CAP 10 - OCW Usal
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Introducción a los Métodos Cromatográficos 2<br />
Tema <strong>10</strong><br />
INTRODUCCION A LOS METODOS CROMATOGRAFICOS<br />
Los métodos que se utilizan en análisis químico presentan una selectividad más o<br />
menos alta, si bien, existen muy pocos que sean verdaderamente específicos. Por ello,<br />
en muchas ocasiones, la separación del analito de las posibles sustancias interferentes<br />
suele ser una etapa fundamental en los procedimientos analíticos. Sin duda, la<br />
Cromatografía es uno de los métodos de separación más poderosos que se hayan<br />
descubierto. Fue desarrollada originalmente por el botánico ruso M. S. Tswett como<br />
técnica para la separación de pigmentos vegetales coloreados, y la I.U.P.A.C. * la define<br />
como:<br />
"Un método utilizado inicialmente para la separación de los componentes de una<br />
muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las<br />
cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estaconara i i<br />
puede ser un sólido, un líquido sobre un soporte sólido, o un gel. La fase<br />
estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en forma de<br />
capa o dispuesta en forma de película …. La fase móvil puede ser gaseosa o<br />
líquida".<br />
El término "cromatografía" posiblemente derive de las palabras griegas "chroma"<br />
(color) y "graphein" (escribir), aludiendo a que los pigmentos vegetales separados se<br />
ponen claramente de manifiesto como bandas coloreadas. Sin embargo, el mismo<br />
Tswett indica que también pueden separarse sustancias incoloras por el mismo<br />
procedimiento.<br />
Cuando se utiliza una columna rellena de CaCO3 (figura <strong>10</strong>.1.a.), en la que se<br />
introduce un extracto de hojas verdes en éter de petróleo, y seguidamente se añade<br />
disolvente puro (eluyente) es posible la separación de clorofila, carotenos y<br />
xantofilas.<br />
En estas separaciones, la fase estacionaria es el relleno (CaCO3), la fase móvil<br />
es el éter de petróleo y los componentes a separar, los distintos pigmentos vegetales,<br />
los cuales se encuentran sometidos a dos fuerzas contrarias: el disolvente tiende a<br />
arrastrarlos hacia la salida y el CaCO3 a retenerlos. Como este último efecto es<br />
* I.U.P.A.C. "Compendium of Analytical Nomenclature". Pergamon Press. Oxford (1977).
Claudio González Pérez 3<br />
diferente para los distintos pigmentos, éstos se mueven a diferente velocidad y<br />
emergen de la columna a distintos tiempos (figura <strong>10</strong>.1.b.c.d.)<br />
CaCO 3<br />
disolvente puro (eluyente)<br />
extracto de hojas verdes en éter de petróleo<br />
eluato<br />
a b c d<br />
Figura <strong>10</strong>.1. Separación hipotética de tres componentes de una mezcla por cromatografía en columna.<br />
Cuando se mide la concentración de cada componente a la salida de la columna y<br />
se representa en función del volumen de fase móvil, o del tiempo transcurrido desde<br />
la introducción de la muestra, se obtiene una gráfica como la representada en la<br />
figura <strong>10</strong>.2., denominada "cromatograma" *.<br />
R<br />
volumen o tiempo<br />
Figura <strong>10</strong>.2. Cromatograma de la mezcla de tres componentes de la figura <strong>10</strong>.1.<br />
* Aunque es posible recoger distintas fracciones de fase móvil que sale de la columna y determinar en cada<br />
una de ellas la concentración de soluto, normalmente el efluente se monitoriza continuamente con un<br />
detector que mide alguna propiedad física o química del soluto o de la fase móvil.<br />
.
Introducción a los Métodos Cromatográficos 4<br />
La cromatografía es una técnica cuyo campo de aplicación se extiende a todas las<br />
áreas de la Química y de la Bioquímica. Asimismo, es importante en Biología, Control<br />
de Calidad, Investigación, Análisis, separaciones a escala preparativa y medidas<br />
fisicoquímicas. Asimismo, puede aplicarse con el mismo éxito tanto a escala micro<br />
como macro, siendo posible su utilización industrial para la separación de los<br />
componentes en los más diversos materiales: azúcares, tierras raras, productos<br />
farmacéuticos, etc.<br />
CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS<br />
Los métodos cromatográficos pueden clasificarse atendiendo a distintos<br />
factores: estado físico de las fases móvil y estacionaria (gas-líquido, líquido-líquido,<br />
etc), soporte utilizado (columna, papel, etc), mecanismo de la separación (adsorción,<br />
reparto), e incluso el tipo de soluto (cromatografía iónica, cromatografía de proteínas,<br />
etc). En el cuadro de la figura <strong>10</strong>.3. se muestra una clasificación en función de algunos<br />
parámetros mencionados anteriormente.<br />
1. Cuando se utiliza como fase móvil un fluido a presión y temperatura superiores a la crítica se tiene un tipo<br />
de cromatografía denominada de fluido supercrítico.<br />
2. Además de los mecanismos mencionados existen otros tales como: fase enlazada, interacción iónica,<br />
afinidad, quelación.<br />
3. El mecanismo es de adsorción cuando la fase móvil en un líquido polar.<br />
4. El mecanismo puede ser de reparto cuando la fase móvil es un líquido no polar<br />
Figura <strong>10</strong>.3. Clasificación de los métodos cromatográficos
Claudio González Pérez 5<br />
Según la naturaleza de la fase móvil, los métodos cromatográficos se clasifican<br />
en dos grupos: cromatografía líquida y cromatografía de gases (además de la<br />
mencionada en el pie de la figura <strong>10</strong>.3. de fluidos supercríticos), según que la fase<br />
móvil sea un líquido o un gas respectivamente.<br />
En cromatografía líquida, cuando la fase estacionaria es polar y la fase móvil nopolar,<br />
se denominan sistemas normales, o de fase normal. En estos sistemas, la<br />
retención del soluto se incrementa generalmente con su polaridad. Por otra parte, si la<br />
fase estacionaria es menos polar que la fase móvil, el sistema se designa como de fase<br />
inversa, y en éstos, las especies polares tienen poca afinidad por la fase estacionaria,<br />
siendo eluidos más fácilmente.<br />
En cuanto al soporte, o la técnica utilizada para desarrollar el cromatograma,<br />
pueden distinguirse dos categorías: plana y en columna. En cromatografía plana, la<br />
fase estacionaria puede estar constituida por una hoja de papel (cromatografía en<br />
papel) o por una capa de un sólido distribuido uniformemente sobre una lámina de<br />
vidrio, plástico o aluminio (cromatografía de capa fina). Por otra parte, la fase<br />
estacionaria puede estar contenida en una columna, en cuyo caso la técnica se<br />
denomina cromatografía en columna. Cuando la fase estacionaria es un líquido, éste<br />
debe inmovilizarse sobre un soporte sólido inerte, o sobre la propia columna.<br />
Evidentemente, la cromatografía plana está limitada al uso de fase móvil líquida,<br />
debido a las dificultades inherentes para confinar un gas o un fluido supercrítico en<br />
una superficie plana. Sin embargo, la cromatografía en columna puede utilizarse en las<br />
modalidades de líquidos, gases y fluidos supercríticos.<br />
En el caso de la cromatografía líquida en columna existen dos modalidades, que<br />
pueden denominarse en función de su desarrollo cronológico como cromatografía<br />
clásica en columna y cromatografía de alta resolución (CLAR o HPLC) *<br />
Columnas cromatográficas<br />
Las columnas convencionales usadas en cromatografía líquida y de gases tienen<br />
diámetros relativamente grandes: 2-4 mm en CG y 4-6 mm en HPLC. Estas columnas<br />
contienen la fase estacionaria empacada, consistente en un sólido o un líquido volátil<br />
recubriendo a un soporte sólido inerte.<br />
Desde 1957 se han venido desarrollando distintos tipos de columnas capilares<br />
(también denominadas columnas tubulares abiertas) utilizadas inicialmente en CG y<br />
* Las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominación en inglés High Performance Liquid<br />
Chromatography.
Introducción a los Métodos Cromatográficos 6<br />
extendiéndose posteriormente a CL e incluso a cromatografía de fluidos supercríticos.<br />
Estas columnas son mucho más estrechas y mucho más largas que las columnas<br />
empacadas. En ellas, la fase estacionaria sólida está constituida por una capa porosa<br />
(figura <strong>10</strong>.4.a) y la fase estacionaria líquida puede estar recubriendo directamente la<br />
pared interna de la columna (figura <strong>10</strong>.4.b.), o sobre un soporte sólido (figura <strong>10</strong>.4.c.).<br />
fase estacionaria sólida<br />
pared de la columna<br />
fase estacionaria líquida<br />
soporte sólido recubierto<br />
con fase estacionaria líquida<br />
a b c<br />
Figura <strong>10</strong>.4. Columnas tubulares abiertas. a) de capa porosa. b) con pared recubierta. c) con soporte<br />
recubierto.<br />
Las columnas tubulares abiertas proporcionan mayor resolución, requieren menor<br />
tiempo para el análisis y presentan mayor sensibilidad que las columnas empacadas, si<br />
bien, se maneja una cantidad de muestra considerablemente menor y no son útiles<br />
para separaciones preparativas en las que se trate de aislar cantidades relativamente<br />
grandes de compuesto.<br />
Mecanismo de las separaciones cromatográficas<br />
La naturaleza de las interacciones entre los distintos componentes de la muestra<br />
y las dos fases, móvil y estacionaria, permite clasificar los sistemas cromatográficos<br />
desde este punto de vista, si bien, puede considerarse que la fase estacionaria es la<br />
que gobierna el modo de separación. Las fuerzas implicadas en estas interacciones<br />
suelen ser débiles, tales como fuerzas de Van der Waals o enlaces de hidrógeno.<br />
La cromatografía de adsorción se tiene cuando la fase estacionaria es un sólido<br />
adsorbente de gran área superficial (gel de sílice, alúmina, etc.). Los centros activos<br />
situados sobre la superficie del sólido (por ejemplo, los grupos silanol de la gel de<br />
sílice) interaccionan con los grupos funcionales polares de los compuestos a separar<br />
(figura <strong>10</strong>.5.a.). La separación se produce como consecuencia de la distinta intensidad<br />
de las mencionadas interacciones para unos y otros compuestos.
Claudio González Pérez 7<br />
Las primitivas separaciones de Tswett corresponden a un mecanismo de<br />
adsorción. Actualmente aún se utiliza la adsorción en algunas separaciones por<br />
cromatografía líquida en columna, si bien, su principal campo de aplicación corresponde<br />
a la cromatografía de capa fina. Por otra parte, las aplicaciones de la adsorción en<br />
cromatografía de gases se limitan fundamentalmente a separaciones donde los<br />
analitos son gases permanentes.<br />
Una característica importante del adsorbente es el tamaño de partícula. En<br />
principio, la retención es proporcional al área superficial, la cual, a su vez, depende del<br />
tamaño de partícula y de la estructura interna de las partículas de adsorbente. Cuanto<br />
menor sea el tamaño de partícula, mayor será el área superficial del adsorbente y, en<br />
consecuencia, mayor el número de centros activos disponibles para la adsorción.<br />
La cromatografía de reparto tiene lugar cuando se utiliza un líquido como fase<br />
estacionaria. Para inmovilizar este líquido se utiliza un soporte sólido (gel de sílice,<br />
celulosa, tierra de diatomeas, poli-estireno, etc.) de gran área superficial.<br />
En cromatografía líquido-líquido, para evitar que se mezclen las fases se utiliza<br />
como fases móvil y estacionaria dos líquidos de polaridades muy diferentes. Si el<br />
líquido estacionario es polar (por ejemplo, etilen-glicol), la fase móvil será no polar<br />
(por ejemplo, hexano). En este caso, los solutos polares son retenidos más<br />
fuertemente que los no polares. La forma citada es la de operación normal, si bien<br />
también puede operarse con una fase estacionaria no polar (por ejemplo, decano) y con<br />
una fase móvil polar (por ejemplo, agua). Esta forma de proceder se denomina de fase<br />
inversa. En cualquier caso, la separación se produce porque las moléculas de soluto se<br />
distribuyen entre las dos fases según su solubilidad relativa en cada una de ellas *<br />
(figura <strong>10</strong>.5.b.).<br />
En la cromatografía de intercambio iónico, la fase estacionaria es una matriz<br />
rígida, en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva o<br />
negativamente (A) y contra-iones de carga opuesta (M), susceptibles de<br />
intercambiarse con iones de la misma carga contenidos en la fase móvil (figura <strong>10</strong>.5.c.)<br />
Intercambio catiónico:<br />
Matriz-A – M + + X + —> Matriz-A – X + + M +<br />
* Frecuentemente, en cromatografía líquido-líquido, la fase estacionaria está unida quimicamente al soporte<br />
sólido, en lugar de estar simplemente depositado sobre el. En este caso, se tiene la denominada<br />
cromatografía de fase enlazada (bonded-phase chromatography, BPC). El mecanismo de las separaciones<br />
por esta técnica es complejo, si bien, parece que implica una combinación de adsorción y reparto,<br />
dependiendo de las condiciones experimentales. En HPLC, la utilización de la BPC está muy generalizada.
Intercambio aniónico:<br />
Introducción a los Métodos Cromatográficos 8<br />
Matriz-A + M – + Y – —> Matriz-A + Y – +M –<br />
La fase móvil suele ser una solución acuosa tamponada y la separación se produce<br />
por la competencia que se establece entre los iones de la fase móvil y los iones del<br />
analito por los centros activos de la resina. Este tipo de cromatografía se utiliza<br />
ampliamente en química inorgánica para la separación de iones metálicos, así como en<br />
sistemas biológicos para la separación de compuestos iónicos solubles en agua.<br />
.<br />
fase móvil<br />
soluto<br />
+<br />
centros<br />
activos<br />
a) adsorción<br />
interfase<br />
fase<br />
estacionaria<br />
sólida<br />
fase móvil fase<br />
grupo<br />
funcional<br />
+<br />
contraión<br />
estacionaria<br />
sólida<br />
c) intercambio iónico<br />
fase móvil<br />
fase móvil<br />
b) reparto<br />
d) exclusión<br />
fase<br />
estacionaria<br />
líquida<br />
fase<br />
estacionaria<br />
sólida<br />
Figura <strong>10</strong>.5. Representación esquemática de algunos mecanismos de separaciones cromatográficas.<br />
La cromatografía de exclusión también se denomina cromatografía de filtración<br />
en gel o cromatografía de permeación en gel. En ella, la fase estacionaria consiste en<br />
un sólido inerte que contiene pequeños poros en los que pueden penetrar las moléculas<br />
.
Claudio González Pérez 9<br />
de tamaño reducido, pero no las grandes (figura <strong>10</strong>.5.d.). El grado de retención<br />
depende del tamaño de las moléculas (solvatadas) y del tamaño de los poros. Las<br />
moléculas pequeñas pueden penetrar en los poros pequeños, mientras que las de<br />
tamaño intermedio pueden penetrar solo en algunos poros, siendo excluidas de los<br />
otros, y las moléculas grandes son excluidas completamente, Estas últimas se<br />
desplazan con la fase estacionaria y son eluidas en primer lugar. Este tipo de<br />
cromatografía resulta especialmente adecuada para la separación de especies<br />
orgánicas de peso molecular elevado de otras moléculas pequeñas * .<br />
FUNDAMENTOS TEORICOS<br />
Se presentan seguidamente los conceptos en los que se basan las separaciones<br />
cromatográficas y aquellos parámetros que son de utilidad para comprender y mejorar<br />
la calidad de los cromatogramas.<br />
CONSTANTE DE DISTRIBUCION Y SEPARACIONES<br />
Los componentes a separar, en su desplazamiento a lo largo del sistema<br />
cromatográfico se mueven a diferentes velocidades, dependiendo de la afinidad de<br />
cada uno por la fase estacionaria, respecto a la fase móvil. Cada uno de ellos se<br />
distribuye entre las dos fases según un equilibrio caracterizado por una constante<br />
denominada constante de distribución o coeficiente de distribución. Para el<br />
componente A,<br />
Amóvil Aestacionaria<br />
K A = A S<br />
A M<br />
donde [AS] es la concentración de A en la fase estacionaria, y [AM] la concentración<br />
de A en la fase móvil. Este modelo es análogo al utilizado en sistemas de extracción<br />
simple, si bien, la cromatografía es un sistema dinámico en el que los procesos de<br />
* En el extremo opuesto a la cromatografía de exclusión puede situarse la denominada cromatografía de<br />
afinidad. En ésta, la fase estacionaria consiste en una especie bioactiva unida a un soporte sólido. La<br />
separación se produce en función de la afinidad química entre los diferentes solutos y el líquido bioactivo. Se<br />
utilizan interacciones altamente específicas, tales como las existentes entre un antígeno y un anticuerpo. El<br />
compuesto activo es retenido por la fase estacionaria, siendo eluidos los demás. Posteriormente, un cambio<br />
en el pH o en la composición de la fase móvil origina la liberación de la especie retenida, haciendo posible su<br />
elución.
Introducción a los Métodos Cromatográficos <strong>10</strong><br />
separación tienen lugar continuamente, con solutos moviéndose sobre la fase<br />
estacionaria y tratando de alcanzar el equilibrio definido por K. En cualquier caso,<br />
cuanto mayor sea el valor de K, mayor será la afinidad del componente en cuestión<br />
para la fase estacionaria y menor será la velocidad a la que se mueve a través del<br />
sistema.<br />
Para una muestra que contenga los componentes A, B y C, y que se introduzca<br />
como una banda estrecha sobre una fase estacionaria, si<br />
KA > KB > KC<br />
el componente A se desplazará a lo largo del sistema más lentamente que el B, y éste<br />
más despacio que el C.<br />
En cromatografía plana, los componentes A, B y C se ponen de manifiesto por la<br />
presencia de manchas, mientras que en cromatografía de gases o en HPLC, donde<br />
normalmente se utilizan métodos instrumentales como detectores a la salida de la<br />
columna en los que se monitoriza continuamente la composición de la fase móvil, la<br />
señal obtenida es proporcional a la cantidad de soluto presente en el eluyente, con lo<br />
que se obtienen picos más o menos Gaussianos, como los representados en la figura<br />
<strong>10</strong>.7.(Los picos se ensanchan por una serie de causas que se considerarán<br />
posteriormente).<br />
.<br />
A B C A B C A B C<br />
A+B+C COLUMNA DETECTOR<br />
.<br />
Figura <strong>10</strong>.7. Separación cromatográfica de una mezcla de tres compuestos.<br />
RETENCION Y DISTRIBUCION<br />
El cromatograma simplificado representado en la figura <strong>10</strong>.8 corresponde a una<br />
muestra que contiene un solo analito (A). El pico pequeño (B), corresponde a una<br />
especie no retenida por la columna y que a menudo está contenida en la muestra, pero<br />
que puede añadirse para facilitar la identificación de los picos * . En la misma figura se<br />
muestran algunos datos y símbolos característicos.<br />
* En cromatografía de gases con detector de conductividad térmica suele inyectarse, junto con la muestra,<br />
unos micro-litros de aire,.
Claudio González Pérez 11<br />
t M: tiempo muerto (tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector)<br />
V M: volumen muerto (volumen de fase móvil que se requiere para eluir una especie no<br />
retenida)<br />
t R: tiempo de retención (tiempo transcurrido desde la introducción de la muestra hasta<br />
que el componente alcanza el detector)<br />
V R: volumen de retención (volumen de fase móvil que se requiere para eluir un soluto de la<br />
columna cromatográfica)<br />
h: altura de pico; w: anchura de pico; w 1/2: anchura de pico a la semialtura<br />
w 0,1: anchura de pico a un décimo de la altura.<br />
Figura <strong>10</strong>.8. Cromatograma: parámetros característicos.<br />
Anteriormente se ha indicado que la mayor o menor retención de los<br />
componentes de una muestra por la fase estacionaria depende de las correspondientes<br />
afinidades. Estas, a su vez, dependen de diversos factores, entre los que cabe<br />
mencionar:<br />
* Interacciones electrostáticas entre especies de carga opuesta, como las que tienen<br />
lugar en separaciones por cromatografía iónica.<br />
* Interacciones por fuerzas de van der Waals del tipo dipolo-dipolo (orientación) o del<br />
tipo dipolo-dipolo inducido (inducción)<br />
* Interacciones por fuerzas de dispersión entre moléculas neutras o grupos funcionales.<br />
* Formación de enlaces de hidrógeno.
Introducción a los Métodos Cromatográficos 12<br />
El tiempo de retención puede considerarse que está constituido por dos<br />
componentes. Uno de ellos es el ya mencionado tiempo muerto, que es el mismo para<br />
todos los analitos en un sistema cromatográfico determinado, y el otro es el<br />
denominado tiempo de retención ajustado, t'R, que es el tiempo que realmente se<br />
invierte en la retención de un soluto por la fase estacionaria, y que se define como<br />
t'R = tR — tM<br />
Las características de retención de los componentes suelen describirse en la<br />
práctica por el factor de retención o factor de capacidad, k', definido como,<br />
k ' = masa desolutoS =<br />
masa de soluto M<br />
mS mM y relacionado con el coeficiente de distribución y los volúmenes de fase móvil y fase<br />
estacionaria por:<br />
K= A S<br />
A M<br />
=<br />
m SVM<br />
m MVM<br />
= mS .<br />
mM VM =k<br />
VS ' VM VS donde VM y VS son los volúmenes de fase móvil y estacionaria respectivamente. La<br />
relación VM/VS se denomina relación de fases, β, y es uno de los parámetros que se<br />
utilizan para caracterizar una columna cromatográfica, particularmente en<br />
cromatografía de gases.<br />
La medida directa de mS y mM suele ser difícil, por lo que la determinación del<br />
factor de retención generalmente se lleva a cabo a partir de los tiempos de retención,<br />
parámetros fácilmente medibles en el cromatograma. Para ello, el factor de retención<br />
puede considerarse que es,<br />
k ' =<br />
o lo que es lo mismo * ,<br />
tiempo depermanencia del solutoenlafaseestacionaria<br />
tiempo de permanencia del soluto en la fase móvil<br />
k ' = t R — t M<br />
t M<br />
Como el volumen es proporcional al tiempo (VR = tR F, siendo F la velocidad de<br />
flujo de fase móvil a través de la columna y VM = tM F), cualquier relación que se<br />
* La ecuación k' = ms/m M representa la relación entre la probabilidad de que una molécula de soluto<br />
permanezca en la fase estacionaria y en la fase móvil y esta relación de probabilidad es tambien igual a la<br />
relación entre el tiempo que en promedio una molécula de soluto permanece en la fase estacionaria y en la<br />
fase móvil.
Claudio González Pérez 13<br />
exprese como un cociente de tiempos puede escribirse como el cociente de los<br />
volúmenes correspondientes. Por ello,<br />
k ' = t R —t M<br />
t M<br />
= V R —V M<br />
V M<br />
El factor de capacidad es un parámetro importante porque es independiente de<br />
la velocidad de flujo de la fase móvil y de las dimensiones de la columna, y puede<br />
usarse para comparar retenciones en instrumentos diferentes.<br />
Los factores de retención grandes favorecen una buena separación, pero también<br />
incrementan el tiempo de elución y el ancho de banda. Idealmente, las separaciones se<br />
realizan en unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de<br />
una mezcla oscilan entre 1 y 5.<br />
El volumen de retención es un parámetro de utilidad en muchas ocasiones. De la<br />
expresión anterior se deduce que,<br />
y sustituyendo k' por K VS/VM, se tiene,<br />
ó<br />
VR = VM (1 + k')<br />
VR = VM (1 + K VS/VM)<br />
VR = VM + K VS<br />
que es una ecuación importante en cromatografía, si bien, en cromatografía de<br />
adsorción debe modificarse de la forma siguiente:<br />
VR = VM + kA As<br />
donde kA es el coeficiente de adsorción y As el área superficial del adsorbente.<br />
La capacidad de una determinada fase estacionaria para separar dos<br />
componentes A y B se expresa mediante el factor de separación o factor de<br />
selectividad, α, definido por:<br />
α = k '<br />
B<br />
'<br />
kA
Introducción a los Métodos Cromatográficos 14<br />
y, por otra parte, puede determinarse fácilmente de forma directa midiendo los<br />
tiempos de retención de las especies A y B sobre un cromatograma experimental, ya<br />
que,<br />
α = t R B — t M<br />
t R A —t M<br />
EFICACIA DE LAS COLUMNAS CROMATOGRAFICAS<br />
La observación de los picos cromatográficos muestra una gran semejanza con las<br />
curvas de error normal o Gaussianas, lo cual puede explicarse de la forma siguiente:<br />
durante el desplazamiento por el interior de una columna cromatográfica, una<br />
partícula individual de analito experimenta miles de transferencias entre las fases<br />
móvil y estacionaria. El tiempo de residencia en una fase dada es muy irregular,<br />
pudiendo ser muy pequeño en algunas etapas, y relativamente grande en otras. Por<br />
ello, el tiempo de permanencia de la partícula en el interior de la columna también será<br />
irregular, ya que solamente se eluye cuando reside en la fase móvil; algunas partículas<br />
se desplazarán rápidamente, debido a que permanecen más tiempo en la fase móvil,<br />
mientras que otras lo harán con mayor lentitud, como consecuencia de su mayor<br />
permanencia accidental en la fase estacionaria.<br />
Debido a que los procesos individuales mencionados transcurren de forma<br />
aleatoria, se obtiene una dispersión de los tiempos de residencia en la columna (o de<br />
las velocidades) alrededor de un valor medio, originándose un pico Gaussiano como el<br />
representado en la figura <strong>10</strong>.9., y en el que casi un 96 % del área se encuentra dentro<br />
del intervalo comprendido entre más y menos dos veces la desviación estándar<br />
alrededor del máximo.<br />
Respuesta del detector<br />
1/2 h<br />
w 1/2 =2.35 σ<br />
w=4 σ<br />
Volumen<br />
Figura <strong>10</strong>.9. Pico cromatográfico ideal.
Claudio González Pérez 15<br />
Por otra parte, la anchura de los picos está directamente relacionada con el<br />
tiempo de residencia en la columna (inversamente proporcional a la velocidad de flujo<br />
de la fase móvil), ya que a mayor tiempo, mayor dispersión, de forma que las especies<br />
eluidas al final presentan picos más anchos que las eluidas al comienzo, como se<br />
muestra en la figura <strong>10</strong>.2.<br />
El ensanchamiento de los picos de los distintos componentes del analito actúa en<br />
detrimento de la separación, de forma que el objetivo en cromatografía es la<br />
obtención de picos estrechos y simétricos.<br />
El término "eficacia" de una columna, o mejor, de un sistema cromatográfico, se<br />
utiliza para describir el ensanchamiento de las bandas de los solutos en su movimiento<br />
a través de la columna, papel o placa. Los tratamientos que normalmente se utilizan<br />
están relacionados con cromatografía en columna, si bien, pueden extenderse<br />
fácilmente a la cromatografía plana.<br />
El tema de la eficacia de un sistema cromatográfico se aborda desde dos puntos<br />
de vista: la teoría de platos y la teoría cinética, que se consideran brevemente a<br />
continuación.<br />
Teoría de los platos en Cromatografía<br />
Se basa en considerar que la columna cromatográfica es como si estuviera<br />
constituida por numerosas, pero discretas capas estrechas, denominadas platos<br />
teóricos, en términos análogos a lo que ocurre en la teoría de la destilación<br />
fraccionada o de la extracción en contracorriente. Se considera que en cada plato se<br />
establece un equilibrio del componente entre la fase móvil y la fase estacionaria, y el<br />
desplazamiento del analito a través de la columna se trata como una transferencia de<br />
la fase móvil desde un plato al siguiente. La eficacia de la columna aumenta al hacerlo<br />
el número de estas transferencias, esto es, al aumentar el número de platos teóricos.<br />
El número de platos teóricos, N, se define como<br />
N = t R<br />
σ<br />
donde tR es el tiempo de retención del analito y σ la desviación estándar del pico<br />
Gaussiano.<br />
Como, w = 4 σ (figura <strong>10</strong>.9.),<br />
2<br />
N = 16 t R<br />
w<br />
2
Introducción a los Métodos Cromatográficos 16<br />
expresión que permite obtener N midiendo directamente en el cromatograma.<br />
En la práctica, es más frecuente medir la anchura de pico a la semi-altura, w1/2,<br />
en cuyo caso,<br />
N =<br />
t R<br />
w 1/22.35<br />
2<br />
= 5.54<br />
(En esta ecuación, como en la anterior, pueden utilizarse volúmenes de retención,<br />
en lugar de tiempos, en cuyo caso, el ancho se medirá también en unidades de<br />
volumen).<br />
Es evidente que el número de platos teóricos será directamente proporcional a la<br />
longitud de la columna, de forma que si esta se representa por L, la denominada altura<br />
equivalente a un plato teórico, (AEPT * ó H) será:<br />
H= L<br />
N<br />
Es necesario indicar que las columnas se comportan a menudo como si tuvieran<br />
distintos números de platos para distintos solutos en una mezcla.<br />
Los picos simétricos (Gaussianos) se originan cuando el coeficiente de<br />
distribución, K, (K=CS/CM), es constante e independiente de la cantidad de soluto. En<br />
realidad, casi siempre se obtienen picos asimétricos, ya que la relación CS/CM suele<br />
variar con la cantidad de soluto, obteniéndose isotermas (representación gráfica de<br />
CS frente a CM) no lineales. En la figura <strong>10</strong>.<strong>10</strong>. se muestran tres isotermas y las<br />
formas de los picos correspondientes.<br />
C S<br />
Respuesta<br />
.<br />
C M<br />
Respuesta<br />
t R<br />
w 1/2<br />
C S C S<br />
t<br />
t<br />
a b c<br />
C M<br />
a b <strong>10</strong> % h<br />
Figura <strong>10</strong>.<strong>10</strong>. Isotermas y forma de los picos cromatográficos.<br />
* En literatura inglesa, HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate).<br />
2<br />
Respuesta<br />
a<br />
C M<br />
b<br />
t
Claudio González Pérez 17<br />
La isoterma representada en la figura <strong>10</strong>.<strong>10</strong>.b. suele presentarse en sistemas de<br />
adsorción con centros activos donde la fase estacionaria retiene fuertemente al<br />
soluto. Cuando estos centros se saturan, K disminuye, al no existir sitios de retención<br />
fuerte disponibles, lo que se traduce en la presencia de una cola más o menos<br />
pronunciada.<br />
El comportamiento representado en la figura <strong>10</strong>.<strong>10</strong>.c. suele observarse en<br />
sistemas de reparto en los que las interacciones soluto-fase estacionaria son<br />
relativamente débiles comparadas con las interacciones soluto-soluto, o cuando se<br />
añade una cantidad de analito excesivamente grande (sobrecarga). En este caso, la<br />
fase estacionaria sobrecargada tiende a comportarse como una fase líquida<br />
constituida por el mismo soluto y, como "lo semejante disuelve a lo semejante", el<br />
valor de K aumenta con la concentración y el pico presenta un frente difuso y una cola<br />
muy poco pronunciada.<br />
El cálculo del número de platos cuando los picos son asimétricos es más<br />
complicado que cuando son simétricos. Para ello se han propuesto diversos métodos,<br />
siendo uno de los más empleados el que hace uso de la relación<br />
41.7<br />
N =<br />
tR w 0,1<br />
a<br />
b<br />
+1.25<br />
donde w0,1 es la anchura de pico a un décimo de la altura, y a/b (ver figura <strong>10</strong>.<strong>10</strong>.) el<br />
denominado factor de asimetría.<br />
La teoría de platos explica satisfactoriamente la forma de los picos<br />
cromatográficos, si bien, falla al intentar justificar el ensanchamiento de los mismos.<br />
Por otra parte, se basa en unas supuestas condiciones de equilibrio que, en realidad no<br />
se alcanzan, debido al movimiento continuo de la fase móvil.<br />
Teoría cinética<br />
La teoría cinética considera que el ensanchamiento de las bandas (o picos)<br />
cromatográficos se produce como consecuencia de que los distintos procesos de<br />
transferencia de masa durante el desplazamiento de una especie a lo largo de la<br />
columna ocurren a velocidad finita. Según esta teoría, la forma de los picos depende<br />
de los siguientes factores:<br />
* Difusión por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase móvil.<br />
* Difusión longitudinal del soluto a lo largo de la columna.<br />
2
Introducción a los Métodos Cromatográficos 18<br />
* Equilibrio del soluto entre las fases móvil y estacionaria no suficientemente<br />
rápido.<br />
Los tres factores mencionados normalmente se identifican con los parámetros A,<br />
B y C y su contribución al ensanchamiento de las bandas cromatográficas conducen a<br />
la ecuación de van Deemter:<br />
H = A + B<br />
u<br />
+ Cu<br />
donde u es la velocidad lineal media de la fase móvil (u=L/tM; L=longitud de la columna;<br />
tM=tiempo muerto).<br />
Este modelo es el clásico, y puede considerarse anticuado, si bien, se expondrá<br />
aquí por su sencillez y valor didáctico. Por otra parte, la teoría se desarrolló<br />
inicialmente para cromatografía de gases con columnas empacadas, pero puede<br />
extenderse sin demasiadas dificultades a otros tipos de cromatografía, incluyendo<br />
columnas tubulares abiertas e incluso a cromatografía plana.<br />
Término A (difusión por turbulencia)<br />
Este primer factor surge de la multitud de trayectorias de distintas longitudes<br />
que toma la fase móvil que fluye a través de la columna, que está empacada con<br />
partículas de diferentes tamaños y formas acomodadas de manera irregular. Según se<br />
observa en la figura <strong>10</strong>.11., donde se representan las trayectorias seguidas por dos<br />
moléculas durante la elución, la distancia recorrida entre las líneas a y b por la<br />
molécula 1 es mayor que la recorrida por la molécula 2, por lo que ésta llegará antes a<br />
la línea b.<br />
fase<br />
móvil<br />
a<br />
Figura <strong>10</strong>.11. Trayectorias de la fase móvil.<br />
El término A es independiente de la velocidad de la fase móvil, pero es función<br />
del tamaño de las partículas de la fase estacionaria, de forma que<br />
1<br />
2<br />
b
Claudio González Pérez 19<br />
A = λ dp<br />
donde λ es una constante que depende de las dimensiones, geometría y uniformidad<br />
del empaquetamiento de la columna, y dp es el diámetro medio de las partículas de la<br />
fase estacionaria. Según la expresión anterior, partículas pequeñas y uniformemente<br />
empaquetadas conducirán a columnas más eficaces, si bien, ello implicará el empleo de<br />
presiones altas. Por otra parte, el término A es cero para columnas tubulares abiertas,<br />
debido a que la fase estacionaria en tales columnas se deposita directamente sobre la<br />
pared de la columna.<br />
Término B (difusión longitudinal)<br />
El segundo factor que contribuye al ensanchamiento de las bandas es la difusión<br />
longitudinal del soluto en la fase móvil. Se produce debido a que la concentración de<br />
soluto es menor en los bordes de la banda que en el centro, por lo que una banda de<br />
soluto que se mueva a lo largo de la columna (de a hasta b en la figura <strong>10</strong>.12.) se<br />
ensanchará cuando las moléculas se difundan hacia las zonas de menos concentración,<br />
hacia adelante y hacia atrás de la banda.<br />
perfil de<br />
concentraciones<br />
fase<br />
móvil<br />
a b<br />
Figura <strong>10</strong>.12. Ensanchamiento de banda debido a la difusión longitudinal.<br />
La difusión longitudinal se dificulta por las partículas contenidas en la columna y<br />
el coeficiente de difusión en la fase móvil, DM, de forma que,<br />
B = 2 γ DM<br />
donde γ es un factor de impedimento que depende de las características del relleno de<br />
la columna (γ suele ser 0.7 para columnas con relleno y 1.0 para columnas tubulares<br />
abiertas)<br />
La contribución del término B al valor de H suele ser despreciable en<br />
cromatografía líquida, por los bajos valores de los coeficientes de difusión de los<br />
líquidos. Sin embargo, los coeficientes de difusión de los gases suelen ser <strong>10</strong> 5 veces<br />
mayores que en fase líquida. Por otra parte, como la difusión consume un cierto
Introducción a los Métodos Cromatográficos 20<br />
tiempo, el término de difusión en la ecuación de van Deemter depende de la velocidad<br />
de la fase móvil, disminuyendo a medida que aumenta ésta.<br />
Término C (resistencia a la transferencia de masa)<br />
El término C está relacionado con el hecho de que el equilibrio para la<br />
distribución del soluto entre las fases móvil y estacionaria se establece tan<br />
lentamente que una columna cromatográfica siempre opera en condiciones lejos del<br />
equilibrio. En realidad, el término C puede descomponerse en dos, CS y CM, según se<br />
considere la transferencia de masa en la fase estacionaria y en la fase móvil.<br />
La resistencia a la transferencia de masa en la fase estacionaria es despreciable<br />
para fases sólidas, ya que la transferencia del analito sobre la superficie de un<br />
adsorbente es muy rápida. Sin embargo, para fases estacionarias líquidas, el término<br />
depende del espesor de la película (df) y del coeficiente de difusión del analito (DS)<br />
2<br />
C S = d f<br />
En la práctica, las fases estacionarias líquidas poco viscosas presentan un<br />
espesor de película favorable.<br />
D S<br />
El término CM describe la resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil.<br />
En la figura <strong>10</strong>.13. se representa el ensanchamiento de banda originado por el hecho<br />
de que el equilibrio no se produce instantáneamente.<br />
Fase<br />
móvil<br />
Fase<br />
estacionaria<br />
Fase<br />
móvil<br />
Fase<br />
estacionaria<br />
Equilibrio<br />
No equilibrio<br />
Figura <strong>10</strong>.13. Ensanchamiento de banda originado por el no equilibrio en la transferencia de masa.<br />
Perfiles de concentración en las fases móvil y estacionaria.<br />
Si la fase móvil se mueve rápidamente, y el soluto no puede "salir" con rapidez de<br />
la fase estacionaria, entonces la zona del soluto en la fase móvil se adelanta respecto<br />
a la fase estacionaria.
Claudio González Pérez 21<br />
En cromatografía de gases, los efectos de la fase móvil, CM, son mucho menores<br />
que los correspondientes de la fase estacionaria, CS, mientras que en HPLC, CM y CS<br />
tienen valores comparables.<br />
En la figura <strong>10</strong>.14. se representa la variación de los tres términos de la ecuación<br />
de van Deemter en función de la velocidad de la fase móvil. Nótese que la contribución<br />
del término A es independiente de la velocidad, mientras que B/u aumenta cuando la<br />
velocidad disminuye y que Cu predomina a velocidades elevadas.<br />
H<br />
A + B<br />
u<br />
+ Cu<br />
u<br />
C u<br />
A<br />
B/u<br />
Figura <strong>10</strong>.14. Representación esquemática de la ecuación de van Deemter.<br />
Las curvas de la ecuación de van Deemter son similares para CG y para CL,<br />
presentando, en todos los casos un valor mínimo de H para una determinada velocidad<br />
de la fase móvil (condición óptima). A velocidades inferiores a la óptima la difusión<br />
longitudinal (B) origina un incremento en la altura de plato y un ensanchamiento de la<br />
banda, mientras que a velocidades superiores, la resistencia a la transferencia de<br />
masa (equilibrio lento) entre fases provoca que el soluto se extienda.<br />
A partir de la ecuación de van Deemter pueden deducirse las condiciones<br />
experimentales que minimicen el valor de H. Así, el valor de H disminuye con el tamaño<br />
de partícula (dp) y con un empaquetamiento uniforme (λ), así como operando con capas<br />
finas de fase estacionaria líquida (df 2 ) de baja viscosidad y a temperatura elevada<br />
(para incrementar DS).
Introducción a los Métodos Cromatográficos 22<br />
En la práctica, los datos para el gráfico de la ecuación de van Deemter suelen<br />
determinarse experimentalmente usando valores de tiempos de retención, tiempo<br />
muerto y anchuras de pico, con objeto de objeto de obtener N y por tanto, H a<br />
distintas velocidades de fases móviles. En cualquier caso, normalmente suele operarse<br />
a velocidades superiores a la óptima, con objeto de reducir el tiempo necesario para la<br />
separación.<br />
Factores extra-columna sobre el ensanchamiento de las bandas<br />
cromatográficas<br />
Además de los factores ya considerados que contribuyen al ensanchamiento de<br />
los picos y que se producen en la propia columna cromatográfica, es necesario<br />
mencionar algunos que ocurren en otras zonas del sistema distintas de las fase<br />
estacionaria. Entre ellos, pueden considerarse los siguientes:<br />
* Introducción de la muestra. Teóricamente suele considerarse que la muestra<br />
se introduce en el sistema cromatográfico de forma que ocupa una capa de espesor<br />
infinitamente pequeño. Sin embargo, en la realidad, la muestra ocupa un volumen<br />
finito, y a veces relativamente grande, tal como sucede en CG, donde un micro-litro de<br />
una sustancia líquida inyectada puede ocupar un volumen del orden de 0.5 mL cuando<br />
se vaporiza a 250 º, y ello representa varios centímetros de longitud de columna.<br />
Además, la lenta velocidad de vaporización contribuye también al ensanchamiento de<br />
la banda.<br />
En cromatografía líquida suelen emplearse bucles conteniendo un determinado<br />
volumen de muestra a temperatura ambiente. En estas ocasiones, la relativamente<br />
lenta eliminación de trazas de la muestra de las paredes de la válvula es el factor que<br />
puede contribuir al ensanchamiento de la zona.<br />
En cromatografía en papel y de capa fina la muestra deberá aplicarse en forma<br />
de una gota tan pequeña como sea posible.<br />
* Volúmenes muertos en el sistema de inyección, detector y tubos de<br />
conexión. Por volumen muerto se considera el existente entre el punto de inyección<br />
de la muestra y el punto de detección, excepto el volumen ocupado por la fase
Claudio González Pérez 23<br />
estacionaria, de forma que cualquier zona del sistema en la que estén presentes el<br />
soluto y la fase móvil, pero no expuesta a la fase estacionaria contribuye a la difusión<br />
del soluto y, en consecuencia, al ensanchamiento de las bandas cromatográficas. Es<br />
evidente, que deberán usarse tubos estrechos para las conexiones entre el sistema de<br />
inyección y la columna, y entre ésta y el detector.<br />
En CG el volumen muerto constituye un verdadero problema cuando se opera con<br />
columnas tubulares abiertas, mientras que en HPLC, la menor velocidad de difusión en<br />
la fase líquida disminuye la posibilidad de mezclas. Por otra parte, el empacado de la<br />
columna es susceptible de compresión, sobre todo cuando se trabaja con presiones<br />
altas y cuando la columna ha sido objeto de súbitos y rápidos cambios de presión.<br />
En cuanto a los detectores, su propio volumen podrá actuar como una verdadera<br />
cámara de mezcla. Deberán diseñarse de forma que su volumen sea pequeño y de que<br />
se mantenga un flujo laminar en su interior.<br />
En resumen, para minimizar el ensanchamiento de las bandas<br />
cromatográficas por factores extra-columna, deben minimizarse todos los<br />
espacios muertos y las dimensiones de los tubos; la muestra deberá aplicarse en<br />
una zona muy estrecha y deberá procurarse que penetre en la columna antes de<br />
mezclarse con el eluyente.<br />
RESOLUCION Y SU OPTIMIZACION<br />
La separación de solutos por un sistema cromatográfico puede expresarse por el<br />
factor de selectividad, α, ya mencionado,<br />
α = t R B —t M<br />
t R A —t M<br />
= k '<br />
B<br />
'<br />
kA = K B<br />
K A<br />
Sin embargo, α describe la separación entre los centros de las bandas<br />
cromatográficas, pero no tiene en cuenta las anchuras de pico, ya que puede ocurrir<br />
que el factor de selectividad entre dos picos de dos cromatogramas diferentes sean<br />
iguales, y, sin embargo, la resolución sea bastante diferente, como puede apreciarse<br />
en la figura <strong>10</strong>.15.
Introducción a los Métodos Cromatográficos 24<br />
A<br />
B<br />
Figura <strong>10</strong>.15. Selectividad y resolución.<br />
Por lo anteriormente mencionado, resulta más adecuado obtener la resolución a<br />
partir de la expresión (para picos Gaussianos)<br />
o. alternativamente,<br />
R= 2 t RB — t RA<br />
w A —w B<br />
2 tRB — tRA R=<br />
1.699 w 1/2 A +w1/2 B<br />
según se midan anchuras de pico, o anchuras a la semi-altura respectivamente (figura<br />
<strong>10</strong>.16.)<br />
Figura <strong>10</strong>.16. Medidas para calcular la resolución.
Claudio González Pérez 25<br />
Si R=1.5, los dos picos solo se superponen un 0.3 %, mientras que si R=1, la<br />
superposición es del orden del 2 %, que puede considerarse adecuada para muchos<br />
análisis.<br />
La ecuación anterior resulta adecuada para obtener el valor de R, pero no<br />
proporciona información acerca de las propiedades cinéticas o termodinámicas de la<br />
columna, lo cual es importante en orden a optimizar R. Por ello, una ecuación<br />
alternativa para la resolución es la siguiente:<br />
R= 1<br />
4<br />
N α —1<br />
α<br />
k '<br />
1+k '<br />
donde k' es el valor medio de k'A y k'B. Esta expresión indica que la resolución<br />
depende de la eficacia global de la columna (N), de la capacidad de la fase estacionaria<br />
para retener a los componentes (α) y de las características de retención de cada<br />
componente (k).<br />
Según la ecuación anterior, la resolución es una función de la raíz cuadrada de N,<br />
por lo que para aumentar significativamente el valor de R es necesario aumentar<br />
mucho el de N. Esto puede hacerse incrementando la longitud de la columna, si bien<br />
esto puede llevar a un tiempo demasiado grande. Por ello, normalmente suele ser<br />
preferible optimizar k y α.<br />
Una forma relativamente sencilla de mejorar la resolución es optimizando k', lo<br />
cual puede hacerse aumentando la temperatura (sobre todo en CG) o cambiando la<br />
composición de la fase móvil (en HPLC). En cuanto al factor de selectividad, éste<br />
puede modificarse variando la composición de las fases móvil y estacionaria, así como<br />
la temperatura o recurriendo a factores químicos especiales como puede ser<br />
incorporar a la fase estacionaria algún agente complejante particular. En cualquier<br />
caso, y en la práctica, en muchas ocasiones se utiliza el método SIMPLEX u otros más<br />
sofisticados para optimización de los métodos analíticos por cromatografía.<br />
Cuando una muestra está constituida por un gran número de componentes, puede<br />
ocurrir que se consigan las condiciones óptimas para la separación de algunos , pero<br />
ello vaya en detrimento de otros. En estos casos suele recurrirse a cambiar las<br />
condiciones mientras se realiza la separación, para lo cual, puede utilizarse la elución<br />
con gradiente (variación gradual de la composición de la fase móvil durante la elución)<br />
o la programación de temperatura (variación de la temperatura durante la elución).
Introducción a los Métodos Cromatográficos 26<br />
LA CROMATOGRAFIA Y EL ANALISIS QUIMICO<br />
Aunque la cromatografía es el método más importante para la separación de<br />
especies, también es posible su empleo en análisis cualitativo y, sobre todo, en análisis<br />
cuantitativo.<br />
En análisis cualitativo sus aplicaciones son bastante limitadas, sobre todo cuando<br />
se compara la información que proporciona un cromatograma con la que puede<br />
obtenerse con otras técnicas como espectroscopia infrarroja, de resonancia<br />
magnética o de masas. De todas formas, la cromatografía es una herramienta<br />
importante para reconocer la presencia o ausencia de componentes en mezclas que<br />
contengan un número limitado de posibles especies de las que se conozca su identidad.<br />
Por otra parte, en ocasiones interesa conocer si un determinado componente está<br />
ausente en una muestra. En estos casos, muchas veces la cromatografía proporciona<br />
una evidencia segura en este sentido, al no aparecer el pico, o la mancha,<br />
correspondiente al patrón en las mismas condiciones de operación.<br />
Análisis Cuantitativo<br />
En cromatografía plana (papel y capa fina) el área ocupada por las especies<br />
separadas es el parámetro utilizable en análisis cuantitativo.<br />
Las aplicaciones cuantitativas de la cromatografía en columna se basan en la<br />
comparación de la altura o del área del pico del analito con los correspondientes a los<br />
patrones. El empleo de las alturas de pico tiene la ventaja de su fácil medida * , pero<br />
presenta el inconveniente de que debe controlarse rigurosamente la temperatura de la<br />
columna, el caudal de eluyente y la velocidad de inyección de la muestra, ya que estas<br />
variables alteran las anchuras de pico, y éstas están inversamente relacionadas con las<br />
correspondientes alturas. Sin embargo, el área de pico es independiente de los<br />
efectos debidos a las variables anteriormente mencionadas, por lo que es el parámetro<br />
que normalmente se utiliza. Su medida se lleva a cabo con facilidad, ya que casi todos<br />
los cromatógrafos modernos están provistos de integradores electrónicos digitales * .<br />
Sin embargo, hay que tener en cuenta que la respuesta del detector varía de un<br />
compuesto a otro. Así, por ejemplo, el detector ultravioleta depende de la<br />
absortividad de los correspondientes analitos, y el de ionización de llama de la<br />
* La altura de un pico cromatográfico se obtiene uniendo las líneas base a cada lado del pico por una línea<br />
recta y midiendo la distancia perpendicular desde esta línea al pico.<br />
* En el caso de no disponer de estos equipos, un método sencillo para picos simétricos consiste en<br />
multiplicar la altura de pico por la anchura a la semi-altura. Otros métodos implican el uso de planímetros o<br />
incluso la determinación gravimétrica, consistente en recortar el pico y determinar su peso relativo respecto<br />
al peso de un área conocida del papel de registro.
Claudio González Pérez 27<br />
formación de iones. Por ello, a menudo se utilizan los denominados factores de<br />
respuesta, obtenidos de la relación entre el área de un componente y el área de otro<br />
componente elegido como referencia.<br />
Los métodos de cuantificación que principalmente se utilizan en cromatografía<br />
son las rectas de calibrado obtenidas a partir de series de patrones, el método del<br />
patrón interno, el de normalización de áreas y el de adición estándar.<br />
La obtención de rectas de calibrado se lleva a cabo preparando una serie de<br />
disoluciones patrón de composición parecida a la de la muestra, obteniendo los<br />
correspondientes cromatogramas y representando las áreas de pico (o las alturas) en<br />
función de la concentración. En este método, la fuente más importante de error es la<br />
incertidumbre en el volumen de la muestra, sobre todo cuando se utilizan microjeringas.<br />
Estos errores pueden reducirse considerablemente con el empleo de válvulas<br />
rotatorias, cuyo funcionamiento se ilustra esquemáticamente en la figura <strong>10</strong>.17.<br />
Muestra<br />
(salida)<br />
Muestra<br />
(entrada)<br />
Muestra<br />
(salida)<br />
Eluyente<br />
Muestra<br />
(entrada)<br />
Columna<br />
Columna<br />
a) b)<br />
Eluyente<br />
Figura <strong>10</strong>.17. Válvula rotatoria. a) Llenado. b) Inyección (introducción de la muestra en la columna).<br />
En el método del patrón interno se añade a los patrones y a la muestra una<br />
cantidad exactamente medida de un componente puro, ausente en la muestra,<br />
utilizándose como parámetro analítico la relación de áreas de pico del analito y del<br />
patrón interno. Para aplicar este método en cromatografía, es necesario que el pico<br />
del patrón interno esté bien aislado de los picos de los demás componentes de la<br />
muestra, pero deberá estar cerca del pico del analito.
Introducción a los Métodos Cromatográficos 28<br />
El método de normalización de las áreas consiste en eluir todos los componentes<br />
de la muestra, determinar las áreas de todos los picos eluidos y obtener las<br />
correspondientes áreas de pico corregidas (mediante los factores de respuesta del<br />
detector). La concentración del analito se obtiene de la relación entre su área y el<br />
área total de los picos de todos los componentes de la muestra. Para el componente x,<br />
%dex= A corregida dex<br />
A corregidas<br />
. <strong>10</strong>0<br />
Finalmente, por lo que se refiere al método de adición estándar, su uso en<br />
cromatografía está bastante limitado, debido, sobre todo, a la dificultad de inyectar<br />
de forma precisa cantidades exactamente conocidas de la muestra.