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Contenido en alcaloides en semillas de poblaciones naturales
de raigrás inglés del norte de España infectadas con los hongos
endofitos Neotyphodium
J.A. Oliveira * 1 , G.E. Rottinghaus 2 , C. Prego 3 , E. González 3
1 Dpto. de Biología de Organismos y Sistemas, Área de Producción Vegetal, Universidad de Oviedo,
C/Catedrático Rodrigo Uría s/n, 33071 Oviedo, España
2 Veterinary Medical Diagnostic Lab, College of Veterinary Medicine University of Missouri,
Columbia, Estados Unidos
3 Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo, Apdo. 10, 15080 A Coruña, España
oliveira@correo.uniovi.es
RESUMEN
Se analizó el contenido en los alcaloides lolitreno B y ergovalina en semillas de 21 poblaciones naturales
de raigrás inglés (Lolium perenne L.) del norte de España, infectadas con los hongos endofitos Neotyphodium.
El nivel de infección medio fue de 40,1 %, variando desde el 8 al 80 %, estando el 62 % de las poblaciones por
debajo del nivel del 50 % de infección. El contenido medio del alcaloide lolitreno B fue de 1,1 ppm, variando de
0,0 a 7,1 ppm, mientras que el contenido medio del alcaloide ergovalina fue de 13,5 ppm, variando de 1,0 a 36,2
ppm. Se estudiaron las relaciones entre el nivel de infección y el contenido en alcaloides mediante las correlaciones
de Spearman. Se encontraron correlaciones estadísticamente significativas entre el porcentaje de infección
y el contenido en ergovalina (r = 0,59) a un nivel de significación del 1 %. Las concentraciones más altas
de lolitreno Bydeergovalina se consideran suficientes para inducir los síndromes del «ryegrass staggers» y la
«festucosis», pero debido a la diversidad de especies pratenses en los prados naturales del norte de España es
poco probable que aparezcan estos desórdenes. Sin embargo, en pastos con gran abundancia de raigrás inglés infectado
con hongos endofitos sería conveniente evitar que el ganado pastase las plantas espigadas, debido a que
es en las semillas donde las concentraciones de alcaloides son más altas.
Palabras clave: ergovalina, lolitreno B, prados naturales, Lolium perenne.
* Autor para correspondencia
Recibido: 15-6-01
Aceptado para su publicación: 1-2-02
Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. Vol. 17 (2), 2002

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INTRODUCCIÓN
El raigrás inglés (Lolium perenne L.) puede albergar hongos endofitos que pertenecen
a los géneros Epichloë y Neotyphodium (Christensen et al., 1993; Schardl, 1996). Las
plantas de raigrás inglés infectadas por Neotyphodium (Glenn et al., 1996) no presentan
ningún síntoma y el hongo se transmite verticalmente por semilla (Neil, 1941). El hongo
endofítico Epichloë typhina (White, 1987) en Lolium desarrolla un collar de micelio fúngico
en el espigado de la planta, lo que impide la emergencia de la espiga, esterilizando la
planta.
La relación entre el hongo y la planta se considera mutualística (Clay, 1986). Por otra
parte, la infección con el hongo se ha mostrado que aumenta el valor adaptativo de la
planta debido a una mayor tolerancia a la sequía (West et al., 1993), a insectos y nematodos
(Latch, 1993). Los efectos del endofito, tanto en el comportamiento de la planta como
en la producción animal, están influidos por una serie de metabolitos secundarios, incluyendo
diferentes alcaloides tóxicos producidos por la interacción planta-hongo. Christensen
et al. (1993) mostraron una gran variabilidad en la naturaleza y producción de estos
metabolitos secundarios por diferentes cepas de endofitos.
La parálisis del raigrás («ryegrass staggers») es una intoxicación del ganado, especialmente
en Nueva Zelanda, debida a la presencia de Neotyphodium lolii en las plantas
de raigrás consumidas. Esta enfermedad está causada por el lolitreno B, una neurotoxina
sintetizada por el endofito en raigrás inglés (Fletcher et al., 1993). Este síndrome está caracterizado
por una función neuromuscular reducida, temblores en el cuello y miembros,
ganancias de peso reducidas y problemas reproductivos debidos a niveles de la hormona
prolactina bajos (Thompson y Stuedmann, 1993; Valentine et al., 1993). Recientemente
se han descrito casos de esta intoxicación en ovejas, ganado vacuno y caballos en Alemania,
Holanda y el Reino Unido (Lewis, 1997).
Los alcaloides ergopeptínicos se producen también en raigrás inglés infectado por
hongos endofitos (Rowan y Shaw, 1987). De estos compuestos la ergovalina está reconocida
como el más importante en el raigrás. Este alcaloide tiene efectos complejos en los
animales en pastoreo, entre los que la vasoconstricción y el aumento de temperatura corporal
son los más claros. Otros efectos incluyen una disminución de la ganancia de peso y
problemas reproductivos. Este conjunto de síntomas se denomina «festucosis» por haberse
detectado primero en ganado pastando plantas de festuca infectadas por hongos endofitos.
En la actualidad se sospecha que hay una interacción de los efectos de la ergovalina y
el lolitreno B en el agravamiento del «ryegrass staggers» (Fletcher, 1999). Este síndrome
se ha descrito esporádicamente en Francia (Bony et al., 1996) en novillas pastando praderas
viejas de festuca alta.
Los alcaloides lolitreno B y ergovalina están concentrados en los 20-40 mm del pasto
más cercanos al suelo, notablemente en las vainas foliares más viejas y también en los tallos
y espigas, aumentando mucho su concentración con temperaturas ambientes y humedades
relativas altas y en el momento de producción de semillas por parte de la planta
(Hamilton-Manns y Crothers, 1999).
En España, como en otros países europeos, la infección en poblaciones naturales de
raigrás inglés con el hongo endofito es amplia y común (Lewis et al., 1997; Oliveira y
Castro, 1998; Plaza et al., 2001). A pesar de ello, en Europa, la información sobre la producción
de alcaloides en raigrás inglés es escasa. Oldemburg (1997) encontró una variación
estacional en lolitreno B en hierba de ecotipos alemanes de raigrás inglés infectados,

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desde 1993 a 1996. Los valores más altos, 0,8 a 1,4 ppm, se obtuvieron durante los meses
de julio y agosto. En España, Oliveira et al. (1997, 2000) encontraron valores bajos de ergovalina
en hierba de material de mejora de raigrás inglés en el invierno y valores medios
de 1,6 ppm de lolitreno B y de 5,9 ppm de ergovalina en semillas de poblaciones de raigrás
inglés multiplicadas en el Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo.
En este trabajo se muestran resultados de las concentraciones de los alcaloides lolitreno
B y ergovalina en muestras de semillas de raigrás inglés recogidas en 21 zonas del norte
de España y la relación entre el porcentaje de infección y el contenido en alcaloides.
MATERIAL Y MÉTODOS
En una muestra de semillas de 21 poblaciones naturales de raigrás inglés recogidas en
el norte de España se determinó la presencia de hifas de hongos endofitos Neotyphodium.
Las muestras se recogieron en el verano de 1997. En cada uno de los 21 lugares de recogida
(Tabla 1) se tomaron semillas de al menos 50 plantas en una zona ecológicamente
homogénea de 100-1.000 m 2 . Según Tyler (1987), estas condiciones se supone que permiten
obtener una muestra de semillas representativas de la población original. Las semillas
de todas las plantas se mezclaron en cada lugar de recogida y se almacenaron en botes
Tabla 1
Origen, altitud y tipo de hábitat de las 21 muestras de semillas de raigrás inglés
recogidas en el norte de España
Código Origen Altitud (m) Hábitat
1 Argelaguer (Girona) 150 Prado
2 Seo de Urgel (Lleida) 700 Terreno inculto
3 Ariniz (Vitoria) 500 Camino
4 Grado (Asturias) 60 Borde carretera
5 Teverga (Asturias) 600 Camino
6 Barrios de Luna (León) 1.100 Borde carretera
7 Barrios de Luna (León) 1.100 Prado
8 Sena de Luna (León) 1.100 Camino
9 Pobladura de Luna (León) 1.150 Camino
10 Rabanal de Luna (León) 1.150 Camino
11 La Magdalena (León) 1.150 Borde carretera
12 Ponferrada (León) 400 Camino
13 Cariño (A Coruña) 20 Terreno inculto
14 El Ventorrillo (A Coruña) 100 Terreno inculto
15 Ronda de Nelle (A Coruña) 30 Terreno inculto
16 Louro (A Coruña) 40 Terreno inculto
17 Canabal (Lugo) 400 Terreno inculto
18 Rodicio (Ourense) 950 Terreno inculto
19 Ribadumia (Pontevedra) 30 Camino
20 Ponte-Caldelas (Pontevedra) 500 Terreno inculto
21 La Lanzada (Pontevedra) 20 Terreno inculto
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herméticos de cristal en una cámara de conservación a 4 C y una humedad relativa de
45-50 % para evitar la pérdida de viabilidad del hongo endofito. Cien semillas por cada
lugar de recogida se sumergieron en una solución de NaOH (1,25 M) durante 16 horas, se
escurrieron con agua del grifo en un colador, se les quitaron las cubiertas de las semillas,
y se colorearon con el colorante azul de anilina (5 g/L). Finalmente se colocaron en un
portaobjetos y se aplastaron ligeramente con un cubreobjetos (Latch et al., 1987). En cada
preparación se observó al microscopio (Zeiss con 100 aumentos) la presencia de hifas en
la capa de aleurona de la semilla. No se determinó la especie de estos hongos. El número
de semillas conteniendo hifas de los hongos endofitos Neotyphodium se anotó como porcentaje
de infección de la muestra (Hinton y Bacon, 1985).
Con el fin de obtener información de la máxima concentración de alcaloides producidos
en las condiciones ecológicas del norte de España, se tomaron las muestras de semillas,
se molieron pasándolas por un tamiz de 1 mm de malla, se liofilizaron y se almacenaron
en bolsas de plástico herméticas. En dichas muestras se analizó el contenido en ergovalina
mediante una modificación del método de Rottinghaus et al. (1991). En
muestras de 5 g liofilizadas se realizó una extracción con cloroformo conteniendo ergotamina
como patrón interno. Las muestras se colocaron en un agitador durante una noche.
Se añadió sodio sulfato y se volvieron a agitar durante treinta minutos más. Las muestras
se filtraron y se tomaron 20 ml del filtrado que se añadieron a una columna filtrante Ergosil,
bajo vacío. Los pigmentos se diluyeron con 3 ml de acetona:cloroformo (8:2) continuando
con 3 ml de éter de petróleo anhidro. Los extractos obtenidos se diluyeron con 2
ml de metanol y se cromatografiaron en un HPLC con detección por fluorescencia (ex
250 nm, em 420 nm). Los alcaloides se separaron mediante una columna de fase inversa
Phenomenex Luna C18 (250 mm 4,6 mm, 5m) con una fase móvil de 36 % acetonitrilo
en una solución de 200 mg/L de carbonato de amonio.
El contenido en lolitreno B se analizó mediante una modificación del método de Gallagher
et al. (1985). Se realizó una extracción en muestras de 0,2 g liofilizadas con 2 ml
de cloroformo:metanol (2:1) dejándolas en un agitador durante una hora. La mezcla fue
centrifugada y1mldelsobrenadante se concentró hasta desecación. El extracto se transfirió
a un columna pequeña de gel de sílice (Porasil A) con cloruro de metileno. La columna
se lavó inicialmente con 2 ml cloruro de metileno:acetonitrilo (95:5) y el lolitreno B se
diluyó con 2 ml de cloruro de metileno:acetonitrilo (80:20). El pigmento restante se eliminó
pasando el liquido a través de una columna M-224. Las muestras se cromatografiaron
mediante HPLC con detección por fluorescencia (ex 268 nm, em 440 nm). El lolitreno B
se separó en una columna en fase reversa Perkin Elmer (85 mm 4,6 mm, 3 m) con una
fase móvil de cloruro de metileno:acetonitrilo (92:8) a una velocidad de 1 ml/minuto. No
se utilizaron réplicas de las muestras debido a que se utilizó toda la semilla disponible en
cada análisis. La concentración de los alcaloides se expresó en ppm (miligramos del alcaloide/kilogramos
de peso seco de semilla).
Se calcularon correlaciones de Spearman entre el porcentaje de infección y el contenido
de los alcaloides.

ALCALOIDES EN SEMILLAS DE RAIGRÁS INGLÉS 251
RESULTADOS
La distribución geográfica y el tipo de hábitat de las muestras recogidas se muestran
enlaFig.1yenlaTabla 1. Los lugares en los que se recogieron las muestras variaron
desde el nivel del mar hasta los 1.150 m de altitud de tres muestras recogidas en la provincia
de León. El 62 % de las muestras se recogieron en localidades por encima de los
400 m de altitud. El 43 % de las muestras se recogieron en terreno inculto, un 33 % en caminos
de acceso a fincas, un 14 % en borde de carreteras y un 10 % en prados naturales
predominantemente pastados.
prado
camino
terreno inculto
borde de carretera
Fig. 1.–Distribucion geográfica y hábitats de 21 muestras
de semillas de raigrás inglés recogidas en el norte de España
Todas las muestras de raigrás inglés resultaron infectadas con el hongo endofito a una
frecuencia media de 40,1 % (SD = 23,7). El porcentaje de infección varió del 8 al 80 %
(Tabla 2). El 62 % de las poblaciones presentaron niveles de infección bajos (porcentaje
de infección por debajo del 50 %).
El alcaloide lolitreno B se detectó en 10 de las 21 muestras. El contenido medio del
alcaloide lolitreno B fue de 1,1 ppm (SD = 1,8), variando de 0,0 a 7,1 ppm.
La ergovalina se detectó en todas las muestras. El contenido medio de ergovalina fue
de 13,5 ppm (SD = 12,0), variando de 1,0 a 36,2 ppm.
Las correlaciones de Spearman entre el porcentaje de infección y el contenido de alcaloides
revelaron que el contenido en ergovalina resultó correlacionado significativamente
(r = 0,59) a un nivel de probabilidad del 1 %. No se encontraron correlaciones significativas
entre el porcentaje de infección y el contenido en lolitreno B.
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Tabla 2
Porcentajes de infección del hongo endofito Neotyphodium y contenidos
en los alcaloides lolitreno B y ergovalina (ppm = miligramos
del alcaloide/kilogramos de peso seco de semilla) en muestras de semillas
de raigrás inglés recogidas en 21 zonas del norte de España
Código Porcentaje de infección Lolitreno B (ppm) Ergovalina (ppm)
1 51 2,2 2,2
2 10 0,5 1,0
3 72 1,9 7,0
4 20 0,0 4,0
5 12 0,0 2,1
6 40 3,9 6,0
7 42 0,0 36,2
8 18 0,0 6,8
9 39 2,6 19,8
10 41 2,4 13,6
11 72 7,1 8,0
12 78 0,0 11,0
13 30 0,0 32,8
14 21 1,9 5,8
15 80 0,4 35,8
16 52 0,0 26,9
17 15 0,0 4,0
18 8 0,0 2,2
19 21 0,2 14,0
20 59 0,0 13,3
21 62 0,0 31,7
Media 40,1 1,1 13,5
Desviación estándar 23,7 1,8 12,0
DISCUSIÓN
La amplia distribución de los hongos endofitos Neotyphodium en poblaciones naturales
de raigrás inglés está de acuerdo con otros estudios descritos en España (Zabalgogeazcoa
et al., 1997; Oliveira y Castro, 1998) y en otros países europeos (Lewis et al., 1997).
Las razones de esta amplia distribución de la infección de los hongos endofitos en poblaciones
naturales de raigrás inglés no están del todo claras. Algunos autores encontraron
correlaciones significativas entre el nivel de infección y ciertas variables climáticas, particularmente
el déficit hídrico (Lewis et al., 1997; Oliveira y Castro, 1998) indicando que
las condiciones de sequía estival pueden impartir una presión de selección a favor de la
infección por hongos endofitos.
En las zonas del norte de España muestreadas se encontraron porcentajes de infección
en semillas de raigrás inglés, en general, de bajos a moderados (0 a 50 %). Las plantas desarrolladas
a partir de la semilla procedente de una planta infectada se espera que contengan
el mismo hongo endofito presente en la planta maternal (Welty et al., 1987). Una po-

ALCALOIDES EN SEMILLAS DE RAIGRÁS INGLÉS 253
sible excepción a esto es el desarrollo de tallos libres del hongo, en los que los meristemos
del tallo puedan escapar a la infección del micelio del hongo y consecuentemente
den lugar a semillas libres del hongo. Este fenómeno en cierta manera podría explicar el
porqué muchas poblaciones naturales (White y Chambless, 1991) contienen plantas no infectadas
distribuidas al azar, a pesar de los aparentes beneficios para la planta por la infección
con el hongo (Clay, 1987).
Los porcentajes de infección bajos a moderados en raigrás inglés se pueden explicar
por la imperfecta transmisión vertical (en forma de semilla) del hongo (Ravel et al.,
1997).
Este estudio muestra que los alcaloides lolitreno B y ergovalina se producen en poblaciones
naturales de raigrás inglés infectados con hongo endofitos Neotyphodium en las
condiciones edafoclimáticas del norte de España.
La correlación significativa entre el porcentaje de infección del hongo endofito y el
contenido en ergovalina parece indicar que en las zonas donde los porcentajes de infección
son más elevados y que suelen coincidir con las zonas más secas y cálidas (Oliveira
y Castro, 1998), también los contenidos en ergovalina sean altos.
El valor máximo de lolitreno B obtenido en este estudio fue de 7,1 ppm y resultó similar
a los obtenidos por otros autores en Estados Unidos, Nueva Zelanda, Reino Unido y
España y que varían desde 3a10ppmengramíneas (Latch y Tapper, 1988; Prestidge y
Gallagher, 1989; Porter, 1994).
Las concentraciones de lolitreno B en las plantas infectadas de raigrás inglés son más
altas en las vainas foliares, en los tallos espigados y en las semillas y mucho menores en
las hojas (DiMenna et al., 1992). Así el «ryegrass staggers» aparece más frecuentemente
en praderas pastadas intensivamente, en praderas con abundancia de vegetación seca y
muerta o en praderas con abundancia de plantas espigadas.
Los síntomas del «ryegrass staggers» en ovejas, caballos o ganado vacuno se pueden
desarrollar cuando las concentraciones de lolitreno B excedan de 2-2,5 ppm (Prestidge y
Gallagher, 1989; DiMenna et al., 1992).
El contenido medio de ergovalina obtenido en este estudio fue de 13,5 ppm, variando
de 1,0 a 36,2 ppm y por encima del nivel crítico de toxicidad en ganado vacuno de 1,0
ppm (Easton et al., 1996).
Para que aparezcan dichos síntomas, esas concentraciones tienen que presentarse durante
períodos de temperatura ambiente alta (por encima de 30 C) y humedad relativa
también alta. Sin embargo, concentraciones de alcaloides más bajas pueden ser suficientes
para causar efectos subclínicos, como son una disminución de la ganancia de peso, de la
producción de leche y problemas reproductivos (Thompson y Stuedmann 1993; Valentine
et al., 1993).
En las praderas sembradas en Europa con cultivares comerciales de raigrás inglés,
tanto para corte en verde como para silo y heno los problemas de salud en los animales
debido a los alcaloides son muy poco probables porque los cultivares comerciales de raigrás
inglés tienen unos porcentajes de infección muy bajos (Latch et al., 1987).
Los pastos naturales del norte de España son ricos en diferentes especies de gramíneas
y leguminosas, por lo que incluso aunque las concentraciones en alcaloides fueran
altas, los síntomas del «ryegrass staggers» o de la «festucosis» parecen poco probables.
Sin embargo, en pastos con alto contenido de raigrás inglés infectado con los hongos
endofitos, no se debería dejar pastar al ganado durante períodos de altas temperaturas y humedades
ambientes, ya que estas condiciones aumentan los efectos tóxicos de los hongos
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endofitos. En particular, sería necesario tener cuidado en el pastoreo de las plantas espigadas,
ya que las semillas son una fuente importante de alcaloides en los pastos infectados
(Sleper y Buckner, 1995; Ball et al., 1997). En este tipo de pastos, la acumulación de materia
muerta y un mayor consumo de vainas foliares respecto a hojas en el caso de pastoreos
intensivos puede aumentar el contenido en alcaloides. También en las zonas de acampada
del ganado en el pasto donde se acumulan las deyecciones y que son zonas donde el ganado
prefiere pastar por la abundancia de vegetación, las concentraciones de alcaloides son más
altas que en las zonas que rodean a estas zonas más fertilizadas (Keogh y Clements, 1993).
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se ha podido realizar gracias a la financiación concedida en el proyecto RF95-017-C2-1 del
programa de Conservación y Utilización de Recursos Fitogenéticos del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación
y al apoyo del Centro de Investigaciones Agrarias de Mabegondo (Xunta de Galicia).
SUMMARY
Alkaloid content in Neotyphodium-infected seeds of perennial ryegrass wild
populations from the North of Spain
The alkaloid content (lolitrem B and ergovaline) in Neotyphodium-infected seeds of 21 perennial ryegrass
(Lolium perenne L.) wild populations from the North of Spain was analysed. The infection level in perennial
ryegrass was low to moderate (average = 40.1 %), ranging from 8 to 80 %. In most of the populations (62 %) the
infection level was below 50 %. In perennial ryegrass seeds, the average lolitrem B content was 1.1 ppm, ranging
from 0.0 to 7.1 ppm and the average ergovaline content was 13.5 ppm, ranging from 1.0 to 36.2 ppm. The
relationships between endophyte infection and alkaloid content were studied using Spearman’s correlations. Significant
correlations were found between endophyte infection and ergovaline (r = 0.59 at p < 0.01). The highest
concentrations of lolitrem B and ergovaline were considered high enough to induce «ryegrass staggers» and
«fescue toxicosis» but the species diversity in natural pastures of northern Spain can probably prevent the disorders.
In pastures abundant in natural endophyte-infected perennial ryegrass, grazing seed heads should be avoided,
because the highest levels of alkaloids are actually found in seeds.
Key words: ergovaline, lolitrem B, pastures, Lolium perenne
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