desarrollo y validación de metodología para minimizar la ...

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA NACIONAL
DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA MINIMIZAR LA
INCERTIDUMBRE DE LOS CALIBRADORES EN DETERMINACIONES POR
HPLC EN MUESTRAS BIOLÓGICAS
TESIS PRESENTADA POR JOSÉ LUIS DELMONTE PARA OPTAR POR LA MAESTRÍA EN
INGENIERÍA EN CALIDAD
DIRIGIDA POR LA BIOQ. CLAUDIA CRISTINA GARCÍA BONELLI
Y CO-DIRIGIDA POR EL ING. MAG. OMAR HERNÁN GARONIS
BUENOS AIRES, 2012.

DEDICATORIA
Esta Tesis está dedicada a mi familia completa por el apoyo incondicional, a Mariana
por ser mi compañera fiel todos estos años, darme la paz y tranquilidad que
necesitaba y a esa maravillosa hija Francisca, a quién le dedico especialmente este
trabajo y todo lo bueno que pueda hacer de acá en más y le agradezco su alegría la
cual me motiva a seguir adelante contra cualquier obstáculo; sin olvidarme de la
flamante incorporación familiar, no menos maravillosa y ahijada, Sofía.
I

AGRADECIMIENTOS
Quisiera expresar mi más profundo agradecimiento en primera medida, a mis
directores de tesis Claudia García Bonelli y Omar Hernán Garonis por su permanente
apoyo, ánimo y vigilancia. Sin dudas, después de todo este tiempo, puedo decir que
fue un placer que hayan compartido conmigo su tiempo y conocimiento y que fueron
unos grandes directores.
Agradezco al director de la carrera Maestría en Ingeniería en Calidad Ing. Jorge
Rubén López por haber depósito en mí su confianza desde el comienzo de este largo
camino.
Quisiera agradecer a las autoridades de la Facultad Regional Buenos Aires de la
Universidad Tecnológica Nacional, en especial al Vicedecano Ing. Raúl Sack por
haberme dado la posibilidad de cursar la carrera Maestría en Ingeniería en Calidad
mediante una beca y al Ing. Rómulo Tettamanzi por haberme aceptado como
miembro de la Cátedra Ingeniería en Caidad, compartiendo actividades con el Ing.
Gastón Zotta quienes han aportado gran valor a mi formación profesional; sin
olvidarme de todos los integrantes de UDB Fïsica, en especial, Graciela Spielmann,
Alberto Raiker y Roberto Ferrazzo, por su constante confianza.
Quería mencionar al Ing. Segundo Ismael Nuñez Pettinari y agradecerle su
desinteresada y muy valiosa colaboración y ojo crítico.
Un especial y enorme agradecimiento al Laboratorio de Medicina S.A,
fundamentalmente a la Dra. María Eugenia Almagro y al Dr. Emiliano Buitrago,
II

quienes abrieron sus puertas desinteresadamente, fueron generosos al momento de
brindar información siendo claves para el desarrollo de este trabajo.
Agradecer también a las autoridades de Instituto de Investigaciones Científicas y
Técnicas para la Defensa (CITEDEF) por permitirme formar parte de su comunidad
científica y brindarme el valioso tiempo que necesitaba.
Por último agradecer a la gente que ha compartido conmigo todo este tiempo,
familia, amigos, compañeros de estudio y trabajo, los buenos y mejores momentos
de esta gran etapa de mi vida, a todos GRACIAS!
III

RESUMEN
Los avances tecnológicos y la aparición de nuevas moléculas, así como también la
existencia de medicamentos similares y las características farmacocinéticas de ciertas
drogas o fármacos (vale decir su paso a través del organismo en función del tiempo
y de la dosis) han generado la necesidad del desarrollo de metodologías analíticas
con una estricta estandarización de los procesos en ellas involucrados y el estudio de
herramientas específicas para mejorar la calidad de las mediciones.
Las sustancias que se estudiarán tienen una ventana terapéutica estrecha, es decir,
la concentración plasmática eficaz está muy cerca de la tóxica. Es por este motivo
que el monitoreo terapéutico (medición de la concentración en plasma) es de suma
importancia para redefinir la dosis de administración de estos fármacos.
IV

ABSTRACT
The technological advances and the appearance of new molecules, thus like also
existence of similar medicines and the pharmacokinetic characteristics of certain
drugs or drugs (it is worth to say the passage of such through organism in function
of the time and the dose) have generated the necessity of the development of
analytical methodologies with a strict standardization of the processes in them
involved and the study of specific tools to improve the quality of the measurements.
The substances that we will study have a narrow therapeutic window, that is mean,
the effective plasmatic concentration is closely of the toxic one. It is for this reason
that the therapeutic monitoring (measurement of the plasma concentration) is of
extreme importance to redefine the dosage of these drugs.
V

DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
RESUMEN
ABSTRACT
ÍNDICE
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ........................................................................................................ 1
I.1 BREVE DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA Y SU IMPORTANCIA. .................................................................... 1
I.2 NATURALEZA DEL PROBLEMA ....................................................................................................... 2
I.3 MOTIVACIÓN PARA ABORDAR E IMPORTANCIA DE RESOLUCIÓN.............................................................. 4
I.4 CRITERIOS PARA EL ÉXITO .......................................................................................................... 5
I.5 METODOLOGÍA PARA EL CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE .................................................................... 6
CAPÍTULO II: ESTADO DE LA CUESTIÓN .......................................................................................10
II.1 ANTECEDENTES Y TRABAJOS RELACIONADOS ..................................................................................10
II.2 FUNDAMENTOS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS NECESARIOS PARA EL CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE. ..................12
II.2.1 Validación de un método analítico ................................................................................12
II.2.2 INCERTIDUMBRE ANALÍTICA.......................................................................................17
II.2.2.1 Concepto .............................................................................................................17
II.2.2.2 Estrategias para el cálculo de la incertidumbre analítica.........................................18
II.2.2.2.1 Aproximación ISO (“bottom-up”) ....................................................................19
II.2.2.2.2 Estrategia propuesta por el Analytical methods committee (“top-down”)...........25
II.2.2.2.3 Estrategia que utiliza la información de la validación del método. .....................26
II.2.2.3 Comparación y armonización de estrategias; ventajas y desventajas de cada una. ..27
II.3 DOCUMENTACIÓN UTILIZADA ............................................................................................28
II.3.1 Referencia bibliográfica ...............................................................................................28
II.3.2 Referencia normativa ..................................................................................................30
CAPÍTULO III: HIPÓTESIS DE TRABAJO ........................................................................................32
III.1 LA PROBLEMÁTICA DEL CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE DE UNA SOLUCIÓN PATRÓN....................................32
III.2 OBJETIVOS .........................................................................................................................34
III.3 PROPÓSITO.........................................................................................................................34
III.4 CONDICIONES DE TRABAJO ..............................................................................................34
III.4.1 Condiciones iniciales ..................................................................................................34
III.4.2 Normativa legal y regulatoria aplicable ........................................................................36
III.4.3 Restricciones de trabajo ............................................................................................37
CAPÍTULO IV: SOLUCIONES PROPUESTAS.....................................................................................39
IV.1 JUSTIFICACIÓN DE LA SOLUCIÓN, CRITERIOS Y CONCEPTOS ADOPTADOS...........................39
IV.2 METODOLOGÍA UTILIZADA...........................................................................................45
IV.2.1 Introducción .......................................................................................................45
IV.2.2 PRÁCTICA DE FENOBARBITAL ...............................................................................46
IV.2.2.A Introducción ..................................................................................................46
IV.2.2.B PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN PATRÓN DE FENOBARBITAL .............................47
IV.2.2.C Preparación de calibradores de fenobarbital .......................................................54
IV.2.3 PRÁCTICA DE CARBAMAZEPINA ............................................................................63
IV.2.3.A Introducción ..................................................................................................63
IV.2.3.B PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN PATRÓN DE CARBAMAZEPINA..........................64
IV.2.3.C Preparación de calibradores de carbamazepina ..................................................71
IV.2.4 PRÁCTICA DE DIFENILHIDANTOÍNA .................................................................80
IV.2.4.A INTRODUCCIÓN ...................................................................................................80
IV.2.4.B PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN PATRÓN DE DIFENILHIDANTOÍNA ......................81
IV.2.4.C Preparación de calibradores de difenilhidantoína ................................................88
IV. 3 CONCLUSIONES ..........................................................................................................97
VI

CAPÍTULO V: VALIDACIÓN DEL MÉTODO .....................................................................................98
V.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................98
V.2 RESUMEN ....................................................................................................................99
V.3 SUSTANCIAS DE REFERENCIA .....................................................................................100
V.3.1 Preparación de las soluciones patrones .......................................................................100
V.3.2 Estándares ................................................................................................................100
V.4 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS ............................................................................100
V.4.1 Cromatógrafo:........................................................................................................100
V.4.2 Reactivos ...............................................................................................................101
V.4.3 Fase móvil .............................................................................................................101
V.5 PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE PLASMAS SUPLEMENTADO ........................................101
V.6 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y ESTÁNDARES...................................................102
V.7 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN....................................................................................102
V.7.1 Selectividad y Especificidad .....................................................................................102
V.7.2 Rango Analítico ......................................................................................................102
V.7.3 Linealidad ..............................................................................................................103
V.7.4 Precisión intradía....................................................................................................103
V.7.5 Precisión interdía....................................................................................................105
V.7.6 Exactitud ...............................................................................................................106
V.7.7 Recuperación .........................................................................................................108
V.7.8 Límite de cuantificación ..........................................................................................109
V.7.9 Estabilidad .............................................................................................................110
V.7.9.a Estabilidad a largo plazo .................................................................................110
V.8 RESUMEN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN .........111
V.9 CONCLUSIÓN.............................................................................................................114
CAPÍTULO VI: CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE TOTAL DEL MÉTODO.........................................115
VI.1 INTRODUCCIÓN.........................................................................................................115
VI.2 OBJETIVO..................................................................................................................116
VI.3 DESARROLLO.............................................................................................................116
VI.3.1 Identificación del mesurando Y ...........................................................................116
VI.3.2 Identificación de las fuentes de incertidumbre......................................................117
VI.3.3 Estimación de la incertidumbre ......................................................................118
VI.3.3.1 Componente de precisión (SRw) .......................................................................119
VI.3.3.2 Componente relacionado con el error sistemático u(bias)..................................120
VI.3.4 Estimación de la incertidumbre combinada.........................................................122
VI.3.5 Estimación de la incertidumbre expandida U ...........................................................123
VI.3.5 Expresión del resultado..........................................................................................124
VI.3.6 DOCUMENTOS DE REFERENCIA ...............................................................................124
VI.4 CÁLCULOS Y RESULTADOS..........................................................................................125
VI.4.1 Cálculo de incertidumbre del método analítico..........................................................125
VI.4.2 Cálculo de incertidumbre del método analítico considerando los calibradores ............129
VI.4.3 Criterio de redondeo (aproximación) ...............................................................132
VI.5 CONCLUSIONES...........................................................................................................133
CAPÍTULO VII: DISCUSIÓN DE RESULTADOS ..............................................................................134
CAPÍTULO VIII: CONCLUSIONES Y FUTURAS LÍNEAS DE TRABAJO ...............................................137
REFERENCIAS BBLIOGRÁFICAS...................................................................................................141
ANEXOS
VII

ÍNDICE DE FIGURAS
Figura I.1 - Preparación de un estándar de calibración en su forma más genérica...............7
Figura I.2 - Fuentes de incertidumbre básicas para la preparación de una solución patrón....8
FIGURA I.3 - Contribuciones de las incertidumbres al estándar de calibración......................9
Figura II.1- De la exactitud a la incertidumbre. ............................................................... 15
Figura II.2 - Etapas del cálculo de incertidumbre según ISO............................................. 20
Figura II.3 - Diagrama Causa-efecto básico para identificación de fuentes de incertidumbre21
FIGURA IV.1 - Estructura molecular del fenobarbital........................................................ 46
FIGURA IV.2 - Preparación de un estándar de calibración ................................................ 47
FIGURA IV.3 - Diagrama Causa-efecto para identificación de fuentes de incertidumbre ...... 48
FIGURA IV.4 - Contribuciones de las incertidumbres al estándar de calibración.................. 53
FIGURA IV.5 - Preparación de calibradores nivel 4 fenobarbital. ....................................... 54
FIGURA IV.6 - Preparación de calibradores niveles 3, 2, 1 fenobarbital ............................. 57
FIGURA IV.7 - Estructura molecular de carbamazepina.................................................... 63
FIGURA IV.8 - Preparación de un estándar de calibración ................................................ 64
FIGURA IV.9 - Diagrama Causa-efecto para identificación de fuentes de incertidumbre ...... 65
FIGURA IV.10 - Contribuciones de las incertidumbres al estándar de calibración ................ 70
FIGURA IV.11 - Preparación de calibradores nivel 4 carbamazepina .................................. 71
FIGURA IV.12 - Preparación de calibradores niveles 3, 2, 1 carbamazepina ....................... 74
FIGURA IV.13 - Estructura molecular de difenilhidantoína ................................................ 80
FIGURA IV.14 - Preparación de un estándar de calibración............................................... 82
FIGURA IV.15 - Diagrama Causa-efecto para identificación de fuentes de incertidumbre .... 82
FIGURA IV.16 - Contribuciones de las incertidumbres al estándar de calibración ................ 87
FIGURA IV.17 - Preparación de calibradores nivel 4 difenilhidantoína................................ 88
FIGURA IV.18 - Preparación de calibradores niveles 3, 2, 1 difenilhidantoína ..................... 91
VIII

ÍNDICE DE TABLAS
TABLA I.1 - Tabla de valores e incertidumbres......................................................... 8
TABLA I.2 - Planilla de cálculo para la determinación de incertidumbres..................... 9
Tabla II.1 - Distribuciones estadísticas e incertidumbres asociadas. ..........................23
Tabla II.2 - t de Student para un 95% de confianza ................................................24
Tabla IV.1a - Tabla de valores e incertidumbres......................................................49
Tabla IV.1b - Tabla de valores e incertidumbres......................................................50
Tabla IV.1c - Tabla de valores e incertidumbres......................................................51
TABLA IV.2 - Tabla de valores e incertidumbres......................................................53
Tabla IV.3a - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 4......................................56
Tabla IV.3b - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 3......................................58
Tabla IV.3c - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 2 ......................................60
Tabla IV.3d - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 1......................................62
Tabla IV.4 - Incertidumbres a distintos niveles de concentración ..............................62
Tabla IV.5a - Tabla de valores e incertidumbres......................................................66
Tabla IV.5b - Tabla de valores e incertidumbres......................................................67
Tabla IV.5c -Tabla de valores e incertidumbres.......................................................68
TABLA IV.6 - Tabla de valores e incertidumbres......................................................70
Tabla IV.7a - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 4......................................73
Tabla IV.7b - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 3......................................75
Tabla IV.7c - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 2 ......................................77
Tabla IV.7d - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 1......................................79
Tabla IV.8 - Incertidumbres a distintos niveles de concentración ..............................79
Tabla IV.9a - Tabla de valores e incertidumbres......................................................83
Tabla IV.9b -Tabla de valores e incertidumbres.......................................................84
Tabla IV.9c - Tabla de valores e incertidumbres......................................................86
TABLA IV.10 - Tabla de valores e incertidumbres ....................................................87
Tabla IV.11a - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 4 ....................................90
Tabla IV.11b - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 3 ....................................92
Tabla IV.11c - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 2 ....................................94
Tabla IV.11d - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 1 ....................................96
Tabla IV.12 - Incertidumbres a distintos niveles de concentración ............................96
TABLA V.1 - Resultados de la precisión interdía de fenobarbital..............................105
TABLA V.2 - Resultados de la precisión interdía de carbamazepina .........................105
TABLA V.3 - Resultados de la precisión interdía de difenilhidantoína .......................105
TABLA V.4 - Resultados de la recuperación de fenobarbital ....................................108
TABLA V.5 - Resultados de la recuperación de carbamazepina ...............................108
TABLA V.6 - Resultados de la recuperación de difenilhidantoína .............................108
TABLA V.7 - Resultados del límite de cuantificación de fenobarbital ........................109
TABLA V.8 - Resultados del límite de cuantificación de carbamazepina....................109
IX

TABLA V.9 - Resultados del límite de cuantificación de difenilhidantoína..................110
TABLA V.10 - Parámetros de validación de fenobarbital .........................................111
TABLA V.11 - Parámetros de validación de carbamazepina.....................................112
TABLA V.12 - Parámetros de validación de difenilhidantoína...................................113
TABLA VI.1 - Estimación del Componente de bias con datos de programas de
evaluación externa de la calidad para fenobarbital. ...............................................125
TABLA VI.1 -Estimación del componente de bias con datos de programas de
evaluación externa de la calidad para carbamazepina ............................................126
TABLA VI.3 - Estimación del componente de bias con datos de programas de
evaluación externa de la calidad Para difenilhidantoína..........................................127
TABLA VI.4 - Cálculo de la incertidumbre expandida del Nivel 1..............................128
TABLA VI.5 - Cálculo de la incertidumbre expandida del Nivel 2..............................129
TABLA VI.6 - Cálculo de la incertidumbre expandida del Nivel 3..............................129
TABLA VI.7 - Tabla resumen de valores de incertidumbre de
FENOBARBITAL, CARBAMAZEPINA Y DIFENILHIDANTOÍNA para los tres niveles. ....129
TABLA VI.8 - Estimación de la incertidumbre incluyendo la preparación de los
calibradores para fenobarbital. ............................................................................130
TABLA VI.9 - Estimación de la incertidumbre incluyendo la preparación de los
calibradores para carbamazepina.........................................................................131
TABLA VI.10 - Estimación de la incertidumbre incluyendo la preparación de los
calibradores para difenilhidantoína.......................................................................131
TABLA VI.11 - Tabla resumen de valores de incertidumbre de
FENOBARBITAL, CARBAMAZEPINA Y DIFENILHIDANTOÍNA para los tres niveles,
incluyendo la incertidumbre de los calibradores.....................................................132
TABLA VI.12 - Tabla comparativa de los valores de incertidumbre absoluta
expandida calculados por ambos métodos. ...........................................................132
TABLAS VI.13 - Tablas comparativas de los valores de incertidumbre absoluta
expandida calculados por ambos métodos redondeados. .......................................133
X

ANEXOS
ANEXO N° 1.......................................................................................................145
ANEXO N° 2.......................................................................................................149
ANEXO N° 3.......................................................................................................153
ANEXO Nº 4.......................................................................................................157
XI

XII

CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN
I.1 Breve descripción del problema y su importancia.
La metrología resulta esencial en todos los ámbitos de la vida ya que brinda
importantes herramientas científicas y técnicas para asegurar la calidad de las
mediciones. La necesidad de contar con mediciones exactas en la actualidad es un
postulado fundamental para alcanzar un desarrollo integral de nuestra sociedad y
encaminarla hacia un estado de maduración tecnológica comparable con los más
altos estándares mundiales. Un gran número de decisiones se basan sobre
información obtenida de mediciones, en particular químicas, tanto cuantitativas como
cualitativas, generadas en pos de mantener bajo el control deseado todas las
actividades que de ellas dependan, como: monitoreo de procesos, desarrollo de
nuevos materiales en áreas tecnológicas emergentes, el desarrollo de nuevas
moléculas, acuerdos multilaterales, la protección del consumidor (reglamentación del
cumplimiento y la homologación de especificaciones de un producto), etc. El análisis
químico es transversal a una inmensa variedad de actividades con intereses sociales
y económicos, por lo que, obtener un resultado confiable resulta una tarea altamente
compleja debido a que deben mantenerse bajo riguroso control y seguimiento una
enorme cantidad de factores, como ser entre otros: la metodología empleada, el tipo
de muestra, su concentración, la infraestructura e instrumentos del laboratorio, el
sistema de la calidad, la capacitación del personal, el desarrollo de los proveedores,
una adecuada calibración de los instrumentos y que este resultado responda
adecuadamente a las necesidades de información requerida. Todos estos factores
provocan que nuestras mediciones tengan una variabilidad analítica producida
durante el proceso de medición y es debida a la existencia de imperfecciones en los
sistemas de medida; es la responsable de que cuando se mide repetidamente una
magnitud en una misma muestra, se produzca una distribución de resultados que
1

probablemente difieran de aquel considerado como verdadero. Esta variabilidad hace
que los resultados de las mediciones sean tan sólo una aproximación del valor del
mensurando; por esta razón los organismos internacionales de normalización
recomiendan que todo resultado de una medición debe ir acompañado de alguna
indicación cuantitativa que informe la calidad metrológica con la que se ha obtenido.
Este parámetro es la incertidumbre asociada a un resultado. El énfasis en la
incertidumbre (analítica) es prácticamente nuevo para la mayoría de laboratorios
clínicos y analíticos y requerirá información actualizada por parte de los fabricantes
de equipos y calibradores e investigaciones por parte de los profesionales del
laboratorio, fundamentalmente por los profesionales metrológicos, estadísticos y
responsables de llevar adelante el sistema de la calidad.
El desarrollo de nuevas moléculas y la existencia de medicamentos similares, han
generado estudios sobre las características farmacocinéticas de ciertas drogas o
fármacos (vale decir su paso a través del organismo en función del tiempo y de la
dosis). Esta situación ha generado la necesidad de desarrollar metodologías
analíticas con una estricta estandarización de los procesos en ellas involucrados y el
estudio de herramientas específicas para mejorar la calidad de las mediciones. El
método por excelencia para este tipo de análisis es el denominado HPLC.
I.2 Naturaleza del problema
La cromatografía líquida de alta presión (HPLC) es una técnica analítica que
permite separar sustancias y cuantificarlas dando un valor de concentración.
Fundamento: es un método donde se contactan dos fases, una estacionaria sólida
y otra líquida. Dependiendo de la afinidad de las sustancias a medir por cada una de
las fases, quedará retenida por más tempo la que tenga mayor afinidad por la fase
estacionaria (envasada en una columna); entonces al ser retenida por más tiempo,
saldrá más tarde en la corrida cromatográfica. El compuesto menos retenido en la
fase estacionaria, o sea con menor afinidad, saldrá más rápido. De esta manera
tendrán distintos tiempos de retención (Tr) y serán identificados selectivamente.
2

La cromatografía líquida clásica se lleva a cabo en una columna generalmente de
vidrio rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se
hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con objeto
de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija
se disminuye hasta tamaños de los micrómetros, lo que generó la necesidad de
utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil a través de la columna; de
esta manera nació la técnica de cromatografía líquida de alta presión. Son 4 los
parámetros involucrados en HPLC y son los que van a determinar la afinidad de cada
sustancia con la columna, así como el ensanchamiento de la señal que se transmite
en forma de cima gaussiana. Estos 4 parámetros conforman la teoría del plato
teórico dinámico (rate Theory):
Difusión en remolino
Difusión molecular
Resistencia a la transferencia de masa
Velocidad lineal de fluido.
La calibración de este tipo de técnica analítica se realiza preparando soluciones
patrones y estándares de calibración (llamados también calibradores, vale decir
solución de referencia a utilizar, con la cual se contrasta la sustancia a determinar y
cuantificar) de diferentes concentraciones. Se grafica una curva de señal en función
de concentración, en la cual se interpola la señal de la muestra problema
determinándose así un valor de concentración. La mayoría de los métodos de análisis
por HPLC, requieren la preparación de los calibradores en el laboratorio ya que no
existen patrones comerciales para la totalidad de las determinaciones por lo cual,
estos calibradores tienen una incertidumbre asociada. Es fundamental disminuir lo
máximo posible la incertidumbre de los calibradores para que no se propague en la
incertidumbre final del método. No es conveniente comenzar una medición
comparando el elemento o sustancia a determinar y cuantificar con un patrón de
referencia que tiene una incertidumbre asociada considerable. Se propone minimizar
este valor mejorando la incertidumbre de los equipos e instrumentos de laboratorio
utilizando las técnicas descriptas más adelante.
3

La adecuada preparación de soluciones patrones permitirá demostrar la
trazabilidad de nuestras determinaciones analíticas. La trazabilidad es la
propiedad del resultado de una medición de ser comparada con patrones apropiados,
nacionales o internacionales, mediante una cadena ininterrumpida de
comparaciones, todas con incertidumbres conocidas. La importancia de este
parámetro es clave porque asegura la comparabilidad de resultados y da la
posibilidad de confiar en ellos, ya que se comparan con patrones válidos; o sea los
resultados de medición son trazables a patrones nacionales o internacionales. La
calibración de equipos de medición y control y la trazabilidad de las mediciones a
patrones nacionales son requerimientos importantes para la operación de
laboratorios de calibración y ensayo y constituyen prerrequisitos para su acreditación
según lo establece la norma IRAM 301:2005 equivalente a ISO/IEC
17025:2005 1 .
I.3 Motivación para abordar e importancia de resolución
El resultado de un análisis clínico es generalmente utilizado para tomar una
decisión. Una toma errónea de la misma, representaría un peligro para la salud
pública. Si el laboratorio no estima la incertidumbre, o lo hace de forma
improcedente no puede saber si el resultado es válido para cumplir con el requisito
del cliente o paciente. Los resultados de estos análisis suelen ser altamente
variables, y es fundamental cuantificar esta variabilidad. La misión principal de los
laboratorios analíticos es proporcionar información que contribuya a la prevención,
detección precoz, diagnóstico, pronóstico y seguimiento de enfermedades. Estos
resultados provienen de la medición de magnitudes biológicas con interés clínico,
para lo cual es necesario contar con la información precisa de los parámetros claves
del procedimiento de medición que permitan la correcta interpretación de los
resultados, como pueden ser los valores de referencia, la descripción del
procedimiento de medición utilizado o una información sobre la incertidumbre
asociada a los resultados.
1 Requisitos Generales para la Competencia de Laboratorios de ensayo y Calibración, ISO(2005).
4

La acreditación (reconocimiento formal de la competencia de una organización
para desarrollar funciones o prestaciones específicas) tiene cada vez más importancia
como instrumento de gestión y como medio para crear confianza en los resultados.
Para recibir la tan ansiada acreditación otorgada por el organismo nacional de
acreditación competente, el laboratorio debe dar evidencia objetiva de tener
competencia técnica (demostrar dominio de las tareas profesionales, los
conocimientos y destrezas necesarios); para lograrlo, deben fijar criterios sólidos,
uniformes y consistentes para asegurar trazabilidad y estimación de
incertidumbre, con el objeto de dar evidencia ante un organismo de acreditación,
que son competentes, operan un sistema de calidad efectivo y son capaces de
generar resultados técnicamente válidos.
Para aplicar un método analítico, debe ser validado, (se debe tomar el trabajo
experimental encaminado a obtener pruebas documentadas de que un método
analítico proporciona consistentemente la información requerida al uso al que se lo
destina); o sea debe determinarse su precisión, exactitud o sesgo, linealidad,
intervalo de linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, sensibilidad,
selectividad, robustez e incertidumbre. Para adoptar métodos de cálculo para esta
última, se trata de llegar a una armonización (consenso), ya que hay diversidad de
criterios en la estimación de incertidumbre en métodos analíticos, que cada
laboratorio adoptará oportunamente dependiendo de su objetivo de análisis, las
características del analito y la información que se posea.
I.4 Criterios para el éxito
Se propone minimizar el valor de incertidumbre del patrón de referencia mejorando
la incertidumbre de los equipos e instrumentos de laboratorio (balanzas, pipetas,
material volumétrico (material de laboratorio utilizado para medir volúmenes),
drogas, pureza de las drogas, etc.) y trabajando en el laboratorio con un sistema de
gestión de la calidad de los procedimientos analíticos. Una manera de disminuir la
incertidumbre de las pipetas es por medio de un control exhaustivo de la precisión
con control gravimétrico. Este control se realiza pesando un volumen determinado
5

con una pipeta automática n veces (de 5 a 10) calculando el promedio y desvío
estándar, y por ende el coeficiente de variación porcentual. El control de la exactitud
se realiza con un service y calibración externos por un laboratorio adecuado. De la
misma manera se procederá con la balanza analítica, una verificación diaria de la
precisión y exactitud es conveniente, con el control de la masa de una pesa con
masa conocida, además de calibración externa por un service periódicamente. Con
respecto del material volumétrico, existe en el mercado material calibrado por unidad
o por lote, con una incertidumbre determinada. En cuanto a las drogas que se
utilizarán como material de referencia, es condición la adquisición de drogas de alta
pureza, marca reconocida en el mercado, con una incertidumbre asociada ya que con
ellas se va a contrastar los datos de las muestras.
I.5 Metodología para el cálculo de la incertidumbre
Se basará sobre la metodología presentada en “Quantifying Uncertainty in Analytical
Measurement” Apéndice A –Preparación de un Standard de calibración; EURACHEM /
CITAC Guide CG 4; Segunda edición: 2000, adaptando el método a los
requerimientos. Más adelante se fundamentarán las razones de la elección de este
método en función de los objetivos e información disponible.
El método propuesto para el cálculo de incertidumbre de un estándar de calibración
consta de los siguientes pasos genéricos y básicos a ser optimizados, los cuales
pueden modificarse o adecuarse para ser aplicado en casos particulares; a saber:
Elaboración de la especificación:
a) Datos de entrada: el primer paso es definir de manera clara lo que va a ser
medido. Este paso inicial también incluye la preparación del estándar de calibración y
la relación matemática entre el mensurando y los parámetros de los que depende.
b) Procedimiento: la información detallada de cómo se preparan los estándares de
calibración está dada en el procedimiento operativo estándar (POE) de cada
organización, y consiste básicamente de los siguientes pasos (Figura I.1):
6

Figura I.1 -Preparación de un estándar de calibración en su forma más genérica
c) Definición del mesurando: se define la concentración de la solución estándar de
calibración, que depende del peso del estándar de alta pureza, de su pureza y del
volumen del líquido en el que está disuelto, según la expresión:
Cc = m ⋅ p / v
Cc: concentración del estándar de calibración [generalmente en mg/ml]
m: masa del estándar de alta pureza [generalmente en mg]
p: pureza estándar
V: volumen del líquido del estándar de calibración [generalmente en ml]
En la práctica se prepararán varios niveles de concentración de los estándares para
confeccionar una curva de calibración, cumpliendo con la función y = ax + b
(regresión lineal).
Identificación de las fuentes de incertidumbre:
Se detallan las distintas fuentes de incertidumbre en un diagrama de Ishikawa
(espina de pescado) para cada parámetro que afecta el valor del mensurando (figura
I.2)
7

Figura I.2 -Fuentes de incertidumbre básicas para la preparación de una solución patrón
Análisis de las fuentes de incertidumbre:
a) Cuantificar las fuentes de incertidumbre: se estima el valor de cada una de las
fuentes de incertidumbre utilizando resultados experimentales previos o derivados de
algún análisis teórico.
b) Combinar las incertidumbres: se propagan las distintas contribuciones de las
fuentes de incertidumbre de forma cuadrática.
c) Expandir las incertidumbres: la incertidumbre expandida se calcula multiplicando
la incertidumbre combinada por un factor de cobertura dependiente de las
características de la distribución de la magnitud analizada.
Registro de los resultados
Los resultados obtenidos se asentarán como mínimo, en las siguientes tablas:
TABLA I.1 – Tabla de valores e incertidumbres.
Descripción Valor Incertidumbre
estándar
p Pureza del estándar
m Masa del estándar
V Volumen
Cc
Concentración del
estándar de calibración
8
Incertidumbre
estándar relativa

TABLA I.2 – Planilla de cálculo para la determinación de incertidumbres
A B C D E
1 P m V
2 Valor
3 Incertidumbre
4
5 P
6 m
7 V
8
9 Cc
10 u(y,xi)
11 u(y)²,u(y,xi)²
12
13 u(Cc)
Nota (Procedimiento para utilización de tabla I.2):
Los valores de los parámetros se introducen en la segunda fila de C2 a E2. Sus incertidumbres se
encuentran en la siguiente fila (C3-E3). Se copian los valores de C2-E2 en la segunda columna de B5
a B7. El resultado (Cc) utilizando estos valores, figura en B9. En C5 se muestra el valor de P mas su
incertidumbre. El resultado del cálculo utilizando los valores C5-C7 se registra en C9. En las columnas
D y E se debe seguir el mismo procedimiento. Los valores que aparecen en la fila 10 (C10-E10) son
las diferencias de la fila (C9-E9) menos el valor dado a B9. En la fila 11 (C11-E11), los valores de la
fila 10 (C10-E10) se elevan al cuadrado y se suman para dar el valor que figura en B11. Finalmente
B13 da la incertidumbre estándar combinada, que es la raíz cuadrada de B11.
FIGURA I.3 – Contribuciones de las incertidumbres al estándar de calibración
V
m
p
Otros
Cc
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
u(y,xi) ( mg.ml -¹ )
9

CAPÍTULO II: ESTADO DE LA CUESTIÓN
II.1 Antecedentes y trabajos relacionados
Se expresan en este punto todos los antecedentes que son conocidos, trabajos
previos que han servido de fundamento para la investigación, trabajos equivalentes
en distintas materias de los que se extrajeron analogías, estudios de impacto en
distintas áreas y estudios de evolución esperada para esta actividad.
a) EURACHEM / CITAC Guide CG 4
Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement.
Segunda edición (2000)
Apéndice A – Preparación de un Standard de calibración.
EURACHEM es una red de organizaciones europeas que tiene como objetivo
establecer un sistema internacional para la trazabilidad de las mediciones químicas y
la promoción de buenas prácticas de la calidad; proporciona un espacio para la
discusión de problemas comunes, para el desarrollo de un enfoque técnico y político
de ambas cuestiones y una visión en el mundo de la química analítica y la calidad en
Europa muy respetada por la comunidad científica.
“Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement” es la guía de consulta de
cabecera de los laboratorios analíticos. Presenta ejemplos de preparación de
soluciones patrones, detallándose la preparación de una solución a partir de
elementos de alta pureza de forma precisa, desde la pesada, disolución y dilución,
hasta obtener la concentración deseada. Muestra como identificar la fuentes de
incertidumbre del material volumétrico, pureza de las drogas y pesada, además de
cómo se combinan y expanden. En la actualidad, casi la totalidad de tesis y trabajos
de investigación referidos al cálculo de incertidumbre en determinaciones analíticas
10

por HPLC, citan y reconocen que dicho manual fue fuente principal de información e
motivación.
Ahora hablando específicamente del cálculo de incertidumbre para la preparación de
soluciones patrones, luego de una exhaustiva búsqueda y recopilación de
información, el autor está en condiciones de afirmar que es bibliografía única con
entidad científica comprobable en este tema de investigación.
b) UNIVERSITAT ROVIRA VIRGILI – Facultad de Química (Tarragona)
Incertidumbre en métodos analíticos de rutina
Tesis doctoral (2002)
Alicia Maroto Sánchez
Capítulo 2.4.2.1 -Incertidumbre del valor de referencia.
En esta tesis doctoral se proponen diversas metodologías para calcular la
incertidumbre en métodos analíticos que se utilizan de forma rutinaria en el
laboratorio. Estas metodologías están basadas sobre el cálculo de la incertidumbre
globalmente (es decir, agrupando términos de incertidumbre siempre que sea
posible) y la utilización de la información obtenida durante el proceso de validación
del método especialmente mediante la verificación de la trazabilidad (a diferencia del
caso presentado anteriormente en “Quantifying Uncertainty in Analytical
Measurement”). La ventaja de estas metodologías es que pueden aplicarse a todos
los métodos de rutina y requieren poco trabajo adicional, ya que los métodos
analíticos siempre deben validarse antes de aplicarlos al análisis de muestras de
rutina.
c) FUNDACIÓN CENTRO NACIONAL DE MEDIO AMBIENTE- CENMA
Universidad de Chile
Materiales de referencia y comparaciones interlaboratorios.
Herramientas para el control de calidad en laboratorios de ensayos.
Santiago de Chile (2006).
11

Es uno de los productos del proyecto desarrollado por el Centro Nacional del Medio
Ambiente (CENMA) de la Universidad de Chile, cuyo objetivo fue desarrollar e
implementar un laboratorio de referencia para mediciones químicas medio
ambientales en CENMA. Tiene por objeto diseminar el conocimiento científico y
técnico en el campo de la metrología en investigadores, técnicos, profesionales y
publico en general. Es presentado para contribuir y promover un rápido desarrollo de
la metrología en Latinoamérica. Se reconocemos esta bibliografía como de gran
utilidad en cuanto a una concepción global y conceptual del tema, con objetivos e
ideas muy claras para comprender su importancia (no en cuanto a detalles y
procedimientos técnicos).
La bibliografía presentada abarca los conceptos más novedosos, actualizados,
originales e innovadores en relación al tema presentado. Luego de un detallado
análisis podemos proclamar con toda seguridad, la no existencia de trabajos de
investigación que sirvan como antecedente para afirmar (a priori), que la
incertidumbre en el proceso de preparación de soluciones patrones para
determinaciones analíticas por HPLC en muestras biológicas en laboratorios de
análisis clínicos, es despreciable frente al dato total de incertidumbre. Por esta razón
se confía en la originalidad del tema, además de en su alta aplicabilidad y utilidad
como poderosa herramienta metrológica en mediciones químicas, lo cual sirve como
fuente de motivación para la confección de este trabajo de tesis, que en un futuro
cercano, funcione como guía técnica para todo laboratorio clínico que efectúe
determinaciones por HPLC.
II.2 Fundamentos teóricos y prácticos necesarios para el cálculo de la incertidumbre.
II.2.1 Validación de un método analítico
Se comienza definiendo las entidades analíticas necesarias para la elaboración de un
método analítico y su correspondiente protocolo. Un proceso analítico es un
conjunto de operaciones analíticas que se realizan entre la muestra y el resultado; en
cambio una técnica analítica es un principio científico útil o necesario para obtener
12

información sobre la composición de una muestra. Entonces se define un método
analítico como la adaptación de una técnica analítica, para llevar a cabo la
determinación y/o cuantificación de un analito; pueden existir varios métodos
analíticos distintos para determinar el mismo analito mediante la misma técnica. En
tanto un procedimiento analítico es un conjunto de instrucciones generales
escritas necesarias para utilizar un método, dando lugar al último concepto y más
abarcativo como es el protocolo analítico, el cual está compuesto por las
directrices específicas escritas que recogen los pasos necesarios para desarrollar el
método analítico; contiene detalles específicos que no detalla el procedimiento.
Los laboratorios analíticos deben demostrar que sus métodos analíticos son
confiables, proporcionan resultados confiables y son aptos para la finalidad o
propósito perseguido. La validación de estas metodologías (junto con las condiciones
de aseguramiento de calidad de los laboratorios) permite afirmar que el laboratorio
brinda la tan buscada confiabilidad en los resultados. Validar un método consiste en
verificar y documentar su validez, o sea demostrar la adecuación a los requisitos
establecidos previamente para satisfacer objetivos específicos.
Se conoce como validación a la confirmación mediante el suministro de evidencia
objetiva que se han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación
específica prevista de un método analítico. Un método analítico está validado,
cuando resulta adecuado para un cierto propósito. Los criterios de validación se
deben relacionar con las especificaciones a examinar, por lo que el método deberá
poseer la característica básica necesaria para discriminar de forma segura la
información analítica de interés.
El laboratorio debe validar todo método analítico utilizado que: no esté normalizado o
sea de diseño y desarrollo propio, o bien esté normalizado pero se utiliza fuera del
alcance previsto, e incluso contenga ampliaciones o modificaciones de métodos
normalizados.
Para validar un método analítico se suele usar una o varias de las siguientes
técnicas: la calibración del método utilizando patrones o materiales de referencia
certificados, ejercicios comparativos con resultados obtenidos por otros métodos,
realización de ejercicios interlaboratorios, evaluación sistemática de los factores
13

individuales que influyen en el resultado, evaluación de la incertidumbre de los
resultados basada en principios teóricos y en la experiencia práctica previa.
Los parámetros a verificar para la validación analítica son:
(a) Exactitud
(b) Sesgo
(c) Precisión
(d) Linealidad
(e) Intervalo de linealidad
(f) Límite de detección
(g) Límite de cuantificación
(h) Sensibilidad
(i) Selectividad
(j) Robustez
(k) Incertidumbre
(a) Exactitud
Es el grado de coincidencia entre el valor obtenido de la magnitud medida y el valor
real de la misma; es representativo de la medida del error sistemático. La exactitud
está determinada por la precisión más la veracidad (expresión cualitativa del sesgo),
según Figura 1.
(b) Sesgo
El sesgo es la expresión cuantitativa de la veracidad. La vercidad es la proximidad
entre el valor promedio obtenido de una serie de resultados de ensayo y un valor de
referencia aceptado. El sesgo o Bias es la diferencia entre la esperanza matemática
de los resultados de ensayo y un valor de referencia aceptado; es el error sistemático
total en contraste con el error aleatorio.
(c) Precisión
Es el nivel de concordancia mutua entre los datos que se han obtenido de una misma
forma; representa el grado de aproximación entre los resultados. Está dado por los
siguientes factores: repetibilidad y reproducibilidad.
14

Repetibilidad: es la variación de los resultados dentro del curso del mismo análisis;
es un indicador de proximidad cuando se efectúan mediciones repetidas del mismo
mesurando, en las mismas condiciones; es decir cuando los resultados son obtenidos
con el mismo método, sobre ítems de ensayo idénticos, en el mismo laboratorio, por
el mismo operador usando el mismo equipo, en un intervalo corto de tiempo.
Reproducibilidad: está representada por la proximidad entre los resultados de
mediciones de un mismo mesurando, realizadas bajo distintas condiciones de
medición; es decir resultados obtenidos con el mismo método, sobre ítems de
ensayo idénticos, en diferentes laboratorios o en el mismo laboratorio, con diferentes
operadores usando distintos equipos.
La precisión está dada por la repetibilidad + la reproducibilidad, según Figura II.1.
Figura II.1- De la exactitud a la incertidumbre. 2
2 Evaluación de la incertidumbre de la medición Lic. Alba N. Zaretzky (OAA)
15

(d) Linealidad
Es la capacidad del método para establecer una relación matemática entre el
resultado y la concentración del analito; se expresa de acuerdo con la variación de la
pendiente de la recta de regresión, según: y = mx + b
(e) Intervalo de linealidad
Está determinado por los niveles de concentración límites en los que el método
puede utilizarse con precisión, exactitud y linealidad; se expresa en unidades de
concentración.
(f) Límite de detección
Está dado por la mínima concentración o cantidad de analito que puede ser
detectada, pero no necesariamente cuantificada, según la evaluación adecuada:
evaluación visual (métodos no instrumentales), evaluación basada sobre la relación
señal/ruido (3:1) y evaluación basada sobre la desviación estándar instrumental y la
pendiente (m) de la curva LD = 3δ / m
(g) Límite de cuantificación
Es la mínima concentración o cantidad de analito que puede ser determinado con
aceptable exactitud y precisión, según la evaluación adecuada: evaluación visual
(métodos no instrumentales), evaluación basada en la relación señal/ ruido (10:1) y
evaluación basada en la desviación estándar instrumental y la pendiente (m) de la
curva LDQ = 10δ / m
(h) Sensibilidad
Es la capacidad del instrumento para discriminar pequeñas diferencias en la
concentración del analito. La sensibilidad está limitada por dos factores: la pendiente
de la curva de calibrado y la precisión. Existen dos tipos
de sensibilidad: de calibración s = m ⋅ c + S Blanco m s s Blanco c / ) = ( − y analítica
γ =
m / δSeñales
16

(i) Selectividad
Es la capacidad del método analítico para medir con exactitud y precisión el analito
en presencia de otros componentes. Se mide comparando los resultados de un
análisis de la muestra con componentes extraños, con los resultados de la misma
muestra sin dichos componentes.
(j) Robustez
Es la capacidad del método para permanecer inalterable a pequeñas modificaciones
ambientales o de procedimiento. Se mide mediante la reproducibilidad. Los factores
contemplados son: estabilidad de las disoluciones, tiempos de extracción y
específicamente en HPLC: variaciones de pH de la fase móvil, variaciones de
composición de la fase móvil, diferentes columnas, temperatura y caudal, por
ejemplo.
(k) Incertidumbre
Ver punto II.2.2.
II.2.2 INCERTIDUMBRE ANALÍTICA
II.2.2.1 Concepto
La incertidumbre es un parámetro asociado al resultado de la medición que
caracteriza la dispersión de los valores que pueden ser razonablemente
atribuidos al mesurando. Cuando se informa el resultado de medición de una
magnitud, es obligatorio proporcionar alguna indicación cuantitativa de la calidad del
resultado, de manera tal que el usuario pueda evaluar su confiabilidad. Sin esa
indicación, los resultados de las mediciones no podrían ser comparados, ni entre sí,
ni con valores de referencia dados en una especificación o norma. La incertidumbre
del resultado de una medición refleja la falta de conocimiento exacto del valor
del mesurando. El resultado de una medición, luego de ser corregido por la
presencia de efectos sistemáticos reconocidos, es todavía una estimación del valor
17

del mesurando, por la incertidumbre proveniente de los efectos aleatorios y de la
corrección imperfecta de los efectos sistemáticos, siendo algunas posibles fuentes de
incertidumbre las siguientes (más adelante se detallarán los procedimientos
adecuados para identificar y cuantificar cada una de las fuentes que surgen del
proceso de medición): definición incompleta del mesurando, realización imperfecta
de la definición del mesurando, muestreo no representativo, inadecuado
conocimiento de los efectos de las condiciones ambientales sobre la medición o
medición imperfecta de las condiciones ambientales, desvíos personales en la lectura
de instrumentos analógicos, resolución finita del instrumental o del umbral de
discriminación, valores inexactos de los patrones de medición y materiales de
referencia, valores inexactos de constantes y otros parámetros obtenidos de fuentes
externas y empleados en los cálculos, aproximaciones y suposiciones incorporadas
en el método de medición y procedimiento, variaciones en las observaciones
repetidas del mesurando bajo condiciones aparentemente idénticas, entre otras.
II.2.2.2 Estrategias para el cálculo de la incertidumbre analítica.
Para adoptar la estrategia adecuada en el cálculo de la incertidumbre de un método
analítico, se trata de llegar a una armonización (consenso), ya que hay diversidad
de criterios en la estimación de incertidumbre analítica. No hay una estrategia
absoluta e ideal para la totalidad de determinaciones; cada uno de los métodos
existentes será el más acertado dependiendo del objetivo del análisis y de la
información recopilada; pero siempre se debe demostrar que el criterio elegido es
estadísticamente válido y relevante para la disciplina. En este apartado se estudiará
cada uno de los criterios, ventajas y desventajas de cada uno y en qué caso es
conveniente aplicarlos en función de los objetivos y características del laboratorio
analítico.
La armonización antes mencionada puede observarse tanto en el marco mundial
como en diferentes asociaciones regionales y supranacionales y tiene el objetivo de:
eliminar barreras técnicas, asegurar y facilitar su libre intercambio de los mismos,
garantizar su esencial seguridad, contribuir a la comparabilidad de productos y
establecer exigencias mínimas acerca de la calidad de los productos, entre otros.
18

En los últimos años se tomaron en cuenta diferentes enfoques del cálculo de
incertidumbre analítica. Una es la presentada en la Guía ISO GUM:1995 3 (también
conocida como aproximación “bottom-up”) [Eurachem2000], que está basada
sobre identificar, cuantificar, combinar y expandir todas las fuentes de incertidumbre
del procedimiento analítico. Además existen dos aproximaciones alternativas que
calculan la incertidumbre de forma más global, agrupando fuentes de incertidumbre
siempre que sea posible. La primera de estas aproximaciones es la propuesta por el
Analytical Methods Committee (AMC) [AMC1995] y está basada sobre la utilización
de la información generada en los ejercicios interlaboratorio de tipo colaborativo. La
segunda se basa en la utilización de la información generada en la verificación de la
trazabilidad del método analítico [Maroto 2002].
II.2.2.2.1 Aproximación ISO (“bottom-up”)
Se conoce de esta manera a la estrategia para el cálculo de la incertidumbre
propuesta por la ISO, presentada en la Guía ISO GUM:1995, la cual se aplicó
inicialmente a las medidas físicas, y con el tiempo, viendo la flexibilidad del método,
fue adaptada por EURACHEM para las mediciones químicas. En la actualidad es la
más utilizada, y por las razones que se detallan más adelante, será la estrategia de
cálculo de incertidumbre que se adopta, ya que será más sencillo trabajar sobre los
distintos factores involucrados para minimizarla, en comparación con los demás
métodos. Está conformado por los siguientes pasos según la figura II.2
3 Guide to the expression of Uncertainty in Measurement (GUM), (ISO), (1995).
19

Figura II.2– Etapas del cálculo de incertidumbre según ISO.
En la etapa de planificación se deben definir claramente las variables en su fase
óptimas a tener en cuenta para que nuestra medición tenga un rango de
incertidumbre adecuado a efectos de cumplir los objetivos, definiendo factores como
ser: tipo de materiales, instrumentos de medición, procedimientos analíticos del
sistema de calidad, nivel de capacitación, condiciones ambientales del laboratorio,
elección y método de seguimiento de proveedores, herramientas estadísticas,
criterios de aceptación, criterios de evaluación etc. Luego del cálculo de la
incertidumbre (5 pasos), se verificará mediante herramientas estadísticas definidas
en la etapa de planificación, si la incertidumbre obtenida es válida a efectos de
nuestra medición. De así ser, se documentará detalladamente cada uno de los
movimientos realizados e instrumentos y materiales utilizados en los procedimientos
analíticos del sistema de la calidad, estandarizando el método de cálculo de
incertidumbre óptimo que satisfizo nuestra necesidad analítica.
20

Definición del mensurando (Paso 1)
Citar de manera clara y lo más detallada posible qué se está midiendo y, una
expresión cuantitativa que relacione el valor del mesurando con los parámetros de
los que depende.
Identificación de las fuentes de incertidumbre (Paso 2)
Se debe confeccionar una lista completa de las fuentes relevantes de incertidumbre,
mencionándose entre otras: metodologías asumidas, herramientas estadísticas,
muestreo y / o submuestreo, condiciones de almacenamiento, efectos atribuibles a
los instrumentos de medición (incluyendo función de calibrado, preparación de
soluciones patrones, número de cifras significativas, redondeo de cifras
significativas), pureza de los reactivos, niveles de concentración, estequiometría
asumida, condiciones de medición, matrices, corrección por blanco, efectos
atribuibles al operador, efectos aleatorios, condiciones del sistema de calidad,
regulaciones etc. Una de las formas de identificar las fuentes es utilizando un
diagrama causa-efecto de Ishikawa (espina de pescado) (Figura II.3). Para
establecerlo se consideran como base los grupos presentados a continuación, que a
su vez se dividirán en tantos subgrupos como fuentes de incertidumbre se
identifiquen.
Figura II.3 - Diagrama causa-efecto básico para identificación de fuentes de incertidumbre
21

Cuantificación de la incertidumbre de cada fuente (Paso 3)
Para estimar la incertidumbre total, se consideran todas las fuentes de
incertidumbre que puedan ser significativas y obtener la contribución individual de
cada una de ellas. Se debe realizar una estimación y evaluación de la incertidumbre
por cuantificación de sus componentes individuales derivadas del trabajo
experimental realizado en el laboratorio, o basadas en algún dato particular, como
ser: datos obtenidos en mediciones previas, especificaciones del fabricante,
provenientes de certificados de calibración, tomados de manuales, registros,
experiencia o conocimiento general del comportamiento y propiedades relevantes de
los materiales e instrumentos. Generalmente la incertidumbre se expresa como un
intervalo de confianza, por lo que es necesario convertir estas incertidumbres en
incertidumbres estándares, para ello es necesario conocer la distribución que asume
cada magnitud, así como su nivel de confianza. En los casos que se sabe que el tipo
de distribución es gaussiana, la incertidumbre estándar se calcula dividiendo el valor
de incertidumbre obtenido, por el factor k = 2 . Cuando no se tiene información de la
distribución que asume la magnitud, como en el caso de las tolerancias del material
volumétrico, se asume que el valor verdadero tiene igual probabilidad de ser
cualquier valor dentro del intervalo de indeterminación, esta información hace
suponer una distribución rectangular, y por lo tanto, la incertidumbre estándar se
obtiene dividiendo el valor de tolerancia por k = 3 . Si es más probable que el valor
verdadero tienda a ser el valor representativo (o sea el centro del intervalo) se
asume un distribución triangular, entonces la incertidumbre estándar se obtiene
dividiendo el valor de tolerancia obtenido por k = 6 . Se detallarán algunos casos
generales en los que se utilizan cada una de las magnitudes en la siguiente tabla
(Tabla II.1)
22

Tabla II.1– Distribuciones estadísticas e incertidumbres asociadas. 4
Distribución Utilización Incertidumbre
Cálculo de la incertidumbre combinada (paso 4)
Considerando las fuentes de variación antes descriptas, la incertidumbre combinada
está dada por la raíz cuadrada de la suma de los cuadrados de todas ellas (o sea las
fuentes de incertidumbre se propagan cuadráticamente).
2 2 2
u ( x)
= u a + u b + u c + ... ∑ = U
4 Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM/ CITAC Guide CG 4, Segunda edición: 2000.
Apéndice A – Preparación de un Standard de calibración.
● Cuando no hay datos del tipo de la
distribución, se asume que existe la
misma probabilidad que el valor
verdadero sea cualquiera dentro del
intervalo de indeterminación.
● Cuando un certificado o especificación
presenta un intervalo sin detallar el
nivel de confianza.
● Cuando los valores cercanos al valor
representativo, tienen mas posibilidad
de ocurrencia que a los extremos.
● Cuando la estimación fue hecha por
el método de rango máximo con una
distribución simétrica.
● Cuando la incertidumbre se presenta
para un intervalo de confianza del 95%
● Cuando se expresa la desviación
estándar, la desviación estándar relativa
o la desviación relativa porcentual, sin
especificar la distribución.
● Cuando la estimación se realiza en un
proceso de variabilidad aleatoria.
● Cuando se aplica el teorema central
del límite, o sea se trabaja con valores
promedios.
23
2
i
u ( x)
= δ /
u ( x)
= δ /
u ( x)
= c / 2
(95%)
u ( x)
= c / 3
(99,7%)
6
3
u ( x)
= s
u( x)
= x ⋅ ( s / x)
u ( x ) = x ⋅ ( s / x ) ⋅ 100
u ( x)
= s
u (
x)
= s

Cálculo de la incertidumbre expandida (Paso 5)
Finalmente, el cálculo de la incertidumbre expandida, proporciona un intervalo de
confianza donde se encuentra el verdadero valor con una determinada probabilidad;
se obtiene multiplicando la incertidumbre por un factor de cobertura K, el cual
depende de la probabilidad de contener al valor verdadero y de la distribución
asumida.
U ( X ) = k u(
x)
La elección del valor del factor de cobertura k, depende de los siguientes factores:
1- el nivel de confianza requerido,
2- datos de las distribuciones de las magnitudes involucradas,
3- grados de libertad de la estimación.
Se recomienda asumir el k = 2 para la mayoría de los casos; este valor
representa una distribución normal y un intervalo de confianza del 95% de
contener al valor verdadero. Quizás en algunos casos este valor sea insuficiente,
como en los que el cálculo estadístico de la incertidumbre tenga relativamente
pocos (seis o menos) grados de libertad; por lo tanto la elección de k también
depende de los grados de libertad, y se considera adecuado utilizar el valor de t
de Student de dos colas tabulado para el nivel de significación escogido
(generalmente 95%) y grados de libertad efectivos, según la tabla II.2.
Tabla II.2- t de Student para un 95% de confianza
Grados de libertad
Ν
1 12.7
2 4.3
3 3.2
4 2.8
5 2.6
6 2.5
24
t

II.2.2.2.2 Estrategia propuesta por el Analytical methods committee (“top-down”)
Este método se basa sobre el cálculo de la incertidumbre globalmente es decir,
agrupando fuentes de incertidumbre siempre que sea posible, utilizando la
información generada en los ejercicios interlaboratorio de tipo colaborativo. La
incertidumbre analítica total se determina a partir de la desviación estándar de los
resultados obtenidos por los laboratorios participantes. La incertidumbre se obtiene
multiplicando la desviación estándar de la reproducibilidad, por el factor de cobertura
k. Al igual que en la estrategia propuesta por ISO, un factor de k = 2 proporciona un
intervalo donde hay aproximadamente un 95% de probabilidad de que contenga al
valor verdadero. Esta aproximación no considera fuentes de incertidumbre asociadas
a la heterogeneidad de la muestra, a diferencias entre la muestra analizada en el
ejercicio y la muestra de rutina, analizada en el laboratorio (debidas al tipo de matriz
o al nivel de concentración) y a pretratamientos que se realicen en las muestras de
rutina pero que no se hayan realizado en el ejercicio colaborativo. Por lo tanto, estas
fuentes de incertidumbre deberían incluirse en el caso de que fuera necesario. La
también conocida como aproximación “top-down” agrupa las posibles fuentes de
error en tan solo cuatro términos generadores de la incertidumbre: el desvío del
método, el desvío del laboratorio, el desvío de la serie (ocasionado por las
condiciones en que se estudia la muestra como ser analista, dia, reactivos etc.) y por
último el error aleatorio. La incertidumbre expandida final del método utilizando la
ley de propagación es:
( δ δ
2
2
U x)
= k u met + u lab + serie + rep
Donde uδ met es la incertidumbre del método, u δ lab + serie + rep considera las
incertidumbres del laboratorio, de la serie y los errores aleatorios y k es el factor de
cobertura antes descripto.
25

II.2.2.2.3 Estrategia que utiliza la información de la validación del método.
Este método tiene como fundamento aprovechar la información generada en el
proceso de verificación de la trazabilidad del método analítico, la cual se verifica
mediante una muestra representativa de manera excluyente, para ello debe
asegurarse que la muestra de referencia también lo sea. Además la muestra de
referencia debe analizarse en condiciones intermedias de precisión, es decir,
variando todos los factores que puedan influir en la variabilidad de los resultados, lo
que significa que la muestra debe ser analizada en distintos momentos, por
diferentes personas y variando demás factores que influyan en dicha variabilidad.
Una vez verificada la trazabilidad, se está en condiciones de calcular la
incertidumbre. El laboratorio debe demostrar que la trazabilidad es sostenible en el
tiempo, y por ende que la incertidumbre sigue siendo válida, para ello el laboratorio
analítico debe trabajar en condiciones sólidas de aseguramiento de calidad.
A continuación se presenta la ecuación para calcular la incertidumbre expandida por
este método:
2
proced
2
trazab
26
2
pretratam
u ( x ) = k u . + u . + u . + u
uproced
El primer término
2
otrositems
corresponde a la incertidumbre debida a las características
propias del procedimiento, contempla la variabilidad del método analítico; se calcula
u
mediante la precisión intermedia de dicho método. El segundo término trazab
surge
de afirmar que el método es trazable y se calcula teniendo en cuenta la
incertidumbre de los materiales de referencia. El tercer término
upretratam
contempla
los factores que afectan la heterogeneidad de la muestra y los pretratamientos no
u
considerados al analizar la trazabilidad. El último otrosterm
abarca otros términos no
tenidos en cuenta anteriormente como la variabilidad de la matriz de la muestra.
Luego la incertidumbre total expandida del método se calcula propagando
cuadráticamente los factores, y multiplicando por el factor de cobertura k. Se suele
utilizar k = 2 , ya que con este valor, el valor verdadero se encuentra dentro del
intervalo con un 95% de nivel confianza.

II.2.2.3 Comparación y armonización de estrategias; ventajas y desventajas de cada
una.
Calcular la incertidumbre con la aproximación ISO tiene como ventaja que al
identificar y cuantificar todas las fuentes de incertidumbre del método analítico se
puede disminuir la incertidumbre de los resultados mejorando cada uno de los
factores del método involucrados que contribuyen al dato total de incertidumbre,
como ser la de los equipos e instrumentos de laboratorio (balanzas, pipetas, material
volumétrico, etc.), pureza de las drogas y obviamente el valor de incertidumbre del
patrón de referencia.
A diferencia de la estrategia ISO, en la estrategia AMC se calcula la incertidumbre de
forma global sin tener que identificar y cuantificar las distintas fuentes, lo que
evidencia una mayor simplicidad de operación. Por otro lado, es un enorme
obstáculo su poca aplicabilidad, ya que en muchas ocasiones no se dispone de la
información requerida sobre los ejercicios colaborativos correspondientes a cierta
muestra y metodología adecuada; por lo tanto no resulta útil a los efectos buscados.
La estrategia que utiliza la información obtenida en la verificación de la trazabilidad
tiene la ventaja que supone poco esfuerzo adicional ya que dicha verificación es un
paso previo al cálculo de la incertidumbre de los resultados. Tiene como desventaja
invalidante al objetivo buscado, la existencia de pocos analitos y matrices con un
elevado nivel de trazabilidad disponibles (se estima entre el 5% y el 10% de los
casos).
Más allá del método seleccionado son prerrequisitos comunes y esenciales: identificar
procedentemente los componentes de variabilidad en los métodos de ensayo y
demostrar como se los domina, por ejemplo con diagramas de flujo, diagramas de
espina de pescado, listas, tablas, matrices, herramientas estadísticas, hojas de
recolección de datos, etc.
Luego de la comparación de las estrategias presentadas se evidencia que la
aproximación ISO es un método complejo y arduo, pero el más optimizable, ya que
se identifican cada una de las fuentes de incertidumbre, se detallan las
contribuciones individuales a la incertidumbre final del resultado, entonces a los
efectos de este trabajo será beneficioso para minimizar cada una de ellas,
27

disminuyendo al máximo cada uno de los subfactores que afectan cada fuente hasta
llegar al valor óptimo individual factible en las condiciones de trabajo de un
laboratorio analítico que opera con un sistema de gestión de la calidad eficiente y
sostenible.
II.3 DOCUMENTACIÓN UTILIZADA
II.3.1 Referencia bibliográfica
Se presenta a continuación la documentación considerada para elaborar definiciones
y precisar conceptos necesarios que permiten introducir en este tema de
investigación. Para la elaboración de las definiciones relacionadas con la validación
de un método analítico (II.2.1) y el concepto de incertidumbre analítica (II.2.2) se
utilizan los fundamentos expuestos en el congreso armonizador dictado en
representación del Organismo Argentino de Acreditación (OAA), cuyo contenido se
encuentra sintetizado en la siguiente presentación:
a) EVALUACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE LA MEDICIÓN
(OAA) Organismo Argentino de Acreditación
Lic. Alba N. Zaretzky
Buenos Aires, Argentina, 30 de abril del 2008.
Esta presentación abarca el siguiente contenido temático: introducción a la Guía ISO
para la determinación de la incertidumbre de medida, conceptos básicos y
definiciones, exactitud (diferentes componentes y sus conceptos), nociones
estadísticas básicas, concepto de incertidumbre, métodos para la determinación de
las fuentes de incertidumbre, estimación de los valores, metodologías para la
evaluación de la incertidumbre, definición del modelo matemático, propagación de
incertidumbres, incertidumbre estándar, combinada y expandida, factores de
cobertura; o sea ofrece las herramientas necesarias para estimar la incertidumbre de
las mediciones correspondientes a un laboratorio ensayos químicos.
28

De la misma manera para presentar cada una de las estrategias conocidas para el
cálculo de incertidumbre, comparación y armonización, se utilizó como modelo el
siguiente artículo:
b) ESTRATEGIAS PARA EL CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE
Instituto de estudios avanzados. UNIVERSITST ROVIRA VIRGILI
Departamento de química analítica y química orgánica
Alicia maroto, Ricar Boqué, Jordi Riu, F. Xavier Rius
Pl. Imperial Tàrraco, 1. 43005-Tarragona.
Es sabido que el cálculo de la incertidumbre no resulta una tarea fácil, por lo tanto se
considera este artículo de gran valía ya que presenta herramientas útiles para
disminuir la dificultad al identificar y cuantificar todas las fuentes de incertidumbre
presentes en un proceso químico de medición. Fundamenta que las distintas
estrategias pueden ser armonizadas, que cada una es tan útil como la otra
dependiendo de ciertos factores como ser: la definición del mensurando, el objetivo
de la medición y recursos e información disponible.
Adicionalmente para consolidar argumentos y conclusiones en relación a las distintas
estrategias para el cálculo de incertidumbre, se considera de gran utilidad la
siguiente bibliografía:
1- Community Bureau of Reference (BCR). Certified reference material BCR-
649. Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM), Geel
Belgica, (2000).
2- BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML, Guide to the expression of
uncertainty in measurement, ISO, Ginebra,(1993).
3- EURACHEM/CITAC, Quantifying uncertainty in analytical measurement,
EURACHEM/CITAC Guide, 2nd Edition, (2000) http://www.eurachem.bam.de/.
4- Alicia Maroto, Ricard Boqué, Jordi Riu, F. Xavier Rius, “Incertidumbre y
precisión” Técnicas de Laboratorio, 266 (2001) 834-837.
5- Alicia Maroto, Ricard Boqué, Jordi Riu, F. Xavier Rius “Estrategias para el
cálculo de la Incertidumbre” Técnicas de Laboratorio 270 (2002) 223-227.
29

6- Alicia Maroto, Jordi Riu, Ricard Boqué, F. Xavier Rius, “Estimating
uncertainties using information from the validation process” Analytica
Chimica Acta 391 (1999) 173-185.
II.3.2 Referencia normativa
La siguiente documentación normativa fue utilizada como vehículo para la realización
de este trabajo de tesis, y además presenta un conjunto de requisitos iniciales para
la elaboración de los métodos para minimizar la incertidumbre en la preparación de
soluciones patrones en determinaciones por HPLC aquí propuestos.
El cálculo de la incertidumbre de los calibradores como demás fuentes de
incertidumbre significativas, es exigencia de la norma IRAM-ISO 15189:2007 5
Requisitos particulares para la calidad y competencia, para laboratorios de análisis
clínicos: “Cuando sea pertinente y posible, el laboratorio debe determinar la
incertidumbre de los resultados. Se deben tener en cuenta los componentes de
incertidumbre que sean de importancia. Las fuentes que contribuyan a la
incertidumbre pueden incluir muestreo, preparación de muestra, selección de la
alícuota de muestra, calibradores, materiales de referencia, cantidades ingresadas,
equipamiento usado, condiciones ambientales, condición de la muestra y cambios de
operador.”
La acreditación de los análisis del laboratorio clínico en su sentido más amplio tiene
cada vez más importancia como instrumento de gestión y como medio para crear
confianza en los resultados. La norma internacional ISO-EC 17025:2005
proporciona los requisitos generales para el sistema de gestión de la calidad y para la
competencia técnica, y exige que un laboratorio de calibración o de ensayo que
realiza calibración interna debe tener y aplicar un procedimiento para estimar la
incertidumbre de medición para todas las calibraciones. Sin embargo, los laboratorios
clínicos han manifestado mediante sus actividades, que su relación con los pacientes
merece consideraciones especiales, por lo que, cualquier laboratorio que procure el
reconocimiento de su competencia por vía de la acreditación, encontrará muy útil la
norma IRAM-ISO 15189: 2007.
5 Laboratorios de análisis clínicos –Requisitos particulares para la calidad y la competencia,
ISO(2007).
30

Se presenta a continuación las normas básicas que fueron consideradas para afianzar
conceptos en cuanto a fundamentos estadísticos y al cálculo y evaluación de la
incertidumbre de la medición:
1- IRAM 35050 - Procedimientos para la evaluación de la incertidumbre de
medición, (2001).
2- IRAM 35051 - Procedimientos para la evaluación de la incertidumbre de
medición en la calibración, (2004).
3- IRAM 35052 - Procedimientos para la evaluación de la incertidumbre en
química analítica.
4- IRAM 34552-1. - Estadística. Vocabulario y símbolos. Parte 1: Definiciones
de probabilidad y de estadística general, (2003).
5- IRAM 34553-1 - Estadística. Exactitud (certeza, repetibilidad y
reproducibilidad) de los métodos de medición y de sus resultados. Parte 1:
Principios generales y definiciones, (2006).
31

CAPÍTULO III: HIPÓTESIS DE TRABAJO
Iii.1 La problemática del cálculo de incertidumbre de una solución patrón
Como se ha mencionado anteriormente la mayoría de las determinaciones por HPLC
requieren la preparación de los calibradores en el laboratorio ya que no existen
patrones comerciales para la totalidad de las determinaciones. Dicha preparación
obviamente posee una incertidumbre asociada la cual debe ser mínima para que no
se propague en la incertidumbre final del método. No es conveniente comenzar un
proceso de medición con una incertidumbre de base considerable. No todos los
laboratorios analíticos poseen personal idóneo para realizar esta tarea, ya que es
difícil contar con profesionales con conocimientos matemáticos, estadísticos y
metrólogicos, así como también conocimientos normativos pertinentes tanto como
los necesarios para planificar, implementar y hacer sostenible y sustentable un
sistema de la calidad que respalde y acobije los conceptos, métodos y cálculos
propuestos para obtener de forma óptima dicho valor de incertidumbre.
Como se citó anteriormente hay diversos antecedentes bibliográficos para al cálculo
de incertidumbre de variables preanalíticas y posanalíticas (vale reiterar que no
forman parte del trabajo de investigación); lo mismo sucede con las variables
analíticas propiamente dichas a excepción de los detalles relacionados con la
preparación de soluciones patrones, cuyos antecedentes se limitan a "Quantifying
Uncertainty in Analytical Measurement" en su Apéndice A: "Preparación de un
standard de calibración" comentado anteriormente en el capítulo II.1. En cuanto a la
minimización aceptable del valor de incertidumbre de las soluciones patrones, luego
de un detallado análisis, se afirma la no existencia de trabajos de investigación que
sirvan como antecedente para afirmar a priori, que la incertidumbre en el proceso de
preparación de soluciones patrones para determinaciones analíticas por HPLC en
muestras biológicas en laboratorios de análisis clínicos es despreciable frente al dato
total de incertidumbre, esto denota una gran importancia del tema en el contexto de
32

estudio, de ahí el entusiasmo por este asunto y la respuesta a la pregunta que puede
llegar a surgir: ¿por qué este problema a deshilar y no otro?
La complejidad en el cálculo de la incertidumbre de las soluciones patrones puede
evidenciarse en la cantidad de parámetros a controlar en cada una de sus etapas
(detalladas en el capítulo II.2.2.2.1). Comenzando desde la definición del
mensurado, ahí es cuando debemos especificar de forma precisa y clara las variables
de las que depende y la adecuada preparación del estándar de calibración desde el
momento de realizar la pesada, su posterior disolución y dilución, hasta la obtención
de la concentración deseada. En el momento de identificar las fuentes de
incertidumbre, es crucial hacerlo de manera detallada, discriminando cuales serán
significativas a los efectos buscados; la omisión de alguna puede ser
determinante al instante de obtener un valor adecuado. Lo mismo sucede cuando
se cuantifica cada una de las fuentes, lo cual debe ejecutarse de manera procedente
y exacta, teniendo en cuenta que muchos de esos valores surgen de certificados de
calibración que deben ser convenientemente verificados e interpretados. Además se
debe establecer de forma certera la distribución asumida por cada uno de los
intervalos de incertidumbre, así como también el nivel de confianza requerido. Luego
aparecen distintos métodos de propagación, a lo que se tendrá que responder con
una correcta selección del mismo para calcular la incertidumbre combinada, la cual
deberá ser expandida y el parámetro en juego será el factor de cobertura (k) que
asume la medición; elegirlo no es tarea sencilla ya que depende de otros factores
como ser el nivel de confianza requerido, datos de las magnitudes involucradas y
grados de libertad de la estimación.
Considerando que se propone minimizar el valor de incertidumbre del patrón de
referencia mejorando la incertidumbre de cada uno de los equipos e instrumentos de
laboratorio (balanzas, pipetas, material volumétrico etc.), y que trabajando en el
laboratorio con un sistema de gestión de la calidad de los procedimientos analíticos,
cada paso debe estar orientado a obtener un valor óptimo por lo que se debe contar
con información clara y precisa de fabricantes y service de dichos equipos, así como
con un sistema de gestión de la calidad con su respectivo personal de laboratorio con
funciones en perfecta armonía.
33

Brevemente se pudo comentar muchas de las problemáticas más comunes que
surgen habitualmente, lo que refleja una alta complejidad al momento de tener bajo
control la enorme cantidad de variables involucradas.
III.2 Objetivos
El objetivo principal del trabajo es establecer pautas para el desarrollo y validación
de métodos para minimizar el valor de incertidumbre en la preparación de
calibradores (soluciones patrones) en determinaciones por HPLC en muestras
biológicas para ensayos en laboratorios analíticos y laboratorios de análisis clínicos.
Además es objetivo asociado al anterior desarrollar los cálculos necesarios para
demostrar que la incertidumbre de los calibradores es muy baja y despreciable ante
el dato total de incertidumbre del resultado.
III.3 Propósito
El propósito de este trabajo es proveer herramientas para calcular la incertidumbre
de los calibradores en determinaciones por HPLC, que en un futuro cercano,
funcionen como guía técnica con entidad científica reconocida en el medio, a
laboratorios analíticos con interés clínico, acreditados o en vías de acreditación, con
deseos de ofrecer servicios con validez y excelencia técnica.
III.4 CONDICIONES DE TRABAJO
III.4.1 Condiciones iniciales
Según se sabe, los responsables de los laboratorios de análisis clínicos, como
profesionales de la salud de nuestra sociedad, tienen obligaciones que superan los
34

equisitos mínimos fijados por la ley; en este caso se refiere al código de ética de la
profesión detallado en el siguiente anexo:
Norma IRAM-ISO 15189:2007
Laboratorios de análisis clínicos - Requerimientos particulares para la calidad y la
competencia.
Anexo C -Ética en el laboratorio de análisis clínicos,
C.2 -Principios generales.
Se considera que queda claro el espíritu de este anexo en el apartado mencionado
anteriormente:
"El principio general de la ética del cuidado de la salud es que el bienestar del
paciente es de máxima importancia. Sin embargo, la relación entre el laboratorio y el
paciente es complicada por el hecho de que podría también haber una relación
contractual entre el solicitante y el laboratorio. Aunque esta relación (que a menudo
es comercial) puede frecuentemente ser vista como la más importante, se
recomienda que la obligación del laboratorio sea la de asegurar que el bienestar y el
interés del paciente sean siempre la primera consideración y tenga prioridad"
“Se recomienda que el laboratorio trate a todos los pacientes equitativamente y sin
discriminación"
No está de más aclarar que la confiabilidad de los resultados de mediciones quininas
con interés clínico, requieren como condición inicial el cumplimiento de los principios
éticos aquí resumidos; todo resultado analítico con interés clínico no puede ser
influenciado por intereses económicos, comerciales o de cualquier otra índole, así
como tampoco debe incluir prácticas restringidas por la ley ni que comprometan la
reputación de la profesión; es decir todo laboratorio de análisis clínicos debe
comprometerse en todas las operaciones que realiza y aplicar la ética con todos
aquellos con quienes está vinculado: médicos y pacientes, empleados, proveedores,
comunidades en las que está instalado y con la sociedad en general, o sea que
enfoque sus principios y valores al servicio del bien común y aplique la ética
al servicio de la salud.
35

III.4.2 Normativa legal y regulatoria aplicable
Resolución 1189/2007
Créase el Sistema Nacional de Evaluación Externa en Servicios de Salud.
Registros Nacionales de Entidades Evaluadoras Externas en Servicios de Salud y de
Servicios de Salud con Evaluación Externa. Requisitos;
Ministerio de Salud de la República Argentina,
Boletín Oficial de la República Argentina, 24 de septiembre del 2007, Buenos Aires.
En diciembre de 2006, el Ministerio de Salud publicó la resolución ministerial N°1924,
con el objetivo de crear la Comisión Nacional de Evaluación Externa de Servicios de
Salud con la intención de cumplir funciones de asesoramiento al ministerio en la
elaboración de requisitos mínimos para las instituciones que realicen actividades de
evaluación externa y para los establecimientos que estas instituciones evalúen;
contado con la participación activa del Organismo Argentino de Acreditación (OAA).
El 19 de septiembre del 2007 se llevó a cabo el lanzamiento efectivo de la comisión
Nacional de evaluación externa de Servicios de Salud y la posterior publicación de la
resolución ministerial 1189/07 por la cual se crearon el Sistema Nacional de
Evaluación Externa de Servicios de Salud y el Registro de entidades acreditadotas y
de los establecimientos y servicios de salud acreditados, detallando en esta
resolución los requisitos que deben cumplir la entidades acreditadotas. Dicha
comisión es la encargada de asesorar al ministerio en la implementación de este
sistema.
Se citan dentro del artículo 3° donde se detallan los requisitos mínimos, los
apartados m y n que manifiestan la necesidad de tener un sistema de gestión de
calidad efectivo y el x que hace referencia al tratamiento de los estándares en su
correcta definición y demás información.
“Art. 3º — Serán requisitos ineludibles para el registro de las Entidades Evaluadoras
externas en servicios de salud:”
“m. Poseer un sistema de calidad que incluya la estructura organizativa que permita
dar confianza a los interesados.”
36

“n. Tener procedimientos documentados para su sistema de calidad que incluyan:
política y procedimiento de toma de decisiones y para la resolución de quejas y
apelaciones.”
“x. Publicar los estándares detallando claramente su definición y la información
mediante la cual serán verificados, de manera que se encuentren en conocimiento de
los potenciales usuarios de los servicios de evaluación.”
III.4.3 Restricciones de trabajo
La mayoría de las determinaciones por HPLC requieren la preparación de los
calibradores en el laboratorio ya que no existen patrones comerciales para la
totalidad de dichos análisis. Operativamente la mejor referencia posible para
asegurar la trazabilidad de los resultados analíticos es preparar estas soluciones a
partir de materiales de referencia certificados (MRC); se estima que sólo hay
disponibles entre un 5% y un 10% de los MRC para los análisis que se realizan en la
actualidad en todo el mundo y, considerando además el enorme rango de matrices,
la gran cantidad de analitos y las concentraciones existentes, vemos un gran
obstáculo, desde un punto de vista práctico, al momento de preparar las solución
patrón deseada.
Son restricciones además el elevado precio de dichos materiales, y la dificultad para
importar ciertas drogas por características críticas de sus propiedades, las cuales
necesitarán la obtención de un permiso especial a ser otorgado por el Administración
Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica (ANMAT) y el organismo
competente del país de procedencia de la droga. En el próximo capítulo se analizará
el caso de experiencias con tres drogas, a saber: fenobarbital, carbamazepina y
difenilhidantoína. Dichas drogas son procedentes de Estados Unidos de Norteamérica
y al ser psicotrópicos (que afectan el sistema nervioso) requieren sus
correspondientes permisos, en este caso de la Drug Enforcement Administration
(DEA).
Dichas situaciones obligan a que cada laboratorio analítico se especialice en
contadas determinaciones en el momento de realizar un análisis rutinario con
37

materiales de referencia internos, preparados por el propio laboratorio, a partir de
materiales de referencia certificados.
Actualmente existen en el mundo unos 20000 MRC producidos por unos 130
suministradores. Sin embargo, organizaciones como la EURACHEM o la ISO alertan
sobre la enorme y creciente cantidad de organismos que comercializan MRC de
dudosa calidad 6 . Más allá de esta inevitable situación, se evidencia un aumento en
el número de los productores de materiales de referencia, su correspondiente
demostración de capacidad científica y técnica, la cual es un requisito básico para
asegurar la calidad de los materiales de referencia. La guía ISO 34:2000 7 (ILAC-G12)
delinea los requisitos generales con los cuales un productor de materiales de
referencia debe considerar en el desarrollo de sus funciones. Dicha guía especifica
que el productor debe establecer, implementar y mantener un sistema de calidad
apropiado a la naturaleza de las actividades; que debe contar con políticas, sistemas,
programas, procedimientos, instrucciones, hallazgos, etc. documentados, que
aseguren la calidad de los materiales de referencia que produce; debe estar
legalmente establecida, organizada, contar con una dirección respaldada por
personal técnico, con la autoridad y los recursos necesarios para delegar
responsabilidades, contar con una dirección técnica responsable de las operaciones
técnicas, que asegure que la calidad del trabajo realizado no sea
dependiente de las presiones comerciales, financieras o de cualquier otro
desvío del interés clínico.
6
Fuente: Materiales de referencia certificados / Jjordi Riu del Grupo de Quimiometría y Cualimetría -
Universitat Rovira i Virgili.
7
International Organization for Standardization“Guide 34 - General requirements forthe competence
of reference materials producers” Switzerland : ISO (2000)
38

CAPÍTULO IV: SOLUCIONES PROPUESTAS
IV.1 JUSTIFICACIÓN DE LA SOLUCIÓN, CRITERIOS y CONCEPTOS ADOPTADOS.
La solución propuesta es el desarrollo de un método para disminuir la incertidumbre
en la preparación de los calibradores basado en la estandarización de las actividades
y los criterios necesarios para hacer que este procedimiento sea el óptimo para que
el método analítico proporcione consistentemente la información requerida para
demostrar que el método es adecuado al uso previsto, es decir pueda ser validado de
manera adecuada.
El objetivo es minimizar el valor de incertidumbre del patrón de referencia mejorando
la incertidumbre de los equipos e instrumentos de laboratorio (pureza de las drogas,
balanzas, pipetas, material volumétrico, termómetros) y trabajando en el laboratorio
con un sistema de gestión de la calidad de los procedimientos analíticos.
En la práctica, la selección de un instrumento de medición es un factor clave
en el proceso de medición y se inicia delimitando el uso previsto y definiendo las
características metrológicas (parámetro identificable que puede influir en los
resultados de la medición) requeridas para obtener mediciones confiables. Se
selecciona entonces un instrumento de medición, mediante la comparación de estos
requisitos metrológicos y las declaraciones del fabricante.
Al seleccionar los elementos de medición para la preparación de las soluciones
patrones, se consideran, al menos, los siguientes aspectos:
1- Todo equipo de inspección, medición y ensayo, así como los patrones
utilizados para su calibración, deben ser seleccionados sobre la base de los
siguientes aspectos (recordando que no siempre lo mejor o más caro es lo
39

apropiado): capacidad de medición, relación de incertidumbre (cociente
entre la tolerancia (diferencia admisible especificada entre valores máximo
y mínimo de una magnitud) y la incertidumbre del instrumento,
estableciéndose por acuerdo internacional que una relación de
incertidumbres entre 3 y 10 es apropiada para asegurar, hasta cierto
punto, la confiabilidad en las mediciones), relación Costo-Beneficio,
condiciones críticas de funcionamiento, manejo, operatividad y adaptación
a las necesidades.
2- Para determinar si un instrumento operará adecuadamente a nuestras
necesidades debemos efectuar adicionalmente, un análisis detallado de las
condiciones a las que operará el instrumento o equipo de medición
(temperatura, presión, humedad, vibraciones, etc.).
Otro importante factor es la determinación de los períodos de calibración y
verificación. La diversidad de variables a tener en cuenta para efectuar este
proceso es muy amplia y se agrupan en factores según su origen:
Metrológicos: la incertidumbre de las mediciones requeridas o declaradas por el
Laboratorio y el riesgo de que el instrumento de medida exceda los límites máximos
de error cuando se usa.
Debidos al instrumentos: tendencia de al desgaste o deterioro y recomendaciones
del fabricante.
Debidos al uso: el uso que posee el instrumento en cuanto a frecuencia y
severidad, las condiciones ambientales, tales como humedad, temperatura y nivel de
preparación del personal que utilice los instrumentos de medida.
Debidos al registro: la tendencia de los datos obtenidos en registros de
calibraciones previas, registros históricos de mantenimiento y servicio del equipo,
frecuencia de chequeo cruzado con otros patrones de referencia e instrumentos de
medición, frecuencia y calidad de chequeos intermedios en el intervalo de tiempo y
arreglos de transporte y riesgo.
De costo: Costo de la corrección de medidas cuando se encuentra que el
instrumento no es el apropiado para el período de tiempo estimado y relación costo-
beneficio.
40

La pureza de los reactivos es de fundamental importancia para la exactitud de los
resultados de un análisis y se utilizarán para los análisis de laboratorio, drogas o
reactivos químicos de máxima pureza. Existen en el mercado drogas de diferentes
calidades y de diferentes purezas.
Según Disposición ANMAT 5040/06 8 : “el uso de sustancias químicas de alto grado
de pureza es fundamentalmente para asegurar la calidad de los datos analíticos en la
cuantificación de los fármacos y/o sus metabolitos. Para tal fin y de acuerdo a las
Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP), se debería trabajar con estándares
desarrollados por USP, BP, INAME o de otros organismos internacionales
reconocidos.”
”En todos los casos, los estándares deberán ser trazables y contar con protocolos
analíticos, así como ser almacenados conforme a las instrucciones del proveedor.
Frecuentemente, éstos deben ser conservados en un lugar fresco, al abrigo de la luz,
con baja humedad y siempre en frascos bien cerrados a los fines de resguardar su
identidad durante todo el período de vida útil del mismo. Se debe llevar la planilla de
stock de estándares en la que debería figurar la cantidad disponible de cada uno,
masa utilizada y período de validez.”
El centro debe contar con un procedimiento operativo estándar (POE) donde se
describa la forma de conservación de los estándares y de que manera se llevará un
almacenamiento de manera de contar con estándares que se encuentren dentro del
período de validez.
La balanza analítica es un instrumento para la determinación de masa cuya
capacidad es desde un gramo hasta algunos kilogramos con una precisión que
supera 1 parte en 10 6 de su capacidad máxima.
Dentro de las balanzas analíticas más comunes tenemos:
Microbalanzas: tienen una capacidad de máxima de 160-200 g y una precisión de
0,1 mg. Semimicroanalíticas: tienen una capacidad de máxima de 10-30 g y una
precisión de 0,01 mg. Microanalítica: poseen una capacidad de máxima de 1-3 g y
una precisión de 0,001 mg.
8 Disposición Nº 5040/2006, referido al Régimen de Buenas Prácticas para la Realización de Estudios
de Biodisponibilidad/Bioequivalencia.
41

La balanza microanalítica electrónica será la adecuada al uso previsto en función de
su capacidad de medición y su precisión asociada.
Dicha balanza analítica requerirá una verificación diaria de la precisión y exactitud,
con el control del peso de una pesa calibrada con masa conocida, además de
calibración externa por un service periódicamente, respetando el programa de
calibraciones elaborado a dichos efectos. Las consideraciones necesarias de uso,
mantenimiento, calibración y verificación serán las detalladas en la disposición
ANMAT 5040/06.
Disposición ANMAT 5040/06: “las balanzas analíticas deben ser instaladas en un local
adecuado, niveladas, libre de corriente de aire, en mesadas exclusivas para las
mismas y estables. Siempre que se pueda, estarán dispuestas en ambientes con
temperatura controlada. Las balanzas deben ser acondicionadas después de su uso.
Debe haber un programa de mantenimiento que incluya el mantenimiento y la
calibración periódica (como mínimo, anualmente) con toda la información registrada
y archivada.”
Todos los registros deben ser archivados y las pesas utilizadas en las verificaciones
deben ser recertificadas anualmente.
El laboratorio debe contar con un procedimiento operativo estándar (POE) con la
información básica sobre el uso y funcionamiento de la balanza, limpieza,
mantenimiento y calibración.
Una manera de disminuir la incertidumbre de las pipetas es por medio de un
control exhaustivo de la precisión con control gravimétrico. Este control se realiza
pesando un volumen determinado con una pipeta automática n veces (de 5 a 10)
calculando el promedio y desvío estándar, y por ende el coeficiente de variación
porcentual. El control de la exactitud se realiza con un service y calibración externos
por un laboratorio adecuado.
Las normas ISO 9001 y ISO 17025 exigen la comprobación periódica de los aparatos
de medida volumétricos, y la ISO 8655 9 y la DIN 12650 10 son las reglamentaciones
técnicas equivalentes mas utilizadas en cuanto a su manejo en el laboratorio.
9 Piston-Operates volumetric apparatus, (2002).
10 The Standard Committee for Laboratory Devices and Equipment in the DIN (Deutsches Institut für
Normung), determina las normas para las pruebas de conformidad y certificación. Último borrador,
(4th Standard Proposal, 1996-07).
42

Estas referencias normativas informan que para un uso diario de dichos
instrumentos, es conveniente una calibración cada tres meses y un control diario de
funcionamiento que conste de las siguientes pruebas al menos: estanqueidad (tomar
el volumen nominal máximo de agua destilada y poner la pipeta en un soporte sin
vibraciones y verificar que durante 1 minuto no se formen gotas claras en la punta),
control visual: se debe observar durante el uso diario si hay rayas o daños en el cono
de trabajo, o uniones flojas y de aparecer alguno se procede a efectuar una prueba
de gravimetría (calibración-verificación), y un control de funcionalidad al uso que se
le dará.
La calibración trimestral constará de, al menos, una limpieza integral, un ensayo de
funcionalidad, un control gravimétrico y el archivo de resultados medidos y valores
estadísticos asociados calculados. La calibración de pipetas comprende la
comparación de volumen real (valor medio para el volumen que se determina
gravimétricamente para un número dado de pipeteos repetidos) y volumen teórico
(volumen regulado en el indicador digital de la pipeta). Se debe realizar
periódicamente (cada 3 meses), siempre después de cada limpieza y sustitución de
componentes. Los parámetros estadísticos a informar y controlar van a ser la
exactitud (desviación cuantitativa del valor real frente al teórico) y la precisión
(desviación típica en % del valor real. También llamada desviación típica relativa
(DTR) o coeficiente de variación (CV)).
Según Disposición ANMAT 5040/06: “el centro debe contar con un POE para
utilización, limpieza y conservación de las pipetas automáticas y toda verificación de
la performance y calibraciones externas deben ser registradas y archivadas.
Los ensayos para determinar exactitud y precisión de las pipetas mecánicas de
volumen fijo se deben realizar con masa de agua cada tres meses. En el caso de
pipetas de volumen variable también se debe verificar la exactitud y la precisión
usando una masa de agua por lo menos cada tres meses pero en dos puntos
distintos.”
Con respecto del material volumétrico, existe en el mercado material calibrado
por unidad o por lote, con una incertidumbre determinada.
43

Al utilizar instrumentos de vidrio, se debe tener en cuenta que este material se
expande y se contraen de acuerdo con la temperatura, por eso se deben respetarse
las recomendaciones del fabricante y/o literatura práctica disponible.
La calibración de estos instrumentos de medida suele efectuarse con una frecuencia
de tres meses considerando un uso diario mediante una comparación entre el
volumen actual dispensado con el volumen nominal ajustado, para ello se mide un
líquido de densidad conocida a una temperatura determinada y se convierte la masa
en volumen o con un factor de corrección (debido al empuje del aire dado que la
densidad del agua es muy inferior a la de las pesas), teniendo en cuenta que el
líquido usado sea agua destilada, la cual se expande 0,02% por grado Celsius a los
20º C .
Estos procedimientos, como el adecuado uso y mantenimiento se detallan en la
norma ISO 4787:2011 11 y en la norma ASTM E 542-01 12 .
Con respecto de la medición de temperatura en el laboratorio, el error máximo de
medida de temperatura permitido (EMP) es un parámetro clave a tener en cuenta en
cuanto a la elección del instrumento de medición en el laboratorio clínico y depende
sustancialmente del objeto de la medición. Se debe establecer las medidas que con
cada termómetro se efectuarán y asignarle como error máximo permitido el más
estricto de las categorías de medida que se realizan con el mismo. Las categorías se
definen como A con un EMP (º C) = 0,5, B con un EMP (º C) = 1,0 y C con un EMP
(º C) = 2,0. Este error admisible se utilizará como criterio de aceptación de las
calibraciones.
La frecuencia de calibración de un termómetro depende de las características del
instrumento y del uso. En general es suficiente calibrar los termómetros una vez al
año. También deberían calibrarse siempre que exista alguna sospecha de
funcionamiento incorrecto o después de haber sido sometidos a temperaturas
inadecuadas u otra situación que se presume puede comprometer su
funcionamiento, según lo detallado en la norma IRAM 9102 13 .
11 ISO 4787:2011 - Laboratory glassware - Volumetric instruments - Methods for testing of capacity
and for use.
12 ASTM E 542-01 - Standard Practice for Calibration of Laboratory Volumetric Apparatus1 (2007)
13 IRAM 9102 - Método de calibración y control del punto 0 °C, 4/12/1970.
44

Los parámetros considerados al estimar la incertidumbre en mediciones realizadas
con dichos termómetros deben ser los debidos a la dispersión de las lecturas
calculada a partir de la desviación típica de cierta cantidad de mediciones (entre 5 y
10), los dependientes de la resolución de dicho dispositivo, al certificado de
calibración que deriva de los datos del patrón y eventuales factores adicionales.
Para alcanzar los objetivos planteados, se deberá analizar, estudiar y compatibilizar
un amplio conjunto de conceptos, métodos y modelos de gestión orientados a
normalizar esta actividad. Analizando las fortalezas de cada método, combinando los
siguientes conceptos de manera adecuada, se obtendrá el objetivo planteado de la
manera proyectada. Dicha normalización deberá armonizar conceptos matemáticos y
estadísticos para el cálculo y evaluación de incertidumbre, que brinden confianza en
los resultados, procedimientos de gestión de calidad para laboratorios analíticos de
análisis clínicos basados sobre las normas de referencia y las buenas prácticas de
laboratorio, procedimientos técnicos que permitan asegurar la correcta preparación
de soluciones patrones utilizadas para calibración del método analítico. Para obtener
la incertidumbre resultante de este procedimiento se aplicará la metodología
presentada en “Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement” Apéndice A –
Preparación de un Standard de calibración; EURACHEM / CITAC Guide CG 4;
Segunda edición: 2000, adaptando el método a los requerimientos, antes descripta
en el Capítulo I.5.
IV.2 METODOLOGÍA UTILIZADA
IV.2.1 Introducción
Las sustancias que se estudiarán a continuación tienen una ventana terapéutica
estrecha, es decir la concentración plasmática eficaz está muy cerca de la tóxica.
Es por este motivo que el monitoreo terapéutico (medición de la concentración en
plasma) es de suma importancia para redefinir la dosis de administración de estos
fármacos.
45

IV.2.2 PRÁCTICA DE FENOBARBITAL
IV.2.2.A Introducción
El fenobarbital (figura IV.1) es un barbitúrico de acción prolongada utilizado en el
tratamiento de las convulsiones neonatales, convulsiones tónico clónicas
generalizadas, epilepsias parciales, prevención de algunas convulsiones febriles y en
el estado de mal elíptico resistente a otros tratamientos. 14
FIGURA IV.1 - Estructura molecular del fenobarbital
El procedimiento utilizado para determinar los niveles séricos de fenobarbital para
control de los niveles circulantes en pacientes tratados en estado estacionario o en
estudios de biodisponibilidad, mediante cromatografía líquida de alta presión y la
preparación de soluciones patrón y calibradores destinadas a dichos efectos será
descripto en el procedimiento operativo estándar (POE) “Práctica fenobarbital”
(Anexo Nº 1) y las actividades derivadas de dicho instructivo son:
14 J. Floez, J.A. Armijo, A. Mediavilla, “Farmacología humana”, España, Ed. Masson, pp. 530-531
(2005)
46

IV.2.2.B PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN PATRÓN DE FENOBARBITAL
Paso 1: Definición del mensurando
Se efectúa la preparación de una solución patrón de fenobarbital para determinación
de HPLC a partir de una droga de alta pureza, según los pasos detallados en la figura
1.
CcFBT = ( m.
p / V )
CcFBT: concentración del estándar de calibración [generalmente en mg/ml]
m: masa del estándar de alta pureza [generalmente en mg]
p: pureza estándar
V: volumen del líquido del estándar de calibración [generalmente en ml]
FIGURA IV.2 - Preparación de un estándar de calibración
47

Paso 2: Identificación de las fuentes de incertidumbre
Se confeccionó una lista completa de las fuentes relevantes de incertidumbre. Para
visualizarlo de forma clara se realizará un diagrama causa-efecto de Ishikawa o
espina de pescado como el representado en la figura IV.3.
FIGURA IV.3 - Diagrama causa-efecto para identificación de fuentes de incertidumbre
Paso 3: Cuantificación de la incertidumbre de cada fuente
Se estimará la incertidumbre total, para ello se consideran todas las fuentes de
incertidumbre que puedan ser significativas y se obtendrá la contribución individual
de cada una de ellas. Además se calculará la incertidumbre estándar, mediante el
cociente entre dicha incertidumbre y un factor de cobertura que depende de la
distribución asumida y el intervalo de confianza correspondiente (Ver tabla 1–
Distribuciones estadísticas e incertidumbres asociadas (capítulo II))
48

(1) Pureza
Se analiza la pureza de la droga mediante datos del fabricante; a saber:
pureza superior al 99%
En el certificado del fabricante no declara la incertidumbre de la pureza, por lo tanto
se toma la peor situación. ∆p = 1 % = 0,
01
Pureza = ( 99 ± 1)%
Pureza = ( 0,
99 ±
0,
01)
Por no poseer información del tipo de distribución se asume una distribución
rectangular, al considerar el peor caso; con k = 3 .
u ( p)
= ∆p
/ k
u(
p)
=
u(p): Incertidumbre estándar debido a la pureza de la droga
u ( p)
= 0,0057735
Tabla IV.1a- Tabla de valores e incertidumbres
(2) Masa
0,
01/
Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
Valor Estándar
Estándar relativa
P Pureza 0,99 0,0057735 0,005831
Se pesan 5 mg de la droga para su posterior disolución y dilución;
y las fuentes de incertidumbre tenidas en cuenta serán las siguientes:
1- Repetibilidad
2- Resolución digital
3- Calibración
El efecto combinado de la incertidumbre se evidencia en el ensayo de linealidad que
muestra el certificado.
u(
m)
= 0,
00013g
u(
m)
= 0,
13mg
3
49

Las pesadas asumen una distribución normal con k = 2
u(
m)
=
Sm / k
u(
m)
= 0,
13mg
u(m): Incertidumbre estándar debido a la masa de la droga
u( m)
= 0,
065mg
Tabla IV.1b -Tabla de valores e incertidumbres
Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
Valor mg estándar mg estándar relativa
m Masa 5 0,065 0,013
(3) Volumen
Existen tres fuentes de incertidumbre a ser consideradas en la obtención del volumen
deseado:
1- Incertidumbre del matraz aforado de 5 ml
2- Variación en el llenado del matraz
3- Diferencias de temperatura
3-1- Calibración
En el certificado del fabricante se declara:
Valor nominal: 5 ml
Tolerancia: 0,025 ml
Temperatura: 20,00 ºC / 68 ºF
Y la incertidumbre expresada en la tolerancia será:
u(
V )
1
u(
V )
1
u (V ) 1
= ∆v
/ k
= 0,
025ml
/
6
= 0,0102062
3-2- Repetibilidad
ml
Valor nominal: 5,006 ml
Se asume distribución triangular k = 6
La repetibilidad está representada por la magnitud estadística: desviación estándar
δ v = 0,
013ml
/ 2
50

u ( v)
2 = δv
/ k
con k = 2
u ( v)
2 = 0,
013m
/ 2
3-3-Temperatura
= 0,0065 ml
Se expresará la incertidumbre debida a la variabilidad térmica estimada:
Volumen (V ) = 5ml
Variación de temperatura ∆ T = ± 2º
C
Coeficiente de expansión térmica del agua α =
Variación del volumen ∆ V = ± V∆Tα
∆ V = ±
- 4 -1
5ml. 2º
C.
2,
110 º C
∆ V = 2,
1x10
-3
ml
Asumiendo una distribución rectangular,
u ( v)
3 V / k ∆ = Con 3 = k
u (v)
3 = 0,0012124355
ml
51
- 4
2, 110 º C
Se procede a combinar las incertidumbres individuales relativas al volumen.
2
1
2
2
u ( V ) = ( u(
V ) + u(
V ) + u(
V )
2
2
2
( V ) = 0,
0102062072ml
+ 0,0065 ml 0,
0012124355ml
2
3
u +
u (V): incertidumbre estándar debido al volumen de la droga
u (v)
= 0,01216
ml
Tabla IV.1c -Tabla de valores e incertidumbres
Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
Valor ml estándar ml estándar relativa
V Volumen 5 0,01216 0,002432
-1

Paso 4: Cálculo de la incertidumbre combinada
La incertidumbre combinada estará dada por la raíz cuadrada de la suma de los
cuadrados de todas las fuentes (o sea las fuentes de incertidumbre se propagan
cuadráticamente).
Se combinan las incertidumbres en su expresión relativa, para obtener índices
provenientes de distintas fuentes de incertidumbre adimensionales, por lo tanto
combinables.
u +
2
2
( FBT)
/ CcFBT = ( u(
p)
/ p0
) + ( u(
m)
/ m0)
( u(
V ) / V0
CcFBT = ( m ⋅ p / V ) mg / ml
CcFBT = 5mg
⋅ 0,
99/
5ml
= 0,
99mg
/ ml
u
2
2
( FBT)
/ CcFBT = ( 0,005773505
/ 0,99) + ( 0,
065mg
/ 5mg)
+ ( 0,0121608659
ml / 5ml
-5
u ( FBT ) / CcFBT = 3,40101 10 + 0,000169 + 0,0000059154
= 0,01445425 77
Incertidumbre combinada
u (FBT)
= 0,0144542577 ⋅ 0,99 mg/ml
u(FBT) = 0,01430971
mg/ml
Paso 5: Cálculo de la incertidumbre expandida
Se obtiene multiplicando la incertidumbre por un factor de cobertura k, el cual
depende de la probabilidad de contener al valor verdadero y de la distribución
asumida.
Incertidumbre expandida
U ( FBT ) = k ⋅ u(
FBT ) con k = 2
U ( FBT ) = 2 ⋅ 0,0143097151mg/ml
U ( FBT ) = 0,0286194302
mg/ml ≅ 0,029 mg/ml
Redondeando a la segunda cifra significativa. Ver VI.4.3.
52
)
2
)
2

TABLA IV.2- Tabla de valores e incertidumbres
A B C D E
1 P M V
2 Valor 0,99 5,000 5,000
3 Incertidumbre 0,005773505 0,065 0,0121608659
4
5 P 0,99 0,995773505 0,99 0,99
6 m 5,000 5,000 5,065 5,000
7 V 5,000 5,000 5,000 5,0121608659
8
9 Cc 0,99 0,995773505 1,00287 0,98665
10 u(y,xi) 0,005773505 0,01287 -0,00335
11 u(y)²,u(y,xi)² 0,0002101928 0,0000333334 0,0001656369 0,0000112225
12
13 u(CcFBT) 0,014498027 U(CcFBT) 0,028996055 ≅0,029
FIGURA IV.4 - Contribuciones de las incertidumbres al estándar de calibración
p
v
m
U(Cc)
0 0,005 0,01 0,02 0,.04 0,08
u(y,xi) ( mg.ml -¹)
53

IV.2.2.C Preparación de calibradores de fenobarbital
Se efectuó la preparación del calibrador de nivel 4 de fenobarbital a partir del
estándar patrón.
FIGURA IV.5 – Preparación de calibradores nivel 4 fenobarbital
Identificación de las fuentes de incertidumbre:
1- Incertidumbre estándar del patrón
2- Dosificación con pipeta
3- Volumen
1- Incertidumbre estándar del patrón
u(FBT) = 0,0143097151mg/ml
U
(FBT)
= 0,0286194302 mg/ml ≅
0,029mg/ml
54

2- Dosificación con pipeta
Se emplea monopipeta monocanal de volumen variable.
Gilson / P1000 / 200-1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
00033ml
con k = 2
u( pipeta)
= 0,
00033ml
/ 2
u ( pipeta)
= 0,000165 ml
3- Volumen
1- Incertidumbre de cerificado del matraz aforado de 5ml
2- Variación en el llenado del matraz
3- Diferencias de temperatura.
3-1- Calibración
El certificado del fabricante declara:
Valor nominal V 0 = 5 ml
Tolerancia= 0,025 ml
Temperatura= 20,00º C / 68,00º F
La incertidumbre asociada a la tolerancia asume una distribución
Triangular k = 6
u V ) = ∆V
/ k = 0,
025ml
/
( 1
u ( V1)
= 0,0102062
3-2- Repetibilidad
ml
6
La repetibilidad está representada por la magnitud estadística: desviación
estándar δ v = 0,
013ml
u V ) = v / k
Con k = 2
( 2 δ
u
( V ) 2 = 0,
013m
/ 2
= 0,0065 ml
55

3-3- Temperatura
Volumen V0 5ml
=
Variación de la temperatura: ∆ T = ± 2º
C
- 4
Coeficiente de expansión térmica del agua α = 2,
110 º C
Variación del volumen v = ± V ∆Tα
∆ 0
- 3
∆ V = 2,
110 ml con = 3
u V ) = ∆V
/ k
( 3
u ( V3
) = 0,00121243
ml
Cálculo de la incertidumbre combinada
u ( V ) = u(
V1)
+ u(
V2
) + u(
V3)
=
56
−1
k (distribución rectangular)
2
2
2 2
( 0,01020620 72 + 0,
0065 + 0,00121243 ) ml
= 0,01216086
ml
Combinación del nivel 4
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u(FBT) = 0,0144822961
mg/ml
2- Dosificación pipeta u ( pipeta)
= 0,000165 ml
u (V ) =
3- Volumen 0,01216086 ml
Concentración del estándar en su cuarto nivel (CSTD 4)
:
CSTD 4 = 0,
1mg
/ ml
Tabla IV.3a- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 4
Nivel 4
Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
Valor estándar
estándar relativa
Cc Concentración del estándar
de calibración
0,99 mg/ml 0,0144822961 mg/ml 0,0146285819
Xp Dosificación pipeta 0,5 ml 0,000165 ml 0,00033
V Volumen 5 ml 0,0121608600 ml 0,0024321720
Se llevan las expresiones a incertidumbres relativas para comparar magnitudes heterogéneas

u +
2
2
( STD4)
= u(
FBT ) + u(
pipeta)
u(
V
u p +
2
2
( STD4)
/ CSTD4
( u(
FBT ) / C(
FBT )) ( u(
pipeta)
/ X ) ( u(
V ) / V0
+
=
u ( STD4)
= ( ( 0,
0002139954 + 0,
0000001089 + 0,0000059154)
⋅ 0,
1mg
/ ml
u ( STD4)
= 0,01483306 30 ⋅ 0,
1 mg / ml
u ( STD4)
= 0,001483 mg / ml
No redondear el valor de la incertidumbre hasta calcularla en su expresión expandida.
Incertidumbre expandida
U ( STD4)
= k ⋅u(
STD4)
Con k = 2
U ( STD4)
= 0,0029666 mg / ml ≅ 0,
0030mg
/ ml
Preparación de calibradores de fenobarbital
)
2
Se efectúa la preparación de los calibradores de los niveles 3, 2 y 1 de fenobarbital a
partir del estándar de nivel 4.
FIGURA IV.6 – Preparación de calibradores niveles 3, 2, 1 fenobarbital
Identificación de las fuentes de incertidumbre
57
)
2

1. Incertidumbre estándar 4 (STD4)
2. Dosificación con pipeta
1 -Incertidumbre del STD4
u(STD 4) = 0,0014833063
mg/ml con k = 2
U ( STD4)
= 0,00296661 26 mg / ml ≅ 0,
0030mg
/ ml
2 -Dosificación pipeta
1- 1ml STD4
2- 1ml plasma libre de droga
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p1000 / 200 a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
± 0,
0019ml
u ( pipeta)
= 0,00095ml
= con k = 2
Combinación del nivel 3
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u ( STD4)
= 0,0014833063
mg/ml
2- Dosificación pipeta
Concentración del estándar en su tercer nivel ( CSTD 3 ) :
CSTD 3 = 0,05 mg/ml
Tabla IV.3b- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 3
58
Incertidumbre
estándar
Incertidumbre
estándar relativa
Nivel 3
Descripción
Valor
CcFBT Concentración del estándar
de calibración (nivel 4) 0,1 mg/ml 0,0014833 mg/ml 0,014833
Xp Dosificación pipeta 1 ml 0,00095 ml 0,00095
Xp Dosificación pipeta 1 ml 0,00095 ml 0,00095

u +
2
2
( STD3)
/ CSTD 3 = ( u(
FBT ) / Cc(
FBT )) + ( u(
pipeta 1)
/ X p ) ( u(
pipeta 2 ) / X p
u ( STD 3 ) / CcSTD 3 = 0,0148937825
u ( STD3)
=
0,0007446891
Incertidumbre expandida
mg/ml
U ( STD3)
= k ⋅u(
STD3)
con k = 2
U ( STD3)
= 0,00148937 83 mg / ml ≅ 0,
0015mg
/ ml
Preparación de calibradores de fenobarbital
Identificación de las fuentes de incertidumbre
1- Incertidumbre estándar 4 (STD4)
2- Dosificación con pipeta
1 -Incertidumbre del STD4
u(STD 4) = 0,0014833063
mg/ml con k = 2
U ( STD4)
= 0,00296661 26 mg / ml ≅ 0,
0030mg
/ ml
2 -Dosificación pipeta
1- 0,250 ml STD4
2- 0,750ml plasma libre de droga
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p1000 / 200 a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
0019ml
con k = 2
u
( pipeta)
= 0,00095ml
59
)
2

Combinación del nivel 2
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u ( STD4)
= 0,0014833063
mg/ml
2- Dosificación pipeta.
Concentración del estándar en su segundo nivel ( CSTD 2 ) :
CSTD 2 = 0,
025mg
/ ml
Tabla IV.3c- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 2
Nivel 2
CcFBT
u +
2
2
( STD 2)
/ CSTD 2 = ( u(
FBT ) / Cc(
FBT )) + ( u(
pipeta1)
/ X p ) ( u(
pipeta 2 ) / X p
u ( STD2)
/ CSTD2
= 0,0153643810
u ( STD2)
=
Descripción
Concentración del estándar
de calibración (nivel 4)
0,0003841095
mg/ml
Incertidumbre expandida
U ( STD2)
= k ⋅u(
STD2)
con k = 2
U ( STD2)
= 0,0007682190
mg/ml ≅ 0,
00077mg
/ ml
Preparación de calibradores de fenobarbital
Identificación de las fuentes de incertidumbre
1- Incertidumbre estándar 4 (STD4)
2- Dosificación con pipeta.
1 -Incertidumbre del STD4
Valor
0.1 mg/ml
u(STD 4) = 0,0014833063
mg/ml con k = 2
U ( STD4)
= 0,0029666 mg / ml ≅ 0,
0030mg
/ ml
Incertidumbre
estándar
0,0014833 mg/ml
60
Incertidumbre
estándar relativa
0,014833
X p Dosificación pipeta 0,250 ml 0,00095 ml 0,0038
X p Dosificación pipeta 0,750 ml 0,00095 ml 0,001266667
)
2

2 - Dosificación pipeta
1- 0,875 ml Plasma libre de droga
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p1000 / 200 a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
0019ml
con k = 2
u ( pipeta)
= 0,00095ml
2- 0,125 ml del nivel 4
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p200 / 50a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
00033ml
con k = 2
u ( pipeta)
= 0,000165ml
Combinación del nivel 1
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u (STD4)
= 0,00150 mg/ml
2- Dosificación pipeta
Concentración del estándar en su segundo nivel (CSTD 1)
:
( CSTD 1)
=
0,
0125mg
/ ml
61

Tabla IV.3d- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 1
Nivel 1
Descripción
u +
2
2
( STD1)
/ CSTD1
= ( u(
FBT ) / Cc(
FBT )) + ( u(
pipeta1)
/ X p ) ( u(
pipeta 2 ) / X p
u ( STD1)
/ CSTD1
=
u (STD1)
= 0,00018664
0,0149312067
Incertidumbre expandida
mg/ml
Valor
0,1 mg/ml
U ( STD1
) = k u(
STD1
) con k = 2
U ( STD1)
= 0,00037328 02 mg / ml = 0,
00038mg
/ ml
Se prepararan varios niveles de concentración de los estándares para confeccionar
una curva de calibración, cumpliendo con la función y = ax + b (regresión lineal).
Tabla IV.4- Incertidumbres a distintos niveles de concentración
62
Incertidumbre
estándar
Incertidumbre
estándar relativa
CcFBT Concentración del estándar
de calibración (nivel 4)
0,.0014833 mg/ml 0,014833
Xp Dosificación pipeta 0,125 ml 0,000165 ml 0,00132
Xp Dosificación pipeta 0,875 ml 0,00095 ml 0,0010857143
Nivel
Valor de
concentración
mg/ml
Incertidumbre
combinada
mg/ml
Incertidumbre
expandida
mg/ml
Patrón 1,000 ±0,015 ±0,029 2,9
4 0,1000 ±0,0015 ±0,0030 3
3 0,05000 ±0,00074 ±0,0015 3
2 0,02500 ±0,00038 ±0,00077 3,08
1 0,01250 ±0,00019 ±0,00038 3,04
Incertidumbre
relativa
%
)
2

IV.2.3 PRÁCTICA DE CARBAMAZEPINA
IV.2.3.A Introducción
La carbamazepina (figura IV.2) es un derivado del iminoestilbeno con un grupo
carbonilo, el cual es esencial para su efecto antiepiléptico. Tiene relación química con
los antidepresivos tricíclicos. Es prácticamente insoluble en agua y éter, soluble 1 en
10 de alcohol y en 1 en 10 de cloroformo, soluble en acetona. 15
La carbamazepina es un agente efectivo para controlar la epilepsia y tratar la
neuralgia del trigémino, las enfermedades maníacodepresivas y los pacientes que
presenten crisis convulsivas generalizadas tónicoclónicas 16 . Debido a su extendido
uso se debe disponer (en lo posible) de parámetros farmacocinéticas adecuados para
establecer los diferentes regímenes terapéuticos, y que estos sean los adecuados
para el tratamiento de las distintas patologías.
FIGURA IV.7 - Estructura molecular de carbamazepina
El procedimiento utilizado para determinar los niveles séricos de carbamazepina para
control de los niveles circulantes en pacientes tratados en estado estacionario o en
estudios de biodisponibilidad, mediante cromatografía líquida de alta presión y la
preparación de soluciones patrón y calibradores destinadas a dichos efectos será
15 Wedlund P, Levy R. Time-Dependent Kinetics VII: Effect of Diurnal Oscilations on the Time
Course of Carbamazepine Autoinduction in the Rhesus Monkey. J Pharmaceut Sci. 1983.
16 Goodman y Gilman, “Las bases farmacológicas de la terapéutica”, editado por J.G. Hardman y L.
Limbird, McGraw-Hill, décima edición, 2003, Vol. 1,
63

descripto en el procedimiento operativo estándar (POE) “Práctica fenobarbital”
(Anexo Nº 2) y las actividades derivadas de dicho instructivo se presentan a
continuación:
IV.2.3.B PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN PATRÓN DE CARBAMAZEPINA
Paso 1: Definición del mensurando
Se efectúa la preparación de una solución patrón de carbamazepina para
determinación de HPLC a partir de una droga de alta pureza, según los pasos
detallados en la Figura 1
CcCBZ = ( m.
p / V )
CcCBZ: concentración del estándar de calibración [generalmente en mg/ml]
m: masa del estándar de alta pureza [generalmente en mg]
p: pureza estándar
V: volumen del líquido del estándar de calibración [generalmente en ml]
Figura IV.8 - Preparación de un estándar de calibración
64

Paso 2: Identificación de las fuentes de incertidumbre
Se confecciona una lista completa de las fuentes relevantes de incertidumbre. Para
visualizarlo de forma clara se realizará un diagrama causa-efecto de Ishikawa o
espina de pescado como el representado en la figura 2
Figura IV.9- Diagrama causa-efecto para identificación de fuentes de incertidumbre
Paso 3: Cuantificación de la incertidumbre de cada fuente
Se estima la incertidumbre total, para ello se consideran todas las fuentes de
incertidumbre que puedan ser significativas y se obtendrá la contribución individual
de cada una de ellas. Además se calcula la incertidumbre estándar, mediante el
cociente entre dicha incertidumbre y un factor de cobertura que depende de la
distribución asumida y el intervalo de confianza correspondiente (Ver tabla 1–
Distribuciones estadísticas e incertidumbres asociadas (capítulo II))
65

(1) Pureza
Se analiza la pureza de la droga mediante datos del fabricante; a saber:
pureza superior al 99%
En el certificado del fabricante no declara la incertidumbre de la pureza, por lo tanto
se toma la peor situación. ∆p = 1 % = 0,
01
Pureza = ( 99 ± 1)%
Pureza = ( 0,
99 ±
0,
01)
Por no tener información del tipo de distribución se asume una distribución
rectangular, al considerar el peor caso; por lo tanto k = 3 .
u ( p)
= ∆p
/ k
u(
p)
=
u(p): incertidumbre estándar debido a la pureza de la droga
u ( p)
= 0,0057735
Tabla IV.5a- Tabla de valores e incertidumbres
(2) Masa
0,
01/
Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
Valor estándar
estándar relativa
P Pureza 0,99 0,0057735 0,00583182
Se pesan 5 mg de la droga para su posterior disolución y dilución;
y las fuentes de incertidumbre tenidas en cuenta serán las siguientes:
1- Repetibilidad
2- Resolución digital
3- Calibración
El efecto combinado de la incertidumbre se puede evidenciar en el ensayo de
linealidad que muestra el certificado.
u(
m)
= 0,
00013
u(
m)
= 0,
13mg
3
g
66

Las pesadas asumen una distribución normal por lo tanto, con k = 2
u(
m)
=
Sm / k
u(
m)
= 0,
13mg
u(m): incertidumbre estándar debido a la masa de la droga
u( m)
= 0,
065mg
Tabla IV.5b -Tabla de valores e incertidumbres
Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
Valor mg estándar mg estándar relativa
m Masa 5 0,065 0,013
(3) Volumen
Existen tres fuentes de incertidumbre a ser consideradas en la obtención del volumen
deseado:
1- Incertidumbre del matraz aforado de 5 ml
2- Variación en el llenado del matraz
3- Diferencias de temperatura
3-1- Calibración
En el certificado del fabricante se declara:
Valor nominal: 5 ml
Tolerancia: 0,025 ml
Temperatura: 20.00 º C / 68 º F
Y la incertidumbre expresada en la tolerancia será:
u(
V ) = ∆v
/ k
1
u(
V ) = 0,
025ml
/
1
u (V ) 1
/ 2
6
= 0,0102062
3-2- Repetibilidad
ml
Valor nominal: 5,006 ml
Se asume distribución triangular con k = 6
67

La repetibilidad está representada por la magnitud estadística: desviación estándar
δ V = 0,
013ml
u V ) = v / k
Con k = 2
( 2 δ
u ( V ) 2 = 0,
013m
/ 2
3-3-Temperatura
= 0,0065 ml
Se expresará la incertidumbre debida a la variabilidad térmica estimada:
Volumen V =5 ml
Variación de temperatura ∆ T = ± 2º
C
- 4
Coeficiente de expansión térmica del agua α = 2, 110 º C
Variación del volumen ∆V = ± V ⋅ ∆T
⋅α
−4
∆ V = ± 5ml ⋅ 2º
C ⋅ 2,
110 º C
∆ V =
2,
110
− 3
ml
Asumiendo una distribución rectangular,
u ( V ) 3 V / k ∆ = con 3 = k
u (V ) 3 = 0,00121
ml
1
Procedemos a combinar las incertidumbres individuales relativas al volumen.
2
1
2
2
u ( V ) = ( u(
V ) + u(
V ) + u(
V )
2
2
2
( V ) = 0,
0102062072ml
+ 0,0065 ml 0,
0012124355ml
2
3
u +
u (V): incertidumbre estándar debido al volumen de la droga
u (V ) = 0,0121608659
ml
Tabla IV.5c -Tabla de valores e incertidumbres
Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
Valor ml estándar ml estándar relativa
V Volumen 5 0,0121608659 0,0024321731
68
-1

Paso 4: Cálculo de la incertidumbre combinada
La incertidumbre combinada está dada por la raíz cuadrada de la suma de los
cuadrados de todas las fuentes; o sea las fuentes de incertidumbre se propagan
cuadráticamente.
Se combinan las incertidumbres en su expresión relativa, para obtener índices
provenientes de distintas fuentes de incertidumbre adimensionales, por lo tanto
combinables.
u +
2
2
( CBZ)
/ CcCBZ = ( u(
p)
/ p0
) + ( u(
m)
/ m0)
( u(
V ) / V0
CcCBZ = ( m ⋅ p / V )
CcCBZ = 5mg
⋅ 0,
99 / 5ml
= 0,
99mg
/ ml
u
2
2
( CBZ)
/ CcCBZ = ( 0,005773505
/ 0,99) + ( 0,
065mg
/ 5mg)
+ ( 0,0121608659
ml / 5ml
-5
u ( CBZ ) / CcCBZ = 3,40101 10 + 0,000169 + 0,0000059154
= 0,014454
Incertidumbre combinada
u (CBZ)
= 0,0144542577 ⋅0,99
mg/ml
u( CBZ ) = 0,0143097151
mg/ml
Paso 5: Cálculo de la incertidumbre expandida
Se obtiene multiplicando la incertidumbre por un factor de cobertura K, el cual
depende de la probabilidad de contener al valor verdadero y de la distribución
asumida.
Incertidumbre expandida
U ( CBZ ) = k ⋅u(
CBZ ) con k = 2
U (CBZ)
= 2 ⋅ 0,0143097151
mg/ml
U ( CBZ ) = 0,0286194 mg/ml ≅ 0,029 mg/ml
Redondeando a la segunda (2da) cifra significativa. Ver VI.4.3.
69
)
2
)
2

Tabla IV.6- Tabla de valores e incertidumbres
A B C D E
1 P M V
2 Valor 0,99 5,000 5,000
3 Incertidumbre 0,005773505 0,065 0,0121608659
4
5 P 0,99 0,995773505 0,99 0,99
6 m 5,000 5,000 5.065 5,000
7 V 5,000 5,000 5,000 5,0121608659
8
9 Cc 0,99 0,995773505 1,00287 0,98665
10 u(y,xi) 0,005773505 0,01287 -0,00335
11 u(y)²,u(y,xi)² 0,0002101928 0,0000333334 0,0001656369 0,0000112225
12
13 u(CcCBZ) 0,014498027 U(CcCBZ) 0,028996055 ≅0,029
Gráfico IV.10 - Contribuciones de las incertidumbres al estándar de calibración
p
v
m
U(Cc)
0 0,005 0,01 0,02 0,04 0,08
u(y,xi) (mg.ml-¹)
70

IV.2.3.C Preparación de calibradores de carbamazepina
Se efectúa la preparación del calibrador de nivel 4 de carbamazepina a partir del
estándar patrón.
FIGURA IV.11 – Preparación de calibradores nivel 4 carbamazepina
Identificación de las fuentes de incertidumbre:
1- Incertidumbre estándar del patrón
2- Dosificación con pipeta
3- Volumen
1- Incertidumbre estándar del patrón
u( CBZ ) = 0,0143097151
mg/ml
U (CBZ)
= 0,0286194302 mg/ml ≅
2- Dosificación con pipeta
0.029mg/ml
Se emplea monopipeta monocanal de volumen variable.
71

Gilson / P200 / 50-200 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
00033ml
con k = 2
u( pipeta)
= 0,
00033ml
/ 2
u ( pipeta)
= 0,000165ml
3- Volumen
1- Incertidumbre de cerificado del matraz aforado de 5ml
2- Variación en el llenado del matraz
3- Diferencias de temperatura.
3-1- Calibración
El certificado del fabricante declara:
Valor nominal V 0 = 5 ml
Tolerancia= 0,025 ml
Temperatura= 20,00º C / 68,00º F
La incertidumbre asociada a la tolerancia asume una distribución
triangular k = 6
u V ) = ∆V
/ k = 0,
025ml
/
( 1
u ( V1)
= 0,0102062
3-2- Repetibilidad
ml
6
La repetibilidad está representada por la magnitud estadística: desviación
estándar δ v = 0,
013ml
u V ) = v / k
con k = 2
( 2 δ
u
( V ) 2 = 0,
013m
/ 2
= 0,0065 ml
72

3-3- Temperatura
Volumen V0 5ml
=
Variación de la temperatura: ∆ T = ± 2º
C
- 4
Coeficiente de expansión térmica del agua α = 2,
110 º C
Variación del volumen v = ± V ∆Tα
∆ 0
-3
∆ V = 2,
110 ml Con = 3
u V ) = ∆V
/ k
( 3
u ( V3)
= 0,00121243
ml
Cálculo de la incertidumbre combinada
u v)
= u(
V ) + u(
V ) + u(
V )
=
( 1 2 3
73
−1
k (distribución rectangular)
2
2
2 2
( 0,01020620 72 + 0,
0065 + 0,00121243 ) ml
= 0,01216086
ml
Combinación del nivel 4
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u(CBZ) = 0,0144822961
mg/ml
2- Dosificación pipeta u ( pipeta)
= 0,000165 ml
3- Volumen u ( V ) = 0,01216086 ml
Concentración del estándar en su cuarto nivel (CSTD 4)
:
CSTD 4 = 0,
02mg
/ ml
Tabla IV.7a- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 4
Nivel 4 Descripción
Cc Concentración del
estándar de calibración
Valor
0,99
mg/ml
Incertidumbre Incertidumbre
estándar
estándar relativa
0,0144822961 mg/ml 0,0146285819
X p Dosificación pipeta 0,1 ml 0,000165 ml 0,00165
V Volumen 5 ml 0,01216086 ml 0,002432172
Se llevan las expresiones a incertidumbres relativas para comparar magnitudes heterogéneas

u +
2
2
( STD4)
= u(
CBZ ) + u(
pipeta)
u(
V
u p +
2
2
( STD4)
/ CSTD4
= ( u(
CBZ ) / C(
CBZ )) + ( u(
pipeta)
/ X ) ( u(
V ) / V0
u ( STD4)
= 0,0149209014
0,
02 mg / ml
u ( STD4)
= 0,0002984 mg / ml
No redondear el valor de la incertidumbre hasta calcularla en su expresión expandida.
Incertidumbre expandida
U ( STD4)
= k u(
STD4)
con k = 2
U ( STD4)
= 0,000596 mg / ml ≅ 0,
0006mg
/ ml
Preparación de calibradores de carbamazepina
)
2
Se efectúa la preparación de los calibradores de los niveles 3, 2 y 1 de
carbamazepina a partir del estándar de nivel 4.
FIGURA IV.12 – Preparación de calibradores niveles 3, 2, 1 carbamazepina.
Identificación de las fuentes de incertidumbre
1- Incertidumbre estándar 4 (STD4)
2- Dosificación con pipeta
Pipeteo de STD4
Pipeteo de
plasm a
Resultado
74
)
2

1 -Incertidumbre del STD4
u(STD 4) = 0,0002984180
mg/ml con k = 2
U ( STD4)
= 0,000596 mg / ml ≅ 0,
00060mg
/ ml
2 -Dosificación pipeta
1- 1ml STD4
2- 1ml plasma libre de droga
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p1000 / 200 a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
0019ml
con k = 2
u ( pipeta)
= 0,00095ml
Combinación del nivel 3
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u (STD4)
= 0,001483 mg/ml
2- Dosificación pipeta
Concentración del estándar en su tercer nivel ( CSTD 3 ) :
CSTD 3 = 0,
01mg
/ ml
Tabla IV.7b- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 3
Incertidumbre
estándar
75
Incertidumbre
estándar relativa
Nivel 3 Descripción
Concentración del estándar
Valor
CcCBZ de calibración (nivel 4) 0,02mg/ml 0,00030mg/ml 0,015
Xp Dosificación pipeta 1 ml 0,00095 ml 0,00095
Xp Dosificación pipeta 1 ml 0,00095 ml 0,00095

u +
2
2
( STD3)
/ CSTD 3 = ( u(
CBZ ) / Cc(
CBZ )) + ( u(
pipeta 1)
/ X p ) ( u(
pipeta 2 ) / X p
u ( STD3)
/ CcSTD3
= 0,0150600465
u ( STD3)
=
0,0001506005
mg/ml
Incertidumbre expandida
U ( STD3)
= k ⋅u(
STD3)
con k = 2
U ( STD3)
= 0,00030120 093 mg / ml ≅ 0,
00030mg
/ ml
Preparación de calibradores de carbamazepina
Identificación de las fuentes de incertidumbre
1- Incertidumbre estándar 4 (STD4)
2- Dosificación con pipeta
1- Incertidumbre del STD4
u(STD 4) = 0,0002984180
mg/ml con k = 2
U ( STD4)
= 0,000596 mg / ml ≅ 0,
00060mg
/ ml
2- Dosificación pipeta
1- 0,250 ml STD4
2- 0,750ml plasma libre de droga
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p1000 / 200 a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
76
)
2

3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
0019ml
con k = 2
u ( pipeta)
= 0,00095ml
Combinación del nivel 2
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u (STD4)
= 0,0014833 mg/ml
2- Dosificación pipeta.
Concentración del estándar en su segundo nivel ( CSTD 2 ) :
CSTD 2 = 0,
005mg
/ ml
Tabla IV.7c- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 2
u +
2
2
( STD 2)
/ CSTD 2 = ( u(
CBZ ) / Cc(
CBZ )) + ( u(
pipeta1)
/ X p ) ( u(
pipeta 2 ) / X p
u ( STD2)
/ CSTD2
= 0,015524318
u ( STD2)
=
0,
00007762
Incertidumbre expandida
mg/ml
U ( STD2)
= k ⋅u(
STD2)
con k = 2
Incertidumbre
estándar
U ( STD2)
= 0,
000155243mg/m
l ≅ 0,
00016mg
/ ml
Preparación de calibradores de carbamazepina
77
Incertidumbre
estándar relativa
Nivel 2 Descripción
Concentración del estándar
Valor
CcCBZ de calibración (nivel 4) 0,02 mg/ml 0,0003 mg/ml 0,015
Xp Dosificación pipeta 0,250 ml 0,00095 ml 0,0038
Xp Dosificación pipeta 0,750 ml 0,00095 ml 0,00126667
)
2

Identificación de las fuentes de incertidumbre
1- Incertidumbre estándar 4 (STD4)
2- Dosificación con pipeta.
1 -Incertidumbre del STD4
u(STD 4) = 0,0002984 mg/ml con k = 2
U ( STD4)
= 0,000596 mg / ml ≅ 0,
00060mg
/ ml
2 -Dosificación pipeta
1- 0,875ml plasma libre de droga
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p1000 / 200 a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
0019ml
con k = 2
u ( pipeta)
= 0,00095ml
2- 0,125 ml del nivel 4
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p200 / 50a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
00033ml
con k = 2
u
( pipeta)
= 0,000165ml
78

Combinación del nivel 1
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u (STD4)
= 0,0015027978
mg/ml
2- Dosificación pipeta
Concentración del estándar en su segundo nivel (CSTD 1)
:
( CSTD 1)
= 0,
0025mg
/ ml
Tabla IV.7d- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 1
Nivel 1
CcCBZ
u +
2
2
( STD1)
/ CSTD1
= ( u(
CBZ ) / Cc(
CBZ )) + ( u(
pipeta 1)
/ X p ) ( u(
pipeta 2 ) / X p
u ( STD1)
/ CSTD1
=
u ( STD1)
=
Descripción
Concentración del estándar
de calibración (nivel 4)
0.
0000377426
0,0150970585
Incertidumbre expandida
mg/ml
Valor
0,02mg/ml
Incertidumbre
estándar
0,0003 mg/ml
U ( STD1
) = k u(
STD1
) con k = 2
U ( STD1)
= 0,
0000754853
mg / ml ≅ 0,
000076mg
/ ml
Se prepararan varios niveles de concentración de los estándares para confeccionar
una curva de calibración, cumpliendo con la función y = ax + b (regresión lineal).
Tabla IV.8- Incertidumbres a distintos niveles de concentración
79
Incertidumbre
estándar relativa
0,015
X p Dosificación pipeta 0,125 ml 0,000165 ml 0,00132
X p Dosificación pipeta 0,875 ml 0,00095 ml 0,001085714
Nivel
Valor de
concentración
mg/ml
Incertidumbre
combinada
mg/ml
Incertidumbre
expandida
mg/ml
Patrón 1,000 ±0,015 ±0,029 2,9
4 0,02000 ±0,00030 ±0,00060 3
3 0,01000 ±0,00015 ±0,00030 3
2 0,005000 ±0,000078 ±0,00016 3,2
1 0,002500 ±0,000038 ±0,000076 3
Incertidumbre
relativa
%
)
2

IV.2.4 PRÁCTICA DE DIFENILHIDANTOÍNA
IV.2.4.A INTRODUCCIÓN
La difenilhidantoína (figura IV.3) es un antiepiléptico potente no sedante, indicado en
crisis parciales y crisis tonicocilónicas. Ejerce un efecto estabilizador sobre las
membranas excitables de diversas células, incluso neuronas y miocitos cardíacos.
Puede reducir los flujos de reposo del Na+ así como las corrientes de éste que fluyen
durante los potenciales de acción o la despolarización inducida químicamente. Su
capacidad para reducir la duración de las posdescargas y limitar la propagación de la
crisis es más pronunciada que su efecto sobre el umbral de estimulación (o sea que
puede prevenir la diseminación del foco más que abolir su descarga convulsiva). Sus
características farmacocinéticas están afectadas por su limitada solubilidad en agua y
por la eliminación dependiente de la dosis. La absorción luego de la administración
oral es lenta, variable y en ocasiones incompleta. Es el fármaco por excelencia en
crisis generalizadas y parciales (las inducidas por electroshock máximo).
Tiene un mecanismo de acción muy complejo actuando principalmente sobre los
canales iónicos: es capaz (no siempre) de anular las descargas del foco o la
trasmisión del impulso actuando fundamentalmente sobre los canales de Na+.
También actúa disminuyendo o bloqueando la liberación del neurotrasmisor actuando
sobre los canales de calcio (aunque su acción fundamental es sobre los canales de
sodio).
FIGURA IV.13 - Estructura molecular de difenilhidantoína
80

El procedimiento utilizado para determinar los niveles séricos de difenilhidantoína
para control de los niveles circulantes en pacientes tratados en estado estacionario o
en estudios de biodisponibilidad, mediante cromatografía liquida de alta presión y la
preparación de soluciones patrón y calibradores destinadas a dichos efectos será
descripto en el procedimiento operativo estándar (POE) “Práctica fenobarbital”
(Anexo Nº 3) y las actividades derivadas de dicho instructivo son:
IV.2.4.B PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN PATRÓN DE DIFENILHIDANTOÍNA
Paso 1: Definición del mensurando
Se efectúa la preparación de una solución patrón de difenilhidantoína para
determinación de HPLC a partir de una droga de alta pureza, según los pasos
detallados en la figura 1.
CcDFH = ( m.
p / V )
CcDFH: concentración del estándar de calibración [Generalmente en mg/ml]
m: masa del estándar de alta pureza [Generalmente en mg]
p: pureza estándar
V: volumen del líquido del estándar de calibración [Generalmente en ml]
81

Figura IV.14 - Preparación de un estándar de calibración
Paso 2: Identificación de las fuentes de incertidumbre
Se confecciona una lista completa de las fuentes relevantes de incertidumbre. Para
visualizarlo de forma clara se realizará un diagrama causa-efecto de Ishikawa o
espina de pescado como el representado en la figura 2
Figura IV.15- Diagrama Causa-efecto para identificación de fuentes de incertidumbre
82

Paso 3: Cuantificación de la incertidumbre de cada fuente
Se estima la incertidumbre total, para ello se consideran todas las fuentes de
incertidumbre significativas y se obtendrá la contribución individual de cada una de
ellas. Además se calcula la incertidumbre estándar, mediante el cociente entre dicha
incertidumbre y un factor de cobertura que depende de la distribución asumida y el
intervalo de confianza correspondiente (Ver tabla 1– Distribuciones estadísticas e
incertidumbres asociadas (capítulo II))
(1) Pureza
Se analiza la pureza de la droga mediante datos del fabricante; a saber:
pureza superior al 99%.
En el certificado del fabricante no declara la incertidumbre de la pureza, por lo tanto
se toma la peor situación. ∆p = 1 % = 0,
01
Pureza = ( 99 ± 1)%
Pureza = ( 0,
99 ±
0,
01)
Por no poseer información del tipo de distribución se asume una distribución
rectangular, al considerar el peor caso con k = 3 .
u ( p)
= ∆p
/ k
u(
p)
=
u(p): incertidumbre estándar debido a la pureza de la droga
u ( p)
= 0,0057735
Tabla IV.9a- Tabla de valores e incertidumbres
Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
Valor estándar
estándar relativa
P Pureza 0,99 0,0057735 0,00583182
(2) Masa
0,
01/
3
Se pesan 5 mg de la droga para su posterior disolución y dilución;
y las fuentes de incertidumbre tenidas en cuenta serán las siguientes:
1- Repetibilidad
83

2- Resolución digital
3- Calibración
El efecto combinado de la incertidumbre se puede evidenciar en el ensayo de
linealidad que muestra el certificado.
u(
m)
= 0,
00013
u(
m)
= 0,
13mg
g
Las pesadas asumen una distribución normal, con k = 2
u(
m)
=
Sm / k
u(
m)
= 0,
13mg
/ 2
u(m): incertidumbre estándar debido a la masa de la droga
u( m)
= 0,
065mg
Tabla IV.9b - Tabla de valores e incertidumbres
Valor Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
mg estándar mg estándar relativa
m Masa 5 0,065 0,013
(3) Volumen
Existen tres fuentes de incertidumbre a ser consideradas en la obtención del volumen
deseado:
1- Incertidumbre del matraz aforado de 5 ml
2- Variación en el llenado del matraz
3- Diferencias de temperatura
3-1- Calibración
En el certificado del fabricante se declara:
Valor nominal= 5 ml
Tolerancia= 0,025 ml
Temperatura= 20,00 º C / 68,00 º F
Y la incertidumbre expresada en la tolerancia será:
84

u(
v)
1
u(
v)
1
u (v)
1
= ∆v
/ k
= 0,
025ml
/
6
= 0,0102062
3-2- Repetibilidad
ml
Valor nominal: 5.006 ml
Se asume distribución triangular, con k = 6
La repetibilidad está representada por la magnitud estadística: desviación estándar
δ v = 0,
013ml
u v)
= v / k
con k = 2
( 2 δ
u ( v)
2 = 0,
013m
/ 2
3-3-Temperatura
= 0,0065 ml
Se expresará la incertidumbre debida a la variabilidad térmica estimada:
Volumen V = 5 ml
Variación de temperatura ∆ T = ± 2º
C
Coeficiente de expansión térmica del agua α = 2,
110
Variación del volumen ∆ V = ± V∆Tα
∆ V = ±
∆ V
−4
-1
5ml ⋅ 2º
C ⋅ 2,
110 º C
= 2,
110
-3
ml
Asumiendo una distribución rectangular,
u ( V ) 3 V / k ∆ = con 3 = k
u (V ) 3
= 0,0012124
ml
Procedemos a combinar las incertidumbres individuales relativas al volumen.
2
1
2
2
u ( V ) = ( u(
V ) + u(
V ) + u(
V )
2
3
u +
85
- 4
º
2
2
2
( V ) = 0,
0102062072ml
+ 0,0065 ml 0,
0012124355ml
u (V): incertidumbre estándar debido al volumen de la droga
u
(V ) = 0,01216 ml
C
−1

Tabla IV.9c -Tabla de valores e incertidumbres
Incertidumbre Incertidumbre
Descripción
Valor ml estándar ml estándar relativa
V Volumen 5 0,0121608659 0,0024321731
Paso 4: Cálculo de la incertidumbre combinada
La incertidumbre combinada está dada por la raíz cuadrada de la suma de los
cuadrados de todas las fuentes (o sea las fuentes de incertidumbre se propagan
cuadráticamente).
Se combinan las incertidumbres en su expresión relativa, para obtener índices
provenientes de distintas fuentes de incertidumbre adimensionales( por lo tanto
combinables).
u +
2
2
( DFH ) / CcDFH = ( u(
p)
/ p0
) + ( u(
m)
/ m0
) ( u(
V ) / V0
CcDFH = ( m ⋅ p / V )
CcDFH = 5mg
⋅ 0,
99 / 5ml
= 0,
99mg
/ ml
2
u ( DFH)
/ CcDFH = ( 0,0057735 / 0,99) + ( 0 , 065mg
/ 5 mg)
+ ( 0,0121608659
ml / 5 ml )
u ( DFH ) / CcDFH
= 0,0144542577
=
Incertidumbre combinada
u (DFH)
-5
3,4010110
= 0,0144542577 ⋅0,99
mg/ml
u( DFH ) = 0,0143097 mg/ml
86
2
+ 0,000169 +
Paso 5: Cálculo de la incertidumbre expandida
)
2
0,0000059154
Se obtiene multiplicando la incertidumbre por un factor de cobertura K, el cual
depende de la probabilidad de contener al valor verdadero y de la distribución
asumida.
2

Incertidumbre expandida
U ( DFH ) = k ⋅u(
DFH ) con k = 2
U (DFH ) = 2 ⋅ 0,0143097
mg/ml
U ( DFH ) = 0,0286194302
mg/ml ≅ 0,029 mg/ml
Redondeando a la segunda (2da) cifra significativa. Ver VI.4.3.
Tabla IV.10- Tabla de valores e incertidumbres
A B C D E
1 P M V
2 Valor 0,99 5,000 5,000
3 Incertidumbre 0,005773505 0,065 0,0121608659
4
5 P 0,99 0,995773505 0,99 0,99
6 m 5,000 5,000 5,065 5,000
7 V 5,000 5,000 5,000 5,0121608659
8
9 Cc 0,99 0,995773505 1,00287 0,98665
10 u(y,xi) 0,005773505 0,01287 -0,00335
11 u(y)²,u(y,xi)² 0,0002101928 0,0000333334 0,0001656369 0,0000112225
12
13 u(Cc DFH ) 0,014498027 U(CcDFH) 0,028996055 ≅0,029
Gráfico IV.16- Contribuciones de las incertidumbres al estándar de calibración
p
v
m
U(Cc)
0 0,005 0,01 0,02 0,04 0,08
u(y,xi) (mg.ml -¹)
87

IV.2.4.C Preparación de calibradores de difenilhidantoína
Se efectúa la preparación del calibrador de nivel 4 de difenilhidantoína a partir del
estándar patrón.
FIGURA IV.17 – Preparación de calibradores nivel 4 difenilhidantoína.
Identificación de las fuentes de incertidumbre:
1- Incertidumbre estándar del patrón
2- Dosificación con pipeta
3- Volumen
1- Incertidumbre estándar del patrón
u(DFH) = 0,0143097mg/ml
U (DFH)
= 0,0286194302 mg/ml ≅ 0,029mg/ml
2- Dosificación con Pipeta
Se emplea monopipeta monocanal de volumen variable.
Gilson / P200 / 50-200 µl
88

El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0.
00033ml
con k = 2
u( pipeta)
= 0,
00033ml
/ 2
u ( pipeta ) = 0,000165ml
3- Volumen
• Incertidumbre de cerificado del matraz aforado de 5ml
• Variación en el lenado del matraz
• Diferencias de temperatura.
3-1- Calibración
El certificado del fabricante declara:
Valor nominal V 0 =5 ml
Tolerancia= 0,025 ml
Temperatura= 20,00º C / 68,00º F
La incertidumbre asociada a la tolerancia asume una distribución
Triangular, con k = 6
u V ) = ∆V
/ k = 0.
025ml
/
( 1
u ( V1)
= 0,0102062072
ml
3-2- Repetibilidad
6
La repetibilidad está representada por la magnitud estadística: desviación
estándar δ v = 0.
013ml
u v)
= v / k
con k = 2
( 2 δ
u
( v)
2 = 0,
013m
/ 2
= 0,0065 ml
89

3-3- Temperatura
Volumen V0 5ml
=
Variación de la temperatura= ∆ T = ± 2º
C
- 4
Coeficiente de expansión térmica del agua α = 2,
110 º C
Variación del volumen v = ± V ∆Tα
∆ 0
-3
∆ V = 2,
1x10
ml con = 3
u V ) = ∆V
/ k
( 3
u ( V3
) = 0,00121243
ml
Cálculo de la incertidumbre combinada
u V ) = u(
V ) + u(
V ) + u(
V )
=
( 1 2 3
90
−1
k (distribución rectangular)
2
2
2 2
( 0,01020620 72 + 0,
0065 + 0,00121243 ) ml
= 0,01216 ml
Combinación del nivel 4
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u( DFH ) = 0,0144822961mg/ml
2- Dosificación pipeta u ( pipeta ) = 0,000165ml
3- Volumen u (V ) = 0,0121608600
ml
Concentración del estándar en su cuarto nivel (CSTD 4)
:
CSTD 4 = 0,
025mg
/ ml
Tabla IV.11a- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 4
Incertidumbre Incertidumbre
Nivel 4 Descripción
Valor estándar
estándar relativa
Cc Concentración del 0.99 mg/ml 0,0144822961 mg/ml 0,01462858
Xp estándar de calibración
Dosificación pipeta 0,125 ml 0,000165 ml 0,00132
V Volumen 5 ml 0,0121608600 ml 0,002432
Se llevan las expresiones a incertidumbres relativas para comparar magnitudes heterogéneas

u +
2
2
( STD4)
= u(
DFH ) + u(
pipeta)
u(
V
u p +
2
2
( STD4)
/ CSTD4
= ( u(
DFH ) / C(
DFH )) + ( u(
pipeta)
/ X ) ( u(
V ) / V0
u ( STD4)
/ CSTD4
= 0,014888024
u ( STD4)
= 0,0003722 mg / ml
No redondear el valor de la incertidumbre hasta calcularla en su expresión expandida.
Incertidumbre expandida
U ( STD4)
= k u(
STD4)
con k = 2
U ( STD4)
= 0,00074440 1 mg / ml ≅ 0,
00075mg
/ ml
Preparación de calibradores de difenilhidantoína
)
2
Se efectúa la preparación de los calibradores de los niveles 3, 2 y 1 de
difenilhidantoína a partir del estándar de nivel 4.
FIGURA IV.18 – Preparación de calibradores niveles 3, 2, 1 difenilhidantoína
Identificación de las fuentes de incertidumbre
1- Incertidumbre estándar 4 (STD4)
2- Dosificación con pipeta
91
)
2

1 -Incertidumbre del STD4
u(STD 4) = 0,0002984180
mg/ml con k = 2
U ( STD4)
= 0,000596 mg / ml ≅ 0,
00060mg
/ ml
2 -Dosificación pipeta
1- 1ml STD4
2- 1ml plasma libre de droga
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p1000 / 200 a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0.
0019ml
con k = 2
u ( pipeta)
= 0,00095 ml
Combinación del nivel 3
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u ( STD4)
= 0,0014833063
mg/ml
2- Dosificación pipeta
Concentración del estándar en su tercer nivel ( CSTD 3 ) :
CSTD 3 = 0,
0125mg
/ ml
Tabla IV.11b- Tabla de valores e incertidumbres del nivel 3
Incertidumbre
estándar
92
Incertidumbre
estándar relativa
Nivel 3 Descripción
Valor
CcDFH Concentración del estándar
de calibración (nivel 4) 0,025mg/ml 0,0003 mg/ml 0,012
Xp Dosificación pipeta 1 ml 0,00095 ml 0,00095
Xp Dosificación pipeta 1 ml 0,00095 ml 0,00095

u +
2
2
( STD3)
/ CSTD 3 = ( u(
DFH ) / Cc(
DFH )) + ( u(
pipeta 1)
/ X p ) ( u(
pipeta 2 ) / X p
u ( STD3)
/ CcSTD3
= 0,012074974
u ( STD3)
= 0,000150937175mg/ml
Incertidumbre expandida
U ( STD3)
= k ⋅u(
STD3)
Con k = 2
U ( STD3)
= 0,00030187 435 mg / ml ≅ 0,
00030mg
/ ml
Preparación de calibradores de difenilhidantoína
Identificación de las fuentes de incertidumbre
1- Incertidumbre estándar 4 (STD4)
2- Dosificación con pipeta
1 -Incertidumbre del STD4
u(STD 4) = 0,0002984180
mg/ml con k = 2
U ( STD4)
= 0,0005960 mg / ml ≅ 0,
0006mg
/ ml
2 -Dosificación pipeta
1- 0,250 mlSTD4
3- 0,750ml plasma libre de droga
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p1000 / 200 a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
± 0,
0019ml
= Con k
= 2
93
)
2

u ( pipeta)
= 0,00095ml
Combinación del nivel 2
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u ( STD4)
= 0,0014833063
mg/ml
2- Dosificación pipeta.
Concentración del estándar en su segundo nivel ( CSTD 2 ) :
CSTD 2 = 0,
00625mg
/ ml
Tabla IV.11c - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 2
u +
2
2
( STD 2)
/ CSTD 2 = ( u(
DFH ) / Cc(
DFH )) + ( u(
pipeta1)
/ X p ) ( u(
pipeta 2 ) / X p
u ( STD2)
/ CSTD2
= 0,0126508707
u ( STD2)
=
0.
000079
mg/ml
Incertidumbre expandida
U ( STD2)
= k ⋅u(
STD2)
con k = 2
U ( STD2)
= 0,
0001581359mg/
ml ≅ 0,
00016mg
/ ml
Preparación de calibradores de difenilhidantoína
Identificación de las fuentes de incertidumbre
1- Incertidumbre estándar 4 (STD4)
2- Dosificación con pipeta.
1 -Incertidumbre del STD4
Incertidumbre
estándar
94
Incertidumbre
estándar relativa
Nivel 2 Descripción
Concentración del estándar
Valor
CcDFH de calibración (nivel 4) 0,025mg/ml 0,0003mg/ml 0,012
Xp Dosificación pipeta 0,250 ml 0,00095ml 0,0038
Xp Dosificación pipeta 0,750 ml 0,00095ml 0,00126667
)
2

u(STD 4) = 0,0002984 mg/ml con k = 2
U ( STD4)
= 0,000596 mg / ml ≅ 0,
00060mg
/ ml
2 -Dosificación pipeta
1- 0,875ml plasma libre de droga
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p1000 / 200 a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
0019ml
con k = 2
u ( pipeta)
= 0,00095ml
2- 0,125 ml del nivel 4
Micropipeta nomocanal de volumen variable
Gilson / p200 / 50a 1000 µl
El certificado considera:
1- Densidad del líquido de referencia utilizado
2- Desvío estándar de las mediciones
3- Condiciones ambientales
u( pipeta)
= ± 0,
00033ml
con k = 2
u ( pipeta)
= 0,000165 ml
Combinación del nivel 1
Factores a considerar:
1- Incertidumbre estándar del patrón u (STD4)
= 0,0015028 mg/ml
2- Dosificación pipeta
Concentración del estándar en su segundo nivel (CSTD 1)
:
95

( CSTD 1)
= 0,
003125mg
/ ml
Tabla IV.11d - Tabla de valores e incertidumbres del nivel 1
Nivel 1
CcDFH
u +
2
2
( STD1)
/ CSTD1
= ( u(
DFH ) / Cc(
DFH )) + ( u(
pipeta 1)
/ X p ) ( u(
pipeta 2 ) / X p
u ( STD1)
/ CSTD1
=
u ( STD1)
=
Descripción
Concentración del estándar de
calibración (nivel 4)
0,
0000378
0,0121211045
mg/ml
Incertidumbre expandida
Valor
0,025mg/ml
U ( STD1
) = k u(
STD1
) con k = 2
U ( STD1)
= 0,
0000757
mg / ml ≅ 0,
000076mg
/ ml
Se prepararan varios niveles de concentración de los estándares para confeccionar
una curva de calibración, cumpliendo con la función y = ax + b (regresión lineal).
Tabla IV.12 - Incertidumbres a distintos niveles de concentración
96
Incertidumbe
estándar
0,0003mg/ml
Incertidumbre
estándar relativa
0,012
X p Dosificación pipeta 0,125 ml 0,000165ml 0,00132
X p Dosificación pipeta 0,875 ml 0,00095ml 0,001085714
Nivel
Valor de
concentración
mg/ml
Incertidumbre
combinada
mg/ml
Incertidumbre
expandida
mg/ml
Incertidumbre
relativa %
Patrón 1,000 ±0,015 ±0,029 2,9
4 0,02500 ±0,00037 ±0,00075 3,0
3 0,01250 ±0,00015 ±0,00030 2,4
2 0,006250 ±0,000079 ±0,00016 2,56
1 0,003125 ±0,000038 ±0,000076 2,432
)
2

IV. 3 CONCLUSIONES
Se ha desarrollado un método para el cálculo de incertidumbre en la preparación de
las soluciones patrones para determinaciones por HPLC sobre base a las directrices
generales de la guía GUM ISO 1995 y EURACHEM e intentando optimizar el cálculo
de la incertidumbre de los equipos e instrumentos de laboratorio (pureza de las
drogas, balanzas, pipetas, material volumétrico, termómetros) y trabajando en el
laboratorio con un sistema de gestión de la calidad de los procedimientos analíticos.
97

CAPÍTULO V: VALIDACIÓN DEL MÉTODO
V.1 INTRODUCCIÓN
En este apartado se enfocan los esfuerzos en demostrar que el método propuesto es
consistente. En el laboratorio, para obtener resultados confiables, es necesario
trabajar bajo un sistema de gestión de la calidad y con la utilización de métodos
validados con equipos certificados, instrumentos con la precisión adecuada, insumos
de calidad analítica y controles de calidad.
La norma 5040/06 nos sugiere cómo debemos validar los métodos bioanalíticos, e
indica cuáles son los criterios de aceptación de los parámetros de validación, así
también indica las condiciones de los equipos críticos para las determinaciones
analíticas, como por ejemplo balanza analítica, pipetas automáticas, condiciones de
los congeladores y heladeras, peachímetros, calidad de reactivos y solventes,
centrífugas, equipos de HPLC, etc.
Se procede a realizar los ejercicios necesarios en pos de validar el método para la
determinación de fenobarbital, difenilhidantoína y carbamacepina siguiendo los
criterios de esta norma nacional, basada fundamentalmente sobre las normas de la
Food and drug administration (FDA) y los resultados de los parámetros de dicha
validación que deben cumplir con los criterios de aceptación que sugiere la norma.
Las curvas de calibración serán preparadas a partir de la droga sólida con pureza
conocida, con los equipos e instrumentos del laboratorio, conservando las soluciones
en las condiciones adecuadas. En estas curvas de calibración, con varios niveles de
concentración, se interpolarán los datos de los cromatogramas, para obtener los
resultados de precisión y exactitud.
Esta información, es decir que el método será apto para cumplir con los
criterios de aceptación de los parámetros de validación según la norma,
98

permitirá concluir que las curvas a partir de las soluciones estándares,
fueron correctamente preparadas, demostrando así la validez del método
de preparación de los calibradores.
Se realizan las pruebas y ensayos necesarias para elaborar la documentación que se
desprende de la validación de cada uno de los parámetros estadísticos requeridos
para afirmar que el método analítico provee información consistente sobre su
adecuación al uso previsto.
Para aplicar un método analítico, el mismo debe ser validado. Para ello se obtienen
pruebas documentadas de que un método proporciona consistentemente la
información requerida al uso al que se lo destina; o sea debe ser determinada su
precisión, exactitud o sesgo, linealidad, intervalo de linealidad, límite de detección,
límite de cuantificación, sensibilidad, selectividad, y en algunos casos puntuales,
robustez e incertidumbre.
Según Disposición ANMAT 5040/06: “La metodología bioanalítica utilizada para la
cuantificación del principio activo y/o metabolitos, debe estar bien caracterizada,
validada y documentada.” “La validación tiene por objeto demostrar que el método
utilizado es confiable y reproducible.” “En la etapa bioanalítica de los estudios de
bioequivalencia, deben aplicarse las Buenas Prácticas de Laboratorio.”
“Se hará una presentación detallada de la metodología bioanalítica utilizada para la
determinación del principio activo, con detalle de: a) Control de calidad o Curva
Estándar de Concentración, b) Precisión Intra-día (CV%),c) Exactitud Intra-día, d)
Precisión Inter-día (CV%), e) Exactitud Inter-día, f) Linearidad, g) Rango lineal, h)
Sensibilidad/LOQ, i) Recuperación (%).”“Toda la metodología bioanalítica debe estar
detalladamente descripta en el protocolo y en el informe final.”
V.2 RESUMEN
Se desarrollará un método para medir fenobarbital, carbamazepina y
difenilhidantoína en plasma humano por HPLC con detección ultravioleta
previa precipitación protéica.
99

V.3 SUSTANCIAS DE REFERENCIA
V.3.1 Preparación de las soluciones patrones
Los patrones más concentrados de carbamazepina, difenilhidantoína y
fenobarbital son preparados en metanol a partir de la droga sólida. Pesar 5 mg
de cada una de las 3 drogas por separado y llevar a volumen en matraz de 5
ml aforado y calibrado.
Preparación de los calibradores:
Como matriz de los calibradores se utilizan agua o sueros libres de drogas y
HIV negativos. Se alicuota en tubos y se congelan para ser utilizados en las
siguientes corridas. Para ello, tomar 100ul de la solución de carbamazepina,
difenilhidantoína y fenobarbital y volver a llevar a 5 ml en matraz aforado y
calibrado con agua o plasma libre de drogas a cuantificar. Luego se realizan
diluciones para obtener la curva de calibración (QC) si se preparan en el
laboratorio.
V.3.2 Estándares
Nombres:
Fenobarbital (ácido 5-etil-5-fenilbarbitúrico)
Origen: Instituto Nacional de Farmacología y Bromatología, actual Instituto
Nacional de Medicamentos, (INAME)
Difenilhidantoína o fenitoína (5,5-Difenilhidantoina)
Origen: Sigma
Carbamazepina
Origen: Sigma-Aldrich
V.4 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS
V.4.1 Cromatógrafo:
Bomba Thermo Spectra System P 2000
Detector Thermo Spectra System UV 1000
Loop: 100 µl
100

Columna: ODS2 150 X 4,6, tamaño de partícula 3 µm
Temperatura ambiente
Programa para adquisición de datos: PeakSimple
Flujo: 1 ml/min
Longitud de onda 210 nm
V.4.2 Reactivos
Acetonitrilo grado HPLC
Agua destilada obtenida en el laboratorio
Acetato de sodio grado analítico
Ácido acético grado analítico
V.4.3 Fase móvil
Acetato de sodio 5 mM pH: 5,4 / acetonotrilo 100:65.
La preparación de la fase móvil consiste en pesar 0,285g de acetato de sodio
(PM 82) y se lleva a aproximadamente 450 ml con agua. Agitar hasta
disolución de la droga. Se mide el pH utilizando el pHmetro Hanna HI 98127.
Se ajusta el pH a 5,4 con ácido acético 1/10 del concentrado (Glacial). Llevar a
500 ml con agua. Se guarda refrigerado. La fase móvil se desgasifica por
filtración al vacío.
V.5 PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE PLASMAS SUPLEMENTADO
Origen de los plasmas: se obtuvieron plasmas, con EDTA como anticoagulante,
del laboratorio, se poolearon y se verificó que los pooles no presentaran señal
en el tiempo de retención de fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína.
Luego se suplementaron con volúmenes de soluciones estándar para llegar a
concentraciones deseadas.
101

V.6 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Y ESTÁNDARES
100 µl de suero o calibrador o control se desproteinizan por el agregado de
100 µl de acetonitrilo puro mas 10 µl de ZnSO4 al 10%. Se agita 30 segundos
en vortex y luego se centrifuga durante 4 minutos a máxima velocidad. 100 µl
de sobrenadante límpido se pasan a tubo nuevo y se diluye por el agregado de
300 µl de agua. Se agita en vortex y se inyectan 100 µl en el sistema
cromatográfico.
V.7 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN
V.7.1 Selectividad y Especificidad
Este parámetro se determinó procesando 6 muestras de distintos orígenes
(plasmas libres de drogas), con el objetivo de evaluar, si en el tiempo de
retención de fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína no se registre
señal cromatográfica. Asimismo no se observaron interferencias en el tiempo
de retención correspondiente a fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína
en presencia de anticoagulante EDTA.
Se procesaron también 3 plasmas hemolizados y 3 plasmas lipémicos
(obtenidos con EDTA). En todos los casos, en el tiempo de retención de la
molécula en estudio no se observó señal que pudiera interferir en la
cuantificación de fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína.
La inyección de agua tampoco mostró señal en el tiempo de retención de
fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína.
V.7.2 Rango Analítico
El método fue desarrollado para los siguientes rangos:
FBT: 1,25 µg/ml a 100 µg/ml
CBZ: 0,25 µg/ml a 20 µg/ml
DFH: 0,3125 µg/ml a 25 µg/ml
102

V.7.3 Linealidad
El método es lineal en el rango de concentración de:
FBT: 1,25 µg/ml a 100 µg/ml
CBZ: 0,25 µg/ml a 20 µg/ml
DFH: 0,3125 µg/ml a 25 µg/ml
Se estudió la linealidad (y = ax + b), en varios días obteniendo en todas las
rectas un coeficiente de correlación mayor a 0.98 (R 2 >0,98)
V.7.4 Precisión intradía
Se analizaron por quintuplicado plasmas suplementados en concentraciones
bajas, medias y altas (QCB, QCM y QCA) obteniendo los siguientes resultados.
Fenobarbital:
Para concentración 11,19 µg/ml (QC bajo), el coeficiente de variación
porcentual (CV%) es:
Día 1: 2,0%
Día 2: 2,0%
Día 3: 1,2%
Para concentración 28,33 µg/ml, (QC medio), el coeficiente de variación
porcentual (CV%) es:
Día 1: 0,7%
Día 2: 2,3%
Día 3: 7,8%
Para concentración 62,19 µg/ml, (QC alto), el coeficiente de variación
porcentual (CV%) es:
Día 1: 1,9%
Día 2: 2,6%
Día 3: 0,9%
Carbamazepina:
103

Para concentración 3,00 µg/ml (QC bajo), el coeficiente de variación
porcentual (CV%) es:
Día 1: 3,4%
Día 2: 1,8%
Día 3: 3,7%
Para concentración 8,77 µg/ml, (QC medio), el coeficiente de variación
porcentual (CV%) es:
Día 1: 0,9%
Día 2: 1,3%
Día 3: 1,4%
Para concentración 14,16 µg/ml, (QC alto), el coeficiente de variación
porcentual (CV%) es:
Día 1: 2,0%
Día 2: 2,3%
Día 3: 2,6%
Difenilhidantoína:
Para concentración 6,91 µg/ml (QC bajo), el coeficiente de variación
porcentual (CV%) es:
Día 1: 1,5%
Día 2: 0,8%
Día 3: 1,6%
Para concentración 12,76 µg/ml, (QC medio), el coeficiente de variación
porcentual (CV%) es:
Día 1: 1,6%
Día 2: 1,8%
Día 3: 1,5%
104

Para concentración 22,50 µg/ml, (QC alto), el coeficiente de variación
porcentual (CV%) es:
Día 1: 1,7%
Día 2: 2,8%
Día 3: 2,6%
V.7.5 Precisión interdía
Se analizaron por quintuplicado, plasmas suplementados en concentraciones
bajas, medias y altas (QCB, QCM y QCA) en 3 días distintos con dos analistas
distintos, obteniendo los siguientes resultados:
TABLA V.1 – Resultados de la precisión interdía de fenobarbital
Concentración Coeficiente de Variación porcentual (CV%)
QCB 2,0
QCM 5,13
QCA 2,11
TABLA V.2 – Resultados de la precisión interdía de carbamazepina
Concentración Coeficiente de Variación porcentual (CV%)
QCB 2,79
QCM 2.,65
QCA 2,17
TABLA V.3 – Resultados de la precisión interdía de difenilhidantoína
Concentración Coeficiente de Variación porcentual (CV%)
QCB 1,38
QCM 1,62
QCA 2,41
105

V.7.6 Exactitud
Se ha estudiado la exactitud calculando el bias% de plasmas suplementados.
BIAS%= [(valor obtenido – valor teórico)/ valor teórico] 100
Se analizaron por quintuplicado plasmas suplementados en concentraciones
bajas, medias y altas (QCB, QCM y QCA) obteniendo los siguientes resultados.
Fenobarbital
Para concentración 11,19 µg/ml (bias%):
Día 1: 1,9%
Día 2: 0,4%
Día 3: 3,1%
Para concentración 28,33 µg/ml (bias%):
Día 1: 0,9%
Día 2: -0,8%
Día 3: -5,9%
Para concentración 62,19 µg/ml (bias%):
Día 1: 0,5%
Día 2: -1,7%
Día 3: 0,7%
Carbamazepina
Para concentración 3,00 µg/ml (bias%):
Día 1: 1,9
Día 2: 3,7
Día 3: 4,4
106

Para concentración 8,77 µg/ml (bias%):
Día 1: 2,6
Día 2: 0,2
Día 3: 4,7
Para concentración 14,16 (bias%):
Día 1: 1,8
Día 2: 1,6
Día 3: 2,2
Difenilhidantoína
Para concentración 6,91 µg/ml (bias%):
Día 1: -2,9
Día 2: -1,7
Día 3: -2,1
Para concentración 12,76 µg/ml (bias%):
Día 1: -0,2
Día 2: -1,7
Día 3: -2,1
Para concentración 22,50 µg/ml (bias%):
Día 1: -0,5
Día 2: -1,2
Día 3: -2,7
Criterios de aceptación según Disposición ANMAT 5040/06:
“El valor medido debe ser mayor o igual al 85% del valor real, excepto para el
límite de cuantificación, el cual no debe ser menor del 80%”
107

V.7.7 Recuperación
Las soluciones de plasmas suplementados (QCB, QCM y QCA) se compararon
contra soluciones controles externas en las mismas concentraciones. Se
estudió el % de recuperación obteniendo los siguientes resultados:
TABLA V.4 – Resultados de la recuperación de fenobarbital
Concentración
%
Recuperación
QCB (nivel 1) 99,89
QCM (nivel 2) 99,46
QCA (nivel 4) 99,60
TABLA V.5 – Resultados de la recuperación de carbamazepina
Concentración
%
Recuperación
QCB (nivel 1) 99,60
QCM (nivel 2) 97,62
QCA (nivel 4) 101,10
TABLA V.6 – Resultados de la recuperación de difenilhidantoína
Concentración
%
Recuperación
QCB (nivel 1) 100,82
QCM (nivel 2) 102,73
QCA (nivel 4) 109,43
108

V.7.8 Límite de cuantificación
Fenobarbital
Se ensayó el límite de cuantificación en 1,25 µg/ml obteniendo los siguientes
resultados:
TABLA V.7 – Resultados del límite de cuantificación de fenobarbital
Concentración
Día 1 Día 2
LQ CV% Bias % CV% Bias %
1,25 4,1 -2,5 7,1 0,4
Por lo tanto, el límite de cuantificación es de 1,25 µg/ml siendo preciso y
exacto ya que tanto el bias% y el CV% resultaron

Difenilhidantoína
Se ensayó el límite de cuantificación en 0,3125 µg/ml obteniendo los
siguientes resultados:
TABLA V.9 – Resultados del límite de cuantificación de difenilhidantoína
Concentración
Día 1 Día 2
LQ CV% Bias % CV% Bias %
0,3125 2,1 2,4 5,0 -0,1
Por lo tanto el límite de cuantificación es de 0,3125 µg/ml siendo preciso y
exacto ya que tanto el bias% y el CV% resultaron

V.8 RESUMEN DE LOS PARÁMETROS DE VALIDACIÓN Y CRITERIOS DE
ACEPTACIÓN
Ver ANEXO Nº 4
TABLA V.10 - Parámetros de validación de fenobarbital
Veracidad
(exactitud según la
norma)
Recuperación
Linealidad
Límite de
cuantificación
QCbajo
QCmedio
QCalto
QCbajo
QCmedio
QCalto
LQ = 1,25
µg/ml
bias% 3,1
bias% -5,9
bias% 0,7
01-07-2011
99,89%
99,46%
99,09%
CV%=0,4
El coeficiente de
regresión (r 2 )
siempre fue mayor
a 0,99
CV% 7,1 y
bias%0,4
2-07-2011
111
Criterios de
aceptación según
la norma 5040
ANMAT
Cumple
bias%

TABLA V.11- Parámetros de validación de carbamazepina
Veracidad (exactitud
según la norma)
Recuperación
Linealidad
Límite de
cuantificación
QCbajo
QCmedio
QCalto
QCbajo
QCmedio
QCalto
LQ = 0,25
µg/ml
bias% 4,4
bias% 4,7
bias% 2,2
01-07-2010
99,6%
97,62%
101,1%
CV%=1,8
El coeficiente de
regresión (r 2 )
siempre fue mayor
a 0,99
CV% 3,4 y bias%
8,4
2-07-2010
112
Criterios de
aceptación según
la norma 5040
ANMAT
Cumple
bias%

TABLA V.12 - Parámetros de validación de difenilhidantoína
Veracidad (exactitud
según la norma)
Recuperación
Linealidad
Límite de
cuantificación
QCbajo
QCmedio
QCalto
QCbajo
QCmedio
QCalto
LQ =
0.313µg/ml
bias% 1,7
bias% 0,6
bias% -1,2
30-06-2010
100,82%
102,73%
109,43%
CV%=4,3
El coeficiente de
regresión (r 2 )
siempre fue mayor
a 0,99
CV% 5,0 y
bias%-0,1
2-07-2010
113
Criterios de
aceptación según
la norma 5040
ANMAT
Cumple
bias%

Nota: durante todos los días en los que se estudiaron los parámetros, todos
cumplieron con los criterios de aceptación, sólo se registraron datos de 1 solo día, al
azar.
V.9 CONCLUSIÓN
Se ha desarrollado y validado un método para cuantificar fenobarbital,
carbamazepina y difenilhidantoína en plasma humano por HPLC con detección UV
que se adapta a las necesidades del laboratorio en el rango analítico estudiado.
114

CAPÍTULO VI: CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE TOTAL DEL MÉTODO
VI.1 INTRODUCCIÓN
La incertidumbre total y final del método de detección y cuantificación de las
sustancias de estudio, debe ser calculada a efectos de ser comparada con la
obtenida en el procedimiento de preparación de estándares de calibración descripta
en el capítulo IV.
A continuación se explicará cómo se calcularon los diferentes términos de
incertidumbre y como se observa en el siguiente procedimiento, puede obtenerse un
término de incertidumbre a partir de la precisión resultante de la reproducibilidad
intralaboratorio, también conocida como condición de precisión intermedia (es la
magnitud que relaciona la variación de los resultados observados, cuando uno o
mas factores, tales como tiempo, equipamiento, operador, varían dentro de un
mismo laboratorio) 17 de una medición (componente relacionado con el error
aleatorio) y otro que incluye los datos de evaluación externa de la calidad para
estimar el bias o sesgo que es la diferencia entre la esperanza matemática de los
resultados de ensayo y un valor de referencia aceptado. El sesgo es el error
sistemático total en contraste con el error aleatorio. Un valor grande del sesgo refleja
una diferencia sistemática importante con respecto al valor de referencia
aceptado.) 18 y la incertidumbre relativa a su estimación (componentes relacionados
con el error sistemático).
Se debe establecer un procedimiento para la estimación de la incertidumbre asociada
a los resultados de los análisis que permita decidir si dicho resultado es adecuado
para su propósito y para evaluar si es consistente con otros, el cual se presenta a
continuación:
17 Incertidumbre de medición en métodos de ensayo microbiológicos cuali y cuantitativos Susana
Carnevali De Falke (OAA), (2008)
18 Op. Cit 2
115

VI.2 OBJETIVO
Establecer un procedimiento para la estimación de la incertidumbre asociada a los
resultados de los análisis
VI.3 DESARROLLO
La incertidumbre es un parámetro asociado al resultado de la medición que
caracteriza la dispersión de los valores que pueden ser razonablemente atribuida al
mesurando.
La incertidumbre es requerida para decidir si un resultado es adecuado para su
propósito y para evaluar si es consistente con otros resultados. Se distinguen dos
métodos principales para cuantificar las fuentes de incertidumbre.
Método de Evaluación Tipo A: está basado sobre un análisis estadístico de una
serie de mediciones repetidas.
Método de Evaluación Tipo B: comprende todas las demás maneras de estimar la
incertidumbre; en este caso, de una magnitud de entrada, se usa información
externa u obtenida por experiencia. Las fuentes de información pueden ser:
certificados de calibración, normas, valores de mediciones anteriores etc. (ej.:
incertidumbre estimada de un calibrador, de una balanza, de una pipeta, etc.).
Para calcular la incertidumbre asociada a los resultados de los análisis cada
responsable de área tiene en cuenta los siguientes pasos:
VI.3.1 Identificación del mesurando Y
Analito: sustancia o componente de interés que es objeto de la medición
Mesurando: es la propiedad cuantificable del analito a utilizar en el sistema de
medición.
Y = mesurando
116

El valor del resultado Y está influenciado por distintas fuentes de incertidumbre
Y = f(X1, X2, X3)
Donde Xi son las fuentes de incertidumbre
VI.3.2 Identificación de las fuentes de incertidumbre
Se identifican y asocian las siguientes fuentes que determinan la incertidumbre:
X1= Variables preanaliticas: variaciones biológicas del paciente (debido a
factores intrínsecos, posturales, alimentación, etc), toma de muestras (horario,
postura, punción), conservación (temperatura, tiempo, etc.).
veracidad (sesgo).
bioquímico).
X2=Variables analíticas: repetibilidad (precisión intra e interensayo),
X3= Variables postanalíticas: dependen de la validación clínica (criterio
Variaciones
biológicas del
paciente
Veracidad
Variables
analíticas
Variables pre
analíticas
Precisión
Conservación
Variables post
analíticas
117
Verificación
clínica
Interpretación
bioquímica
ANALITO

Existen diversas fuentes de incertidumbre preanalíticas y postanalíticas. Siendo
éstas difíciles de estimar, el laboratorio normaliza estas etapas. Con este criterio la
incertidumbre se hace dependiente solo de la fase analítica.
La normalización de la fase preanalítica se logra con las condiciones de toma de
muestra, conservación, etc., indicadas en la guía de toma de muestra.
VI.3.3 Estimación de la incertidumbre
Se utilizan datos provenientes de la evaluación del método, control de calidad interno
y control externo de calidad:
Se consideran dos componentes principales:
Efectos aleatorios: determinación de la precisión de mediciones realizadas bajo
condiciones de precisión intermedia, durante un periodo prolongado de tiempo, a
efectos de considerar las distintas variables que generan potencialmente variabilidad
en los resultados. Se obtiene del procesamiento del control de calidad interno.
Efectos sistemáticos: la veracidad de un valor se estima por comparación con un
VR aceptado en un material de referencia. El sesgo se obtiene por comparación de
los datos de un programa de control de calidad externo o peer group (QCS-insight,
etc.).
Se considera que el desvío relativo estándar es constante en el intervalo del ensayo,
la incertidumbre relativa de la recuperación es independiente de la concentración del
analito, sin embargo se estima a por lo menos dos niveles de decisión médica
distintos.
Idealmente se debe tener la incertidumbre asociada la material de control declarada
por el fabricante. En el caso de desconocerla se usa el desvío estándar que figura en
el inserto.
La incertidumbre de medición se calcula como una suma a raíz de los cuadrados de
una desviación estándar s que caracteriza a la precisión de la medición y una
118

estimación de b que se relaciona con la estimación del bias, para dar la
incertidumbre u de acuerdo con la siguiente ecuación:
S: componente relacionado con el error aleatorio.
b: componente relacionado con el error sistemático.
uc: incertidumbre combinada.
Una vez estimada la incertidumbre combinada, se procede a estimar la incertidumbre
expandida empleando la siguiente ecuación:
U = uc.k
U: incertidumbre expandida
uc: incertidumbre combinada.
k: factor de cobertura
VI.3.3.1 Componente de precisión (SRw)
A efectos de valuar la acción conjunta de distintas variables que generan dispersión
en las mediciones, se estima el componente de precisión a partir de la
reproducibilidad intralaboratorio también conocida como condición de precisión
intermedia de una medición:
“condición de medición dentro de un conjunto de condiciones que incluye el mismo
procedimiento de medición, el mismo lugar y mediciones repetidas del mismo objeto
u objetos similares durante un periodo amplio de tiempo, pero que puede incluir
otras condiciones que involucren variaciones”
119

- el mismo procedimiento de medida
- el mismo laboratorio
- diferentes operadores
- el mismo equipo
- más de un lote de reactivo
- más de una calibración
- más de un mantenimiento preventivo.
Se considera el coeficiente de variación acumulada (SRw) de un periodo de tiempo,
de entre 6 meses y un año, cuando sea posible.
Estos datos son obtenidos a partir de control de calidad interno y esquemas peer
group o interlaboratorio cuando estén disponibles.
Por lo tanto:
S = SRW
El SRW será considerado a dos o tres niveles de decisión médica según el ensayo
evaluado.
VI.3.3.2 Componente relacionado con el error sistemático u(bias)
En el laboratorio de análisis clínicos no es frecuente efectuar correcciones del bias. El
Bias es estimado pero no corregido y por lo tanto debe ser incorporado a la
estimación de la incertidumbre de la medición. Se emplean esquemas de evaluación
externa de la calidad para estimar el bias y la incertidumbre relativa a su estimación,
para aplicarlos a la estimación de la incertidumbre de la medición.
En la medida de lo posible, se tomaran en cuenta 12 encuestas y se estimara el bias
de cada una de ellas. De las encuestas se obtiene:
Valor Nominal: media de comparación del esquema de evaluación externa
Valor Informado: Valor reportado por el laboratorio.
120

Bias %: [ (valor informado – valor nominal) / valor nnominal ]100
CVGrupo (SR): coeficiente de variación del grupo de comparación.
n: cantidad de resultados aceptados en el grupo de comparación.
Se estima el RMS bias:
RMS bias
Empleando los datos de CV grupo(SR) y n de las distintas encuestas se estimará la
incertidumbre asociada a la estimación del Bias u(Cref):
SR: media de los SR de las distintas encuestas o RMS SR.
n: media de los n de las distintas encuestas o RMS n.
u(Cref): incertidumbre asociada a la estimación del bias.
Si los datos de SR y n varían mucho de encuesta a encuesta se puede emplear el los
respectivos RMS en lugar de las medias.
Luego integrando las ecuaciones anteriores se puede estimar u(bias) empleando la
siguiente ecuación:
Estimación del componente de bias con datos de programas interlaboratorio.
Se emplean los datos provenientes del reporte interlaboratorio del ensayo para
estimar el bias:
121

∆RV = bias
Xlab = Media mensual laboratorio
XRV = Media acumulada grupo
Entonces la u(∆RV) se estima como:
Donde:
Slab: coeficiente de variación mensual del laboratorio.
Nlab: numero de datos de control reportados por el laboratorio en el mes.
SRV: coeficiente de variación acumulado del grupo par.
NRV: numero de laboratorios participantes del grupo par (acumulados).
Finalmente,
b =
2
bias + u ( ∆
RV
)
2
)
VI.3.4 Estimación de la incertidumbre combinada
La incertidumbre combinada resulta de la combinación de la incertidumbre de la
precisión, el bias o sesgo y la incertidumbre asociada a la estimación del bias o
sesgo.
Retomando la ecuación:
Donde:
122

s: componente relacionado con el error aleatorio.
b: componente relacionado con el error sistemático.
uc: incertidumbre combinada.
Reemplazando:
s= SRW
b=
También sabemos que empleando los datos de los esquemas de evaluación externa
de la calidad podemos estimar cada uno de los componentes de la formula anterior:
RMS Bias o
Y por otro lado:
o
VI.3.5 Estimación de la incertidumbre expandida U
La incertidumbre expandida se calcula multiplicando la incertidumbre relativa
combinada por el factor de cobertura.
Se asume una distribución normal (gaussiana) al mensurando, por lo tanto el factor
de cobertura utilizado es k=2.
La incertidumbre expandida asociada corresponde a una probabilidad de cobertura
de, aproximadamente, un 95%.
U = uc.k (k=2)
123

U: incertidumbre expandida
uc: incertidumbre combinada.
k: factor de cobertura
VI.3.5 Expresión del resultado
El resultado de la medición con su incertidumbre se expresa
Y =Yo ± U
“La incertidumbre expandida de medida se ha obtenido multiplicando la
incertidumbre típica de medición por el factor de cobertura k=2 que, para una
distribución normal, corresponde a una probabilidad de cobertura de
aproximadamente el 95%.”
VI.3.6 DOCUMENTOS DE REFERENCIA
* Incertidumbre en métodos analíticos de rutina- Alicia Maroto Sánchez
Estudio de la incertidumbre asociada a los resultados obtenido con ciertos
procedimientos de medida bioquímicos-clínicos- Bernardino González de la Presa.
* Michel Gluschke y cols. A case study in the practical estimation of measurement
uncertainty. Accred Qual Assur (2005) 10:107-111 EUROLAB Technical Report
1/2007, “Measurement uncertainty revisited:Alternative approaches to uncertainty
evaluation”
* EUROLAB Technical Report 1/2006,“Guide to the Evaluation of Measurement
Uncertainty for Quantitative Test Results”
* Handbook for calculation of measurement uncertainty inenvironmental
laboratories, edition 2, nordtest. Nt techn report 537, Approved 2004-02.
124

VI.4 CÁLCULOS Y RESULTADOS
VI.4.1 Cálculo de incertidumbre del método analítico
Las tablas VI.1, VI.2 y VI.3 muestran la incertidumbre estándar en términos relativos
porcentuales de los componentes relacionados con el error aleatorio y con el
error sistemático de incertidumbre descripto en el procedimiento anterior.
La incertidumbre final de los resultados se obtiene combinando los términos de
incertidumbre estándar y multiplicando por el factor de cobertura k, tal y como se
muestra a continuación. La incertidumbre final para cada nivel, para cada sustancia,
quedará expresada en término relativo porcentual.
TABLA VI.1- Estimación del componente de bias con datos de programas de
evaluación externa de la calidad para fenobarbital
Control Bio Rad
Lote Nivel 1 57171 11,246 SRW Nivel 1 7,2
Analito Fenobarbital Lote Nivel 2 57172 28,382 SRW Nivel 2 4,2
Unidades ug/ml Lote Nivel 3 57173 62,247 SRW Nivel 3 5,1
Encuesta Unidades Valor Nominal
Valor
Informado BIAS % CV Grupo (SR) N
Ciclo 39 / 12 RQAS ug/ml 8,033 7,200 10,37 9,6 69
Ciclo 40 / 2 RQAS ug/ml 28,411 26,000 8,49 6,8 66
Ciclo 40 / 3 RQAS ug/ml 50,098 44,400 11,37 6,0 91
Ciclo 40 / 4 RQAS ug/ml 29,237 30,000 2,61 5,7 93
Ciclo 40 / 5 RQAS ug/ml 18,421 17,800 3,37 5,1 85
Ciclo 40 / 6 RQAS ug/ml 39,608 34,800 12,14 5,9 89
Ciclo 40 / 7 RQAS ug/ml 50,378 49,900 0,95 5,5 92
Ciclo 40 / 8 RQAS ug/ml 7,985 8,200 2,69 8,2 98
Ciclo 40 / 9 RQAS ug/ml 18,536 18,500 0,19 6,7 96
Ciclo 40 / 10 RQAS ug/ml 28,657 24,600 14,16 6,2 96
Ciclo 40 / 11 RQAS ug/ml 29,226 27,100 7,27 4,9 89
Ciclo 40 / 12 RQAS ug/ml 39,372 39,300 0,18 6,6 81
X 6,15 6,43 87,1
RMS 7,83 6,55 88
Cantidad de encuestas 12
125

2
RMS( bias)
= biasi
/ n
126
RMS bias 7,83
u(Cref) 0,70
7,83 u(bias) 7,90
U(expandidad)% 21,38
(K=2) Nivel 1
U(expandidad)% 17,90
0,70 (K=2) Nivel 2
7,90
U(expandidad)% 9,40
(K=2) Nivel 3
TABLA VI.1- Estimación del componente de bias con datos de programas de
evaluación externa de la calidad para carbamazepina
Control Bio Rad
Lote Nivel 1 57171 3,011 SRW Nivel 1 6,3
Analito Carbamazepina Lote Nivel 2 57172 8,853 SRW Nivel 2 4,7
Unidades ug/ml Lote Nivel 3 57173 14,074 SRW Nivel 3 5,2
Encuesta Unidades Valor Nominal
Valor
Informado BIAS % CV Grupo (SR) N
Ciclo 39 / 12 RQAS ug/ml 3,168 3,100 2,15 6,9 82
Ciclo 40 / 2 RQAS ug/ml 9,003 8,600 4,48 7,0 83
Ciclo 40 / 3 RQAS ug/ml 16,542 15,100 8,72 7,2 118
Ciclo 40 / 4 RQAS ug/ml 9,985 9,800 1,85 5,9 118
Ciclo 40 / 5 RQAS ug/ml 6,163 6,400 3,85 6,1 111
Ciclo 40 / 6 RQAS ug/ml 12,766 11,400 10,70 7,8 114
Ciclo 40 / 7 RQAS ug/ml 16,761 16,300 2,75 7,9 117
Ciclo 40 / 8 RQAS ug/ml 3,220 3,600 11,80 7,1 124
Ciclo 40 / 9 RQAS ug/ml 6,228 7,100 14,00 6,8 123
Ciclo 40 / 10 RQAS ug/ml 9,201 9,800 6,51 5,7 128
Ciclo 40 / 11 RQAS ug/ml 10,001 10,000 0,01 5,7 117
Ciclo 40 / 12 RQAS ug/ml 12,881 14,200 10,24 6,7 103
X 6,42 6,72 111,5
RMS 7,76 6,76 112
Cantidad de
encuestas 12

2
RMS( bias)
= biasi
/ n
127
RMS bias 7,76
u(Cref) 0,60
7,76 u(bias) 7,80
U(expandidad)% 20,06
(K=2) Nivel 1
U(expandidad)% 18,22
0,60 (K=2) Nivel 2
7,80
U(expandidad)% 18,74
(K=2) Nivel 3
TABLA VI.3- Estimación del componente de bias con datos de programas de
evaluación externa de la calidad para difenilhidantoína
Control Bio Rad
Lote Nivel 1 57171 6,848 SRW Nivel 1 5,9
Analito Fenitoina Lote Nivel 2 57172 12,873 SRW Nivel 2 3,2
Unidades ug/ml Lote Nivel 3 57173 22,054 SRW Nivel 3 5,5
Encuesta Unidades Valor Nominal
Valor
Informado BIAS % CV Grupo (SR) N
Ciclo 41 / 1 RQAS ug/ml 4,301 4 7 11,1 86
Ciclo 41 / 2 RQAS ug/ml 15,886 13,8 13,13 7,2 87
Ciclo 41 / 3 RQAS ug/ml 21,545 19,8 8,1 7,3 119
Ciclo 41 / 4 RQAS ug/ml 13,106 12,5 4,62 6,4 130
Ciclo 41 / 5 RQAS ug/ml 10,234 10,7 4,55 6,5 111
Ciclo 41 / 6 RQAS ug/ml 18,815 18,8 0,08 6,9 121
Ciclo 41 / 7 RQAS ug/ml 21,491 21,3 0,89 6,4 120
Ciclo 41 / 8 RQAS ug/ml 4,363 3,9 10,61 9,8 139
Ciclo 41 / 9 RQAS ug/ml 10,158 10,6 4,35 6,4 124
Ciclo 41 / 10 RQAS ug/ml 15,82 14,3 9,61 5,5 140
Ciclo 41 / 11 RQAS ug/ml 13,143 13,2 0,43 6,2 118
Ciclo 41 / 12 RQAS ug/ml 18,954 16,1 15,06 7,5 102
X 6,54 7,27 116,4
RMS 8,07 7,43 118
Cantidad de encuestas 12

2
RMS ( bias ) =
bias i / n
128
RMS bias 8,07
u(Cref) 0,7
8,07 u(bias) 8,1
U(expandidad)% 20,04
(K=2) Nivel 1
0,7 (K=2) Nivel 2
8,1
U(expandidad)% 17,42
U(expandidad)% 19,58
(K=2) Nivel 3
La incertidumbre se ha calculado en los tres casos para los tres niveles utilizando un
factor de cobertura k = 2. Por tanto, hay aproximadamente un 95% de probabilidad
de que la concentración verdadera de cada analito de una muestra de rutina esté
contenida dentro del intervalo proporcionado por la concentración obtenida al
analizar la muestra de rutina y su incertidumbre asociada (U).
Se presentan las tablas desprendidas de los cálculos anteriores donde se plasman los
resultados finales de los ensayos, discriminados por nivel en los primeros casos,
donde se podrá comparar cómo evoluciona cada valor de incertidumbre para cada
sustancia al mismo nivel de concentración por lote.
TABLA VI.4 - Cálculo de la incertidumbre expandida del Nivel 1
Valor
Nominal
u(combinada)
U (expandida) %
Analito Unidades Control LOTE Nivel 1 SRW u (bias) % % (K=2)
Carbamazepina ug/ml Bio Rad 57171 3,011 6,3 7,8 10,03 20,05
Difenilhidantoína ug/ml Bio Rad 57171 6,848 5,9 8,1 10,02 20,04
Fenobarbital ug/ml Bio Rad 57171 11,246 7,2 7,9 10,69 21,38

TABLA VI.5 - Cálculo de la incertidumbre expandida del Nivel 2
Valor
Nominal
u(combinada)
U (expandida) %
Analito Unidades Control LOTE Nivel 2 SRW u (bias) % % (K=2)
Carbamazepina ug/ml Bio Rad 57172 8,853 4,7 7,8 9,11 18,21
Difenilhidantoína ug/ml Bio Rad 57172 12,873 3,2 8,1 8,71 17,42
Fenobarbital ug/ml Bio Rad 57172 28,382 4,2 7,9 8,95 17,89
TABLA VI.6 - Cálculo de la incertidumbre expandida del Nivel 3
Valor
Nominal
u(combinada)
U (expandida) %
Analito Unidades Control LOTE Nivel 3 SRW u (bias) % % (K=2)
Carbamazepina ug/ml Bio Rad 57173 14,074 5,2 7,8 9,37 18,75
Difenilhidantoína ug/ml Bio Rad 57173 22,054 5,5 8,1 9,79 19,58
Fenobarbital ug/ml Bio Rad 57173 62,247 5,1 7,9 9,40 18,81
TABLA VI.7- Tabla resumen de valores de incertidumbre de fenobarbital,
carbamazepina y difenilhidantoína para los tres niveles.
Analito Unidades Nivel 1 U(expandida)% Nivel 2 U(expandida)% Nivel 3 U(expandida)%
Carbamazepina ug/ml 3,011 20,05 8,853 18,21 14,074 18,75
Difenilhidantoína ug/ml 6,848 20,04 12,873 17,42 22,054 19,58
Fenobarbital ug/ml 11,246 21,38 28,382 17,89 62,247 18,81
VI.4.2 Cálculo de incertidumbre del método analítico considerando los calibradores
Todos los términos de incertidumbre debidos a fuentes de variación no considerados
previamente, se combinan cuadráticamente, siguiendo la ley de propagación de
errores y las consideraciones mencionadas en el procedimiento elaborado en este
capítulo, con los considerados anteriormente.
Se calcula la incertidumbre total del método, en este caso, incluyendo la
incertidumbre obtenida en la preparación de los calibradores para cada nivel
(obtenida en el capítulo IV, según lo indicado en tablas IV.4, IV.8 Y IV.12) en su
expresión combinada, para luego ser combinada con los factores S: componente
relacionado con el error aleatorio y b: componente relacionado con el error
sistemático y expandida para un intervalo de confianza determinado, para ser
129

comparada con la calculada anteriormente y expresada en la tabla resumen tabla
VI.7.
u +
2 2
2
( x)
= S + B STDn
U (exp %)
= k ⋅ u(x)
130
con k = 2
TABLA VI.8- Estimación de la incertidumbre incluyendo la preparación de los
calibradores para fenobarbital
U DE FENOBARBITAL
SRW Nivel 1 7,2
SRW Nivel 2 4,2
SRW Nivel 3 5,1
RMS bias 7,76
u(Cref) 0,60
u(bias) 7,80
U(STD1) 1,52
U(STD2) 1,56
U(STD3) 1,48
U(expandidad)% 21,37
(K=2) Nivel 1
U(expandidad)% 17,99
(K=2) Nivel 2
U(expandidad)% 18.87
(K=2) Nivel 3

TABLA VI.9- Estimación de la incertidumbre incluyendo la preparación de los
calibradores para carbamazepina
U DE CARBAMAZEPINA
SRW Nivel 1 6,3
SRW Nivel 2 4,7
SRW Nivel 3 5,2
RMS bias 7,76
u(Cref) 0,60
u(bias) 7,80
U(STD1) 1,52
U(STD2) 1,56
U(STD3) 1,5
U(expandidad)% 20.196
(K=2) Nivel 1
U(expandidad)% 18.478
(K=2) Nivel 2
U(expandidad)% 18.987
(K=2) Nivel 3
TABLA VI.10- Estimación de la incertidumbre incluyendo la preparación de los
calibradores para difenilhidantoína
U DE DIFENILHIDANTOÍNA
SRW Nivel 1 5.9
SRW Nivel 2 3.2
SRW Nivel 3 5.5
RMS bias 8.07
u(Cref) 0.70
u(bias) 8.10
U(STD1) 1,216
U(STD2) 1,264
U(STD3) 1,2
U(expandidad)% 20.199
(K=2) Nivel 1
U(expandidad)% 17.80
(K=2) Nivel 2
U(expandidad)% 19.723
(K=2) Nivel 3
131

TABLA VI.11- Tabla resumen de valores de incertidumbre de fenobarbital,
carbamazepina y difenilhidantoína para los tres niveles, incluyendo la incertidumbre
de los calibradores.
Analito Unidades Nivel 1 U(exp)%
Carbamazepina ug/ml 3,011 20,05
Difenihidantoína ug/ml 6,848 20,04
Fenobarbital ug/ml 11,246 21,38
U(exp)% 1 Nivel 2 U(exp)%
20.196 8,853 18,21
20,199 12,873 17,42
21.37 28,382 17,89
132
U(exp)% 1 Nivel 3 U(exp)%
18.478 14,074 18,75
17.80 22,054 19,58
17.99 62,247 18,81
TABLA VI.12- Tabla comparativa de los valores de incertidumbre absoluta
expandida calculados por ambos métodos.
Analito
Nivel 1
ug/ml
U(exp)
ug/ml
U(exp) 1
ug/ml
Nivel 2
ug/ml
U(exp)
ug/ml
U(exp) 1 Nivel 3
ug/ml
U(exp)
ug/ml
U(exp)% 1
18.987
19.73
18.87
U(exp) 1
ug/ml
Carbamazepina 3,011 0,6037055 0,60810156 8,853 1,6121313 1,63585734 14,074 2,638875 2,67223038
Difenihidantoína 6,848 1,3723392 1,38322752 12,873 2,2424766 2,291394 22,054 4,3181732 4,3512542
Fenobarbital 11,246 2,4043948 2,4032702 28,382 5,0775398 5,1059218 62,247 11,7086607 11,7460089
VI.4.3 Criterio de redondeo (aproximación)
El criterio de redondeo que se utiliza es redondear a la segunda cifra significativa de
la incertidumbre expandida, aumentándola en una unidad, siempre que el orden de
magnitud siguiente al que corresponde redondear sea distinto de cero.
El orden de magnitud que asuma la incertidumbre será el mismo que deberá tener
el valor nominal, por lo tanto, no está de más aclarar que la incertidumbre y el valor
nominal tendrán el mismo orden de magnitud.
Considerando que ninguno de los resultados ofrecidos por los fabricantes, service y
proveedores de calibraciones a través de los certificados de calibración de los
instrumentos que permitieron llevar adelante esta serie de ensayos supera las dos
cifras significativas, se considera conveniente este criterio.

TABLAS VI.13- Tablas comparativas de los valores de incertidumbre absoluta
expandida calculados por ambos métodos redondeados.
Analito
Nivel 1
ug/ml
U(exp)
ug/ml
U(exp) 1
ug/ml
Nivel 2
ug/ml
133
U(exp)
ug/ml
U(exp) 1 Nivel 3
ug/ml
U(exp)
ug/ml
U(exp) 1
ug/ml
Carbamazepina 3,01 0,61 0,61 8,9 1,7 1,7 14,1 2,7 2,7
Difenihidantoína 6,9 1,4 1,4 12,9 2,3 2,3 22,1 4,4 4,4
Fenobarbital 11,3 2,4 2,4 28,4 5,1 5,1 63 12 12
Analito
Nivel 1
mg/ml
U(exp)
mg/ml
U(exp) 1
mg/ml
Nivel 2
mg/ml
U(exp)
mg/ml
U(exp) 1 Nivel 3
mg/ml
U(exp)
mg/ml
U(exp) 1
mg/ml
Carbamazepina 0,00301 0,00061 0,00061 0,0089 0,0017 0,0017 0,0141 0,0027 0,0027
Difenihidantoína 0,0069 0,0014 0,0014 0,0129 0,0023 0,0023 0,0221 0,0044 0,0044
Fenobarbital 0,0113 0,0024 0,0024 0,0284 0,0051 0,0051 0,063 0,012 0,012
VI.5 CONCLUSIONES
Se ha calculado la incertidumbre del método analítico validado para determinación y
cuantificación de fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína en sus diferentes
niveles de concentración y se ha vuelto a calcular dicha incertidumbre, teniendo en
cuenta además de los factores aleatorios y sistemáticos descriptos anteriormente, el
factor relativo a la preparación de los calibradores en sus distintos niveles, y según lo
indicado en las tablas VI.11, no fue necesario el empleo de ninguna herramienta
estadística, tan solo aplicando el criterio de redondeo comentado anteriormente (esto
indica que las diferencias decimales obtenidas en los dos métodos no son
significativas), se puede afirmar que el resultado es el mismo, o sea que la
contribución individual de la preparación de la solución patrón y los
calibradores es despreciable, si es calculada de manera adecuada, ante la
incertidumbre total del método.

CAPÍTULO VII: DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Según lo mencionado en el artículo “Declaración de política referente a la trazabilidad
metrológica”, presentado en la revista número 5 del Organismo Argentino de
Acreditación (OAA), diciembre 2011:
“La Oficina Internacional de Pesas y Medidas (BIPM); la Organización Internacional
de Metrología Legal (OIML); la Cooperación Internacional para Acreditación de
Laboratorios (ILAC); y la Organización Internacional de Normalización (ISO) han
publicado una declaración conjunta con referencia a la política que estos cuatro
organismos promueven, en el campo de la trazabilidad metrológica.
Se trata, sin duda, de un documento de significativa trascendencia, por su contenido,
por surgir de las cuatro organizaciones creadas y reconocidas internacionalmente y
que son responsables de la metrología, la acreditación y la normalización a escala
mundial.
En primer término, cabe dar referencia de estas organizaciones: en dicha declaración
conjunta estos cuatro organismos afirman que:
1) Se requiere de modo indispensable asegurar la consistencia y comparabilidad
de las mediciones para cumplir con la misión que a cada uno compete.
2) La comparabilidad de las mediciones es una de las características esenciales
de un sistema internacional de medición, sin la cual, los resultados no podrían
ser universalmente aceptables.
3) Esta consistencia y comparabilidad internacional sólo puede organizarse si los
resultados de medición son trazables a referencias internacionales
reconocidas.
134

4) En general estas referencias son el Sistema Internacional de Unidades, pero
podrían ser otras cuando la trazabilidad al SI no sea, o no aún posible.
Estas cuatro organizaciones internacionales colaboran en la integración del Comité
Conjunto para Guías en Metrología (JCGM) desarrollando documentos comunes,
algunos de los cuales han sido claves para esta declaración.
Particularmente el VIM en el que se define a la trazabilidad metrológica como: “la
propiedad del resultado de una medición tal que el mismo pueda compararse con
una referencia establecida mediante una cadena continua de calibraciones
documentadas en la que cada una contribuye a la incertidumbre de medición”. Se
incorporan así los conceptos de incertidumbres de medición, calibraciones y
jerarquía de patrones de referencia.
De este modo el BIPM, la OIML, la ILAC y la ISO declaran y promueven la
siguiente política:
Para alcanzar aceptabilidad internacional las calibraciones deberían ser realizadas en:
• Institutos nacionales de metodología o en
• Laboratorios acreditados por la organismos de acreditación firmantes de
acuerdo multilateral de ILAC.
Respetándose que:
o La incertidumbre de medición debería seguir los principios de cálculo
establecidos de la GUM.
o Los resultados de las mediciones realizadas en laboratorios acreditados
deberían ser trazables al SI.
o Los Institutos Nacionales de Metrología que proveen la trazabilidad a los
laboratorios acreditados deberían ser firmantes del CIPM MRA y
publicar sus capacidades de medición y calibración en las áreas
relevantes de la base de datos KCDB.
135

o Dentro de los Acuerdos de Aceptación Mutua de OIMLs, la acreditación
debería ser provista por organismos firmantes del acuerdo multilateral
de ILAC y de ahí alinearse con las políticas de trazabilidad al SI.
o Los principios citados deberían seguirse toda vez que se necesite
demostrar la trazabilidad metrológica para tener aceptabilidad
internacional “.
Se concluye que existe y se consolida día a día un marco mundial que respalda la
validez y comparabilidad de las mediciones a nivel nacional e internacional que
facilita la cooperación y colaboración entre laboratorios que comparten actividades
con los organismos nacionales cuyas funciones se alinean con las de estas cuatro
organizaciones internacionales, lo que indica que a un profesional parte activa de un
laboratorio, le interesará compartir actividades con otros laboratorios que puedan
demostrar que son técnicamente competentes, operan un sistema de calidad efectivo
y son capaces de generar resultados de calibración y ensayo técnicamente válidos,
ante el Institutos nacionales de metrología o laboratorios acreditados por la
organismos de acreditación firmantes del Acuerdo Multilateral de ILAC, ya sean
proveedores de calibraciones, coparticipantes o proveedores de ensayos de aptitud,
proveedores de materiales de referencia, fabricantes de instrumentos de laboratorio
o equipos de ensayos, o cualquier otra parte interesada o involucrada en el proceso
de medición desde el comienzo hasta el final de la cadena; en resumen un
laboratorio que quiera producir resultados universalmente válidos, trazables y
comparables, debe suscribir a la política metrológica de estos organismos referentes.
Nota: en nuestro país, por ley nacional, se aplica el Sistema Métrico Legal Argentino
(SIMELA), que adopta las mismas unidades, múltiplos y submúltiplos del Sistema
Internacional (SI) y está detallado en la norma nacional IRAM 2 –Sistema de
unidades (1989)
136

CAPÍTULO VIII: CONCLUSIONES Y FUTURAS LÍNEAS DE TRABAJO
1) El cálculo y evaluación de la incertidumbre en el análisis químico es una
actividad clave dentro de la administración de los recursos de un laboratorio
de análisis clínicos y dicho análisis da un gran valor a la calidad de los
productos certificados y a la trazabilidad del resultado informado. La
incertidumbre es una manera adecuada de medir y categorizar objetivamente
a un laboratorio de análisis clínicos, más allá de su sistema de gestión de la
calidad.
2) Se ha desarrollado un método simple y sencillo para minimizar el valor de
incertidumbre del patrón de referencia a distintos niveles de concentración,
mejorando la incertidumbre de los equipos e instrumentos de laboratorio
(pureza de las drogas, balanzas, pipetas, material volumétrico, termómetros)
y trabajando en el laboratorio con un sistema de gestión de la calidad de los
procedimientos analíticos. Para alcanzar los objetivos planteados, se ha
analizado, estudiado y armonizado un amplio conjunto de conceptos,
métodos y modelos de gestión orientados a normalizar esta actividad.
Este trabajo se ha basado sobre la metodología presentada en “Quantifying
Uncertainty in Analytical measurement” Apéndice A –Preparación de un
Standard de calibración; EURACHEM / CITAC Guide CG 4; Segunda edición:
2000, en el momento de planificar el cálculo de incertidumbre y en las
recomendaciones presentadas en la disposición ANMAT 5040/06 en lo
relacionado a la selección del instrumento, su mantenimiento, conservación,
calibraciones y service, además de la pureza de los materiales de referencia
utilizados.
3) Los valores de incertidumbre obtenidos en su expresión relativa porcentual
expandida, a los distintos niveles de concentración para el fenobarbital,
oscilan entre 2,9 y 3,08 %, para la carbamazepina entre 2,9 y 3,2 % y entre
137

2,4 y 3,0 para la difenilhidantoína, con un intervalo del 95% de confianza de
contener al verdadero valor.
4) Se ha demostrado la validez del método de preparación de soluciones
patrones y sus calibradores propuesto, o sea se lo ha validado mediante la
validación del método analítico de determinación y cuantificación de
fenobarbital, carbamazepina y difenilhidantoína, es decir, se han realizado las
pruebas y ensayos necesarios para validar cada uno de los parámetros
estadísticos requeridos para afirmar que el método analítico para cada analito
provee información consistente sobre su adecuación al uso previsto,
demostrando así la validez del método de preparación de los calibradores.
5) Se ha elaborado un procedimiento operativo estándar que permitió estimar de
manera adecuada la incertidumbre total del método, combinando
cuadráticamente los factores de origen aleatorio que se presentan en el
laboratorio (agrupados con la denominación de precisión intermedia) y los
sistemáticos resultantes de la evaluación externa de la calidad (bias) y se
obtuvo como resultado una incertidumbre expandida relativa porcentual para
fenobarbital, Nivel 1 de concentración: 21,38%, Nivel 2: 17,89% y Nivel 3:
18,81%. Para carbamazepina a Nivel 1: 20,05%, Nivel 2: 18,21% y Nivel 3:
18,87% y para difenilhidantoína a Nivel 1: 20,04%, Nivel 2: 17,42% y Nivel 3:
19,58%.
6) Se ha vuelto a calcular la incertidumbre teniendo en cuenta además de los
factores aleatorios y sistemáticos descriptos anteriormente, el factor relativo a
la preparación de los calibradores en sus distintos niveles y una vez
combinados cuadráticamente los tres factores agrupados según su origen, se
concluyó que este último es despreciable frente a los otros dos, ya que los
resultados son iguales, obteniendo como resultado una incertidumbre
expandida absoluta para fenobarbital, Nivel 1 de concentración: 0,0024
mg/ml, Nivel 2: 0,0051 mg/ml y Nivel 3: 0,012 mg/ml. Para carbamazepina a
Nivel 1: 0,00061 mg/ml, Nivel 2: 0,0017 mg/ml y Nivel 3: 0,0027 mg/ml y
138

para difenilhidantoína a Nivel 1: 0,0014 mg/ml, Nivel 2: 0,0023 mg/ml y Nivel
3: 0,0044 mg/ml.
7) El trabajo se aboca a demostrar que la incertidumbre asociada a los
calibradores es despreciable o poco significativa en relación a los otros
componentes de incertidumbre. Sin embargo, sería de gran valor si se
realizara un abordaje completo, combinando para tal fin todas las fuentes de
incertidumbre en un solo análisis y se evaluara y cuantificara el aporte relativo
de cada una de ellas. En su momento se creyó clave acotar el tema lo máximo
posible, no obstante, es habitual que a lo largo de su realización se vislumbren
diferentes líneas de investigación que, aún guardando relación con los
trabajos realizados, quedan apartadas de los objetivos iniciales o fuera del
ámbito de la tesis. Estas líneas de investigación podrían dar lugar a nuevas
tesis o trabajos de investigación.
Como planteamos anteriormente (II.2.2.2 Estrategias para el cálculo de la
incertidumbre analític), es posible también calcular la incertidumbre utilizando
información de datos de validación o ejercicios colaborativos. Se plantea la
posible elaboración de una curva de calibración con datos de entrada referidos
a las concentraciones asignadas a los materiales de referencia (X) y las
respuestas generadas por el equipo o sistema de medición (y), considerando
un comportamiento lineal, la expresión matemática para la recta de calibración
estará dada por: y ( x ) = a + bx
Para evaluar la incertidumbre se debe tener en cuenta la incertidumbre
estándar asociada a cada uno de los componentes de entrada, así también
como las correlaciones entre ellos. Por otro lado deben considerarse los
coeficientes de sensibilidad de cada uno de los factores a fin de combinarlos.
Se estima el residuo i-ésimo entre el punto (x,y) y la recta de calibración
e y a −b
i = i − xi . La desviación estándar residual estará dada por la expresión (2)
e indicará si es correcto el ajuste con dos grados de libertad además de
cuantificarlo.
139

Luego de obtener la recta de calibración, para determinar la concentración de
la muestra analizada, se la mide de manera repetida m (m>1) veces y su
expresión estará dada por la expresión (3)
x . y − x . y
b = (1)
S
2
X
S e
e2
i
=
n − 2
∑ (2)
140
Y0
− a
X 0 = (3)
b
A partir de aquí, para simplificar cálculos, se considera la hipótesis que:
● Las incertidumbres asociadas a los materiales de referencia de los
estándares de calibración Ux son despreciables frente a los otros factores de
incertidumbre Uy.
Se deduce que el intervalo de incertidumbre expandida (1- α ) para x0
(intervalo de predicción) a partir de las siguiente expresions:
2
2 S e 1 1 ( x 0 − x )
U ( x 0 ) = [ + +
]
2
b m n
2
ns
x
2
X
Y − a
b
0
0 = ± t n −2 α / 2
S e
⋅ ⋅
b
1 1 ( x 0 − x )
+ +
m n ns
Este enfoque puede ser el inicio de una serie de trabajos de aplicación a
diferentes problemas, mas aún pudiendo verificar la hipótesis anterior,
objetivo del presente trabajo. Realizar un abordaje completo, combinando
para tal fin todas las fuentes de incertidumbre en un solo análisis utilizando
datos de validación y ejercicios colaborativos, permitirá encarar con optimismo
otros problemas de similar interpretación en la química analítica.
2
x
19 20
19 Kornblit, F.; Puglisi,C.; “Incertidumbre En Mediciones Químicas. Recta De Calibración”, INFOSIM
n°8, 2002. http://portal.oas.org/linkclick.aspx?fileticket=uy27xwj4w1w%3d&tabid=584
20 Nuevas consideraciones sobre incertidumbres y recta de calibración en Química Analítica, Boletín
informativo del sistema interamericano de metrología – OEA, Querétara, México / Diciembre 2008. /
http://www.sim metrologia.org.br/docs/revista__sim2008_20ene09.pdf
2

REFERENCIAS BBLIOGRÁFICAS
En el presente trabajo se han utilizado como referencia los siguientes documentos:
1- IRAM 301:2005 equivalente a ISO/IEC 17025:2005 - Requisitos Generales para la
Competencia de Laboratorios de ensayo y Calibración, ISO (2005).
2- Evaluación de la Incertidumbre de la medición, OAA (Organismo argentino de
aceditación) Alba N. Zaretzky, Buenos Aires- Argentina, 30 de abril del 2008.
3- ISO GUM:1995 , Guide to the expression of Uncertainty in Measurement (GUM), ISO,
1995.
4- Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM/ CITAC Guide CG 4,
Segunda edición: 2000. Apéndice A – Preparación de un Standard de calibración.
5- IRAM-ISO 15189: 2007 ; Laboratorios de análisis clínicos –Requisitos particulares
para la calidad y la competencia, ISO (2007).
6- Materiales de referencia certificados / Jordi Riu del Grupo de Quimiometría y
Cualimetría -Universitat Rovira i Virgili.
7- Guía ISO 34:2000 (ILAC-G12) “International Organization for Standardization” Guide
34 - General requirements for the competence of reference materials producers”
Switzerland : ISO, 2000.
8- Disposición Nº 5040/2006, referido al Régimen de Buenas Prácticas para la
Realización de Estudios de Biodisponibilidad /Bioequivalencia.
9- ISO 8655, Piston-Operates volumetric apparatus, 2002.
10- DIN 12650, The Standard Committee for Laboratory Devices and Equipment in the
DIN (German Institute for Standardization) determines the regulations for conformity
testing and certification. The latest draft (4th Standard Proposal, 1996-07)
141

11- ISO 4787:2011, Laboratory glassware - Volumetric instruments - Methods for
testing of capacity and for use.
12- ASTM E 542-01, Standard Practice for Calibration of Laboratory Volumetric
Apparatus1 (2007).
13- IRAM 9102, Método de calibración y control del punto 0 °C, 4/12/1970.
14- Farmacología humana, J. Florez, J.A. Armijo, A. Mediavilla, España, Ed. Masson,
2005, pp. 530-531.
15- Effect of Diurnal Oscilations on the Time Course of Carbamazepine Autoinduction in
the Rhesus, Wedlund P, Levy R. Time-Dependent Kinetics VII: Monkey. J Pharmaceut
Sci. 1983.
16- Las bases farmacológicas de la terapéutica, Goodman y Gilman, editado por J.G.
Hardman y L. Limbird, McGraw-Hill, décima edición, 2003, Vol. 1,
17- Incertidumbre de medición en métodos de ensayo microbiológicos cuali y
cuantitativos, Susana Carnevali De Falke, (OAA) (2008).
18- Evaluación de la Incertidumbre de la medición, OAA (Organismo argentino de
aceditación) Alba N. Zaretzky, Buenos Aires- Argentina, 30 de abril del 2008.
19- Incertidumbre En Mediciones Químicas. Recta de Calibración; Kornblit, F.;
Puglisi,C. - INFOSIM n°8, 2002.
http://portal.oas.org/linkclick.aspx?fileticket=uy27xwj4w1w%3d&tabid=584
20- Nuevas consideraciones sobre incertidumbres y recta de calibración en Química
Analítica, Boletín informativo del sistema interamericano de metrología – OEA,
Querétara, México / Diciembre 2008.
http://www.sim metrologia.org.br/docs/revista__sim2008_20ene09.pdf
Se detallan otros documentos que fueron consultados para la elaboración del
trabajo:
- Incertidumbre en métodos analíticos de rutina. UNIVERSITST ROVIRA VIRGILI –
Facultad de química. Tesis Doctoral: 2002. Alicia Maroto Sánchez, Capitulo 2.4.2.1 -
Incertidumbre del valor de referencia.
- Materiales de referencia y comparaciones interlaboratorios. FUNDACION CENTRO
NACIONAL DE MEDIO AMBIENTE- CENMA. UNIVERSIDAD DE CHILE. Herramientas
para el control de calidad en laboratorios de ensayos., SANTIAGO DE CHILE (2006).
142

- Estrategias para el cálculo de incertidumbre, Instituto de estudios avanzados.
Universitst rovira virgili, departamento de química analítica y química orgánica, Alicia
Maroto, Ricar Boqué, Jordi Riu, F. Xavier Rius. PL. Imperial Tàrraco, 1. 43005-
Tarragona.
- Certified reference material BCR-649, Community Bureau of Reference (BCR),
Community Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM), Geel
(Belgium),2000.
- Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM), Geel (Belgium),2000.
- BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML, Guide to the expression of uncertainty
in measurement, ISO, Ginebra,1993.
- Incertidumbre y precisión. Técnicas de Laboratorio, Alicia Maroto, Ricard Boqué,
Jordi Riu, F. Xavier Rius, 266 (2001) 834-837.
- Estimating uncertainties using information from the validation process, Alicia
Maroto, Jordi Riu, Ricard Boqué, F. Xavier Rius, Analytica Chimica Acta 391 (1999)
173-185.
- IRAM 35050 Procedimientos para la evaluación de la incertidumbre de medición,
2001.
- IRAM 35051 Procedimientos para la evaluación de la incertidumbre de medición en
la calibración, 2004.
- IRAM 35052 Procedimientos para la evaluación de la incertidumbre en química
analítica, 5/3/2009
- IRAM 34552-1. Estadística. Vocabulario y símbolos. Parte 1: Definiciones de
probabilidad y de estadística general, 2003.
- IRAM 34553-1. Estadística. Exactitud (certeza, repetibilidad y reproducibilidad) de
los métodos de medición y de sus resultados. Parte 1: Principios generales y
definiciones, 2006.
143

- Resolución 1189/2007, Créase el Sistema Nacional de Evaluación Externa en
Servicios de Salud. Registros Nacionales de Entidades Evaluadoras Externas en
Servicios de Salud y de Servicios de Salud con Evaluación Externa. Requisitos;
Ministerio de Salud de la República Argentina, Boletín oficial de la República
Argentina, 24 de Septiembre del 2007, Buenos Aires.
- Estudio de la incertidumbre asociada a los resultados obtenido con ciertos
procedimientos de medida bioquímicos-clínicos- Bernardino González de la Presa.
- Measurement uncertainty revisited: Alternative approaches to uncertainty
evaluation. Michel Gouache y cols. A case study in the practical estimation of
measurement uncertainty. Accrued Quall Assure (2005) 10:107-111 EUROLAB
Technical Report 1/2007.
- Guide to the Evaluation of Measurement Uncertainty for Quantitative Test Results,
EUROLAB Technical Report 1/2006.
- Handbook for calculation of measurement uncertainty in environmental
laboratories, Edition 2, nor test, not techno report 537, approved 2004-02.
- Declaración de política referente a la trazabilidad metrológica, presentado en la
revista #5 del Organismo Argentino de Acreditación (OAA), Diciembre 2011.
12th International Congress of Therapeutic Drug Monitoring& Clinical Toxicology,
October 2 – 6,2011, Stuttgart, Germany.
- Norma nacional IRAM 2 – Sistema de unidades (1989)
- JCGM 200:2012– Vocabulario Internacional de Metrología – Conceptos
fundamentales y generales, y términos asociados (VIM).
- Declaración de política referente a la trazabilidad metrológica, revista número 5 del
Organismo Argentino de Acreditación (OAA), diciembre 2011.
144

145

1 - OBJETIVO
ANEXO N ° 1
PRÁCTICA DE FENOBARBITAL
Determinar los niveles séricos de fenobarbital para control de los niveles
circulantes en pacientes tratados en estado estacionario o en estudios de
biodisponibilidad, mediante cromatografía líquida de alta presión y detección
UV.
Preparación de soluciones patrón y calibradores.
2- ALCANCE
Todas las muestra cuya solicitud médica indiquen el procesamiento para esta
determinación.
3 - DESARROLLO
Para el procesamiento de las muestras se sigue el procedimiento
correspondiente al procesamiento de muestras en HPLC, donde se indican los
pasos para el procesamiento de controles, calibración, evaluación de
desempeño y procesamiento de muestras indicando los registros pertinentes.
3.1 FUNDAMENTO DEL TEST:
La cromatografía líquida de alta presión utilizando columnas de fase
reversa es una cromatografía en la cual el solvente o fase móvil es más
polar que la fase estacionaria. Esto se debe a que se utiliza un
componente químico no polar unido a la sílica como fase estacionaria,
en este caso cadenas de 18 carbonos. De esta forma, solventes
polares como agua, metanol, acetonitrilo, utilizadas en combinación con
bufferes de diferente fuerza iónica son utilizados para eluir la muestra.
Dado que la columna es no polar, moléculas más polares tendrán un
tiempo de retención menor, resultando dicho tiempo dependiente de la
polaridad y fuerza iónica de la fase móvil. El FBT entonces es eluido
aproximadamente a los 3-4 minutos siendo separado de los restantes
anticonvulsivantes y otros componentes que puedan estar presentes en
el suero. La detección se realiza por absorbancia a 210 nm.
146

3.2 REACTIVOS Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS:
Acetonitrilo grado HPLC
Agua destilada obtenida en el laboratorio
Acetato de sodio grado analítico
Columna Fase Reversa C18, 15 cm, 5 µm
Inyector 100 µl
Flujo 1-1,5 ml
Longitud de onda 210 nm
Fase Móvil: acetato de sodio 5 mM pH: 5,4 / Acetonotrilo 100:65.
La preparación de la fase móvil consiste en pesar 0,285g de acetato de
sodio (PM 82) y se lleva a aproximadamente 450 ml con agua. Agitar
hasta disolución de la droga. Se mide el pH utilizando el pHmetro
Hanna HI 98127. Se ajusta el pH a 5,4 con ácido acético 1/10 v/v del
concentrado (Glacial). Llevar a 500 ml con agua. Se guarda refrigerado.
La fase móvil se desgasifica por filtración al vacío.
3.3 MUESTRA:
0,5 ml de suero.
3.4 TÉCNICA:
100 µl de suero o calibrador o control se desproteinizan por el agregado
de 100 µl de acetonitrilo puro mas 10 µl de ZnSO4 al 10%. Se agita 30
segundos en vortex y luego se centrifuga durante 4 minutos a máxima
velocidad. 100 µl de sobrenadante límpido se pasan a tubo nuevo y se
diluye por el agregado de 300 µl de agua. Se agita en vortex y se
inyectan 100 µl en el sistema cromatográfico.
3.5 SOLUCIONES PATRONES Y CALIBRADOR:
Preparación de soluciones patrones
Patrones (son pesados en metanol). Pesar 5 mg de FBT y llevar a
volumen en matraz de 5 ml aforado y calibrado
Preparación de calibradores de FBT
Como calibradores se utilizan sueros libres de drogas y HIV negativos,
suplementados con concentraciones conocidas de standard. Se alicuota
en tubos nuevos y se congelan para ser utilizados en las siguientes
corridas.
Tomar 500 µl FBT volver a llevar a 5 ml en matraz aforado y calibrado
con agua o plasma libre de droga a medir (nivel 4). Conjuntamente se
agregan DFH y CBZ.
Nivel 3: tomar 1 ml de nivel 4 y diluir con 1 ml de agua o plasma libre
de droga.
147

Nivel 2: tomar 250 µl de nivel 4 y agregar 750 µl de agua o plasma
libre de droga.
Nivel 1: tomar 125 µl de nivel 4 y agregar 875 µl de agua o plasma
libre de droga.
Los calibradores así preparados corresponden a una concentración en
µg/ml de:
Droga Nivel 4 Nivel 3 Nivel 2 Nivel 1
Fenobarbital 100 50 25 12,5
Se abarca un rango de concentraciones que contenga el rango
terapéutico y se corren en el HPLC.
Se construye una curva de calibración de señal en función de
concentración. En esta curva se interpolan la señal de las muestras y
los controles y se obtiene el dato en concentración.
3.6 FRECUENCIA DE CALIBRACIÓN:
La calibración es diaria para cada corrida.
3.7 CONTROL DE CALIDAD:
Se utilizan los controles de calidad de BIO-RAD, Lyphochek therapeutic
drug monitoring (TDM) levels 1 /2 /3 alicuotados y guardados siguiendo
las especificaciones del fabricante.
Los mismos se procesan y corren a diario en cada corrida. Se acepta un
desvío máximo de +/- 2SD para los tres niveles de control. Por otro
lado, se realiza un seguimiento de CCI según se describe en el
procedimiento correspondiente.
El tiempo de retención del analito se determina en cada corrida
analítica, utilizando para ello el tiempo de retención del calibrador. Este
valor es registrado y es evaluado y aceptado por personal idóneo. La
identificación tanto de controles como de muestras se acepta si la señal
se encuentra en los +/-20 segundos del tiempo de retención fijado para
esa corrida.
Si existiesen dudas respecto de la identidad del pico, se procede a la
confirmación del tiempo de retención del analito, mediante el agregado
a la muestra de estándar externo de fenobarbital en alta concentración
evitando así el efecto de dilución.
3.8 CONTROL DE CALIDAD EXTERNO:
La determinación esta sometida a los controles quincenales del RIQAS
(Therapeutic drugs programme).
148

3.9 VALORES NORMALES:
Las concentraciones se expresan en µg/ml de suero y los valores
normales son: de 15 hasta 40.
3.10 INTERFERENCIAS:
Si la muestra presenta un pico irregular, asimétrico o una interferencia
que absorbe e esta longitud de onda no permitiendo ver el pico se
solicita nueva muestra si no se supera el problema repitiendo la
inyección.
3.11 INTERPRETACIÓN:
Debido a que esta determinación se le solicita comúnmente a pacientes
a los que se les ha suministrado la droga, de encontrarse un valor no
detectable luego de repetir el dosaje, se realiza una consulta al paciente
para confirmar el pedido. Por el contrario de encontrar una muestra con
un resultado mayor a 2 veces el valor normal alto, debido a la toxicidad
de la droga, se sigue el procedimiento de comunicación de valores
pánico.
3.12 RANGO ANALITICO: 1,25 a 100.
3.13 RANGO REPORTABLE: 1,3 a 200 µg/ml (en caso de obtener un
resultado mayor a 100 ug/ml, la muestra se diluye al ½).
3.14 VALORES PÁNICO: mayor de 70 µg/ml.
149

1 - OBJETIVO
ANEXO N ° 2
PRÁCTICA DE CARBAMAZEPINA
Determinar los niveles séricos de carbamacepina para control de los niveles
circulantes en pacientes tratados en estado estacionario o en estudios de
biodisponibilidad, mediante cromatografía líquida de alta presión y detección
UV.
Preparación de soluciones patrón y calibradores.
2 - ALCANCE
Todas las muestra cuya solicitud médica indiquen el procesamiento para esta
determinación.
3 - DESARROLLO
Para el procesamiento de las muestras se sigue el procedimiento
correspondiente al procesamiento de muestras en HPLC, donde se indican los
pasos para el procesamiento de controles, calibración, evaluación de
desempeño y procesamiento de muestras indicando los registros pertinentes.
3.1 FUNDAMENTO DEL TEST:
La cromatografía líquida de alta presión utilizando columnas de fase
reversa es una cromatografía en la cual el solvente o fase móvil es más
polar que la fase estacionaria. Esto se debe a que se utiliza un
componente químico no polar unido a la sílica como fase estacionaria,
en este caso cadenas de 18 carbonos. De esta forma, solventes
polares como agua, metanol, acetonitrilo, utilizadas en combinación con
bufferes de diferente fuerza iónica son utilizados para eluir la muestra.
Dado que la columna es no polar, moléculas más polares tendrán un
tiempo de retención menor, resultando dicho tiempo dependiente de la
polaridad y fuerza iónica de la fase móvil.
La CBZ entonces es eluído aproximadamente a los 6-7 minutos siendo
separado de los restantes anticonvulsivantes y otros componentes que
puedan estar presentes en el suero. La detección se realiza por
absorbancia a 210 nm.
150

3.2 REACTIVOS Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS:
Acetonitrilo grado HPLC
Agua destilada obtenida en el laboratorio
Acetato de sodio grado analítico
ZnSO4
Columna fase reversa C18, 15 cm, 5 µm
Inyector 100 µl
Flujo 1-1,5 ml
Longitud de onda 210 nm
Fase Móvil: acetato de sodio 5 mM pH: 5,4 / Acetonotrilo 100:65
La preparación de la fase móvil consiste en 0,285g de Acetato de sodio
(PM 82) y se lleva a aproximadamente 450 ml con agua. Agitar hasta
disolución de la sal. Se mide el pH utilizando el pHmetro Hanna HI
98127. Se ajusta el pH a 5,4 con ácido acético 1/10 v/v del concentrado
(Glacial). Llevar a 500 ml con agua. Se guarda refrigerado.
La fase móvil se desgasifica por filtración al vacío.
3.3 MUESTRA:
0,5 ml de suero.
3.4 TÉCNICA:
100 µl de suero o calibrador o control se desproteinizan por el agregado
de 100 µl de acetonitrilo puro 10 µl de ZnSO4 al 10%. Se agita 30
segundos en vortex a máxima velocidad y luego se centrifuga durante 4
min a maxima velocidad. 100 µl de sobrenadante límpido se pasan a
tubo nuevo y se diluye por el agregado de 300 µl de agua. Se agita en
vortex y se inyectan 100 µl en el sistema cromatográfico.
3.5 SOLUCIONES PATRONES Y CALIBRADOR:
Preparación de soluciones patrones
Patrones (son pesados en metanol). Pesar 5 mg de CBZ y llevar a
volumen en matraz de 5 ml aforado y calibrado.
Preparación de calibradores de CBZ
Como matriz de los calibradores se utilizan agua o sueros libres de
drogas y HIV negativos, suplementados con concentraciones conocidas
de Standard. Se alicuota en tubos nuevos y se congelan para ser
utilizados en las siguientes corridas.
Tomar 100 µl CBZ volver a llevar a 5 ml en matraz aforado y calibrado
con agua o plasma libre de droga a medir (nivel 4). Conjuntamente se
agregan DFH y FBT.
151

Nivel 3: tomar 1 ml de nivel 4 y diluir con 1 ml de agua o plasma libre
de droga.
Nivel 2: tomar 250 µl de nivel 4 y agregar 750 µl de agua o plasma libre
de droga.
Nivel 1: tomar 125 µl de nivel 4 y agregar 875 µl de agua o plasma
libre de droga.
Los calibradores así preparados corresponden a una concentración en
µg/ml de:
Droga Nivel 4 Nivel 3 Nivel 2 Nivel 1
Carbamacepina 20 10 5 2,5
Se abarca un rango de concentraciones que contenga el rango
terapéutico y se corren en el HPLC.
Se construye una curva de calibración de señal en función de
concentración. En esta curva se interpolan la señal de las muestras y
los controles y se obtiene el dato en concentración.
3.6 FRECUENCIA DE CALIBRACIÓN:
La calibración es diaria para cada corrida.
3.7 CONTROL DE CALIDAD Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN:
Se utilizan los controles de calidad de BIO-RAD, Lyphochek therapeutic
drug monitoring (TDM) levels 1 /2 /3 alicuotados y guardados siguiendo
las especificaciones del fabricante.
Los mismos se procesan y corren a diario en cada corrida. Se acepta
un desvío máximo de +/- 2SD para los 3 niveles de Control. Por otro
lado, se realiza un seguimiento de CCI según el procedimiento
correspondiente.
El tiempo de retención del analito se determina en cada corrida
analítica, utilizando para ello el tiempo de retención del calibrador. Este
valor es registrado, es evaluado y aceptado por personal idóneo. La
identificación tanto de controles como de muestras se acepta si la señal
se encuentra en los +/-25 segundos del tiempo de retención fijado para
esa corrida.
Si existiesen dudas respecto de la identidad del pico, se procede a la
confirmación del tiempo de retención del analito, mediante el agregado
a la muestra de estándar externo de carbamazepina en alta
concentración evitando así el efecto de dilución.
3.8 CONTROL DE CALIDAD EXTERNO:
152

La determinación esta sometida a los controles quincenales del RIQAS
(Therapeutic drugs programme).
3.9 VALORES NORMALES:
Las concentraciones se expresan en µg/ml de suero y los valores
normales son: de 4 hasta 10 µg/ml.
3.10 INTERFERENCIAS:
Si la muestra presenta un pico irregular, asimétrico o una interferencia
que absorbe e esta longitud de onda no permitiendo ver el pico se
solicita nueva muestra.
3.11 INTERPRETACIÓN:
Debido a que esta determinación se le solicita comúnmente a pacientes
a los que se les ha suministrado la droga, de encontrarse un valor no
detectable luego de repetir el dosaje, se realiza una consulta al paciente
para confirmar el pedido. Por el contrario de encontrar una muestra con
un resultado mayor a 2 veces el valor normal alto, debido a la toxicidad
de la droga, se sigue el procedimiento de comunicación de valores
pánico.
3.12 RANGO ANALITICO: 0,25 a 20 µg/ml.
3.13 RANGO REPORTABLE: 0,3 a 40 µg/ml (en caso de obtener un resultado
mayor a 20 ug/ml, la muestra se diluye al ½).
3.14 VALOR PÁNICO: mayor de 20 µg/ml.
153

1 - OBJETIVO
ANEXO N ° 3
PRÁCTICA DE DIFENILHIDANTOÍNA
Determinar los niveles séricos de difenilhidantoina para control de los niveles
circulantes en pacientes tratados en estado estacionario o en estudios de
biodisponibilidad, mediante cromatografía líquida de alta presión y detección
UV.
Preparación de soluciones patrón y calibrador.
2 - ALCANCE
Todas las muestra cuya solicitud médica indiquen el procesamiento para esta
determinación.
3 - DESARROLLO
Para el procesamiento de las muestras se sigue el procedimiento
correspondiente al procesamiento de muestras en HPLC, donde se indican los
pasos para el procesamiento de controles, calibración, evaluación de
desempeño y procesamiento de muestras indicando los registros pertinentes.
3.1 FUNDAMENTO DEL TEST:
La cromatografía líquida de alta presión utilizando columnas de fase
reversa es una cromatografía en la cual el solvente o fase móvil es más
polar que la fase estacionaria. Esto se debe a que se utiliza un
componente químico no polar unido a la silica como fase estacionaria,
en este caso cadenas de 18 carbonos. De esta forma, solventes
polares como agua, metanol, acetonitrilo, utilizadas en combinación con
buffers de diferente fuerza iónica son utilizados para eluir la muestra.
Dado que la columna es no polar, moléculas más polares tendrán un
tiempo de retención menor, resultando dicho tiempo dependiente de la
polaridad y fuerza iónica de la fase móvil.
La DFH entonces es eluida aproximadamente a los 7-8 minutos siendo
separada de los restantes anticonvulsivantes y otros componentes que
154

puedan estar presentes en el suero. La detección se realiza por
absorbancia a 210 nm.
3.2 REACTIVOS Y CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS:
Acetonitrilo grado HPLC
Agua destilada obtenida en el laboratorio
Acetato de sodio grado analítico
Columna fase reversa C18, 15 cm, 5 µm
Inyector 100 µl
Flujo 1-1,5 ml
Longitud de onda 210 nm
Fase Móvil: acetato de sodio 5 mM pH: 5,4 / Acetonotrilo 100:65
La preparación de la fase móvil consiste en pesar 0,285g de acetato de
sodio (PM 82) y se lleva a aproximadamente 450 ml con agua. Agitar
hasta disolución de la droga. Se mide el pH utilizando el pHmetro
Hanna HI 98127. Se ajusta el pH a 5,4 con acido acético 1/10 v/v del
concentrado (Glacial). Llevar a 500 ml con agua. Se guarda refrigerado.
La fase móvil se desgasifica por filtración al vacío.
3.3 MUESTRA:
0,5 ml de suero.
3.4 TÉCNICA:
100 µl de suero o calibrador o control se desproteinizan por el agregado
de 100 µl de acetonitrilo puro mas 10 ul de Zn SO4.al 10% Se agita 30
segundos en vortex a máxima velocidad y luego se centrifuga durante 4
minutos a máxima velocidad. 100 µl de sobrenadante límpido se pasan
a tubo nuevo y se diluye por el agregado de 300 µl de agua. Se agita
en vortex y se inyectan 100 µl en el sistema cromatográfico.
3.5 SOLUCIONES PATRONES Y CALIBRADOR:
Preparación de soluciones patrones
Patrones (son pesados en metanol). Pesar 5 mg de DFH y llevar a
volumen en matraz de 5 ml aforado y calibrado.
Preparación de calibradores de DFH
Como calibradores se utilizan agua o plasma suero libres de drogas y
HIV negativos, suplementados con concentraciones conocidas de
standard. Se alícuota en tubos nuevos y se congelan para ser utilizados
en las siguientes corridas.
Tomar 125 µl DFH volver a llevar a 5 ml en matraz aforado y calibrado
con agua o plasma libre de droga a medir (nivel 4). Conjuntamente se
agregan CBZ y FBT.
155

Nivel 3: tomar 1 ml de nivel 4 y diluir con 1 ml de agua o plasma libre
de droga.
Nivel 2: tomar 250 µl de nivel 4 y agregar 750 µl de agua o plasma libre
de droga.
Nivel 1: tomar 125 µl de nivel 4 y agregar 875 µl de agua o plasma libre
de droga.
Los calibradores así preparados corresponden a una concentración en
µg/ml de:
Droga Nivel 4 Nivel 3 Nivel 2 Nivel 1
Difenilhidantoía 25 12,5 6,25 3,125
Se abarca un rango de concentraciones que contenga el rango
terapéutico y se corren en el HPLC.
Se construye una curva de calibración de señal en función de
concentración. En esta curva se interpolan la señal de las muestras y
los controles y se obtiene el dato en concentración.
3.6 FRECUENCIA DE CALIBRACIÓN:
La calibración es diaria para cada corrida.
3.7 CONTROL DE CALIDAD:
Se utilizan los controles de calidad de BIO-RAD, Lyphochek therapeutic
drug monitoring (TDM) levels 1 /2 /3 alicuotados y guardados siguiendo
las especificaciones del fabricante.
Los mismos se procesan y corren a diario en cada corrida. Se acepta
un desvío máximo de +/-2SD para los tres niveles de control. Por otro
lado, se realiza un seguimiento de CCI según el procedimiento
correspondiente.
El tiempo de retención del analito se determina en cada corrida
analítica, utilizando para ello el tiempo de retención del calibrador. Este
valor es registrado y es evaluado y aceptado por personal idóneo. La
identificación tanto de controles como de muestras se acepta si la señal
se encuentra en los +/-30 segundos del tiempo de retención fijado para
esa corrida.
Si existiesen dudas respecto de la identidad del pico, se procede a la
confirmación del tiempo de retención del analito, mediante el agregado
a la muestra de estándar externo de difenilhidantoína en alta
concentración evitando así el efecto de dilución.
156

3.8 CONTROL DE CALIDAD EXTERNO:
La determinación esta sometida a los controles quincenales del RIQAS
(Therapeutic drugs programme).
3.9 VALORES NORMALES:
Las concentraciones se expresan en µg/ml de suero y los valores
normales son: de 10 hasta 20.
3.10 INTERFERENCIAS:
Si la muestra presenta un pico irregular, asimétrico o una interferencia
que absorbe en esta longitud de onda no permitiendo ver el pico se
solicita nueva muestra.
3.11 INTERPRETACIÓN:
Debido a que esta determinación se le solicita comúnmente a pacientes
a los que se les ha suministrado la droga, de encontrarse un valor no
detectable luego de repetir el dosaje, se realiza una consulta al paciente
para confirmar el pedido. Por el contrario de encontrar una muestra con
un resultado mayor a 2 veces el valor normal alto, debido a la toxicidad
de la droga, se sigue el procedimiento de comunicación de valores
pánico.
3.12 RANGO ANALÍTICO: 0,31 a 25 µg/ml
3.13 RANGO REPORTABLE: 0,4 a 50 µg/ml (en caso de obtener un resultado
mayor a 25 ug/ml, la muestra se diluye al ½).
3.14 VALOR PÁNICO: mayor de 30 µg/ml.
157

Precisión Interdía
ANEXO Nª 4
DATOS DE LA VALIDACIÓN
FBT QC 1 QC 2 QC 3 CBZ QC 1
QC
2 QC 3 DFH QC 1 QC 2 QC 3
28/06/2010 11,67 28,77 62,03 28/06/2010 3,24 9,07 14,60 28/06/2010 6,79 12,61 21,84
11,61 28,87 61,43 3,04 9,04 14,42 6,60 12,82 22,57
11,33 28,58 62,17 3,03 9,01 14,29 6,59 13,06 22,77
11,11 28,61 64,60 3,01 9,02 14,00 6,79 12,55 22,14
11,30 29,06 62,41 2,98 8,87 14,74 6,77 12,65 22,61
30/06/2010 11,21 27,86 62,02 30/06/2010 3,15 8,78 14,25 30/06/2010 6,86 12,69 22,17
11,42 29,24 60,67 3,09 8,87 14,50 6,76 12,61 21,71
10,99 27,67 60,36 3,18 8,62 13,98 6,77 13,05 22,70
11,50 28,03 63,37 3,10 8,91 14,89 6,84 12,73 21,57
11,06 27,71 59,34 3,04 8,77 14,32 6,74 13,13 22,99
01/07/2010 11,52 26,40 62,77 24/11/2009 3,24 9,08 13,83 24/11/2009 6,80 12,84 21,28
11,71 25,95 62,14 2,95 9,20 14,59 6,83 13,20 21,67
11,60 25,92 62,91 3,23 9,40 14,55 6,89 12,99 21,65
11,33 25,52 63,41 3,15 9,16 14,58 6,70 12,76 22,11
11,53 30,57 61,96 3,11 9,09 14,83 6,61 12,73 22,77
Media 11,39 27,92 62,10 Media 3,12 8,99 14,42 Media 6,76 12,83 22,17
DS 0,23 1,43 1,31 DS 0,09 0,24 0,31 DS 0,09 0,21 0,54
CV% 2,00 5,13 2,11 CV% 2,79 2,65 2,17 CV% 1,38 1,62 2,41
158

Exactitud, precisión, linealidad y límite de cuantificación
159

Linealidad y límite de cuantificación
160

Precisión, exactitud y linealidad
161

Recuperación
DFH DFH
nivel 1 agua nivel 1 suero Recup % nivel 2 agua nivel 2suero Recup %
17,298 17,218 38,88 38,734
17,588 17,743 38,077 37,436
17,284 16,787 38,879 36,59
17,39 17,25 100,82 38,61 37,59 102,73
Agua Plasma
DFH DFH agua plasma Media SD CV% Media SD CV%
nivel 4 agua nivel 4 suero Recup % 3,125 17,298 17,218
63,314 59,687 3,125 17,588 17,743 17,39 0,17 0,99 17,25 0,48 2,78
65,238 57,978 3,125 17,284 16,787
64,905 59,128 6,25 38,88 38,734
64,49 58,93 109,43 6,25 38,077 37,436 38,61 0,46 1,20 37,59 1,08 2,87
6,25 38,879 36,59
DFH
25
25
127,276
129,708
127,102
128,118 128,93 1,43 1,11 126,13 2,61 2,07
140
25 129,81 123,174
120
100
80
60
40
20
y = 5,0007x + 4,3452
R 2 = 0,9975
y = 4,8885x + 4,3086
R 2 = 0,9972
0
0 10 20 30
Carba
nivel 1 agua nivel 1 suero Recup % Carba
31,416 31,863 nivel 2 agua nivel 2 suero Recup %
31,273 31,518 63,841 64,375
31,094 30,783 63,233 64,895
31,26 31,39 99,60 63,305 65,76
63,46 65,01 97,62
agua
plasm
Carba
Agua Plasma
nivel 4 agua nivel 4 suero Recup % Carba agua plasma Media SD CV% Media SD CV%
227,716 229,028 2,5 31,416 31,863
227,68 223,24 2,5 31,273 31,518 31,26 0,16 0,52 31,39 0,55 1,76
227,874 223,546 2,5 31,094 30,783
227,76 225,27 101,10 5 63,841 64,375
5 63,233 64,895 63,46 0,33 0,52 65,01 0,70 1,08
Carba
5
20
63,305
227,716
65,76
229,028
250
20
20
227,68
227,874
223,24
223,546
227,76 0,10 0,05 225,27 3,26 1,45
200
150
100
50
y = 11,132x + 5,4461
R 2 = 0,9996
y = 10,941x + 6,9281
R 2 = 0,9987
0
0 5 10 15 20 25
agua
plasm
162

Feno Feno
nivel 1 agua nivel 1 suero Recup % nivel 2 agua nivel 2 suero Recup %
105,346 106,768 212,452 212,201
105,553 106,202 211,513 212,466
105,924 104,188 211,472 214,193
105,61 105,72 99,89 211,81 212,95 99,46
Feno
Agua Plasma
nivel 4 agua nivel 4 suero Recup % Feno agua plasma Media SD CV% Media SD CV%
777,044 797,816 12,5 105,346 106,768
777,862 781,964 12,5 105,553 106,202 105,61 0,29 0,28 105,72 1,36 1,28
778,538 775,852 12,5 105,924 104,188
777,81 785,21 99,06 25 212,452 212,201
25 211,513 212,466 211,81 0,55 0,26 212,95 1,08 0,51
25 211,472 214,193
Feno
75 777,044 797,816
900
75 777,862 781,964 777,81 0,75 0,10 785,21 11,34 1,44
800
75 778,538 775,852
700
600
500
400
300
y = 10,917x - 44,297
R 2 = 0,9982
y = 11,036x - 45,876
R 2 200
100
0
= 0,9978
0 20 40 60 80
agua
plasm
163

Estabilidad de los calibradores (a largo plazo)
Estabilidad: desde 05-03-2010 hasta 07-06-2010
ug/ml 05-Mar 10-Mar 15-Mar 26-Mar 09-Abr 19-Abr 19-May 26-May 07-Jun CV% Prom SD
FBT
12,5 85,131 87,828 83,963 95,475 87,528 84,508 80,715 78,501 64,058 10,3 83,1 8,6
25 170,774 167,150 160,932 189,914 157,958 170,538 158,210 153,710 126,312 10,6 161,7 17,1
50 327,773 335,086 327,382 367,423 306,318 347,462 311,844 292,284 273,376 8,9 321,0 28,6
100 699,904 675,425 610,687 717,624 572,791 687,126 634,105 581,932 525,299 10,4 633,9 65,9
CBZ
2,5 28,205 30,123 26,289 31,989 29,042 28,045 26,314 22,757 18,837 14,8 26,8 4,0
5 56,775 55,558 51,028 60,465 52,542 54,508 48,194 45,786 36,985 13,6 51,3 7,0
10 113,245 113,213 103,618 124,414 101,647 109,352 97,343 84,595 83,537 13,1 103,4 13,5
20 237,099 230,762 194,183 240,671 191,430 226,366 193,471 170,457 158,172 14,7 204,7 30,1
DFH
3,125 22,540 21,174 18,479 20,159 16,149 16,027 17,819 15,487 15,847 14,2 18,2 2,6
6,25 39,169 37,938 37,030 45,660 31,274 33,424 31,912 31,569 29,532 14,5 35,3 5,1
12,5 81,687 77,247 73,627 86,080 59,519 63,812 66,167 56,737 64,710 14,5 70,0 10,2
25 165,355 156,247 139,363 169,724 122,063 149,483 129,949 116,651 121,032 14,2 141,1 20,0
164