
với stevioside và 2,0% đối với rebaudioside A đối với hỗn hợp methanol-nước (80: 20)
gần như tương đương với kết quả thu được bằng phương pháp thông thường (sử dụng
methanol-nước làm dung môi với thời gian 12 giờ), tức là 6,04% stevioside và 1,2%
rebaudioside A [26] .
Bằng sáng chế Trung Quốc (Ruihua và cộng sự, 2010) [80] cũng mô tả sự hỗ trợ siêu âm
trong quá trình chiết xuất lá cỏ ngọt. Bột stevioside 85-98% được sản xuất bằng cách sử
dụng các phương pháp khác nhau (keo tụ, lọc, hấp thụ, khử màu, cô đặc và sấy phun)
sau khi chiết siêu âm.
30

Phương pháp chiết bằng vi sóng
Một số lợi thế chiết xuất bằng vi sóng (MAE) giúp nó cạnh tranh với các quy trình thông
thường khác. Đây là những phương pháp tách nhanh hơn, giảm sử dụng dung môi và
tinh chế nhanh hơn. MAE của stevioside và rebaudioside A lần đầu tiên được báo cáo
bởi Jaitak et al. (2009) [81] . Trong nghiên cứu này, việc chiết xuất lá cỏ ngọt bằng nước,
methanol, ethanol và hỗn hợp nhị phân methanol-nước và etanol-nước được tiến hành
với sự hiện diện của lò vi sóng ở các mức công suất khác nhau trong khoảng từ 20 đến
160W với thời gian chiết 30 giây đến 5 giây ở nhiệt độ 10-90°C. Kết luận rằng sản lượng
stevioside (8,64%) và rebaudioside A (2,34%) cao hơn so với phương pháp truyền thống
(6,54% và 1,20%). Công suất 80W, 50°C và thời gian 1 phút cho kết quả tối ưu. Dung
môi nước:methanol (80:20) là môi trường chiết tốt nhất với sự hỗ trợ vi sóng mức tới
mức cao nhất.
Phương pháp tinh chế bằng các chất tạo phức:
Để khắc phục việc sử dụng các hoá chất độc hại và thiết bị chậm, chuyên dụng và đắt
tiền như sắc ký và trao đổi ion, các chất tạo phức đôi khi được sử dụng để loại các thành
phần không mong muốn / tạo thành phức hợp với các chất này, dẫn đến sự loại bỏ dễ
dàng hơn.
Kumar (1986) [70] đã đề xuất một quy trình chiết stevioside có sử dụng chất tạo phức.
Trong đó lá đã được nghiền nhỏ thành kích thước mong muốn và được chiết xuất với
nước nóng ở 60-80°C trong 2-5 giờ. Dịch chiết nước được cho tạo phức với axit
carboxylic, chẳng hạn như axit citric, để loại bỏ vật liệu kim loại, protein hoặc màu tạo
thành ở khoảng pH 2-4. Hỗn hợp được khuấy khoảng 1-2 giờ ở nhiệt độ 30-80°C và lọc
qua celite (chất trợ lọc). Độ pH của dung dịch kết quả tăng lên 10-13 bằng cách sử dụng
canxi oxit hoặc canxi hydroxit, được đun nóng trong khoảng từ 35-80 o C trong 1-2 giờ
và làm lạnh đến nhiệt độ phòng với sự khuấy chậm. Dung dịch này được lọc lại bằng
diatomit để loại bỏ các prôtêin, chất màu,… Các dung dịch đã được khử màu sau đó
được trung hòa bằng axit cacboxylic hữu cơ như axit citric. Dịch lọc chiết với dung môi
như n-butanol bão hòa. Lớp nước sau đó được làm lạnh đến 5-12°C trong 8-14 giờ để
lấy tinh thể stevioside đem lọc và sấy khô. Hiệu suất của quá trình là 7.5%.
31

Năm 1990, Giovanetto [68] trong một nghiên cứu về quy trình chiết cỏ ngọt đã sử dụng
canxi hydroxit cho vào dịch chiết nước để tạo tủa loại bỏ các hợp chất không mong
muốn.
Deji (2009) đã phát minh ra một phương pháp cải tiến để chiết xuất stevioside bao gồm
các bước sau:
− Chiết hoàn lưu với nước
− Keo tụ bằng đất sét biến tính
− Vi lọc
− Hấp thụ bằng nhựa ADS-4 và -7
− Dịch giải ly được cô đặc bằng cô quay chân không
Những thuận lợi của quá trình này là: tốc độ nhanh và độ tinh khiết cao (lên đến 90%);
các vật liệu nhạy nhiệt không bị phá hủy; Thông lượng cao, và có thể được thực hiện
một quá trình liên tục.
Weiping và Zhou (1999) [82] mô tả một quy trình để chiết xuất các STEVIOL
GLYCOSIDE:
− Chiết cỏ ngọt trong nước nóng hoặc dung dịch ethanol trong 1-3 giờ
− Dịch chiết được trộn với một dung dịch bão hoà của canxi hoặc nhôm hydroxyd
và trộn đều trong 1-3h, kết tủa các chất không mong muốn
− Dịch lọc cho qua một cột hấp phụ trung tính, nó hấp thụ các glycosid
− Giải ly cột bằng dung dịch ethanol để làm sạch các glycosid
− Dịch giải ly bằng ethanol được cho qua cột kiềm thứ hai, nơi các chất không
mong muốn được hấp phụ, thu được dung dịch ethanol với glycosid tinh khiết.
− Sau đó, dung dịch được sấy phun hoặc cô quay bằng chân không ở 50°C và thu
được bột rắn, khoảng 80% độ tinh khiết.
Abelyan và cộng sự (2010) [83] đã phát minh ra một phương pháp để trích xuất stevioside
và rebaudioside A độ tinh khiết cao từ nhà máy:
− Chiết cỏ ngọt với nước ở 50-60 ° C trong khoảng 1-6 giờ.
− Tăng hiệu suất chiết bằng cách bổ sung enzym pectinase (2g / L)
32

− Dịch lọc được kết tủa bằng canxi hydroxit ở khoảng 50°C trong khoảng 1 giờ
đến pH khoảng 10,0 và làm mát đến nhiệt độ môi trường xung quanh
− Keo tụ dung dịch với bentonit (2-3 g / l)
− Dịch lọc trộn với ethanol ở khoảng 50°C trong khoảng 30 phút); Tủa đã được
loại ra và bột chứa khoảng 84% rebaudioside A
− Dịch thu được cho qua một cột nhựa trao đổi ion sau khi đó bay hơi ethanol, cô
đặc và làm khô. Cắn thu được chứa stevioside tinh khiết 93%.
Một loạt các bằng sáng chế của Nhật Bản có sẵn để sử dụng các chất tạo phức khác nhau
để tinh chế chiết xuất cỏ ngọt. Một số trong đó bao gồm việc sử dụng thiếc chloride,
thiếc sulfate, axit stannic,…, các muối Ca và Fe khác nhau (Shinichi và cộng sự,
1980 [84] ), và sử dụng CaCl2 và Ca(OH)2 (Kotaro Và Tokuo 1987 [85] , Taku và Yukio
1983 [86] , Yukio và cộng sự, 1983 [87] ).
Phương pháp trao đổi ion:
Trao đổi ion là một quá trình trong đó tạp chất tích điện âm và nó được loại bỏ khỏi
dòng nước bằng các chất nhựa tích điện dương [88] . Năm 1973, Persinos [89] đã nộp một
bằng sáng chế về sản xuất stevioside từ nhà máy Stevia. Cây và lá đã được sấy khô và
nghiền nhỏ trộn với canxi cacbonat và nước và hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong
khoảng 20 giờ. Sau đó, chất cặn được lọc, sau đó cô quay loại bớt dung môi và quy trình
được lặp lại hai lần. Dịch lọc được trộn với Amberlite IR-120 nhựa trao đổi ion. Chất
kết tủa gồm nhựa đã được lọc. Dịch lọc được khử ion bằng cách cho qua hai cột nhựa
trao đổi ion (Amberlite IR-120(+) và Duolite A4 (-)). Tập trung dịch qua cột để qua đêm
ở 50°C. Cô dịch thu được cắn, sau đó hòa tan trong methanol và làm lạnh đến 5°C để
có được tinh thể stevioside. Tăng độ tinh khiết bằng cách kết tinh lại nhiều lần.
Năm 1987, Adduci [90] báo cáo cách chiết stevioside bằng ba bước chính: trích nước nóng
và sự khử màu bằng điện phân và sau đó trao đổi ion. Độ tinh khiết của stevioside đạt
được 70-80% và năng suất khoảng 10%. Nhiệt độ chiết nước là 90-100°C. Điện phân
được thực hiện bằng cách sử dụng dòng điện dòng 30 Ampe trong 2 giờ bằng cách bổ
sung 0,02M HCl / lít dịch chiết. Lọc hỗn hợp và điện phân lần thứ hai được thực hiện
trong khoảng 20-30 phút theo các điều kiện hoạt động ở trên. Sau khi lọc thu được dung
dịch có màu vàng, sau đó cho dịch qua một cột nhựa trao đổi ion hỗn hợp bao gồm
33

Amberlite MB-1 (Amberlite IR-120 (+) và Amberlite IRA-401 (-)). Trong dịch đi ra, có
một dung dịch trong suốt với độ dẫn điện nhỏ hơn 50 S/m. Cắn thu được sau khi cô quay
dung dịch đó không có vị hậu, có thể kết luận đó là rebaudioside A.
Bằng sáng chế Hàn Quốc [91] có một phương pháp trong đó dịch chiết được cho qua cột
nhựa trao đổi ion tích điện dương (Diaion SKIB) và sau đó cho qua cột nhựa tích điện
âm (Amberlite IRA-904). Trong phương pháp này, thu được một hỗn hợp các steviol
glycoside. Một quy trình được cấp bằng sáng chế của cùng một công ty bao gồm việc
xử lý dịch chiết nước với canxi clorua và sau đó đi qua cột nhựa phân cực vừa Amberlite
XAD-7. Giải ly cột bằng methanol và được tinh chế bằng sắc ký cột. Stevioside được
tinh chế tiếp bằng cách kết tinh với methanol. Tuy nhiên, trong phương pháp này, cả
hóa chất, canxi clorua và methanol, đều độc hại. Phép sắc ký cột cũng không khả thi về
mặt thương mại. Trong một bằng sáng chế khác [92] , chiết xuất nước đã được xử lý bằng
nhựa anion thì stevioside thu được có độ tinh khiết thấp. Trong các bằng sáng chế khác
ở Nhật Bản, tinh chế stevioside bằng nhựa trao đổi ion không cần thiết (Toyoshige
1984).
Năm 1990, Giovanetto [68] công bố một phương pháp, trong đó dịch chiết nước được ly
tâm và sau đó xử lý bằng canxi hydroxit. Dịch đã được lọc tủa được tinh chế bằng cách
sử dụng nhựa trao đổi ion tích điện âm (Dowex 50 W và Rohm và Haas IRA 120,…) và
ion tích điện dương (Dowex WGR, Dowex MWA-1,Rohm và Haas IR4B,…). Có thể
lặp lại nhiều lần, sau đó cô dung dịch thành cắn, chứa 75% stevioside.
Năm 1999, Payzant [69] đề xuất một quy trình trao đổi ion hai bước để làm sạch steviol
glycoside từ lá cỏ ngọt. Tính năng nổi bật của phương pháp này là tách từng steviol
glycoside riêng ra khỏi hỗn hợp của chúng. Trong bước đầu tiên của phương pháp này,
chiết lá cỏ ngọt bằng nước. Sau khi chiết, dịch lọc được loại tạp bằng cách tủa với
Ca(OH)2. Tiếp theo, lọc loại tủa rồi cho dịch lọc qua một loạt các loại nhựa trao đổi ion
để loại bỏ các axit hữu cơ, muối vô cơ, các chất phenol, protein,… Dung dịch thu được
có chứa hỗn hợp 70% steviol glycoside. Thu hồi dung môi, thu được bột khô được hòa
tan trong nước và được đưa đi qua một lớp nhựa Amberlite XAD-7 (nhựa không phân
cực). Steviol glycoside và tạp dầu gây ra vị đắng được hấp thụ trong lớp nhựa, các
glycoside không ngọt và tạp chất carbohydrate không bị hấp phụ. Cột được giải ly bằng
dung dịch methanol, sau đó cô quay thu được 95% steviol glycoside. Cắn hòa tan vừa
34

đủ với methanol khan, sau đó làm mát thu được kết tinh stevioside, lọc lấy tính thể. Dịch
lọc được đun nóng và làm mát sau đó để cho kết tủa thu được rebaudioside A. Chất này
có thể tinh chế tiếp bằng cách hòa tan với methanol và đưa nó vào một loạt các bước
đun nóng và làm mát để độ tinh khiết cuối cùng của rebaudioside A lên tới 95%. Quy
trình có ưu điểm:
− Quy trình đơn giản
− Ứng dụng được trong công nghiệp
− Sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao
35

Dịch chiết nước
Tủa với Ca(OH)2
Dịch lọc
Lọc loại tủa
Cô bớt dịch lọc
Giải ly cột
bằng MeOH
Cột trao đổi ion
Cột nhựa phân
cực vừa
>70% hỗn hợp steviol
glycoside
Cô bớt dung môi dịch
giải ly
>90% hỗn hợp steviol
glycoside
Làm lạnh để tủa
Lọc tủa kết tinh lại nhiều lần thu
được stevioside 95%
Dịch lọc
− Cô bớt dịch lọc
− Thêm một ít nước
Kết tủa
Thu được rebaudioside
tinh khiết trên 90%
Hình 1.5. Quy trình chiết cỏ ngọt theo John Donald Payzant
Năm 2006, Kumar [93] đã phát triển một quy trình sản xuất stevioside từ lá cỏ ngọt. Trong
quá trình này, bột nghiền bột của lá Stevia được chiết xuất với nước ở 50-120°C trong
0.25-4 giờ dưới áp suất 1-8 bar. Chiết xuất sau đó được trộn với calcium hydroxide đến
pH 9.2 và xuất hiện tủa. Sau đó, lọc tủa và dịch lọc được cho qua cột nhựa trao đổi cation
36

mạnh, tiếp theo là một nhựa trao đổi anion yếu. Dịch thu được là hỗn hợp steviol
glycoside hàm lượng 65%.
Năm 2011, Yang và cộng sự [94] đã phát triển một quy trình để thu hồi 99% rebaudioside
A tinh khiết 99% từ lá cỏ ngọt. Lá được chiết bằng nước hoặc ethanol hoặc một hỗn hợp
của hai ở 50-80°C trong khoảng 30 phút dưới áp suất cao trong khoảng 200-3000MPa.
Dịch chiết được cô đặc bằng cách bốc hơi ở nhiệt độ cao, lọc và đi qua một lớp nhựa
phân cực chọn lọc, steviol glycoside bị hấp thụ. Cột được giải ly bằng hỗn hợp ethanolnước
thu được hỗn hợp steviol glycoside và rebaudioside A được tinh chế bằng cách kết
tinh dung dịch giải ly thu được , thu được rebaudioside A tinh khiết 85%. Sau đó tiếp
tục kết tinh lại nhiều lần cho đến khi rebaudioside A đạt độ tinh khiết 99%.
Một phương pháp để đạt được độ tinh khiết cao stevioside và rebaudioside A đã được
đề xuất bởi Purakayastha (2010) [95] và Magomet (2011) [96] . Trong phương pháp này, lá
cây đã được nung nóng ở 45-75°C bằng cách sử dụng nước (tỉ lệ lá:nước từ 1kg: 10 L)
trong khoảng 1-6 giờ. Dịch chiết lọc được làm nóng đến khoảng 50°C trong 0.5-1.0 giờ
bằng cách bổ sung canxi hydroxyd lên pH khoảng 10, lọc loại tủa và dung dịch được
trung hòa bằng dung dịch sắt clorua trong khoảng 10-15 phút. Dịch thu được cho qua
cột celite (một cột nhựa) để khử ion, và qua ba cột Amberlite để khử màu. Dung dịch
được sấy phun và chứa khoảng 65% stevioside và 25% rebaudioside A. Cắn hòa tan
trong methanol (ở 20-25°C trong 0.5-1.0 giờ có khuấy, tỉ lệ cắn:dung môi khoảng 1:5
(g:mL)). Làm lạnh để kết tinh, các tinh thể thu được sau lọc và sấy khô, đem phân tích
khoảng 90% stevioside. Dung dịch lọc còn lại được cho bay hết methanol. Cắn thu được
hòa tan trong ethanol (tỉ lệ 1:5 (g:mL), ở 40-45 ° C trong khoảng 30 phút, khuấy nhẹ).
Chất kết tủa được lọc và sấy đạt được khoảng 90% rebaudioside A.
37

Phương pháp tính chế bằng sắc kí và hấp phụ:
Lựa chọn tách một chất từ chất lỏng thường có thể dùng phương pháp hấp phụ. Các hợp
chất có tính đặc thù cao có thể được tách một cách chọn lọc bằng các quá trình sắc ký.
Sắc ký là một phương pháp phổ biến để phân tách và phân tích các hỗn hợp phức tạp.
Năm 2011, Chiang [97] và cộng sự đề xuất phương pháp tách rebaudioside A bằng sắc ký
trong đó hỗn hợp steviol glycoside chứa stevioside (38%), rebaudioside A (42%) và các
glycoside khác (20%) được hòa tan trong hỗn hợp nước-ethanol. Dung dịch được đưa
qua cột nhựa với tỷ lệ cụ thể. Dịch giải ly chứa 69% rebaudioside A, 31% stevioside và
các glycoside khác; 93% tổng số rebaudioside A nạp vào cột đã được tinh chế. Sử dụng
cột phát triển, một dòng có chứa stevioside và rebaudioside A cũng có thể được phân
chia.
Một bằng sáng chế của Hoa Kỳ (Yang và các cộng sự, 2011) [94] đã tiết lộ một quy trình
trong đó rebaudioside A trong cỏ ngọt bằng cách sử dụng nhựa phân cực trong sắc ký
cột silica gel và sử dụng dung môi thích hợp. Sau đó, thu được tinh thể rebaudioside A.
Năm 2012, Liu và cộng sự [98] đề xuất một phương pháp tách sắc ký giữa hai STEVIOL
GLYCOSIDE, stevioside và rebaudioside A. Những ưu điểm của phương pháp này là
nó đơn giản, nhanh và hiệu quả về chi phí. Việc tách và tách cả hai glycosides được thực
hiện trong một cột đơn và một bước. Một hỗn hợp gồm 41% stevioside và 35,8%
rebaudioside A hòa tan trong dung dịch ethanol được đưa lên trên cột sắc ký đặc biệt
bao gồm một thành phần đặc biệt của nhựa polyme polymetacrylate / DVB có chức năng
chịu áp suất cao đến khoảng 1500 psi. Cột được rửa bằng áp suất trung bình (dưới
300psi) với dung môi methanolacetone với tốc độ 4-5 mL / phút. Các phân đoạn của
stevioside và rebaudioside A được thu thập lại và sau đó kết tinh. Lọc tính thể thu được
stevioside và rebaudioside có độ tinh khiết 98% độ tinh khiết với mỗi chất.
Sự hấp phụ chọn lọc trên zeolit X và A đã được nghiên cứu với cỏ ngọt và được báo cáo
bởi Moraes và Machado (2001) [99] . Nghiên cứu này kết luận rằng CaX Zeolite có hiệu
quả hơn trong việc làm rõ sự trích xuất của Stevia trong nước nóng. Cả zeolit bột và hạt
đều gần như hiệu quả. Các điều kiện điều trị tối ưu là zeolit 40% (g/g), thời gian tiếp
xúc 60 phút ở 30°C. Thu được độ tinh khiết 70%. Zeolite tái sử dụng cũng cho thấy hiệu
suất tương đương. Các tác giả cũng tiến hành thí nghiệm cột liên tục cho thấy sử dụng
38

tốc độ dòng chảy 30 L/ngày, có thể tinh chế cỏ ngọt bằng cách sử dụng zeolite lên đến
khoảng 60% trong 11 giờ.
Năm 2009, Rajab [100] đã phát triển một quy trình gồm hai bước để làm trong và tinh chế
dịch chiết. Lá cỏ ngọt khô được đun sôi với nước (tỷ lệ lá:nước 1 kg: 5 L) trong 3 giờ
và lọc dịch chiết xuất. Tiếp theo, dịch chiết được xử lý bằng 10% than hoạt tính trong
20 phút. Dịch chiết được và than hoạt tính được trộn với nước sôi trong 10 phút và lọc
để thu hồi stevioside. Lặp lại quá trình này ba lần. Trong quá trình này, một số lượng
chlorophyll, phenol và carotenoid đã được loại bỏ. Trong bước tiếp theo, dịch chiết vàng
được xử lý với 5% celite và khuấy trong 20 phút. Ly tâm dịch chiết không màu ở tốc độ
12.000 vòng / phút trong vòng 15 phút và dung dịch nước sạch được thu hồi và lưu trữ.
Dịch thu được đem sấy khô (nhiệt độ đầu vào 180°C, nhiệt độ đầu ra 95°C, áp suất 500
psi) để có bột màu trắng. Nồng độ cuối cùng của Stevioside là 11,6%.
Năm 2002, Rongfu Shi [101] và các đồng nghiệp đã tổng hợp các chất hấp phụ polyme
bằng cách đưa vào nhóm amoni thành vật liệu hấp phụ nhựa thông thường tinh chế các
hợp chất steviol glycoside. Kết quả của thí nghiệm đã kết luận rằng khả năng hấp phụ
các hợp chất steviol glycoside giảm và hiệu quả khử màu tăng vì nồng độ của nhóm
amoni bậc bốn trong chất hấp phụ tăng. Cơ chế hấp phụ và khử màu cũng đã được đề
xuất [101] .
Một số phương pháp khác
Năm 1997, Liu [102] trích stevioside từ lá cỏ ngọt khô với methanol nóng. Họ cũng nghiên
cứu dịch chiết của steviol glycoside, như rebaudioside A, rebaudioside C, và dulcoside
A bằng cách chiết xuất chất lỏng dưới tới hạn (Sub FE). Phương pháp đơn giản Sub FE
hiệu suất nhỏ được phát triển và hiệu xuất hơn 88% dịch chiết thu được bằng cách sử
dụng methanol.
Một số nghiền cứu tinh chế steviol glycoside bằng công nghệ màng, có thể được sử dụng
ở nhiệt độ phòng dẫn đến không có sự thay đổi pha; không có hóa chất được thêm vào;
nó rất dễ dàng để mở rộng quy mô [103] . Như vậy, công nghệ đã được sử dụng rộng rãi
để xử lý nước táo, nước mosambi nước ép lựu, nước ép cà rốt… [103] . Có khá nhiều bằng
sáng chế sử dụng công nghệ màng. Năm 1990, Fuh và Chiang sử dụng muối vô cơ và
màng siêu lọc giảm khối lượng phân tử (MWCO) 25,000 và 100,000 Da để tinh chế
39

stevioside, sau đó thẩm thấu ngược và sử dụng trao đổi ion, 45% stevioside thu hồi sau
siêu lọc [67] . Năm 2000, Zhang và Kumar [71] sử dụng màng vi lọc, sau đó dùng màng siêu
lọc, cuối cùng dùng màng lọc nano để lọc sạch dịch chiết cỏ ngọt [71] . Năm 2007, Sliva
và Bergamasco đã dùng Zeolite hiệu chỉnh (NaX) trước khi lọc bằng màng vi lọc, lọc
sạch xấp xỉ 80-100% dịch chiết cỏ ngọt với màng kích cỡ khe lọc thay đổi và áp suất
vận hành khác [104] . Năm 2009, Reis sử dụng màng vi lọc ceramic đê lọc dịch chiết Cỏ
ngọt. Một nghiên cứu khác bởi , so sánh sự khác nhau sử dụng màng PES may đo và
thương mại trong lọc sạch stevioside [105] .
Phương pháp Accelerated Solvent Extraction (ASE) là công nghệ chiết tự động sử dụng
ở nhiệt độ và áp suất cao thực hiện trong thời gian ngắn. Nhiệt độ cao dẫn đến khả năng
hòa tan tốt hơn chất phân tích, tốc độ khuếch tán nhanh hơn, độ nhớt dung môi thấp
hơn và sự suy yếu các tương tác chất tan – chất dính. Áp suất cao cho phép làm việc với
các dung môi dạng lỏng trên điểm sôi của chúng và tăng tốc quá trình chiết tổng thể [106] .
Cuối cùng, so với phương pháp thông thường khác, tự động hóa, hiệu suất chiết, độ thu
hồi cao và thu được sản phẩm trong thời gian ngắn [107] .
1.2.2.2. Các phương pháp định lượng các hợp chất steviol glycoside
Trước đây từ rất lâu trên thế giới, đã có rất nhiều phương pháp có sẵn để xác định độ ổn
định và độ tinh khiết của rebaudioside A và stevioside, và các phương pháp đó đã được
áp dụng cho các mẫu cỏ ngọt trồng ở các khí hậu và các nước khác nhau, cũng như
những đồ uống và thực phẩm chứa những chất ngọt đó [1, 4, 108] . Các phương pháp cơ bản
định tính và định lượng cho chất làm ngọt cỏ ngọt được phân loại trước đây dựa trên sự
xác định màu, phương pháp enzyme sử dụng enzyme hesperidinase thô, phương pháp
sắc kí khí-lỏng (GLC), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc kí bản mỏng (TLC)/phép
đo tỉ trọng [1] . Năm 1977, H. Sugisawa cùng đồng nghiệp đã định lượng stevioside bằng
cách ứng dụng phương pháp màu Carr-Price, phản ứng tạo màu xanh lam với thuốc thử
SbCl3/cloroform, đo E ở bước sóng 524 nm [109] . Trước đây có một phương pháp được
công bố về stevioside, rebaudiana A và steviolbioside trong trích ly cỏ ngọt thương mại,
nó sử dụng điện di mao mạch ở chế độ mixen (MEKC) [110] . Một cách tiếp cận khác là
phân tích định lượng stevioside trong lá cỏ ngọt sử dụng phương pháp phổ phản xạ hồng
ngoại gần [111] . Dần dần, các phương pháp phân tích liên quan đến stevioside,
40

rebaudioside và chất ngọt tương tự, các sản phẩm phân hủy và chuyển hóa không yêu
cầu dẫn xuất hóa học.
Ngày nay, có một vài phương pháp xác định nồng độ glycoside, xác định các hợp chất
đa glycoside, một vài glycoside phức tạp trong cây cỏ và ngũ cốc như sắc kí khí [103] ,
quang phổ hồng ngoại, quang phổ khối lượng [10] , cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ,
HPLC,… Trong đó, phương pháp đơn giản nhất, phổ biến nhất và hiệu quả nhất là
HPLC, còn được sử dụng để xác định hợp chất trong cỏ ngọt ở những vùng địa lý khác
nhau [24] . Trong tài liệu khoa học, chỉ ra nhiều cách xác định stevioside, rebaudioside A
và steviol như thủy phân men & dò hóa chất, GC, TLC áp suất dư, đo tỉ trọng, HPLC và
điện di mao dẫn [22] . Mô hình quang phổ hồng ngoại gần (NIR) đã được thiết lập để đo
trực tiếp nồng độ các stevioside glycoside (rebaudioside A và stevioside) trong lá S.
rebaudiana Bertoni. Mô hình này có thể được áp dụng để đo nồng độ rebaudioside A và
stevioside trong lá lá S. rebaudiana Bertoni, và giải quyết được vấn đề giá cao và vận
hành phức tạp trong các phương pháp trong phòng thí nghiệm hiện nay [112] .
Phương pháp LC-TOF định tính đã được dự kiến để đánh giá các hợp chất steviol
glycoside [18] cùng với phương pháp HPTLC được phê chuẩn cùng với thiết bị dò tỷ
trọng [113] và phương pháp NIRS cho việc định lượng steviol glycosides [114] . Trước đây,
một phương pháp xác định bán định lượng các hợp chất steviol glycoside được thực
hiện bằng phương pháp khối phổ ion hóa tia điện không thấm [115] . Đối với định lượng
steviol năm 2009 Minne thực hiện phương pháp RP-LC với đầu dò fluorometric sau khi
dẫn xuất bởi một sản phẩm phụ coumarin.
Cuối cùng, phương pháp định lượng syevioside phổ biến nhất, được sử dụng rộng rãi
nhất là HPLC với cột Silicagel pha đảo C18. Điều kiện vận hành cột:
− Nhiệt độ thường
− Hệ dụng môi giải ly acetonitrile:nước tỉ lệ 80:20
− Tôc độ dòng: 1µm/mL
− Đầu dò UV-vis 210nm
41

CHƯƠNG 2.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. Mục tiêu nghiên cứu và đối tượng nghiên cứu
Hoàn thiện và khảo sát quy trình tách chiết chất ngọt từ cỏ ngọt, định hướng ứng dụng
trong quy mô công nghiệp. Đối tượng nghiên cứu là lá và cành cây cỏ ngọt được phân
phối bởi công ty Thảo dược Tấn Phát.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Với mục tiêu như trên, đề tài dự kiến tiến hành các công việc như sau:
− Khảo sát quy trình chiết cỏ ngọt với dung môi nước
− Khảo sát quy trình quy trình tinh chế các chất ngọt steviol glycoside
2.3. Hóa chất và thiết bị
2.3.1. Hóa chất
− Nước cất, PTN hóa dược, Đại học Bách Khoa TpHCM
− Ca(OH)2, CHEMSOL, Việt Nam
− Citric acid, CHEMSOL, Việt Nam
− HCl, CHEMSOL, Việt Nam
− NaOH, CHEMSOL, Việt Nam
− Nhựa trao đổi cation, Việt Nam
− Nhựa trao đổi anion, Việt Nam
2.3.2. Thiết bị
− Máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis Thermo Genesys 10S UV-Vis;
− Máy đo màu Minonta CR400;
− Máy đo độ ẩm Satorius MA 35.
42

2.4. Thực nghiệm
2.4.1. Nguyên liệu
Thu gom nguyên liệu:
Lá và cành cỏ ngọt khô dùng làm nguyên liệu được mua tại công ty thảo dược Tấn Phát
Xử lý nguyên liệu:
Lá và cành khô mua về được bảo quản trong bọc kín có túi hút ẩm.
2.4.2. Phương pháp đo độ ẩm
Độ ẩm được xác định bằng máy đo độ ẩm Satorius MA 35.
Cách tiến hành: Cân 0.2 g nguyên liệu trải thành một lớp mỏng trên đĩa nhôm, cho vào
máy đo độ ẩm. Nguyên liệu được sấy ở 105 o C đến khối lượng không đổi. Kết thúc đo
khi màn hình máy hiện chữ END vả đọc độ ẩm trên máy. Độ ẩm được xác định bằng
công thức:
W(%) =
khối lượng đầu − khối lượng sau
khối lượng đầu
× 100
Phép đo dược thực hiện 3 lần và lấy kết quả trung bình. Từ độ ẩm (W), khối lượng
nguyên liệu khô (mnlk) được tính theo công thức:
m = â×()
(g)
2.4.3. Khảo sát điều kiện chiết cỏ ngọt với dung môi nước
Quá trình tối ưu điều kiện chiết sẽ khảo sát theo các yếu tố: dạng nguyên liệu, tỉ lệ
rắn/lỏng, nhiệt độ, thời gian và số lần chiết để thu được hiệu suất chiết tốt nhất.
Đáp ứng:
− Cân khối lượng
− Đo độ ẩm cao
− UV-Vis: đo độ hấp thu chất ngọt trong vùng UV (λ=210 nm)
− TLC: bán định lượng chất ngọt
Thực hiện bán định lượng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC):
43

− Pha tĩnh: Sắc ký lớp mỏng Merck GF 60 tráng sẵn
− Pha động: EtOAc:EtOH:H2O:AF = 12:4:2.5:0.5
− Thuốc thử nhận danh: H2SO4:Cồn = 1:5
Hiệu suất chiết được tính theo công thức:
m
cao
× (1 − w
cao
)
H= × 100%
m
Trong đó:
mcao: khối lượng cao tổng thu được (g);
mnlk: khối lượng nguyên liệu quy khô (g);
wcao: độ ẩm cao (%).
nlk
Khảo sát yếu tố dạng nguyên liệu chiết
Mục đích: Chọn ra dạng nguyên liệu chiết thích hợp hòa tan tối đa lượng chất ngọt có
trong cỏ ngọt.
Phương pháp: Lần lượt với mỗi dạng nguyên liệu: lá nguyên, bán nguyên, bột mịn lấy
50 g cỏ ngọt chiết với dung môi nước, tỉ lệ rắn/lỏng 1:6 (g/mL), thời gian chiết 30 phút,
ở nhiệt độ 80 o C, chiết 2 lần.
Khảo sát yếu tố tỉ lệ rắn/lỏng
Mục đích: Chọn ra tỉ lệ rắn/lỏng đủ để chiết ra các hợp chất ngọt trong cỏ ngọt, việc
khảo sát yếu tố tỉ lệ rắn/lỏng giúp tiết kiệm dung môi sử dụng.
Phương pháp: Lấy 50 g cỏ ngọt với dạng nguyên liệu thích hợp nhất chiết với dung môi
nước lần lượt với tỉ lệ rắn/lỏng là 1/6, 1/7, 1/8, 1/9 (g/mL), trong thời gian 30 phút, ở
nhiệt độ 80 o C, chiết 2 lần.
Khảo sát yếu tố thời gian mỗi lần chiết
Mục đích: nhằm xác định thời gian chiết đủ để hòa tan tối đa các chất ngọt trong cỏ
ngọt, yếu tố này ảnh hưởng đến tính kinh tế và năng suất đáng kể.
44

Phương pháp: Lấy 25 g cỏ ngọt với dạng nguyên liệu thích hợp nhất chiết với dung môi
nước tỉ lệ rắn/lỏng thích hợp, trong khoảng thời gian lần lượt 10, 20, 30, 40, 50, 60 (phút)
ở nhiệt độ 80 o C, chiết 2 lần.
Khảo sát yếu tố nhiệt độ
Mục đích: nhiệt độ có thể làm thay đổi đến tính chất của dung môi, các chất ngọt steviol
glycoside trong cỏ ngọt, làm thay đổi khả năng hòa tan các hợp chất đó, dẫn đến thay
đổi hiệu suất chiết. Do đó, cần khảo sát yếu tố nhiệt độ để chọn ra nhiệt độ thích hợp để
hiệu suất chiết là cao nhất.
Phương pháp: Lấy 25 g cỏ ngọt với dạng nguyên liệu thích hợp nhất chiết với dung môi
nước tỉ lệ rắn/lỏng, thời gian thích hợp, ở các nhiệt độ lần lượt 60, 70, 80, 90, 100 ( o C),
chiết 2 lần.
Khảo sát yếu tố số lần chiết
Mục đích: nhằm xác định số lần chiết để thu được hiệu suất chiết cao đồng thời thỏa
mãn được yếu tố tiết kiệm chi phí dung môi, năng lượng và thời gian trong quá trình
chiết.
Phương pháp: Lấy 25 g cỏ ngọt với dạng nguyên liệu thích hợp nhất chiết với dung môi
nước theo tỉ lệ rắn/lỏng, thời gian, nhiệt độ thích hợp, số lần chiết thay đổi lần lượt 1,
2, 3,4 lần.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình.
45

2.4.4. Khảo sát quy trình tinh chế các hợp chất steviol glycoside
Dịch chiết nước
Gia vôi
Trung hòa bằng citric acid
Loại màu
Trao đổi nhựa anion
Trao đổi nhựa cation
Cô đặc dung dịch
Hình 2.1. Quy trình tinh chế các chất ngọt trong cỏ ngọt
Mô tả quy trình
Dịch chiết nước cỏ ngọt thu được đem tủa với Ca(OH)2 để loại acid tạo tủa, chất màu,
nhựa, chất béo, sáp,...Tiến hành lọc loại tủa với chất trợ lọc diatomite. Trung hòa dịch
lọc thu được bằng citric acid. Sau đó, tiếp tục loại màu bằng cột nhựa trao đổi cation và
anion. Cô đặc dung dịch thu được cao có nồng độ các chất ngọt cao.
Tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng (TLC) trong quá trình loại màu để bán định lượng
dung dịch thu được so với dung dịch chiết ban đầu. Đồng thời, đo UV/Vis tại bước sóng
hấp thu của stevioside (λ=210 nm), và cường độ màu (L*, a*, b*) để so sánh với dung
dịch gốc và các dung dịch với nhau để tối ưu các yếu tố khảo sát.
Phương pháp so sánh màu:
Độ khác biệt màu sắc:
∆ E* = (L*-L ) +(a*-a ) +(b*-b )
2 2 2
ab 0 0 0
Trong đó:
L*, a*, b*: của dung dịch sau loại màu;
L0, a0, b0: của dung dịch gốc trước khi loại màu.
46

2.4.4.1. Khảo sát quá trình gia vôi
Nguyên tắc: vôi là chất vô định hình có độ phân tán cao. Khi hòa tan trong nước có tính
chất keo. Độ hòa tan của vôi trong nước, trong dung dịch cỏ ngọt có ý nghĩa rất lớn vì
các quá trình lý hóa của giai đoạn làm sạch loại màu phụ thuộc vào độ hòa tan của vôi.
Vôi
hòa tan
đường
keo tụ
Khi vôi cho vào dung dịch cỏ ngọt, sẽ có những tác dụng sau đây:
− Kết tủa hoặc đông tụ những chất không đường, đặc biệt protein, pectin, chất màu
và những acid tạo muối không tan;
− Phân hủy một số chất không đường;Tác dụng cơ học: những kết tủa được tạo
thành có tác dụng kéo theo những chất lơ lửng, và những chất không đường khác;
− Sát trùng dung dịch, làm vi sinh vật không sinh trưởng được.
Quá trình gia vôi sẽ khảo sát các yếu tố: nồng độ dung dịch, tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối
lượng cao, nhiệt độ, thời gian để chọn điều kiện loại các chất màu trong dịch chiết cỏ
ngọt tốt nhất đồng thời hạn chế lượng các chất ngọt bị mất trong quá trình loại màu bằng
gia vôi ít nhất.
Đáp ứng:
− UV-Vis: đo độ hấp thu chất ngọt trong vùng UV (λ=210nm)
− L, a, b: đo màu dung dịch sau phản ứng
− TLC: bán định lượng chất ngọt
Khảo sát yếu tố nồng độ dung dịch
Mục đích: nồng độ dung dịch cũng ảnh hưởng đến độ hòa tan vôi trong dung dịch, dẫn
đến ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa loại tạp màu của vôi, nên chọn nồng độ dung dịch
thích hợp để gia vôi có hiệu quả tốt nhất và phù hợp vơi nồng độ ban đầu của dịch chiết
thu được.
Phương pháp: Lấy 100 g cỏ ngọt chiết với dung môi nước theo các điều kiện thích hợp
đã được khảo sát. Dịch chiết thu được cô quay loại bỏ hoàn toàn dung môi. Sau đó, cân
47

22.5 g cao (bỏ qua độ ẩm cao) hòa tan rồi định mức trong bình định mức 250 mL, ta
được dung dịch gốc nồng độ 90 g/mL. Lần lượt lấy 10 mL dung dịch gốc pha loãng
thành các nồng độ khác nhau: 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 (g/mL). Sau đó, cho phản
ứng với Ca(OH)2 với tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao 1.5/1 (g/g), ở nhiệt độ phòng,
trong khoảng thời gian 10 phút. Lọc các dịch thu được sau đó đem trung hòa với citric
acid đến khoảng pH=6, cô quay và định mức về 10 mL dung dịch ban đầu. Lúc này, các
dung dịch với nồng độ khác nhau đã quay về thể tích ban đầu giúp cho việc so sánh độ
giảm màu dễ dàng hơn.
Khảo sát yếu tố tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao
Mục đích: lượng Ca(OH)2 cho vào dung dịch cần lớn hơn lượng Ca(OH)2 có thể hòa
tan, do đó cần khảo sát lượng Ca(OH)2 cho vào thích hợp nhất để loại màu tốt nhất và
thỏa mãn tính kinh tế.
Phương pháp: với nồng độ dung dịch thích hợp cho phản ứng với Ca(OH)2 theo tỉ lệ
lượng Ca(OH)2/khối lượng cao lần lượt là 0.5/1, 1/1, 1.5/1, 2/1 (g/g) , ở nhiệt độ phòng,
trong khoảng thời gian 10 phút. Sau đó, đem các dung dịch thu được sau khi lọc loại tủa
trung hòa đến khoảng pH=6.
Khảo sát yếu tố nhiệt độ
Mục đích: nhiệt độ ảnh hưởng đến độ hòa tan của vôi trong dung dịch, dẫn đến ảnh
hưởng đến khả năng loại màu của vôi. Do đó, cần khảo sát nhiệt độ thích hợp để quá
trình loại màu diễn ra tốt nhất.
Phương pháp: với nồng độ dung dịch thích hợp cho phản ứng với Ca(OH)2 theo tỉ lệ
lượng Ca(OH)2/khối lượng cao thích hợp, ở các nhiệt độ lần lượt 0, 10, 20, 30, 40, 50,
60 ( o C), trong khoảng thời gian 10 phút. Sau đó, đem các dung dịch thu được sau khi
lọc loại tủa trung hòa đến khoảng pH=6.
Khảo sát yếu tố thời gian
Mục đích: nhằm xác định thời gian phản ứng tốt nhất cho quá trình gia vôi loại màu,
đồng thời thỏa mãn tính kinh tế.
Phương pháp: với nồng độ dung dịch thích hợp cho phản ứng với Ca(OH)2 theo tỉ lệ
lượng Ca(OH)2/khối lượng cao, nhiệt độ thích hợp, trong các khoảng thời gian lần lượt
48

là 2, 5, 10, 15 (phút). Sau đó, đem các dung dịch thu được sau khi lọc loại tủa trung hòa
đến khoảng pH=6.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình.
2.4.4.2. Khảo sát quá trình sắc ký trao đổi cation và anion
Nguyên tắc: trao đổi ion là một phương pháp mà trong một số điều kiện, một chất không
tan (nhựa) hút một ion dương hay âm của một dung dịch và nhả ra một ion khác cùng
dấu. Hiện tượng này dựa trên phản ứng tổng quát sau:
n(R - A + ) + B n+ → Ra - B n+ + nA +
Trong đó:
R - gốc hút anion của nhựa trao đổi ion;
A + các ion trao đổi của nhựa;
B n+ các ion hòa tan trong dung dịch.
Sau một thời gian nhất định, phản ứng trao đổi xảy ra cân bằng.
Quá trình chuẩn bị nhựa trao đổi ion
Cho dung dịch HCl 1N đối với nhựa cation và dung dịch NaOH 1N đối với nhựa anion
chảy qua cột với tốc độ dòng chảy rất nhỏ (8 mL/phút) cho đến khi dung dịch ra khỏi
cột có nồng độ HCl và NaOH bằng nồng độ đầu vào (có thể dùng giấy pH để ước tính).
Phản ứng chuyển đổi ion trao đổi của nhựa xảy ra như sau:
R – Na + + H + → R – H + + Na +
R – Cl - + OH - → R – OH - + Cl -
Quá trình tái sinh cột nhựa trao đổi ion trong các thí nghiệm
Quá trình tái sinh cột trao đổi ion sau các thí nghiệm là quá trình tái sinh cùng chiều.
Bao gồm các bước sau:
− Rửa cột bằng nước cất sau mỗi thí nghiệm nhằm loại bỏ dung dịch trong khoảng
trống giữa các hạt nhựa.
− Thực hiện quá trình tái sinh cùng chiều, dung dịch HCl 1N (đối với nhựa cation),
dung dịch NaOH 1N (đối với nhựa anion) được cho chảy qua cột với tốc độ dòng
49

chảy 4mL/phút, cho đến khi dung dịch đầu ra có nồng độ bằng dung dịch đầu
vào.
− Sau khi tái sinh cột cũng được rửa lại bằng nước cất với tốc độ dòng chảy cao
cùng chiều với dòng tái sinh nhằm loại bỏ dung dịch HCl (hay NaOH) trong
khoảng trống giữa các hạt nhựa. Mặt khác còn làm rỗng tầng nhựa để thuận lợi
cho thí nghiệm tiếp theo.
Cột trao đổi ion sử dụng trong thí nghiệm là cột nhựa có các thông số sau đây:
− Chiều cao cột: 20 cm
− Đường kính cột trong: 2.7 cm
Quá trình trao đổi nhựa ion cần khảo sát 2 yếu tố: tốc độ dòng chảy, tỉ lệ thể tích nhựa/thể
tích dung dịch để chọn điều kiện loại màu tốt nhất và làm hao hụt rất ít lượng chất ngọt
steviol glycoside có trong dịch.
Đáp ứng:
− UV-Vis: đo độ hấp thu chất ngọt trong vùng UV (λ=210 nm)
− L*, a*, b*: đo màu dung dịch sau sắc ký
− TLC: bán định lượng chất ngọt
Khảo sát yếu tố tốc độ dòng chảy
Mục đích: tốc độ dòng chảy ảnh hưởng đến tốc độ trao đổi cột do đó cần khảo sát để
chọn điều kiện loại màu nhất, chất ngọt bị hấp thu ít nhất đồng thời đảm bảo tính kinh
tế.
Phương pháp: Lấy 80 mL dung dịch đã được loại màu bằng gia vôi với các điều kiện
thích hợp nhất đã khảo sát ở trên, cho chảy qua cột có thể tích nhựa 8mL với tốc độ dòng
chảy lần lượt là 0.5, 1, 1.5, 2 (mL/phút), tái sinh nhựa sau mỗi thí nghiệm.
Khảo sát yếu tố tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dung dịch
Mục đích: cột nhựa trao đổi sau một thời gian nhất định sẽ xảy ra trạng thái cân bằng,
nhựa hết khả năng trao đổi, thành phần hóa học của dung dịch đầu vào và ra giống nhau,
khi đó cột cần tái sinh. Vì vây, chọn tỉ lệ thể tích dịch trên thể tích nhựa thích hợp sao
cho cột chưa đạt cân bằng và loại màu tốt nhất mà vẫn thỏa mãn tính kinh tế.
50

Phương pháp: Lấy lần lượt 40, 80, 120, 160 (mL) dung dịch đã được loại màu bằng gia
vôi với các điều kiện thích hợp nhất đã khảo sát, cho chảy qua cột có thể tích nhựa 8mL
với tốc độ dòng chảy thích hợp, tái sinh nhựa sau mỗi thí nghiệm.
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 2 lần và lấy giá trị trung bình.
51

CHƯƠNG 3.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát quá trình chiết nước
Đánh giá nguyên liệu:
− Nguyên liệu có độ ẩm trung bình 10.60%
− Nguyên liệu có màu xanh nhạt
Đánh giá quá trình chiết:
− Dịch chiết cỏ ngọt thu được có màu nâu đen, mùi thơm nhẹ giống mùi nước trà;
− Quá trình lọc có nhiều bọt
− Cao sau khi cô quay chân không có màu nâu đen đậm, cao khá giống với mạch
nha nhưng khô hơn.
Stevioside
Rebaudiana A
Hình 3.1. TLC bột steviol glycoside có hàm lượng > 95%
Năm 2009, tác giả Nguyễn Thị Lý cùng cộng sự đã phân lập và nhận danh được
rebaudiana A và stevioside, vết của hai hợp chất được thể hiện trong Hình 3.1.
3.1.1. Khảo sát dạng nguyên liệu chiết
Điều kiện khảo sát:
− Nhiệt độ: 80 o C
− Thời gian: 30 phút
− Tỉ lệ rắn/lỏng: 1/6 (g/mL)
52

− Chiết 2 lần.
A
B
C
Hình 3.2. Nguyên liệu dạng: A – lá nguyên; B – bán nguyên; C – bột mịn.
Hiệu suất chiết (%)
40.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Abs (A)
0.0
Lá nguyên Bán nguyên Bột mịn
Dạng nguyên liệu
0.0
Hiệu suất (%)
Abs (A)
Hình 3.3. Hiệu suất chiết theo dạng nguyên liệu chiết (Phụ lục 1)
53

Hình 3.4. TLC các dịch chiết trong khảo sát dạng nguyên liệu chiết
Dựa vào Hình 3.3 và Hình 3.4, nhận thấy nguyên liệu dạng bột mịn có hiệu suất cao
nhất, đồng thời vết rebaudiana A đậm nhất. Tuy nhiên, quá trình lọc dịch chiết nguyên
liệu dạng bán nguyên và bột mịn bị cản trở bởi bọt nên tốn nhiều thời gian lọc hơn dạng
lá nguyên. Bên cạnh đó, hiệu suất chiết giữa các dạng chênh lệch không đáng kể. Vì
vậy, chọn nguyên liệu dạng lá nguyên để khảo sát tiếp.
3.1.2. Khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng
Điều kiện khảo sát:
− Dạng nguyên liệu: lá nguyên
− Nhiệt độ: 80 o C
− Thời gian: 30 phút
− Chiết 2 lần
54

40.0
Hiệu suất chiết (%)
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
Abs (A)
5.0
0.2
0.0
1/6 1/7 1/8 1/9
Tỉ lệ rắn/lỏng
0.0
Hiệu suất (%)
Abs (A)
Hình 3.5. Hiệu suất chiết theo tỉ lệ rắn/lỏng (Phụ lục 2)
Hình 3.6. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát tỉ lệ rắn/lỏng
Tỉ lệ rắn/lỏng càng cao thì hiệu suất chiết và lượng chất ngọt càng tăng, đến tỉ lệ 1/8
(g/mL) thì lượng chất tách ra hầu như không đổi (Hình 3.5). Nguyên nhân khi lượng
dung môi tăng lên thì khả năng tiếp xúc với nguyên liệu càng lớn, khi đó lượng chất
55

ngọt steviol glycoside tách ra càng nhiều và hầu như được tách hoàn toàn ở tỉ lệ 1/8. Do
đó, chọn tỉ lệ rắn/lỏng 1/8 (g/mL) là thích hợp nhất.
3.1.3. Khảo sát thời gian chiết
Điều kiện khảo sát:
− Dạng nguyên liệu: lá nguyên
− Tỉ lệ rắn/lỏng: 1/8 (g/mL)
− Nhiệt độ: 80 o C
− Chiết 2 lần
40.0
Hiệu suất chiết
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
Abs (A)
10.0
0.4
5.0
0.2
0.0
10 20 30 40 50 60
Thời gian (phút)
0.0
Hiệu suất (%)
Abs (A)
Hình 3.7. Hiệu suất chiết theo thời gian (Phụ lục 3)
56

Hình 3.8. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết
Dựa vào Hình 3.7 thời gian khảo sát càng dài khối lượng cao thu được càng tăng, hiệu
suất tăng mạnh trong khoảng thời gian 20 đến 30 phút, đồng thời lượng chất ngọt thu
được từ 30 phút trở đi có xu hướng không thay đổi. Điều này có thể giải thích như sau:
các hợp chất ngọt steviol glycoside rất dễ tan trong nước, lá cỏ ngọt mỏng và xốp nên
truyền khối tốt, do đó thời gian 30 phút cho phép tách gần như hoàn toàn lượng chất
ngọt có trong mẫu. Vậy để tiết kiệm thời gian và chi phí gia nhiệt chọn 30 phút là thời
gian trích ly phù hợp.
3.1.4. Khảo sát nhiệt độ
Điều kiện khảo sát:
− Dạng nguyên liệu: lá nguyên
− Tỉ lệ rắn/lỏng: 1/8 (g/mL)
− Thời gian: 30 phút
− Chiết 2 lần
57

40.0
Hiệu suất chiết (%)
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
Abs (A)
5.0
0.2
0.0
60 70 80 90 100
Nhiệt độ (C)
0.0
Hiệu suất (%)
Abs (A)
Hình 3.9. Hiệu suất chiết theo nhiệt độ (Phụ lục 4)
Hình 3.10. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát nhiệt độ chiết
Từ Hình 3.9 cho thấy khi nhiệt độ càng cao thì hiệu suất chiết và lượng chất ngọt steviol
glycoside thu được càng tăng, đạt cực đại tại 90 o C. Nguyên nhân là khi nhiệt độ tăng
thì thuận lợi cho việc phá hủy màng tế bào thực vật, độ hòa tan của các chất ngọt tăng,
dẫn đến tăng hiệu suất chiết. Vì vậy, chọn nhiệt độ chiết là 90 o C để khảo sát tiếp.
58

3.1.5. Khảo sát số lần chiết
Điều kiện khảo sát:
− Dạng nguyên liệu: lá nguyên
− Tỉ lệ rắn/lỏng: 1/8 (g/mL)
− Nhiệt độ: 90 o C
− Thời gian: 30 phút.
45.0
Hiệu suất chiết (%)
40.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
Abs (A)
0.0
1 2 3 4
Số lần chiết (lần)
0.0
Hiệu suất (%)
Abs (A)
Hình 3.11. Hiệu suất chiết theo số lần chiết (Phụ lục 5)
59

Hình 3.12. TLC các dịch chiết thu được trong khảo sát thời gian chiết
Khi tăng số lần chiết, hiệu suất chiết tăng mạnh, tuy nhiên sau lần chiết 2 thì lượng tăng
đó không đáng kể. Do ở lần chiết thứ nhất lượng chất tách ra chưa hết, kể từ lần chiết
thứ 2, lượng chất ngọt cũng như các chất hữu cơ khác trong cỏ ngọt được tách ra gần
như tối đa, dẫn đến hiệu suất chiết tăng không đáng kể ở các lần chiết sau. Để tiết kiệm
dung môi và thời gian cho quá trình cô dung môi để thực hiện các giai đoạn tinh chế
sau, chọn số lần chiết thích hợp là 2 lần.
60

3.2. Khảo sát quá trình gia vôi
A
Stevioside
Rebaudioside A
Hình 3.13. TLC chưa hiện màu và đã hiện màu của dịch chiết ban đầu
A: là chất tạo màu vàng nâu của dịch chiết
(hệ giải ly EtOAc:EtOH:H2O:AF = 12:4:2.5:0.5)
Kết quả sắc ký bản mỏng cho thấy tạp chất gây màu vàng sậm (A) của cao chiết ban đầu
có độ phân cực thấp hơn stevioside, rebaudioside A. Các chất màu (A) cần phải được
loại bỏ thông qua việc khử màu bằng quá trình gia vôi và sắc kí cột trao đổi nhựa ion.
Vì (A) là các chất màu, nên hiệu quả của quá trình khử màu được đánh giá thông qua
độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dung dịch sau khi được loại màu bằng gia vôi và sắc kí
nhựa; độ chênh lệch màu ∆E*ab càng lớn, hiệu quả khử màu càng cao. Ngoài ra còn đánh
giá độ hấp thu chất ngọt stevioside trong vùng UV (λ=210 nm) để ước chừng độ giảm
lượng chất ngọt sau quá trình loại màu, do dung dịch có màu do các chất màu gây ra nó
có thể che các hợp chất ngọt làm giảm độ hấp thu của nó nên cách đánh giá này mang
tính chất tương đối không có độ chính xác cao.
3.2.1. Khảo sát nồng độ dịch chiết
Điều kiện khảo sát:
− Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
− Thời gian: 10 phút
61

− Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng chất rắn : 1.5/1 (g/g)
.
20.0
18.0
16.0
1.4
1.2
∆E* ab
14.0
12.0
10.0
8.0
1.0
0.8
0.6
Abs (A)
6.0
4.0
2.0
0.0
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Nồng độ dung dịch trước phản ứng (g/ml)
0.4
0.2
0.0
Delta E*ab
Abs (A)
Hình 3.14. Độ khác biệt màu sắc ∆E của các dịch thu được so với dung dịch gốc
(Phụ lục 6)
Hình 3.15. TLC các dung dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ
62

Hình 3.16. Các dịch thu được sau giai đoạn gia vôi trong khảo sát nồng độ
Từ Hình 3.14 cho thấy khả năng loại màu hiệu quả tại nồng độ 80 g/mL và 90 g/mL,
trong đó nồng độ 80 g/mL cho hiệu quả tốt nhất. Điều này có thể giải thích như sau:
nồng độ dung dịch tăng thì độ hòa tan của vôi tăng dẫn đến phản ứng keo tụ diễn ra tốt
hơn. Tuy nhiên, dịch chiết thô ban đầu có nồng độ khoảng 30 g/mL, để thuận lợi cho
quá trình cô đặc nên chọn nồng độ 90 g/mL (cô dịch chiết cho đến khi còn 1/3 so với
thể tích dung dịch đầu) là nồng độ tốt nhất để khảo sát quá trình gia vôi.
3.2.2. Khảo sát tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao
Điều kiện khảo sát:
− Nồng độ dung dịch: 90 g/mL
− Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
− Thời gian: 10 phút
63

25.0
1.4
20.0
1.2
1.0
∆E* ab
15.0
10.0
0.8
0.6
Abs (A)
0.4
5.0
0.2
0.0
0.5/1 1/1 1.5/1 2/1
Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao
0.0
Delta E*ab
Abs (A)
Hình 3.17. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ lượng
Ca(OH)2/khối lượng cao so với dung dịch gốc (Phụ lục 7)
Hình 3.18. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tỉ lệ lượng
Ca(OH)2/khối lượng cao
64

Hình 3.19. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát
tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng cao
Từ Hình 3.17 Hình 3.17khi tỉ lệ lượng Ca(OH)2 càng lớn hơn khối lượng cao thì độ
khác biệt màu sắc ∆E*ab càng lớn (đồ thị 3.7) chứng tỏ loại màu càng tốt và ở tỉ lệ 1/1
loại màu tốt nhất. Điều này có thể giải thích như sau: lượng vôi càng lớn thì độ hòa tan
càng lớn, với tỉ lệ 1/1 (g/g) thì độ hòa tan của vôi gần như tối đa nên khi tăng tỉ lệ thì
khả năng loại màu dung dịch hầu như không tăng. Mặt khác, độ hấp thu UV (λ=210 nm)
càng giảm khi khả năng loại màu càng tốt nhưng giảm rất ít. Do đó, chọn tỉ lệ lượng
Ca(OH)2/khối lượng cao tốt nhất là 1/1 (g/g).
3.2.3. Khảo sát nhiệt độ
Điều kiện khảo sát:
− Nồng độ dung dịch: 90 g/mL
− Thời gian: 10 phút
− Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng chất rắn: 1/1 (g/g)
65

25.0
1.4
20.0
1.2
1.0
15.0
∆E* ab
0.8
Abs (A)
10.0
0.6
0.4
5.0
0.2
0.0
0 10 20 30 40 50 60
Nhiệt độ (C)
0.0
Delta E*ab
Abs (A)
Hình 3.20. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát
nhiệt độ so với dung dịch gốc (Phụ lục 8)
Hình 3.21. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ
66

Hình 3.22. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát nhiệt độ
Dựa vào Hình 3.20 cho thấy nhiệt độ càng thấp thì khả năng loại màu càng tăng và tốt
nhất ở 0 o C. Điều này theo Herzfelt nghiên cứu độ hòa tan của vôi trong nước ở những
nhiệt độ khác nhau và thấy rằng khi nhiệt độ càng giảm [116] , độ hòa tan của vôi càng
tăng. Vậy, chọn nhiệt độ tốt nhất cho quá trình gia vôi là 0 o C.
3.2.4. Khảo sát thời gian phản ứng
Điều kiện khảo sát:
− Nồng độ dung dịch: 90 g/mL
− Nhiệt độ: 0 o C
− Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối lượng chất rắn: 1/1 (g/g)
67

25.0
1.4
20.0
1.2
∆E* ab
15.0
10.0
1.0
0.8
0.6
Abs (A)
0.4
5.0
0.2
0.0
2 5 10 15
Thời gian (phút)
0.0
Delta E*ab
Abs (A)
Hình 3.23. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát thời gian so
với dung dịch gốc (Phụ lục 9)
Hình 3.24. TLC các dung dịch thu được sau quá trình gia vôi trong khảo sát thời gian
68

Hình 3.25. Các dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát thời gian
Trong khoảng thời gian khảo sát thì giá trị thời gian loại màu tốt nhất là 10 phút (Hình
3.23). Điều này có thể giải thích như sau: thời gian phản ứng càng lâu thì phản ứng keo
tụ càng tốt và ở thời gian 10 phút là thời gian mà phản ứng diễn ra gần như tốt nhất. Vì
vậy, chọn thời gian gia vôi tốt nhất là 10 phút.
3.3. Khảo sát quá trình sắc ký cột nhựa trao đổi cation và anion
3.3.1. Khảo sát tốc độ dòng chảy
Điều kiện khảo sát:
− Tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch: 1/10 mL/mL.
69

∆E*ab
45.0
40.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
0.5 1 1.5 2
Tốc độ chảy (ml/phút)
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Abs (A)
Delta E*ab
Abs (A)
Hình 3.26. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng
chảy so với dung dịch gốc (Phụ lục 10)
Hình 3.27. TLC các dung dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy
70

Hình 3.28. Các dịch thu được trong khảo sát tốc độ dòng chảy
Từ Hình 3.26 thấy rằng trong khoảng tốc độ dòng chảy khảo sát, dung dịch được loại
màu tốt nhất ở tốc độ 0.5 mL/phút. Điều này có thể được giải thích như sau: tốc độ dòng
chảy càng chậm thì thời gian tiếp xúc lâu hơn, dẫn đến tăng khả năng trao đổi ion. Độ
hấp thu UV (λ=210 nm) của dung dịch ở 4 tốc độ so với dung dịch ban đầu gần như
không đổi, chứng tỏ tốc độ dòng chảy không ảnh hưởng lớn đến lượng chất ngọt trong
dịch. Do đó, chọn tốc độ dòng chảy 0.5 mL/phút là tốc độ dòng chảy tốt nhất.
3.3.2. Khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch
Điều kiện khảo sát:
− Tốc độ dòng chảy: 0.5 mL/phút.
71

∆E*ab
45.0
40.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
1/5 1/10 1/15 1/20
Tỉ lệ V nhựa /V dịch
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
Abs (A)
Delta E*ab
Abs (A)
Hình 3.29. Độ khác biệt màu sắc ∆E*ab của dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ thể tích
nhựa/thể tích dịch so với dung dịch gốc (Phụ lục 11)
Hình 3.30. TLC các dung dịch thu được sau gia vôi trong khảo sát tốc độ dòng chảy
72

Hình 3.31. Các dịch thu được trong khảo sát tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch
Dựa vào Hình 3.29 thấy rằng ∆E*ab của dung dịch giảm mạnh từ tỉ lệ 1/10 đến 1/15
mL/mL. Nguyên nhân do cột nhựa trao đổi sau một thời gian nhất định sẽ xảy ra cân
bằng, nồng độ dung dịch vào bằng nồng độ dung dịch sau, nên khả năng loại màu sẽ
càng giảm khi thời gian trao đổi càng lâu. Mặt khác, ta thấy tỉ lệ 1/5 và 1/10 khả năng
loại màu chênh lệch không đáng kể. Vì vậy, để tiết kiệm thời gian và hóa chất cho quá
trình tái sinh nhựa, chọn tỉ lệ 1/10 (mL/mL) là tỉ lệ tốt nhất.
3.4. Sản phẩm thu được sau quy trình chiết và tinh chế các chất ngọt steviol
glycoside
A B C
Hình 3.32. Dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu;
B – Dịch sau quá trình gia vôi; C – Dịch sau quá trình trao đổi ion.
73

A B C
Hình 3.33. TLC của dung dịch: A – Dịch chiết nước ban đầu;
B – Dịch sau quá trình gia vôi; C – Dịch sau quá trình trao đổi ion.
Bảng 3.1. Hàm lượng chất ngọt thu được sau quá trình chiết và tinh chế
Cao chiết thô
Cao sau tinh chế
Khối lượng (g) 35.12 4.20
Độ ẩm (%) 3.37 1.25
Hiệu suất (%) 37.96 12.22
Hiệu suất tổng (%) 4.64
Khối lượng nguyên liệu : 100 g (độ ẩm 10.06%)
74

A
B
Hình 3.34. A – Cao chiết thô; B – Cao sau tinh chế.
75

CHƯƠNG 4.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Đề tài: “Nghiên cứu quy trình chiết các hợp chất steviol glycoside từ cỏ ngọt” đã thực
hiện những nội dung đưa ra như sau:
− Khảo sát quy trình chiết với dung môi nước thu được cao có hiệu suất chiết tốt
nhất. Kết quả khảo sát như sau: dạng nguyên liệu lá nguyên, tỉ lệ rắn/lỏng 1/8
g/mL, thời gian chiết 30 phút, nhiệt độ 90 o C, chiết 2 lần.
− Khảo sát quy trình gia vôi làm sạch dịch chiết cỏ ngọt thu được dung dịch với
điều kiện loại màu tốt nhất. Kết quả khảo sát như sau: nồng độ dung dịch 90
g/mL, khối lượng Ca(OH)2/khối lượng cao 1/1 g/g, nhiệt độ 0 o C, thời gian 10
phút.
− Khảo sát quá trình trao đổi ion đã thu được dung dịch chứa các chất ngọt steviol
glycoside có độ tinh khiết khá cao. Kết quả khảo sát như sau: tốc độ dòng chảy
0.5 mL/phút, tỉ lệ thể tích nhựa/thể tích dịch 1/10 mL/mL.
4.2. Kiến nghị
Trong tương lai, đề nghị có thể phát triển theo hướng sau:
− Kết tinh các hợp chất ngọt steviol glycoside với dung môi an toàn trong thực
phẩm.
− Xây dựng đường chuẩn stevioside trong HPLC để định lượng chính xác nồng độ
các hợp chất steviol glycoside trong dung dịch khảo sát.
− Khảo sát quá trình loại màu với các chất hấp phụ như diatomite,than hoạt tính,
Al2(SO4)3… nhằm nâng cao hàm lượng các hợp chất ngọt steviol glycoside và
loại màu từ dịch trích từ cây cỏ ngọt. So sánh tính hiệu quả của các quy trình
nhằm tìm quy trình thích hợp, có khả năng triển khai ở quy mô lớn.
76

TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] A.D. Kinghorn, D.D. Soejarto, Current status of stevioside as a sweetening agent
for human use, Economic and medicinal plant research/edited by H. Wagner, Hiroshi
Hikino, Norman R. Farnsworth, (1985).
[2] S.-J. Wu, L.-T. Ng, Y.-M. Huang, D.-L. Lin, S.-S. Wang, S.-N. Huang, C.-C. Lin,
Antioxidant activities of Physalis peruviana, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 28
(2005) 963-966.
[3] Trần Đình Long, Liakhovkin A. G., M.P. Anh, Cây cỏ ngọt (Stevia rebaudiana
Bertoni), NXB Nông nghiệp, (1992).
[4] A.D. Kinghorn, Stevia: the genus Stevia, CRC Press, 2003.
[5] C.C. Shock, Experimental cultivation of Rebaudi’s stevia in California, Univ.
California, Davis Agron. Progr. Rep, 122 (1982).
[6] P. Mishra, R. Singh, U. Kumar, V. Prakash, Stevia rebaudiana–A magical sweetener,
Global J Biotechnol Biochem, 5 (2010) 62-74.
[7] S. Singh, & Rao, G., Stevia: The herbal sugar of 21st Century, Sugar Tech, 71, 7
(2005) 17-24.
[8] Nguyễn Văn Tý, Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đồng sulfat đến một số chỉ tiêu
sinh lí-sinh hóa và năng suất cây cỏ ngọt trồng trên đất vườn đồi Bắc Thái, (1996) 28-
29.
[9] Quách Đĩnh, Nguyễn Văn Thoa, N.V. Tiếp, Công nghệ sau thu hoạch và chế biến
rau quả, NXB KHKT, (1996).
[10] S.D. Anton, C.K. Martin, H. Han, S. Coulon, W.T. Cefalu, P. Geiselman, D.A.
Williamson, Effects of stevia, aspartame, and sucrose on food intake, satiety, and
postprandial glucose and insulin levels, Appetite, 55 (2010) 37-43.
[11] S. Ghanta, A. Banerjee, A. Poddar, S. Chattopadhyay, Oxidative DNA damage
preventive activity and antioxidant potential of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, a
natural sweetener, Journal of agricultural and food chemistry, 55 (2007) 10962-10967.
[12] M. Darise, H. Kohda, K. Mizutani, R. Kasai, O. Tanaka, Chemical constituents
of flowers of Stevia Rebaudiana Bertoni., Agri Biol Chem 47, (1983) 133-135.
[13] J. Brandle, P. Telmer, Steviol glycoside biosynthesis, Phytochemistry, 68 (2007)
1855-1863.
[14] U. Wölwer-Rieck, The leaves of Stevia rebaudiana (Bertoni), their constituents and
the analyses thereof: a review, Journal of agricultural and food chemistry, 60 (2012)
886-895.
[15] Geuns, Jan, Stevia and steviol glycosides, Euprint bvba, 2010.
[16] C. Giraldo, L. Marín, D. Habeych, Obtención de edulcorantes de Stevia rebaudiana
Bertoni, Revista CENIC Ciencias Biológicas, 36 (2005) 3-10.
77

[17] R. Lemus-Mondaca, A. Vega-Gálvez, L. Zura-Bravo, K. Ah-Hen, Stevia
rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural sweetener: A comprehensive
review on the biochemical, nutritional and functional aspects, Food Chemistry, 132
(2012) 1121-1132.
[18] J. Pól, B. Hohnová, T. Hyötyläinen, Characterisation of Stevia rebaudiana by
comprehensive two-dimensional liquid chromatography time-of-flight mass
spectrometry, Journal of Chromatography A, 1150 (2007) 85-92.
[19] Geuns, Jan MC, Stevioside, Phytochemistry, 64 (2003) 913-921.
[20] A. Nepovim, H. Drahosova, P. Valicek, T. Vanek, The effect of cultivation
conditions on the content of stevioside in Stevia rebaudiana Bertoni plants cultivated in
the Czech Republic, Pharmaceutical and Pharmacological Letters, 8 (1998) 19-21.
[21] Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, N.T. Làn, Nguyễn Thị Việt Hà, Phạm Linh
Kho, Lê Hồng Dũng, Xác định thành phần dinh dưỡng của lá Cỏ ngọt Việt Nam, Tạp
chí Khoa học và Phát triển. Tập, 12 (2014) 73-77.
[22] C. Gardana, M. Scaglianti, P. Simonetti, Evaluation of steviol and its glycosides in
Stevia rebaudiana leaves and commercial sweetener by ultra-high-performance liquid
chromatography-mass spectrometry, Journal of chromatography A, 1217 (2010) 1463-
1470.
[23] V. Kochikyan, A. Markosyan, L. Abelyan, A. Balayan, V. Abelyan, Combined
enzymatic modification of stevioside and rebaudioside A, Applied Biochemistry and
Microbiology, 42 (2006) 31-37.
[24] G. Kovylyaeva, G. Bakaleinik, Strobykina, I., Gubskaya, V., Sharipova, R.,
Al¢fonsov,, L.G. Vieira, Glycosides from Stevia rebaudiana, Chemistry of Natural
Compounds, 43 (2007) 81-85.
[25] B.H. de Oliveira, J.F. Packer, M. Chimelli, D.A. de Jesus, Enzymatic modification
of stevioside by cell-free extract of Gibberella fujikuroi, Journal of biotechnology, 131
(2007) 92-96.
[26] Sirshendu De, Sourav Mondal, and Suvrajit Banerjee, I.I.o.T.I. Kharagpur, I.
Kharagpur, Stevioside, Technology, Applications and Health, Indian Institute of
Technology (IIT) Kharagpur
Kharagpur, India, (2013).
[27] B. Crammer, R. Ikan, Sweet glycosides from the stevia plant, Chemistry in Britain,
22 (1986) 915.
[28] Abou-Arab, A Esmat, A Azza, Abu-Salem, M. Ferial, Physico-chemical
assessment of natural sweeteners steviosides produced from Stevia rebaudiana Bertoni
plant, African Journal of Food Science, 4 (2010) 269-281.
[29] V.V. Panpatil, K. Polasa, Assessment of stevia (Stevia rebaudiana)--Natural
sweetener: A review, Journal of Food Science and Technology, 45 (2008) 467.
[30] Abou-Arab, Esmat A, Abu-Salem, F. M, Evaluation of bioactive compounds of
Stevia rebaudiana leaves and callus, African Journal of Food Science, 4 (2010) 627-
634.
78

[31] K. Takahashi, S. Shigeta, N. Sato, Stevia extracts for the inhibition of rotavirus,
Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2001106635 (2001).
[32] K. Takahashi, S. Shigeta, N. Sato, Stevia rebaudiana Bertoni extraction as
antibacterials against Helicobacter pylori,, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2001122793,
(2001).
[33] B. Bogicevic, Oral application of extract of Stevia rebaudiana or its active
substances for the elimination of cellulite, , Pct Int. Appl. WO 29005048973, (2005).
[34] S. Gregersen, P.B. Jeppesen, K.H. J.J. Holst, Antihyperglycemic effects of stevioside
in type diabetic subjets,, Metab., Clin. Exp. (1) 53, (2004) 73.
[35] P. Chan, D.E. Xu, J.C. Liu , Y.J. Chen, B. Tomlinson, J.T.C. W.P. Huang, The
effect of stevioside on blood pressure and plasma catecholamines in spontaneously
hypertensive rats,, Life Sci. (19) 63, (1998) 1679.
[36] J.C. Liu, P.K. Kao, P. Chan, Y.H. Hsu, C.C. Hoi, G.S. Lien, M.H. Hsieh, Y.J.
Cheng, J.T. Cheng, Mechanism of the antihypertensive effect of stevioside in
anesthetized dogs,, Pharmacol. (1) 67, (2003) 14.
[37] H. Hanada, H. Senpuku, M. Arakawa, T. Ishizaki, S. Sakuma, Dental drug delivery
system agents containing hydroxyapatite, and control of cariogenic bacteria using them,
, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2004035416, (2004).
[38] S. Sugiyama, N. Doi, S. Ejiri, Y. Ishii, Dentifrices containing apatite and polymers,,
Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2001131041, (2001).
[39] Y. Suzuki, T. Yokoo, Liquid dentifrice compositions containing cationic
bactericides, polyoxyethylene alkyl ethers, and cationic polymers, , Jpn. Kokai Tokkyo
Koho JP 2001139433, (2001).
[40] E. Takeoka, C. Hamada, O. Suzuki, M. Tajima, Hair growth period extended agent,
, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 10265347 (1998).
[41] H. Takada, K. Teraoka, B.H. Kim, Hair growth stimulants containing Stevia and
Udo extracts,, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 2003040790, (2003).
[42] B.E. Kim, M.K. Kim, K.T. Kim, R.W. Chang, J.W. Jong, Y.G. Kim, Study on the
degradation of dioxin by the Stevia extract, , Organohalogen Comp.54, (2001).
[43] Y.G. Kim, A method for preparing dioxin decomposers from Stevia, a dioxin
decomposer prepared by the method and a method for decomposing dioxins using it, ,
PCT Int. Appl. WO 2001040495, (2001).
[44] M. Sato, M. Takeuchi, N. Sato, Antihistaminic substance of stevia origin,, U.S. US
5958419, (1999).
[45] J. Thomas, M. Glade, Stevia: it’s not just about calories. , Open Obes J 2,
, (2010) 101–109.
[46] S. Shukla, A. Mehta, V. Bajpai, S. Shukla, In vitro antioxidant activity and total
phenolic content of ethanolic leaf extract of Stevia Rebaudiana Bert. , Food Chem
Toxicol 47,, (2009) 2338–2343.
79

[47] PGS.PTS. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Bài giảng chiết suất dược liệu, Trường Đại
học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh-Bộ môn Dược liệu, (1998).
[48] M.S. Melis, Chronic administration of aqueous extract of Stevia Rebaudiana in
rats: renal effects., J. Ethnopharmacol 47,, (1995) 129− 134.
[49] M.S. Melis, A.R. Sainati, Effect of calcium and verapamil on renal function of rats
during treatment with Stevioside., J. Ethnopharmacol 33, , (1991) 257 −262.
[50] M.S. Melis, A.R. Sainati, Participation of prostaglandins in the effect of Stevioside
on rat renal function and arterial pressure. , Braz J Med Biol Res 24, , (1991)
1269−1276.
[51] W.W.H.O.S.E.o.C.F. Additives., S.G.A.J.F.W.E.C.o. Food, A.W.F.A.S.N.G.
WHO., Safety Evaluation of Certain Food Additives. Steviol Glycosides (Addendum). ,
Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. WHO Food Additive Series
No. 60. Geneva: WHO., (2009).
[52] E.E.F.S. Authority), Scientific opinion on the safety of Steviol glycosides for the
proposed uses as a food additive. , EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources
added to Food (ANS). EFSA J 8,, 1537.
[53] L.L. Curry, Agency Response Letter GRAS Notice No. , GRN 000287. Washington,
DC: Food and Drug Administration.
, (2010).
[54] F.F.a.A. Organisation), Steviol Glycosides., FAO JECFA Monographs 10. Rome:
Food and Agriculture Organisation., (2010).
[55] F.F.S.A.N. Zealand), Final Assessment Report, Application A540, Steviol
Glycosides as Intense Sweeteners. , Canberra: Food Standards Australia New Zealand.,
(2008).
[56] C. González, M. Tapia, E. Pérez, D. Pallet, M. Dornier, Main properties of steviol
glycosides and their potential in the food industry: a review, Fruits, 69 (2014) 127-141.
[57] S. Stoyanova, J. Geuns, É. Hideg, W. Van Den Ende, The food additives inulin and
stevioside counteract oxidative stress, International journal of food sciences and
nutrition, 62 (2011) 207-214.
[58] P.D. Richard C. Kraska, DABT, P.D. Robert S. McQuate, P.D. Madhusudan G.
Soni, FACN, Gras assessment of high purity steviol glycosides ( 95%) Food Usage
Conditions for General Recognition of Safety for Compound Solutions, Inc. Vista, CA,
(July 2011).
[59] Hoàng Văn Phiệt, Hoàng Thanh Phương, Trương Tất Hiếu, Nguyễn Kim Sơn, Đào
Đình Kim, Chiết suất Steviolside từ lá cỏ ngọt,, Tuyển tập các công trình nghiên cứu
khoa học 1994-1995, 1995,, 28-29.
[60] Tôn Nữ Liên Hương, Võ Hoàng Duy, Dương Mộng Hòa, Đỗ Duy Phúc, và Nguyễn
Duy Thanh, CHIẾT XUẤT STEVIOSIDE TỪ CÂY CỎ NGỌT (Stevia rebaudiana
Bertoni), Tạp chí Khoa học Đại học Cần thơ, (2015) 73-76.
80

[61] N. Bondarev, O. Reshetnyak, A. Nosov, Peculiarities of diterpenoid steviol
glycoside production in in vitro cultures of Stevia rebaudiana Bertoni, Plant Science,
161 (2001) 155-163.
[62] T. Morita, I. Fujita, J. Iwamura, Sweetening compound, method of recovery, and
use thereof, in, Google Patents, 1978.
[63] R.H. Dobberstein, M.S. Ahmed, Extraction, separation and recovery of diterpene
glycosides from Stevia rebaudiana plants, in, Google Patents, 1982.
[64] N. Kolb, J. Herrera, D. Ferreyra, R. Uliana, Analysis of sweet diterpene glycosides
from Stevia rebaudiana: improved HPLC method, Journal of agricultural and food
chemistry, 49 (2001) 4538-4541.
[65] H. Makapugay, N. Nanayakkara, A.D. Kinghorn, Improved high-performance
liquid chromatographic separation of the Stevia rebaudiana sweet diterpene glycosides
using linear gradient elution, Journal of Chromatography A, 283 (1984) 390-395.
[66] J. Striedner, F.C. Czygan, G. Braunegg, Contributions to the biotechnological
production of sweeteners from Stevia rebaudiana Bertoni. I. A method for the serial
analysis of diterpene glycosides by HPLC, Engineering in Life Sciences, 11 (1991) 495-
499.
[67] W.S. FUH, B.H. CHIANG, Purification of steviosides by membrane and ion
exchange processes, Journal of food science, 55 (1990) 1454-1457.
[68] R.H. Giovanetto, Method for the recovery of steviosides from plant raw material,
in, Google Patents, 1990.
[69] J.D. Payzant, J.K. Laidler, R.M. Ippolito, Method of extracting selected sweet
glycosides from the Stevia rebaudiana plant, in, Google Patents, 1999.
[70] S. Kumar, Method for recovery of stevioside, in, Google Patents, 1986.
[71] S.Q. Zhang, A. Kumar, O. Kutowy, Membrane-based separation scheme for
processing sweeteners from stevia leaves, Food Research International, 33 (2000) 617-
620.
[72] U. Kienle, Method of making a natural sweetener based on Stevia rebaudiana, and
use thereof, in, Google Patents, 1992.
[73] M. Fumio, Stevioside extracted from Stevia containing sweetener., Japanese
Patent 55-0007039.
, (1980).
[74] M.C. Jackson, G.J. Francis, R.G. Chase, High yield method of producing pure
rebaudioside A. , US Patent 0083838, (2006).
[75] J. Pol, E.V. Ostra, P. Karasek, M. Roth, B. Karolinka, J. Kaslavsky, Comparison of
two different solvents employed for pressurized fluid extraction of stevioside from Stevia
Rebaudiana: methanol versus water., Anal Bioanal Chem 388,
, (2007) 1847–1857.
[76] H. Tadaaki, I. Ryoichi, K. Teruo, A method for purifying stevioside., Japanese
Patent 51-131900.
81

, (1976).
[77] K. Tadashi, K. Masato, Production of Stevia sweetener. , Japanese Patent 07-
143860., (1995).
[78] M. Toyoshige, B. Usei, Sweetener obtained from plant body of variety of Stevia
Rebaudiana cultivatable from seed., Japanese Patent 2002-262822., (2002).
[79] M. Chhaya, G.C., S. De, O.o.p.p.f.w.e.o.s.u. response, surface methodology.
Separation Science and Technology, s.f. publication., Optimization of process
parameters for water extraction of stevioside using response surface methodology,
, Separation Science and Technology, submitted for publication., (2012).
[80] G. Ruihua, S. Jingwen, Y. Xinwei, Method for ultrasonic extraction of stevioside.
, Chinese Patent 101798329A., (2010).
[81] V. Jaitak, B.S. Bandna, V. Kaul, An efficient microwave‐assisted extraction process
of stevioside and rebaudioside‐A from Stevia rebaudiana (Bertoni), Phytochemical
Analysis, 20 (2009) 240-245.
[82] H. Weiping, J.H. Zhou, Process for extracting sweet diterpene glycosides. , US
Patent 6,228,996.
, (1999).
[83] V.H. Abelyan, V.T. Ghochikyan, A.A. Markosyan, M.O. Adamyan, L.A. Abelyan,
Extraction, separation and modification of sweet glycosides from the Stevia Rebaudiana
plant. , US Patent 7,838,044 B2., (2010).
[84] K. Shinichi, T. Masaaki, F. Masahiro, Purification of stevioside solution.
, Japanese Patent 55-120770., (1980).
[85] K. Kotaro, O. Tokuo, Extraction and purification of sweetener component from dry
leaf of Stevia. , Japanese Patent 62-166861., (1987).
[86] T. Taku, O. Yukio, Preparation of stevioside., Japanese Patent 58-028246., (1983).
[87] O. Yukio, I. Hajime, T.P.m.o.s.s.J. Taku, P. 58-028247., Purifying method of
stevioside solution., Japanese
Patent 58-028247.
, (1983).
[88] P.C. Wankat, Separation Process Engineering. , New York: Prentice-Hall., (2007).
[89] G.J. Persinos, Method of producing stevioside. , US Patent 3,723,410, (1973).
[90] J. Adduci, D. Buddhasukh, B. Ternai, Improved isolation and purification of
stevioside. , J Sci Soc Thai 13, , (1987) 179–183.
[91] S.H. Won, C.K. Jin, C.H. Hoon, b.P.p.o.s. Korean, P. B1., Purification process of
stevioside. , Korean Patent 1019900005468 B1., (1990).
[92] O.D.a.p.o.s.s.c.J. Susumu, P. 55-111768., Decolorization and purification of stevia
sweet component., Japanese Patent 55-111768., (1980).
82

[93] J.K. Kumar, G.K. Babu, V.K. Kaul, P.S.P.f.p.o. Ahuja, s.f.S.R.B.I.P.W. 2006/, A1.,
Process for production of stevioside from Stevia Rebaudiana Bertoni. , International
Patent WO 2006/038221 A1., (2006).
[94] M. Yang, J. Hua, L. Qin, High purity rebaudioside A and method of extracting
same. , US Patent 7,923,541B2., (2011).
[95] S. Purakayastha, A. Markosyan, M. Malsagov, Process for manufacturing a
sweetener and use thereof., US Patent Application 2010/0227,034., (2010).
[96] M. Magomet, T. Tomov, T. Somann, V.H. Abelyan, Process for manufacturing of
a sweetener and use thereof., US Patent 7,862,845B2., (2011).
[97] C. Chiang, J.C. Evans, J.J. Hahn, Separation of rebaudioside A from Stevia
glycosides using chromatography., US Patent 2011/0087011 A1., (2011).
[98] J. Liu, K. Zhang, S. Guo, Separation and purification of stevioside and
rebaudioside A. , US Patent 2012/0083593A1., (2012).
[99] E.P. Moraes, N.R.C.F. Machado, Clarification of Stevia Rebaudiana (Bert.)
Bertoni extract by adsorption in modified zeolites. , Acta Scientiar 23 (2001) 1375–
1380.
[100] R. Rajab, C. Mohankumar, K. Murugan, M. Harish, P.V.P. Mohanam, and toxicity
studied of stevioside from Stevia Rebaudiana Bertoni. Toxicol Int 16, 49–54.,
Purification and toxicity studied of stevioside from Stevia Rebaudiana Bertoni., Toxicol
Int 16, (2009) 49–54.
[101] Rongfu Shi, Mancai Xu, Zuoqing Shi, Yunge Fan, Xianzhi Guo, Yongning Liu,
Chunhong Wang, Binglin He, Synthesis of bifunctional polymeric adsorbent and its
application in purification of Stevia glycosides, Reactive and Functional Polymers, 50
(2002) 107-116.
[102] J. Liu, C. Ong, S. Li, Subcritical fluid extraction of Stevia sweeteners from Stevia
rebaudiana, Journal of chromatographic science, 35 (1997) 446-450.
[103] C. Sharma, S. Mondal, G. Majumdar, S. De, Clarification of Stevia extract by
ultrafiltration: selection criteria of the membrane and effects of operating conditions,
Food and bioproducts processing, 90 (2012) 525-532.
[104] F.V. Silva, R. Bergamasco, C.M.G. Andrade, N. Pinheiro, N.R.C.F. Machado,
M.H.M. Reis, A.A. de Araujo, S.L. Rezende, Purification process of stevioside using
zeolites and membranes, International Journal of Chemical Reactor Engineering, 5
(2007) 1443.
[105] M. Reis, F. Da Silva, C. Andrade, S. Rezende, M. Wolf Maciel, R. Bergamasco,
Clarification and purification of aqueous stevia extract using membrane separation
process, Journal of food process engineering, 32 (2009) 338-354.
[106] A. Mustafa, C. Turner, Pressurized liquid extraction as a green approach in food
and herbal plants extraction: A review, Analytica chimica acta, 703 (2011) 8-18.
[107] W. Kukula-Koch, N. Aligiannis, M. Halabalaki, A.-L. Skaltsounis, K. Glowniak,
E. Kalpoutzakis, Influence of extraction procedures on phenolic content and antioxidant
activity of Cretan barberry herb, Food chemistry, 138 (2013) 406-413.
83

[108] K. Phillips, Stevia: steps in developing a new sweetener, Developments in
sweeteners, 3 (1987) 1-43.
[109] H. Sugisawa, T. Kasai, and H. Suzuki, ibid.,, 51 (1977) 175.
[110] P. Mauri, G. Catalano, C. Gardana, P. Pietta, Analysis of Stevia glycosides by
capillary electrophoresis, Electrophoresis, 17 (1996) 367-371.
[111] P. Nishiyama, M. Alvarez, L.G. Vieira, Quantitative analysis of stevioside in the
leaves of Stevia rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy, Journal of the
Science of Food and Agriculture, 59 (1992) 277-281.
[112] C. Yu, K. Xu, Y. Shi, The spectrum model established for measuring the contents
of Rebaudioside A and Stevioside quickly in the leaves of Stevia rebaudiana Bertoni,
Energy Procedia, 5 (2011) 855-861.
[113] V. Jaitak, A. Gupta, V. Kaul, P.S. Ahuja, Validated high-performance thin-layer
chromatography method for steviol glycosides in Stevia rebaudiana, Journal of
pharmaceutical and biomedical analysis, 47 (2008) 790-794.
[114] L. Hearn, P. Subedi, Determining levels of steviol glycosides in the leaves of Stevia
rebaudiana by near infrared reflectance spectroscopy, Journal of Food Composition
and Analysis, 22 (2009) 165-168.
[115] A.U. Jackson, A. Tata, C. Wu, R.H. Perry, G. Haas, L. West, R.G. Cooks, Direct
analysis of Stevia leaves for diterpene glycosides by desorption electrospray ionization
mass spectrometry, Analyst, 134 (2009) 867-874.
[116] PGS. Nguyễn Ngộ, Công nghệ đường mía, Nhà suất bản Bách Khoa - Hà Nội,
(2011) 272.
84

PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo dạng nguyên liệu trong
quá trình chiết
Dạng nguyên liệu
chiết
Khối lượng cao thu được (g)
Lá nguyên Bán nguyên Bột mịn
Thí nghiệm 1 15.79 16.21 18.17
Thí nghiệm 2 15.52 16.60 18.12
Trung bình 15.66 16.41 18.15
Hiệu suất chiết 33.41 35.35 39.12
Dạng nguyên liệu
chiết
Độ ẩm cao
Lá nguyên Bán nguyên Bột mịn
Thí nghiệm 1 0.036 0.0352 0.0353
Thí nghiệm 2 0.0372 0.0359 0.0361
Trung bình 0.04 0.04 0.04
Dạng nguyên liệu
chiết
Khối lượng nguyên liệu chiết quy khô
Lá nguyên Bán nguyên Bột mịn
Thí nghiệm 1 45.15 44.75 44.72
Thí nghiệm 2 45.14 44.75 44.73
Trung bình 45.14 44.75 44.72
Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%
85

Dạng
nguyên liệu
chiết
Lá nguyên
Bán nguyên
Bột mịn
Độ hấp thu (A)
Bước sóng 210 nm
TN1
Định mức dung dịch: 100mL
TN2
0.92 0.904
0.939 0.933
0.954 0.906
1.308 1.303
1.192 1.315
1.235 1.362
1.233 1.193
1.207 1.149
1.292 1.201
Phụ lục 2. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo tỉ lệ rắn/lỏng trong quá
trình chiết
Tỉ lệ rắn/lỏng
(g/mL)
Khối lượng cao thu được (g)
1/6 1/7 1/8 1/9
Thí nghiệm 1 15.79 16.53 16.60 16.96
Thí nghiệm 2 15.52 16.20 17.61 17.34
Trung bình 15.66 16.37 17.11 17.15
Hiệu suất chiết cao
tổng 33.44 35.26 36.81 36.93
Tỉ lệ rắn/lỏng
(g/mL)
Độ ẩm cao
1/6 1/7 1/8 1/9
Thí nghiệm 1 0.035 0.0352 0.0357 0.0377
Thí nghiệm 2 0.0362 0.0359 0.0364 0.0353
Trung bình 0.04 0.04 0.04 0.04
86

Tỉ lệ rắn/lỏng
(g/mL)
Khối lượng nguyên liệu chiết quy khô
1/6 1/7 1/8 1/9
Thí nghiệm 1 45.15 44.77 44.79 44.75
Thí nghiệm 2 45.14 44.74 44.80 44.73
Trung bình 45.14 44.76 44.79 44.74
Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%
Tỉ lệ
rắn/lỏng
(g/mL)
1/6
1/7
1/8
1/9
Độ hấp thu (A)
Bước sóng 210 nm
TN1
TN2
0.92 0.904
0.939 0.933
0.954 0.906
0.998 0.972
0.984 0.977
0.957 0.979
0.993 1.072
0.973 1.051
1.006 1.054
1.042 1.005
1.027 1.042
1.009 1.003
Định mức dung dịch: 100mL
Phụ lục 3. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo thời gian trong quá trình
chiết
Thời gian (phút)
Khối lượng cao thu được (g)
10 20 30 40 50 60
Thí nghiệm 1 7.42 7.67 8.02 8.07 8.40 8.42
Thí nghiệm 2 7.34 7.73 8.16 8.16 8.39 8.15
Trung bình 7.38 7.70 8.09 8.12 8.40 8.29
Hiệu suất chiết cao
tổng
32.30 33.55 35.29 35.35 36.67 36.14
87

Thời gian
(phút)
Độ ẩm cao
10 20 30 40 50 60
Thí nghiệm 1 0.0225 0.0233 0.0245 0.0245 0.0235 0.0285
Thí nghiệm 2 0.0214 0.0289 0.0257 0.0282 0.0238 0.0215
Trung bình 0.02 0.03 0.03 0.03 0.02 0.03
Thời gian
(phút)
Khối lượng nguyên liệu chiết quy khô
10 20 30 40 50 60
Thí nghiệm 1 22.35 22.35 22.35 22.35 22.35 22.35
Thí nghiệm 2 22.35 22.35 22.35 22.35 22.35 22.35
Trung bình 22.35 22.35 22.35 22.35 22.35 22.35
Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%
Thời gian
(phút)
10
20
30
40
50
Độ hấp thu (A)
Bước sóng 210 nm
TN1 TN2
0.801 0.789
0.801 0.799
0.798 0.798
0.814 0.823
0.805 0.821
0.802 0.816
0.835 0.861
0.825 0.859
0.835 0.867
0.836 0.847
0.845 0.872
0.842 0.850
0.879 0.871
0.901 0.882
0.892 0.902
88

60
0.890 0.825
0.890 0.867
0.889 0.873
Định mức dung dịch: 100mL
Phụ lục 4. Bảng số liệu hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo nhiệt độ trong quá trình
chiết
Nhiệt độ (oC)
Khối lượng cao thu được (g)
60 70 80 90 100
Thí nghiệm 1 6.05 8.02 8.37 8.85 8.02
Thí nghiệm 2 6.24 7.89 8.16 8.39 8.15
Trung bình 6.15 7.96 8.27 8.62 8.09
Hiệu suất chiết cao
tổng
26.74 34.32 35.70 37.14 34.83
89

Nhiệt độ (oC)
Độ ẩm cao
60 70 80 90
Thí nghiệm 1 0.027 0.036 0.0352 0.0373
Thí nghiệm 2 0.028 0.0357 0.0341 0.037
Trung bình 0.028 0.036 0.035 0.037
Khối lượng nguyên liệu chiết quy khô
Nhiệt độ (oC)
60 70 80 90 100
Thí nghiệm 1 22.35 22.35 22.35 22.35 22.35
Thí nghiệm 2 22.35 22.35 22.35 22.35 22.35
Trung bình 22.35 22.35 22.35 22.35 22.35
Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%
Nhiệt độ
(oC)
60
70
80
90
100
Độ hấp thu (A)
Bước sóng 210 nm
TN1 TN2
0.785 0.787
0.796 0.786
0.792 0.794
0.855 0.778
0.839 0.766
0.842 0.758
0.845 0.830
0.867 0.823
0.872 0.826
0.903 0.851
0.893 0.862
0.882 0.875
0.839 0.825
0.825 0.830
0.819 0.842
90

Định mức dung dịch: 100mL
Phụ lục 5. Bảng số liệu tính hiệu suất chiết và độ hấp thu UV theo số lần chiết trong
quá trình chiết
Số lần chiết (lần)
Khối lượng cao thu được (g)
1 2 3 4
Thí nghiệm 1 6.22 8.84 9.05 9.25
Thí nghiệm 2 6.15 8.69 9.19 9.30
Trung bình 6.19 8.77 9.12 9.28
Hiệu suất chiết cao
tổng (%)
19.34 38.09 39.58 40.44
Số lần chiết
(lần)
Độ ẩm cao
1 2 3 4
Thí nghiệm 1 0.304 0.0283 0.0301 0.028
Thí nghiệm 2 0.298 0.0294 0.0298 0.0232
Trung bình 0.301 0.03 0.03 0.03
Số lần chiết
(lần)
Khối lượng nguyên liệu chiết quy
khô
1 2 3 4
Thí nghiệm 1 22.35 22.35 22.35 22.35
Thí nghiệm 2 22.35 22.35 22.35 22.35
Trung bình 22.35 22.35 22.35 22.35
Độ ẩm trung bình nguyên liệu: 10.6%
Số lần chiết
(lần)
1
Độ hấp thu (A)
Bước sóng 210 nm
TN1
TN2
0.775 0.789
0.785 0.778
0.784 0.769
2 0.879 0.859
91

0.855 0.862
0.867 0.867
0.879 0.879
3 0.875 0.897
0.883 0.882
0.894 0.905
4 0.901 0.889
0.886 0.897
Định mức dung dịch: 100mL
Phụ lục 6. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nồng độ dung dịch trong
quá trình gia vôi
Nồng độ dung dịch
trước phản ứng (g/mL)
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Dịch gốc: 90g/L
Độ hấp thu (A)
TN1 TN2
0.605 0.606
0.603 0.606
0.597 0.608
0.602 0.607
0.587 0.607
0.578 0.604
0.601 0.605
0.623 0.632
0.572 0.608
0.583 0.604
0.557 0.587
0.555 0.567
0.569 0.597
0.582 0.592
0.533 0.541
0.538 0.533
0.54 0.578
0.545 0.567
1.200
1.264
Nồng độ dung
dịch trước phản
ứng (g/mL)
10
TN1
TN2
L* a* b* L* a* b*
27.31 5.54 7.06 27.12 5.54 6.98
27.19 5.61 7.06 27.22 5.35 6.83
92

20
30
40
50
60
70
80
90
Dịch gốc: 90g/L
27.09 5.65 7.07 27.13 5.45 6.91
29.13 6.99 9.83 28.94 6.89 9.74
29.11 7.05 9.79 28.94 6.83 9.79
29.05 6.78 9.60 29.05 6.78 9.63
30.3 6.14 12.58 29.04 6.15 12.14
30.14 6.20 12.76 29.02 6.21 12.16
30.63 6.07 12.37 29.05 6.26 12.17
28.83 5.42 10.02 29.03 5.12 11.82
29.52 4.78 9.28 28.98 4.78 12.08
28.8 5.58 10.26 28.84 5.18 11.86
29.8 5.72 12.58 29.14 5.52 12.59
29.91 5.65 12.57 29.15 5.54 12.49
30.04 5.61 12.49 29.2 5.42 12.59
30.69 5.89 14.04 29.98 5.79 12.44
31.6 5.14 12.93 29.97 5.74 12.43
31.16 5.65 14.06 29.88 5.65 12.56
30.98 5.87 12.80 31.89 5.98 12.70
30.99 5.63 12.24 31.78 5.93 12.64
30.82 5.78 12.52 31.84 5.89 12.62
33 5.76 16.16 32.87 5.57 16.06
32.9 5.94 16.61 32.79 5.65 16.01
32.77 5.88 16.38 32.74 5.65 16.18
32.11 6.18 16.07 32.24 6.08 16.17
32.27 6.12 15.84 32.31 6.11 16.14
32.34 5.98 15.76 32.35 6.13 15.96
24.14 -1.66 2.22 24.14 -1.66 2.22
25.49 -1.86 2.3 25.49 -1.86 2.3
24.2 -1.81 2.27 24.2 -1.81 2.27
Phụ lục 7. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối
lượng cao trong quá trình gia vôi
Tỉ lệ lượng Ca(OH)2/khối
lượng cao (g/g)
0.5/1
1/1
1.5/1
2/1
Dịch ban đầu: 90g/L
Độ hấp thu (A)
TN1 TN2
0.588 0.583
0.608 0.589
0.559 0.561
0.568 0.559
0.577 0.567
0.578 0.579
0.566 0.571
0.571 0.569
1.569
1.659
93

Tỉ lệ lượng
Ca(OH)2/khối lượng
rắn (g/g)
0.5:1
1:1
1.5:1
2:1
Dịch ban đầu: 90g/L
TN1
TN2
L* a* b* L* a* b*
29.22 5.49 14.50 29.43 5.59 15.05
29.27 5.67 14.62 29.47 5.56 15.02
29.24 5.48 14.45 29.54 5.49 15.03
29.98 6.73 15.99 30.18 6.88 16.00
30.02 6.74 15.94 30.11 6.84 16.02
30.09 6.67 15.95 30.10 6.79 16.01
30.58 6.49 15.37 30.48 6.57 15.77
30.48 6.46 15.33 30.50 6.54 15.87
30.55 6.50 15.35 30.49 6.58 15.85
30.52 6.69 15.34 30.32 6.89 15.79
30.34 6.74 15.41 30.29 6.84 15.71
30.27 6.75 15.42 30.30 6.79 15.82
19.85 -1.04 1.34 19.85 -1.04 1.34
20.22 -1.08 1.33 20.22 -1.08 1.33
20.27 -1.09 1.37 20.27 -1.09 1.37
94

Phụ lục 8. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo nhiệt độ trong quá trình
gia vôi
Nhiệt độ ( o C)
0
10
20
30
40
50
60
Dịch ban đầu:
90g/L
Độ hấp thu (A)
TN1 TN2
0.603 0.610
0.583 0.601
0.555 0.570
0.545 0.563
0.576 0.578
0.570 0.580
0.568 0.586
0.597 0.562
0.606 0.598
0.619 0.588
0.615 0.601
0.628 0.602
0.697 0.612
0.682 0.603
1.14
1.181
Nhiệt độ ( o C)
TN1
TN2
L* a* b* L* a* b*
31.71 3.33 18.31 31.62 3.41 18.11
0 31.71 3.35 18.39 31.63 3.45 18.19
31.66 3.39 18.35 31.7 3.38 18.05
29.29 3.92 16.34 29.07 3.82 16.12
10 29.22 3.81 16.21 29.11 3.71 16.20
29.46 3.80 16.17 29.03 3.86 16.27
28.38 3.79 15.10 28.31 3.83 15.17
20 28.67 3.64 15.01 28.54 3.59 15.11
28.33 3.80 15.10 28.42 3.67 15.21
27.66 4.44 13.08 27.28 4.33 13.11
30 27.88 4.38 13.16 27.28 4.32 13.09
27.62 4.37 13.04 27.37 4.14 13.14
26.76 4.33 11.31 25.96 4.03 10.98
40 26.65 4.34 11.28 26.05 4.12 10.87
26.91 4.29 11.19 26.01 4.03 10.99
26.30 4.16 11.21 25.98 3.79 10.20
50 26.42 4.08 11.20 25.87 3.87 10.35
25.67 4.15 11.24 25.89 3.88 10.42
60 25.21 3.27 9.63 25.01 3.37 9.73
95

Dịch ban đầu:
90g/L
25.28 3.23 9.64 25.19 3.28 9.84
24.42 3.17 9.63 25.20 3.18 9.73
20.75 -1.16 1.14 20.75 -1.16 1.14
21.27 -1.20 1.10 21.27 -1.20 1.10
21.18 -1.14 1.18 21.18 -1.14 1.18
Phụ lục 9. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo thời gian trong quá trình
gia vôi
Thời gian
(phút)
2
5
10
15
Dịch ban đầu:
90g/L
Độ hấp thu (A)
TN1 TN2
0.514 0.567
0.528 0.562
0.550 0.557
0.542 0.557
0.520 0.538
0.519 0.545
0.533 0.554
0.542 0.556
1.326
1.298
Thời gian
(phút)
2
5
10
15
Dịch ban đầu:
90g/L
TN1
TN2
L* a* b* L* a* b*
33.28 4.97 17.78 32.98 4.37 16.98
33.51 4.85 17.75 32.95 4.36 16.87
33.47 4.92 17.97 32.97 4.32 16.87
34.50 2.54 19.94 34.02 2.39 19.78
34.45 2.70 20.11 34.04 2.36 19.88
34.53 2.63 20.07 34.13 2.03 19.72
34.91 3.43 20.35 34.06 3.13 19.99
34.76 3.50 20.17 34.02 3.19 20.03
34.61 3.49 20.14 34.01 3.20 20.04
33.78 5.28 18.44 33.98 4.95 19.31
33.95 5.17 18.14 34.01 4.90 19.23
33.79 5.28 18.14 33.99 5.01 19.34
24.36 -1.76 2.41 24.36 -1.76 2.41
24.15 -1.74 2.40 24.15 -1.74 2.40
23.91 -1.82 2.40 23.91 -1.82 2.40
96

Phụ lục 10. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tốc độ dòng chảy trong
quá trình trao đổi ion
Tốc độ chảy
(mL/phút)
0.5
1
1.5
2
Dịch sau gia vôi
Độ hấp thu (A)
TN1 TN2
0.434 0.511
0.434 0.510
0.456 0.512
0.447 0.510
0.466 0.504
0.467 0.509
0.463 0.512
0.461 0.511
0.566
0.578
Tốc độ chảy
(mL/phút)
0.5
1
1.5
2
Dịch sau gia
vôi
TN1
TN2
L* a* b* L* a* b*
52.89 -6.06 18.95 51.65 -6.11 18.78
52.81 -6.10 19.01 51.61 -6.09 18.91
53.81 -6.12 19.00 51.74 -6.02 18.36
46.65 -5.25 22.17 45.45 -4.15 21.06
46.83 -5.33 22.18 45.27 -4.28 21.35
46.60 -5.25 21.93 45.27 -4.27 21.37
46.29 -4.84 25.29 45.11 -4.24 24.89
46.32 -4.81 25.06 45.17 -4.21 24.86
46.43 -4.84 25.06 45.18 -4.34 24.76
46.13 -4.75 25.86 45.13 -4.15 24.86
46.36 -4.68 25.35 45.16 -4.08 24.75
46.48 -4.77 25.37 45.18 -4.17 24.77
31.94 3.21 15.47 31.94 3.21 15.47
31.94 3.11 15.49 31.94 3.11 15.49
31.78 3.13 15.42 31.78 3.13 15.42
97

Phụ lục 11. Bảng số liệu độ hấp thu UV và kết quả đo màu theo tỉ lệ thể tích nhựa/ thể
tích dịch trong quá trình trao đổi ion
Tỉ lệ thể tích nhựa/
thể tích dịch
(mL/mL)
1/5
1/10
1/15
1/20
Dịch sau gia vôi
Độ hấp thu (A)
TN1
TN2
0.427 0.435
0.436 0.445
0.415 0.432
0.419 0.437
0.443 0.467
0.425 0.478
0.435 0.487
0.423 0.479
0.566
0.578
Tỉ lệ thể tích
nhựa/ thể tích dịch
(mL/mL)
1:5
1:10
1:15
1:20
Dịch sau gia vôi
TN1
TN2
L* a* b* L* a* b*
55.06 -5.37 19.14 54.96 -5.63 18.78
55.03 -5.33 19.03 54.97 -5.67 18.89
55.04 -5.35 19.11 54.89 -5.77 18.99
54.59 -5.29 20.21 54.07 -4.98 19.50
54.51 -5.25 20.04 54.12 -4.95 19.47
54.59 -5.31 20.17 54.15 -4.87 19.58
53.19 -4.66 22.61 51.88 -4.11 21.78
53.23 -4.66 22.59 51.90 -4.10 21.64
53.22 -4.66 22.68 51.95 -4.03 21.72
48.43 -3.46 22.59 48.01 -3.26 22.98
48.51 -3.45 22.51 48.01 -3.28 22.87
48.59 -3.44 22.67 48.00 -3.31 22.94
31.94 3.21 15.47 31.94 3.21 15.47
31.94 3.11 15.49 31.94 3.11 15.49
31.78 3.13 15.42 31.78 3.13 15.42
98