Determinación de la supervivencia de Trypanosoma evansi en ... - OIE

Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1995,14 (3), 753-759
Determinación de la supervivencia de
Trypanosoma evansi en sangre de equinos,
empleando el método del microhematocrito
C.M. MONZÓN, G.A. JARA y C.B. HOYOS *
Resumen: Empleándose el método del microhematocrito, se investigó la
supervivencia de Trypanosoma evansi en sangre de equinos proveniente de dos
lotes infectados naturalmente con el parásito. Se realizaron estudios
comparativos de muestras recolectadas con ácido etilendiamino tetra acético,
citrato de sodio y citrato de sodio con 1% de glucosa, las que fueron enviadas al
laboratorio refrigeradas con hielo. En general, el número de muestras positivas
al microhematocrito tuvo mínimas variaciones durante las primeras
24-36 horas posteriores a la extracción de la muestra (p.e.m.). Con variaciones
que obedecieron a los anticoagulantes empleados, la supervivencia de los
flagelados declinó progresivamente a partir de las 48 horas p.e.m.,
observándose parásitos vivos hasta el séptimo día, en un porcentaje no mayor a
un 10% de las muestras. En base a los datos obtenidos, se recomienda utilizar
citrato de sodio para recolectar muestras de sangre de equinos, para diagnóstico
parasitológico de T. evansi.
PALABRAS CLAVE: Enfermedades de los equinos - Muestras de sangre -
Supervivencia - Técnicas de diagnóstico - Trypanosoma evansi.
INTRODUCCIÓN
La concentración de parásitos mediante la centrifugación de sangre en capilares de
microhematocrito, constituye en la actualidad uno de los métodos más empleados para
demostrar la presencia de los tripanosomas (4,10,13); sin embargo, al emplear estas
técnicas, un número importante de animales con parásitos permanecen sin ser
detectados (8,11). Se logra el diagnóstico de un mayor número de casos, combinando
un método de concentración sensible con la detección de anticuerpos (5) o de antígenos
del parásito (2,12). Los métodos de concentración, al requerir tripanosomas vivos, ven
limitada su efectividad con el tiempo, porque el número de parásitos decrece
rápidamente una vez fuera de sus hospederos naturales (10,13,14). La sobrevida de los
parásitos es un factor crítico cuando los estudios no pueden ser realizados en el campo
por carencia de electricidad, centrífugas o técnicos especializados en la identificación de
los mismos.
Teniendo en cuenta los escasos estudios realizados sobre la supervivencia de
Trypanosoma evansi en muestras de sangre de equinos, el presente trabajo se realizó a
los fines de obtener mayor información sobre el tema.
* Centro de Diagnóstico e Investigaciones Veterinarias Formosa (CEDIVEF), CONICET,
Gobierno de la Provincia de Formosa, FUNDANORD, Casilla de Correo 292, 3600 Formosa,
República Argentina.

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MATERIALES Y MÉTODOS
Se emplearon en los estudios, muestras de sangre de dos tropillas de equinos
infectados por T. evansi, provenientes de Formosa, Argentina.
Lote N 9 1
El lote N 9 l era constituido por 32 equinos. De cada uno de los animales se
recolectaron 5 ml de sangre yugular. Las muestras se colocaron en tubos de ensayo que
contenían 70 μl de ácido etilendiamino tetra acético (EDTA) en una concentración de
0,342 Mol/1, pH 7,2 (anticoagulante W).
Lote N 9 2
El lote N 9 2 era constituido por 44 equinos. La sangre se recolectó empleándose los
siguientes anticoagulantes:
a) EDTA, en la forma indicada anteriormente;
b) citrato de sodio al 3,8% en agua destilada, en una relación de 1 ml de solución
citrato por 4 ml de sangre;
c) citrato de sodio al 3,8% en agua destilada, adicionado de 1% de glucosa y
antibióticos (penicilina 2.000 UI/ml, estreptomicina 50 μg/ml).
Los tubos con sangre fueron transportados en gradillas colocadas dentro de una caja
térmica, refrigerada mediante cubos de hielo en su interior, y arribaron al laboratorio
aproximadamente tres a seis horas posteriores a la extracción de las muestras (p.e.m.).
Durante el transporte, no se permitió el contacto de los tubos con el hielo. En el
laboratorio, las muestras se colocaron en heladera convencional de 4-8°C, mientras
duró el ensayo.
La detección de los hemoparásitos se realizó mediante el método del
microhematocrito (15), empleándose un capilar por muestra. Los parásitos se
identificaron en frotes coloreados con Giemsa, realizados a partir de muestras
sanguíneas de ratones que fueron inoculados con la sangre de los equinos positivos al
microhematocrito.
Un primer examen fue realizado inmediatamente, al arribar las muestras al
laboratorio. En aquellas muestras en las que se visualizaron tripanosomas, se repitieron
los análisis a intervalos de 12-24 horas, durante una semana.
En seis muestras pertenecientes al lote N Q 1, se realizó un recuento de parásitos cada
24 horas, durante cinco días. Cinco microlitros de sangre se colocaron bajo cubre-objeto
de 22 x 22 mm, obteniéndose un promedio de los parásitos contados en 20 campos
microscópicos, observados a 400x.
El análisis estadístico de los resultados se realizó mediante el test del chi-cuadrado (χ 2 ).
RESULTADOS
Se detectaron 53 equinos infectados por T. evansi, 23 pertenecientes al lote N°l y 30
al lote N°2.
En las muestras de sangre del lote N 9 1, el número de capilares microhematocritos
positivos a T. evansi se mantuvo inalterable en las primeras 36 horas p.e.m. A las

48 horas p.e.m., la detección fue posible en un 61% de los capilares, y a las 120 horas
p.e.m. se llegó a una detección en un 8,6% (Fig. 1).
Con pequeñas diferencias que obedecieron a los anticoagulantes empleados, la
sobrevida de T. evansi en el lote de sangre N 9 2 declinó progresivamente con el tiempo,
encontrándose hasta un 10% de muestras con tripanosomas vivos, siete días después de
haberse recolectado las muestras de sangre (Fig. 2).
La comparación de pares de anticoagulantes mediante el test del χ2, no demostró
diferencias significativas en la utilización de citrato de sodio y citrato de sodio más el
agregado de glucosa. Las diferencias entre citrato de sodio con glucosa y EDTA, fueron
significativas (P < 0,05) sólo a partir de las 120 horas p.e.m.; entre citrato de sodio y
EDTA se observaron diferencias, altamente significativas (P < 0,01), a partir de las
96 horas p.e.m.
El conteo de los parásitos realizado en las muestras del lote N°1, se encuentra en el
Cuadro I.
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DISCUSIÓN
En el sub-trópico argentino, T. evansi produce en los equinos una enfermedad
denominada «mal de caderas», que se caracteriza por anemia, debilidad, pérdida de
peso, edemas y que, de no mediar tratamiento, generalmente conduce a la muerte de los
animales (6,7,9).
Las adversas condiciones climáticas y grandes distancias en los sistemas de cría
extensivos de los establecimientos ganaderos de Formosa, son factores que demoran el
arribo de las muestras para estudios de laboratorio, lo que incide desfavorablemente en
el aislamiento e identificación de los tripanosomas. La mayoría de los establecimientos
donde se crían equinos carecen de luz eléctrica, y la utilización de una minicentrífuga
para centrifugar microhematocrito, tal como lo describen Kelley y Schillinger (3), no se
ha difundido aún.
FIG. 1
Horas
Sobrevida de Trypanosoma evansi en 23 muestras de sangre de equinos (lote N° 1),
recolectadas con citrato de sodio

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Horas
muestras recolectadas con citrato de sodio
H muestras recolectadas con citrato de sodio con glucosa al 1%
H
muestras recolectadas con ácido etilendiamino tetra acético
FIG. 2
Sobrevida de Trypanosoma evansi en 30 muestras de sangre de equinos (lote N 9 2),
recolectadas con citrato de sodio, citrato de sodio con glucosa al 1% y
ácido etilendiamino tetra acético
Los resultados del presente trabajo demuestran que la sobrevida de T. evansi
experimenta mínimas variaciones durante las primeras 36 horas p.e.m. Posteriormente,
la detección de parásitos disminuye notoriamente hasta llegar solamente a un 8-10%
entre el quinto y séptimo día p.e.m. De allí que los autores recomiendan que las
muestras de sangre de equinos, enviadas para diagnóstico de T. evansi mediante los
diferentes métodos de concentración, arriben al laboratorio en un plazo no mayor de
36 horas p.e.m. Estos resultados son más alentadores que los enunciados por Paris y
col. (13), y Murray y col. (10), quienes sostienen que las técnicas de concentración para
el diagnóstico de las tripanosomosis africanas de los bovinos, deberían ser realizadas en
un plazo de cuatro a seis horas p.e.m., debido a la disminución del número de parásitos
CUADRO I
Promedio de Trypanosoma evansi en muestras de sangre de seis equinos,
obtenido por observación de veinte campos microscópicos
Sobrevida en horas
Muestras N 9 3-6 24 48 72 96 120
1 7 8 10 3 4 5
2 26 17 25 11 1 -
3 158 61 40 1 — -
4 2 2 • 1 _ _
-
5 48 40 15 — _ -
6 2 2 5 3 4 2

detectables. Esta contraposición de datos se debería a que las especies de tripanosomas
poseen diferentes tiempos de sobrevida, fuera de sus hospederos. Por ejemplo, T. cruzi
sobrevive en sangre humana citratada hasta 17 días, cuando se conserva a temperatura
de 4°C (1). La viabilidad de los parásitos estaría también relacionada con diferentes
hospederos. Siswansyah y col. (14) reportan una supervivencia de T. evansi de 24 horas,
en sangre de búfalos infectados con el parásito.
No fue posible comprobar que la adición de glucosa en las muestras de sangre es un
medio para aumentar la sobrevida de los tripanosomas. Sin embargo, se pudo observar
en estas muestras un notorio aumento de la movilidad de los parásitos, lo que facilita el
diagnóstico, especialmente en los especímenes con escasos parásitos.
De los anticoagulantes evaluados, se recomienda utilizar el citrato de sodio, con o sin
agregado de glucosa, dado que con EDTA se obtuvieron menores porcentajes de
detección de parásitos.
*
* *
757
DÉTERMINATION DE LA SURVIE DE TRYPANOSOMA EVANSI DANS LE SANG
DES ÉQUIDÉS PAR LA TECHNIQUE DES MICROHÉMATOCRITES. -
C.M. Monzón, G.A. Jara et C.B. Hoyos.
Résumé : La technique des microhématocrites a été utilisée pour étudier la
survie de Trypanosoma evansi dans le sang d'équidés atteints d'une infection
naturelle et appartenant à deux troupeaux. Une comparaison a été effectuée
entre des prélèvements traités à l'acide éthylènediaminetétraacétique et au
citrate de sodium (pur ou avec glucose à 1 %) et envoyés au laboratoire,
conditionnés dans de la glace. En général, les prélèvements donnant des
résultats positifs par la technique des microhématocrites présentaient la plus
faible variation dans les 24 à 36 heures suivant le prélèvement. La survie du
trypanosome variait selon l'anticoagulant utilisé, mais elle déclinait rapidement
48 heures après le prélèvement, bien que des parasites vivants soient toujours
observés dans 10 % des prélèvements jusqu'au septième jour. Sur la base des
résultats obtenus, les auteurs recommandent de traiter les prélèvements de sang
d'équidés au citrate de sodium pour le diagnostic parasitologique de T. evansi.
MOTS-CLÉS : Maladies des équidés - Prélèvements sanguins - Survie -
Techniques de diagnostic - Trypanosoma evansi.
*
DETERMINATION OF THE SURVIVAL OF TRYPANOSOMA EVANSI IN EQUINE
BLOOD, USING THE MICROHAEMATOCRIT TECHNIQUE. - CM. Monzón,
G.A. Jara and C.B. Hoyos.
Summary: The microhaematocrit (MH) technique was used to study the
survival of Trypanosoma evansi in blood from two herds of naturally-infected
horses. A comparison was made between samples treated with
ethylenediaminetetraacetic acid and sodium citrate (alone or with 1% glucose),
and sent to the laboratory packed in ice. In general, the number of samples

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yielding positive results by the MH technique showed the least variation during
the first 24-36 h after sample collection. Survival varied with the anticoagulant
used, but it declined rapidly from 48 h after collection, although live parasites
were still observed in up to 10% of samples until the seventh day. On the basis of
the results obtained, the authors recommend the use of sodium citrate in treating
equine blood samples for the parasitological diagnosis of T. evansi.
KEYWORDS: Blood samples - Diagnostic techniques - Horse diseases -
Survival - Trypanosoma evansi.
* *
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