Selección asistida por marcadores moleculares

Introducción al mejoramiento de
plantas asistido por marcadores
moleculares

Mejoramiento Convencional
de Plantas
Esta basado principalmente en la selección fenotipica
de individuos superiores en progenies segregantes
Muchos logros en importantes características
agronómicas
Considerables dificultades en algunos casos debido
principalmente a las interacciones genotipo-ambiente

Selección Asistida por
Marcadores Moleculares
Marker-Assisted Selection
MAS
Selección de plantas que contienen regiones
genomicas que están involucradas en la expresión
de características de interés

Marcadores morfológicos
Influencia del ambiente
Bajo número
Caracteres de madurez
Entrenamiento y subjetividad
Marcadores moleculares
Sin influencia ambiental
Cantidad ilimitada
Análisis en fases tempranas
Sencillos, rápidos y objetivos

Aplicaciones de los marcadores moleculares al
análisis de Genomas Vegetales:
1. Diversidad genética:
Evaluación de Germoplasma
Identificación y Protección Varietal
2. Base Genética de los Caracteres de interés Agronómico:
Caracteres simples
Caracteres Complejos
3. Mapeo Comparativo
4. Mejora asistida por Marcadores
5. Clonaje de Genes de Interés

La búsqueda de genes consiste en establecer una
asociación entre un marcador molecular y un gen
que determina una característica específica en un
ser vivo. Esta técnica resulta bastante útil en las
ciencias médicas, veterinarias y agronómicas.
Resulta además, un paso inicial en el proceso de
aislamiento de genes y apoya el mejoramiento
genético en la agricultura

Marcadores moleculares como huellas
digitales
Una huella digital de ADN es un conjunto de
marcadores moleculares cuya combinación resulta
ser única e irrepetible entre individuos de una
población. Se usa para resolver casos forenses y
de paternidad. En agricultura se logra identificar
plantas fuera de tipo en cultivos de interés
económico.

¿Genoma
Cromosomas humanos
46 8
Cromosomas de la mosca del vinagre

¿ADN
ADN es la abreviatura del ácido
desoxirribonucleico. Es el componente
químico primario de los cromosomas y el
material del que los genes están formados.
Su función es dictar las instrucciones para
fabricar un ser vivo.

Marcador
Secuencia de ADN identificable, de herencia mendeliana
que facilita el estudio de la herencia de un carácter o
de un gen ligado
Marcador molecular
Marcador genético que se utiliza en la tecnología de
los ácidos nucleicos

James Watson y Francis Crick, 1953
http://www.time.com/time/time100/scientist/profile/watsoncrick.html

ADN
1953 Watson-Crick
ADN
1983 1a. Planta GM
1993 1er. Alimento GM
2003 10 GENOMAS

A = Adenina
T = Timina
C = Citosina
G = Guanina

genoma
ADN
cromosomas
genes
Célula
los genes
contienen
instrucciones
para hacer
proteínas
proteínas
las proteínas actúan
solas o en complejos
para realizar las
funciones celulares

AGAGCTACGTATCGTTCGATCGACTAGCTAGCTAGATACGAT
ATCGGCGCTATATACGGCCGATATATATCGCTATACGATCGA
TCGATAGCATATATCGCGATACGTAGCTATAGCATATTAGCG
ATACGATTATAGCGATAGCGATACGCATACGATCGATACGCG
CTATCGCGCATATCGATCGAGCTACGGCATCGATCGATACGA
TCGATGCTGCGTTTTGCGCGCATATAACGCGCCGTTTCCCCA
ATGTGGCTATACGCTAGCTAGTTAGCTAGCTGCTATCGATCG
ATCGATAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCT
AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGGAG
CTACGTATCGTTCGATCGACTAGCTAGCTAGATACGATATCG
GCGCTATATACGGCCGATATATATCGCTATACGATCGATCGA
TAGCATATATCGCGATACGTAGCTATAGCATATTAGCGATAC
GATTATAGCGATAGCGATACGCATACGATCGATACGCGCTAT
CGCGCATATCGATCGAGCTACGGCATCGATCGATACGATCG
ATGCTGCGTTTTGCGCGCATATAACGCGCCGTTTCCCCAATG
TGGCTATACGCTAGCTAGTTAGCTAGCTGCTATCGATC…
3,000 millones de letras

Todos los seres vivos tienen su información hereditaria
GENOMAS
codificada en la molécula de ADN. El juego completo de
ADN de un ser vivo es el genoma. El genoma humano
cuenta con 3 mil millones de pares de bases (pb) y unos 30,000 genes, que son un
3% del genoma. El tamaño del genoma es independiente de la complejidad del
organismo. El Genoma de mayor tamaño es el del pez pulmonado africano Protopterus
aethiopicus con 139 mil millones de pb; una planta con flores Fritillaria assyriaca
tiene 124,900 millones de pb.
60%
IDENTIDAD GENÉTICA
70%
95% idéntico
20%
De 289 genes
humanos
implicados en
enfermedades,
hay 177
cercanamente
similares a los
genes de
Drosophila.
Humanos
30,000
genes
Chimpancé
30,000
genes
Ratón
30,000
genes
A. thaliana
25,000
genes
C. elegans
19,000
genes
D. melanogaster
13,000
genes
Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%

Gen deseable
Lo primero
Información de secuencias
Expresión de secuencias marcadas
Secuencias genomicas
Secuencias de proteínas

Gen deseable
• Resistencia a plagas y enfermedades
• Resistencia a herbicidas
• Calidad de alimentos

Gen deseable
Resistencia a Enfermedades
Interacción
Gen*Gen

R
Avr
Clonación y caracterización
Genes de resistencia a virus, bacterias, hongos

R-genes
1. Permite a las plantas detectar las moléculas
Avr-gene de patógenos específicos
2. Iniciar la transducción de señales para activar
las defensas
3. Tienen la capacidad de evolucionar rápidamente
en nuevos genes de resistencia

BASE DEL ANALISIS
• Marcadores basados en
fragmentos de restricción
(RFLP)
• Marcadores basados en
amplificación de fragmentos PCR
(Polymerase Chain Reaction) SSR

Endonucleasas de restricción

Electroforesis de fragmentos de ADN cortados con
enzima de restricción
-
+

...TTGCAACTGACGTACGTA...
Hibridación
de sonda
GACGTA
...AACGTTGACTGCAT
CTGCATGCAT... GCAT...

Apa I
A1
A2
99 pb 449 pb
57 pb
99 pb 316 pb 133 pb 57 pb
A1
A2
449
316
133
99
57

PCR
Amplificación IN VITRO de secuencias
determinadas de ADN basada en el uso
de:
-Polimerasa
-Cebadores
-dNTPs

PCR
ADN
TAQ
Primers
dGTP
dCTP
dATP
94°
72°
dTTP
20°
50-65°
4°
30 ciclos

1ª FASE: Desnaturalización
94°C
CICLO 1
dGTP
dATP
dCTP
Primers
dTTP
TAQ

2ª FASE: Anillamiento
50-65°C
CICLO 1
dGTP
dATP
dCTP
Primers
dTTP
TAQ

3ª FASE: Extensión
72°C
CICLO 1
dGTP
dATP
dCTP
Primers
dTTP
TAQ

3ª FASE: Extensión
72°C
CICLO 1
dGTP
dATP
dCTP
Primers
dTTP
TAQ

3ª FASE: Extensión
72°C
CICLO 1
dGTP
dATP
dCTP
Primers
dTTP
TAQ

1ª FASE: Desnaturalización
94°C
CICLO 2
Application
dATP
dGTP
dTTP
dCTP
TAQ
Primers

Microsatélites
Repeticiones en tándem de secuencias cortas de ADN,
de 1 a 10 pares de bases de longitud, para formar
secuencias de menos de 150 pb.
Ejemplos: : (GA) 14 , (GAT) 10 , (CATC) 8
...GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA...
...GATGATGATGATGATGATGATGATGATGAT...
...CATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATC...
Sinónimos: : SSRs, STRs

SSR
Repeticiones simples de secuencias
MICROSATELITES
Se han convertido en marcadores estándares de ADN
para análisis de genomas de plantas y están siendo
usados ampliamente como marcadores en programas
de mejoramiento asistido por marcadores

Sequence-Tagged Microsatellite
Sites
5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGA
TGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’
3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT
ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’
16 repeticiones
5’...TGACAGTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGA
TGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’
TCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGCGA...3’
CTGCGATCAGCCCATCATCG 5’
5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAG
3’...ACTGTCACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT
ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCT...5’
5’ GTGGGTCACGACTTGAGCCAGTCGTAGCT
TCGTAGCTTGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGACTCAGTGTGACGCTAGTCGGGTAGTAGC 3’
3’ CACCCAGTGCTGAACTCGGTCAGCATCGAACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACT
ACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTACTGAGTCACACTGCGATCAGCCCATCATCGCTGCGATCAGCCCATCATCG 5’
105 pb

Origen del polimorfismo de los
STMSs
1
2
3
4
1 2 3 4

Fuente: CIAT, La biotecnología en el salón de clases.

Fuente: CIAT, La biotecnología en el salón de clases.

Fuente: CIAT, La biotecnología en el salón de clases.

Fuente: CIAT, La biotecnología en el salón de clases.

Fuente: CIAT, La biotecnología en el salón de clases.

Fuente: CIAT, La biotecnología en el salón de clases.

Diversidad genética de 48 variedades de caña
de azúcar
CP70-1133MW
0.03 0.15 0.28 0.40 0.52
Coefficient
B37-172
B65-15
CG96-37
CP72-2086
CG96-52
CG96-59
B73-06
Mex73-523
CP72-1312
CG98-91
Mex57-683
Mex69-290
C87-51
CC85-63
B76-196
Co421
CP57-603
CP63-588
B69-613
CG97-100
CG96-143
CG96-40
CP70-1133
CB46-47
CP72-1210
CC84-75
CG96-78
CGCP95-55
JA64-19
My74-64
JA64-20
L68-40
L80-38
SachOff
CP88-1165
MZC74-275
PR75-2002
PR78-3025
PR87-2048
V71-51
SP79-2233
CG97-83
CP88-1508
Mex79-431
POJ2878
IJ76521
CP65-357
CG96-01

Fuente: CIAT, La biotecnología en el salón de clases.

Use of Pi5(t) markers in marker-assisted selection
to screen for cultivars with resistance to
Magnaporthe grisea
Yi et al. 2004
Theor Appl Genet (2004). 109: 978-985

Pi5(t) es un gen localizado en el cromosoma 9
al igual que Pii(t), Pi3(t), y Pi15(t) que
también son genes de resistencia a
M. grisea

Marker
Forward primer (5′→3′) Reverse primer (5′→3′) (bp)
JJ80-T3 TTATGAGATTAGGAGTGTAT ATGTAAAGGCAAAAGCTGAT 442
JJ81-T3 TCTACAAACTCAGTTAAACT AGCGAAAATCATTTATCACA 343
JJ113-T3 CTCTTGGTGATCTTTGTTAC GGATGATGTGATCTGCAGAG 484

Fig. 1a–c DNA gel-blot analysis of
RIL260 (5), C104PKT (3),
CO39 (C), Tetep (T), Moroberekan
(M), and PKT (P) genomes.
Genomic DNAs digested with BamHI,
HindIII, EcoRI, and EcoRV
were electrophoresed, blotted, and
hybridized with the BIBAC-end
sequences JJ80-T3 (a), JJ113-T3 (b),
and JJ81-T3 (c), respectively,
as probes. Note: none of the markers
could be hybridized with the
CO39, Moroberekan, or PKT genomic
DNAs

Fig. 2a–c DNA gel-blot analysis
of RIL260 (R), IRBL3-CP4 (3),
and IRBL5-M (5) genomes.
Genomic DNAs digested with
BamHI,BglII, DraI, EcoRI,
EcoRV, and HindIII were
electrophoresed, blotted, and
hybridized with the BIBAC-end
sequences JJ80-T3 (a),JJ113-T3
(b), and JJ81-T3
(c),respectively, as probes. All
lines are monomorphic at the
three probe regions tested

Table 2. PCR analysis of 24 monogenic rice lines and nine
resistance donors
Line Resistance gene Marker
JJ80-T3 JJ81-T3 JJ113-T3
IRBLa-A Pia − − −
IRBLa-C Pia − − −
IRBLb-B Pib − − −
IRBLi-F5 Pii + + +
IRBLk-Ka Pik − − −
IRBLks-F5 Piks − − −
IRBLks-S Piks − − −
IRBLkh-K3 Pikh − − −
IRBLkp-K60 Pikp − − −
IRBLt-K59 Pit − − −
IRBLsh-S Pish − − −

IRBLsh-B Pish − − −
IRBLta-K1 Pita − − −
IRBLta-CT2 Pita − − −
IRBLz-Fu Piz − − −
IRBLz5-CA Piz5 − − −
IRBLzt-T Pizt − − −
IRBL1-CL Pi1 − − −
IRBL3-CP4 Pi3 + + +
IRBL5-M Pi5 + + +
IRBL7-M Pi7 − − −
IRBL9-W Pi9 − − −
IRBL12-M Pi12 − − −

IRBL19-A Pi19 − − −
Inabawase Pii + + +
Hikuriku11 Pii + + +
Tarehonami Pii + + +
AkitagomachiPii + + +
Fujisaka5 Pii + + +
Nongbaeg Pii + + +
Koshihikari Piks − − −
Tsuyuake
Reiho Pikm Pita2 − − −

Ingeniería Genética:
NUEVOS ALIMENTOS
ARROZ con enzima lactoferrina de leche
humana, que puede ser utilizada para mejorar
las fórmulas de leche infantil. Los niños la
necesitan para usar eficientemente el hierro y
pelear contra las infecciones
(Pearson, H. Nature, 26 april 2002).
ARROZ DORADO con beta caroteno de
genes de narciso y de Erwinia uredovora,
pigmentos que se transforman en provitamina
A al ser ingeridos.
ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.
ARROZ con aa esenciales
(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

Ingeniería Genética NUEVAS PLANTAS
ARROZ con altos niveles de tolerancia a
diferentes condiciones ambientales de estrés.
Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa
de E. Coli y un promotor tejido específico
dependiente del estrés. Los genes de trehalosa
permiten la producción de arroz aún si está
estresado por frio, sequía o altos niveles de
salinidad e incrementa la producción en 20%.
El azúcar trehalosa ayuda a estabilizar
moléculas biológicas: lípidos, enzimas y otras
proteínas, en organismos en condiciones de
estrés. La composición química de los granos no
cambia (PNAS Online, 27 nov. 2002).

Retos del futuro
¿Podrá Nicaragua, apropiarse de los
conocimientos de la Biotecnología para ayudar a
resolver la necesidad de alimentar
adecuadamente a su creciente población
¿Seremos capaces de preparar los recursos
humanos, que aprovechen los conocimientos
derivados de la Convergencia Nanotecnológica
(Tecnología de la Información, Biotecnología,
Nanotecnología, Ciencias del Conocimiento), en
beneficio del país

GRACIAS