Diagnóstico molecular de parásitos - IIB-INTECH

• Metodos mas comunes que se empleanpara el diagnostico de parásitos?2

PROCEDIMIENTO1. Tomar una muestra de aproximadamente 3 g de material fecal y agregarle 30 ml de aguamezclándola de forma homogénea.2. Filtrar la suspención a través de un colador o gasa y ayudándose con un embudo llenar el tubo deensayo a 2 o 3 mm antes del borde.3. Balancear con otro tubo de ensayo lleno de agua y centrifugar durante un minuto a 2500 r.p.m.4. Decantar el sobrenadante y agitar el sedimento; agregar agua hasta llenar el tubo(efectuar los pasos3 y 4 las veces que sean necesarias hasta que el sobrenadante sea claro).5. Agregar 4ml de formol al 10% durante 10 minutos.Agregar 2 ml de nafta, tapar el tubo y agitar vigorosamente durante 30 seg. destapando lentamentepara que el contenido no salga al exterior.7. Centrifugar un minuto a 1500 r.p.m. Se observan cuatro capas: 1-nafta, 2-restos fecales, 3-formol, 4-sedimento.Decantar el sobrenadante.9. Agregar una gota de colorante al sedimento.10. Colocar una gota del sedimento sobre un portaobjeto. Se observa la preparación en el microscopiocon objetivo 10x y 40x.Tabla 1. Muestras fecales estudiadas y protozoos diagnosticados por el método directo ypor la técnica de Ritchie con nafta y éter.N=400 N=400 N=400M. Directo T de Ritchie nafta T de Ritchie eterNo % No % No %Giardia lamblia 46 11,5 72 18,0 74 18,5Entamoeba histolytica 41 10,2 62 15,5 63 15,7Giardia lamblia y E. histolitica 2 0,5 2 0,5 2 0,5Total 89 22,2 136 34,0 139 34,73

Esquema celular deltaquizoitoEstadíos del Toxoplasma gondii:Taquizoitos en VacuolaparasitóforaQuiste tisular7

Variación intra-especespecífica• Cepas no virulentas– Baja tasa de replicación– Menos patogénicas para el ratón– Producen más cantidad de quistes– Producen infecciones crónicasTipo II ( DX; 76K )Tipo III (C56, NED)• Cepas virulentas– Alta tasa de replicación– Más patogénicasTipo I (RH, BK, TT2975)8

Toxoplasmosis congénita nita por transmisióntransplacentaria1 er trimestre 2 do trimestre 3 er trimestreInfección severaInfecciónSubclínica9

Mujeres con serología positiva previa al embarazoPoblación inmune y no requiere nuevos controles(títulos elevados correlacionan con infecciones recientesse debe confirmar con IgM e IgA)Mujeres con serología negativa previa al embarazoPoblación susceptible y requiere nuevos controlesDiagnóstico precoz10

Diagnóstico• Directo:– PCR– Inoculación n experimental en animales o encultivo celular• Indirecto:– Sabin-FeldmanEvalúan an diferentes– IFIisotipos de anticuerpos– ISAGA(IgG, IgM e IgA) anti- T.– Elisagondii11

InmunodiagnósticoIgG –IgM –IgG –IgA –No infectadoNo infectadoEmbarazada repetir cada trimestreIgG + IgM –IgG +IgA –Infectado por más m s de 1 año. aInfectadoIgG + IgM + IgA –IgG + IgM – IgA +IgG + IgM + IgA +IndeterminadoInfectadorecientemente odentro de losúltimos 12 añosaTESTdeAVIDEZ12

AvidezAgudoCrónico13

Diagnóstico por PCRToxoplasmosis14

PCR-RFLP para el diagnostico dela toxoplasmosis15

Técnica de RT-loop-mediatedisothermal amplification (LAMP) assay16

LAMP: procedimiento parte I17

Procedimiento LAMP parte 218

Visualización de LAMP19

Proteínas recombinantesMW Sin ind ind eluidopurificaciones20

Sensibilidad de 4 antígenosrecombinantes del T. gondii con suerosdiluidos 1:100sensibilidad (%)rec. adq. (n=12) crónica (n=22)rGra4 7 (58.3) 4 (18.2)rGra7 9 (75) 8 (36.3)rRop2 10 (83.3) 12 (54.5)rP30ct 1 (8.3) 3 (13.6)rG4+rG7* 10 (83.3) 13 (59.1)rR2+rG4* 10 (83.3) 15 (68.2)rR2+rG7* 12 (100) 15 (68.2)R2+G4+G7* 12 (100) 18 (81.2)21

Sensibilidad de 4 antígenosrecombinantes del T. gondii consueros a 25 U/mlsensibilidad (%) rec. adq. (n=12) crónica (n=22)rGra4 12 (100) 17 (77.3)rGra7 11 (91.6) 19 (86.3)rRop2 11 (91.6) 21 (95.4)rP30ct 4 (33.3) 14 (63.6)rG4+rG7 12 (100) 21 (95.4)rR2+rG4 12 (100) 21 (95.4)rR2+rG7 12 (100) 22 (100)22

Reactividad de 4 antígenosrecombinantes del T. gondii con suerosa 25 U/mlrGra4rGra70,40,3*0,40,3*A4500,20,1A4500,20,10ChAc0ChAcrRop2rP30ctA4500,250,20,150,10,050A4500,120,10,080,060,040,020ChAcChAc23

Sensibilidad de los rAg de T. gondii con sueros de reciénnacidos con infección congénita (CT) o no infectados conanticuerpos maternosCT+/n (%)No- infectado+/n (%)PTodosrRop2 20/22 (91) 22/33 (67) 0.05rGra4 19/22 (86) 10/34 (29)

Cinética de reactividad de los rAg de T.gondii con sueros de niños no infectadosensayoedad denegativización(meses)promedio (95% CI)p vs cELISAcELISA 5.8 (4.9 – 6.7) NCrRop2 3.7 (2.8 – 4.6)

Aplicación de técnicas moleculares para el estudiode cepas de Echinococcus granulosusMara RosenzvitLaboratorio de Biología a Molecular de HidatidosisDepartamento de ParasitologíaInstituto Nacional de Enfermedades InfecciosasANLIS-“Dr. Carlos G. Malbrán”28

Quiste hidatidico29

Ciclo de vida de Echinococcus granulosus30

Cepas de E. granulosusOvejasVacasCabrasCerdosG1OvejasVacasG2BúfalosVacas?CiervoAlceG8G3CaballosBurrosCerdos?G4JabalíesG7CamellosCabrasVacasG6VacasG531

Detección n de infección n en perros1. Purgas con arecolina y observación macroscópica deadultos:• Específico pero con baja sensibilidad• Libera huevos contaminantes al medio ambiente• Peligroso para el personal que realiza la tarea• Morfología microscópica de huevos de teniasidéntica para todas las especies2. Coproantígeno:• Genero específico (no sirve para zonasendémicas con coexistencia de distintasespecies)• La sensibilidad depende de la carga parasitariadel animal del que proviene la muestra32

Importancia del desarrollo de un método mmolecularpara detección n de E. granulosus en perro• Monitorización de programas de control• Aumentar la sensibilidad y especificidaddiagnóstica• Evitar los riesgos de los métodos existentes33

Variabilidad genéticaExisten cepas o variantes genéticas del parásitoDifieren en:♣ rango de hospedadores♣ infectividad en el hombre♣ distribución geográfica♣ períodos prepatentes34

Métodos moleculares comunmenteutilizados para la identificación de cepasTécnicaPolimorfismode amplificación al azar(RAPD-PCR)Región del genomaDiversas regiones del genomaPolimorfismo de conformaciónde fragmentos simple cadena(SSCP)Polimorfismo delongitud de fragmentosde restricción (RFLP)(PCR o Southern blot)SecuenciaciónGenes mitocondriales: ND1 y CO1Zona regulatoria de gen nuclear:MDHGen nuclear ribosomal: ITS1Elemento repetido:TREGGenes mitocondriales: ND1 y CO135

Marcadores molecularesExpresadoNo expresadoSegmento específico de ADNExtra nuclearNuclear36

Métodos moleculares comunmenteutilizados para la identificación de cepasTécnicaPolimorfismode amplificación al azar(RAPD-PCR)Región del genomaDiversas regiones del genomaPolimorfismo de conformaciónde fragmentos simple cadena(SSCP)Polimorfismo delongitud de fragmentosde restricción (RFLP)(PCR o Southern blot)SecuenciaciónGenes mitocondriales: ND1 y CO1Zona regulatoria de gen nuclear:MDHGen nuclear ribosomal: ITS1Elemento repetido:TREGGenes mitocondriales: ND1 y CO137

Técnica de RFLP - Southern blotMembranaADNElectroforesisGelTransferencia a membranaDigestión con enzimas de restricciónDesnaturalización con solución alcalinaLa sonda hibrida con ADN complementarioIncubación consonda radiomarcadaLavado de sondaExposición y revelado38

G7 G6 G1Análisis mediante unelemento repetido no transcriptoRFLP-Southern blotG7 G6 G1G2 G1G5 Em39

Métodode PCR-SSCPIndivivuohomocigota5´ATTGCAATCGG 3´3´TAACGTTAGCC 5´5´ATTGCAATCGG 3´3´TAACGTTAGCC 5´5´ATTGCAATCGG 3´3´TAACGTTAGCC 5´5´ATTCCAATAGG 3´3´TAAGGTTATCC 5´IndivivuoheterocigotaDesnaturalización95 ºCElectroforesis no desnaturalizanteSimple cadena40

Análisismediante una zona regulatoria nuclear(MDH)SSCPG1- G2 G6- G7 G541

Determinación de cepa mediante secuenciación del genmitocondrial CO1Obtención de material parasitario(protoescólex o capa germinal de un quiste o adulto individual)Extracción de ADN totalAmplificación por PCR del gen mitocondrial CO1SecuenciaciónAlineación de secuencias con cepas patrones42

Métodode secuenciación automáticaticaNucleótidosfluorescentesReacción de secuenciaFraccionamiento deproductosCapturadorde imagenDetectorBandas fluorescentesatraviesan el detector43

Alineamiento de las secuencias CO1G1 patrón TGTGTTGATTTTGCCTGGATTTGGTATAATTAGTCATATTTGTTTGAGTATTAGTGCTAATTTTG 65G2 .................................................................G5......A...........G......G.T.......................C...........G.G6.........................G.T....................G......T.......G.G7...............C.........G.T....................G......T.......G.G1 patrón ATGCGTTTGGGTTCTATGGGTTGTTGTTTGCTATGTTTTCTATAGTGTGTTTGGGTAGCAGGGTT 130G2...T.........T...................................................G5...TT........T...........A..........................A.....T......G6...TT........T......................................A.....T..T...G7...TT........T......................................A.....T..T...G1 patrón TGGGGTCATCATATGTTTACTGTTGGGTTGGATGTGAAGACGGCTGTTTTTTTTAGCTCTGTTAC 195G2 .................................................................G5........................................................T........G6.....A....................A..A ...........T..............T........G7.....A....................A..A ...........T..............T........G1 patrón TATGATTATAGGGGTTCCTACTGGTATAAAGGTGTTTACTTGGTTATATATGTTGTTGAATTCGA 260G2 .................................................................G5............T................................G........A........T.G6............T................................G........A........T.G7............T................................G........A........T.44

Los tres marcadores molecularesagruparon en forma similar a losdiferentes genotiposHaplotipo CO1 Genotipo MDH Patrón TREGG1 A1/A2 DG1 A2/A2 DG2 A2/A2 DG5 A3/A3 UG6 A4/A4 TG7 A4/A4 T45

Distribución n geográficade las cepasG1: cepa ovejaG2: cepa oveja de TasmaniaG5: cepa vacaG6: cepa camelloG7: cepa cerdo46

Cepas presentes en nuestro país en diferenteshospedadores G1 (cepa oveja) G2 (cepa oveja de Tasmania) G5 (cepa vaca) G6 (cepa camello) G7 (cepa cerdo)Cepas encontradasen el hombre Varias cepas se encuentran en una misma zonageográficaTodas las cepas se encontraron en hospedadoresintermediarios y definitivos47

Diagnósticodepaludismo porPlasmodium vivaxutilizando secuenciasrepetitivas de ADNparasitarioBuenos Aires. Argentina48

P. vivax porconquistadoresQuechuas:quina-quinaEspaña SXIImalariaP. falciparumpor esclavosInglaterra S XIV-XVIIImalaria importadaRepública Romana S IIacEgipto 3000-1300acesplenomegaliafiebreRusia S XIImalariamalariaGrecia S V acfiebre terciana ycuartanaIndia 1500-800 acesplenomegaliafiebre otoñalChina 2700 acesplenomegaliafiebre terciana ycuartana49

• 1880: Laveran descubre el P. malariae en sangre de unpaciente febril en África• 1897: Ross descubre los parásitos de la malaria en Anophelesen la India• 1900: Grassi postula la existencia de un ciclo no eritrocítico• 1948: Shortt y Garnham encuentran plasmodios en hígado• 1966: Garnham describe el ciclo completo de P. falciparum50

Subreino ProtozoaPhylum ApicomplexaClase SporozoeaSubclase CoccidiaOrden EucoccidiidaSuborden HaemosporidiideaFamilia PlasmodiidaeGénero PlasmodiumEspecies que infectan al hombrePlasmodium malariae (Laveran, 188Plasmodium vivax (Grassi y FelettiPlasmodium falciparum (Welch, 18Plasmodium ovale (Stephens, 192251

sp.Ciclo52Plasmodium sp.Ciclo biológico biol gico de de Plasmodium

Métodos de diagnóstico de paludismo MicroscopíaópticaTests dediagnóstico rápidoInmunodiagnóstico Hibridación QBC PCR53

Especies de plasmodios que infectan al hombre• Plasmodiumvivax• Plasmodiumfalciparum• Plasmodiummalariae• PlasmodiumovaleTrofozoítojovenTrofozoítomaduroEsquizontejovenEsquizontemaduroMicrogametocitoMacrogametocito54

Extendido hemático55

Distribución geográfica de los principales vectoresdel paludismo en Argentina62

Disección ymicroscopíaópticaIRMADetección de plasmodiosen mosquitosELISASquash blotPCR63

Distribución mundial actual de la malaria64

Distribución de la malaria a mediados del siglo65

Distribución n de los casos de malariaen la Región n de las Américas, 199966

Paludismo en la República Argentina25002000CASOS1500100050001989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000AÑOTotalAutóctonos e introducidosFuente: Programa Nacional de Paludismo67

Desarrollo de un diagnóstico molecular paramalaria68

Clonado de un elemento repetitivo de PvIREpara el diagnóstico específico de lamalaria por “vivax”69

Clonado de Pv10, un elementoconteniendo un potencial PvIRE70

Tamaño de Pv10Pv1071

Cosntruccion de la minigenoteca con Pv1072

Clonado de PvIRE: las flechas se corrieron, el circulo indica las colonias especificas.ADN de P.vivax como sonda ADN de P. falciparum como sonda73

PvIRE es un elemento repetitivoLibrería de P. vivax en YACPvIREMspI (copia única)74

Número de copiasPlasmidsParasites75

Análisis de secuencia de Pv10PvIRE esel de 75pb76

Detección molecular de P. vivaxP falciparumPCRP falciparumHibridación por Dot blot77