N-acetyl-β-D-Glucosaminidase - Spinreact

Quantitative determination of N-acetyl-β-D-Glucosaminidase
(NAG) in urine
IVD
Store at 2-8ºC
PRINCIPLE OF THE METHOD
NAG hydrolyses ammonium 5-[4-(2- acetamido-2-deoxy-beta-Dglucopyranosyloxy)-3-
methoxyphenylmethylene]-2-thioxothiazolidin-
4-one-3-ethanoate (VRA-GlcNAc), the product formation is detected
by development of color at 505nm upon addition of alkaline buffer.
CLINICAL SIGNIFICANCE
NAG is a lysosomal enzyme involved in the breakdown metabolism of
glycoproteins. Increased NAG levels in urine are an early indication of
renal disease and can serve as a valuable renal monitoring test in
disorders such as nephritic syndrome, glomerulunephritis, drug abuse
associated nephrotoxicity, diabetes-associated nephropathy,
hypertension and urinary tract infections.
REAGENTS
R 1
R 2
Citrate acid buffer pH 4.8
VRA-GlcNAc 1mM
Stabilizer
Na2CO3 buffer pH 9.5
Stabilizer
NAG CAL Ref. 1002235
PREPARATION
Reagents are ready to use.
NAG CAL: reconstitute with 2mL of distilled water. Close vial and let
stand for 24 hours at 2-8ºC to equilibrate before using, dissolving
contents completely by swirling gently.
PRECAUTIONS
Solution R1 and NAG CAL contain Sodium Azide. Avoid ingestion or
contact with skin or mucous membranes. In case of skin contact, flush
affected area with copious amounts of water. In case of contact with
eyes or if ingested, seek immediate medical attention. See MSDS for
disposal of the product.
All specimens used in this test should be considered potentially
infectious.
CALIBRATION
Recommend that this assay should be calibrated using NAG
Calibrator ref.1002235 included in the kit.
STORAGE AND STABILITY
R1 and R2 are stable until the expiration date on the label when
stored tightly closed at 2-8ºC, protected from light and contaminations
prevented during their use. Stability: 1 month at 2-8ºC after opening, if
contamination avoided and vials recapped immediately after use.
NAG CAL: Lyophilized NAG calibrator is stable until the expiry date
indicated on the lable when stored at -20ºC. Reconstituted NAG
calibrator is stable for 2 weeks when stored at 2-8 ºC.
Do not use reagents over the expiration date.
Signs of reagent deterioration:
- Presence of particles and turbidity.
ADDITIONAL EQUIPMENT
- Spectrophotometer or colorimeter measuring at 505/700 nm.
- Thermostatic bath at 37ºC ( 0.1ºC)
- Matched cuvettes 1.0 cm light path.
- General laboratory equipment.
SAMPLES
Fresh urine samples should be used when possible. However, urine
samples can be stored for one week at 2-8ºC or up to 1 month at -
20℃ without significantly affecting NAG activity. Samples containing
low amount of preservative can be used (less than 0.02% sodium
azide). NAG activity is pH-sensitive, hence urine samples should
have a pH range between 4.0-8.0.
PROCEDURE
1. Assay conditions:
Wavelength (main/sub): . . . . . . . . . . . .505 nm/700 nm
Cuvette: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . 1 cm light path
Constant temperature . . . . . . . . . . . . ………………37ºC
N-acetyl-β-D-Glucosaminidase
Colorimetric
2. Pipette into a cuvette:
BEIS50-I 23/06/11 SPINREACT,S.A./S.A.U. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN
Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: spinreact@spinreact.com
NAG
Reagent blank Sample
Distilled water ( L) 30 --
Sample ( L) -- 30
Reagent 1 ( L) 450 450
3. Mix and incubate for 5 minutes. Read initial absorbance A1.
4. Add:
Reagent 2 ( L) 150 150
5. Mix and incubate for 5 minutes. Read final absorbance A2.
6. Calculate the absorbance change ΔA=A2-A1.
CALCULATIONS
ΔAsample -ΔAblank
NAG (U/L) = × Calibrator value
ΔAcalibrator -ΔAblank
Units: One international unit (IU) is the amount of enzyme that
transforms 1 mol of substrate per minute, in standard conditions. The
concentration is expressed in units per litre of sample (U/L).
QUALITY CONTROL
Control sera are recommended to monitor the performance of assay
procedures: NAG Control ref. 1002237.
If control values are found outside the defined range, check the
instrument, reagents and technique for problems.
Each laboratory should establish its own Quality Control scheme and
corrective actions if controls do not meet the acceptable tolerances.
REFERENCE VALUES
Urine: 0.3 – 12 U/L
These values are for orientation purpose; each laboratory should
establish its own reference range.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
Linearity: The method is linear between of 1 - 300 U/L.
If the results obtained were greater than linearity limit, dilute the sample
1/2 with NaCl 9 g/L and multiply the result by 2.
Precision:
Intra-assay (n=20) Inter-assay (n=5)
Mean (U/L) 40.8 40.8
SD 0.23 0.44
CV (%) 0.55 1.07
Sensitivity: The minimum detectable level that can be distinguished
from zero has been determined as 0.29U/L.
Accuracy: Results obtained using SPINREACT reagents (y) did not
show systematic differences when compared with other commercial
reagents (x).
The results obtained were the following:
Correlation coefficient (r): 0.9996.
Regression equation: y= 1.5655 x + 1.3439
The results of the performance characteristics depend on the analyzer
used.
INTERFERENCES
Bilirrubin (up to 12 mg/dL), Ascorbic acid (up to 60 mg/dL), BSA (up to
100 mg/dL) and Urea (up to 6 g/dL) do not interfere.
NOTES
SPINREACT has instruction sheets for several automatic analyzers.
Instructions for many of them are available on request.
BIBLIOGRAPHY
1. Krishna KS,Kirubakaran MG,Pandey AP,et al.Urinary NAG and AAP in the diagnosis of
graft rejection after live donor renal transplantation. Clin Chim Acta,1985,150(2):69-85.
2.IIstran pocsl et.al. VRA-GlcNAc: novel substrate for N-Acetyl-β-D-glucosaminidase
applied to assay of this enzyme in urine.Clinical chemisty, 1990,36(11): 1884-1888
PACKAGING
Ref: 1001072 Cont.
R1: 1x60 mL R2: 1x20 mL
CAL: 1 x 2 mL

Determinación Cuantitativa de N-acetil-β-D-Glucosaminidasa
(NAG) en orina
IVD
Conservar a 2-8ºC
PRINCIPIO DEL MÉTODO
NAG hidroliza amonio 5-[4-(2- acetamida-2-deoxi-beta-Dglucopiranosiloxi)-3-metoxifenilmetileno]-2-tioxotiazolidina4-uno-3etanoato
(VRA-GlcNAc), la formación del producto se detecta por el
desarrollo del color a 505nm al añadir un tampón alcalino.
SIGNIFICADO CLÍNICO
NAG es una enzima lisosómica involucrada en la rotura del metabolismo
de glicoproteínas. Niveles altos de NAG en la orina son una indicación
prematura de enfermedad renal y puede servir como una prueba renal
valiosa en desórdenes tales como síndrome nefrítico, glomerulunefritis,
abuso de drogas asociadas con nefrotoxicidad, diabetes asociada con
nefropatía, hipertensión e infecciones del tracto urinario.
REACTIVOS
R 1
R 2
Tampón Citrato ácido pH 4.8
VRA-GlcNAc 1mM
Estabilizador
Tampón Na2CO3 pH 9.5
Estabilizador
NAG CAL Ref. 1002235
PREPARACIÓN
Los reactivos están listos para su uso.
NAG CAL: reconstituir con 2 mL de agua destilada. Cerrar el vial y dejar
reposar durante 24 horas a 2-8ºC para que se equilibre antes de usar,
agitando suavemente para disolver el contenido completamente.
PRECAUCIONES
La solución R1 y NAG CAL contienen Azida de Sodio. Evitar la ingestión o
el contacto con la piel o membranas mucosas. En caso de contacto con la
piel, limpiar la zona afectada con abundante agua. En caso de contacto
con los ojos o ingestión, acudir inmediatamente al médico. Ver MSDS
para disposición del producto
Todos los especímenes utilizados en esta prueba se deben considerar
como potencialmente infecciosos.
CALIBRACIÓN
Se recomienda que la prueba se calibre utilizando el Calibrador NAG
ref.1002235 incluido en el kit.
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
R1 y R2 son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta,
cuando se mantienen bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se
evita su contaminación durante el uso.
Estabilidad: 1 mes a 2-8ºC una vez abierto, si se evita la contaminación y
los viales se tapan inmediatamente después de su uso.
NAG CAL: El Calibrador NAG liofilizado es estable hasta la fecha de
caducidad indicada en el envase cuando se conserva a -20ºC. El
Calibrador NAG reconstituido es estable durante 2 semanas cuando se
conserva a 2-8ºC.
No utilice reactivos fuera de la fecha indicada.
Indicadores de deterioro de los reactivos:
- Presencia de partículas y turbidez.
MATERIAL ADICIONAL
- Espectrofotómetro o colorímetro para mediciones a 505/700 nm.
- Baño termostático a 37ºC ( 0.1ºC)
- Cubetas de paso de luz de 1,0 cm.
- Equipamiento habitual de laboratorio.
MUESTRAS
Cuando sea posible se deben utilizar muestras frescas de orina. Sin
embargo, las muestras de orina se pueden conservar durante una semana
a 2-8ºC o hasta 1 mes a -20℃ sin afectar la actividad del NAG. Se pueden
utilizar muestras con bajo contenido en persevantes (menos de 0,02% de
azida de sodio). La actividad de NAG es sensible al pH, por lo tanto las
muestras de orina deben tener un pH entre 4.0-8.0.
PROCEDIMIENTO
Condiciones del ensayo:
1. Longitud de onda (principal/sub): . . . . . . . . . . . .505 nm/700
nm
N-acetil-β-D-Glucosaminidasa
Colorimétrico
BEIS50-E 23/06/11 SPINREACT,S.A./S.A.U. Ctra.Santa Coloma, 7 E-17176 SANT ESTEVE DE BAS (GI) SPAIN
Tel. +34 972 69 08 00 Fax +34 972 69 00 99. e-mail: spinreact@spinreact.com
NAG
Cubeta: . . . . . . . . . . . . . . . . ……... . . . .. . . . paso de luz de 1 cm
Temperatura constante . . . . …………. . . . . . . . ………………37ºC
1. Pipetear en una cubeta:
Blanco Muestra
Agua destilada ( L) 30 --
Muestra ( L) -- 30
Reactivo 1 ( L) 450 450
2. Mezclar e incubar durante 5 minutos. Leer la absorbancia A1 inicial.
3. Añadir:
Reactivo 2 ( L) 150 150
4. Mezclar e incubar durante 5 minutos. Leer la absorbancia A2 final.
5. Calcular el cambio de absorbancia ΔA=A2-A1.
CÁLCULOS
ΔAmuestra -ΔAblanco
NAG (U/L) = × Valor Calibrador
ΔAcalibrador -ΔAblanco
Unidades: Una unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que
convierte 1 moL de sustrato por minuto, en condiciones estándar. La
concentración se expresa en unidades por litro (U/L).
CONTROL DE CALIDAD
Es conveniente analizar junto con las muestras control valorados: Control
NAG ref. 1002237.
Si los valores de control están fuera del rango definido, se debe revisar el
instrumento, los reactivos y la técnica.
Cada laboratorio deberá disponer su propio Control de Calidad y establecer
correcciones en el caso que los controles no cumplan con las tolerancias.
VALORES DE REFERENCIA
Orina: 0.3 – 12 U/L
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio
establezca sus propios valores de referencia.
CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
Linealidad: La prueba es lineal entre 1 - 300 U/L.
Si los resultados obtenidos fuesen mayores que el límite de linealidad, diluir
1/2 con NaCl 9 g/L y multiplicar el resultado por 2.
Precisión:
Intraserie (n=20) Interserie (n=5)
Media (U/L) 40.8 40.8
SD 0.23 0.44
CV (%) 0.55 1.07
Sensibilidad: La concentración mínima detectable es 0,29U/L.
Exactitud: Los reactivos SPINREACT (y) no muestran diferencias
sistemáticas significativas cuando se comparan con otros reactivos
comerciales (x).
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Coeficiente de correlación (r): 0.9996.
Ecuación de la recta de regresión: y= 1,5655x + 1,3439
Las características del método varían según el analizador utilizado.
INTERFERENCIAS
No se han observado interferencias con Bilirrubina (hasta 12 mg/dL), ácido
ascórbico (hasta 60 mg/dL), BSA (hasta 100 mg/dL) y Urea (hasta 6 g/dL).
NOTAS
SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de
este reactivo en distintos analizadores.
BIBLIOGRAFÍA
1. Krishna KS,Kirubakaran MG,Pandey AP,et al.Urinary NAG and AAP in the
diagnosis of graft rejection after live donor renal transplantation. Clin Chim
Acta,1985,150(2):69-85.
2.IIstran pocsl et.al. VRA-GlcNAc: novel substrate for N-Acetyl-β-Dglucosaminidase
applied to assay of this enzyme in urine.Clinical chemisty,
1990,36(11): 1884-1888
PRESENTACIÓN
Ref: 1001072 Cont.
R1: 1x60 mL R2: 1x20 mL
CAL: 1 x 2 mL