Contenido en alcaloides en semillas de poblaciones naturales ... - Inia

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250 J.A. OLIVEIRA et al. herméticos de cristal en una cámara de conservación a 4 C y una humedad relativa de 45-50 % para evitar la pérdida de viabilidad del hongo endofito. Cien semillas por cada lugar de recogida se sumergieron en una solución de NaOH (1,25 M) durante 16 horas, se escurrieron con agua del grifo en un colador, se les quitaron las cubiertas de las semillas, y se colorearon con el colorante azul de anilina (5 g/L). Finalmente se colocaron en un portaobjetos y se aplastaron ligeramente con un cubreobjetos (Latch et al., 1987). En cada preparación se observó al microscopio (Zeiss con 100 aumentos) la presencia de hifas en la capa de aleurona de la semilla. No se determinó la especie de estos hongos. El número de semillas conteniendo hifas de los hongos endofitos Neotyphodium se anotó como porcentaje de infección de la muestra (Hinton y Bacon, 1985). Con el fin de obtener información de la máxima concentración de alcaloides producidos en las condiciones ecológicas del norte de España, se tomaron las muestras de semillas, se molieron pasándolas por un tamiz de 1 mm de malla, se liofilizaron y se almacenaron en bolsas de plástico herméticas. En dichas muestras se analizó el contenido en ergovalina mediante una modificación del método de Rottinghaus et al. (1991). En muestras de 5 g liofilizadas se realizó una extracción con cloroformo conteniendo ergotamina como patrón interno. Las muestras se colocaron en un agitador durante una noche. Se añadió sodio sulfato y se volvieron a agitar durante treinta minutos más. Las muestras se filtraron y se tomaron 20 ml del filtrado que se añadieron a una columna filtrante Ergosil, bajo vacío. Los pigmentos se diluyeron con 3 ml de acetona:cloroformo (8:2) continuando con 3 ml de éter de petróleo anhidro. Los extractos obtenidos se diluyeron con 2 ml de metanol y se cromatografiaron en un HPLC con detección por fluorescencia (ex 250 nm, em 420 nm). Los alcaloides se separaron mediante una columna de fase inversa Phenomenex Luna C18 (250 mm 4,6 mm, 5m) con una fase móvil de 36 % acetonitrilo en una solución de 200 mg/L de carbonato de amonio. El contenido en lolitreno B se analizó mediante una modificación del método de Gallagher et al. (1985). Se realizó una extracción en muestras de 0,2 g liofilizadas con 2 ml de cloroformo:metanol (2:1) dejándolas en un agitador durante una hora. La mezcla fue centrifugada y1mldelsobrenadante se concentró hasta desecación. El extracto se transfirió a un columna pequeña de gel de sílice (Porasil A) con cloruro de metileno. La columna se lavó inicialmente con 2 ml cloruro de metileno:acetonitrilo (95:5) y el lolitreno B se diluyó con 2 ml de cloruro de metileno:acetonitrilo (80:20). El pigmento restante se eliminó pasando el liquido a través de una columna M-224. Las muestras se cromatografiaron mediante HPLC con detección por fluorescencia (ex 268 nm, em 440 nm). El lolitreno B se separó en una columna en fase reversa Perkin Elmer (85 mm 4,6 mm, 3 m) con una fase móvil de cloruro de metileno:acetonitrilo (92:8) a una velocidad de 1 ml/minuto. No se utilizaron réplicas de las muestras debido a que se utilizó toda la semilla disponible en cada análisis. La concentración de los alcaloides se expresó en ppm (miligramos del alcaloide/kilogramos de peso seco de semilla). Se calcularon correlaciones de Spearman entre el porcentaje de infección y el contenido de los alcaloides.
ALCALOIDES EN SEMILLAS DE RAIGRÁS INGLÉS 251 RESULTADOS La distribución geográfica y el tipo de hábitat de las muestras recogidas se muestran enlaFig.1yenlaTabla 1. Los lugares en los que se recogieron las muestras variaron desde el nivel del mar hasta los 1.150 m de altitud de tres muestras recogidas en la provincia de León. El 62 % de las muestras se recogieron en localidades por encima de los 400 m de altitud. El 43 % de las muestras se recogieron en terreno inculto, un 33 % en caminos de acceso a fincas, un 14 % en borde de carreteras y un 10 % en prados naturales predominantemente pastados. prado camino terreno inculto borde de carretera Fig. 1.–Distribucion geográfica y hábitats de 21 muestras de semillas de raigrás inglés recogidas en el norte de España Todas las muestras de raigrás inglés resultaron infectadas con el hongo endofito a una frecuencia media de 40,1 % (SD = 23,7). El porcentaje de infección varió del 8 al 80 % (Tabla 2). El 62 % de las poblaciones presentaron niveles de infección bajos (porcentaje de infección por debajo del 50 %). El alcaloide lolitreno B se detectó en 10 de las 21 muestras. El contenido medio del alcaloide lolitreno B fue de 1,1 ppm (SD = 1,8), variando de 0,0 a 7,1 ppm. La ergovalina se detectó en todas las muestras. El contenido medio de ergovalina fue de 13,5 ppm (SD = 12,0), variando de 1,0 a 36,2 ppm. Las correlaciones de Spearman entre el porcentaje de infección y el contenido de alcaloides revelaron que el contenido en ergovalina resultó correlacionado significativamente (r = 0,59) a un nivel de probabilidad del 1 %. No se encontraron correlaciones significativas entre el porcentaje de infección y el contenido en lolitreno B. Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. Vol. 17 (2), 2002
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