Contenido en alcaloides en semillas de poblaciones naturales ... - Inia

250 J.A. OLIVEIRA et al.
herméticos de cristal en una cámara de conservación a 4 C y una humedad relativa de
45-50 % para evitar la pérdida de viabilidad del hongo endofito. Cien semillas por cada
lugar de recogida se sumergieron en una solución de NaOH (1,25 M) durante 16 horas, se
escurrieron con agua del grifo en un colador, se les quitaron las cubiertas de las semillas,
y se colorearon con el colorante azul de anilina (5 g/L). Finalmente se colocaron en un
portaobjetos y se aplastaron ligeramente con un cubreobjetos (Latch et al., 1987). En cada
preparación se observó al microscopio (Zeiss con 100 aumentos) la presencia de hifas en
la capa de aleurona de la semilla. No se determinó la especie de estos hongos. El número
de semillas conteniendo hifas de los hongos endofitos Neotyphodium se anotó como porcentaje
de infección de la muestra (Hinton y Bacon, 1985).
Con el fin de obtener información de la máxima concentración de alcaloides producidos
en las condiciones ecológicas del norte de España, se tomaron las muestras de semillas,
se molieron pasándolas por un tamiz de 1 mm de malla, se liofilizaron y se almacenaron
en bolsas de plástico herméticas. En dichas muestras se analizó el contenido en ergovalina
mediante una modificación del método de Rottinghaus et al. (1991). En
muestras de 5 g liofilizadas se realizó una extracción con cloroformo conteniendo ergotamina
como patrón interno. Las muestras se colocaron en un agitador durante una noche.
Se añadió sodio sulfato y se volvieron a agitar durante treinta minutos más. Las muestras
se filtraron y se tomaron 20 ml del filtrado que se añadieron a una columna filtrante Ergosil,
bajo vacío. Los pigmentos se diluyeron con 3 ml de acetona:cloroformo (8:2) continuando
con 3 ml de éter de petróleo anhidro. Los extractos obtenidos se diluyeron con 2
ml de metanol y se cromatografiaron en un HPLC con detección por fluorescencia (ex
250 nm, em 420 nm). Los alcaloides se separaron mediante una columna de fase inversa
Phenomenex Luna C18 (250 mm 4,6 mm, 5m) con una fase móvil de 36 % acetonitrilo
en una solución de 200 mg/L de carbonato de amonio.
El contenido en lolitreno B se analizó mediante una modificación del método de Gallagher
et al. (1985). Se realizó una extracción en muestras de 0,2 g liofilizadas con 2 ml
de cloroformo:metanol (2:1) dejándolas en un agitador durante una hora. La mezcla fue
centrifugada y1mldelsobrenadante se concentró hasta desecación. El extracto se transfirió
a un columna pequeña de gel de sílice (Porasil A) con cloruro de metileno. La columna
se lavó inicialmente con 2 ml cloruro de metileno:acetonitrilo (95:5) y el lolitreno B se
diluyó con 2 ml de cloruro de metileno:acetonitrilo (80:20). El pigmento restante se eliminó
pasando el liquido a través de una columna M-224. Las muestras se cromatografiaron
mediante HPLC con detección por fluorescencia (ex 268 nm, em 440 nm). El lolitreno B
se separó en una columna en fase reversa Perkin Elmer (85 mm 4,6 mm, 3 m) con una
fase móvil de cloruro de metileno:acetonitrilo (92:8) a una velocidad de 1 ml/minuto. No
se utilizaron réplicas de las muestras debido a que se utilizó toda la semilla disponible en
cada análisis. La concentración de los alcaloides se expresó en ppm (miligramos del alcaloide/kilogramos
de peso seco de semilla).
Se calcularon correlaciones de Spearman entre el porcentaje de infección y el contenido
de los alcaloides.