Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico y de ...

Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico y de químicos
presentes en la fase fluida (III):
Perspectivas de investigación en la técnica del esputo inducido. El estudio
de muestras mediante citometría de flujo
S. Quirce Gancedo 1 , J. Villarubia 2 , A. Pacheco 3
ESTUDIO DE MUESTRAS DE ESPUTO
INDUCIDO Y MARCADORES
MOLECULARES
Las técnicas inmunohistoquímicas constituyen
un método versátil y adecuado para detectar antígenos
y marcadores celulares que sólo recientemente
se han aplicado al estudio del esputo. Tras
la dispersión del esputo con DTT pueden obtenerse
muestras (“cytospins”) aptas para su procesamiento
y marcaje con técnicas inmunocitoquímicas
que permiten la detección de ciertos antígenos
celulares. Girgis-Gabardo et al 1 han utilizado esta
técnica para detectar la proteína EG-2+ (producto
de conversión de la ECP) en eosinófilos así como
la proteína GM-CSF en macrófagos y eosinófilos
del esputo.
El sobrenadante del esputo puede ser procesado
para medir marcadores moleculares que reflejan
determinados aspectos de la inflamación de las
vías respiratorias 2 , incluyendo reclutamiento y
activación eosinofílica (ECP, MPO, EDN, BPM),
activación de mastocitos (triptasa, histamina), producción
de citocinas (ej. IL-5), y permeabilidad
microvascular (albúmina, fibrinógeno). En la
tabla I se muestran los principales marcadores de
inflamación que pueden medirse en la fase líquida
del esputo 2 . No obstante, el número de marcado-
Rev. Esp. Alergol Inmunol Clín, Octubre 1998 Vol. 13, Núm. 5, pp. 261-265
261
Artículo Especial
1 Servicio de Alergia. Fundación Jiménez Díaz. Madrid. 2 Servicio de Hematología. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
3 Servicio de Neumología. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
res solubles estudiados en el esputo va aumentando
rápidamente, habiéndose ampliado recientemente
a moléculas de adhesión (ICAM-1), RAN-
TES, IgA, y determinación de actividad
quimiotáctica para eosinófilos 3 . Un problema añadido
en la determinación de estos marcadores es
la técnica empleada en el procesamiento del esputo,
bien seleccionando los tapones o grumos
mucosos del esputo o bien procesando toda la
expectoración de esputo y saliva. En este último
caso el inconveniente fundamental es que el esputo
se diluye con la saliva y el factor de esta dilución
es muy difícil de determinar. En un estudio
reciente se ha observado que la concentración de
ECP es 5-6 veces mayor en las porciones seleccionadas
del esputo que en la fracción residual 4 ,
indicando el importante factor diluyente de la saliva.
También se ha descrito que los niveles de ECP
y otros marcadores de la inflamación son considerablemente
mayores en el esputo que en el fluido
del LBA 5 .
Las concentraciones de ECP, triptasa, fibrinógeno
y albúmina son mayores en el esputo de
pacientes asmáticos que en controles sanos y las
determinaciones de las mismas son reproducibles
2 . Como era previsible, se ha encontrado una
buena correlación entre la ECP y la triptasa con el
recuento diferencial de eosinófilos y células meta-
Miembros del Comité de Estudio del Asma SEAIC: Dr. Miguel Hinojosa Macías (Coordinador), Dr. José Mª. Olaguibel Rivera
(Coordinador), Dra. Pilar Barranco Sanz, Dra. Teresa Carrillo Díaz, Dr. Carlos Colás Sanz, Dra. Valentina Gutiérrez Vall de Cabres,
Dr. Belen de la Hoz Caballer, Dr. Marcel Ibero Iborra, Dr. Santiago Quirce Gancedo, Dra. Mª Ángeles Rico Díaz, Dr. Carlos Senent
Sánchez (Secretario), Dr. José Mª Vega Chicote.

262 S. Quirce Gancedo, et al Volumen 13
Tabla I. Principales marcadores de fase líquida en el esputo
(ref. 9)
Marcador Expresa Rango normal*
ECP Activación eosinofílica 288 (338) µg/L
EDN Activación eosinofílica 448 (376) µg/L
MBP Activación eosinofílica 304 (602) µg/L
Triptasa Activación mastocitaria 13 (11,2) U/L
Albúmina Permeabilidad vascular 288 (318) mg/µl
Fibrinógeno Permeabilidad vascular 440 (756) ng/µl
* Rango normal obtenido en 10 controles sanos y expresado
como la mediana (rango inter-cuartílico).
cromáticas, respectivamente. Además se ha observado
un aumento en el número de eosinófilos y
células metacromáticas y en las concentraciones
de ECP y triptasa en esputo tras la provocación
bronquial específica con alergeno 6, 7 y una disminución
tras el tratamiento con corticosteroides 8 .
CITOMETRÍA DE FLUJO EN EL ESTUDIO
DEL ESPUTO INDUCIDO
Otra posibilidad muy interesante es resuspender el
pellet de células del esputo para estudiar las subpoblaciones
linfocitarias y marcadores de activación
mediante citometría de flujo. La citometría de flujo
representa un método rápido y cuantitativo de análisis
de células u otras partículas en suspensión y consiste
en hacer pasar a las mismas, alineadas y de una
en una, por delante de un haz luminoso. La interacción
de las células o las partículas con el rayo luminoso
genera señales que se llevan a los detectores
adecuados y estas señales luminosas detectadas se
transforman en impulsos eléctricos que se amplifican
y se convierten en señales digitales que se procesan
en el ordenador. La información generada procede de
un lado de la dispersión de la luz y de otro de la emisión
de luz por los fluorocromos presentes en la célula
o la partícula al ser excitada por el rayo luminoso.
De las diferentes aplicaciones de la citometría de
flujo en el diagnóstico clínico, destaca por su uso y
relevancia la determinación de antígenos celulares,
moléculas presentes en las células capaces de unir
anticuerpos dirigidos específicamente contra ellas.
Las combinaciones de diversos anticuerpos monoclonales
contra antígenos celulares pueden utilizarse
para identificar poblaciones celulares específicas.
Además el marcaje simultáneo de diferentes antígenos
celulares ha permitido obtener importantes
logros en el diagnóstico clínico, tal como la identi-
ficación de las subpoblaciones linfocitarias en distintas
patologías 9 . Esta técnica ha sido empleada
previamente en el análisis de las células inflamatorias
contenidas en el LBA 10, 11 pero hasta el momento
son escasos los estudios que han analizado los
linfocitos en el esputo mediante citometría de flujo.
El primer antecedente de la utilización de la
citometría de flujo en el esputo se aplicó únicamente
al estudio de eosinófilos 12 . Se estudiaron 11
pacientes asmáticos y se comparó la presencia de
diversos marcadores de superficie en eosinófilos
de sangre periférica y del esputo mediante citometría
de flujo con doble fluorescencia (eosinófilos
identificados como granulocitos CD9+). Los
eosinófilos provenientes del esputo pero no los de
sangre periférica expresaban ICAM-1 y HLA-DR.
Posteriormente, Kidney y col. 13 del grupo de
Ontario investigaron la validez y reproducibilidad
de las determinaciones de subpoblaciones linfocitarias
en el esputo de 11 pacientes con asma en fase
estable y en 10 fumadores no asmáticos. Los anticuerpos
monoclonales utilizados para el estudio de
las subpoblaciones linfocitarias en el esputo fueron:
CD3/CD19 (linfocitos T y B), CD3/CD4 (T cooperadores)
y CD3/CD8 (T supresores), así como el
marcador de activación linfocitaria CD25 (receptor
de IL-2) junto a CD4 (T cooperadores activados) o
CD8 (T supresores activados). Los linfocitos eran
detectados por fluorescencia ajustada a las características
de los linfocitos del BAL. El número total
de linfocitos se expresaba como la suma de células
B y T, calculándose los porcentajes respectivos a
partir de esta cifra. En los pacientes con asma se
observó un porcentaje significativamente mayor de
linfocitos B que en los no asmáticos así como un
incremento en los linfocitos T cooperadores activados
(CD25+). Además se encontró una correlación
significativa entre el recuento diferencial de eosinófilos
con los linfocitos B en el esputo de los asmáticos.
La reproducibilidad de dos determinaciones
en una semana de subpoblaciones de linfocitos en
el esputo fue buena, pero la técnica no está exenta
de inconvenientes, principalmente:
– Necesidad de disponer de una cantidad suficiente
de linfocitos (más de 1 millón de células) y
por tanto de un volumen suficiente de esputo.
– Autofluorescencia de los macrófagos, especialmente
en fumadores.
– Posible interferencia del DTT con los marcadores
celulares, aunque no se han encontrado
34

Núm. 5 Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico (III) 263
cambios en linfocitos de sangre periférica, y quizá
únicamente pueda verse alterado HLA-DR por
presentar puentes disulfuro.
Louis y col. 3 aplicaron la citometría de flujo
para determinar subpoblaciones linfocitarias en el
esputo mediante un nuevo método que requiere
menor cantidad de células y que se efectúa con un
cocktail de 5 anticuerpos monoclonales en un único
tubo así como inmunofluorescencia tricolor
(fluoerescein isotiocianato -FITC-, ficoeritrina-
PE-, y peridinin clorofil proteína conjugado-
PerCP-) 14 . Los anticuerpos monoclonales empleados
fueron: CD3-PerCP para identificar el número
total de linfocitos T, CD4-FITC y CD8-PE para
linfocitos T CD4+ y CD8+, respectivamente,
CD16-PE para células asesinas (NK) y CD19-
FITC para los linfocitos B. Además se realizó
citometría de flujo bicolor estándar con CD3-
FITC/CD25-PE, CD3-FITC/HLA-DR-PE, CD3-
FITC/VLA-4-PE, ICAM-1-FITC/CD3-PE, LFA-
1-FITC/CD3-PE. En el estudio realizado por estos
autores en 22 pacientes asmáticos y 14 controles
no atópicos utilizando la citometría de flujo referida
encontraron un aumento significativo de los
linfocitos CD4+ en el esputo de los pacientes
asmáticos, así como un aumento de la expresión
de ICAM-1 en los linfocitos T de los asmáticos.
Por el contrario, el porcentaje de células asesinas
(CD16+ NK) estaba reducido significativamente
en los asmáticos. En la fase líquida del esputo de
los asmáticos también encontraron un aumento
significativo de los niveles de ECP, triptasa y de
ICAM-1 soluble, pero no de histamina ni de
MPO. También se encontró un aumento significativo
en el porcentaje de linfocitos con expresión
de los marcadores de activación CD25, HLA-DR
e ICAM-1 en el esputo comparado con la sangre
periférica tanto en asmáticos como no asmáticos 3 .
En el Hospital Ramón y Cajal hemos realizado
un estudio preliminar aplicando citometría de flujo
en 15 muestras de esputo inducido de pacientes con
asma 15 . Utilizamos un método fluorescente con triple
marcaje (FITC, PE y PerCP) en un citómetro de
flujo FACScan (Becton-Dickinson) realizando una
adquisición de 10.000 células y con los anticuerpos
monoclonales CD45, CD3 y CD33, obteniéndose
un contaje celular basado en la expresión antigénica
celular en todos los casos. La puesta en marcha
de la técnica aún está pendiente de solucionar algunos
problemas, como la degeneración celular pre-
35
sente en el 27% de las muestras de esputo de los
asmáticos, la autofluorescencia de macrófagos, y
las dificultades en la correcta identificación fenotípica
de las subpoblaciones linfocitarias por las diferencias
existentes entre los linfocitos de sangre
periférica y de las vías respiratorias 13 .
EXPRESIÓN DE CITOCINAS
Se ha descrito que los pacientes asmáticos muestran
un aumento en la expresión de RNAm que
codifica diversas citocinas, incluyendo IL-5 en el
BAL 16 en muestras de biopsia bronquial 17 y linfocitos
CD4+ en sangre periférica 18 . Por primera vez
Gelder y col. 19 estudiaron la expresión de RNAm
para citocinas en el esputo inducido en pacientes
normales, atópicos y asmáticos mediante la técnica
de la PCR (“polymerase chain reaction”). Para ello,
el RNA de la muestra de esputo se extrajo mediante
la técnica previamente descrita 20 y se aplicó el
método de la transcripción inversa. El DNAc resultante
se utilizó como plantilla para la reacción de la
PCR, utilizando cebadores específicos para las
diversas interleucinas. El análisis de los resultados
mostró que el RNAm para IL-5 se detectaba en la
mayoría de los pacientes asmáticos (80% en los
asmáticos moderados y 40% en los leves), mientras
que se detectó en el 33% de los atópicos no asmáticos
y en el 10% de los controles no atópicos. Los
autores concluyen que la obtención de esputo inducido
en combinación con la técnica de PCR permite
identificar la expresión de citocinas que pueden
intervenir en el proceso inflamatorio crónico de las
vías respiratorias en pacientes asmáticos. Sin
embargo, también existen algunos problemas en
esta técnica, ya que el método utilizado es cualitativo
pero no cuantitativo, y que la demostración de la
implicación de una determinada citocina debe
basarse en la identificación de la proteína real y no
únicamente en el RNAm que lo codifica.
CONSIDERACIONES FINALES
Los nuevos métodos de obtención y procesamiento
del esputo que se han comenzado a aplicar
al estudio del asma muestran una gran fiabilidad. En
concreto, la técnica del esputo inducido con salino
hipertónico puede aportar interesantes posibilidades

264 S. Quirce Gancedo, et al Volumen 13
clínicas y de investigación, ya que la obtención de
marcadores celulares y moleculares de la inflamación
de forma directa y no invasiva proporciona una
alternativa práctica y viable para estudiar muestras
seriadas en un gran número de pacientes.
Una aplicación clara es utilizar los índices de
inflamación en el esputo para incrementar nuestro
conocimiento de las complejas interrelaciones
entre células, mediadores y citocinas en el asma, y
de éstos con alteraciones en la reactividad bronquial
y en la respuesta terapéutica a distintos fármacos.
Por ejemplo, un estudio muy reciente
muestra la utilidad de las determinaciones secuenciales
de los marcadores de inflamación en el
esputo en el seguimiento de las agudizaciones graves
del asma, y que éstos podrían constituir una
mejor guía terapéutica que los índices clínicos o en
sangre periférica en el control de la inflamación 21 .
Por otro lado, la incorporación de la técnica del
esputo inducido para medir la inflamación de las
vías respiratorias tras la provocación específica
con alergeno abre interesantes perspectivas de
futuro en la investigación sobre las complejas
interrelaciones entre la fisiopatología e histopatología
del asma bronquial.
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