Pruebas Bioquímicas T.P. Nº 5

T.P. Nº 5Pruebas Bioquímicas1

Especie bacteriana: colección de cepas que comparten propiedades estables y difierensignificativamente de otros grupos de cepas.Asociación DNA-DNA (>70%)Porcentaje de similitud rRNA 16S (>97%)IDENTIFICACION DE UN MICROORGANISMOPruebas bioquímicas:Ensayos que ponen de manifiesto características metabólicasde los microorganismos.2

CatalasaOxidasaHidrólisis de almidónMotilidadSensibilidad a antibióticosIMViCAgar Hierro-Dos azúcares de KliglerAPI 20EPruebas bioquímicas para laidentificación deenterobacterias3

Prueba de la Oxidasa(citocromo C oxidasa)VibrioAeromonasPseudomonasEscherichia coli4

Prueba de la Oxidasa(citocromo C oxidasa)Se utiliza un donor deelectrones artificial (tetrametilp-fenilenediamina).Reacción + Reacción -VibrioAeromonasPseudomonasEnterobacterias5

Prueba de la CatalasaPeróxido de hidrógenoCompuesto producido en pequeñas cantidadesdurante la respiración aeróbica. Su producciónestá mediada por flavoproteínas.Radical hidroxiloRadical libre altamente reactivo. Agenteoxidante capaz de atacar cualquier moléculaorgánica presente en la célula.6

Prueba de la CatalasaEnzimas que actúan sobrelos derivados tóxicos deloxígeno:CatalasaPeroxidasaEnzimas que destruyen el peróxido dehidrógeno.Superóxido dismutasaEnzima que destruye el aniónsuperóxido ( ).7

Prueba de la Catalasa-+Ensayo:Se toman bacterias de un cultivosólido y se esparcen con ansa sobreuna gota de peróxido de hidrógeno30%.Reacción +Aerobios estrictos ofacultativosReacción -Anaerobios estrictos omicroaerófilosBacillusStaphylococcusEnterobacteriasClostridiumStreptococcusLactobacillus8

Hidrólisis de almidónα-amilasa: Enzima que hidroliza los enlaces α(1-4)de polímeros de glucosa.-+Reacción +(Halo transparente)Agregado deLugolBacillusAgar - almidón9

MotilidadSe detecta la presencia de flagelo bacteriano.Se cultivan las bacterias por punción enplacas de agar blando.Se observa migración como un halo desdeel punto de siembra.Bacterias móvilesPseudomonasBacillusEnterobacterVibrioBacterias no móvilesStaphylococcus10

Sensibilidad a antibióticosMecanismos de acciónInhibición de la síntesis de la pared (Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina,Cefalosporinas, Vancomicina, etc.)Inhibición de la síntesis de proteínas (Streptomicina, Gentamicina,Cloranfenicol, Tetraciclina, etc.)Inhibición de la sínteis de ácidos nucléicos (Ciprofloxacina, Rifampicina, etc.)Disrupción de la membrana (Polimixina B)Antagonistas metabólicos (Sulfonamida, Trimetoprima)11

Sensibilidad a antibióticosMIC (concentración inhibitoria mínima)Análisis desensibilidad aantibióticosMLC (concentración letal mínima)Análisis de difusión en agar(sistema de discos)12

Sensibilidad a antibióticosMetodología de trabajo:Se crecen cultivos en medio líquido.Se mezcla el cultivo con agar blando (0,7%) y se vuelca sobre una placa de agar nutritivo.Se depositan discos con diferentes antibióticos.Se mide el diametro del halo de inhibición.13

Sensibilidad a antibióticosAntibiótico/Agente micribianoContenidodel discoDiámetro de la zona de inhibición (mm)Resistente(< ó =)IntermedioSensible(> ó =)Ampicilina Enterobacteriaceae10 µg1314-1617Ampicilina Estafilococos10 µg28---29Ampicilina Enterococos10 µg16---17Ampicilina Estreptococos ß hemoliticos10 µg1819-2526Mezlocilina Pseudomonas aeruginosa75 µg15---16Mezlocilina Enterobacteriaceae75 µg1718-2021Oxacilina Estafilococos1 µg1011-1213Oxacilina Neumococos1 µg------20Penicilina G Estafilococos10 U28---29Penicilina Enterococos10 U14---15Penicilina Estreptococos ß hemoliticos10 U1920-2728Piperacilina Pseudomonas aeruginosa100 µg17---18Piperacilina Enterobacteriaceae100 µg1718-202114

Pruebas bioquimicas para laidentificación de EnterobacteriasCocobacilos Gram negativosAerobios facultativos (Catalasa positivos)Fermentadores de GlucosaOxidasa negativos1) IMViCa) Prueba del Indolb) Rojo Metiloc) Voges Proskauerd) Prueba del citrato2) Agar Hierro Dos Azúcares de Kligler15

1)IMViCa) Prueba del IndolIndol: Subproducto de la degradación del aminoácido Triptofanopor la enzima triptofanasa.Cultivar la bacteria en caldo de peptonas(alto contenido de Triptofano ) por 48 h.Agregar al cultivo cinco gotas de reactivode Kovacs (dimetilaminobenzaldehído).Reacción –Formación de una faseorgánica amarillaReacción +Formación de una faseorgánica rojaEl reactivo de Kovacs reacciona con elindol dando un producto de color rojo.SalmonellaEnterobacterKlebsiellaE. coliProteus16

Fermentacion:Tipos de Fermentación1) Láctica2) Alcohólica3) Propiónica4) Butilenglicólica5) Ácido Mixta6) Aceto-Butírica17

Fermentación ButilenglicólicaEnterobacterSerratiaErwiniaBacillus18

Fermentación ÁcidoMixtaEscherichia, Salmonella,Proteus, etc.19

1)IMViCb) Rojo de MetiloEste ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de realizarfermentación ácido-mixta.Rojo de Metilo: Indicador de pH que vira al rojo por debajo de 4,3Se inocula medio RM-VPIncubación 48h a 37ºCSe agregan 3 gotas de Rojo deMetilo 0,1%.Reacción –(Amarillo)Reacción +(Rojo)EnterobacterKlebsiellaE. coli20

1)IMViCc) Voges ProskauerEste ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de produciracetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la frementación butilenglicólica de laglucosa.Se inocula medio RM-VPIncubación 48h a 37ºCReacción –Reacción +Se agregan 0,6 ml de reactivo de Barrit(α-naftol, vira al rojo al reaccionar con laacetoína) y 0,2 ml de KOH 40%.E. coli EnterobacterKlebsiella21

1)IMViCd) Prueba del CitratoEste ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de utilizarcitrato como única fuente de carbono.Estriar agar citrato de Simmons (contiene Azul debromotimol como indicador de pH).Incubación 48h a 37ºCReacción –Sin cambio (medio decolor verde).Reacción +Crecimiento y viraje alazul (la eliminación delcitrato alcaliniza elmedio).E. coliShigellaSalmonellaEnterobacterKlebsiella22

1)IMViCEscherichia coliProteus mirabilisSalmonellaEnterobacterKlebsiellaI M V C_ _+ +_ _+ +_ _+ +_ _+ +_ _+ +23

2) Agar Hierro-Dos azúcares de KliglerMedio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad parafermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.Peptona de carneLactosa y Glucosa(10:1)Tiosulfato de sodio.Citrato de hierro y amonio.A partir del consumo de peptonas se libera NH3 produciendouna alcalinización del medio.La fermentación de estos sustratos produce compuestosácidos.El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro dehidrógeno, el cual reacciona con la sal de hierroproduciendo sulfuro de hierro (precipitado negro) .Rojo fenolVira al amarillo en medio ácido.24

2) Agar Hierro-Dos azúcares de KliglerMedio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad parafermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.Se inocula el medio porpunción y estría ensuperficie.Incubación 24h a 37ºC25

2) Agar Hierro-Dos azúcares de KliglerMedio de cultivo para la diferenciación de enterobacterias en base a su capacidad parafermentar glucosa y lactosa, y para producir ácido sulfhídrico.26

API 20ESistema para la identificación rápida de enterobacterias.Dispositivo plástico con tubos que contienen medios deshidratados.Se inocula cada minitubo con una suspensión del microorganismo a analizar y seincuba 24 hs a 37ºC en una atmósfera húmeda.Al cada resultado se le asigna un código que da como resultado un número de 7cifras que se compara con tablas o bases de datos para la identificación de laespecie..27

API 20E28