Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico y de ...

Núm. 5 Inducción de muestras de esputo para el estudio citológico (III) 263
cambios en linfocitos de sangre periférica, y quizá
únicamente pueda verse alterado HLA-DR por
presentar puentes disulfuro.
Louis y col. 3 aplicaron la citometría de flujo
para determinar subpoblaciones linfocitarias en el
esputo mediante un nuevo método que requiere
menor cantidad de células y que se efectúa con un
cocktail de 5 anticuerpos monoclonales en un único
tubo así como inmunofluorescencia tricolor
(fluoerescein isotiocianato -FITC-, ficoeritrina-
PE-, y peridinin clorofil proteína conjugado-
PerCP-) 14 . Los anticuerpos monoclonales empleados
fueron: CD3-PerCP para identificar el número
total de linfocitos T, CD4-FITC y CD8-PE para
linfocitos T CD4+ y CD8+, respectivamente,
CD16-PE para células asesinas (NK) y CD19-
FITC para los linfocitos B. Además se realizó
citometría de flujo bicolor estándar con CD3-
FITC/CD25-PE, CD3-FITC/HLA-DR-PE, CD3-
FITC/VLA-4-PE, ICAM-1-FITC/CD3-PE, LFA-
1-FITC/CD3-PE. En el estudio realizado por estos
autores en 22 pacientes asmáticos y 14 controles
no atópicos utilizando la citometría de flujo referida
encontraron un aumento significativo de los
linfocitos CD4+ en el esputo de los pacientes
asmáticos, así como un aumento de la expresión
de ICAM-1 en los linfocitos T de los asmáticos.
Por el contrario, el porcentaje de células asesinas
(CD16+ NK) estaba reducido significativamente
en los asmáticos. En la fase líquida del esputo de
los asmáticos también encontraron un aumento
significativo de los niveles de ECP, triptasa y de
ICAM-1 soluble, pero no de histamina ni de
MPO. También se encontró un aumento significativo
en el porcentaje de linfocitos con expresión
de los marcadores de activación CD25, HLA-DR
e ICAM-1 en el esputo comparado con la sangre
periférica tanto en asmáticos como no asmáticos 3 .
En el Hospital Ramón y Cajal hemos realizado
un estudio preliminar aplicando citometría de flujo
en 15 muestras de esputo inducido de pacientes con
asma 15 . Utilizamos un método fluorescente con triple
marcaje (FITC, PE y PerCP) en un citómetro de
flujo FACScan (Becton-Dickinson) realizando una
adquisición de 10.000 células y con los anticuerpos
monoclonales CD45, CD3 y CD33, obteniéndose
un contaje celular basado en la expresión antigénica
celular en todos los casos. La puesta en marcha
de la técnica aún está pendiente de solucionar algunos
problemas, como la degeneración celular pre-
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sente en el 27% de las muestras de esputo de los
asmáticos, la autofluorescencia de macrófagos, y
las dificultades en la correcta identificación fenotípica
de las subpoblaciones linfocitarias por las diferencias
existentes entre los linfocitos de sangre
periférica y de las vías respiratorias 13 .
EXPRESIÓN DE CITOCINAS
Se ha descrito que los pacientes asmáticos muestran
un aumento en la expresión de RNAm que
codifica diversas citocinas, incluyendo IL-5 en el
BAL 16 en muestras de biopsia bronquial 17 y linfocitos
CD4+ en sangre periférica 18 . Por primera vez
Gelder y col. 19 estudiaron la expresión de RNAm
para citocinas en el esputo inducido en pacientes
normales, atópicos y asmáticos mediante la técnica
de la PCR (“polymerase chain reaction”). Para ello,
el RNA de la muestra de esputo se extrajo mediante
la técnica previamente descrita 20 y se aplicó el
método de la transcripción inversa. El DNAc resultante
se utilizó como plantilla para la reacción de la
PCR, utilizando cebadores específicos para las
diversas interleucinas. El análisis de los resultados
mostró que el RNAm para IL-5 se detectaba en la
mayoría de los pacientes asmáticos (80% en los
asmáticos moderados y 40% en los leves), mientras
que se detectó en el 33% de los atópicos no asmáticos
y en el 10% de los controles no atópicos. Los
autores concluyen que la obtención de esputo inducido
en combinación con la técnica de PCR permite
identificar la expresión de citocinas que pueden
intervenir en el proceso inflamatorio crónico de las
vías respiratorias en pacientes asmáticos. Sin
embargo, también existen algunos problemas en
esta técnica, ya que el método utilizado es cualitativo
pero no cuantitativo, y que la demostración de la
implicación de una determinada citocina debe
basarse en la identificación de la proteína real y no
únicamente en el RNAm que lo codifica.
CONSIDERACIONES FINALES
Los nuevos métodos de obtención y procesamiento
del esputo que se han comenzado a aplicar
al estudio del asma muestran una gran fiabilidad. En
concreto, la técnica del esputo inducido con salino
hipertónico puede aportar interesantes posibilidades