Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico y de ...

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Artículo Especial
Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico y de químicos
presentes en la fase fluida (II):
Descripción de la técnica de induración y procesado
de las muestras de esputo
INTRODUCCIÓN
La técnica del recuento citológico de las
extensiones de esputo en el asma fue descrita inicialmente
por Gibson y cols. 1 hace relativamente
poco tiempo. Posteriormente y con el fin de solventar
el problema que supone que muchos
asmáticos no expectoran espontáneamente, Pin y
cols 2 . sistematizaron el método de inducción de
esputo mediante la inhalación de soluciones salinas
hipertónicas. Sin embargo, el procedimiento
se mostró laborioso: para que los recuentos
pudieran considerarse reproducibles se precisaba
una media de cuatro recuentos de la laminilla a
estudiar, lo que suponía el empleo de más de 1
hora. Por este motivo, Popov y cols. 3 en 1994
modificaron el método para mejorar la definición
de las extensiones y hacer más rápido el recuento
citológico de las mismas, además de posibilitar
la obtención de una fase líquida en la que es
posible cuantificar ciertos mediadores solubles.
Básicamente, las modificaciones consisten en la
homogeneización de la muestra de esputo por
medio de un mucolítico hasta hacerla fluida, y el
empleo de citocentrifugados de la suspensión de
células de la muestra.
V. Gutiérrez Vall de Cabres
Sección de Alergología. Hospital Dr. Peset. Valencia
DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA DE
INDUCCIÓN. PROCESADO Y ANÁLISIS
DEL ESPUTO
A) Inducción
El método de inducción de esputo con salino
hipertónico ofrece una serie de ventajas que lo
hacen practicable para su uso en clínica:
• El equipamiento que se precisa es sencillo y
está al alcance de todos los centros.
• El método se ha mostrado seguro y bien tolerado
4 , por lo que puede realizarse a la mayoría de
los pacientes sin excesivos riesgos.
Sin embargo, debe llevarse a cabo con precauciones
puesto que la inhalación de soluciones
hipertónicas puede producir broncoconstricción 5 .
Si el paciente con asma se halla en situación inestable
o con afectación significativa del FEV1
deben extremarse las precauciones. En el protocolo
de nuestro Centro 4,5 se exige un FEV1 ≥ 70%
del teórico para proseguir con la exploración.
Se precisa la colaboración del sujeto, por lo que
no es practicable en niños muy pequeños.
El procedimiento de inducción se basa en la
administración de una solución salina hipertónica,
mediante un nebulizador ultrasónico, durante la
Miembros del Comité de Estudio del Asma SEAIC: Dr. Miguel Hinojosa Macías (Coordinador), Dr. José Mª. Olaguibel Rivera
(Coordinador), Dra. Pilar Barranco Sanz, Dra. Teresa Carrillo Díaz, Dr. Carlos Colás Sanz, Dra. Valentina Gutiérrez Vall de Cabres,
Dr. Belen de la Hoz Caballer, Dr. Marcel Ibero Iborra, Dr. Santiago Quirce Gancedo, Dra. Mª Ángeles Rico Díaz, Dr. Carlos Senent
Sánchez (Secretario), Dr. José Mª Vega Chicote.
Rev. Esp. Alergol Inmunol Clín, Octubre 1998 Vol. 13, Núm. 5, pp. 252-258

Núm. 5 Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico (II) 253
cual se anima al paciente para que expectore. Previamente,
los pacientes reciben 200 µg de salbutamol
inhalado para prevenir el broncoespasmo.
Tras cada período de inhalación debe registrarse
el PEF para detectar caídas de la función pulmonar.
Como la contaminación abundante con células
de origen orofaríngeo dificulta el recuento
diferencial de las muestras, se debe adiestrar al
paciente para que se suene la nariz y se enjuague
la boca y la garganta antes de proceder a la emisión
del esputo. Es muy importante dar confianza
al paciente, comunicarle que se trata de un proceso
activo y a veces lento, y tener grandes dosis de
paciencia.
Parece que factores dependientes del sujeto
(hábito de fumar, grado de inflamación) o del procedimiento
(concentración del salino, débito del
nebulizador, pre-tratamiento con β-agonistas,
habilidad del técnico para estimular al paciente)
podrían condicionar la rentabilidad (porcentaje de
éxitos) del método 3 .
Ante la posibilidad de que la inducción de salino
hipertónico pudiera alterar los componentes
(celulares o solubles) del esputo, algunos autores 8
han comparado muestras de esputo espontáneo e
inducido de los mismos pacientes con asma y
parece que, si bien las muestras inducidas contienen
menor proporción de células escamosas que
las espontáneas, mejorando la calidad de los citocentrifugados
sin alterar su composición celular,
la inducción sí que podría alterar las concentraciones
de ciertos marcadores solubles. Estos autores
sugieren 8 que para obviar este problema la
proporción de células no escamosas y reconocibles
debe superar el 50%.
Material necesario
Para proceder a la inducción de una muestra de
esputo las necesidades de material son las
siguientes:
1. Espirómetro y medidores de Flujo Espiratorio
Máximo (FEM) portátil Mini-Wright o similar
(Clement-Clarke International. Londres).
2. β-agonistas inhalados de acción corta
(Salbutamol o Terbutalina) y cámaras espaciadoras.
3. Un nebulizador ultrasónico del tipo del
Ultraneb 2000 (De Vilbiss Co. Somerset), Mistogen
(Mistogen Equipment. Oakland), Fisoneb
25
(Fisons. Londres), o similar. Debe estar provisto
de boquilla para inhalación oral y de los filtros
adecuados. El nebulizador que se emplea en nuestro
Centro (Ultraneb 2000) proporciona un flujo
entre 2.1 y 5.9 ml/min y el diámetro medio de las
partículas es de 4.14 µm.
4. Placas de Petri, vasos y pañuelos desechables.
5. Pinzas de disección, tijeritas y capilares de
Pasteur con aspiradores.
6. Tubos de ensayo de plástico 10 ml, gradillas.
7. Solución salina hipertónica:
Mientras que algunos investigadores emplean
soluciones progresivamente más concentradas de
salino que varían entre el 3 y el 10% 2,6,7,9 , otros
autores nebulizan la misma concentración (3,5 a
5%) durante todo el procedimiento 10-12 . Se desconoce
qué concentración es la ideal puesto que los
métodos de inducción de los distintos grupos
difieren en otros aspectos y no son estrictamente
comparables.
8. Cronómetro y calculadora.
9. La medicación habitual para la atención de
una emergencia respiratoria, en previsión de eventuales
accidentes: β-adrenérgicos inhalados de
acción corta, adrenalina 1/1000 o bien salbutamol
o terbutalina en ampollas, aminofilina para uso
parenteral, fluidos y sistemas de perfusión i.v.,
esteroides i.v. (metilprednisolona o hidrocortisona),
ventimask y sondas nasales para administración
de O2.
Personal
Un ATS debidamente entrenado.
Procedimiento para la inducción del esputo
Es muy importante explicar al paciente la finalidad
de la exploración, en qué consiste, y la necesidad
de colaboración por su parte. Hay que transmitirle
confianza y tranquilidad e informarle de
que el procedimiento puede ser lento, por lo que
no debe tener prisa.
En primer lugar, se realiza una espirometría
basal para constatar la estabilidad del funcionalismo
pulmonar del sujeto y prevenir accidentes,
puesto que las soluciones no isotónicas son capaces
de desencadenar episodios de broncoespasmo
en pacientes con asma 13,14 . A continuación se debe
administrar un β-adrenérgico de acción corta (salbutamol
o terbutalina) por medio de una cámara
espaciadora.

254 V. Gutiérrez Vall de Cabres Volumen 13
Tras un intervalo de 15 minutos se registra el
FEV1 o bien el FEM basal (la mejor de tres determinaciones).
Con este valor se deberán comparar
los obtenidos después de nebulizar las distintas
dosis de salino. Los descensos respecto del basal
suelen expresarse en %.
• Posteriormente se nebulizan las soluciones
salinas durante períodos de 5 minutos y con intervalos
de 5-10 minutos.
• Tras cada dosis de salino, el paciente se sonará
la nariz y se enjuagará la boca y faringe. A continuación,
hay que estimularle para que tosa y
expectore en placa de Petri.
• Antes de pasar al siguiente período de nebulización
se debe controlar la función pulmonar
mediante la determinación del PEF. A continuación
se detalla la sistemática que se emplea
actualmente en nuestra Sección 6 :
Procedimiento por pasos
1. Registrar el FEV1 basal y el PEF (los mejores
de tres maniobras correctas). Proceder a la inducción
sólo en el caso de FEV 1 ≥ 70% del teórico.
2. Administrar 200 mcg de salbutamol inhalado
(Ventolín. Glaxo S.A. Madrid) mediante una
cámara espaciadora (Volumatic. Glaxo). Registrar
el PEF al cabo de 15 minutos. Este valor se considerará
como PEF-basal.
3. Rellenar el depósito del nebulizador ultrasónico
Ultraneb 2000 (De Vilbiss) con 150 ml de
solución salina al 5%. Aplicar la pinza nasal y
nebulizar el salino, con boquilla, durante un máximo
de 4 períodos de 5 minutos y con intervalos de
10 minutos.
4. Determinar y registrar el valor del FEV1 (o
del FEM) después de cada período de nebulización.
Suspender la inducción:
A. Si se detectan caídas del FEV1 (o del FEM)
> 30% con respecto al obtenido 15 minutos después
de la beta2. Si el deterioro del FEV1 es del
15-29%, administrar una nueva dosis de beta2,
confirmar mejoría a los 10 minutos y seguir.
B. Cuando el paciente refiera molestias subjetivas
intensas.
C. Cuando se obtenga muestra de esputo adecuada.
5. Durante el intervalo entre dosis, estimular al
paciente para que expectore. Recordarle que debe
sonarse y enjuagarse la boca y faringe para minimizar
la contaminación salivar de la muestra.
MODELO DE FORMULARIO DE RECOGIDA DE
DATOS DURANTE LA INDUCCIÓN
MODELO DE FORMULARIO DE RECOGIDA DE DATOS
DURANTE LA INDUCCIÓN
FEV1 BASAL..................CC. % TEÓRICO..............%
“ADMINISTRAR 200 MCG DE SALBUTAMOL INHALADO”.
PEF (15 minutos después)*.....................L/min
“NEBULIZAR EL SALINO HIPERTÓNICO MEDIANTE
ULTRANEB 2000, DURANTE 5 MINUTOS Y CON INTER-
VALOS DE 10 MINUTOS. REALIZAR DETERMINACIO-
NES DE PEF TRAS CADA PERÍODO DE NEBULIZACIÓN.
DOSIS 1 (5 %)
PEF..................l/min % CAÍDA..............%
SÍNTOMAS.................................................
OBTENCIÓN ESPUTO SÍ NO
DOSIS 2 (5%)
PEF..................l/min % CAÍDA..............%
SÍNTOMAS.................................................
OBTENCIÓN ESPUTO SÍ NO
DOSIS 3 (5%)
PEF..................l/min % CAÍDA..............%
SÍNTOMAS.................................................
OBTENCIÓN ESPUTO SÍ NO
DOSIS 4 (5%)
PEF..................l/min % CAIDA..............%
SÍNTOMAS.................................................
OBTENCIÓN ESPUTO SÍ NO
* = mejor de tres maniobras obtenidas con mini-Wright
6. Recoger la muestra en una placa de Petri de
plástico.
B) Dispersión del esputo y preparación de la
suspensión celular
Se realiza según la técnica descrita por Popov
y cols 3 :
La muestra de esputo se recoge en placas de
Petri de plástico y se registran las características
macroscópicas de la misma. Posteriormente se
seleccionan los acúmulos densos y viscosos
mediante pinzas y se transvasan a un vial graduado
de poliestireno. Si estas porciones no pueden
identificarse a simple vista es útil depositar la placa
de Petri sobre una superficie oscura o una fuente
de transiluminación (negatoscopio portátil).
A continuación se añade un agente dispersante
(ditiotreitol 0.1%) con el fin de homogeneizar la
muestra y la suspensión celular fluida se filtra a
través de una malla de polipropileno que retiene
las fibras y permite el paso de las células.
26

Núm. 5 Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico (II) 255
Fig. 1. Se representa un esquema del proceso de inducción de esputo.
Las muestras deben procesarse dentro de
las 2 horas siguientes a su obtención. La solución
de ditiotreitol es estable durante 24
horas.
2.1 Material necesario
1. Placas de Petri desechables.
2. Pinzas de disección y de filatelia.
3. Capilares de Pasteur.
4. Viales graduados de poliestireno.
5. Ditiotreitol liofilizado (Sputasol, Unipath
Ltd, Hampshire. UK).
6. Agitador vortex.
7. Bandeja agitadora. (IKA Minishaker. Ika
Werke. Staufen. Dinamarca).
8. Portafiltros y filtros de 45 ± 9 mm de poro
(Millipore Co. EE.UU.)
27
2.2. Procedimientos por pasos
1. Anotar las características de la muestra entera
de esputo recogida en la placa de Petri.
2. Sobre una superficie oscura, seleccionar los
acúmulos de esputo por medio de unas pinzas y
unas tijeras o bien un capilar de Pasteur. Transferirlos
a un vial graduado y registrar el volumen de
esputo a procesar después de que se sedimente
(“A”).
3. Añadir un volumen igual de solución de trabajo
(0.1 mg/ml) de Sputasol. Agitar con vortex 30 seg.
4. Poner el tubo en la bandeja y agitar durante
20 minutos para permitir la acción del dispersante.
Vortex 30 seg.
5. Montar un filtro en el portafiltros y depositar
la muestra a través del mismo. Anotar el volumen
de la suspensión filtrada de células (“B”).

256 V. Gutiérrez Vall de Cabres Volumen 13
Fig. 2. Se representa el procedimiento para el análisis de las muestras de esputo inducido.
C) Preparación y recuento de los
citocentrifugados
Aunque no se trata de un paso indispensable, y
algunos investigadores lo obvian 15 , el cálculo de la
celularidad total de la suspensión y su posterior
ajuste a una celularidad aproximada de 1.0 x 10 3
celulas/ml parece conveniente 3,4,9,10,12,16-18 . La finalidad
de este paso intermedio, además de dar información
acerca de la riqueza celular de la muestra, es obtener
citocentrifugados óptimos para el recuento,
puesto que la superposición de elementos celulares
que se produce en suspensiones demasiado concentradas
dificulta y hace menos fiable su reconocimiento
y recuento.
El cálculo de la celularidad total se realiza
mediante un hemocitómetro convencional y su
ajuste con salino tamponado con fosfato (PBS).
Posteriormente se preparan dos citocentrifugados
de la suspensión por medio de una citocentrífuga.
Las laminillas se secan al aire y se tiñen con
un tricrómico.
Un citopatólogo entrenado debe realizar los
recuentos diferenciales de eosinófilos, macrófagos,
linfocitos, células epiteliales y neutrófilos,
sobre al menos 400 células no escamosas. Se
recomienda realizar el recuento de células metacromáticas
(mastocitos y basófilos) sobre 1.500
células no escamosas 2,17 . El recuento diferencial se
debe realizar de forma sistemática empezando por
la parte superior izquierda y siguiendo en zig-zag
hasta la parte inferior derecha.
Aunque es motivo de controversia, se consideran
no adecuadas para análisis las muestras con
más del 50 % de total de células escamosas 3 .
28

Núm. 5 Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico (II) 257
Material necesario
1. Capilares de Pasteur
2. Citómetros de Neubauer y cubreobjetos adecuados.
3. Microscopio con objetivos 10, 40 y 100 X.
(Olimpus CHS 213E o similar).
4. Salino tamponado con fosfato (PBS).
5. Pipetas de 2 y 5 ml. Aspirador.
6. Citocentrífuga del tipo Shandon III (Shandon
Scientific, Sewickley. EE.UU.).
7. Copas, portas, papel secante, cubres y otros
fungibles necesarios para el uso de la citocentrífuga.
8. Soluciones I, II y Reveladora del tricrómico
rápido (Diff-Quick, DADE Diagnostika, Unterschleissheim.
Alemania).
9. Resina acrílica (Diatex. Cornwell Corp.
Riverdale. EE.UU.).
10. (Opcional). Contador de células.
29
MODELO DE FORMULARIO DE
RECOGIDA DE DATOS
PACIENTE.......................HC............ FECHA............................
HORA RECOGIDA....................REGISTRO A.P........................
INSPECCIÓN:
COLOR incolor blanco amarillo verdoso
CONTAMINACIÓN SALIVAR menor mayor
RECUENTO TOTAL DE CÉLULAS (RTC)
Volumen de esputo a procesar (A)....................................... ..ml
Peso del mismo.................................................................... .mg
Volumen de la suspensión tras filtración (B)....................... .ml
RTC de la suspensión (C).............................................x 103 c/µl
Número absoluto de células recuperadas (D) = B x C.. .x 103 c
RTC por volumen de esputo (D/A)........................... .x 103 c/µl
RECUENTO DIFERENCIAL DE CÉLULAS (RDC)
NEUTRÓFILOS.................................. %
EOSINÓFILOS.................................... %
MACRÓFAGOS................................. %
LINFOCITOS..................................... %
C.EPIT. BRONQUIAL......................... %
C. METACROMÁTICAS…………… %
C. INDETERMINADAS...................... %
Procedimiento por pasos
1. Por medio de un capilar de Pasteur llenar la
cámara del citómetro de Neubauer con la suspensión
filtrada de células. Realizar el recuento total
de células de la suspensión por ml (“C”).
2. Calcular el número absoluto de células recuperadas
(“B”x “C”) y registrarlo (“D”).
3. Obtener el recuento total de células como el
número de células recuperadas por unidad de
volumen de esputo (“D”/“A”).
4. Ajustar la suspensión celular con PBS a una
concentración aproximada de 1.0 x 10 3 celulas/µl.
5. Preparar dos extensiones añadiendo 3 gotas
(75 µl) de la muestra a sendas copas de la citocentrífuga.
Centrifugar a 450 rpm durante 6 minutos.
6. Centrifugar la parte restante de la suspensión
celular a 4000 rpm durante 10 minutos y reservar
el sobrenadante que se almacenará a –80°C.
7. Secar al aire los citocentrifugados, fijar con
metanol y teñir con Diff Quick.
8. Realizar un recuento diferencial de 400 células
no escamosas. Diferenciar las células como neutrófilos,
eosinófilos, macrófagos, linfocitos, células del
epitelio bronquial e indeterminadas. No se consideran
los fragmentos subcelulares. El recuento de células
metacromáticas debe realizarse sobre 1.500 células
no escamosas. Registrar el la hoja de recuento.
9. Hacer un segundo recuento diferencial de
células no escamosas.
Para facilitar la implantación de la técnica
reproducimos un formulario de recogida de los
datos para la fase de inducción de la muestra de
esputo y para la fase de procesado de la misma.
En las figuras 1 y 2 se representan en forma
esquemática ambos procesos.
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V. Gutiérrez Vall de Cabres
Sección de Alergología
Hospital Dr. Peset
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30

Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico y de químicos
presentes en la fase fluida (III):
Perspectivas de investigación en la técnica del esputo inducido. El estudio
de muestras mediante citometría de flujo
S. Quirce Gancedo 1 , J. Villarubia 2 , A. Pacheco 3
ESTUDIO DE MUESTRAS DE ESPUTO
INDUCIDO Y MARCADORES
MOLECULARES
Las técnicas inmunohistoquímicas constituyen
un método versátil y adecuado para detectar antígenos
y marcadores celulares que sólo recientemente
se han aplicado al estudio del esputo. Tras
la dispersión del esputo con DTT pueden obtenerse
muestras (“cytospins”) aptas para su procesamiento
y marcaje con técnicas inmunocitoquímicas
que permiten la detección de ciertos antígenos
celulares. Girgis-Gabardo et al 1 han utilizado esta
técnica para detectar la proteína EG-2+ (producto
de conversión de la ECP) en eosinófilos así como
la proteína GM-CSF en macrófagos y eosinófilos
del esputo.
El sobrenadante del esputo puede ser procesado
para medir marcadores moleculares que reflejan
determinados aspectos de la inflamación de las
vías respiratorias 2 , incluyendo reclutamiento y
activación eosinofílica (ECP, MPO, EDN, BPM),
activación de mastocitos (triptasa, histamina), producción
de citocinas (ej. IL-5), y permeabilidad
microvascular (albúmina, fibrinógeno). En la
tabla I se muestran los principales marcadores de
inflamación que pueden medirse en la fase líquida
del esputo 2 . No obstante, el número de marcado-
Rev. Esp. Alergol Inmunol Clín, Octubre 1998 Vol. 13, Núm. 5, pp. 261-265
261
Artículo Especial
1 Servicio de Alergia. Fundación Jiménez Díaz. Madrid. 2 Servicio de Hematología. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
3 Servicio de Neumología. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
res solubles estudiados en el esputo va aumentando
rápidamente, habiéndose ampliado recientemente
a moléculas de adhesión (ICAM-1), RAN-
TES, IgA, y determinación de actividad
quimiotáctica para eosinófilos 3 . Un problema añadido
en la determinación de estos marcadores es
la técnica empleada en el procesamiento del esputo,
bien seleccionando los tapones o grumos
mucosos del esputo o bien procesando toda la
expectoración de esputo y saliva. En este último
caso el inconveniente fundamental es que el esputo
se diluye con la saliva y el factor de esta dilución
es muy difícil de determinar. En un estudio
reciente se ha observado que la concentración de
ECP es 5-6 veces mayor en las porciones seleccionadas
del esputo que en la fracción residual 4 ,
indicando el importante factor diluyente de la saliva.
También se ha descrito que los niveles de ECP
y otros marcadores de la inflamación son considerablemente
mayores en el esputo que en el fluido
del LBA 5 .
Las concentraciones de ECP, triptasa, fibrinógeno
y albúmina son mayores en el esputo de
pacientes asmáticos que en controles sanos y las
determinaciones de las mismas son reproducibles
2 . Como era previsible, se ha encontrado una
buena correlación entre la ECP y la triptasa con el
recuento diferencial de eosinófilos y células meta-
Miembros del Comité de Estudio del Asma SEAIC: Dr. Miguel Hinojosa Macías (Coordinador), Dr. José Mª. Olaguibel Rivera
(Coordinador), Dra. Pilar Barranco Sanz, Dra. Teresa Carrillo Díaz, Dr. Carlos Colás Sanz, Dra. Valentina Gutiérrez Vall de Cabres,
Dr. Belen de la Hoz Caballer, Dr. Marcel Ibero Iborra, Dr. Santiago Quirce Gancedo, Dra. Mª Ángeles Rico Díaz, Dr. Carlos Senent
Sánchez (Secretario), Dr. José Mª Vega Chicote.

262 S. Quirce Gancedo, et al Volumen 13
Tabla I. Principales marcadores de fase líquida en el esputo
(ref. 9)
Marcador Expresa Rango normal*
ECP Activación eosinofílica 288 (338) µg/L
EDN Activación eosinofílica 448 (376) µg/L
MBP Activación eosinofílica 304 (602) µg/L
Triptasa Activación mastocitaria 13 (11,2) U/L
Albúmina Permeabilidad vascular 288 (318) mg/µl
Fibrinógeno Permeabilidad vascular 440 (756) ng/µl
* Rango normal obtenido en 10 controles sanos y expresado
como la mediana (rango inter-cuartílico).
cromáticas, respectivamente. Además se ha observado
un aumento en el número de eosinófilos y
células metacromáticas y en las concentraciones
de ECP y triptasa en esputo tras la provocación
bronquial específica con alergeno 6, 7 y una disminución
tras el tratamiento con corticosteroides 8 .
CITOMETRÍA DE FLUJO EN EL ESTUDIO
DEL ESPUTO INDUCIDO
Otra posibilidad muy interesante es resuspender el
pellet de células del esputo para estudiar las subpoblaciones
linfocitarias y marcadores de activación
mediante citometría de flujo. La citometría de flujo
representa un método rápido y cuantitativo de análisis
de células u otras partículas en suspensión y consiste
en hacer pasar a las mismas, alineadas y de una
en una, por delante de un haz luminoso. La interacción
de las células o las partículas con el rayo luminoso
genera señales que se llevan a los detectores
adecuados y estas señales luminosas detectadas se
transforman en impulsos eléctricos que se amplifican
y se convierten en señales digitales que se procesan
en el ordenador. La información generada procede de
un lado de la dispersión de la luz y de otro de la emisión
de luz por los fluorocromos presentes en la célula
o la partícula al ser excitada por el rayo luminoso.
De las diferentes aplicaciones de la citometría de
flujo en el diagnóstico clínico, destaca por su uso y
relevancia la determinación de antígenos celulares,
moléculas presentes en las células capaces de unir
anticuerpos dirigidos específicamente contra ellas.
Las combinaciones de diversos anticuerpos monoclonales
contra antígenos celulares pueden utilizarse
para identificar poblaciones celulares específicas.
Además el marcaje simultáneo de diferentes antígenos
celulares ha permitido obtener importantes
logros en el diagnóstico clínico, tal como la identi-
ficación de las subpoblaciones linfocitarias en distintas
patologías 9 . Esta técnica ha sido empleada
previamente en el análisis de las células inflamatorias
contenidas en el LBA 10, 11 pero hasta el momento
son escasos los estudios que han analizado los
linfocitos en el esputo mediante citometría de flujo.
El primer antecedente de la utilización de la
citometría de flujo en el esputo se aplicó únicamente
al estudio de eosinófilos 12 . Se estudiaron 11
pacientes asmáticos y se comparó la presencia de
diversos marcadores de superficie en eosinófilos
de sangre periférica y del esputo mediante citometría
de flujo con doble fluorescencia (eosinófilos
identificados como granulocitos CD9+). Los
eosinófilos provenientes del esputo pero no los de
sangre periférica expresaban ICAM-1 y HLA-DR.
Posteriormente, Kidney y col. 13 del grupo de
Ontario investigaron la validez y reproducibilidad
de las determinaciones de subpoblaciones linfocitarias
en el esputo de 11 pacientes con asma en fase
estable y en 10 fumadores no asmáticos. Los anticuerpos
monoclonales utilizados para el estudio de
las subpoblaciones linfocitarias en el esputo fueron:
CD3/CD19 (linfocitos T y B), CD3/CD4 (T cooperadores)
y CD3/CD8 (T supresores), así como el
marcador de activación linfocitaria CD25 (receptor
de IL-2) junto a CD4 (T cooperadores activados) o
CD8 (T supresores activados). Los linfocitos eran
detectados por fluorescencia ajustada a las características
de los linfocitos del BAL. El número total
de linfocitos se expresaba como la suma de células
B y T, calculándose los porcentajes respectivos a
partir de esta cifra. En los pacientes con asma se
observó un porcentaje significativamente mayor de
linfocitos B que en los no asmáticos así como un
incremento en los linfocitos T cooperadores activados
(CD25+). Además se encontró una correlación
significativa entre el recuento diferencial de eosinófilos
con los linfocitos B en el esputo de los asmáticos.
La reproducibilidad de dos determinaciones
en una semana de subpoblaciones de linfocitos en
el esputo fue buena, pero la técnica no está exenta
de inconvenientes, principalmente:
– Necesidad de disponer de una cantidad suficiente
de linfocitos (más de 1 millón de células) y
por tanto de un volumen suficiente de esputo.
– Autofluorescencia de los macrófagos, especialmente
en fumadores.
– Posible interferencia del DTT con los marcadores
celulares, aunque no se han encontrado
34

Núm. 5 Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico (III) 263
cambios en linfocitos de sangre periférica, y quizá
únicamente pueda verse alterado HLA-DR por
presentar puentes disulfuro.
Louis y col. 3 aplicaron la citometría de flujo
para determinar subpoblaciones linfocitarias en el
esputo mediante un nuevo método que requiere
menor cantidad de células y que se efectúa con un
cocktail de 5 anticuerpos monoclonales en un único
tubo así como inmunofluorescencia tricolor
(fluoerescein isotiocianato -FITC-, ficoeritrina-
PE-, y peridinin clorofil proteína conjugado-
PerCP-) 14 . Los anticuerpos monoclonales empleados
fueron: CD3-PerCP para identificar el número
total de linfocitos T, CD4-FITC y CD8-PE para
linfocitos T CD4+ y CD8+, respectivamente,
CD16-PE para células asesinas (NK) y CD19-
FITC para los linfocitos B. Además se realizó
citometría de flujo bicolor estándar con CD3-
FITC/CD25-PE, CD3-FITC/HLA-DR-PE, CD3-
FITC/VLA-4-PE, ICAM-1-FITC/CD3-PE, LFA-
1-FITC/CD3-PE. En el estudio realizado por estos
autores en 22 pacientes asmáticos y 14 controles
no atópicos utilizando la citometría de flujo referida
encontraron un aumento significativo de los
linfocitos CD4+ en el esputo de los pacientes
asmáticos, así como un aumento de la expresión
de ICAM-1 en los linfocitos T de los asmáticos.
Por el contrario, el porcentaje de células asesinas
(CD16+ NK) estaba reducido significativamente
en los asmáticos. En la fase líquida del esputo de
los asmáticos también encontraron un aumento
significativo de los niveles de ECP, triptasa y de
ICAM-1 soluble, pero no de histamina ni de
MPO. También se encontró un aumento significativo
en el porcentaje de linfocitos con expresión
de los marcadores de activación CD25, HLA-DR
e ICAM-1 en el esputo comparado con la sangre
periférica tanto en asmáticos como no asmáticos 3 .
En el Hospital Ramón y Cajal hemos realizado
un estudio preliminar aplicando citometría de flujo
en 15 muestras de esputo inducido de pacientes con
asma 15 . Utilizamos un método fluorescente con triple
marcaje (FITC, PE y PerCP) en un citómetro de
flujo FACScan (Becton-Dickinson) realizando una
adquisición de 10.000 células y con los anticuerpos
monoclonales CD45, CD3 y CD33, obteniéndose
un contaje celular basado en la expresión antigénica
celular en todos los casos. La puesta en marcha
de la técnica aún está pendiente de solucionar algunos
problemas, como la degeneración celular pre-
35
sente en el 27% de las muestras de esputo de los
asmáticos, la autofluorescencia de macrófagos, y
las dificultades en la correcta identificación fenotípica
de las subpoblaciones linfocitarias por las diferencias
existentes entre los linfocitos de sangre
periférica y de las vías respiratorias 13 .
EXPRESIÓN DE CITOCINAS
Se ha descrito que los pacientes asmáticos muestran
un aumento en la expresión de RNAm que
codifica diversas citocinas, incluyendo IL-5 en el
BAL 16 en muestras de biopsia bronquial 17 y linfocitos
CD4+ en sangre periférica 18 . Por primera vez
Gelder y col. 19 estudiaron la expresión de RNAm
para citocinas en el esputo inducido en pacientes
normales, atópicos y asmáticos mediante la técnica
de la PCR (“polymerase chain reaction”). Para ello,
el RNA de la muestra de esputo se extrajo mediante
la técnica previamente descrita 20 y se aplicó el
método de la transcripción inversa. El DNAc resultante
se utilizó como plantilla para la reacción de la
PCR, utilizando cebadores específicos para las
diversas interleucinas. El análisis de los resultados
mostró que el RNAm para IL-5 se detectaba en la
mayoría de los pacientes asmáticos (80% en los
asmáticos moderados y 40% en los leves), mientras
que se detectó en el 33% de los atópicos no asmáticos
y en el 10% de los controles no atópicos. Los
autores concluyen que la obtención de esputo inducido
en combinación con la técnica de PCR permite
identificar la expresión de citocinas que pueden
intervenir en el proceso inflamatorio crónico de las
vías respiratorias en pacientes asmáticos. Sin
embargo, también existen algunos problemas en
esta técnica, ya que el método utilizado es cualitativo
pero no cuantitativo, y que la demostración de la
implicación de una determinada citocina debe
basarse en la identificación de la proteína real y no
únicamente en el RNAm que lo codifica.
CONSIDERACIONES FINALES
Los nuevos métodos de obtención y procesamiento
del esputo que se han comenzado a aplicar
al estudio del asma muestran una gran fiabilidad. En
concreto, la técnica del esputo inducido con salino
hipertónico puede aportar interesantes posibilidades

264 S. Quirce Gancedo, et al Volumen 13
clínicas y de investigación, ya que la obtención de
marcadores celulares y moleculares de la inflamación
de forma directa y no invasiva proporciona una
alternativa práctica y viable para estudiar muestras
seriadas en un gran número de pacientes.
Una aplicación clara es utilizar los índices de
inflamación en el esputo para incrementar nuestro
conocimiento de las complejas interrelaciones
entre células, mediadores y citocinas en el asma, y
de éstos con alteraciones en la reactividad bronquial
y en la respuesta terapéutica a distintos fármacos.
Por ejemplo, un estudio muy reciente
muestra la utilidad de las determinaciones secuenciales
de los marcadores de inflamación en el
esputo en el seguimiento de las agudizaciones graves
del asma, y que éstos podrían constituir una
mejor guía terapéutica que los índices clínicos o en
sangre periférica en el control de la inflamación 21 .
Por otro lado, la incorporación de la técnica del
esputo inducido para medir la inflamación de las
vías respiratorias tras la provocación específica
con alergeno abre interesantes perspectivas de
futuro en la investigación sobre las complejas
interrelaciones entre la fisiopatología e histopatología
del asma bronquial.
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