SAMPLE REQUIREMENTS FOR MACROGEN SEQUENCING - VHIR

SAMPLE REQUIREMENTS FOR MACROGEN SEQUENCING
DNA samples and primers have to be premixed before shipping them to Macrogen.
Tubes or plates containing samples must be clearly labeled and match the data introduced in
the sequencing form of the service request.
Sequencing with users’ own primers: please bring to the UAT your premixed DNA plus
primer as indicated below.
Sequencing with universal primers: we will manage them at the UAT, so users are only
asked to bring the DNA samples. The universal primer specific for each sample must be
indicated in the “Comments” field of the sequencing form.
In particular cases, e.g. for those users that most frequently use a specific primer, the
Technician in charge (Rosa Arjona, ext. 4179) can store and handle it at the UAT.
‣ Sample requirements.
Starting material Concentration Volum Solvent
Purified PCR product 50 ng/µl 5 µl Distilled H 2 O or 10 mM Tris (no TE)
Plasmid 100 ng/µl 5 µl Distilled H 2 O or 10 mM Tris (no TE)
The success of automated sequencing critically depends on having high purity template in the
correct concentration. Both plasmid and amplicons must be purified. For plasmids, available
commercial methods are strongly recommended (Qiagen Mini and MidiPrep‐like kits). PCR
products must be free of contaminants, unused primers or dNTPs. PCR templates that do not
undergo any kind of post PCR clean up are not suitable for sequencing and will yield unusable
sequencing data. Commercial cleaning kits such as Qiagen Gel Extraction Kit or PCR‐Clean Up
Kit usually produce good results. It is highly recommended to check the PCR template in a gel
to confirm the presence of a specific product with the right size.
Sequencers are able to handle a wide range of DNA concentrations; however, scarce DNA
input will affect negatively data quality. Using UV absorbance‐based methods to quantify DNA
solutions often produces widely inaccurate results. Alternatively, a good way to quantify DNA
is to run an aliquot in a minigel and compare its intensity with a known concentration control
(e.g. a DNA ladder).
Please be advised that quantification by gel electrophoresis rather than Nanodrop is strongly
recommended.
‣ Primer requirements.
5 µl of a 5 pmol/µl primer solution are required per sample. Each primer must be premixed
with its matching DNA sample in the same tube/well (10 µl final volume).
The following universal primers are available at the UAT without any additional cost:

Primer name Primer sequence (5’ → 3’) Nº bases
T3 ATTAACCCTCACTAAAG 17
T7 AATACGACTCACTATAG 17
SP6 ATTTAGGTGACACTATAG 18
M13‐F GTAAAACGACGGCCAGT 17
M13‐R GCGGATAACAATTTCACACAGG 22
EGFP‐C CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG 22
EGFP‐N CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 22
Macrogen offers more universal primers at no extra charge. The complete list can be checked
at the web http://dna.macrogen.com/eng/support/seq/seq_uniencebador.jsp. Users
interested in requesting some of these primers may contact amb the Technician in charge.
Primers must be diluted in distilled H 2 O at the stated concentration and meet the following
requirements:
‐ High purity (free of salts, EDTA or other contaminants). Always avoid TE buffer.
‐ No secondary priming sites
‐ No mismatches
‐ A length of 18‐25 bases
‐ GC content between 40% and 60%
‐ Tm between 55°C and 60°C
‐ No significant hairpins (>3bp)
‣ Sample format.
Single samples: 1.5 ml tubes.
96‐well plates should be “semi‐skirted” to prevent physical damage during shipping and
tightly sealed using an adhesive cover after primer addition to avoid cross‐contamination
and sample evaporation. Samples should be prepared to avoid any well‐to‐well
concentration or size difference to obtain quality results.

CONDICIONS DE LES MOSTRES PER SEQÜENCIAR A MACROGEN
La mostra a seqüenciar i el encebador s’han d’enviar barrejats al mateix tub o pouet.
Les mostres s’han de retolar clarament i han de correspondre amb les dades introduïdes a
la plantilla de seqüenciació adjunta a la sol∙licitud del servei.
Si l’encebador és de l’usuari, s’ha de portar feta la barreja d’encebador i mostra al
mateix tub/placa en les condicions que s’indiquen a continuació.
Si l’encebador és universal, se n’afegirà a la UAT i per tant solament caldrà portar la
mostra. En aquest cas s’haurà d’indicar obligatòriament al camp de “comentaris” de la
plantilla de seqüenciació de la sol∙licitud quin encebador s’ha de fer servir per cada
mostra.
En casos particulars, p.ex. si feu servir habitualment un mateix primer i voleu que el
tinguem a la UAT, podeu contactar amb la Responsable del servei (Rosa Arjona, ext.
4179).
Condicions de les mostres:
Tipus de material Concentració Volum Solvent
Producte de PCR purificat 50 ng/µl 5 µl H 2 O destil∙lada o 10 mM Tris (no TE)
Plàsmid 100 ng/µl 5 µl H 2 O destil∙lada o 10 mM Tris (no TE)
En tots dos casos les mostres han de estar purificades. En el cas de plàsmids es recomana
purificar‐los fent servir kits comercials tipus Qiagen Miniprep/Midiprep. Els productes de PCR
també han d’anar purificats, lliures de contaminants, restes de encebadors i dNTPs, per tant
s’han de purificar, preferiblement utilitzant algun kit comercial tipus Qiagen Gel Extraction Kit
o PCR Clean‐up kit. Es recomana comprovar la presència d'un sol producte d'amplificació de la
mida correcta mitjançant un gel d’agarosa.
La quantificació s’ha de fer, si és possible, utilitzant algun mètode que no estigui basat en
l'absorbància, ja que aquests són gaire inexactes. Una bona manera de quantificar DNA és
carregar una alíquota en un minigel i comparar l’ intensitat de la banda amb un control de
concentració coneguda (p.ex. un marcador de pes molecular). Es preferible evitar mesures
fetes amb instruments tipus Nanodrop.
Condicions dels encebadors:
A cada mostra s’han d’afegir 5 µl de encebador a una concentració de 5 pmol/µl, per obtenir
un volum final de 10 µl.
Teniu a la vostra disposició els següents encebadors universals, que podeu utilitzar sense cap
cost addicional:

Encebador Seqüència (5’ → 3’) Nº bases
T3 ATTAACCCTCACTAAAG 17
T7 AATACGACTCACTATAG 17
SP6 ATTTAGGTGACACTATAG 18
M13‐F GTAAAACGACGGCCAGT 17
M13‐R GCGGATAACAATTTCACACAGG 22
EGFP‐C CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG 22
EGFP‐N CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 22
Macrogen ens permet disposar de més encebadors de forma gratuïta. Podeu consultar la llista
complerta i la seqüència a http://dna.macrogen.com/eng/support/seq/seq_uniencebador.jsp.
Si esteu interessats en fer ús d’algun encebador diferent als esmentats podeu contactar amb la
Responsable del servei i ella s’encarregarà de gestionar‐lo.
Els encebadors han d'estar dissolts en H 2 O destil∙lada a la concentració requerida i tenir les
següents característiques:
‐ Purificats, lliures de sals, EDTA o altres contaminants. S’
‐ No contenir llocs d'encebament secundaris
‐ No “mismatches”
‐ Longitud de 18‐25 bases.
‐ Contingut de GC entre 40% i 60%.
‐ Tm entre 55 ° C i 60 ° C
‐ No contenir forquilles importants (> 3 pb)
Format d’entrega de mostres.
‣ Seqüències individuals: tubs de 1.5 ml.
‣ Les plaques de 96 pouets han de ser de tipus “semi‐skirted” i si ja s’ha afegit el primer han
de estar perfectament segellades amb una coberta adhesiva per evitar contaminacions
creuades entre mostres o accidents durant el transport. Per obtenir resultats de bona
qualitat utilitzant el format placa és convenient que la mida y la concentració de la mostra
siguin homogenis a tots els pouets.