L - IIB-INTECH

Introducción.

Introducción - 6Tratamiento de la enfermedad.El tratamiento etiológico en la enfermedad de Chagas está dirigido a erradicar el parásito, evitar laaparición o progresión de lesiones viscerales e interferir en la cadena de transmisión.Dicho tratamiento se indica en: infección aguda, infección congénita, reactivaciones en inmunodeprimidose infección crónica indeterminada (exclusivamente en niños y menores de 14 años). Antes de realizar eltratamiento, la infección debe ser confirmada mediante técnicas de referencia cuantitativas ya que ladisminución de los títulos pos-tratamiento constituyen un indicador de buena respuesta terapéutica enlos casos agudos [Rosa y col; 2001].La terapia para la enfermedad de Chagas ha dependido de dos drogas nitro-heterocíclicas, el Nifurtimoxy el Benznidazol. El primero es un nitrofurano introducido en la década de 1960 para el tratamiento dela patología en el estado agudo, es una droga tripanocida, fundamentalmente para los trypomastigotescirculantes, y es mejor tolerada en pacientes jóvenes. El mecanismo de acción de Nifurtimox involucraun metabolismo reductivo que lleva a la formación de radicales libres del oxígeno altamente tóxicos[Packchanian; 1957]. El Benznidazol, por su parte, es un 5’-nitroimidazol que se dió a conocer en ladécada del 70, y su efecto se produciría a través de la unión a macromoléculas produciendo daño a niveldel DNA. Debido a que los tratamientos con ambas drogas son prolongados, a que producen seriosefectos secundarios, y a que su eficacia es parcial, ya que no son efectivos para el tratamiento delChagas crónico; la necesidad de desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos se ha convertido enuna problemática de carácter urgente para la comunidad científica [ Barrett y col; 2003].Perspectivas para el desarrollo de nuevos agentes quimioterapéuticos.Trypanosoma cruzi posee numerosas características estructurales y metabólicas que lo diferencian desus huéspedes mamíferos. La explotación de dichas divergencias para el desarrollo de nuevas drogasdestinadas al tratamiento de la enfermedad es actualmente tema de investigación de numerosos gruposcientíficos de América Latina y de otras partes del mundo. Más adelante se hará mención a estospotenciales blancos de quimioterapia.

Introducción - 7Control vectorial.Cabe aclarar que el punto más directo para el manejo de la transmisión de la enfermedad, es el controldel vector. La enfermedad de Chagas, tal como se mencionó anteriormente es una patologíaperidomiciliaria, ya que la mayor parte de las personas infectadas fueron picadas por el insecto vectordentro de su propia vivienda. Los triatominos residen en lugares oscuros, grietas en los muros y techosde paja de viviendas precarias. Por lo tanto, la reparación de dichas grietas, o el reemplazo de losmuros y techo por planchas de chapa corrugada, madera o cemento, convierte a las estas viviendas enmedios adversos para el hábitat del insecto vector. La adición de insecticidas (piretroides sintéticos) deliberación lenta en pinturas, la aplicación directa de los mismos por aspersión y la utilización deformulaciones que generan humo, son también extensamente usados para el control del vector. A estotambién debe sumársele la implementación de planes de educación para la salud para las personasresidentes en lugares endémicos. Los países Latinoamericanos afectados por esta patología hanimplementado numerosas campañas, con las características antes mencionadas, para el control del vector.Esto ha llevado hoy en día a que la transmisión vectorial haya sido eliminada en Uruguay y Chile, y ennumerosas partes de Brasil y Argentina. Informes del año 1999 en los cuales se estima el número depersonas infectadas, sugieren que hay una disminución en la prevalencia de la enfermedad [Dias y col;2002].Trypanosoma cruziInfección y ciclo de vida.Los protozoarios de la familia Trypanosomatidae presentan durante su ciclo de vida numerosas formasque pueden ser facilmente distinguidas por microscopía de campo claro, y que reciben el nombre deestadíos. A grandes rasgos en T. cruzi pueden detectarse cuatro estadíos, dos en el mamífero hospedador(amastigote y tripomastigote sanguíneo) y dos en el insecto vector (epimastigotes y trypomastigotesmetacíclicos). Los epimastigotes se encuentran en el estómago e intestino medio de la vinchuca, poseenforma ahusada, una longitud de 20-40 µm, el núcleo posee forma redondeada y el kinetoplasto (región

Introducción - 8de la mitocondra que contiene el ADN mitocondrial) se encuentra ubicado anterior al mismo. Sonformas replicativas (se dividen por fisión binaria) no-infectivas y, a diferencia de los demás estadíos,pueden cultivarse en medio axénico. Esto hace que este sea la forma biológica de elección para la mayorparte de los experimentos que se llevan a cabo en T. cruzi (Fig.2A). Los tripomastigotes metacíclicosANKFBKNMOCKCMDGRKNFig.2. Estadíos del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi. A) Epimastigotes, B) Tripomastigote metacíclico, C)Amastigotes en el interior de una célula muscular, D) Tripomastigote sanguíneo en sangre periférica. N: núcleo; K:kinetoplasto; F: flagelo; MO: membrana ondulante; GR: glóbulo rojo; CM: célula muscular.por su parte, se generan por diferenciación de epimastigotes. Cuando estos últimos llegan al recto delinsecto vector, se adhieren a través de su flagelo mediante interacciones hidrofóbicas a la cutícula de lapared intestinal; esta adhesión es la que dispara el proceso de transformación que se denominametaciclogénesis y que está mediado por AMP c[Tyler y col; 2001]. Este proceso involucra cambiosen el metabolismo del parásito, expresión de nuevos marcadores de superficie, cambios en lahidrofobicidad que la membrana flagelar (que le permiten despegarse del sustrato al cual se había unidoel epimastigote), y la salida del ciclo celular, ya que esta forma del parásito es infectiva y no replicativa.Los trypomastigotes metacíclicos así generados se despegan de la pared intestinal y son eliminados enlas heces y la orina de la vinchuca. Poseen forma elongada (aprox. 20 µm de longitud), una membranaondulante en uno de sus lados, su núcleo es alargado y el kinetoplasto se encuentra ubicado posterioral mismo (Fig.2B). El ciclo de vida de Trypanosoma cruzi (Fig. 3) comienza cuando el insecto vectorse alimenta con la sangre del hospedador mamífero y luego defeca sobre la zona afectada. Lostripomastigotes metacíclicos contenidos en las heces del triatomino penetran a través de la piel lesionada,pasan al torrente sanguíneo e invaden un amplio rango de células nucleadas. Inicialmente se produce la

Introducción - 9Fig.3. Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi.adhesión del parásito a la membrana plasmática de la célula huésped, mediante un proceso dereconocimiento célula-célula en el que intervienen residuos de azúcares: galactosa, manosa y N-acetilglucosamina expuestos por la superficie de ambas (Fig.4a). Existen numerosas evidencias queindican que el ácido siálico está fuertemente involucrado en dicho proceso de reconocimiento, y que unaglicoproteína de superficie del parásito con actividad de trans-sialidasa y neuraminidasa, denominadatrans-sialidasa, cumple un rol primordial en la invasión . Una vez unido a la membrana plasmática de lacélula hospedadora, el trypomastigote envía una serie de señales que producen modificaciones en laconcentación de Ca 2+ intracelular de dicha célula, y que conducen a la movilización de microtúbulos desu citoesqueleto. Esto produce el reclutamiento de lisosomas hacia la zona de contacto con el parásito(Fig.4b). Se postula que las movilizaciones de Ca 2+ serían mediadas por la acción de dos peptidasasparasitarias: la oligopeptidasa B y la cruzipaína. La primera actuaría de manera indirecta mediante elclivaje (en el citoplasma del parásito) de un precursor inactivo para generar un agonista de calcio que esliberado al exterior. Posteriormente, este interactúa con un receptor de la membrana plasmática de lacélula del mamífero que produce la activación de la fosfolipasa C que a su vez genera un aumento en losniveles intracelulares de inositol tri fosfato (IP3). Dichos aumentos conducen a la movilización del calcio+intracelular [Burleigh y col; 2002]. El mecanismo de movilización de Ca 2cruzipaína-dependiente,

Introducción - 10involucra la liberación de la enzima al espacio extracelular a traves del bolsillo flagelar del parásito, elclivaje por parte de la misma de quininógenos de alto peso molecular provenientes de la célula huésped,y la concomitante formación de quininas activas (bradiquinina). Estas son reconocidas por un receptor+presente en la membrana plasmática de la célula hospedadora que estimula la liberación del Ca 2intracelularIP3 dependiente [Del Nery y col; 1997][Scharfstein y col; 2000].Diez minutos después de producida la adhesión del parásito a la membrana de la célula, este entra enella mediante un proceso de endocitosis constituyéndose así la vacuola parasitófora, que posee loslisosomas movilizados unidos a su cara externa (Fig.4c). Luego, dichos lisosomas se fusionan con lamembrana de la vacuola y liberan su contenido produciendo de esta manera la acidificación delcompartimiento (Fig.4d). A continuación el parásito secreta una molécula tipo porina denominada Tc-Tox, que produce poros en la membrana de la vacuola parasitófora y permite su salida hacia el citosolde la célula hospedadora (Fig.4e). La exposición de los tripomastigotes al medio ácido de dicha vacuolaes un pre-requisito para la sobrevida de T. cruzi, ya que la activación de Tc-Tox ocurre solamente eneste entorno. Una vez en el citoplasma de la célula, el tripomastigote comienza a sufrir el proceso dediferenciación a esferomastigote o amastigote (Fig.4f): su flagelo se acorta y se hace casi inexistente,su cuerpo celular se redondea y el núcleo vuelve a tomar forma redondeada (Fig.2C). Esta forma delparásito es replicativa, y ahora es considerada también infectiva, ya que se ha comprobado queamastigotes liberados al torrente sanguíneo son capaces de propagar la infección. [Ley y col; 1988]demostraron que los amastigotes son capaces de invadir células, fundamentalmente fagocíticas, por unmecanismo esencialmente distinto al de los trypomastigotes. Unas 24 a 35 horas después de su salida alcitosol, el amastigote comienza a dividirse activamente por fisión binaria y llega a formar pseudo-quistesdentro de la célula (Fig.4g). Cuando ya existe una alta densidad de parásitos intracelulares, los amastigotesse diferencian a tripomastigotes sanguíneos que salen de la célula infectada, pasan a la sangre o linfa delmamímero y pueden invadir nuevas células [Burleigh y col; 2002] [Tyler y col; 2001]. Los tripomastigotessanguíneos (Fig.2D) poseen forma similar a los tripomastigotes metacíclicos, y comparten algunaspropiedades biológicas, sin embargo los primeros poseen la capacidad de transformarse en epimastigotesa 27ºC en sangre o medio axénico, propiedad que está ausente en los metacíclicos. Además ambasformas del parásito también poseen antígenos estadío específicos y presentan diferentes modos deinteraccionar con las células hospedadoras. El ciclo de vida del parásito se cierra cuando el insectovector se alimenta con la sangre de un mamífero infectado. Dicha sangre contiene trypomastigotessanguíneos que, al llegar al intestino del triatominio se diferencian a epimastigotes.

Introducción - 11Tal como se mencionó al principio de este apartado la subdivisión de T. cruzi en tan sólo cuatro formasbiológicas es tan solo una simplificación, ya que se han detectado numerosas formas intermedias delparásito con características morfológicas, de antigenicidad e infectividad diferentes [Tyler y col; 2001][Navarro y col; 2003], sin embargo la descripción de las mismas supera los objetivos de esta tesis.abcgedfFig.4. Esquema correspondiente al proceso de invasión celular. a) reconocimento célula-célula, b) movilización delisosomas hacia la zona de contacto con el parásito, c) endocitosis y formación de la vacuola parasitófora, d) fusiónde los lisosomas con la membrana de dicha vacuola y acidificación de la misma, e) liberación de la molécula Tc-TOXy formación de poros en la membrana vacuolar, f) salida del parásito hacia el citoplasma celular y diferenciación aamastigotes, g) replicación activa de los amastigotes dentro de la célula hasta llegar a la formación de pseudoquistes.

Introducción - 12Características ultraestructurales y metabólicas de Trypanosoma cruzi.MPGliMMKMIGolKBFPMNMMCFMNMSNFig.5. Ultraestructura de Tripanosoma cruzi. Microscopía electrónica de transmisión de epimastigotes deTrypanosoma cruzi. MP: membrana plasmática, MM: membrana mitocondrial, MN: membrana nuclear, MS: microtúbulossubpeliculares, MI: microtúbulos intranucleares, Gli:Glicosoma, N: núcleo, K: kinetoplasto, C: centríolo, BF: bolsilloflagelar,F: flagelo, PM: placas mitóticas, Gol: aparato de golgi.El núcleo.*Estructura y genoma.La forma del núcleo depende del estadío del parásito. Tal como se mencionó anteriormente entrypomastigotes metacíclicos y sanguíneos es alargado y se encuentra ubicado en la parte central de lacélula; en epimastigotes y amastigotes, en cambio, posee forma redondeada. Se encuentra rodeado poruna membrana nuclear típica, y se ha determinado la existencia de continuidad entre la membrana nuclearexterna y el retículo endoplásmico (RE). El nucléolo posee una ubicación algo excéntrica y deja de serobservado cuando la célula entra en división. El genoma de T. cruzi posee un tamaño aproximado de

Introducción - 1345-50 Mpb, y una característica particular de este parásito es que el ADN nuclear no se condensa paraformar cromosomas en ninguna de sus formas de vida; solamente es posible observar durante la interfaseciertos acúmulos de cromatina en la periferia del núcleo, por debajo de la membrana nuclear interna. Sinembargo, el desarrollo de la técnica de pulsed field gel electrophoresis ha permitido identificar enepimastigotes de T. cruzi de 30 a 40 “bandas cromosomales”, que poseen un tamaño de entre 0.45 y 4Mpb [De Souza; 2002].*Regulación de la expresión de los genes nucleares.En tripanosomátidos los genes nucleares carecen de intrones y aparecen generalmente dispuestos endensos grupos que contienen repeticiones de un mismo gen, con marcos abiertos de lectura (ORF) norelacionados interpuestos. Los sucesivos genes están separados entre si por cortas secuenciasdenominadas, secuencias intergénicas, y debido a la existencia de tan solo unos pocos promotorespara la transcripción, son transcriptos por la RNA polimerasa II como largas unidades policistrónicas.Los transcriptos primarios asi generados son posteriormente procesados, mediante un mecanismo decortado y pegado, en los ARN mmaduros e individuales correspondientes a cada uno de sus genescomponentes. Este proceso involucra la adición de una cola de adeninas en el 3’ de los transcriptos(poli-adenilación) y el agregado de 35 nucleótidos estrictamente conservados, denominados mini exóno splice leader en el 5’. Este último proceso se denomina capping y ocurre por trans splicing. Tantola poli-adenilación como el capping no se llevan a cabo en un lugar fijo de la región intergénica, sinó quepueden ocurrir en varios lugares dentro de una ventana relativamente estrecha de la misma, y estáninfluenciados por la presencia de corridas de poli-pirimidinas que interaccionan con aquellas proteínasinvolucradas en el procesamiento del ARN. Estas posiciones alternativas para el procesamiento de losmensajeros primarios hacen que existan distintos ARN m, con diferentes longitudes de regiones nocodificantes, para un mismo gen. Estas variaciones serían potencialmente importantes para la regulaciónde la expresión génica en tripanosomátidos, ya que a diferencia de otros organismos, los niveles en laexpresión de proteínas en estos parásitos están controlados post-transcripcionalmente por unmecanismo que involucra estabilización o desestabilización de los ARN m[ Vanhamme y col; 1995].La posibilidad de interferir con este proceso es considerada un posible blanco para el desarrollo dedrogas.

Introducción - 14La superficie celular.Puede considerarse que la superficie celular de los tripanosomátidos posee dos componentesestrechamente asociados: la membrana plasmática, y una extensa capa de microtúbulos denominadosmicrotúbulos subpeliculares asociados a ella. La membrana puede subdividirse en tres subdominiosmorfológicamente distintos, cada uno de los cuales posee funciones, composición proteica y lipídicadiferentes: la membrana flagelar, la membrana del bolsillo flagelar y la membrana plasmática del cuerpodel parásito [Landfear y col; 2001].*Los microtúbulos.Los microtúbulos subpeliculares se extienden por debajo de la membrana plasmática a lo largo de todoel cuerpo del parásito excepto en la región del bolsillo flagelar. Se encuentran unidos entre si y a lamembrana mediante filamentos cortos de naturaleza desconocida que le dan rigidez a la célula; estánregularmente espaciados y su número está relacionado con el diámetro de la misma. De esta manera, enla parte posterior y anterior del parásito la cantidad de microtúbulos es menor, mientras que en la regióncentral, entre el núcleo y el kinetoplasto donde se encuentra el aparato de Golgi, existe una granacumulación de ellos. Están involucrados en los cambios morfológicos que sufre T. cruzi durante suciclo de vida, y cumplen un rol fundamental en la división celular. Debido a esto el desarrollo de drogasque inhiban el ensamblado de los microtúbolos es un potencial blanco quimioterapéutico. Se ha demostradoque son resistentes a los inhibidores clásicos de microtúbulos tales como colchicina y benzimidazoles,sin embargo algunos alcaloides y macrólidos han mostrado ser efectivos [De Souza; 2002].* Arquitectura de membranas, transportadores y entrada de drogas.Los tripanosomátidos poseen transportadores de membrana que median la captación de nutrientes delmedio (célula hospedadora), e intervienen en la internalización de drogas. En el primer caso, el diseñode compuestos que bloqueen específicamente dichos transportadores es considerado de gran importancia[Hasne y col; 2000], mientras que en el segundo, el conocimiento de la estructura de las moléculastransportadoras es crucial para el desarrollo de drogas que puedan adaptarse mejor a ellas, y por lotanto puedan ser internalizadas con mayor eficacia. Muchas de las proteínas estructurales de superficiede los tripanosomatidos, incluso las mucinas de T. cruzi, están unidas a la membrana mediante anclasde glicosil-fosfatidil-inositol (GPI). Las enzimas parasitarias encargadas de la biosíntesis de dichas anclas

Introducción - 15difieren bastante de sus homólogas de mamíferos, y se ha demostrado que son esenciales para la sobrevidadel parásito mediante la utilización de inhibidores específicos [Ferguson y col; 1999].Bolsillo flagelar, vía endocítica y secretoria.El bolsillo flagelar es una invaginación de la membrana plasmática ubicada en la región anterior delparásito desde donde emerge el flagelo; presenta distinta morfología en los diferentes kinetoplástidos, ytambién varía de acuerdo al estadío del ciclo de vida del parásito; sin embargo, en todos los casos sufunción es similar. En epimastigotes y amastigotes de T. cruzi es una estructura con forma de tuneldenominada complejo citostomo-citoprandix, constituída por una profunda invaginación de la membranaplasmática que puede llegar hasta la región nuclear. La apertura del complejo, conocida como citostoma,posee un diámetro que puede llegar a los 0.3 µm [De Souza; 2002]. En la región del bolsillo flagelarexiste solución de continuidad entre la membrana plasmática y la flagelar. Representa entre el 0.4 y el 3% de la superficie del parásito, su lumen ha demostrado estar constituído por un material electron densoque contiene proteínas específicas y debido a que es una región altamente especializada de la membrana,difiere en composición y distribución de proteínas con respecto al resto y carece de los microtúbulossubpeliculares. Es el único sitio conocido hasta el momento en tripanosomátidos a través del cual sellevan a cabo los procesos de endocitosis, secreción de proteínas hacia el espacio extracelular, eintegración de proteínas de membrana de la superficie del parásito. [Landfear y col; 2001].* Vía endocítica y reservosomas.Las moléculas a ser endocitadas por el parásito, inicialmente se unen a la región del bolsilo flagelar(citostomo), y luego son internalizadas en el fondo del citoprandix, apareciendo en el citoplasmacelular como pequeñas vesículas endocíticas que, posteriormente se fusionan entre si y generan estructurastubulares que pueden observarse en la zona central del parásito. Más tarde las macromoléculas endocitadasson concentradas en estructuras denominadas reservosomas. Cada epimastigote presenta variosreservosomas localizados en la región posterior de la célula, su forma puede variar de acuerdo a lascondiciones de crecimiento del parásito, pero puede decirse que en general presentan forma esférica,que están rodeados por una única membrana y que poseen un diámetro aproximado de 0.7 µm. Talcomo lo indica su nombre, los reservosomas son organelas de reserva, que contienen lípidos y proteínasque son utilizados por el parásito cuando se encuentra creciendo en un medio escaso de nutrientes. Una

Introducción - 16característica importante de los reservosomas es que acumulan grandes cantidades de cruzipaína que esla cisteina proteinasa principal presente en T. cruzi.*Vía secretoria.Los trypanosomátidos poseen un retículo endoplasmico (RE) extenso disperso por todo el citoplasmacelular, que posee solución de continuidad con la membrana nuclear externa. El aparato de Golgi esuna organela situada en el centro de la vía secretoria cuya función es la de agregar carbohidratos complejosa lípidos de membrana y proteínas sintetizadas de novo en el RE que serán secretadas al medio extracelularo integradas a membranas. En tripanosomátidos el complejo de Golgi se encuentra ubicado entre elnúcleo y el kinetoplasto, posee de 4 a 6 sacos aplanados con una cara cis, de entrada de vesículasprovenientes del RE y una cara trans de salida de vesículas (conteniendo lipidos y proteínas ya procesados)hacia el bolsillo flagelar.El flagelo.Todos los miembros de la familia Trypanosomatidae poseen un flagelo que emerge del bosillo flagelar, yle otorga movilidad al parásito. Posee una estructura basica similar a la de otros flagelos, presenta unaxonema con una patrón de microtúbulos de 9+2, y una estructura filamentosa altamente organizadaque lo acompaña en toda su longitud y que se denomina bastón paraflagelar (paraflagellar rod). Lalongitud del flagelo varía de acuerdo al estadío del ciclo de vida del parásito, de esta manera, en amastigotesmide solamente 1µm, mientras que en epimastigotes y trypomastigotes llega a medir 20 µm [De Souza;2002].Mitocondria y kinetoplasto.Trypanosoma cruzi, al igual que el resto de los miembros de la familia trypanosomatidae, posee unaúnica mitocondria que se extiende a lo largo del cuerpo celular del parásito. A diferencia de lo queocurre en las células de mamíferos, la membrana mitocondrial de los tripanosomátidos presenta una altacantidad de esteroles. Se ha demostrado que el tratamiento de parásitos con drogas que alteran la

Introducción - 17síntesis de ergosterol produce graves cambios morfológicos y funcionales en la mitocondria; estacaracterística hace que el desarrollo de nuevas drogas que inhiban la biosíntesis de esteroles seaconsiderado un blanco de quimioterapia muy promisorio [De Souza; 2002].Otra característica importante de la mitocondria de los tripanosomátidos es su material genético, elADN mitocondrial representa entre el 20 y el 25 % del ADN total del parásito y se encuentra localizadocerca del cuerpo basal formando una estructura denominada kinetoplasto. Este está constituído poruna intrincada red de mini y maxi círculos de ADN [Shapiro y col; 1995]. Existen aproximadamente de20.000 a 30.000 minicírculos que poseen una longitud de 0.45 µm (aproximadamente 1440 pb), ycerca de 30 maxicírculos con un diámetro de 10 µm y un tamaño comparable al ADN mitocondrial deotras células eucariotas. Estos últimos serían los componentes activos del genoma mitocondrial delparásito [De Souza; 2002].* Editado del RNA.Los productos de la expresión de algunos de los genes codificados en el kinetoplasto participan en eleditado del RNA mitocondrial, que involucra la adición o remoción de residuos de uridina a lostranscriptos primarios, para dar transcriptos maduros que puedan ser traducidos. La especificidad deeste mecanismo esta determinada por la presencia de ARNs complementarios que actúan mayoritariamenteen trans, y solo en algunos casos en cis, y que guían a la maquinaria enzimática a los sitios específicosdonde deben llevarse a cabo las inserciones o deleciones de residuos de uridina [Simpson y col; 2003].Debido a que este es un proceso único para los tripanosomátidos, aquellas enzimas involucradas en elmismo son potenciales blancos para el desarrollo de nuevas drogas.Glicosomas.*Características generales.Son organelas relacionadas con los peroxisomas y glioxisomas debido a que poseen característicasmorfológicas y algunas vías metabólicas en común. Sin embargo, existen diferencias que los conviertenen organelas únicas, y por ello son considerados buenos blancos para el desarrollo de nuevos agentesquimioterapéuticos. La característica más importante de los glicosomas, que los diferencia de los otrosmiembros de su familia, es la presencia de las siete primeras enzimas de la vía glicolítica en la matrizglicosomal. Esta compartimentalización les otorga a las enzimas características bioquímicas y de regulación

Introducción - 18particulares, que están siendo ampliamente estudiadas y sobre las cuales se hablará más adelante. Enestas organelas es posible también encontrar enzimas involucradas en el metabolismo de peróxidos, sinembargo, la catalasa, considerada como marcadora de peroxisomas y glioxisomas, se encuentra ausenteen algunos miembros de la familia Trypanosomatidae como ser T .cruzi, T. brucei y Leishmania. Enotros miembros de la familia, sin embargo, la enzima pudo ser detectada con facilidad; este es el caso deCrithidia y Leptomonas. Otras de las vías compartidas entre glicosomas y peroxisomas, son la β-oxidación de ácidos grasos, la primera parte de la biosíntesis de eteres lipídicos y la hidroxi-metil glutarilCoA reductasa para la síntesis de isoprenoides. Los glicosomas poseen también enzimas de la vía de laspentosas fosfato, en concordancia con los peroxisomas de hígado de rata donde se ha detectado lapresencia de las deshidrogenasas de la rama oxidativa de dicha vía [Tabla.1] [Parsons y col; 2001].Otra característica única de los glicosomas, es la presencia de enzimas correspondientes a las vía desalvataje de purinas, biosíntesis de pirimidinas y gluconeogénesis.*-oxidación deácidos grasosPeroxisomasde mamíferosPeroxisomasde lavadurasGlioxisomasGlicosomasSi Si Si Si*Catalasa Si Si SiEspeciedependiente*Glicólisis No No No Si*Ciclo delglioxilato*Biosíntesis deisoprenoides*Vía de salvatajede purinas*Síntesis de étereslipídicosNo Si Si NoSi No ? ?No No No SiSi No No Si*Vía de lapentosas fosfatoEspeciedependiente? ? SiTabla.1. Comparación de vías metabólicas presentes en peroxisomas, glioxisomas y glicosomas.*Características ultraestructurales y funcionales.Los glicosomas son microcuerpos esféricos, poseen un tamaño de entre 0.1-0.3 µm, se encuentrandistribuídos al azar por todo el citoplasma del parásito y están rodeados por una única membrana cuya

Introducción - 19composición lipídica y proteica difiere de la del resto de la célula. Dicha membrana posee bajapermeabilidad a la mayor parte de los metabolitos incluyendo el NAD(H), de manera tal que el movimientode los mismos a través de la membrana se realiza por medio de moléculas transportadoras homólogasa los transportadores ABC involucrados en el movimiento de ácidos grasos a través de la membranaperoxisomal de levaduras y células de mamíferos [Hannaert y col; 2003]. Los glicosomas, al igual quelos peroxisomas y glioxisomas carecen de material genético, por lo que se considera que las proteínaslumenales de dichas organelas están codificadas por genes nucleares, son sintetizadas en ribosomaslibres en el citosol, y transportadas post-traduccionalmente hacia las mismas. Los mecanismos deinternalización de proteínas hacia la matriz glicosomal difieren sustancialmente de aquellos involucradosen la inserción de proteínas a la membrana de dicha organela, y no involucran ningún tipo de procesamientoproteolítico de la proteína a ser internalizada. Es un mecanismo en que pueden identificarse tres pasosfundamentales: 1) reconocimiento de la secuencia señal, presente en la proteína a ser internalizada, porparte de receptores citoplasmáticos denominados peroxinas; 2) desplazamiento de los complejos enzimareceptorhacia la membrana glicosomal donde se unen a los complejos proteicos de membranaresponsables de la traslocación de las proteínas hacia la matriz; 3) internalización de los complejosenzima-receptor, en su estado nativo y posterior salida del receptor nuevamente hacia el citosol [Parsonsy col; 2001]. Se han identificado dos tipos de señales denominadas PTS (peroxisomal targeting signal)presentes en la proteínas a ser internalizadas. Una de ellas, llamada PTS 1es un tripéptido C-terminalSeñal PTS 1Eficiencia de internalizaciónTripanosomas MamíferosNinguna - -SKL + +AKL + +CKL ++ +SRL ++ +SSL + -SHL + +SKM + +/-ARL + +Tabla.2. Polimorfismos en el tripéptido C-terminal correspondiente a la señal de reclutamiento glicosomal detipo PTS 1.Eficiencia de las variantes del tripeptido canónico SKL, para el reclutamiento de proteínas hacia la matrizglicosomal (tripanosomátidos) y peroxisomal (mamiferos). Dicha efiencia expresada como ++ (muy buena),+ (buena)+/- (baja) y – (nula, no dectable), se analizó mediante la construcción de híbridos CAT-PGK (cloramfenicol acetiltransferasa fusionada a 22 residuos de aminoácidos de extremo C-terminal de la fosfoglicerato kinasa glicosomal deT. brucei), a los cuales se les variaba la secuencia del tripéptido C-terminal. [Blattnery col; 1992]

Introducción - 20cuya secuencia canónica es Ser, Lys, Leu (SKL); sin embargo existe una relativa plasticidad en sucomposición, la que varía sustancialmente entre mamíferos y tripanosomátidos. Mediante experimentosde fusión de los distintos tripéptidos a secuencias reporteras, se ha podido evaluar su eficiencia comoseñales de importación. (Tabla.2). [Blattner y col; 1992].Estudios posteriores han permitido determinar que en realidad, las señales de tipo PTS 1están constituídaspor 12 residuos de aminoácidos, de manera tal que su eficiencia como secuencia de importación nosolo está influenciada por la composición aminoacídica particular del tripéptido C-terminal, sinótambién por la naturaleza de los 9 residuos de aminoácidos que lo anteceden ver (Fig.6) [Neuberguer ycol; 2003]. Así, estas variaciones estarían influyendo en el reconocimiento de la señal PTS 1por parte desu molécula receptora, denominada PEX 5, en el citosol. De acuerdo con esto, un único polipéptido,conteniendo dicha señal puede ser parcialmente internalizado en los glicosomas, presentando unadistribución dual entre dicha organela y el citosol. Este es el caso de la glucosa fosfato isomerasa (PGI)de Leishmania mexicana y T. brucei, que a pesar de ser codificadas por un único gen y presentar laseñal C-terminal AHL y SHL respectivamente, no poseen una distribución exclusivamente glicosomal.La enzima de Leishmania se encuentra distribuída fundamentalmente en citosol y tan solo un pequeñoporcentaje en glicosoma. Su homólogo de T. brucei en cambio, sufre variaciones en su localización deacuerdo al ciclo de vida del parásito. De esta manera, mientras que en la forma sanguínea de T. bruceila enzima posee una localización casi exclusivamente glicosomal, en procíclicos una fracción considerableX-X-X-X-X-X-X-X-X-S-K-L -10-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0-11 -9 -8 Tripéptido C-terminal sujeto a las variacionesde secuencia expuestas en la Tabla.3.Región encargada de interaccionar con la superficie de la moléculaRegión no estructurada accesible al solvente, que posee funcionesde "linker", entre la proteína a ser internalizada a la matrizglicosomal y su receptor.Fig.6. Esquema de la señal de reclutamiento glicosomal de tipo PTS 1, tripéptido C-terminal y aminoácidosacompañantes. En dicho esquema se muestra el tripéptido SKL posición 0 a -2 (que puede estar sujeto a lasvariaciones de secuencia expuestas en la tabla 3). Los residuos de aminoácidos ubicados en las posiciones -3 a -6,participan en la interacción con el receptor PEX5 y por lo tanto existen exigencias en cuanto a la naturaleza de cadauno de ellos. En la posición -3 hay preferencia por residuos de aminoácidos básicos, en la posicion -4 se requierenresiduos hidrofóbicos y alifáticos (Leu), y en la posición -6 es necesaria la presencia de un residuo flexible para evitarimpedimentos estéricos con el receptor (en muchos casos se encuentra una Lys). Los residuos de aminoácidos de lasposiciones -7 a –11, son generalmente hidrofílicos y flexibles.

Introducción - 21de la misma se encuentra en el citosol. Hay varias teorías tendientes a explicar estas localizacionesbipartitas: una de ellas tal como se explicó anteriormente tiene que ver con la naturaleza de la propiasecuencia señal y los residuos de aminoácidos que la flanquean; otras en cambio, proponen la existenciade modificaciones post traduccionales menores, aún no detectadas, que conducirían a la retencióncompleta o parcial de dichas proteínas en los glicosomas. Por último, y en un intento de explicar lasdiferencias inter-estadío encontradas para la PGI de T. brucei se ha propuesto la teoría de controlcinético para la internalización de proteínas glicosomales. De acuerdo con esto en un determinadoestadío del ciclo de vida del parásito, las velocidades de síntesis de proteínas en el citosol, y la velocidadde internalización de las mismas en el glicosoma determinan su concentración en el estado estacionarioen ambos compartimientos. Estas concentraciones pueden variar drásticamente si se presentan cambiostanto en la velocidad de síntesis de proteínas como en su internalización hacia la matriz glicosomal, y estopuede ocurrir durante la transformación de un estadío celular a otro. Como se puede observar, unateoría no excluye a la otra de manera tal que la localización bipartita de esta enzima pueden ser deresultado de una sumatoria de factores aún no demasiado clarificados [Nyame y col; 1994]. El otro tipode señal de localización peroxisomal, se denomina PTS 2.Se trata de un nonapéptido ubicado en laregión amino terminal de las proteínas, que es reconocido en el citosol por un receptor denominadoPEX 7. Es una secuencia que presenta bastante plasticidad ya que tan solo unos pocos aminoácidos seencuentran estrictamente conservados ver (Fig.7). En tripanosomatidos se ha detectado esta señal en la1MSESVGRTSAM - H R L Q V V L G H L - A G R P .... Tiolasa A de rata1M - H R L Q V V L G H L - A G R S .... Tiolasa B de rata1M - Q R L Q V V L G H L - R G P A .... Tiolasa humana1M S Q R L Q S I K D H L - - - V L.... Tiolasa de S. cerevisiae1M S K R V E V L L T Q L P A Y N...... Aldolasa de T. bruceiFig.7. Señal de reclutamiento glicosomal de tipo PTS 2. Alineamiento de secuencias que poseen señales de tipoPTS 2. En el caso de la tiolasa A de rata el nonapéptido que constituye esta señal (subrayado), se encuentra en laregión amino terminal de la proteína, mientras que en los otros casos dicho nonapéptido constituye el extremoamino terminal de las proteínas. Los residuos de aminoácidos estrictamente conservados se encuentran señaladosen letras rojas, mientras que aquellos que se encuentran parcialmente conservados han sido denotados en letrasnaranjas.

Introducción - 22aldolasa de T. brucei [Blattner y col; 1995]. Por último cabe aclarar que está siendo considerada laposibilidad de la existencia de señales internas de reclutamiento de proteínas hacia la matriz glicosomal.Acidocalcisomas.Son vacuolas citoplasmáticas acídicas rodeadas por una única membrana. Poseen una matriz electróndensa compuesta por altas concentraciones de Ca 2+ , P, Mg y Zn. El fósforo detectado se encuentra enla forma de pirofosfato y polifosfatos de cadena corta, el primero es el fosfato de alta energía másabundante presente en T. cruzi. En menor proporción se detectaron también Cl, K y S (el bajo contenidode azufre sugiere la presencia de baja concentración de proteinas). En su membrana se detectaron unaCa 2+ - H + ATPasa, una H + -ATPasa (involucrada en la mantención del pH acídico de la organela), unapirofosfatasa vacuolar (encargada de la traslocación de protones), y dos intercambiadores de Na + -H +y Ca 2+ -H + [Docampo y col; 1999]. Existen diferentes teorías, no mutuamente excluyentes, desarrolladaspor Docampo y col; 1999, referentes a las posibles funciones de esta organela. Una de ellas habla de unrol fundamental en el almacenamiento de Ca 2+ en determinados estadíos del ciclo de vida del parásito,ya que, tal como se discutió anteriormente, este catión se encuentra involucrado en los proceso deinvasión, señalización, diferenciación, etc. Otra función propuesta para los acidocalcisomas tiene quever con el almacenamiento de energía, ya que contiene altas concentraciones de PPi, a su vez, debido ala presencia de una H + -ATPasa en su membrana, se propuso que podría estar cumpliendo un rolimportante en la regulación del pH citosólico. Por último también se ha propuesto un posible rol en elcontrol de la osmorregulación.Vías metabólicas y su posible explotación para el desarrollo de nuevosagentes quimioterapéuticos.*Vía glicolítica.La vía glicolítica es operativa en todos los trypanosomátidos estudiados hasta el momento, y presentados características principales que la distinguen de la de mamíferos:

Introducción - 231) Compartamentalización de la vía: a diferencia de las enzimas glicolíticas de mamíferos queposeen una localización estrictamente citosólica, en tripanosomátidos la vía se encuentra parcialmentecompartimentalizada dentro del glicosoma. Así en Trypanosoma cruzi y procíclicos de T. brucei, lasprimeras seis enzimas de la vía (desde la hexoquinasa (HK) hasta la gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa(G3PDH) residen dentro de dicha organela, y las cuatro restantes en el citosol. En la forma sanguínea deTrypanosoma brucei, en cambio, las siete primeras enzimas de la vía glicolítica residen dentro delglicosoma (desde la HK hasta la fosfoglicerato quinasa (PGK)). Esto hace que en dicho estadío existaun balance dentro del glicosoma entre el ATP consumido por la HK y la fosfofructoquinasa (PFK), yel producido por la PGK. Estos parásitos también poseen la característica particular de carecer delciclo del ácido tri-carboxílico y de citocromos. Debido a esto, en aerobiosis la reoxidación del NADHproducido por la gliceraldehído 3-fosfato dehidrogenasa se lleva a cabo dentro del glicosoma mediantela transferencia de los electrones a una glicerol 3- fosfato oxidasa mitocondrial. Esto ocurre a través deuna lanzadera redox que posee tres componentes: una glicerol 3-fosfato deshidrogenasa NADdependiente (glicosomal), un transportador de membrana involucrado en el intercambio de glicerol 3-fosfato por fosfato de di-hidroxiacetona (aún no identificado) y la glicerol 3-fosfato oxidasa mitocondrialantes mencionada (Fig.8). Las membranas glicosomal y peroxisomal son escasamente permeables a lamayoría de los metabolitos incluyendo adenina nucleótidos y NAD(H), por lo tanto, se postula que lamovilización de metabolitos a través de las mismas debería realizarse a través de transportadores.Recientemente Hettema y col [2000], informaron la presencia de transportadores homólogos a losABC involucrados en el transporte de ácidos grasos a través de la membrana de peroxisomas delevaduras y células de mamíferos. En condiciones de anaerobiosis, o cuando la glicerol 3-fosfato oxidasamitocondrial se encuentra inhibida, la reoxidación del NADH se lleva a cabo mediante la producción deglicerol (que es acompañada por la síntesis de ATP) por medio de la glicerol quinasa. En otrostripanosomátidos, incluído T. cruzi y los procíclicos de T. brucei, en aerobiosis, el NADH es reoxidado(al menos parcialmente), a través de la cadena respiratoria. Este proceso, al igual que en otros organismos,es una oxidación ligada a fosforilación en la que interviene una ATPasa Mg 2+ dependiente. En estascondiciones es posible detectar también productos fermentativos, como L-lactato, acetato, CO 2ysuccinato (este proceso fue denominado fermentación aeróbica por von Brand [1979]). El succinato,es el producto que se encuentra en mayor cantidad y en T. cruzi y procíclicos de T. brucei, se genera através de la fijación de C0 2en el C 3del fosfo enol piruvato (PEP) por medio de la fosfo enol piruvatocarboxi quinasa (PEPCK) glicosomal. Por medio de esta reacción se obtiene oxaloacetato que luegoes reducido a L-malato por medio de una isoforma glicosomal de la malato deshidrogenasa. Luego el

Introducción - 24L-malato se transforma en fumarato por medio de la fumarasa, y este último es reducido a succinatopor acción de la fumarato reductasa. El PEP es producido en el citosol y puede seguir dos vías: a) puedeentrar en el glicosoma y ser carboxilado a oxaloacetato, tal como se mencionó anteriormente, o b)puede convertirse en piruvato por acción de la piruvato quinasa citosólica. Este último compuesto esluego transaminado a L-alanina (Fig 8)H 2 OMITOCONDRIAO 2Di OHacetonafosfatoGlucosaATPHexoquinasaADPGlucosa 6-fosfatoGlucosa fosato isomerasaFructosa 6-fosfatoATPFosfo fructo quinasaADPFructosa 1,6-bis fosfatoGLICOSOMADi OHacetonaGliceraldehido 3-fosfato MalatoTriosa fosfato isomerasafosfatoNADGliceraldehido 3-PNADHMalato desh.desh.NADHNAD1,3 di-fosfo glicerato OxaloacetatoATPPEPCKADPADPglicero fosfatoGliceroquinasafosfatasaFosfo enolATPPipiruvatoglicerolMITOCONDRIANADPH PiruvatoEnz CO 2 OxaloacemálicaNADPtatoMalato desh.MalatoFumarasaFumaratoFum. red.Succ. deshSUCCINATOL-alaninaAlanina aminotransferasaCadena respiratoria.Acetil CoACitratosintasaCitrato1,3 di-fosfo gliceratoCITOSOLFosfogliceratoquinasa3-fosfo gliceratoL-malatoL-alaninaFosfogliceratomutasa2-fosfo gliceratoEnolasaNADHNH Fosfo enol3NAD piruvatoADPoxo-glutarato L-glutamato PiruvatoGlutamato deshkinasaAlanina aminoATPtransferasaPiruvatoGlutamato desh.oxo-glutarato L-glutamatoEnzima málicaCO 2NADPNADPHNH 3NADPHNADPFig.8. Esquema de compartamentalización subcelular de las enzimas involucradas en el catabolismo de laglucosa en T. cruzi y T. brucei. El 1-3 di fosfo glicerato y el gliceraldeído 3-P se muestran dentro de líneas punteadaspara indicar que la fosfoglicerato quinasa se encuentra dentro de los glicosomas en la forma sanguínea de T. brucei;y en el citosol tanto en T. cruzi como en los procíclicos de T. brucei. El rectángulo de la izquierda representa a lamitocondria de la forma sanguínea de T. brucei, mientras el de la derecha representa la mitocondria de epimastigotesde T. cruzi y procíclicos de T. brucei.

Introducción - 252) En la mayor parte de los organismos, las enzimas de la vía glicolítica están altamente reguladas;en tripanosomátidos, en cambio, la comparimentalización de la vía, sumada a la baja permeabilidad dela membrana glicosomal para la mayor parte de los intermediarios metabólicos, hace que dichas enzimasestén sujetas a poca o ninguna regulación. El ejemplo más claro de esto está dado por las enzimashexoquinasa (HK) y fosfofructo quinasa (PFK). En la mayoría de los organismos dichas enzimasestán sujetas a regulación por varios intermediarios glicolíticos y factores alostéricos, sin embargo, lasenzimas del parásito parecen ser insensibles a los mismos. Una de las consecuencias más destacadas deesta falta de regulación es la carencia del “efecto Pasteur” que puede observarse en tripanosomátidos.En la mayor parte de los organismos, la transición de anaerobiosis a aerobiosis produce una considerabledisminución en la velocidad de utilización de la glucosa. Los tripanosomátidos en cambio, son capacesde fermentar la glucosa aeróbicamente a una velocidad igual, y en algunos casos aún mayor que enanaerobiosis. [Cazzulo ; 1992].Estas características, sumadas al hecho de que varias de las enzimas de la vía glicolítica poseen diferenciasestructurales con sus homólogas de mamíferos, las convierte en buenos blancos para el desarrollo denuevas drogas. Un ejemplo de ello ha sido el desarrollo de inhibidores para la gliceraldehído 3-fosfatodeshidrogenasa de tripanosomátidos que poseen relativamente alta especificidad y selectividad para laenzima. Esto se llevó a cabo mediante la comparación del sitio activo de la enzima de mamíferos y consu homólogo de parásitos. Mas allá de este ejemplo en particular, son numerosos los inhibidores que sehan desarrollado y han demostrado ser específicos para las enzimas parasitarias y efectivos comopotenciales agentes quimioterapéuticos, ya que aparte de bloquear la glicólisis en los parásitos producenretardo en su crecimiento en cultivo sin producir ningún efecto sobre el crecimiento de las células demamíferos. Actualmente se está trabajando en la mejora de dichos compuestos como así también en labúsqueda de nuevos compuestos [Verlinde y col; 2001].*Proteasas.Debido a que las proteasas presentes en los tripanosomátidos cumplen un rol importante en la relaciónparásito-huésped, diferenciación, evasión de la respuesta inmune y nutrición del parásito, han sidoextensamente estudiadas durante los últimos diez años. La mayor actividad proteolítica encontrada entripanosomátidos correponde a cisteina proteasas; la principal de ellas, presente en todos los estadíosde T. cruzi, pero mayoritaria en epimastigotes, es la cruzipaína, una proteasa de la familia de la papaína

Introducción - 26que ha demostrado ser fuertemente antigénica. Es una enzima que se encuentra codificada por un altonúmero de genes (más de 130 en cepa Tul 2), que se encuentran dispuestos cabeza-cola. Esta enzimaposee una inusual extensión C-terminal que se encuentra ausente en el resto de los miembros de lafamilia de la papaína. Dicha extensión presenta numerosas modificaciones post-traduccionales y es laresponsable de la alta antigenicidad de esta proteasa. Se localiza en los lisosomas-reservosomas y, enmucha menor cantidad en la superficie del parásito, en un patrón que parecería ser estadío específico.De esta manera, a parte de cumplir un rol fundamental en la nutrición del parásito, participaría en laevasión de la respuesta inmune mediante la degradación de inmuno globulinas que se adhieren a lasuperficie del mismo, en la penetración de las células del mamífero, y en los procesos de diferenciaciónde tripomastigotes a amastigotes luego de la invasión, y de amastigotes a tripomastigotes antes de susalida de la célula. La enzima es inhibida por compuestos organomercuriados, E64 (trans-epoxi succinylamido (4-guanidino) butano), leupeptina, TLCK ( N-α−tosil-lisil-clorometilcetona), y derivados depeptidil fluoro metano [Cazzulo y col; 2001] [Cazzulo; 2002]. Engel y col [1998] demostraron que elcompuesto MFhFVSPh (morfolinourea-FhF-vinil sulfonico fenil) bloquea efectivamente el crecimientode epimastigotes en cultivo, a concentraciones tan bajas como 10 µM, causando la muerte celular en 72hs (estos efectos fueron paralelos con la acumulación de cruzipaína en aparato de Golgi como asítambién la inducción de diversas alteraciones morfológicas en al parásito). Posteriormente este mismogrupo analizó los efectos de este inhibidor y del N-metil-piperazina-FhF-vinil sufonico fenil (PFhFVSPh),en ratones infectados con T. cruzi. El tratamiento llevado a cabo con este último compuesto mediante laadministración de 3 dosis diarias de 0.7 mg resultó ser 100 % efectivo (todos los animales fueronrescatados de infecciones letales con el parásito). Estos resultados han sido muy promisorios ya que losanimales controles (no infectados) a los que se les administró el inhibidor no presentaron signos detoxicidad [Engel y col; 1998b]. Actualmente se están llevando a cabo estudios en perros con este mismoinhibidor [McKerrow y col; 1999].Otro tipo de proteasas detectadas en tripanosomátidos son las serina proteasas. Como miembros deesta familia pueden mencionarse: la oligopeptidasa B (que parece estar indirectamente involucrada enlos mecanismos de penetración del tripomastigote en la célula del mamífero mediante la activación defactores que producen aumentos transientes en las concentraciones de Ca 2+ intracelular) [Burleigh y col;1995], la serina carboxipeptidasa de T. cruzi y la prolil endopeptidasa Tc80 (colagenasa). La serinacarboxi peptidasa de T. cruzi es una glicoproteína de alta manossa con localización lisosomal que seencuentra codificada por cerca de 20 genes dispuestos unos detrás de otros, distribuídos en doscromosomas (por genoma haploide del parásito). La enzima nativa ha sido purificada a homogeneneidad

Introducción - 27a partir de epimastigotes de T. cruzi y la proteína recombinante ha sido expresada y purificada. Esto hapermitido llevar a cabo una caracterización completa de la enzima, sin embargo, su rol biológico aún noha sido develado [Parussini y col; 2003]. La prolil endopeptidasa Tc80 es una enzima con actividad decolagenasa ya que es capáz de degradar el colágeno humano tipo I y tipo IV, como así también lafibronectina. Esta enzima se encuentra localizada en un compartimiento vesicular cerca del bolsillo flagelar,y cumpliría un rol importante en la degradación de la matriz extracelular para permitir la entrada de losparásitos en los tejidos del huésped [Santana y col; 1997]. Recientemente se han diseñados inhibidoresselectivos para dicha enzima que han demostrado bloquear la entrada del parásito en células de mamíferos[Vendeville y col; 1999].Con respecto a las metaloproteinasas, en T. cruzi han sido identificados recientemente homólogos a laGP63 de Leishmania spp. Dentro del genoma de T. cruzi existen múltiples copias del gen que codificapara dicha enzima. Estos pudieron ser organizados en dos grupos cuya expresión mostró estar reguladade manera diferencial durante los procesos de diferenciación del parásito. También se ha determinadoque al menos uno de los genes correspondiente al grupo I de las gp63 de T. cruzi, codifica para unaproteína con actividad de metaloproteinasa que se encuentra unida a la membrana plasmática del parásitomediante un ancla de GPI [Cuevas y col; 2003].En la mayoría de las células eucariotas, el recambio de proteínas citoplasmáticas se lleva a cabo encomplejos proteicos compuestos por múltiples subunidades denominados proteasomas. Estos seencargan de degradar proteínas ubiquitiniladas, participando en la regulación de la proliferación celulary control del ciclo celular. Su rol en tripanosomátidos ha sido ampliamente estudiado; en T. cruzi lautilización de lactacystin, un inhibidor específico del proteasoma, ha mostrado ser efectivo en el bloqueode los procesos de diferenciación de tripomastigotes a amastigotes y viceversa, además de producir unadisminución en el recambio de las proteínas celulares como así también la acumulación de proteínasubiquitiniladas [Klemba y col; 2002].De esta manera, la mejora y el desarrollo de nuevos inhibidores específicos para las diferentes proteasasde tripanosomátidos son considerados un frente muy promisorio para el tratamiento de las enfermedadesparasitarias.

Introducción - 28*Mecanismos de defensa contra estrés oxidativo.La mayor parte de los protozoarios parásitos son células aeróbicas y viven en medios oxigenados. Elmetabolismo aeróbico utiliza oxígeno molecular como aceptor final en diferentes sistemas de transportede electrones, como ser aquellos presentes en la mitocondria, donde el oxigeno es reducido por cuatroelectrones a dos moléculas de agua. Sin embargo, también puede ser parcialmente reducido generándoselas denominadas especies reactivas del oxígeno (ROS) que son altamente inestables, y pueden provocardaño celular. De esta manera mediante la reducción univalente, divalente y trivalente del oxígeno molecularse generan anión superóxido (O 2-), peróxido de hidrógeno (H 2O 2) y radical hidroxilo (OH . )respectivamente. Este último es altamente tóxico, ya que es un oxidante poderoso e inespecífico quepuede atacar y dañar proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. El anión superóxido O 2-, en cambio, no esdemasiado reactivo per-se, pero es el precursor de oxidantes fuertes como ser el peróxido de hidrógenoy el peroxinitrito [Docampo; 1995]. En condiciones normales, estas especies son mantenidas enconcentraciones constantes y relativamente bajas dentro de la célula por sistemas enzimáticos ymoléculas antioxidantes de bajo peso molecular. Por lo tanto, un desbalance en este estado estacionarioconduce a daños celulares por estrés oxidativo [Turrens; 2004]. T. cruzi está expuesto a las especiesreactivas del oxígeno provenientes de su propio metabolismo y de la respuesta inmune de las célulasinfectadas. Relacionado con esto último, puede decirse que el mayor mecanismo de muerte de T. cruzien macrófagos activados involucra la producción de oxido nítrico, que tal como se mencionó anteriormentereacciona con el anión superóxido para generar peroxinitrito, una molécula que produce la muerte deeste parásito en una manera dosis dependiente. La mayoría de los organismos aeróbicos poseen dostipos de defensas antioxidantes: las enzimáticas y las no enzimáticas. Dentro de las primeras puedendistinguirse cuatro enzimas antioxidantes principales: 1) Cu-Zn superóxido dismutasa (Cu-Zn SOD),se encuentra en el citoplasma y en el espacio intermembrana mitocondrial, encargada de transformar elanión superóxido en peróxido de hidrógeno; 2) Mn-SOD, que posee la misma función que la anteriorpero se encuentra solamente en la matriz mitocondrial; 3) glutatión peroxidasa, encargada de reducirel peróxido de hidrógeno e hidroperóxidos mediante la concomitante oxidación del glutatión, en estesistema también participa la glutatión reductasa encargada de reducir el glutatión en un proceso NADPHdependiente; y por último la catalasa, encargada de catalizar la dismutación del peróxido de hidrógenoa oxígeno molecular y agua (Fig.9A) Las defensas antioxidantes no enzimáticas, están representadaspor compuestos de bajo peso molecular tales como: vitamina E, vitamina C, ácido úrico, ubiquinona,cisteína y glutatión. Los tripanosomátidos poseen algunas variaciones en dichos sistemas de

Introducción - 29detoxificación de ROS, que las convierte en posibles blancos de quimioterapia. Entre ellas puedenmencionarse: la presencia de dos isoformas (mitocondrial y citosólica) de SOD que contienen hierro,usualmente encontradas en bacterias y ausentes en células eucariotas; la ausencia de catalasa y glutatiónperoxidasa Se-dependiente, y lo más llamativo, la presencia de un sistema antioxidante tiol-dependientepara la detoxificación de peróxido de hidrógeno totalmente distinto al de otros organismos. [Turrens;2004]. En este sistema, el glutatión, molécula primordial involucrada en los procesos de óxido reducciónque conducen a la detoxificación de ROS en la mayoría de las células, es reemplazado una moléculadenominada tripanotiona (N 1 -N 8 bis-glutationilespermidina, T[SH 2]). Este compuesto es un tiol debajo peso molecular constituído por dos moléculas de glutatión unidas por una molécula de espermidina[Fairlamb y col; 1992]. La tripanotiona y el glutatión poseen distinta reactividad, de esta manera laprimera es capaz de reducir el dehidroascorbato a ácido ascórbico mientras que el segundo no; y demanera similar, posee la capacidad de reducir directamente la triparedoxina oxidada, que es unatioredoxina encontrada en tripanosomátidos que desempeña rol central en el metabolismo de peróxidos[Turrens; 2004] (Fig.9B). Debido a que la tripanotiona está ausente en células eucariotas, las enzimasinvolucradas en su metabolismo son consideradas buenos blancos para el desarrollo de nuevos agentesquimioterapéuticos. Un ejemplo de ello es la tripanotiona reductasa [Schmidt y col; 2002], la enzimaencargada de mantener a la tripanotiona en su estado reducido T[SH] 2, y hacia la cual converge unaintrincada red de vías metabólicas para la detoxificación de hidroperóxidos, y que depende de losequivalentes de reducción provenientes del NADPH generado fundamentalmente por la vía de laspentosas fosfato. Si bien esta enzima y la glutatión reductasa pertenecen a la misma familia de flavoproteínas-disulfuro oxidorreductasas, sus especificidades son mutuamente exclusivas [Steenkamp; 2002].Para tratar de establecer la relevancia in vivo de la tripanotiona reductasa, se intentaron obtener mutantesnulos para la enzima en Leishmania, sin embargo todos los intentos realizados fueron infructuosos, yaque los parásitos, mediante recombinación homóloga llevaban a cabo la duplicación de dicho gen, demanera tal que solo fue posible obtener simples mutantes. Estos parásitos no presentaron alteracionesen su crecimiento ni en su capacidad de diferenciarse a amastigotes, sin embargo mostraron unadisminución dramática en su sobrevida dentro de líneas macrofágicas humanas [Dumas y col; 1997]. Talcomo se mencionó anteriormente, en tripanosomátidos la glutatión peroxidasa Se-dependiente estáausente, en su lugar se ha encontrado una enzima con actividad de peroxidasa dependiente de tripanotionaa la que se denominó Triparedoxina peroxidasa (TPx), de la cual existen dos isoformas, una conlocalización citosólica y la otra con localización mitocondrial. Adicionalmente a esto, se han detectadoen T. cruzi peroxidasas dependientes de glutatión denominadas TcGPXI y TcGPXII, con localización

Introducción - 30citosólica y glicosomal la primera [Wilkinson y col; 2002], y en retículo endoplásmico la segunda[Wilkinson, Taylor y col; 2002]. Estas enzimas son similares a las fosfolípido glutatión peroxidasas demamíferos y plantas. Poseen la capacidad de metabolizar hidroperóxidos de fosfolípidos y ácidos grasospero no peróxido de hidrógeno. Su rol fundamental sería el de protección de membranas al daño porestrés oxidativo. Estas moléculas se mantienen en estado reducido mediante la transferencia de electronespor parte del glutatión, y no actúan con tripanotiona [Wilkinson y col; 2000] (Fig.9B). Por último, otrotipo de tioles encontrados en tripanosomátidos pero no en células de mamíferos son los ovotioles.Estos compuestos son mercaptohistidinas, inicialmente detectadas en huevos y ovarios de invertebradosmarinos. Constituyen una familia de tres miembros, ovotiol A, B y C que difieren entre si en el númeroA2 O 2- +2 H+1H 2 O 2 + O 22 32GSHH 2 O + 1/2 O 2NADP + 4 GSSG 2 H 2 ONADPH +H +Via de las pentosas fosfatoB2 O 2- +2 H+1H 2 O 2 + O 22 3ascorbato Tpx(red)dehydroascorbato2 H 2 OTpx (ox) 2 H 2 OROOH4GSSG*GSHROHtripanotiona (red) T[SH] 2 tripanotiona (ox) TS 2NADP +tripanotiona reductasaNADPH +H +Via de las pentosas fosfatoFig.9. Esquema propuesto para el metabolismo antioxidante en mamíferos (A) y kinetoplástidos (B).A) reacciones enzimáticas antioxidantes presentes en células de mamíferos: 1) Cu,Zn Superóxido dismutasa y Mn-Superóxido dismutasa; 2) catalasa; 3) Glutatión peroxidasa; 4) Glutatión reductasa, GSH: glutatión reducido,GSSG: glutatión oxidado.B) metabolismo antioxidante presente en kinetoplástidos: 1) Fe-superóxido dismutasa; 2) Ascorbato peroxidasa; 3)Triparedoxina peroxidasa, Tpx (red): triparedoxina reducida, Tpx (ox): triparedoxina oxidada; 4) Glutatión peroxidasaI y Glutatión peroxidasa II, ROOH: hidroperóxidos, ROH: alcohol del hidroperóxido, GSH: glutatión reducido, GSSG:glutatión oxidado, *: interacción no enzimática entre el GSSG y la tripanotiona reducida T[SH] 2 .

Introducción - 31de sustituyentes presentes en el grupo α amino. Actúan como detoxificantes no enzimáticos de peróxidode hidrógeno y radicales libres. En tripanosomátidos se ha detectado la presencia de ovotiol A (N 1 -metil-4-mercaptohistidina) en todos los estadíos del ciclo de vida del parásito, excepto en las formassanguíneas de T. brucei y en los amastigotes de Leishmania [Ariyanayagam y col; 2001]. Debido a queno se ha detectado actividad de ovotiol reductasa en tripanosomátidos, y a que el ovotiol oxidado no essustrato de la tripanotiona reductasa, se ha propuesto que dicho compuesto es reducido noenzimáticamente por la tripanotiona produciéndose por lo tanto consumo de NADPH [Schmidt y col;2002].*Metabolismo de poliaminas.El metabolismo de poliaminas está directamente relacionado con la síntesis de tripanotiona, ya que éstase genera a partir de glutatión y espermidina. En T. brucei , las poliaminas son sintetizadas de novo pormedio de la ornitina decarboxilasa (ODC), esta enzima constituye un blanco importante para el desarrollode drogas para el tratamiento de la enfermedad transmitida por este parásito. La esencialidad de laODC en T. brucei se ha determinado mediante la obtención de parásitos dobles knock-out para estegen, que mostraron ser incapaces de crecer en ausencia de putrescina. También se ha desarrollado uninhibidor para esta enzima denominado α−difluorometilornitina (DFMO) que ha demostrado ser efectivopara curar la infección por T. brucei en ratones y humanos [Schmidt y col; 2002]. T. cruzi, en cambio,carece de ODC y se provee de poliaminas mediante su captación del medio; de manera tal que lostransportadores de dichas moléculas representan un potencial blanco para el desarrollo dequimioterapéuticos en este parásito [Le-Quesne y col; 1996].*Metabolismo de esteroles y lípidos. Señalización y diferenciación celular.Debido a que los lípidos poseen un rol central en la estructura de membranas celulares y en la señalizacióncelular y a que las vías de biosíntesis de esteroles en tripanosomátidos difieren de las de mamíferos y seasemejan a las de hongos, inhibidores desarrollados para algunas de las enzimas fúngicas están siendoprobados en tripanosomátidos [Urbina; 1997].

Introducción - 32*Vía de las pentosas fosfato.Glucosa 6- fosfatoGlucosa 6-fosfato deshidrogenasaRamaoxidativa6-fosfoglucono lactona6-fosfoglucono lactonasa6-fosfogluconato6-fosfogluconato deshidrogenasaRibulosa 5-fosfato 3-epimerasaXilulosa 5-fosfatoRibulosa 5-fosfatoRibulosa 5-fosfato 3-isomerasaRibosa 5-fosfatoTranscetolasaSedoheptulosa 5-fosfatoGliceraldehído 3-fosfatoRama nooxidativaTransaldolasaEritrosa 4-fosfatoFructosa 6-fosfatoTranscetolasaGliceraldehído3-fosfatoFructosa 6-fosfatoFig.10. Esquema de la vía de las pentosas fosfatos.

Introducción - 33La vía de las pentosas fosfato, llamada también vía de las hexosas monofosfato, o vía oxidativa delfosfogluconato, es una vía de catabolismo de glucosa en la que pueden distinguirse dos ramas, unaoxidativa y una no oxidativa. A través de la misma se generan cuatro metabolitos principales: 1) NADPH,para ser utilizado en biosíntesis reductivas y protección contra el estrés oxidativo, 2) ribosa 5-fosfatopara ser utilizada en la síntesis de ácidos nucleicos, 3) eritrosa 4-fosfato, utilizado como precursor deaminoácidos aromáticos y vitaminas y 4) sedoheptulosa 7-fosfato, utilizado como componente de lapared celular de algunas bacterias. (Fig. 10). La rama oxidativa de esta vía comienza con ladeshidrogenación de la glucosa 6-fosfato (G6P) en el C 1, para dar 6-fosfoglucono- γlactona (γ6PGL)mediante una reacción esencialmente irreversible catalizada por la glucosa 6-fosfato dehshidrogenasa(G6PDH). En esta reacción el aceptor de electrones es el NADP+, de manera tal que por cada mol deG6P oxidado se genera un mol de NADPH. La velocidad de esta reacción es considerada el pasolimitante de la vía en general. El factor regulatorio más importante en este punto es la relación entre lasconcentraciones de NADP + y NADPH de la célula, ya que la coenzima reducida inhibe a la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). La γ6PGL generada se hidroliza para dar 6-fosfogluconato (6PG).Esta reacción puede ocurrir espontáneamente, pero también existe una 6-fosfoglucono lactonasa(6PGL) específica que cataliza esta reacción produciendo la apertura del anillo de la lactona sólocuando ésta se encuentra en configuración γ. A su vez, la γ6PGL puede transformarse en δ6PGL medianterearreglos intramoleculares, esta última es considerada un compuesto sin salida (dead end), ya que esincapaz de hidrolizarse espontáneamente y no es sustrato de la 6PGL. De esta manera se considera queel rol fundamental de la 6PGL es acelerar la hidrólisis de la γ lactona para evitar su interconversión a laforma δ, metabólicamente inerte? (Miclet y col; 2001). La última reacción de la rama oxidativa de la víade las pentosas, involucra la oxidación y decarboxilación del 6PG para generar ribulosa 5-fosfato (RU-5P) en una reacción irreversible catalizada por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH), dondeG6PDH 6PGL 6PGDHFig.11. Reacciones correspondientes a la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato

Introducción - 34el aceptor final de electrones es también el NADP + . La RU-5P así generada es posteriormentemetabolizada en la rama no oxidativa de la vía. De esta manera, por cada mol de G6P que ingresa enla rama oxidativa, se genera un mol de CO 2y dos moles de NADPH, ver Fig.11.La rama no oxidativa o de interconversión de azúcares, involucra una serie de reacciones reversibles.Puede funcionar completa o no dependiendo del estado metabólico particular de la célula. Aquí se llevaa cabo el paso final de la síntesis de ribosa 5-fosfato (R-5P) que involucra la isomerización de la (RU-5P) mencionada anteriormente, por medio de la ribulosa 5-fosfato isomerasa (RU-5PI) en una reacciónque procede a través de un enediol intermediario. Si la célula se encuentra en un estado metabólico talque necesita NADPH pero no R-5P, esta última será convertida en gliceraldehido 3-fosfato (G-3P) yfructosa 6-fosfato (F-6P), mediante una serie de reacciones enzimáticas acopladas en las que intervienenla transaldolasa (TAL) y la transcetolasa (TKT). De esta manera se establece un vínculo reversibleentre la glicólisis y la vía de las pentosas fosfato. El primer paso de esta serie de reacciones involucra laepimerización de la RU-5P a xilulosa-5P (Xi-5P) por medio de la ribulosa 5-fosfato epimerasa (RU-5PE). Luego, la Xi-5P le transfiere dos unidades carbonadas a la R-5P en una reacción catalizada porla TKT generándose así sedoheptulosa-7P (S-7P) y G-3P. Posteriormente ambos compuestos reaccionanentre si por acción de la transaldolasa que cataliza la transferencia de tres unidades carbonadas delprimero al segundo, generándose de esta manera eritrosa 4-P (E-4P) y F-6P. Por último, en una tercerreacción la transcetolasa cataliza la transferencia de dos unidades carbonadas de la X-5P a la E-4P paradar G-3P y F-6P que pueden ingresar en la vía glicolítica (Fig.10). De esta manera, el exceso de ribosa5-P formado a través de la rama no oxidativa de la vía de las pentosas puede ser completamenteconvertido en intermediarios glicolíticos, ya que a través de las reacciones antes mencionadas es posiblegenerar 2 moles de fructosa 6 fosfato y un mol de gliceraldehido 3-fosfato, a partir de 3 moles deribosa-5P. Si la célula necesita mucho más NADPH que R-5P, es el caso de aquellas células que llevana cabo una síntesis activa de lípidos, la fructosa-6P (generada tal como se mencionó anteriormente) seráisomerizada a glucosa-6P, por medio de la fosfoglucosa isomerasa, y entrará nuevamente en la ramaoxidativa de la vía. Si en cambio, la célula se encuentra en activa división, necesitará más ribosa-5P queNADPH. En este caso, la rama no oxidativa de la vía de las pentosas funcionará en forma reversa, lamayor parte de la glucosa 6-fosfato entrará en la vía glicolítica, generándose F-6P y G-3P, y éstos seránmetabolizados a R-5P, por acción de la transaldolasa y transcetolasa mediante la reversión de lasreacciones descriptas anteriormente. Por último, si las necesidades de NADPH y R-5P en célula estánbalanceadas, funcionará la rama oxidativa de la vía para cubrir las necesidades de NADPH, y la RU-5Pgenerada sera isomerizada a R-5P para su posterior utilización [Stryer; 1999].

Introducción - 35La vía de las pentosas fosfato se encuentra presente en la mayoría de los protozoarios parásitos y estáintimamente relacionada con la defensa contra el estrés oxidativo y detoxificación de xenobióticos. Sibien experimentos genéticos llevados a cabo en otras células eucariotas mostraron que la vía esdispensable, permitieron determinar su relevancia en la protección contra el estrés oxidativo [Barrett;1997]. Durante los últimos diez años, la vía de las pentosas fosfato ha sido objeto de numerosos estudiosen tripanosomátidos. Todas las enzimas de ambas ramas de la vía han sido detectadas en tripomastigotesprocíclicos de T. brucei [Cronin y col; 1989]. y en promastigotes de Leishmania mexicana, dondetambién se ha determinado su funcionalidad in vivo [Maugeri y col; 2003]. En T. cruzi, los primerosestudios realizados mostraron que las dos deshidrogenasas de la rama oxidativa se encontraban presentes[Raw; 1959]; sin embargo, se dudaba de la existencia de una vía completamente funcional. Recientemente,[Maugeri y col; 2004] demostraron la presencia de todas las enzimas de ambas ramas de la vía en loscuatro estadíos del ciclo de vida de T. cruzi, y mediante estudios de liberación de 14 CO 2realizados conglucosa marcada en C-1 o C-6, pudo demostrase su funcionalidad in vivo, como así también la activaciónde la misma en presencia de azul de metileno, un compuesto que mimetiza condiciones de estrés medianteel consumo de NADPH. Inicialmente se consideraba a la vía de las pentosas fosfato como esencialmentecitosólica; sin embargo, posteriores estudios demostraron su presencia en cloroplastos [Schnarrenberguery col; 1995] y peroxisomas [Corpas y col; 1998] de plantas superiores como así también la presenciade las dos deshidrogenasas de la vía en peroxisomas de intestino de rata [Antonekov; 1989] y enretículo endoplásmico y Golgi de células de intestino de conejo [Ninfali y col; 2001]. Por medio delanálisis de patrones de extracción proteica con digitonina, y experimentos de fraccionamiento subcelular(llevados a cabo por centrifugación diferencial en gradientes de sacarosa), en epimastigotes de T.cruzi, fue posible determinar la localización subcelular de las enzimas de la vía en este parásito. Estosexperimentos indicaron que la mayor parte de dichas enzimas posee un componente esencialmentecitosólico, pero mostraron también la existencia de un pequeño componente particulado correspondientea la fracción de gránulos chicos y en algunos casos también a la fracción microsomal. Estas localizacionessugieren la presencia de una pequeña fracción de las enzimas en glicosomas, y el sistema retículoendoplásmico-Golgi respectivamente. La Ribulosa 5-fosfato epimerasa, sin embargo constituye unaexcepción a lo antes expuesto debido a que en experimentos de digitonina se libera casi completamentea concentraciones extremadamente bajas del detergente antes que el marcador citosólico utilizado(piruvato quinasa); sugiriendo su localización en un compartimento altamente accesible [Maugeri y col;2004]. Adicionalmente, estudios de localización subcelular llevados a cabo en T. brucei mostraron quela glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, al igual que la 6-fosfoglucono lactonasa, poseen una localización

Introducción - 36dual en glicosoma y citosol [Heise y col; 1999] [Duffieux y col; 2000]. Una distribución similar seespera para otros miembros de la vía (Ru-5PE, R-5PI y TKT) de T. brucei y Leishmania, ya que hansido identificadas en bases de datos varias secuencias correspondientes a dichas enzimas que exhibenseñales de tipo PTS 1[Hannaert y col; 2003]. Tal como se mencionó anteriormente, las primeras sieteenzimas de la vía glicolítica se encuentran dentro del glicosoma, por lo que se han propuesto variasrazones para explicar la presencia de la vía de las pentosas fosfato, o al menos parte de ella dentro deesta organela [Hannaert y col; 2003]. Una de ellas habla de la necesidad de intercambio de intermediariosentre ambas vías para ajustar las necesidades de ATP, NADPH y precursores de nucleótidos. Otra,habla de la necesidad de la vía dentro del glicosoma debido a que la síntesis de purinas y pirimidinas, queutiliza como sustrato el 5-ribosil-1-pirofosfato generado a partir de R-5P se encuentra dentro de estaorganela. Por último debido a que algunas enzimas involucradas en la detoxificación de ROS (queforman parte del sistema tripanotiona-tripanotiona reductasa) han sido detectadas tanto en citosol comoen glicosomas [Dey y col; 1994] [Wilkinson y col; 2002], y a que también existen evidencias de lapresencia de ésta última en dicha organela; se hace necesaria la presencia de al menos la rama oxidativade la vía de las pentosas dentro de la misma para poder cubrir las necesidades de NADPH de la TR[Hannaert y col; 2003]. Debido al rol fundamental que posee la vía de las pentosas fosfato en la defensacontra el estrés oxidativo se la considera un potencial blanco para el desarrollo de agentesquimioterapéuticos; esto es más promisorio aún teniendo en cuenta que en los tripanosomas muchas delas enzimas que forman parte de esta vía están más relacionadas con isoformas procedentes decianobacterias que con sus homólogos de eucariotas. Estas observaciones han llevado a Hannaert y col;2003, a proponer que los ancestros de los tripanosomátidos albergaron un endosimbionte que se perdióen algún momento de su evolución después de transferir genes al genoma nuclear. De esta manera,algunas de las enzimas de tripanosomátidos pertenecientes a esta vía poseen características bioquímicasdiferentes a las de mamíferos, haciendo más promisorio el desarrollo de inhibidores específicos para lasenzimas del parásito. Un ejemplo de ello es la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de Trypanososmabrucei, una enzima esencial para los tripanosomas y cuyas diferencias estructurales y bioquímicas conlas de mamíferos han sido explotadas para el desarrollo de inhibidores específicos [Barrett y col; 2002].

Introducción - 37Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa.Tal como se mencionó anteriormente, la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), es la primeraenzima de la rama oxidativa de la vía de las pentosas y cataliza la oxidación del 6-fosfogluconato a 6-fosfoglucono- γ lactona con la concomitante producción de NADPH [Fig. ]. En humanos la G6PDH esuna enzima ´´housekeeping´´ y se encuentra codificada por un gen ligado al cromosoma X, ubicado enuna región del mismo que posee alta variabilidad genética. De acuerdo con esto, existen mas de 100mutaciones o mutaciones combinadas que conducen a la presencia de casi 200 variantes de este gen.La mayor parte de esas alteraciones producen la pérdida parcial de la actividad de la enzima, fenómenoque se encuentra relacionado con la aparición de una amplia variedad de anemias hemolíticas [Beutler ycol; 1996]. Más de 400 millones de personas en el mundo son G6PDH-deficientes, convirtiéndose enla enzimopatía más común en humanos. Gracias al modelado molecular de la G6PDH humana en basea la estructura de su homóloga de Leuconostoc mesenteroides, ha sido posible ubicar espacialmentelas mutaciones antes mencionadas, y se ha llegado a la conclusión de que aquellas que se encuentranubicadas en la interfase del dímero conducen a una disminución en la termoestabilidad de la enzima.Algunas variantes genéticas poseen alta incidencia en determinadas partes del mundo, de esta manera seha detectado la presencia de dos mutaciones puntuales V68M y N126D, en la G6PDH de poblacionesafricanas que conducen a la pérdida de más del 90% de la actividad enzimática por desestabilización dela proteína [Gallego y col; 2000]. Debido a que en los glóbulos rojos la única fuente de NADPHproviene de la vía de las pentosas fosfato, una deficiencia en alguna de las enzimas de la vía, como es elcaso de la G6PDH, conducirá a hemólisis bajo condiciones de estrés oxidativo como ser la ingesta dedeterminados alimentos (por ejemplo habas) o incluso medicamentos. Debido a que, tal como se discutióanteriormente, la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato posee una estrecha relación con losmecanismos de detoxificación de ROS, en distintos organismos se ha propuesto que la G6PDH formaparte de un mecanismo inducible de respuesta celular al estrés oxidativo. De esta manera [Ursini y col;1997] [Salvemini y col; 1999] al igual que [Filosa y col; 2003] mediante trabajos llevados a cabo condistintos tipos celulares, han demostrado que en respuesta al aumento en las concentraciones intracelularesde agentes oxidantes como el anión superóxido (O 2.), o a disminución en los niveles intracelularesnormales de glutatión reducido (GSH), se produce un incremento en la expresión de la G6PDH,tendiente a aumentar la producción de NADPH que posteriormente será utilizado para restablecer las

Introducción - 38condiciones normales de la célula. Originariamente la G6PDH era considerada una enzima citosólica[Luzzato y col; 1984], pero en la última década su estudio en distintos organismos ha demostrado supresencia en diferentes compartimientos celulares. [Corpas y col; 1998] detectaron actividad de G6PDHen peroxisomas de plantas superiores, mientras que [Wendt y col; 2000] demostraron la presencia dedos isoformas de la enzima, con distintas propiedades cinéticas, en cloroplastos. Más recientemente[Ninfali y col; 2001] han detectado la presencia de la enzima en retículo endoplásmico liso y rugosocomo así también en aparato de Golgi de células de intestino de conejo. La G6PDH ha sido tambiénestudiada en parásitos: en promastigotes de Leishmania trópica se han detectado dos isoformas de laenzima con propiedades cinéticas idénticas, mientras que en Plasmodium sp, la G6PDH existe comouna enzima bi-funcional, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa-6 fosfoglucono lactonasa que cataliza losdos primeros pasos de la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato [Clarke y col, 2003]. En T.brucei, la actividad de la G6PDH ha sido detectada tanto en citosol como en glicosomas, pero no sehan encontrado evidencias de la presencia de isoenzimas [Heise y col; 1999]. Dufrieux y col [2000]avalaron esta observación mediante la detección de un único gen para la G6PDH de T. brucei, pero apesar de la propuesta localización glicosomal para la enzima, no se detectó ningún tipo de señal PTS 1oPTS 2de reclutamiento a dicha organela. En T. cruzi, la información acerca de la G6PDH es muy escasa;en 1977 Funayama y col; purificaron parcialmente la G6PDH de la cepa Y de T. cruzi, y determinaronalgunas de sus propiedades cinéticas. Unos años después, Lupiañez y col [1987] informaron la presenciade dos diferentes isoenzimas de G6PDH de T. cruzi, una de ellas presente en epimastigotes, con altaafinidad por su sustrato y otra, presente en tripomastigotes metacíclicos, con menor afinidad por elmismo. Recientemente, Maugeri y Cazzulo [2004] mediante experimentos de fraccionamiento subcelularllevados a cabo con epimastigotes de T. cruzi demostraron que un 65% de la enzima posee una localizacióncitosólica, mientras que el 35 % restante se distribuye entre la fracción microsomal (retículo endoplásmicoy Golgi), y en menor proporción en la fracción denominada de gránulos chicos (donde sedimentanmayoritariamente los glicosomas).

Introducción - 396-fosfogluconato deshidrogenasa.Tal como se mencionó anteriormente esta enzima es la tercera de la rama oxidativa da la vía de laspentosas fosfato y cataliza la oxidación y decarboxilación del 6-fosfogluconato a ribulosa- 5P y CO 2con la concomitante producción de NADPH. Estudios llevados a cabo con la 6PGDH de hígado deoveja han permitido determinar que el mecanismo general de reacción para la enzima se lleva a cabo enmúltiples pasos. Basándose en la dependencia del pH de los parámetros cinéticos, se ha propuesto unmecanismo general ácido-base para la reacción que involucra una transferencia de hidruros previa a ladecarboxilación (Fig.12). En dicho mecanismo, una base general acepta un protón del 3-OH del 6PGconcomitantemente con la transferencia del ion hidruro del C 3del 6PG al C 4del NADP, generándoseasí un 3-ceto derivado. Este es posteriormente decarboxilado para dar un 1-2 enediol intermediarioOAcido generalOCOO -HOC Glu 190OCOHOC Glu 190NH 2N +Lys 183 N :HHHOCCOHHOLys 183HN-HHOCCOHONH 2NBase generalHHHCCOHOHNADPHHHCCOHOHNADPHH 2 C O PO 32-H 2 C O PO 32-6-fosfogluconato3-ceto derivadoCO 2OOLys 183HNHHC Glu 190O -H C OHO CH C OHH C OHONH 2NH 2 C O PO 2- 3 NADPHRibulosa 5-fosfatoTautomerizaciónceto-enólicaLys 183 N:HHC Glu 190HOH C OHNHHO C2OH C OHNH C OHH 2 C O PO 2- 3NADPH3-ceto derivadoFig.12. Esquema del mecanismo de reacción propuesto para la 6PGDH.

Introducción - 40que, mediante una tautomerización ceto-enólica genera Ru-5P. A lo largo de la reacción, el protón essucesivamente intercambiado entre la base y el oxígeno del azúcar siendo finalmente aceptado por laprimera cuando la Ru-5P ha sido formada. En este mecanismo el ácido general intervendría solamenteen la reacción de tautomerización cediendo un protón al enediol intermediario [Hanau y col 1992][Berdis y col ; 1993]. Se ha propuesto que el Glu 190, conservado en todas las 6PGDH funciona comoel ácido general [Karsten y col; 1998], mientras que la base general propuesta es la Lys 183, quetambién se encuentra completamente conservada en los distintos organismos para los cuales existensecuencias diponibles correspondientes a la enzima [Zhang y col; 1999]. La 6PGDH es considerada entripanosomátidos un potencial blanco para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos debido a que seha demostrado en otros organismos que la deleción del gen que codifica para dicha enzima es letal. Laesencialidad del gen de la 6PGDH para el crecimiento de la forma sanguínea de T. brucei, ha sidodemostrada mediante la técnica de ARNi (ARN de interferencia) [Barrett y col; 2002]. Este efectoestaría causado por el bloqueo de la vía de las pentosas fosfato como así también de la vía glicolítica, yaen ausencia de 6PGDH se produce la acumulación de 6PG que ha mostrado ser un potente inhibidor dela glucosa fosfato isomerasa. [Barrett; 1997]. De acuerdo con lo expuesto, esta enzima ha sidoampliamente estudiada en T. brucei con la finalidad de encontrar diferencias cinéticas y estructuralescon respecto a su homólogo de mamíferos que permitan el desarrollo de inhibidores específicos. Deesta manera el gen de la 6PGDH de este parásito ha sido identificado y clonado [Barrett y col; 1993],se ha expresado la proteína recombinante en un sistema heterólogo y se han determinado los parámetroscinéticos de la misma [Hanau y col; 1996]. También se ha llevado a cabo la cristalización de la proteínarecombinante [Phillips y col; 1998], lo que ha permitido desarrollar inhibidores específicos para laenzima muchos de los cuales, debido a su elevada afinidad y especificidad han mostrado ser muypromisorios como potenciales agentes quimiotepaéuticos [ Dardonville y col; 2003] [Dardonville y col;2004].

Objetivos.

Objetivos - 41Objetivos.Dentro del marco de la explotación de distintas vías metabólicas para el desarrollo de nuevos agentesquimioterapéuticos para el tratamiento de la enfermedad de Chagas, y debido a que la rama oxidativade la vía de las pentosas fosfato es considerada un posible blanco para el desarrollo de nuevas drogas(a causa de su potencial rol en la defensa del parásito contra el estrés oxidativo); el principal objetivo deeste trabajo de Tesis fue la realización de un estudio detallado de ambas deshidrogenasas de la vía de laspentosas fosfato de T. cruzi a los fines de determinar su relevancia en los mecanismos de defensa frenteal estrés oxidativo, como así también la detección de características diferenciales con respecto a sushomólogos de mamíferos que pudiesen ser potencialmente explotables en el desarrollo de nuevas drogas.De acuerdo con esto, en la primer parte de este trabajo de Tesis se presenta el análisis de la organizacióngenómica de la glucosa-6 fosfato deshidrogenasa de T. cruzi, como así también el clonado, expresión ycaracterización de dos de los genes que codifican para dicha enzima. A su vez se presenta un análisis dela localización subcelular de la misma a largo de los distintos estadíos del ciclo de vida del parásitocomo así también un estudio de la relevancia de la enzima en los mecanismos de defensa del parásitofrente a condiciones de estrés oxidativo.Teniendo en cuenta que, tal como se mencionó anteriormente, la 6-fosfogluconato deshidrogenasa esuna enzima considerada como posible blanco para el desarrollo de agentes quimioterapéuticos para eltratamiento de las distintas tripanosomiasis; y que aquella perteneciente a T.brucei ha sido ampliamenteestudiada habiéndose desarrollado inhibidores específicos para esta enzima que día a día están siendomejorados; establecimos como objetivo de la segunda parte de este trabajo de Tesis, el clonado, expresión,caracterización y localización subcelular de la 6PGDH de T. cruzi. A partir de estos estudios y mediantela comparación de los parámetros cinéticos de ambas deshidrogenasas, como así también mediante laprueba de algunos de los inhibidores desarrollados para la 6PGDH de T. brucei, nos propusimosanalizar también la factibilidad de la extrapolación de dichos inhibidores a la 6PGDH de T. cruzi.

Glucosa 6 -fosfato deshidrogenasa (G6PDH)

Resultados G6PDH - 42Identificación y clonado de la G6PDH de Trypanosoma cruzi.Al comienzo de este trabajo de Tesis en las distintas bases de datos no existían secuencias disponiblescorrespondientes al gen de la G6PDH de Tripanosoma cruzi. Así, para obtener el marco abierto delectura (ORF) para dicha enzima, se realizó el alineamiento de la secuencia aminoacídica correspondientea distintas G6PDHs con el objetivo de identificar regiones conservadas entre las mismas que pudiesenser utilizadas en el diseño de oligonucleótidos para llevar a cabo la amplificación del gen de la G6PDHde T. cruzi por PCR. De esta manera, se alinearon las secuencias aminoacídicas correspondientes a laG6PDH humana (NP_000393), la G6PDH de T. brucei (CAC07816), la G6PDH de ratón, Musmusculus (NP_032088), la G6PDH de E. coli (BAB35985), la G6PDH de Leishmania mexicana(AA037825) y la G6PDH de levadura, Saccharomyces cerevisiae (NP_014158). A partir de dichoalineamiento se identificaron dos secuencias estrictamente conservadas: la de unión a cofactor GASGDLA,y aquella denominada la firma de las G6PDHs RIDHYLGKE. En base a dichas secuencias se diseñarondos oligonucleótidos degenerados, con residuos de inosina en la tercer base de alguno de sus codonesPr-s: 5’-GGIGCGTCIGGIGACTTGGC-3’, y Pr-as: 5’-TCCTTICCIAGGTAGTGGTC-3’ quepermitieron amplificar una secuencia de 519 pb correspondiente a la región central del gen de la G6PDHde T. cruzi que fue clonada en pGEM ® −T Easy (Promega) y completamente secuenciada (Fig1 A). Apartir de la misma se diseñaron tres oligonucleótidos anti sentido denominados Pr-1: 5’-TGCGGAATACCTGGCGTTCA-3’, Pr-2: 5’-AAGAGCTGCTCGGAGGTCTC-3’, Pr-3:CATCGCCCCTTTGCTGAGAC-3’, para obtener el extremo 5’ del gen mediante transcripción reversay 5’-RACE (amplificación rápida de extremos 5’ de ADNc). De esta manera, el Pr-1 fue utilizado parala síntesis de ADNc, de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y Métodos, para posteriormenteemplearlo como molde en la siguiente reacción de PCR. En dicha reacción, como oligonucleótido sentidose utilizó el denominado Pr-SL: 5’-AACGCTATTATTGATACAGTTT-3’, correspondiente a parte dela secuencia del mini exón o splice leader presente en todos los ARN mde Trypanosoma cruzi, ycomo anti sentido el Pr-1. Luego, mediante sucesivas reacciones anidadas de PCR utlizando siempre elPr-SL como sentido, y los Pr-2 y Pr-3 como anti sentido, fue posible obtener el extremo 5’-del gen dela G6PDH de T. cruzi. Luego de la tercera reacción de PCR se obtuvieron dos productos de amplificaciónde 902 pb y 662 pb respectivamente que fueron clonados en pGEMT- Easy y completamentesecuenciados resultando ser ambos parte del gen de la G6PDH (Fig.1 B). Ambas secuencias presentabandos posibles codones de iniciación separados uno de otro por 111 pb, y la diferencia entre ambasradicaba en la longitud de la región no codificante del 5’ (5’-UTR), presente entre el extremo 3’ del mini

Resultados G6PDH - 43exón y el primer ATG. De esta manera, para el producto de amplificación de 902 pb el 5’-UTR poseíauna longitud de 270 pb (Fig.1 B1), mientras que para el fragmento de 662 pb, su longitud era de tan sólo30 pb (Fig.1 B2). De acuerdo con esto se propuso la existencia de dos posibles codones de iniciaciónpara la traducción del gen de la G6PDH de T. cruzi. Algo similar fue reportado para la G6PDH de T.brucei [Duffrieux y col; 2000] donde se detectó también la presencia de dos posibles codones deiniciación de la traducción separados uno de otro por 111 pb. En este caso, sin embargo, los experimentosde 5’-RACE llevados a cabo mostraron un único producto de amplificación que poseía un 5’-UTR detan sólo 86 pb entre el extremo 3’ del mini exón y el primer ATG. Dicha región no codificante del 5’ fueconsiderada como inusualmente corta para ser funcional, de manera que la G6PDH recombinante de T.brucei fue expresada únicamente a partir del segundo codón de iniciación. En el caso de T. cruzi,tanto el primer como el segundo ATG podrían ser funcionales ya que, siguiendo el mismo criterio aplicadopara la enzima de T. brucei, el 5’-UTR de 30 pb, mencionado con anterioridad, podría ser consideradocomo demasiado corto para ser funcional, dejando en este caso, al segundo codón de iniciación comoAGASGDLAKRIDHYLGKEsecuencia de proteínas de G6PDHsGGIGCGTCIGGIGACTTGGCTCCTTICCIAGGTAGTGGTC519 bpB111 bpPr-1Pr-2Pr-31ME270 bp 5’-UTR ATG ATGT. cruzi G6PDH ORFTAA230 bpATG5’-UTRMET. cruzi G6PDH ORFTAAPr SL ATGTc GH56Tc GRQ77Fig.1. Diagrama correspondiente a los distintos pasos realizados para la obtención del gen de la G6PDH de T.cruzi. A) Esquema correspondiente a las secuencias estrictamente conservadas (entre las distintas G6PDHs) utilizadaspara el diseño de los oligonucleótidos degenerados que permitieron la amplificación por PCR de un fragmento de 519pb correspondiente a la región central del gen de la G6PDH de T. cruzi. B) Esquema correspondiente al 5´RACEllevado a cabo para obtener el extremo 5´del gen de la G6PDH de T. cruzi. En dicho ensayo como oligonucleótidosentido se utilizó parte de la secuencia correspondiente al splice leader de T. cruzi, y como anti sentido losoligonucleòtidos nombrados como Pr-1, Pr-2 y Pr-3 en el panel A. Las dos secuencias amplificadas: 1- de 902 pb delongitud (conteniendo un 5´UTR de 270 pb desde el 3´del splice leader hasta el primer ATG) y 2- de 602 pb delongitud (que presenta un 5´UTR de tan sólo 30 pb) se encuentran señaladas. En ambos casos, los dos codones deiniciación de la traducción (separados por 111pb) se encuentran destacados. La ubicación de los dos GSS utlizadospara completar la secuencia correspondiente al 3´del ORF de la G6PDH de T. cruzi, se muestra con líneas punteadas.

Resultados G6PDH - 44el más probable. Sin embargo, el 5’-UTR de 270 pb de longitud, presente en el producto de amplificaciónde 902 pb, ofrece la posibilidad del comienzo de la traducción a partir de cualquiera de los dos ATG.El extremo 3’ del gen de la G6PDH de T. cruzi se obtuvo finalmente mediante la superposición de dosGSS (TcGH56 y TcGRQ77) pertenecientes a la base de datos de TIGR (The Institute for GenomicReseach) obtenidos posteriormente a partir de una búsqueda realizada en el proyecto genoma de T.cruzi. Dicha búsqueda se llevó a cabo utilizando el programa TblAstN [Altschul y col; 1997], y lasecuencia aminoacídica de la G6PDH de T. brucei (CAC07816) como molde. Finalmente, el ORFcorrespondiente a la G6PDH de T. cruzi se obtuvo mediante la superposición de la secuencia interna de519 pb mencionada anteriormente, las secuencias obtenidas por 5’ RACE, y los dos GSS antesmencionados. A partir de dicha superposición se concluyó que el gen de la G6PDH de T. cruzi podíaposeer una longitud de 1668 pb (a partir del primer codón de iniciación); este gen fue denominadoG6PDH larga; o 1557 pb (a partir del segundo ATG) al cual denominamos G6PDG corta.El ORF correspondiente a la G6PDH cortase amplificó por PCR a partir de ADN genómico utilizandodos oligonucleótidos diseñados en base a la secuencia ensamblada mencionada anteriormente a cadauno de los cuales se le agregó un sitio de corte para enzimas de restricción (para llevar a cabo el clonadodireccional de la enzima en el vector de expresión pET28a (+)). El oligonucleótido sentido, al cual se leagregó el sitio NheI (subrayado), fue diseñado para hibridizar la región flanqueante del segundo codónde iniciación G6PDH cfw: 5’-TCCAAGTGCTAGCATGGAGAACGCCAAA-3’ mientras que elantisentido, al cual se le agregó el sitio XhoI (subrayado), fue diseñado en base a una región de lasecuencia intergénica del 3’, G6PDH crev:5’-CCGCTCGAGACGTTGTTCGATGTTCA-3’. Por otrolado, el gen completo correspondiente a la G6PDH largase amplificó también a partir de ADN genómicode T. cruzi clon CL Brener. El oligonucleótido sentido se diseñó para hibridizar la región flanqueante alprimer codón de iniciación y se le adicionó un sitio NheI para (igual que en el caso anterior) permitir elclonado direccional de dicho gen en el vector de expresión, G6PDH Lfw: 5´-CTAGCTAGCATGAGTGGATCGGAGA-3´. El oligonucleótido anti sentido fue el mismo utilizadopara el clonado de la G6PDH corta. Los productos de PCR así amplificados fueron clonados en pGEMTeasyy completamente secuenciados. El análisis de dichas secuencias mostró la presencia de polimorfismosentre los genes sobre los cuales se discutirá más adelante.

Resultados G6PDH - 45Organización genómica de la G6PDH de T. cruzi.Con la finalidad determinar la organización genómica de la G6PDH de T. cruzi, se llevaron a caboexperimentos de Southern blot de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y Métodos utilizando elgen de la G6PDH cortacomo sonda. De esta manera, cuando el ADN genómico de T. cruzi fue digeridocon enzimas de restricción, cuyos sitios de corte se encontraban ausentes dentro del gen de la G6PDH,se observaron patrones variados dependiendo de la enzima utilizada. Así, cuando la digestión se llevó acabo con (KpnI, NcoI y SacI) se observaron tres bandas reactivas, mientras que al utilizar (XhoI,SacII y NheI) o (BamHI, HindIII, NdeI y NotI), se observaron dos, o una banda reactiva respectivamente(Fig.2). A su vez, digestiones llevadas a cabo con enzimas de restricción con un único sitio de cortedentro del gen de la G6PDH de T. cruzi, mostraron patrones extremadamente complejos. Estos resultadosKpb10987654321.41 2 3 4 5 6 7 8 9 10Fig.2. Análisis del número de genescorrespondiente a la G6PDH de T. cruzi.Autorradiografía correspondiente a un ensayo deSouthern blot llevado a cabo para determinar elnúmero de genes correspondiente a la G6PDH de T.cruzi. El gen completo de la G6PDH cortamarcado conP32 fue utilizado como sonda y el ADN genómicofue digerido con: línea 1: BamHI, línea 2: KpnI, línea3: NcoI, línea 4: XhoI, línea 5: SacII, línea 6: SacI,línea 7: NheI, línea 8: HindIII, línea 9: NdeI y línea 10:NotI.hicieron pensar en la existencia de másde un gen correspondiente a la enzima.Para corroborar la presencia demúltiples copias del gen de la G6PDHen el genoma de T. cruzi se analizaronlas secuencias de 70 GSS de T. cruziaparecidos recientemente en la base dedatos de TIGR, y varios clonescorrespondientes a la G6PDH cortayG6PDH largaobtenidos mediantereacciones independientes de PCR. Apartir de dicho análisis pudieronidentificarse dos pseudo genes, uno deellos con un codón de terminación 321pb río abajo del primer ATG, quecodifica para una proteínaextremadamente corta que carece delsitio de unión a sustrato y por lo tantoes considerada como no-funcional; yotro con un codón de terminación en labase 1233. El polipéptido de 411

Resultados G6PDH - 46residuos de aminoácidos derivado a partir de dicho pseudo gen presenta tanto el sitio de unión acofactor como el sitio de unión a sustrato, pero carece del extremo C-terminal de la proteína. Todos losesfuerzos llevados a cabo para expresar esta enzima en E. coli como una proteína recombinante solublefueron infructuosos, independientemente de las condiciones de expresión utilizadas. En todos los casos,la enzima se presentaba en cuerpos de inclusión como una proteína de masa molecular aparente de 45kDa, no siendo posible detectar actividad enzimática diferencial entre los cultivos controles e inducidos.Esto probablemente se deba a un plegamiento incorrecto de la proteína, lo que condujo a clasificartambién a dicho pseudo gen como no-funcional. El resto de las secuencias analizadas pudieron serseparadas en tres grupos correspondientes a genes completos (no mutados) de la G6PDH de T. cruzi,que poseen un 99 % de identidad entre si. La mayor parte de los cambios nucleotídicos observados endichos genes fueron conservativos y no involucraron residuos importantes para la catálisis, sin embargono puede descartarse que dichas divergencias puedan afectar de algún modo la estabilidad de la enzimacomo ocurre con la G6PDH humana, donde simples mutaciones pueden conducir a la desestabilizaciónde la enzima [Gallego y col; 2000]. Las secuencias nucleotídicas correspondientes al gen de la G6PDHde los tres grupos antes mencionados podían codificar tanto para la G6PDH cortade 518 residuos deaminoácidos, como para la G6PDH largade 555 residuos de aminoácidos de longitud, ya que en dichosgrupos ambos codones de iniciación se encontraban presentes. De esta manera, las secuenciaspolipeptídicas traducidas a partir de los genes mencionados presentaban una masa molecular aparentecalculada de 58 kDa en el primer caso, o 63 kDa en el segundo. La divergencia entre las secuencias dedichos grupos se veía reflejada tan sólo en leves cambios en el punto isoeléctrico calculado para cadauna de ellas, así para la G6PDH largalos pI correspondientes a las secuencias pertenecientes a los tresgrupos eran 8.0, 7.0, y 6.86 ; mientras que para las secuencias correspondientes a la G6PDH los pIcortacalculados fueron 7.4, 7.6 y 7.3. Por otro lado, las secuencias río arriba y río abajo del gen de laG6PDH presentaban marcadas divergencias entre los tres grupos antes mencionados e incluso conaquellas correspondientes a los pseudo genes descriptos más arriba. Todo esto nos permitió confirmarla presencia de más de un gen para la G6PDH en el genoma de T. cruzi. Adicionalmente, mediante laintroducción de cada una de las secuencias correspondientes a la G6PDH de T. cruzi de los tres gruposen la base de datos “gene db” (www.genedb.org), fue posible llevar a cabo la identificación de losgenes acompañantes o flanqueantes de cada uno de ellas. Esto también se realizó para la G6PDH de T.brucei y Leishmania encontrándose cierta correlación entre los genes acompañantes de las mismas yaquellos pertenecientes al entorno de la G6PDH de T. cruzi. De esta manera, río arriba de uno de losgenes completos de la G6PDH de T. cruzi como así también del pseudo gen que codificaba para la

Resultados G6PDH - 47proteína de 45 kDa, se detectó una secuencia correspondiente al gen de una peroxidasa ascorbatodependiente. Este mismo patrón se observó para la G6PDH de L. major. A su vez, río abajo de uno delos alelos correspondiente al gen completo de la G6PDH de T. cruzi que poseía mayor porcentaje deidentidad con su homólogo de T. brucei, se detectaron varios genes no identificados y un gencorrespondiente a la adenilato kinasa de T. cruzi. Una distribucion genómica similar se observó para laG6PDH de T. brucei. El resto de los genes correspondientes a la G6PDH de T. cruzi resultaron tenerentornos diferentes no conservados en otros tripanosomátidos. Estas observaciones tienen buenacorrelación con los análisis llevados a cabo por Ghedin y col [2004], donde se estudió la conservacióndel orden genético (sintenía) en kinetoplástidos. Dichos estudios demostraron la presencia de una fuerteconservación en el orden de los genes entre los tripanosomátidos probablemente debida a que dichosorganismos tuvieron un ancestro común hace 400 o 600 millones de años. En dicho trabajo se mencionóel hecho de que la mayor parte de los genes encontrados en posiciones similares eran ortólogos y que enaquellos casos donde se observaba pérdida en la sintenía, ésta era debida a rearreglos en el genomaABCKpb.2200160012501020825680610Fig.3. Electroforesis en campo pulsante de laG6PDH de T. cruzi. Autorradiografíacorrespondiente a una electroforesis en campoPulsante llevada a cabo tal como se menciona enla sección Materiales y Métodos. El gen deG6PDH corta(marcado con P 32 ) fue utilizado comosonda. A-B y C bandas reactivas de 1425 Kpb,1000 Kpb y 740 Kpb respectivamente.inducidos por la inserción de retrotransposones. Esimportante destacar que en las regiones flanqueantes alos genes de la G6PDH de T. cruzi pudieron serdetectadas también numerosas secuenciascorrespondientes a estos últimos lo que indicaría quedichos genes se encuentran en regiones variables delgenoma tal como ocurre con la G6PDH de mamíferoscuyo gen se encuentra ubicado en una regiónhipervariable del cromosoma X (Xq28). Por otro lado,el hecho de haber detectado entornos genéticosdistintos para cada uno de los genes correspondientesa la G6PDH de T. cruzi demostró que los mismos nose encuentran dispuestos unos detrás de otros ( enbuena concordancia con la ausencia de unidadesrepetitivas en el experimento de Southern blot).Posteriormente, y en un intento de determinar ladistribución cromosómica del gen de la G6PDH de T.cruzi, se llevó a cabo una electroforesis en campopulsante (Pulse Field gel electrophoresis), tal como se

Resultados G6PDH - 48describe en la sección Materiales y Métodos utilizando también en este caso el gen de G6PDH cortacomosonda. En dicho experimento se detectaron de tres bandas reactivas de 1425 Kpb, 1000 Kpb y 740Kpb respectivamente, indicando que los genes de la G6PDH de T. cruzi se encuentran distribuidos entres de los cromosomas del parásito (Fig.3).Análisis de la secuencia primaria de la G6PDH.La única estructura cristalina correspondiente a una G6PDH disponible hasta el momento es la deLeuconostoc mesenteroides [Rowland y col; 1994]. Dicha enzima ha recibido particular atención debidoa que estas bacterias poseen una vía glicolítica incompleta por lo que llevan a cabo la metabolización dela glucosa a través de la vía de las pentosas fosfato. Esta enzima puede utilizar como cofactor tantoNADP como NAD y es la única G6PDH que carece de cisteínas en su secuencia. La forma activa de laenzima es un dímero y sus monómeros poseen 485 residuos de aminoácidos. La estructuracorrespondiente a dicha proteína ha sido ampliamente utilizada para llevar a cabo el modelado molecularde sus homólogos de plantas y humanos. En este último caso dichos modelos han sido utilizados paraubicar espacialmente y analizar la relevancia de las distintas mutaciones puntuales presentes en la enzimay que causan diversos tipos de anemias hemolíticas. La G6PDH de T. cruzi posee un 35 % de identidadcon la G6PDH de Leuconostoc mesenteroides y el siguiente análisis de su estructura primaria se llevóa cabo en base a la descripción detallada realizada para su homólogo bacteriano. De esta manera, fueposible determinar que cada uno de los monómeros correspondientes a la enzima se encuentra constituídopor dos dominios: el dominio N-terminal (de unión a cofactor) que comprende los residuos 63 a 242(desde el primer codón de iniciación) y contiene la secuencia típica de unión a dinucleótidos “GASGDLA”.Dentro de dicho dominio pudo ubicarse la Arg109 (Arg72 en la G6PDH humana y Arg46 en las secuenciacorrespondientes a la enzima de Leuconostoc respectivamente) responsable de otorgar especificidad ala enzima por el NADP, ya que es la encargada de unir el 2’ fosfato del cofactor (Fig.4). En la estructuradimérica de la enzima el dominio de unión a cofactor se encuentra ubicado en los extremos de cada unode los monómeros protruyendo hacia el solvente. El segundo dominio (C-terminal) comprende losresiduos de aminoácidos 243 a 556. Dentro del mismo se encuentra el sitio activo de la enzima queconstituye un bolsillo y posee una gran proporción de residuos estrictamente conservados. La secuencia“RIDHYLGKE” (residuos de aminoácidos 243 a 251), cuya His 246se encarga de unir el sustrato, forma

Resultados G6PDH - 49Tc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDH#Tc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDHTc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDH* * * * *+ ++ +* * * * #Tc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDHTc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDHTc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDHTc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDH+ ++ + + + + + ++ +Tc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDHTc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDHTc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDHTc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDHTc-G6PDHTb-G6PDHL.mex-G6PDHHuman-G6PDHFig.4. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas deducidas de distintas G6PDHs. Las secuenciascorrespondientes a: G6PDH largade T. cruzi (con mayor homología con la G6PDH de T. brucei), G6PDH de T. brucei(CAC07816) con la extensión amino terminal de 37 residuos de aminoácidos, G6PDH de Leishmania mexicana(AA037825) y G6PDH humana (NP_000393) fueron alineadas por el método Clustal. La primer y segunda metionina(en las G6PDHs de T. cruzi y T. brucei) se encuentran señaladas, como así también los dos residuos de cisteínadiferenciales presentes en la extensión amino terminal de la G6PDH de T. cruzi. El sitio de unión a cofactor seencuentra señalado con una línea horizontal, y la secuencia denominada la firma de las G6PDHs (que forma parte delsitio de unión a sustrato) se encuentra destacada con asteriscos. Los residuos involucrados en la unión del sustratoy cofactor se encuentran señalados con #, los residuos de cisteína presentes dentro de la secuencia de la G6PDH deT. cruzi se encuentran señalados con una estrella, y aquellos sujetos a mutación en las variantes genéticas de laG6PDH humana y que se encuentran involucrados en la desestabilización de la proteína se presentan señalados conuna cruz.

Resultados G6PDH - 50parte del sitio activo de la enzima, como así también residuos de aminoácidos circundantes a la misma yalgunos otros que se encuentran mas alejados en la estructura primaria de la enzima (Fig.4).Cuando las secuencias aminoacídicas de las G6PDH de T. cruzi, T. brucei y Leishmania mexicanason comparadas con aquellas pertenecientes a sus homólogos de otros organismos, se observa que los37 residuos de aminoácidos comprendidos entre el primer y el segundo codón de iniciación constituyenuna inusual extensión N-terminal presente en las enzimas de tripanosomátidos, ya que la longitud de lamayoría de las G6PDHs de distintas especies se correlaciona con los 519 residuos de aminoácidoscorrespondientes a la proteína traducida a partir del segundo codón de iniciación, (con la excepciónde la G6PDH de cloroplastos sobre la cual se hablará más adelante). Cabe aclarar que la G6PDH deLeishmania mexicana (AA037825) también presenta una extensión de 40 residuos de aminoácidossimilar a la presente en T. brucei y T. cruzi, sin embargo en dicha proteína existe un único codón deiniciación de la traducción (Fig.4). El análisis de la composición aminoacídica de dichas extensionesmostró la existencia de una gran cantidad de residuos de aminoácidos cargados, tanto positiva comonegativamente manteniéndose de esta manera el balance de cargas. A su vez la comparación de dichassecuencias mostró la existencia de un 59.2 % de identidad entre la de T. cruzi y la de T. brucei, y un62.8 % de identidad entre T. cruzi y Leishmania mexicana. Tal como se mencionó con anterioridad laG6PDH presente en cloroplastos de plantas superiores posee también una extensión N-terminal de 60residuos de aminoácidos, que constituye un péptido de tránsito a plástidos [Wendt y col; 2000], perocarece de homología con aquella encontrada en tripanosomátidos. Para determinar si las extensionespresentes en la G6PDH de dichos parásitos constituían algún tipo de señal de direccionamiento de laproteína hacia alguna organela en particular, éstas fueron analizadas con los programas computacionalesPsortII (www.psort.org), TargetP (www.cbs.dtu.dk/services/targetP) y SignalP (www.cbs.dtu.dk/services/signalP) obteniéndose en todos los casos resultados negativos. Ante todo lo expuesto, yteniendo en cuenta que dicho análisis no fue llevado a cabo con la G6PDH de T. brucei y Leishmania,consideramos de gran interés la determinación de la posible función de dicha extensión N-terminal en laG6PDH de T. cruzi (ver más adelante).Expresión de la G6PDH cortay G6PDH largarecombinantes de T. cruzi.Tal como se mencionó en párrafos anteriores, si bien el gen de la G6PDH de T. brucei, presentatambién los dos codones de iniciación para la traducción se eligió unicamente el segundo de ellos para la

Resultados G6PDH - 51expresión en E. coli de la enzima recombinante [Duffieux y col; 2000]. De esta manera, la G6PDH deT. brucei fue expresada como una proteína soluble y activa de 521 residuos de aminoácidos de longitud(tamaño correspondiente a la mayoría de las G6PDHs citosólicas). A los fines de poder compararambas enzimas parasitarias el gen correspondiente a la G6PDH de T. cruzi que poseía mayor identidadABkDa664524kDa6645241 2 31 2 3 4Fig.5. Indución y purificación de las G6PDHs de T. cruzi. A)SDS page 10% teñido con Coomasie Brillant Blue correspondientea la inducción y purificación de la G6PDH cortade T. cruzi. En laprimera y segunda calle se presentan extractos totales de E. colilibres de células correspondientes a: línea 1- BL21 CodonPlus (DE3)transformadas con pET28a(+)-G6PDH cortasin inducir; línea 2- BL21CodonPlus (DE3) transformadas con pET28a(+)-G6PDH cortainducido; línea 3 G6PDH cortapurificada por IMAC. B) SDS page10% teñido con Coomasie Brillant Blue correspondiente a lainducción de la G6PDH largade T. cruzi. En todas las calles (exceptoen la última) se presentan resuspenciones de células provenientesde 100 µl de cultivo correspondientes a: línea 1- E. coli BL21codonPlus (DE3) transformadas con pET28a (+) inducido, línea 2-E. coli BL21 codonPlus (DE3) transformadas con pET28a (+)-G6PDHlarga sin inducir , línea 3 E. coli BL21 codonPlus (DE3)transformadas con pET28a (+)-G6PDH larga, línea 4 G6PDH corta,cuerpos de inclusión purificados.con su homólogo de T. brucei fueseleccionado inicialmente para expresar laproteína recombinante en E. coli a partirdel segundo codón de iniciación. De estamanera, dicho gen, que previamente habíasido clonado en pGEMT-easy, fueliberado del vector mediante digestión conNheI y XhoI, y posteriormente clonadoen el vector de expresión pET28a(+) demanera tal de obtener la proteínarecombinante con un tracto de 6 residuosde histidinas en su extremo amino terminal.Posteriormente, la construcción pET28a(+)-G6PDH cortafue utilizada paratransformar E. coli de la cepa BL21codon Plus (DE3) y obtener proteínarecombinante que pudo ser purificada porIMAC tal como se describe en la secciónMateriales y Métodos. Si bien las mejorescondiciones encontradas para la inducciónde la G6PDH cortade T. cruzi fueron 3 hs a28 °C en medio LB, esto no impidió quebuena parte de la proteína recombinantepermaneciera en cuerpos de inclusión. Sinembargo, la cantidad de proteína presenteen la fracción soluble fue suficiente para ladeterminación de los parámetros cinéticosde la misma (Fig.5). La G6PDH corta

Resultados G6PDH - 52recombinante resultó ser bastante afectada por la purificación por columnas de Ni 2+ (esto se vio reflejadoen los bajos porcentajes de recuperación de la actividad enzimática observados que resultaron serindependientes de la concentración de imidazol utilizada). Ante lo expuesto, y teniendo en cuenta laescasa proporción de la proteína recombinante presente en la fracción soluble, se decidió llevar a cabolas eluciones en presencia de 300 mM de imidazol, ya que esto permite eluir completamente la proteínaen volúmenes pequeños de solución amortiguadora y obtener por lo tanto una solución más concentradade la misma. La purificación llevada a cabo de esta manera tuvo un rendimiento del 35 % y la actividadespecífica de la proteína recombinante fue de 1.3 µmol.min -1 .mg -1 .Debido a que tal como se mencionó con anterioridad en T. brucei la G6PDH sólo había sido expresadaa partir de su segundo codón de iniciación y no había sido determinada la relevancia de la extensión N-terminal presente en dicha proteína, nos resultó de interés llevar a cabo dicho análisis para la G6PDH largade T. cruzi. De esta manera el gen correspondiente a la enzima se clonó en el vector de expresión talcomo se mencionó anteriormente y la expresión de la proteína recombinante se realizó de acuerdo almismo protocolo utilizado para la G6PDH corta. En estas condiciones casi la totalidad de la enzimarecombinante se presentó en cuerpos de inclusión (Fig. 5 B) con una masa molecular aparente de 61.7kDa, sin embargo la fracción soluble correspondiente a los extractos totales inducidos (donde la proteínarecombinante sólo podía ser identificada por western blot) presentó una actividad específica 3 vecessuperior a la fracción soluble correspondiente a los extractos controles. La proteína recombinante fuepurificada de acuerdo al mismo protocolo utilizado para la purificación de la G6PDH corta, obteniéndoseun rendimiento del 48 % (esta enzima también perdió gran parte de su actividad al ser purificada porcolumna de Ni 2+) y una actividad específica de 7.9 µmol.min -1 .mg -1 , marcadamente superior a la registradapara la G6PDH corta.de T. cruzi.Determinación de masa molecular aparente de subunidad y de la G6PDH activaLa G6PDH cortarecombinante purificada por IMAC mostró una masa molecular aparente de subunidaddeterminada por SDS Page [Weber and Osborn; 1969] de 57 kDa (Fig.6 A), en buena correlación conla masa molecular estimada 60.7 kDa (incluyendo el tracto de 6 residuos de histidina y el sitio de cortepara trombina, presentes en el extremo amino terminal de la proteína recombinante). Por otro lado, conla finalidad de llevar a cabo la determinación de la masa molecular aparente de la proteína recombinanteactiva, se realizaron experimentos de filtración por gel utilizando una columna Bio-Sil SEC 250 (BIO-

Resultados G6PDH - 53RAD), tal como se describe en la sección Materiales y Métodos. En dichos ensayos la G6PDH cortapurificada eluyó como un único pico con actividad de G6PDH con una masa molecular aparente de 128kDa. De acuerdo con estos resultados, la G6PDH cortade T. cruzi sería una proteína dimérica, en buenacorrelación con la mayoría de las G6PDHs (Fig. 6B).ABmAUkDa6635.030.025.0nmoles.seg -1706050BD670 kDa158 kDa44 kDa17 kDa4520.04015.0302410.0205.0102.0 4.0 6.0 8.0 10 mlFig.6. Determinación de la masa molecular aparente de la G6PDH cortade T. cruzi. A) SDS Page teñido con nitratode plata correspondiente a la G6PDHcorta de T. cruzi purificada por IMAC. Dicha proteína presenta una masamolecular aparente de subunidad de 58 kDa. B) Determinación de masa molecular aparente de la G6PDH cortaactiva porfiltración en gel en una columna BIO-Sil SEC 250. La proteína recombinante activa eluyó en un único pico de unamasa molecular aparente de 128 kDa, que presentó actividad de G6PDH.Efecto del DTT sobre la actividad de la enzimática de la G6PDH de T. cruzi.Estudios previos llevados a cabo con extractos totales de epimastigotes de T. cruzi del clon CL Brener,mostraron que la actividad correspondiente a la G6PDH nativa era afectada de manera dramática por lapresencia de un agente reductor en la muestra (ej. DTT). De esta manera, se determinó que la incubaciónde los extractos libres de células en presencia de 4 o 62.5 mM DTT durante 10 min conducía a lapérdida de un 50% y un 85% de su actividad respectivamente, y a partir de los 20 min de incubación laactividad de la enzima se hacía indetectable (para ambas concentraciones del agente reductor). El mismoefecto se observó en extractos totales de tripomastigotes metacíclicos, amastigotes y tripomastigotes decultivo debido a que presentaron una marcada disminución en la actividad correspondiente a la enzima

Resultados G6PDH - 54al ser incubados durante 10 min en presencia de 4 mM DTT. El agregado de un inhibidor de proteasascomo el E64 no previno de manera alguna la inactivación de la enzima sugiriendo que la pérdida deactividad enzimática registrada no se debía a la degradación de la proteína sino más probablemente a lareducción de algunos residuos de cisteína que necesariamente deben mantenerse oxidados para preservarsu actividad. El mismo experimento se llevó a cabo con extractos totales de Leishmania mexicanacepa Costa Rica y Leishmania mexicana MNYC/BZ/62/M379 no detectándose cambios significativosen la actividad de la enzima. Algo similar ocurre con la G6PDH de T. brucei ya que los protocolos depurificación de la enzima nativa informados por Heise y col [1999], incluyen el agregado de 1 mM DTT(concentración final) en todas las soluciones amortiguadoras utilizadas. Teniendo en cuenta que lainactivación de las G6PDHs por agentes reductores es una característica exclusiva de las G6PDHssometidas a regulación redox como ser las isoformas de G6PDH presentes en cloroplastos de plantassuperiores [Wenderoth y col 1997], y G6PDH sujetas a regulación redox de cianobacterias [Summersy col; 1995] (ver más adelante), y que por otro lado las isoformas citosólicas en general no son afectadasde manera alguna por la presencia de dichos compuestos; decidimos estudiar el efecto del DTT sobre la+G6PDH cortarecombinante purificada por columna de Ni 2eluída en presencia de 300 mM imidazol. Adiferencia de lo esperado, al incubar la enzima durante 5 min en presencia de distintas concentracionesde DTT se observó un aumento en su actividad conforme se aumentaba la concentración del agentereductor. Así, cuando a la G6PDH cortapurificada se le adicionó DTT hasta una concentración final de 1mM se detectó un incremento del 11% en la actividad de la enzima, mientras que al incubarla enpresencia de 5 mM DTT el mismo fue del 19 %. A su vez la incubación de la proteína en presencia de25 mM y 62.5 mM DTT durante 5 min condujo a un incremento en su actividad del 22 y del 24 %respectivamente. Este fenómeno de activación puede ser explicado si se considera que las enzimaspurificadas por IMAC sufren frecuentemente oxidaciones que conducen a menudo a la pérdida deactividad enzimática que puede ser revertida mediante el agregado de agentes reductores. Teniendo encuenta esta última observación se decidió determinar si la presencia del DTT podía afectar a largo plazola actividad de la enzima recombinante. Para ello, se incubó la proteína purificada por IMAC durante100 min a 4 °C en presencia de distintas concentraciones de DTT (s/DTT, 1, 5, 25 y 62.5 mM), y sedeterminó su actividad enzimática a distintos intervalos de tiempo. Tal como se observa en la Fig.7 A, lasmuestras incubadas en presencia de 1 y 5 mM DTT presentaron una actividad levemente superior a ladel control a lo largo del todo el experimento. Tal como se discutió con anterioridad, en este caso elDTT estaría previniendo e incluso revirtiendo la oxidación de la proteína causada por la purificación dela misma a través de columnas de Ni 2+ . Por su parte las muestras conteniendo 25 y 62.5 mM DTT

Resultados G6PDH - 55presentaron inicialmente actividades superiores al control observándose luego una disminución en suactividad enzimática a partir de los 25 min. De esta manera, la actividad de las muestras conteniendo 25y 62.5 mM DTT fue 0.75 y 0.48 veces la del control (respectivamente) al final del experimento. Dichainactivación, a pesar de ser pronunciada dista mucho de asemejarse a la registrada para la G6PDHnativa, ya que, tal como se mencionó con anterioridad dicha enzima mostró un 50 y 85 % de inactivacióncon una incubación de tan sólo 10 min en presencia de 5 y 62.5 mM DTT respectivamente. Estosresultados indican que la G6PDH cortarecombinante difiere de la G6PDH nativa presente en los extractostotales de T. cruzi. Debido a que existirían varias isoformas correspondientes a la misma, cabe laposibilidad de que la proteína expresada sea un componente minoritario en los extractos totales de T.cruzi contribuyendo muy poco a la actividad total correspondiente a la enzima. Sin embargo, aunquedicha suposición fuese cierta, sería bastante difícil poder explicar las diferencias en la respuesta a lasdistintas concentraciones del agente reductor ya que entre los distintos genes completos identificados noexisten residuos de cisteína diferenciales que puedan explicar dicho comportamiento (todas las secuenciasaminoacídicas deducidas a partir de los genes de la G6PDH de T. cruzi desde el segundo codón deiniciación poseen 8 residuos de cisteína, 6 de los cuales se encuentran estrictamente conservados en suhomólogo de Leishmania y 5 en el de T. brucei (Fig.4). La otra posibilidad, y tal vez la más acertada,sea considerar que la forma mayoritaria de la G6PDH presente en los extractos totales de T. cruzi seala que denominamos larga (traducida a partir del primer codón del iniciación) ya que dentro de los 37residuos de aminoácidos correspondientes a la extensión amino terminal de dicha proteína existen dosresiduos de cisteína en las posiciones 8 y 33 (presentes en todas las secuencias analizadas) quepotencialmente deban estar formando puentes disulfuro para mantener la actividad de la enzima (Fig.4).Por su parte, las extensiones amino terminales correspondientes a la G6PDH de T. brucei y Leishmania,no poseen residuos de cisteína (en buena concordancia con la ausencia de inhibición por agentesreductores registrada para dichas enzimas). Ante esto decidimos analizar el efecto del DTT sobre laG6PDH largapurificada por columna de Ni 2+ . La enzima purificada fue incubada a 4 °C en presencia delas mismas concentraciones del agente reductor ensayadas para la G6PDH cortadeterminándose su actividadenzimática a distintos intervalos de tiempo durante 85 min. De esta manera, la G6PDH largaincubada enpresencia de 1 mM DTT, presentó a los 5 min de incubación una leve activación de tan sólo un 3 %mientras que concentraciones mayores del agente reductor produjeron en cambio una marcada pérdidade actividad enzimática en el mismo intervalo de tiempo obteniéndose inactivaciónes del 14, 51 y 76 %para las muestras incubadas en presencia de 5, 25 y 62.5 mM DTT respectivamente. (Fig.7 B). Al igualque para la G6PDH corta, la muestra incubada en presencia de 1 mM DTT presentó una mayor estabilidad

Resultados G6PDH - 56que la enzima control (incubada en ausencia del agente reductor) ya que al final del experimento dichamuestra poseía una una actividad 1.7 veces mayor que este último. Por su parte, las muestras incubadasen presencia de concentraciones mayores del agente reductor presentaron una caída dramática de laactividad enzimática en cortos intervalos de tiempo llegando a obtenerse niveles no-detectables deactividad al final del experimento. El hecho de que la G6PDH largahaya presentado un comportamientomuy similar al de la G6PDH nativa de los distintos estadíos del ciclo de vida de T. cruzi frente a lapresencia de agentes reductores, nos condujo a proponer que dicha proteína sería la que potencialmentese está expresando, al menos de manera mayoritaria en el parásito.AB(Act. control/Act. con DTT)(Act. control/Act. con DTT)1,21,00,80,751 mM DTT0,65 mM DTT0,480,425 mM DTT0,262.5 mM DTT0,00 20 40 60 80 100Tiempo (min)1,61,20,80,40,00 15 30 45 60 75Tiempo (min)1,7Serie2 1 mM DTTSerie3 5 mM DTTSerie4 25 mM DTTSerie5 62.5 mM DTT0,20,11,13Fig.7. Efecto del DTT sobre laactividad ambas G6PDHsrecombinantes. Efecto de distintasconcentraciones de DTT, sobre laactividad de la G6PDH cortay G6PDHl argasrecombinante purificadas por IMAC.Ambas proteínas purificadas seincubaron en presencia de distintasconcentraciones de DTT (desde 0hasta 62.5 mM) y su actividadenzimática se determinó a lo largo deltiempo. A) Gráfico correspondiente ala G6PDH cortay B) gráficocorrespondiente a la G6PDH larga. Enambos casos los datos se expresancomo actividad de la muestra sin DTT/Act de la muestra con DTT.

Resultados G6PDH - 57Determinación de los parámetros cinéticos de la G6PDH cortay G6PDH largarecombinantes.De acuerdo con lo expuesto en párrafos anteriores, la G6PDH cortay G6PDG largade T. cruzi presentaroncomportamientos diferenciales que se vieron reflejados no sólo en su respuesta a las distintasconcentraciones de DTT sino también a la marcada diferencia en sus actividades específicas (laG6PDH largaresultó ser 6 veces más activa que la isoforma corta). Ante esto decidimos llevar a cabo ladeterminación de los parámetros cinéticos de ambas enzimas utilizando las proteínas recombinantespurificadas por IMAC. La determinación del pH óptimo para la reacción catalizada por la G6PDH cortarecombinante se realizó de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materiales y Métodos. Así lamáxima actividad correspondiente a la enzima se registró a pH 7.5 (Fig.8), un valor marcadamente0,500,450,400,350,300,250,200,150,100,050,006,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0pHFig.8. Determinación de pH óptimo de la G6PDH cortarecombinante.diferente al informado para las G6PDHs de T. brucei y G6PDH humana que poseen un pH óptimoalcalino: 9.La determinación del K maparente para sustrato y cofactor correspondiente a la G6PDH cortase llevó acabo en presencia y ausencia de DTT para determinar si el agente reductor producía algún tipo demodificación en los parámetros cinéticos de la enzima recombinante. Para estas determinaciones laconcentración final de DTT elegida fue 62.5 mM debido a que en dicha condición se observaba lamayor activación de la enzima con una incubación de 10 min. Las medidas de actividad enzimática sellevaron a cabo por fluorometría de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y Métodos. Estos

Resultados G6PDH - 58estudios mostraron un incremento muy marcado en la velocidad máxima de reacción para las curvascorrespondientes a la proteína incubada en presencia de DTT con respecto a la Vmax de las curvasrealizadas en ausencia del agente reductor. De esta manera, dicho incremento fue de 3.8 veces para[Enzima]/V (nmol -1 .min. mg)0,80,70,60,50,40,30,20,1Serie1 sin DTTSerie2 62.5 mMDTT0-0,02 0 0,02 0,04 0,061/G6P -1y = 10,367x + 0,108R 2 = 0,9977y = 2,1564x + 0,0282R 2 = 0,9958[Enzima]/V (nmol -1 .min. mg)1,21,00,80,60,40,2Serie1 sin DTTSerie262.5 mMDTTy = 1,0888x + 0,2015R 2 = 0,9892y = 0,1365x + 0,0299R 2 = 0,99270,0-0,25 -0,05 0,15 0,35 0,55 0,75 0,95Fig.9. Determinación de K maparente para sustrato y cofactor de la G6PDH cortarecombinante, en presencia yausencia de un agente reductor. Las muestran tratadas con el agente reductor fueron incubadas durante 10 min enhielo en presencia de 62.5 mM DTT (concentración final) previamente a la determinación de actividad enzimática

Resultados G6PDH - 59aquellas realizadas a [G6P] variable y de 6.9 veces para las realizadas a [NADP] variable. Esta divergenciaen el incremento de la Vmax en presencia de DTT puede deberse a que la determinación del K maparente para NADP se llevó a cabo con posterioridad a la determinación del K maparente para G6Ppor lo que al momento de llevar a cabo las mediciones a [NADP] variable la enzima había perdido partede su actividad (probablemente por oxidación), hecho que pudo ser revertido mediante el agregado deun agente reductor. A pesar de dichas diferencias, el valor de K maparente para NADP no se viósignificativamente afectado (5.4 µM y 4.6 µM para las muestras incubadas en ausencia y en presenciade DTT respectivamente) mientras que el K mpara G6P sufrió una cierta variación: 96 µM sin DTT y 76µM con DTT (Fig.9). A su vez si se comparan dichos valores con los informados para la G6PDH de T.brucei 138 µM, y 5.3 µM para G6P y NADP respectivamente [Heise y col; 1999] y la G6PDHhumana 100 µM y 10 µM para G6P y NADP respectivamente [Cohen y col; 1975] se observa que laenzima de T. cruzi posee mayor afinidad por su sustrato que las antes mencionadas, siendo máspronunciada la diferencia entre ambas enzimas parasitarias. Por su parte, los valores de K maparentepara el NADP correspondientes a estas últimas son totalmente comparables entre si, mientras que existeuna pequeña diferencia entre la afinidad de éstas por el cofactor comparada con la enzima de humanos.La determinación del K maparente para sustrato y cofactor correspondiente a la G6PDH largarecombinantese llevó a cabo utilizando el mismo rango de sustratos que para la G6PDH cortacon la excepción de quelas determinaciones pudieron ser realizadas por espectrofotometría debido a la mayor actividad específicade la muestra. Estos experimentos mostraron que dicha proteína posee menor afinidad tanto por susustrato como por su cofactor que la G6PDH corta, siendo más marcada la diferencia para el primero(Fig.10). De esta manera, mientras el K mpara G6P correspondiente a la G6PDH cortaera 76 µM, para laG6PDH largael valor obtenido fue 199 µM. Sin embargo, esta última proteína presentó una constantecatalítica (K cat) 3 veces superior a la correspondiente a la G6PDH corta, indicando que la enzima a pesarde poseer menor afinidad por el sustrato lleva a cabo más rápidamente la reacción. Sin embargo alcomparar la eficiencia catalítica de ambas enzimas (Kcat/Km) se observó que ambos valores eranidénticos para el caso de la G6P (debido a que el aumento en el valor de K mpara dicho compuesto enla G6PDH largabalancea el aumento en su constante catalítica ). La eficiencia catalítica de la G6PDH largacon respecto al NADP es levemente superior a la determinada para la G6PDH corta, debido a que no seregistraron cambios significativos en el valor de K mpara el cofactor entre ambas enzimas. (Tabla .1).Teniendo en cuenta las diferencias detectadas entre los valores de K maparente para el sustratocorrespondiente a ambas isoformas de la enzima nos pareció importante llevar a cabo una estimacióndel K maparente para G6P en un extracto total de epimastigotes de T. cruzi para tratar de discernir cual

Resultados G6PDH - 60[Enzima] /V (umol - 1 .min. mg)1,41,210,80,60,40,2y = 30,327x + 0,1523R 2 = 0,99870-0,01 -0,005 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,0351/G6 P -1[Enzima] /V (umol - 1 . min.mg)1,000,800,600,40y = 1,4715x + 0,1687R 2 = 0,98670,200,00-0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6-1Fig.10. Determinación de K maparente para sustrato y cofactor correspondiente a la G6PDH larga.de las dos isoformas se expresa de manera mayoritaria en el parásito. El extracto total utilizado paraestas determinaciones había sufrido dos procesos de congelación y descongelación por lo que la actividadcorrespondiente a la 6PGDH era no detectable, la actividad correspondiente a la G6PDH, en cambio,

Resultados G6PDH - 61Tabla.1T. cruzi G6PDH corta (-DTT) T. cruzi G6PDH corta (+DTT) T. cruzi G6PDH larga (-DTT)T. bruceiKm ap Kcat Kcat/Km Km ap Kcat Kcat/Km Km ap Kcat Kcat/Km Km ap Kcat Kcat/KmG6PNADP5.40.3 0.0896 0.56 5.8.10 -3 y = 16992x + 59,07376 2.15 0.034.6 2.03 0.44199 7.1 0.0368.7 6.4 0.74138 - -5.3 - -no había se había modificado significativamente (en buena concordancia con las enzimas recombinantesque resultaron no ser afectadas por sucesivos ciclos de congelamiento y descongelamiento). De estamanera la determinación del K map para el sustrato se llevó a cabo por espectrofotometría utilizando elmismo rango de concentraciones de sustrato utilizado para ambas enzimas recombinantes. Dicho análisismostró que los datos se ajustaban a una cinética de tipo Michaeliana , no observándose diferencias enel tipo de curva con respecto a las enzimas recombinantes indicando que la actividad medida en extractototal de epimastigotes correspondería a un único componente con un K maparente para G6P de 288 µM(Fig.11). Si bien este valor dista mucho de ser exacto debido a que las determinaciones fueron llevadasa cabo en un extracto total de epimastigotes de T. cruzi, dicho valor se asemeja más al correspondiente400350300250200150100R 2 = 0,997500-0,004 0,001 0,006 0,011 0,016Fig.11. Determinación de K maparente para G6P en extracto total de epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener.

Resultados G6PDH - 63A0,20000,15000,10000,0500C1E M A T0,0000E M A TBRE M A TkDaKb276662.52.01.545Fig.12. Análisis de la expresión de G6PDH de T. cruzi a lo largo de los distintos estadíos del ciclo de vidadel parásito. A) Actividad específica de G6PDH correspondiente a los distintos estadíos del ciclo de vida deT. cruzi E: epimastigotes, M: tripomastigotes metacíclicos, A: amastigotes, T: tripomastigotes de cultivo. B)Western blot correspondiente a la G6PDH de T. cruzi: R G6PDH cortarecombinante, 0.5 µg; E: epimastigotes,200 µg de proteína total; M: tripomastigotes metacíclicos 100 µg de proteína total; A: amastigotes, 100 µg deproteína total, T: tripomastigotes de cultivo 100 µg de proteína total. El primer anticuerpo (anti G6PDHpurificado) fue utilizado en una dilución 1/100, mientras que el segundo anticuerpo (anti-conejo-peroxidasa)se utilizó en dilución 1/10.000. C) Northern blot correspondiente a la G6PDH de los distintos estadíos de T.cruzi. 1) Autorradiografía del Northern blot. El ARNm correspondiente a la G6PDH se detectó utilizando comosonda el gen correspondiente a la G6PDH cortamarcado con P 32 , E: epimastigotes 12 µg ARN total, M:tripomastigotes metacíclicos, 12 µg ARN total; A:amastigotes, 10 µg ARN total; T: tripomastigotes de cultivo;10 µg ARN total. 2) Membrana teñida con azul de metileno correspondiente a la autorradiografía que semuestra en el panel 1. En dicha membrana pueden distinguirse las bandas correspondientes a los ARNr de T.cruzi.de 2.6 Kpb, indicando que los mismos poseían una región no codificante del 3‘ de aproximadamente670pb (Fig.12 C).

Resultados G6PDH - 64Localización subcelular de la G6PDH en los distintos estadíos del ciclo de vida de T.cruzi.A1K2 3NB1 2 3C1 2 3NKD1 2 3* *Fig.13. Inmunofluorescencias indirectas correspondientes a la G6PDH en epimastigotes y tripomastigotesmetacíclicos de T. cruzi. Como primer anticuerpo se utilizó anti G6PDH de T. cruzi purificado desarrollado en conejoen dilución 1/50 y como segundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000 (verde). El núcleo y kinetoplastofueron teñidos con DAPI (azul). A y B imágenes correspondientes a epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener. B y Cimágenes correspondientes a tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi clon CL Brener. En todos los casos el Panel 1presenta la señal correspondiente a la G6PDH, el panel 2 presenta la ubicación del núcleo (N) y kinetoplasto (K)dentro de la célula y el panel 3 corresponde a la superposición las imágenes anteriores. Con una flecha se señala elcompartimiento de mayor intensidad de fluorescencia detectado en la zona anterior del parásito en epimastigotes yentre núcleo y kinetoplasto en tripomastigotes metacíclicos. En estos últimos se encuentran también señalados conasteriscos algunos gránulos de mayor tamaño que potencialmente podrían ser glicosomas.

Resultados G6PDH - 65La localización subcelular de la G6PDH de T. cruzi se llevó a cabo por inmunofluorescencia indirecta,de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materiales y Métodos utilizando los anticuerpos anti-G6PDH cortapurificados desarrollados en conejo. El patrón observado en epimastigotes del clon CLBrener, mostró que la G6PDH se encuentra distribuída de manera homogénea en el citoplasma celular,sin embargo también se observó una señal de mayor intensidad que frecuentemente se presentaba comoun anillo o un bastón (dependiendo de la posición del parásito) ubicado hacia uno de los lados entre elnúcleo y el kinetoplasto (Fig.13 A y B). Los tripomastigotes metacíclicos presentaron un patrón similaral observado en epimastigotes (aunque algo más particulado), con la excepción de que en este caso, laseñal más intensa observada anteriormente como un anillo, se detectó como una estructura redondeada,algo más pequeña que la anterior, ubicado entre núcleo y kinetoplasto (Fig.13 C y D).Con respecto a los amastigotes y tripomastigotes de cultivo, la señal correspondiente a la G6PDH sedetectó esencialmente en el citoplasma de parásito y pudieron observarse algunos gránulos de mayortamaño que potencialmente podrían ser glicosomas (Fig14 A y B). Sin embargo, debido a que losanticuerpos primarios anti-G6PDH fueron desarrollados en conejo no nos fue posible llevar a caboestudios de co-localización con anticuerpos anti PPDK (piruvato fosfato di-kinasa), enzima marcadorade glicosoma, ya que éstos últimos fueron desarrollados tambien en el mismo animal. Por otro lado,teniendo en cuenta el patrón observado correspondiente a la enzima en epimastigotes y tripomastigotesmetacíclicos, nos pareció interesante identificar la naturaleza de dicho compartimiento celular inmunoreactivo.De acuerdo a la posición del mismo (entre el núcleo y kinetoplasto) existían diversas posibilidadesen cuanto a su identidad ya que en dicha región de la célula se encuentran varias organelas dentro de lascuales se incluye el aparato de Golgi (con la mayor parte de las vesículas endocíticas), elementos delcitoesqueleto como ser el cuerpo basal (en la base del flagelo) y el bolsillo flagelar (Field y col; 2000).De esta manera, inicialmente decidimos llevar a cabo estudios de co-localización de la G6PDH de T.cruzi, con Concanavalina-A-conjugada a tetrametil rodamina. Este compuesto es utilizado entripanosomátidos para la marcación de bolsillo flagelar. Tal como se mencionó en la Introducción dichocompartimiento es una invaginación de la membrana plasmática ubicada en la base del flagelo que poseela característica de ser la única zona de la membrana parasitaria a través de la cual se llevan a cabo losprocesos de endo- y exocitosis. De esta manera, la Concanavalina A se une a la superficie del bolsilloflagelar y es endocitada permitiendo así su marcación específica. El punto más importante de dichamarcación tiene que ver con el tiempo de incubación de los parásitos con la lectina, ya que con intervalosde incubación cortos (de tan sólo 15 seg) se consigue marcar esencialmente el bolsillo flagelar, mientras

Resultados G6PDH - 66A1 2 3**KNB1 2 3K***NFig. 14. Inmunofluorescencias indirectas correspondientes a la G6PDH en amastigotes ytripomastigotes de cultivo de T. cruzi. Como primer anticuerpo se utilizó anti G6PDH de T. cruzi purificadodesarrollado en conejo en dilución 1/50 y como segundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000(verde). El núcleo y kinetoplasto fueron teñidos con DAPI (azul). A- imagen correspondiente a un amastigotede T. cruzi clon CL Brener. B imagen correspondiente a un tripomastigote de cultivo de T. cruzi clon CLBrener. En ambos casos el Panel 1 presenta la señal correspondiente a la G6PDH, el panel 2 presenta laubicación del núcleo (N) y kinetoplasto (K) dentro de la célula y el panel 3 corresponde a la superposiciónlas imágenes anteriores. Los gránulos de mayor tamaño que potencialmente podrían ser glicosomas seencuentran señalados con un asterisco.que con tiempos de incubación más prolongados (de 2 a 5 min), comienza a detectarse la lectina enpequeñas vesículas endocíticas (Jeffries y col; 2001). Dicho experimento, llevado a cabo tal como sedescribe en la sección Materiales y Métodos mostró que la estructura correspondiente a la G6PDH deT. cruzi no co-localiza con el bolsillo flagelar ya que la señal correspondiente al mismo (rojo) se observócomo una pequeña estructura en la parte anterior del parásito perpendicular al kinetoplasto, mientrasque la señal correspondiente a la G6PDH (verde) se observó lateralmente a la misma (Fig.15 A). Esteensayo nos permitió también tener un nuevo punto de referencia para llevar a cabo la ubicación espacialde la señal correspondiente a la G6PDH dentro del parásito, ya que a partir de este experimentopudimos situar dicha señal no sólo con respecto al núcleo y kinetoplasto sino también con respecto albolsillo flagelar. A partir de esta observación y mediante comparación con fotografías de microscopíaelectrónica de transmisión de T. cruzi (Fig.15 B), llegamos a la conclusión de que la localización másprobable de la G6PDH en epimastigotes y potencialmente en tripomastigotes metacíclicos era el aparatode Golgi. Ante esto, y para confirmar dicha hipótesis, decidimos llevar a cabo experimentos de co-

Resultados G6PDH - 67A1 2 3NKB1 2 3NKCRNRKFFig.15. Estudio de co-localización de la señal correspondiente a la G6PDH con Concanavalina A-tetrametilrodamina (marcador del bolsillo flagelar) en epimastigotes de T. cruzi. A y B inmunofluorescencias indirectascorrespondientes a epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener. Para detectar la G6PDH se utilizó anti G6PDH de T. cruzipurificado desarrollado en conejo en dilución 1/50 y como segundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000(verde). La marcación del bolsillo flagelar se llevó a cabo incubando los parásitos con Concanavalina A-tetrametilrodamina (rojo) tal como se describe en la sección Materiales y Métodos, el núcleo y kinetoplasto fueron teñidoscon DAPI (azul). Panel 1-imagen correspondiente a la G6PDH de T. cruzi, panel 2- señal correspondiente al bolsilloflagelar (rojo) con respecto a la ubicación del núcleo (N) y kinetoplasto (K), panel 3 superposición de las imágenesanteriores. C- microscopia electrónica de transmisión de un epimastigotes de T. cruzi donde se muestra la localizaciónde las distintas organelas. En la región anterior del parásito se encuentra el bolsillo flagelar (*) desde donde surgeel flagelo (F), el kinetoplasto (K) que es una zona especializada de la mitocondria (estrella) donde se encuentraubicado el ADN mitocondrial y el aparato de Golgi (flecha) presentando de 4 a 8 cisternas. El núcleo (N) es redondeadoy se ubica en el centro de la célula y en la parte posterior de la misma puede distinguirse los reservosomas (R).Fuente: [Souto-Padrón y col; 2004].

Resultados G6PDH - 68localización de la señal correspondiente a la G6PDH de T. cruzi con aquella perteneciente a BODIPY-C 5-ceramida complejada con BSA y conjugada con Texas-red. La utilización de este compuesto es unmétodo no inmunológico utilizado frecuentemente para marcar el complejo de Golgi de tripanosomátidosy otros tipos celulares ya que dicha ceramida se acumula en esta organela después de haber sidointernalizada por las células in vivo. En dichos experimentos pudimos detectar la señal correspondienteal aparato de Golgi como una estructura redondeada en la parte anterior del parásito ubicada hacia unode los lados entre el núcleo y el kinetoplasto (Fig.16 A1 y B1). La señal correspondiente a la G6PDHmostró el mismo patrón observado anteriormente (Fig.16 A2 y B2), y al superponer ambas imágenespudimos corroborar la co-localización de ambas (Fig.16 A3 y B3). Si bien la inmunofluorescenciaindirecta no es un criterio absoluto para la determinación de la localización subcelular de una proteína, elhecho de haber obtenido co-localización entre la señal correspondiente al marcador de Golgi y aquellaperteneciente a la G6PDH, nos permite inferir con bastante seguridad que una fracción de la G6PDH deA1 2 3NKB1 2 3NKFig.16. Estudio de co-localización de la señal correspondiente a la G6PDH con BODIPY ® TR C 5-ceramidacomplejada con BSA (marcador de aparato de Golgi) en epimastigotes de T. cruzi. A y Binmunofluorescencias indirectas correspondientes a epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener. Para detectarla G6PDH se utilizó anti G6PDH de T. cruzi purificado desarrollado en conejo en dilución 1/50 y comosegundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000 (verde). La marcación del aparato de Golgi se llevóa cabo mediante la incubación de los parásitos con BODIPY ® TR C 5-ceramida complejada con BSA (rojo) talcomo se describe en la sección Materiales y Métodos, el núcleo y kinetoplasto fueron teñidos con DAPI(azul). Panel 1-imagen correspondiente a la G6PDH de T. cruzi, panel 2- señal correspondiente al aparato deGolgi (rojo) con respecto a la ubicación del núcleo (N) y kinetoplasto (K), panel 3 superposición de lasimágenes anteriores. La zona donde co-localiza la señal correspondiente a la G6PDH (verde) con aquellaperteneciente al aparato de Golgi (rojo), se observa en amarillo.

Resultados G6PDH - 69epimastigotes, y potencialmente de tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi se encontraría presente endicha organela.Si bien los anticuerpos utilizados para llevar a cabo estos estudios habían sido purificados por cromatografíade afinidad resultando ser altamente específicos, el hecho de haber detectado a la proteína en unalocalización no demasiado común para una G6PDH (solamente sugerida anteriormente para una isoformade G6PDH presente en células de intestino de conejo) [Ishibashi y col; 1999], creímos necesariocorroborar dicha localización mediante otro método. De acuerdo con esto decidimos construir la fusiónG6PDH corta-Green Fluorescent Protein (pTEX-G6PDH corta-GFP) para transfectar parásitos y analizarasí la localización de la proteína. Para llevar a cabo dicho experimento la G6PDH cortaclonada en pGEM-T Easy, se utilizó como molde para amplificar nuevamente el gen correspondiente a la enzima pero estavez utilizando un par de oligonucleótidos que contenían los sitios BamHI (subrayado) en el sentido, Prs:5’-CGGGATCCATGGAGAACGCCAAAAAG-3´ y SmaI (subrayado) en el anti-sentido, Pr-as:5‘-TCCCCCGGGCAAATATTCACATAA). Este ultimo se diseñó en base a la secuencia flanqueanteal codón de terminación el cual no se incluyó en dicho oligonucleótido para permitir la expresión de laG6PDH cortacomo una fusión a GFP. De esta manera el gen correspondiente a la enzima se clonó en elvector pTEX-GFP previamente digerido con las enzimas de restricción antes mencionadas quedando laGFP fusionada al extremo carboxilo terminal de la G6PDH corta. El plásmido así generado pTEX-G6PDH corta-GFP como así también el pTEX-GFP utilizado como control se purificaron tal como se describe en lasección Materiales y Métodos y fueron utilizados para transfectar epimastigotes de T. cruzi clon CLBrener de acuerdo al protocolo descripto en la misma sección de este trabajo de Tesis. De esta manera,a partir de las tres semanas de realizada la transfección comenzaron a detectarse parásitos verdes(observados por microscopio de fluorescencia) por lo que se continuó la selección de los mismosdurante una semana más y luego se llevaron a cabo los experimentos de co-localización de las señalescorrespondientes a la fusión G6PDH-GFP y GFP con aquella correspondiente al aparato de Golgimarcado con BODIPY ® TR C 5-ceramida complejada con BSA tal como se describe en la secciónMateriales y Métodos. Dichas inmunofluorescencias mostraron que la señal correspondiente a losparásitos controles (transfectados con pTEX-GPF) se encontraba distribuida a lo largo del todo elcuerpo del parásito detectándose una zona de mayor intensidad de fluorescencia sobre el núcleocelular y al rededor del kinetoplasto. Dicha señal no-colocalizó de manera alguna con la correspondienteal aparto de Golgi que se visualizó (como en casos anteriores) como un punto ubicado lateralmente elnúcleo y kinetoplasto Fig.17 A. La señal correspondiente a los parásitos transfectados con pTEX-G6PDH-GFP, se distribuyó también de manera homogénea a lo largo de todo el cuerpo del parásito,

Resultados G6PDH - 70A1 2 3KN4B1 2 3KN4CkDa66451 2Fig.17. Estudio de localización de la G6PDH cortafusionada a GFP. A) Microscopia defluorescencia correspondiente a epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener transfectados conA) pTEX-GFP, B) pTEX-G6PDH corta-GFP. En ambos casos el núcleo y kinetoplasto fueronteñidos con DAPI y el aparato de Golgi se marcó de acuerdo al protocolo descripto enMateriales y Métodos. Panel 1- señal correspondiente a la GFP (A1) o G6PDH corta-GFP (B1),panel 2: superposición de las señales anteriores con aquellas correspondientes a núcleo ykinetoplasto, panel 3: ubicación de la señal correspondiente al aparato de Golgi con respectoal núcleo y kinetoplasto, panel 4: superposición de las imágenes anteriores. En el caso de losparásitos transfectados con pTEX-G6PDH-GFP, la zona de co-localización entre la señalcorrespondiente a la G6PDH corta-GFP (verde) y aquella correspondiente al aparato de Golgi(rojo) se observa amarilla. C) Western blot correspondiente a la G6PDH de T. cruzi llevado acabo en extractos totales libres de células (150 µg de proteína total) de: línea 1- epimastigotesde T. cruzi transfectados con pTEX-GFP y línea 2- epimastigotes de T. cruzi transfectadoscon pTEX-G6PDH-GFP. En ambos casos se observa la banda de 58 kDa correspondiente a laproteína nativa y en línea 2 se detectó también una banda de aproximadamente 81 kDa demayor intesidad correspondiente a la fusión G6PDH corta-GFP. Como primer anticuerpo seutilizó anti-G6PDH de conejo purificado 1/100, como 2 do anticuerpo anti rabbit-peroxidasa yse reveló por quimioluminiscencia

Resultados G6PDH - 71con la excepción de una zona bastante delimitada en la parte anterior del mismo que presentó mayorintensidad de fluorescencia. Dicha señal se asemejaba bastante en cuanto a su ubicación a la detectadapara la G6PDH por inmunofluorescencia indirecta, sin embargo en este caso dicha señal era algo másdifusa (probablemente debido a la sobre-expresión de la enzima). Al superponer dicha señal con lacorrespondiente al aparato de Golgi se observó que ambas co-localizaban aunque la perteneciente a laG6PDH-GFP presentaba un patrón algo más extendido y difuso (Fig.17 B). Para confirmar que dichaseñal correspondía ciertamente a la fusión G6PDH corta-GFP, se llevó a cabo un experimento de Westernblot (utilizando el anticuerpo anti-G6PDH purificado) en el cual se analizaron extractos totales deepimastigotes controles (transfectados con pTEX-GFP) así como también de epimastigotes transfectadoscon la fusión pTEX-G6PDH-GFP. En ambos casos se detectó la señal correspondiente a la G6PDHnativa de 58 kDa, y en este último también se observó una banda reactiva de 81 kDa de mayor intensidadcorrespondiente a la fusión G6PDH corta-GFP (Fig.17.C). Ante esto, y de acuerdo con este nuevoexperimento, pudimos confirmar que la señal observada en las inmunofluorescencias indirectascorrespondía ciertamente a la G6PDH de T. cruzi.Análisis de la expresión de la G6PDH frente a estrés oxidativo en epimastigotes ytripomastigotes metacíclicos de T. cruzi.El rol de la G6PDH en la defensa contra el estrés oxidativo es un hecho bien estudiado en eritrocitoshumanos. En estas células (que poseen una escasa maquinaria metabólica y en las cuales la expresióngénica no puede ser regulada a causa de la falta de núcleo) la G6PDH representa la única fuente deNADPH. Esto conduce a que una producción disminuida del mismo, causada por alteraciones en dichaenzima afecte directamente la producción de glutatión reducido (GSH), convirtiendo a la célula en mássusceptible al estrés oxidativo y a sufrir lisis. En células nucleadas donde existen otras vías metabólicasademás de la vía de las pentosas fosfato para la producción de NADPH se ha demostrado también,mediante análisis mutacionales, la importancia de la G6PDH en la detoxificación de ROS. Así mutantesnulas para G6PDH de Saccharomyces cerevisiae y células embrionarias de ratón presentaron unamarcada sensibilidad a la presencia de agentes oxidantes [Nogae y col; 1990] [Pandolfi y col; 1995].Se ha determinado también en E. coli que el gen correspondiente a la G6PDH forma parte de unregulón que se activa en respuesta al estrés oxidativo [Storz y col; 1990]. A su vez, en líneas celulareshumanas originadas a partir de distintos tejidos se demostró un aumento transiente en la actividad

Resultados G6PDH - 72específica de la G6PDH (de 2.6 veces) como así también en los niveles de ARN mluego de que dichascélulas eran expuestas a 200 µM de H 2O 2(concentración que no reducía la viabilidad celular) o a 500µM diamida (compuesto que produce disminución en los niveles de GSH intracelular) [Ursini y col;1997]. A partir de estos experimentos dichos autores sugirieron que el gen correspondiente a la G6PDHestaría sujeto a inducción (en condiciones de estrés) aunque también se determinó que en dichascondiciones moléculas de enzima pre-existentes en forma inactiva podían sufrir activación por ladisminución en la relación NADPH/NADP (factor de regulación de la enzima).Mediante la incubación de epimastigotes de T. cruzi clon CL. Brener en presencia de azul de metileno(agente que produce la oxidación del NADPH), Maugeri y Cazzulo [2004] demostraron un aumento enla actividad de la vía de las pentosas fosfato (determinada por medio del análisis del flujo de glucosa através de la rama oxidativa de la vía) con respecto a la correspondiente a parásitos incubados enausencia de dicho compuesto, indicando que la actividad de G6PDH en el parásito (al igual que el restode las G6PDHs) se encuentra sujeta a regulación por parte de la relación NADPH/NADP. Ante estonos pareció relevante determinar si la expresión de dicha enzima podía ser inducida en condiciones deestrés oxidativo (tal como se describió para su homólogo de humanos, ratones y E. coli). De estamanera y utilizando como modelo de estrés oxidativo la incubación de los parásitos en presencia deH 2O 2, decidimos llevar a cabo dichos experimentos con epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener. Talcomo se menciona en la sección Materiales y Métodos las incubaciones se llevaron a cabo en soluciónamortiguadora IB [Carnieri y col; 1993] debido a la imposibilidad de utilizar los medios de cultivosconvencionales ya que sus distintos componentes pueden reaccionar con el H 2O 2disminuyendo suconcentración en la solución. Así inicialmente se puso a punto la concentración de H 2O 2a utilizar mediantela incubación de los parásitos (en placas multi-well) lavados y resuspendidos en solución amortiguadoraIB a razón de 10 7 células/ml, en presencia de distintas concentraciones de H 2O 2(20 µM a 4 mM). Elefecto de las mismas se analizó mediante la observación al microscopio teniendo en cuenta los patronesdescriptos por Das y col [2001] para Leishmanias incubadas en presencia de distintas concentracionesde peróxido de hidrógeno. Estos autores describieron que concentraciones altas de dicho compuestodesencadenaban un proceso de muerte similar a la apoptosis que comenzaba con la pérdida de motilidadde los parásitos y que finalizaba con la muerte celular tomando los mismos forma redondeada (similar ala de los amastigotes) pero con el flagelo extendido. Ante esto, y debido a que nuestra intención eraseleccionar una condición de estrés oxidativo que conservase la viabilidad celular decidimos seleccionarla concentración de H 2O 2para la cual la motilidad de los parásitos no se viese significativamente afectada.De esta manera, los parásitos expuestos a concentraciones superiores a 100 µM presentaron una pérdida

Resultados G6PDH - 73marcada de la motilidad en cortos intervalos de tiempo para posteriormente tomar la forma redondeadacaracterística de los parásitos muertos (el porcentaje de células afectadas aumentaba conforme seaumentaba la concentración del agente oxidante). Aquellos incubados en presencia de 100 µM H 2O 2semantuvieron sin alteraciones durante los primeros 40 min de incubación pero fueron gradualmenteafectados por el agente oxidante obteniéndose luego de 6 hs de incubación sólo un 50 % de parásitosviables. Por su parte aquellos incubados en presencia de 20 µM H 2O 2no sufrieron alteración alguna enlas 6 hs de incubación del experimento. De acuerdo con esto, esta última concentración fue la seleccionadainicialmente para llevar a cabo los experimentos de estrés oxidativo. Dicho ensayo se realizó tal comose describe en la sección Materiales y Métodos. Las muestras para la determinación de la actividadcorrespondiente a la G6PDH se tomaron cada 15 min durante 90 min. Dichas medidas en lugar demostrar un incremento en la actividad específica de la enzima mostraron una marcada disminución de lamisma obteniéndose sólo un 30 % de la actividad inicial a los 90 min de incubación. De manera coincidentecon las medidas de actividad, el ensayo de western blot realizado para analizar la expresión de la enzimaen los extractos totales correspondientes a los distintos tiempos de incubación mostró una disminuciónen la intensidad de la banda correspondiente a enzima conforme se aumentaba el tiempo de incubaciónde los parásitos en presencia de H 2O 2, llegando a hacerse indetectable a los 90 min. A partir de dichoexperimento pudimos determinar entonces que en epimastigotes la expresión de G6PDH no es inducidaen condiciones de estrés oxidativo, por lo que probablemente en esta forma del parásito la única respuestaal mismo que involucre a la enzima sea su activación ante la disminución de la relación NADPH/NADP.De acuerdo con estos resultados, y teniendo en cuenta que las formas biológicas del parásito mayormenteexpuestas in vivo al estrés oxidativo son los tripomastigotes metacíclicos y los amastigotes, y debido aque en dichos estadíos se detectaron mayores niveles basales de expresión de la enzima que enepimastigotes, decidimos llevar a cabo los experimentos de estrés con H 2O 2en tripomastigotesmetacíclicos. Debido a que estos últimos resultaron ser menos afectados por el agente oxidante que losepimastigotes (la pérdida de motilidad de los mismos se detectó a concentraciones mayores de H 2O 2)resultó necesario poner a punto la concentración a ser utilizada en los experimentos subsiguientes. Deacuerdo con esto, se incubaron los parásitos en solución amortiguadora IB a la cual se le adicionó 0, 20,40, 60 y 80 µM del agente oxidante y se incubó las muestras durante 7 hs a temperatura ambiente luegode lo cual los parásitos se centrifugaron y se resuspendieron en Tris HCl 50 mM pH 7.6 ,1mM EDTA,100 µM E64, 0.5 mM TLCK y se llevó a cabo la determinación de actividad de G6PDH. Este análisismostró un aumento en la actividad específica de la misma a partir de 40 µM de H 2O 2. Así a dicha

Resultados G6PDH - 74concentración se registró un aumento del 29 % en la actividad de la enzima con respecto al controlmientras que la incubación de los parásitos en presencia de 60 y 80 µM H 2O 2condujo a un aumento del86 y 89 % respectivamente (en dichas condiciones no se observó efecto alguno sobre la motilidad delos parásitos). De acuerdo con lo antes expuesto, la G6PDH presente en metacíclicos parecía inducirseen respuesta al estrés oxidativo, por lo que para determinar si dicho aumento se debía a un incrementoen la expresión de la proteína y si era posible observar dicho efecto a tiempos de incubación menores alas 7 hs se llevó a cabo un nuevo experimento de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materialesy Métodos. En el mismo los parásitos se incubaron en presencia de 70 µM H 2O 2y se tomaron muestrasa T0 (antes del agregado de H 2O 2) como así también a las 4, 5 y 6 hs después del mismo. Tal como seobserva en la Fig.18. A las medidas de actividad enzimática (expresadas como veces de inducción enpresencia de H 2O 2con respecto al control) mostraron un marcado aumento en la actividad específica dela enzima observándose incrementos de 31, 42 y 46 veces en su actividad a las 4, 5 y 6 hs de incubaciónen presencia del agente oxidante respectivamente. Para determinar si dicho aumento en la actividadespecífica se debía ciertamente a una inducción en la expresión de la enzima se llevó a cabo un ensayode western blot donde se sembraron extractos totales de tripomastigotes metacíclicos correspondientesa los distintos tiempos de incubación. En dicho experimento se utilizaron nuevamente los anticuerposanti-G6PDH purificados en dilución 1/100. Para confirmar que todas las calles tuviesen la mismacantidad de proteína total, una vez revelada la membrana para la G6PDH se realizó el stripping de lamisma y se la incubó en presencia de anti α tubulina (Sigma) en dilución 1/1000. Dicho experimentomostró un aumento significativo en los niveles de G6PDH correspondiente a los 3 tiempos de incubaciónen presencia de H 2O 2con respecto al control (T0) donde se observó tan sólo una banda muy tenuecorrespondiente a la enzima. Para descartar que la inducción en la expresión de la G6PDH pudiese sercausada por alguno de los componentes de la solución amortiguadora IB en lugar de ser una respuestael estrés oxidativo, llevamos a cabo un experimento control en el cual los parásitos fueron incubados endicha solución amortiguadora sin el agregado de H 2O 2durante 6 hs. En dicho ensayo se tomaronalícuotas del cultivo a T0, 4, 5 y 6 hs después de la resuspensión de los mismos en dicha soluciónamortiguadora. En este caso las medidas de actividad específica correspondientes a la enzima semantuvieron constantes a lo largo de todo el experimento, descartándose así que la inducción observadaanteriormente para la G6PDH de T. cruzi fuese causada por la propia solución amortiguadora. Porúltimo y con la intención de determinar si el aumento en la expresión de la G6PDH conducía a algúncambio en el patrón en las inmuno fluorescencias indirectas correspondientes a la enzima, decidimosllevar a cabo estas últimas para cada uno de los tiempos de incubación analizados. En dichas

Resultados G6PDH - 75AG6PDH (veces de inducción)B12Tiempo (hs)TO 4 5 6Tc- G6PDHTiempo (hs)CTO 456Fig.18. Análisis de la inducción en la expresión de la G6PDH en tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi porestrés oxidativo generado por H 2O 2. En este experimento los parásitos fueron incubados en soluciónamortiguadora IB en presencia de 70 µM H 2O 2y se tomaron muestras a las 4, 5 y 6 hs posteriores al agregado delagente oxidante. La muestra inicial (sin H2O2) se denominó T0. A) medidas de actividad correspondientes a laG6PDH de T. cruzi expresadas como veces de inducción en la actividad específica de las muestras incubadas enpresencia de H 2O 2con respecto a la actividad específica del control. B) Western blot correspondiente a extractostotales libres de células (30µg de proteína total por calle) correspondiente a los distintos tiempos de incubaciónantes mencionados. 1- señal correspondiente a la G6PDH de T. cruzi. Como primer anticuerpo se utilizó anti-G6PDH de conejo purificado 1/100. 2- señal correspondiente a α-tubulina. Como primer anticuerpo se utilizó antiα tubulina policlonal de conejo 1/1000 (Sigma). En ambos casos como 2 do anticuerpo se utilizó anti rabbitperoxidasay se reveló por quimioluminiscencia. C) Inmuno fluorescencias indirectas correspondientes a cadauno de los tiempos de incubación. Para detectar la G6PDH se utilizó anti G6PDH de T. cruzi purificado desarrolladoen conejo en dilución 1/50 y como segundo anticuerpo anti-rabbit Alexa Fluor 488 ® 1/1000 (verde). El núcleo ykineoplasto se tiñeron con DAPI.

Resultados G6PDH - 76inmunofluorescencias realizadas de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materiales y Métodosse observó un aumento paulatino en la intensidad de fluorescencia conforme se incrementaba el tiempode incubación con el agente oxidante. Dicho aumento se observó esencialmente en el citosol del parásitosin embargo también se detectó un cierto aumento en la intensidad de fluorescencia correspondiente aaquellos gránulos de mayor tamaño que con anterioridad propusimos como glicosomas como así tambiénun leve aumento en la señal correspondiente a la estructura que en epimastigotes identificamos comoaparato de Golgi (Fig.18 C).

Discusión G6PDH - 77Discusión.Con respecto al análisis genético de la G6PDH de T. cruzi, podemos concluir que la enzima, a diferenciade lo que ocurre con su homólogo de T. brucei, se encuentra codificada por más de un gen, ya que sedetectaron tres secuencias correspondientes a genes completos y potencialmente funcionales y doscorrespondientes a pseudo genes (inactivos). Determinamos también que dichas secuencias se hallandistribuídas en tres de los cromosomas del parásito. El análisis de las mismas obtenidas a partir de ADNgenómico, como así también a partir de ADNc (derivadas de los experimentos de 5´-RACE) nospermitió determinar la presencia de dos posibles codones de iniciación de la traducción separados unode otro por 111pb y observados también en la G6PDH de T. brucei. Ambos marcos abiertos delectura codificaron para proteínas activas que pudieron se expresadas en E. coli como proteínasrecombinantes (con un tracto de 6 residuos de histidina en su extremo amino terminal) y purificadas porcolumna de Ni 2+ . Los estudios de filtración en gel llevados a cabo con la G6PDH cortade T. cruzidemostraron que la forma activa de la enzima es un dímero en buena concordancia con otras G6PDHs,aunque en algunas especies como en ratones y humanos la enzima se encuentra en un equilibrio rápidoentre dímero y tetrámero. Tal como se mencionó con anterioridad la enzima de Leuconostocmesenteroides es la única G6PDH que ha sido cristalizada hasta el momento por lo que ha sido utilizadaampliamente para llevar a cabo el modelado molecular de sus homólogos de otros organismos. Dichaproteína también es dimérica y si bien los monómeros poseen una estructura compacta, el dímero resultóser bastante extendido con una distancia de más de 100 Å entre la Arg 46(responsable de la unión del 2’fosfato del NADP) de cada uno de sus monómeros. A partir de dicha estructura ha sido posible establecerque sólo un 11 % de la superficie de los monómeros queda oculta en la interfase del dímero y que lamisma se encuentra formada por la asociación de hojas-β y helices-α pertenecientes al dominio C-terminal de la enzima.Muchas de las características observadas para las G6PDH recombinantes de T. cruzi se asemejan a lasdeterminadas por Wenderoth y col [1997] para sus homólogos de plantas. Tal como se mencionó conanterioridad, las actividades correspondientes a la G6PDH cortay G6PDH largade T. cruzi resultaron sermuy afectadas luego de su purificación por columna de Ni 2+, hecho que se vió reflejado en la escasarecuperación de actividad obtenida al final de la purificación (independientemente de la concentraciónde imidazol utilizada para la elución). Un efecto similar, aunque más pronunciado se describió para la

Discusión G6PDH - 78G6PDH de papa (tanto para la isoforma citosólica como la de cloroplastos) para las cuales se estableció+ +la imposibilidad de utilizar tanto columnas de Ni 2como de Cu 2para purificar dichas enzimasrecombinantes debido a la inactivación total de las mismas. Un análisis más detallado de esta inactivacióndemostró que la actividad de la G6PDH era fuertemente afectada por la presencia de cationes divalentessiendo el efecto inhibitorio más pronunciado para Zn 2+ > Ni 2+ > Co 2+ > Cu 2+ y que la actividad perdidano podía ser recuperada mediante la incubación de la proteína en presencia de EDTA o mediante eldesalado de las muestras. Estas observaciones condujeron a postular que las G6PDH de plantas seinactivarían en los primeros momentos de la purificación al ponerse en contacto las enzimas recombinantescon la matriz de Ni 2+ [Wenderoh y col; 1997]. Este último postulado sería potencialmente extrapolable ala enzima de T. cruzi, aunque no hemos llevado a cabo estudios de la actividad enzimática en presenciade cationes divalentes como para poder atribuir a los mismos de forma fehaciente la inactivación deambas G6PDHs. Otra característica compartida entre la G6PDH nativa y G6PDH largarecombinante deT. cruzi con la isoforma de cloroplastos de plantas (sujeta a regulación redox) es su inactivación enpresencia de DTT. Esta enzima posee 6 residuos de cisteína que se encuentran ubicados dentro de unasecuencia de 100 residuos de aminoácidos de longitud situada en el extremo amino terminal de laproteína, dos de los cuales están estrictamente conservados y han sido involucrados en dicha regulaciónredox [Wenderoth y col; 1997]. De esta manera, la enzima es inactivada por reducción (en presenciade luz) por el sistema ferredoxina/tiorredoxina para evitar interacciones fútiles con el ciclo de Calvin (lasimultánea síntesis de carbohidratos por parte del primero, y su catabolismo por parte de la vía de laspentosas fosfato) durante la fotosíntesis. Esta inactivación ocurre a través de un intercambio reversibleentre la forma reducida (di-thiol), y oxidada (puente disulfuro) de los dos residuos de cisteína conservadosentre las isoformas plastídicas de distintas plantas superiores (ubicadas en un loop expuesto al solventeen la estructura tridimensional de la enzima.). De esta manera, en tejidos autotróficos la G6PDH decloroplastos solamente es activa en la oscuridad mientras que la isoforma citosólica es insensible a lapresencia de agentes reductores. Estas diferencias condujeron a que el método utilizado de rutina paradistinguir ambas isoformas en extractos totales de plantas sea la determinación de actividad de G6PDHen presencia y ausencia de DTT. Por su parte, la G6PDH sujeta a regulación redox de cianobacteriasposee un comportamiento similar a la de cloroplastos de plantas superiores ya que es regulada tambiénpor la reducción y oxidación de un par de cisteínas, sin embargo se ha demostrado que no existeconservación alguna entre la ubicación (dentro de la secuencia) de dichas cisteínas y aquellas propuestascomo regulatorias en su homólogo de cloroplastos.

Discusión G6PDH - 79Ante lo expuesto, y habiendo determinado que la G6PDH largade T. cruzi es la isoforma sensible al DTTy que los únicos residuos de cisteína diferenciales que posee con respecto a la G6PDH cortason aquellospresentes en la extensión amino terminal de la primera, llegamos a la conclusión de que dichas cisteínaspodrían estar formando un puente disulfuro que estabilice de alguna manera la estructura de la enzimapreservando su actividad. El hecho de que la G6PDH largade T. cruzi al igual que la enzima de T. bruceiy Leishmania, posean una inusual extensión N-terminal (que recuerda a aquella presente en las isoformasde G6PDH de cloroplastos) sumado a la inhibición en presencia de DTT observada para la enzima deT. cruzi, conduce nuevamente a la hipótesis del endosimbionte algal de los tripanosomátidos, a partir delcual se piensa que hubo transferencia de genes cuyas características iniciales se fueron suavizando através de la evolución sin llegar a perderse completamente. Existen varias posibilidades con respecto acuál de las isoformas se expresa mayoritariamente en el parásito, si nos basamos en las medidas deactividad enzimática llevadas a cabo en los extractos totales de los distintos estadíos de T. cruzi y surespuesta al DTT podríamos concluir que, tal como se mencionó anteriormente, la enzima que se expresa(al menos de manera mayoritaria) en el parásito es la G6PDH larga. Este punto se ve reforzado por elvalor de K maparente para G6P determinado en extractos totales de epimastigotes de T. cruzi que es delorden del obtenido para dicha enzima. Sin embargo, el análisis del western blot llevado a cabo enextractos totales correspondientes a las cuatro formas del parásito, mostró que la única banda detectadaen epimasigotes, tripomastigotes de cultivo y amastigotes poseía una masa molecular aparente de 58kDa (peso molecular correspondiente a la G6PDH corta) y que únicamente en tripomastigotes metacíclicosse observaba una proteína de mayor peso molecular (62 kDa). Ante esto surgen varias opciones: 1) sinos basamos estrictamente en el patrón obtenido en el ensayo de western blot podría decirse que laG6PDH cortase expresa en epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes de cultivo y que la forma largade la enzima se expresa únicamente en tripomastigotes metacílicos. Esta opción, sin embargo, es bastantepoco probable debido a que no puede ser correlacionada en absoluto con las medidas de actividadenzimática mencionadas anteriormente. 2) otra hipótesis sería que ambas enzimas se estén expresandoen el parásito siendo mayoritaria la G6PDH corta(detectada en los western blot) pero que debido a subaja actividad específica contribuya muy poco a la actividad total de la enzima. En estas condiciones laG6PDH largapodría estar expresándose en menor proporción (siendo no detectable en los western blots)pero contribuyendo a la actividad detectada en extractos totales (en este caso deberíamos considerarque el desplazamiento hacia arriba de la banda reactiva observada en metacíclicos se deba a un artefactode la corrida). 3) Por último podemos proponer también que la enzima que se expresa mayoritariamentees la G6PDH largaque en geles de poliacrilamida corre con una masa molecular aparente menor a la

Discusión G6PDH - 80calculada y nuevamente que el mayor peso molecular de la banda detectada en tripomastigotesmetacíclicos sea un artefacto de la técnica. Esta hipótesis se ve reforzada por el hecho de que tanto laG6PDH cortacomo la G6PDH largarecombinantes (con el tracto de 6 histidinas y residuos de aminoácidoscorrespondientes al sitio de corte para trombina en su extremo amino terminal) presentaron en geles depoliacrilamida una masa molecular aparente menor a la calculada (57 kDa en lugar de 60.7 kda paraprimera y 61.6 kDa en lugar de 65.7 kDa para la segunda). En estas condiciones la presencia de uncomponente minoritario correspondiente a la G6PDH cortatampoco puede ser descartado.Tal como se mencionó con anterioridad los valores de K maparentes tanto para sustrato como paracofactor correspondientes a ambas isoformas de T. cruzi son del orden de los obtenidos para sushomólogos de T. brucei y humanos; sin embargo los valores correspondientes a la constante catalíticadifieren sustancialmente con los informados por Cohen y col [1975] para esta última. Dichos autorespresentaron una K catpara la G6PDH de eritrocitos humanos de 190seg -1 mientras que el valor máselevado que obtuvimos (para la G6PDH larga) fue de tan sólo 7.1 seg -1 . Estas diferencias tan marcadasprobablemente se relacionen (en parte) con la inactivación parcial que sufren ambas proteínas al serpurificadas por columna de Ni 2+ . Dicha inactivación conduce a que parte de las moléculas presentes enla solución (que aportan a la masa de proteína total y por lo tanto afectan el valor de µmoles de enzimapresentes en la solución) se encuentren inactivas o parcialmente inactivas de manera tal que afecten lavelocidad máxima de la reacción y por lo tanto el valor de la K catcalculada. Por otro lado, se debe teneren cuenta que la G6PDH de T. cruzi posee tan sólo un 33 % de identidad con su homólogo de humanospor lo que pueden existir variaciones entre ambas enzimas que conduzcan a dichas divergencias. Unejemplo de ello es la falta de conservación en la G6PDH de T. cruzi en algunos residuos descriptoscomo relevantes en la conservación de la estabilidad de la enzima humana y que forman parte de algunasde las variantes genéticas de la misma que conducen a diversos tipos de anemias hemolíticas. Dichoanálisis lo llevamos a cabo en base al estudio realizado por Naylor y col [1996] sobre la distribuciónespacial de dichas mutaciones en un modelo molecular de la enzima humana llevado a cabo utilizando laestructura tridimensional de la G6PDH de Leuconostoc mesenteroides como molde. En dicho estudiolos autores establecieron que la mayor parte de los contactos entre los monómeros de la enzima ocurrena través de interacciones hidrofóbicas, aunque para la enzima de Leuconostoc se ha propuesto tambiénla presencia de tres puentes salinos inter-subunidad (cuyos residuos de aminoácidos no se encuentranconservados en la mayoría de las G6PDHs) que se encontrarían estabilizando el dímero. De esta manera,se determinó que en la G6PDH humana la mutación Glu 274-Lys, presente en una de las variantes genéticaspara la enzima, conduce a la pérdida del puente salino inter-subunidad Glu 274-Arg 348conduciendo a

Discusión G6PDH - 81tener una proteína con una marcada inestabilidad térmica. Por su parte, algunas variantes como Phe 216-Leu, Val 213-Leu y Met 405-Ile poseen interacciones hidrofóbicas disminuídas conduciendo también a lapérdida de estabilidad del dímero [Naylor y col; 1996]. Mediante la comparación de la secuencia de laG6PDH de T. cruzi y la humana y la localización dentro de las mismas de todos aquellos residuos deaminoácidos para los cuales se observaron mutaciones en esta última (Fig.5) nos fue posible detectar, talcomo se mencionó con anterioridad, algunas divergencias entre ambas. Así 8 de los 15 residuos variablesen la enzima humana Val 213, Phe 216, Glu 274, Ser 278, Arg 393, Pro 396, Arg 387y Gly 410, resultaron estarestrictamente conservados en la G6PDH de T. cruzi mientras que los 7 restantes presentaban variacionescon respecto a los presentes en la enzima humana no mutada y tampoco se correlacionaron con aquellospresentes en las mutantes de la enzima. De acuerdo con esto la Val 394que es reemplazada por Lys enuna de las variantes humanas (Val 394-Lys) apareció como Ala en tripanosomátidos, lo mismo ocurriócon la Met 405-Ile que resultó ser Treo en T. cruzi. Algo similar ocurrió con Lys 386-Glu, Gln entripanosomátidos, Cys 385-Arg, Thr en T. cruzi, Asn 365-Lys, Glu y Arg 439-Pro, Ser en tripanosomátidos(Fig.5). Ante esto, y habiendo detectado variaciones en 7 residuos involucrados en la desestabilizacionde la G6PDH humana podemos inferir (suponiendo que ambas enzimas poseean un plegamiento similar)que la enzima de T. cruzi es más inestable que su homólogo de humanos. Este último hecho se viodirectamente reflejado en la imposibilidad de llevar a cabo la purificación de la enzima nativa del parásitodebido a las marcadas pérdidas de actividad enzimática registradas en los distintos pasos de purificaciónque hicieron imposible el seguimiento de la misma.Con respecto a la localización subcelular de la G6PDH de T. cruzi, los experimentos deinmunofluorescencia indirecta llevados a cabo utilizando los anticuerpos anti-G6PDH purificadosmostraron que la enzima posee una localización esencialmente citosólica en los cuatro estadíos delparásito. Sin embargo, en tripomastigotes metacíclicos, amastigotes y tripomastigotes del cultivo seobservó también señal en unas estructuras granulares distribuidas al azar dentro del cuerpo del parásitoque por su morfología podrían ser glicosomas [Quiñones y col; 2004]. Sin embargo, dicha localizaciónno pudo ser comprobada debido a la imposibilidad de llevar a cabo estudios de co-localización con lapiruvato fosfato di-kinasa (PPDK), una enzima considerada como marcadora de esta organela [Bringaudy col; 1998] debido a que, tal como se mencionó con anterioridad, ambos anticuerpos fueron desarrolladosen conejo. Si bien no pudimos detectar dentro de las secuencias correspondientes a la G6PDH de T.cruzi ninguna señal de reclutamiento glicosomal tipo PTS 1o PTS 2, la presencia de una pequeña fraccióncorrespondiente a la enzima en dicha organela estaría de acuerdo con los experimentos de fraccionamientosubcelular llevados a cabo por Maugeri y col [2004] donde, si bien la mayor parte de la actividad

Discusión G6PDH - 82correspondiente a la enzima fue detectada en la fracción citosólica, también se detectó un pequeñocomponente particulado para la misma que se distribuyó entre la fracción microsomal (donde sedimentael retículo endoplásmico y Golgi) y en mucha menor proporción en la fracción de gránulos chicos(donde se encuentran principalmente los glicosomas). Se debe tener en cuenta que dichos experimentosfueron realizados con epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener estadío en el cual no nos fue posibledetectar un patrón glicosomal para la enzima probablemente por la escasa proporción de la mismadistribuida en esta organela con respecto a la fracción citosólica. Ante lo expuesto, si fuese posiblerealizar un experimento de fraccionamiento subcelular con los demás estadíos del parásito probablementela proporción de la actividad correspondiente a la proteína presente en la fracción de gránulos chicossea bastante mayor que la detectada en epimastigotes. Para la G6PDH de T. brucei se postula tambiénque parte de la actividad correspondiente a la enzima se encuentra localizada en glicosomas aunquepara dicha proteína no se han encontrado tampoco señales de reclutamiento glicosomal (PTS1 o PTS2)dentro de la secuencia que justifiquen dicha localización [Duffieux y col; 2000]. Este supuesto se establecióen base a estudios de fraccionamiento subcelular (llevados a cabo por los mismos autores) quienesdetectaron un 40 % de la actividad total correspondiente a la enzima asociada con a un materialparticulado que sedimentaba en gradientes de sacarosa a la misma densidad que el marcador glicosomal.Sin embargo dicha localización no fue comprobada mediante inmunofluorescencias indirectas. Paraexplicar la presencia de la proteína en dicha organela aún en ausencia de las señales de reclutamientoantes mencionadas, Druffrieux y col [2000] propusieron que la enzima podría entrar a los glicosomaspor medio de la interacción con otra proteína que presentara alguna de dichas señales, y particularmentepropusieron su interacción con la 6-fosfoglucono lactonasa que posee una señal de tipo PTS 1en suextremo carboxilo terminal.Mediante la co-localización de la señal de mayor intensidad de fluorescencia observada en epimastigotes(en la parte anterior del parásito) con BODIPY ® TR C 5-ceramida pudimos inferir que parte de la G6PDHde T. cruzi presente en epimastigotes y potencialmente en tripomastigotes metacíclicos se encuentraasociada al aparato de Golgi. Para confirmar dicha localización llevamos a cabo la fusión pTEX-G6PDH corta–GFP. Los parásitos transfectados con dicha fusión presentaron fluorescencia homogéneaen todo el citosol excepto por una región de mayor intensidad ubicada en la zona anterior del parásitocon un patrón similar, aunque más difuso, que el observado por inmunofluorescencia indirecta. Al llevara cabo la co-localización de dicha señal con aquella correspondiente a la BODIPY ® TR C 5-ceramida,observamos que ambas señales eran superponibles aunque aquella correspondiente a la G6PDHcorta-GFP se presentaba como más extendida que la primera probablemente debido a la sobreexpresión.

Discusión G6PDH - 83Estos experimentos nos permitieron por lo tanto confirmar que parte de la G6PDH se encuentra localizadaen el aparato de Golgi. Hasta el momento no existen evidencias de la presencia de proteínas solubles enel lumen de dicha organela ya que todas aquellas que han sido detectadas son proteínas integrales demembrana o proteínas asociadas a la cara citosólica de la misma [Munro; 1998] y la mayor parte deestas últimas se encuentran involucradas en la conservación de la estructura de la organela. Con respectoa este último punto se ha comprobado que existe más de una manera de interacción de dichas proteínascon la cara externa del aparato de Golgi ya que se han detectado polipéptidos asociados (medianteinteracciones proteína-proteína) a la cola citosólica de aquellas que poseen dominios trans-membrana,y también se han detectado polipéptidos asociados directamente a la membrana de la organela. Deacuerdo con esto aún no ha sido posible determinar cual es la característica particular de la membranadel Golgi que es reconocida por dichas proteínas y que permite su asociación a la misma y no a la deotras organelas. Para algunas proteínas periféricas de Golgi de mamíferos como la glutatión decarboxilasa,la sCG10 y oxido nítrico sintasa endotelial, ha sido posible determinar la secuencia necesaria y suficientepara su asociación a la cara externa de dicha organela [Solimena y col; 1994]. En estas proteínas dichaseñal se localiza dentro de los 30-35 residuos de aminoácidos pertenecientes al extremo N-terminal desu secuencia polipeptídica, sin embargo se comprobó que no existe conservación alguna entre las mismas.Sólo fue posible determinar que esas regiones se encuentran aciladas y que dicha acilación pareceríacontribuir a su asociación a la membrana. Sin embargo, la acilación no es un fenómeno exclusivo de lasproteínas asociadas a la membrana del Golgi sino que también se ha detectado en proteínas asociadasa otras membranas por lo que, tal como se mencionó con anterioridad, el factor que otorga la especificidada estas asociaciones aún no ha sido determinado [Munro; 1998]. Otras proteínas, como la GCP60 delevadura (Golgi complex associated protein of 60 kDa) se encuentra asociada al aparato del Golgi pormedio de interacciones proteína-proteína a Giantina (una proteína que se encuentra anclada a la membranadel mismo a través de su extremo C-terminal y que posee la mayor parte de su cadena polipeptídicaprotruyendo hacia el citoplasma). La naturaleza de la interacción GCP60-Giantina aún es desconocida,sin embargo se ha identificado la región necesaria y suficiente para esta interacción. Dicha región posee152 residuos de aminoácidos, se ubica en el extremo C-terminal de la proteína y carece de los motivostípicos de interacción proteína-proteína [Sohda y col; 2001]. Debido a que la G6PDH de T. cruzi noposee dominios hidrofóbicos que puedan funcionar como secuencia transmembrana, se piensa quedicha enzima se encuentra asociada a la cara externa del aparato de Golgi tal vez mediante asociación aotras proteínas. Ya que, tal como se expuso anteriormente, existen grandes variaciones entre las secuenciaspropuestas como responsables de la asociación de proteínas a la cara externa de esta organela no nos

Discusión G6PDH - 84ha resultado posible determinar qué parte de la secuencia correspondiente a la G6PDH de T. cruzi seencuentra involucrada en dicha interacción. El hecho de que la fusión G6PDH corta-GFP se haya localizadoen parte en el aparato de Golgi indica que la secuencia responsable de la interacción no se encuentraentre los 37 residuos de aminoácidos pertenecientes en la extensión N-terminal de la G6PDH largay sibien no llevamos a cabo la fusión de esta última a GFP para analizar su localización pensamos quepotencialmente podría distribuirse de igual manera que la G6PDH cortaya que ambas proteínas se diferenciansolamente en la extensión amino terminal. La única excepción a lo antes expuesto y que conduciría atener una localización diferente para la G6PDH largasería que dicha extensión N-terminal interfiera con laasociación proteína-proteína propuesta por impedimentos estéricos. Otra conclusión que nos fue posibleobtener a través de los experimentos de localización llevados a cabo con los parásitos transfectados fueque dicha asociación no requiere que la proteína se encuentre en su estado nativo (dímero), ya que secomprobó mediante la comparación de medidas de actividad enzimática de extractos controles(correspondientes a parásitos transfectados con pTEX-GFP) y aquellos correspondientes a parásitostransfectados con pTEX-G6PDH-GFP que la proteína de fusión carece de actividad enzimática,probablemente debida a la imposibilidad de formar la estructura dimérica necesaria para su actividad.De estos experimentos pudimos concluir también que dicha interacción no requiere que el extremocarboxilo terminal de la proteína se encuentre libre ya que la GFP había sido fusionada al C-terminal dela G6PDH corta .En cuanto a la relevancia fisiológica de la presencia de la G6PDH en el aparato de Golgipudimos establecer dos hipótesis: una de ellas tiene que ver con el posible rol establecido para la 6-fosfoglucono lactona como agente capaz de causar reacciones de modificación covalente in vivo comoser glicosilaciones y carbamilaciones debido a que es un compuesto altamente electrofílico [Rakitzis ycol; 1998]. Debido a que la 6-fosfogluconolactona se genera únicamente a través de la G6PDH, elhecho de haber encontrado una fracción de dicha enzima en aparato de Golgi indicaría que potencialmentepodría estar involucrada de manera indirecta en reacciones de glicosilación. Sin embargo, este últimopunto es algo controvertido si se tiene en cuenta que anteriormente postulamos que la enzima se encontraríaasociada a la cara externa del aparato de Golgi. La segunda hipótesis y tal vez la más acertada seríaque fracción correspondiente a la G6PDH ubicada en aparato de Golgi y glicosomas se encuentreinvolucrada en la protección de membranas frente al estrés oxidativo mediante la generación de NADPH.Llegamos a esta conclusión debido a que en T. cruzi ha sido identificado un grupo de peroxidasasdependientes de glutatión cuya función principal es la de metabolizar hidroperóxidos de ácidos grasos yfosfolípidos localizadas en glicosoma (TcGPXI) y fracción microsomal (TcGPXII) [Wilkinson y col;2000]. Estas enzimas estarían involucradas por lo tanto, en la prevención de peroxidación de lípidos y

Discusión G6PDH - 85lípidos de membrana dentro del REG y Golgi, y debido a que forman parte del sistema tripanotionatripanotionareductasa dependen del NADPH provisto por la rama oxidativa de la vía de las pentosas.Con respecto a los experimentos de estrés oxidativo podemos concluir que el hecho de haber detectadouna disminución en la actividad específica de la enzima en lugar de inducción en la expresión de lamisma en epimastigotes podría explicarse de acuerdo a lo siguiente: si se tiene en cuenta que losepimastigotes de T. cruzi usualmente no se enfrentan a estrés oxidativo es posible inferir queprobablemente dichos parásitos posean una resistencia intrínseca menor al estrés que las formas delparásito que si se encuentran usualmente sometidas al mismo (amastigotes y tripomastigotes metacíclicos).Esto se vió reflejado en la mayor sensibilidad a distintas concentraciones de H 2O 2detectada enepimastigotes con respecto a los tripomastigotes metacíclicos. El hecho de no haber detectado inducciónde la G6PDH sinó disminución de la actividad específica de la misma en epimastigotes podría debersea la activación de proteasas dentro de la célula, en respuesta a los daños celulares causados por elestrés, que lleven a degradación de proteínas intracelulares. Ante esto, podemos proponer que enepimastigotes, la respuesta de la G6PDH al estrés oxidativo está relacionada únicamente con un aumentoen la velocidad de la enzima al disminuir la relación NADPH/NADP por consumo del primero siendo lascantidades de NADPH así generadas suficientes para cubrir las necesidades del sistema tripanotionatripanotionareductasa de dicha forma del parásito. Tal como se mencionó con anterioridad, lostripomastigotes metacíclicos presentaron mayor actividad específica correspondiente a la enzima quelos epimastigotes, y al ser sometidos a estrés oxidativo se observó una sustancial inducción en dichaactividad con respecto al control. No nos fue posible establecer a partir de que momento comienza adetectarse la inducción en la expresión de la enzima ni cuanto tarda en volver a los niveles basalesdebido a la escasa cantidad de muestra (tripomastigotes metacíclicos) disponibles para cada uno de losexperimentos. Los analisis llevados a cabo por Salvemini y col [1999] donde se analiza la inducción dela G6PDH en células Hela causada por estrés oxidativo generado por diamida, mostraron que lainducción en la expresión de la enzima comienza a observarse a tiempos tan cortos como 10 min (dondelos niveles de GSH se encuentran marcadamente disminuidos) para volver a sus niveles normales a las 8hs después de iniciado el experimento donde los concentración de GSH se encuentran restablecida.Nuestros experimentos mostraron que los tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi son capaces deinducir la expresión de la G6PDH frente a condiciones de estrés oxidativo probablemente para suplir ala célula de mayor poder reductor conferido por el NADPH utilizado en las reacciones de detoxificaciónde ROS. Pensamos también que dicha respuesta probablemente sea extrapolable a los amastigotes deT. cruzi

Discusión G6PDH - 86De esta manera nos ha resultado posible confirmar que la G6PDH de T. cruzi juega un rol importanteen la protección del parásito frente al estrés oxidativo, al menos en aquellos estadíos del parásito que seencuentran naturalmente sometidos a estrés.

6 -fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH)

Resultados 6PGDH - 87ResultadosIdentificación, clonado y análisis del número de genes de la 6PGDH deTrypanosoma cruzi.Con la finalidad de llevar a cabo el clonado del gen de la 6PGDH de T. cruzi, se realizaron sucesivasbúsquedas en distintas bases de datos utilizando el programa TblAstN y la secuencia aminoacídica de la6PGDH de Trypanosoma brucei (P31072) como molde. A partir de dichas búsquedas se obtuvo unúnico resultado positivo, un EST (AI057839) de T. cruzi de 840 pb de longitud que presentaba uncodón de terminación en la base 377 y pertenecía a la división de ESTs (expressed sequence tags) deGenBank. El análisis de esta secuencia permitió determinar que las primeras 377 pb poseían un 69 % deidentidad con el 3´ del gen de la 6PGDH de T. brucei. Para completar la secuencia del marco abierto delectura (ORF) de su homólogo de T. cruzi se llevó a cabo la técnica de amplificación rápida de losextremos 5’ de ADN c(5´-RACE) utilizando tres oligonucleótidos anti sentido: Pr 1-5’-CTTGTCTAGCCGCTCGTA-3’, Pr 2-5’-GAGCACGGGAGCGTCAA-3’, Pr 3-5’-GGCACAGAGCAGGTTACTTA-3’ diseñados en base a la secuencia del EST antes mencionado. Deesta manera, el Pr 1fue utilizado para la síntesis de ADN c, de acuerdo al protocolo descripto en Materialesy Métodos, para posteriormente emplearlo como molde en la siguiente reacción de PCR. En dichareacción, como oligonucleótido sentido se utilizó parte de la secuencia del splice leader de T. cruzi Pr-T. cruzi EST (AI057839)SL132 bp5’ UTRNdeIT. cruzi 6PGDH gene (1434 bp)SacI3’ UTRPr SLATGPr-3Pr-2TGAPr-1Fig.1. Esquema correspondiente al ORF de la 6PGDH de T. cruzi y secuencias flanqueantes. En dicho esquemase representa el EST de T. cruzi (AI057839) (cuyas primeras 840 pb correponden al gen de la 6PGDH) como asítambién la posición de los oligonucleóticos anti sentido diseñados en base su secuencia del (Pr-1, Pr-2 y Pr-3) paraobtener el extremo amino terminal del ORF mediante la técnica de 5’-RACE. También se encuentran señalados laregión no codificante del 5’ de 132 pb y el oligonucleótido sentido diseñado en base a la secuencia del splice leaderde T. cruzi (Pr-SL).

Resultados 6PGDH - 88SL-5’-AACGCTATTATTGATACAGTTT-3’., y como anti sentido el Pr 1. Luego, mediante sucesivasreacciones anidadas de PCR utlizando siempre el Pr-SL como sentido, y los Pr 2y Pr 3como antisentido (Fig.1), fue posible obtener el extremo 5’-del gen de la 6PGDH de T. cruzi. Las reacciones dePCR se llevaron a cabo utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización: 94 ºC, 45 seg.; pegadodel oligonucleótido: 54 ºC, 45 seg y elongación 72 ºC, 90 seg. De esta manera, luego de la tercerareacción de PCR se logró amplificar un producto específico de 1325 pb, que fue purificado a partir degeles de agarosa, clonado en el vector pGEM-T Easy (Promega) y totalmente secuenciado. Así, lasecuencia completa de 1434 pb correspondiente al marco abierto de lectura (ORF) de la 6PGDH de T.cruzi, se obtuvo mediante la superposición de la secuencia del EST (AI057839) con la del fragmentode 1325 pb mencionado anteriormente.Para determinar la organización genómica de la 6PGDH de T. cruzi, se llevaron a cabo experimentos deSouthern blot donde se utilizaron como sonda, tanto el gen completo de la 6PGDH de T. cruzi, como lasecuencia correspondiente al EST (AI057839), (ambos marcados con P 32 ). De esta manera, cuando elADN genómico fue digerido con enzimas de restricción cuyos sitios de corte se encontraban ausentesdentro del ORF, se obtuvieron bandas únicas (NotI, XhoI, NheI, NcoI y BamHI) o dobles bandas(XbaI y HindIII), independientemente de la sonda utilizada (Fig.2). A su vez, cuando la digestión sellevó a cabo con NdeI (enzima que corta una vez dentro del gen de la 6PGDH de T. cruzi), se obtuvierontres bandas reactivas cuando el ORF correspondiente a la enzima fue utilizado como sonda, y tan sólouna de ellas cuando la membrana fue hibridizada con el EST (Fig.2, flechas en la calle 8). Por su parte,cuando el ADN fue digerido con SacI (enzima que también posee un único sitio de corte dentro delORF), se obtuvieron tres bandas reactivas cuando el gen completo fue utilizado como sonda, mientrasque una de ellas se perdió al hibridizar la membrana con el EST (Fig.2, flecha en la calle 9). El análisisde los resultados obtenidos permitió sugerir la presencia de un único gen correspondiente a la 6PGDHpor genoma haploide de T. cruzi clon CL Brener. A su vez, los patrones correspondientes a las enzimasNheI y SacI, sugirieron la existencia de variaciones entre los alelos, río arriba y río debajo del ORF dela 6PGDH, respectivamente. Esto fue confirmado por el análisis de 13 GSS (genomic sequence survey),aparecidos con posterioridad en la base de datos de T. cruzi de TIGR y varias secuencias obtenidasmediante reacciones independientes de PCR. A partir de dicho análisis fue posible formar dos gruposbien definidos de secuencias correspondientes al gen completo de la 6PGDH. Ambos grupos diferían entan sólo 9 nucleótidos dentro del ORF, que conducían a la variación en 5 residuos de aminoácidosN59K, I204V, N390K, M395L, y T403R (que no comprometían residuos involucrados en la catálisiso en la unión del sustrato). A su vez, tal como se había sugerido a partir de los resultados del análisis de

Resultados 6PGDH - 89Southern blot, las secuencias presentes río arriba y río abajo del ORF correspondiente a la enzimadiferían considerablemente entre ambos grupos.ANdeISacI6PGDHSonda 1Sonda 2BKbSonda 11 2 3 4 5 6 7 8 9Sonda 21 2 3 4 5 6 7 8 99.08.07.06.05.04.0Fig.2. Análisis del número de genes correspondiente a la 6PGDH de T. cruzi por Southern blot. A) Esquema delgen de la 6PGDH de T. cruzi donde se señala la posición de las enzimas de restricción de corte único utilizadas. Sonda1: gen completo de la 6PGDH de T. cruzi. Sonda 2: EST AI057839. B) Autorradiografía correspondiente al ensayo deSouthern blot utilizando sonda 1 (izquierda) y sonda 2 (derecha). El ADN genómico fue digerido con, Línea 1: NotI,línea 2: XhoI, línea 3: NheI, línea 4: NcoI, línea 5: BamHI, línea 6: XbaI, línea 7: HindIII, línea 8: NdeI y línea 9: SacI.Clonado del gen de 6PGDH de T. cruzi en el vector de expresión pET 28 a(+).Tal como se mencionó con anterioridad, mediante la superposición de la secuencia del EST (AI057839),con la del fragmento de 1325 pb amplificado por PCR, fue posible obtener la secuencia correspondienteal ORF de la 6PGDH de T. cruzi. Con la finalidad de amplificar dicho gen por PCR a partir de ADNgenómico de epimastigotes del clon CL Brener y posteriormente clonarlo en el vector de expresiónpET28a (+), se diseñaron dos oligonucleótidos flanqueantes a los codones de iniciación y terminaciónde la traducción de dicho gen. Al oligonucleótido sentido 6PGDH s-5’-AACTTTAAGTGCTAGCATGGACGTTGGCATT-3’ se le agregó un sitio de corte para la enzima derestricción NheI (itálica), mientras que al anti sentido 6PGDH as-5’-AAATTCCCGAGTCGACTCACTGTAGCTCCGGCC-3’ se le adicionó un sitio SalI para permitir

Resultados 6PGDH - 90el clonado direccional del gen en el vector de expresión (también itálica). La reacción de PCR se llevóa cabo tal como se describe en la sección Materiales y Métodos, realizando el pegado de losoligonucleótidos a 65 ºC y las extensiones a 72 ºC durante 2 min. Una vez finalizada dicha reacción elproducto de amplificación de 1466 pb, se purificó a partir de geles de agarosa, se ligó a pGEM-T Easy,y se secuenció completamente. Aquí fue posible nuevamente identificar los dos grupos de secuenciascorrespondientes al gen de la 6PGDH antes mencionados que se registraron bajo los siguientes númerosde acceso de GenBank TM : AY300924 y AY300925. Posteriormente, se liberaron dichas secuencias delpGEM-T Easy mediante digestión con NheI y SalI, y se clonaron en pET28a (+) (vector que dirige laexpresión de la proteína recombinante con una corrida de 6 residuos de histidina en su extremo aminoterminal, bajo el control del promotor T7Lac).Análisis de la secuencia primaria de la 6PGDH de T. cruzi.La secuencia aminoacídica de la 6PGDH de T. cruzi derivada a partir del gen se comparó con aquellascorrespondientes a sus homólogos de T. brucei (P31072), Leishmania major (AAF64172), eritrocitoshumanos (P52209), y E. coli (AAA23918) (Fig.3). La mayor identidad se obtuvo con la 6PGDH de T.brucei (78.6 %), seguida por Leishmania major (73.2 %). Una mayor divergencia se detectó conaquellas pertenecientes a E. coli y eritrocitos humanos que presentaron un 35 % y 32.1 % de identidadcon respecto a la enzima de T. cruzi, respectivamente.La 6PGDH de T. brucei, al igual que el resto de las 6PGDHs, es una enzima dimérica. Cada monómeroposee tres dominios: el dominio amino terminal o de unión a coenzima, que involucra los residuos deaminoácidos 1 a 178; el dominio central (todo hélice) que comprende los residuos 179 a 441; y porúltimo los 37 residuos de aminoácidos correspondientes al extremo C-terminal de la proteína, esencialespara la dimerización [Phillips y col; 1998]. La enzima dimérica posee dos sitios de unión a cofactorcomo así también dos de unión a sustrato. Dichos sitios son idénticos e independientes y los últimos seencuentran constituídos por residuos pertenecientes a ambas subunidades. La 6PGDH de T. cruzicomparte con su homóloga de T. brucei la misma secuencia de unión a dinucleótidos ( 7 GLGVMG 12 )que se diferencia de la informada para las 6PGDHs de mamíferos por poseer una Gly en la terceraposición en lugar de la canónica Ala (GXAXXG). El cambio de A por G permitiría un acercamientomayor del NADP a la enzima. A su vez, la 6PGDH de humanos y ovejas posee una Phe en la posición83 que protruye dentro del bolsillo de unión a coenzima disminuyendo su tamaño. En tripanosomátidos,

Resultados 6PGDH - 91* * * * * ** * * *T.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHT.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHT.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHT.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHT.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHT.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHT.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHT.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHT.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHT.cruzi 6PGDHT.brucei 6PGDHL.major 6PGDHE.coli 6PGDHHuman 6PGDHFig.3. Alineamiento de 6PGDH pertenecientes a distintas especies. Las secuencias de aminoácidos derivadas apartir de los genes de 6PGDH de T. cruzi (AY300924), 6PGDH de Trypanosoma brucei (P31072), 6PGDH de Leishmaniamajor ( AAF64172), 6PGDH de E. coli (AAA23918), y 6PGDH humana (P52209) fueron alineadas por el método deClustal. Con asteriscos se señalan los residuos de aminoácidos que comprenden el sitio de unión a coenzima, y conlíneas horizontales se marca el sitio de unión a sustrato.en cambio, dicha Phe se encuentra ausente siendo reemplazada por una Thr. El cambio en los residuosde aminoácidos antes mencionados probablemente contribuya también a un mayor acercamiento delNADP, viéndose esto reflejado en una mayor afinidad (por parte de las enzimas de tripanosomátidos)

Resultados 6PGDH - 92por el cofactor (ver más adelante) [Barrett y col; 1994]. En la secuencia correspondiente a la 6PGDHde T. cruzi, fue posible también identificar el residuo más importante involucrado en la especificidad delas 6PGDHs por el NADP, la Arg 31, que une el grupo 2’ fosfato de la coenzima. Todos los residuosque componen el sitio de unión a sustrato se encuentran también conservados, siendo la Arg 452 (en lasecuencia de T. cruzi) uno de los residuos de mayor importancia. Dicho aminoácido se encuentraestrictamente conservado en todas las 6PGDHs, se ubica dentro del bolsillo de unión a sustrato, y hademostrado ser crucial para la actividad de la enzima ya que jugaría un rol fundamental en el anclado del6PG mientras este es decarboxilado a Ru-5P [Tetaud y col; 1999] (Fig.3). Usualmente las 6PGDHsson enzimas diméricas, y el modo de dimerización, con el dominio C-terminal de una subunidad cruzandopor sobre la otra se encuentra conservado entre las distintas especies. Las 6PGDHs de la mayoría delos eucariotas poseen un dominio C-terminal desestructurado, de 48 residuos de aminoácidos de longitudrico en glicinas y serinas que se extiende más allá del dímero protruyendo hacia el solvente. Las 6PGDHsde T. cruzi, T. brucei y Leishmania en cambio, poseen un dominio C-terminal más corto (de 37residuos de aminoácidos de longitud) altamente cargado. Estos residuos se encuentran conservados enlos tres parásitos y juegan un rol fundamental en la dimerización de la enzima (Fig.3). En la 6PGDH deT. brucei, 13 de los 37 residuos de aminoácidos son Asp, Glu, His o Arg y 5 de los mismos seencuentran formando puentes salinos inter-subunidad que hacen más estrecha la unión entre los monómerosy por lo tanto la estabilizan. Dos de los mencionados grupos cargados (pertenecientes al dominio C-E463R464D466R259E134R459K139D246E477H253Fig.4. Estructura tridimensional de la 6PGDH de T. brucei, forma dimérica. Los residuos de aminoácidos que seencuentran formando los puentes salinos inter-subunidad se encuentran señalados.

Resultados 6PGDH - 93terminal) forman dichos puentes con dos residuos de aminoácidos pertenecientes al dominio de unión acoenzima Arg459 →Glu134 , y Glu477 →Lys139, mientras que el resto se encuentra formando puentessalinos con residuos pertenecientes al dominio central “todo hélice”: Glu463 →Arg 259, Arg464→Asp246, Asp466 →His255 [Phillips y col; 1998] (Fig.4). En la 6PGDH de T. cruzi, en cambio, sólotres de los cinco puentes salinos mencionados anteriormente podrían estar presentes Arg457 →Glu132,Glu475 →Lys137 y Asp464 →Asp246, debido a sustituciones en el dominio todo hélice de la enzima(Fig.5).6PGDH T.brucei6PGDH T.cruziE132K137H253R457E461R462D464E475E134K139D246H255R259R459E463R464D466E477Fig.5. Esquema de las secuencias aminoacídicas de la 6PGDH de T. brucei y T. cruzi. Los residuos involucradosen la formación de los puentes salinos se hallan señalados (los residuos de aminoácidos D244 y R257 se encuentranausentes en la enzima de T. cruzi siendo reemplazados por residuos no cargados).Expresión de la 6PGDH recombinante de T. cruzi.kDa66 -45 -29 -1 2 3 4Fig.6. Análisis de la expresión y purificación de la6PGDH recombinante de T. cruzi. SDS PAGE 10 % teñidocon Nitrato de Plata. Línea 1: extracto total libre de célulasde E. coli BL21 codón Plus (DE 3) transformadas con pET28 a (+) sin inserto inducido, línea 2: extracto total libre decélulas de E. coli BL21 codón Plus (DE 3) transformadascon pET 28 a (+)-6PGDH no inducido, línea 3: extractototal libre de células de E. coli BL21 codón Plus (DE 3)transformadas con pET 28 a (+)-6PGDH inducido, línea 4:6PGDH recombinante de T. cruzi purificada por IMAC.La 6PGDH de T. cruzi se expresó en E.colicomo una proteína recombinante con una corridade 6 residuos de histidina en su extremo aminoterminal tal como se describe en Materiales yMétodos. Las condiciones de inducción sepusieron a punto variando la temperatura comoasí también el medio de cultivo utilizado. De estamanera, la utilización del medio mínimo M9 auna temperatura de 18 ºC, fueron las mejorescondiciones encontradas para disminuir laformación de cuerpos de inclusión (que dificultande manera pronunciada la ruptura de la células)y favorecer la aparición de proteína

Resultados 6PGDH - 94recombinante en la fracción soluble. Utilizando las condiciones de inducción antes mencionadas, fueposible obtener buenas cantidades de la proteína recombinante que fue posteriormente purificada porIMAC de acuerdo al protocolo descripto en Materiales y Métodos. La proteína recombinante purificadapresentó una masa molecular aparente de subunidad (determinada por SDS PAGE) de 51,8 kDa (Fig.6) en buena correlación con la masa molecular calculada 53,8 kDa. El rendimiento de dicha purificaciónfue del 97%, y la actividad específica de la enzima purificada fue de 32 unidades.mg -1 . Para corroborarla identidad de la proteína purificada y descartar una posible contaminación con la 6PGDH de E. coli se1009080A1591.82002.12565.432743.4% Intensidad705060403020821.41008.411063.521380.61602.31838.12256.042289.92367.0532569.32870.683135.53100800.0 1440.4 2080.8 2721.2 3361.6 4002.0Masa (m/Z)B Fig.7. Análisis por espectrometría de masas de los péptidos obtenidos mediante de la digestión tríptica en gel dela 6PGDH recombinante de T. cruzi. A: Espectro de la relación masa/carga correspondiente a dichos péptidos(aquellos que pudieron ser identificados como correspondientes a la 6PGDH de T. cruzi se encuentran señalados enrojo). B: Tabla donde se muestran las masas determinadas y calculadas de los péptidos antes mencionados, como asítambién su posición dentro de la secuencia de la proteína y composición aminoacídica de cada uno de ellos. Ladigestíon tríptica in silico se llevó a cabo con la secuencia correspondiente a la G6PDH recombinante de T. cruzi(incluído el tracto de 6 residuos de His y los residuos de aminoácidos pertenecientes al sitio de corte para trombina),por lo tanto, la posición de los péptidos mencionados en la tabla se encuentra incrementada en 16 aminoácidos conrespecto a su posición en la Fig.3.

Resultados 6PGDH - 95realizó digestión tríptica en gel (tal como se describe en Materiales y Métodos), y análisis de los péptidosobtenidos por espectrometría de masas. Las masas moleculares de los péptidos detectados fueroncomparadas con aquellas obtenidas mediante la digestión in silico de la 6PGDH de T. cruzi y de E. coli(esto se llevó cabo por medio del programa Peptide Mass disponible en www.expasy.org). Siete de lospéptidos obtenidos experimentalmente pudieron ser identificados como pertenecientes a la 6PGDH deT. cruzi (Fig.7), confirmándose así la identidad de la proteína.La 6PGDH recombinante purificada mostró una marcada pérdida de actividad enzimática en cortosintervalos de tiempo presentando una notable dependencia por la presencia de agentes reductores,como así también una notoria inactivación a concentraciones de imidazol superiores a 100 mM. Dichainactivación pudo ser subsanada sólo parcialmente mediante el agregado de un agente reductor (DTT)4 mM concentración final, inmediatamente después de la purificación y manteniendo la concentraciónde imidazol en niveles que no superasen los 100 mM. Sin embargo, aún utilizando las condiciones antesmencionadas, la necesidad de llevar a cabo sucesivas diluciones de la enzima para la determinación desus parámetros cinéticos, incrementó de manera muy pronunciada la pérdida de actividad enzimática,sugiriendo que dicha inactivación pudiera deberse a fenómenos de disociación (ver más adelante). Estasobservaciones tuvieron buena correlación con la marcada inactivación registrada previamente al intentarllevar cabo la purificación de la 6PGDH “nativa” de T. cruzi (a partir de extractos totales de epimastigotesde Cl Brener) que hicieron imposible su purificación a homogeneidad. Otra característica importanteobservada tanto para la 6PGDH nativa como recombinante fue la imposibilidad de congelar aquellasmuestras que contuviesen la enzima, ya que un único ciclo de congelamiento-descongelamiento conducíaa la pérdida de más del 90 % de la actividad enzimática. De acuerdo con esto, las muestras sólo podíanser conservadas a 4 ºC por cortos períodos de tiempo.Determinación de la masa molecular aparente de la 6PGDH activa.La determinación del peso molecular de la 6PGDH recombinante activa, se llevó a cabo medianteexperimentos de filtración en gel en Superdex G200, tal como se describe en la sección Materiales yMétodos. Así cuando la enzima recombinante era cromatografiada inmediatamente después de lapurificación, la proteína era eluída de la columna en un único pico (con actividad de 6PGDH) con una

Resultados 6PGDH - 96masa molecular aparente de 93 kDa. Esto demostró que en su forma activa, la 6PGDH de T. cruzi aligual que el resto de las 6PGDHs es un homodímero (Fig 8).2.52.0Absorbancia (mU).40302010Log PM1.51.00.5y=-1.7195x+4.7104R 2 =0.991901.3 1.5 1.7 1.9 2.1Ve/Vo93 kDa.0.80.60.40.210 20 30 40mlFig.8. Determinación de la masa molecular aparente de la 6PGDH activa por filtración en gel. Perfil de eluciónde la 6PGDH recombinante de T. cruzi en Superdex-G200. Al ser cromatografiada inmediatamente después de supurificación la proteína eluye en un único pico que presenta actividad de 6PGDH y que posee una masa molecularaparente de 93 kDa.Modelado molecular y mutaciones sitio dirigidas de la 6PGDH de T. cruzi.Se ha demostrado que la dimerización es esencial para la actividad de las 6PGDHs debido a que, talcomo se mencionó anteriormente, cada sitio activo de la enzima se encuentra constituído por residuosde aminoácidos correspondientes a ambas subunidades. Ante esto hemos propuesto que las marcadaspérdidas de actividad enzimática registradas para la 6PGDH de T. cruzi, sobre las cuales se habló conanterioridad, podrían deberse a la disociación de la estructura dimérica de la enzima (causada porinteracciones débiles entre los monómeros). Esto podría deberse a la falta de 2 de los 5 puentes salinosque se encuentran estabilizando el dímero de la enzima de T. brucei y estaría provocado (tal como semencionó con anterioridad) por el reemplazo de dos residuos de aminoácidos en el dominio todo hélicede la 6PGDH de T. cruzi. La ausencia de dichos puentes conduciría a una mayor propensión aldesensamblaje de la estructura dimérica de la enzima, y por lo tanto a la pérdida de su actividad. Con laintención de llevar a cabo la estabilización de la proteína se pensó en realizar mutaciones puntuales en eldominio todo hélice de la 6PGDH de T. cruzi (específicamente en las posiciones 244 y 257), paraintroducir los residuos de aminoácidos cargados necesarios para la formación de los puentes faltantes.Debido a que dicha aproximación sólo podría resultar potencialmente exitosa si la 6PGDH de T. cruziy T. brucei poseían un plegamiento similar que asegurase una conservación en las distancias entre los

Resultados 6PGDH - 97residuos involucrados en la formación de dichos puentes, se llevó a cabo el modelado molecular de la6PGDH de T. cruzi, en base a la estructura tridimensional de los monómeros de su homólogo de T.brucei (ver Materiales y Métodos). Ambas deshidrogenasas mostraron un plegamiento muy similarhaciendo de esta manera más promisorio el intento de estabilización de la enzima de T. cruzi por mediode las mutaciones antes mencionadas (Fig.9). Así y de acuerdo al protocolo descripto en Materiales yFig.9. Modelado molecular de la 6PGDH de T. cruzi en base a la estructura tridimensional de su homólogo de T.brucei. En azul se presenta el monómero modelado de la enzima de T.cruzi y en rojo la estructura correspondiente auno de los monómeros de la 6PGDH de T. brucei (1PGJA).Métodos, se llevaron a cabo las mutaciones V244D y C257R. La 6PGDH recombinante doble mutantese expresó en E. coli de acuerdo al protocolo mencionado con anterioridad y fue purificada por IMACen las mismas condiciones utilizadas para la purificación de la enzima salvaje, no mutada. Para compararla estabilidad de la doble mutante con la de esta última, ambas enzimas se purificaron en el mismomomento y su actividad enzimática se determinó a intervalos de tiempo definidos en distintas condicionesa saber: 1) En presencia de Tris HCl 50 mM pH 7.5, 500 mM ClNa conteniendo 100 mM imidazol, cono sin el agregado de 4 mM DTT o 2) En presencia de la misma solución amortiguadora conteniendo 300mM imidazol, con o sin el agregado del agente reductor (Fig. 10). En dicho experimento, la 6PGDH nomutada, incubada en presencia de 300 mM imidazol, y en ausencia del agente reductor mostró lapérdida de más del 50 % de la actividad enzimática en los primeros 5 min de incubación. La enzimadoble mutante, en cambio, sufrió el mismo decaimiento en su actividad en 30 min. En estas condiciones,

Resultados 6PGDH - 98la adición de DTT sólo protegió parcialmente a ambas enzimas de la inactivación (Fig.10 A). Cuando lasmuestras fueron incubadas en presencia de 100 mM imidazol, el agregado de DTT pareció no afectardemasiado la actividad de la enzima doble mutante (al menos en el tiempo en que se llevó a cabo elexperimento). Sin embargo, su presencia fue crucial para mantener la actividad de la 6PGDH nomutada (Fig.10 B). A su vez, en un intento de corroborar si la mayor estabilidad de la enzima doble0AActividad (%)B1001010 40 80 120 160Tiempo (min)DM + DTTSAL + DTTDM - DTTSAL - DTTFig.10. Comparación deestabilidad entre las 6PGDHrecombinantes de T. cruzi salvaje ydoble mutante. Las enzimasrecombinantes fueron incubadas a 4°C in presencia de la soluciónamortiguadora de eluciónconteniendo 300 mM imidazol (A) o100 mM imidazol (B). Los símbolosabiertos corresponden a la 6PGDHrecombinante no mutada (0.3 mg.ml -1), y los cerrados a la doble mutante(0.24 mg.ml -1 ).Actividad (%)100DM + DTTDM - DTTSAL + DTT10SAL - DTT0 315 630 945 1260Tiempo (min)mutante era una consecuencia de la conservación de su estado dimérico a lo largo del tiempo, sellevaron a cabo sucesivas cromatografías de filtración el gel (en Superdex G200), de acuerdo al protocolodescripto anteriormente. En dicho experimento ambas proteínas recombinantes (no mutada y doblemutante) se purificaron por columna de Ni 2+ en Tris HCL 50 mM pH 7.5, 500 mM ClNa, 100 mMimidazol. Se agregó DTT 4 mM final a cada uno de los eluídos y se cromatografiaron inmediatamentedespués de su purificación, como así también 5 hs. y 24 hs después de la misma. De esta manera, laenzima no mutada mostró un único pico activo con una masa molecular aparente de 93 kDa,

Resultados 6PGDH - 99correspondiente a la forma dimérica de la enzima, cuando esta fue cromatografiada inmediatamentedespués de su purificación (Fig.11 A1); sin embargo, cuando la misma muestra fue cromatografiada 5 hsdespués de su purificación, se observó un segundo pico (con una masa molecular aparente de 45 kDa),sin actividad enzimática, correspondiente a la forma monomérica de la enzima (Fig.11 A2). 24 hs.después de su purificación dicha muestra había sufrido la pérdida del 40 % de su actividad, y al sercromatografiada se observó una marcada disminución en el pico correspondiente al dímero, como asítambién un aumento en el pico correspondiente a la forma monomérica de la enzima (Fig.11 A3). La6PGDH doble mutante, por su parte no sufrió una inactivación significativa en el período de tiempoensayado, y un único pico, con actividad enzimática, correspondiente a la forma dimérica de la enzima,se observó en los tres intervalos de tiempo ensayados (Fig.11 B1-3). De esta manera, se determinó queABAbsorbancia (mUA)403020104030201040302010403020101231101010BD2020202001503030306644291712.4404040mlmlmlO hr5 hr24 hrFig.11. Perfiles cromatográficos enSuperdex G200 de las 6PGDHrecombinantes de T. cruzi salvaje ydoble mutante. 1) Muestrasresueltas inmediatamente despuésde su purificación; 2) muestrasresueltas 5 hs después de supurificación; 3) muestras resueltas 24hs después de su purificación. A)6PGDH recombinante salvaje deT.cruzi (0.5 mg.ml -1 ); B) 6PGDHrecombinante doble mutante (0.24mg.ml -1 ). Las flechas verticales seencuentran señalando el volumen deelución de los estándares de masamolecular utilizados (los valorescorresponden a kDa). BD: Blue Dextran.Entre cada corridacromatográfica las muestras semantuvieron a 4°C en la soluciónamortiguadora de elución enpresencia de 100 mM imidazol y 4mM DTT.Absorbancia (mUA)403020104030231010202030304040mlmlO hr5 hr201010203040ml24 hr

Resultados 6PGDH - 100una de las causas de la pérdida de actividad enzimática observada en la enzima no mutada estabarelacionada con la aparición del monómero libre (inactivo) y se confirmó que la mayor estabilidad de ladoble mutante era debida a la conservación de su estructura dimérica. Debido a que la mayor pérdidade actividad enzimática en la proteína no mutada era causada por fenómenos de disociación, y a queestos se hacían más pronunciados al llevar a cabo diluciones de la enzima, se pensó que el agregado deuna proteína enzimáticamente inerte como la BSA, podría ayudar en la estabilización de la misma. Deesta manera se determinó que el agregado de BSA a una concentración final de 2 mg.ml -1 permitíaprevenir e incluso revertir en cierto grado la inactivación de la enzima.Determinación de pH óptimo y parámetros cinéticos.El pH óptimo para la reacción catalizada por la 6PGDH recombinante se determinó de acuerdo alprotocolo descripto en Materiales y Métodos. La máxima actividad enzimática se registró a pH 8.4. Sinembargo, los estudios de estabilidad a los distintos valores de pH ensayados (llevados a cabo mediantela incubación de la enzima durante 10 min. en las distintas soluciones amortiguadoras), mostraron unamarcada inactivación de la misma a pH extremos, siendo de aproximadamente un 30 % en el rango de8.4 a 9.8 (Fig. 12) indicando la imposibilidad de trabajar al pH óptimo para la enzima. De esta manera,la determinación de los parámetros cinéticos de la 6PGDH de T. cruzi se llevó a cabo utilizandoTrietanolamina 50 mM pH 7.5 como solución amortiguadora.Actividad (µmol.min -1 .ml -1 )9.08.07.06.05.04.03.02.01.0sin inc.inc. 10 min.Fig.12. Determinación de pH óptimo dela 6PGDH recombinante de T. cruzi. ElpH óptimo para la enzima recombinantese determinó tal como se describe en lasección de Materiales y Métodos.6.0 7.0 8.0 9.0 10.0pH

Resultados 6PGDH - 101La determinacion del K maparente para sustrato y cofactor se llevó a cabo (de acuerdo al protocolodescripto en la sección Materiales y Métodos) tanto para la enzima salvaje (no mutada) (Fig.13) comopara la doble mutante (Fig.14). Esto se realizó a los fines de comparar la afinidad de ambas enzimas porsu sustrato y cofactor y de esta manera descartar cualquier alteración en los parámetros cinéticos causadapor la doble mutagénesis. La representación gráfica de los datos obtenidos se llevó a cabo mediante lasrectificaciones de Lineweaver-Burk, y de Woolf. Ambas representaciones fueron utilizadas para ladeterminación de los K maparentes (para sustrato y cofactor) debido a que permiten visualizar de maneradiferente la distribución de los datos. Los valores obtenidos por ambos métodos fueron totalmentecomparables entre si y como así también entre ambas enzimas (ver Fig.13 y 14).Fig.13ADeterminación de Km ap para sustrato y cofactor de la 6PGDH recombinante de T. cruzi (no mutada)Lineweaver-Burk plotWoolf plot[6PG] /V-1/K m-K mBLineweaver-Burk plot Woolf plot-1/K m -K m[NADP] /V

Resultados 6PGDH - 102Fig.14ADeterminación de Km ap para sustrato y cofactor de la 6PGDH recombinante "doble mutante" de T. cruzi .Lineweaver-Burk plotWoolf plot[6PG] /V-1/K m -K mLineweaver-Burk plot Woolf plotB[NADP] /VDebido a marcada inestabilidad de la enzima no mutada, que hacía imposible su utilización en ensayoscinéticos de larga duración (como la determinación de K mreales o ensayos de inhibición), la enzimadoble mutante fue utilizada para la realización de dichos estudios, ya que como se mencionó conanterioridad presenta una mayor estabilidad que la primera.La determinación del Km real para sustrato y cofactor se llevó a cabo variando la concentración de6PG (a distintas concentraciones fijas de NADP), tal como se describe en la sección Materiales yMétodos. De esta manera, los valores de K mreal se determinaron a partir de gráficos secundarios de lasintersecciones y pendientes correspondientes a las rectas derivadas de la representación de Lineweaver-Burk de los datos experimentales (Fig.15). Los valores obtenidos fueron Km real 6PG: 18 ± 0.4 µΜ,Km real NADP 4.87 ± 0.2 µΜ. La constante catalítica calculada fue de 98 s-1.

Resultados 6PGDH - 103A1 K = m 6PG(1+ K s NADP 1 1) * + (1+ K m NADP[NADP])V Vmax[6PG] Vmax [NADP]ym x bBOrd. al origen1/VmaxPendiente-1/K m NADPK m 6PG/VmaxFig.15. Determinación de los parámetros cinéticos (K mreales para 6PG y NADP) de la 6PGDH recombinantedoble mutante de T. cruzi.El tipo de gráfico obtenido anteriormente (con las rectas intersectándose a la izquierda del eje y), estaríaindicando un mecanismo de reacción de tipo secuencial. De acuerdo con esto, y en un intento dediscernir si se trataba de un mecanismo secuencial al azar (de equilibrio rápido) o secuencial ordenado,se llevaron a cabo ensayos de inhibición por producto. Así, los estudios de inhibición por NADPHcon respecto al NADP, llevados a cabo variando la concentración de NADP para distintasconcentraciones del inhibidor y manteniendo el 6PG en concentración saturante (1 mM), mostraron unainhibición de tipo competitiva con un valor de Ki : 4.7 µM. Los ensayos de inhibición por NADPH conrespecto al 6PG en cambio, llevados a cabo variando la concentración de 6PG (para distintasconcentraciones fijas del inhibidor) y manteniendo el NADP saturante (0.5 mM), mostraron un perfil deinhibición de tipo mixto (Fig.16). Por su parte, los estudios de inhibición llevados a cabo con Ru-5Pcon respecto al 6PG, mostraron un patrón de inhibición de tipo a-competitiva. Este último resultado no

Resultados 6PGDH - 104fue tenido en cuenta debido a la posibilidad de la presencia de impurezas en la Ru-5P que pudiesenestar actuando también como inhibidores para la enzima. La imposibilidad de utilizar la Ru-5P comoinhibidor condujo a tener un análisis incompleto de la inhibición por producto de la 6PGDH de T. cruzino pudiéndose definir con exactitud el mecanismo de reacción para la 6PGDH de T. cruzi. Sin embargo,Fig.16.Inhibición por NADPH con respecto al NADP.s/NADPHPendiente-K iInhibición competitiva:1=K m( 1 + I ) 1 + 1V V max K i S V maxInhibición por NADPH con respecto al 6PGs/NADPHInhibición mixta :1 K=m( 1 + I ) 1 + 1 ( 1 + I V V max K i S V max K i«)

Resultados 6PGDH - 105estudios de inhibición llevados a cabo posteriormente con 2-deoxi-6PG (un análogo del sustrato)mostraron perfiles de tipo competitivo con respecto al 6PG (ver más adelante). Esto sugiere que elmecanismo de reacción más probable para la enzima de T. cruzi es secuencial al azar de equilibriorápido.Detección de actividad de 6PGDH en extractos totales de T cruzi, purificaciónparcial de la enzima nativa y determinación de sus parámetros cinéticos.Con la finalidad de determinar la actividad de la 6PGDH en los distintos estadíos del ciclo de vida de T.cruzi del clon CL Brener, se obtuvieron extractos totales libres de células (tal como se describe enMateriales y Métodos) y se llevaron a cabo las determinaciones de actividad enzimática porespectrofotometría tal como se mencionó con anterioridad. Las medidas de actividad específica asíobtenidas mostraron que la mayor actividad para la enzima se encuentra en tripomastigotes metacíclicos(0.1 µmol.min -1 .mg -1 ) mientras que epimastigotes, amastigotes y tripomastigotes de cultivo presentaronactividades específicas similares (0.05, 0.041 y 0.038 µmol.min -1 .mg -1 respectivamente). Por otra partese llevó a cabo también la determinación de la actividad específica de la enzima en extractos totales deepimastigotes de otras cepas y clones de T. cruzi. Los valores así obtenidos indicaron una gran similitudentre los mismos siendo 0.049 µmol.min -1 .mg -1 para Tul 2, 0.045 µmol.min -1 .mg -1 para RA y 0.048µmol.min -1 .mg -1 para Dm28c.Como la finalidad última de la producción de la 6PGDH recombinante doble mutante de T. cruzi era suutilización en estudios de inhibición (debido a la importancia de dicha enzima como posible blanco paraquimioterapia) se consideró necesario establecer si los parámetros cinéticos determinados para la proteínarecombinante se asemejaban a los correspondientes a la enzima nativa. De esta manera se llevó a cabola purificación parcial de la 6PGDH de T. cruzi, a partir de un extracto libre de células de epimastigotesdel clon CL Brener (de acuerdo al protocolo descripto en la sección Materiales y Métodos). Luego delúltimo paso de dicha purificación la recuperación de la actividad enzimática fue de tan sólo un 11 %habiéndose purificado la proteína 25 veces (tabla 1). Las fracciones correspondientes a los distintospasos de purificación fueron analizadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (teñidos conCoomasie Brillant Blue) y Western blot. En ambos casos, previamente a su siembra las muestras fueronconcentradas mediante precipitación con ácido tricloro acético (TCA 10 %). El gel teñido con CoomassieBlue mostró una marcada disminución en el número de bandas conforme se avanzaba en la purificación,

Resultados 6PGDH - 106Muestra Act. Esp (U.mg -1 ) Unidades totales % Recuperación Veces de purificaciónExt. TotalepimastigotesEluído BlueSepharosaEluído 2'- 5'-ADPSepharosa0.059 2.59 100 -0.64 1.96 75.7 10.81.50 0.28 10.8 25.4Tabla 1. Tabla de purificación correspondiente a la 6PGDH nativa de T. cruziAB44332211kDa.664529kDa.664529Fig.17. Purificación parcial de la 6PGDHnativa de T. cruzi. A) SDS PAGE 10 % teñidocon Coomasie Brillant Blue. Línea 1: 6PGDHrecombinante 0.5µg, línea 2: extracto total librede células de epimastigotes de CL Brener, 800 µgde proteína total; línea 3: Eluído de BlueSepharosa, 10 µg de proteína total; línea 4: eluídode 2’-5’ ADP Sepharosa, 40 µg de proteína total.B) Western blot utilizando como primeranticuerpo anti-6PGDH de ratón en dilución 1/250, las muestras se sembraron en igual orden ycantidad que en el gel (A).llegando a obtenerse 6 bandas proteicasmayoritarias y otras tantas de menor intensidad enel eluído de la columna de 2’-5’ ADP Sepharosa(Fig.17.A). Mediante el ensayo de Western blot(donde se utilizaron los anticuerpos anti 6PGDHdesarrollados en ratón en una dilución 1/250), fueposible detectar la proteína nativa solamente en lafracción correspondiente al último paso de lapurificación. La banda reactiva detectada poseíauna masa molecular aparente de 46,6 kDa (menora aquella correspondiente a la proteínarecombinante que se había colocado como controlpositivo en el Western blot) (Fig.17 B). Esteresultado fue acorde a lo esperado ya que la6PGDH recombinante posee en su extremo N-terminal los 6 residuos de histidina como así tambiénlos residuos de aminoácidos que conforman el sitiode corte para trombina, haciendo que la masamolecular aparente calculada para dicha enzima seamayor a la calculada para la proteína nativa.Por otro lado, a pesar de que la cantidad sembradade extracto total de epimastigotes de CL Brenerfue muy elevada (aprox 800 µg), no fue posibledetectar una banda reactiva en dicho extracto,

Resultados 6PGDH - 107indicando que la 6PGDH nativa representa un muy bajo porcentaje de la proteína total, no siendoposible detectarla hasta tanto se obtenga una fracción enriquecida en dicha enzima.Este ensayo de Western blot permitió también determinar la especificidad de los anticuerpos anti 6PGDHde ratón que iban a ser utlizados para llevar a cabo la determinación de la localización subcelular de laenzima mediante inmufluorescencia. Dichos anticuerpos, a pesar de no estar purificados, no presentaronreacción cruzada con otras proteínas, ya que no se detectaron bandas inespecíficas (aún después desembrar 800 µg de proteína total correspondiente al extracto de epimastigotes de CL Brener).Fig.18.Determinación de Km ap para sustrato y cofactor de la 6PGDH nativa de T. cruzi .ALineweaver-Burk plotWoolf plotLineweaver-Burk plotWoolf plot1/V (µmol -1 .min. ml)[NADP] /V1/V (µmol -1 .min. ml)[6PG] /V-1/K m1/[6PG] (µM -1 )-K m[6PG] µMK m ap 6PG: 22.6 µM K m ap 6PG: 22.7 µMB-1/K 1/[NADP] (µM -1 )[NADP] µMmK m ap NADP: 3.1 µM-K mK m ap NADP: 2.8 µM

Resultados 6PGDH - 108Una vez finalizada la purificación antes mencionada, la fracción eluida de 2’-5’ ADP Sepharosa(conteniendo la 6PGDH nativa de T. cruzi), fue utilizada para la determinación del K maparente parasustrato y cofactor tal como se describe en Materiales y Métodos. Los valores obtenidos fueron muysimilares a aquellos determinados para la 6PGDH recombinante no mutada y doble mutante, ya quelos valores de K maparente para el 6PG y NADP obtenidos fueron 22.6 µΜ y 3.0 µΜ respectivamente(Fig.18). Estos resultados permitieron confirmar que la realización de aquellos ensayos tendientes adeterminar el mecanismo de reacción de la enzima, como así también los estudios de inhibición de la6PGDH de T. cruzi (utilizando la 6PGDH recombinante doble mutante, era una aproximación totalmenteválida ya que enzima nativa y las recombinantes poseen la misma afinidad por su sustrato y cofactor, conla ventaja de que la enzima doble mutante posee una mayor estabilidad que permite trabajar concomodidad obteniéndose, por lo tanto, resultados más confiables.Estudios de inhibición de la 6PGDH de T. cruzi.Los estudios de inhibición de la 6PGDH recombinante doble mutante de T. cruzi se llevaron a cabocon algunos de los inhibidores desarrollados para la 6PGDH de T. brucei, proporcionados por la Dra.Stefania Hanau, perteneciente al Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidadde Ferrara, Italia.Dichos inhibidores fueron diseñados en base a estudios cristalográficos llevados a cabo tanto con laenzima de T. brucei como con su homólogo de oveja. Estos estudios mostraron que a pesar de que losresiduos de aminoácidos pertenecientes al centro activo de ambas enzimas se encontraban conservados,existían diferencias en su localización espacial que podían ser explotadas para el diseño de inhibidoresespecíficos. La mayor diferencia fue encontrada en el bolsillo de unión del OH perteneciente al C 2delsustrato que es considerado de importancia para la comunicación entre las subunidades del homodímeroy para la tautomerización ceto-enólica que forma parte del mecanismo de reacción de la enzima. Losprimeros estudios de inhibición de la 6PGDH de T. brucei se llevaron a cabo con análogos del 6PG (2-deoxi 6PG, análogos del 6PG protegidos en el C 2mediante la introducción de un grupo CH 3, como asítambién la combinación de ambos). Estos compuestos poseían mejores propiedades farmacocinéticasque los carbohidratos fosforilados que son marcadamente inestables y presentan alta dificultad paraatravesar membranas. Un análogo del 6PG por el cual la enzima de T. brucei mostró poseer mucha másafinidad que su homólogo de oveja (Ki 4.4 µM y 770 µM respectivamente), fue el 2-deoxi 6PG, sin

Resultados 6PGDH - 109embargo, este compuesto (como así también otros pertenecientes a la misma familia), se comportaroncomo inhibidores débiles ya que sus constantes de inhibición presentaron valores mayores que el K mpara el 6PG [Pasti y col; 2003]. A causa de esto se comenzó a trabajar en el desarrollo de otro tipo deinhibidores, análogos del estado de transición y de los intermediarios de alta energía presentes en lareacción. De acuerdo con el mecanismo propuesto para las 6PGDHs [Berdis y col; 1993] [ Hanau ycol; 1992], estos compuestos serían el 3-ceto 6PG y el 1,2 enediol intermediario (de alta energía). Se hademostrado que algunos derivados de azúcares con grupos fosfato y fosfonatos, presentaron una inhibiciónselectiva para la enzima de T. brucei con respecto a su homólogo de oveja. El mejor de estos compuestosha sido el 4-fosfo eritronato K i (T. brucei)0.13 µM K i (oveja)10.7 µM. Se ha propuesto que estos inhibidoresse unen a la enzima por medio de su grupo fosfato. El 4-fosfo eritronato estaría mimetizando el enediolintermediario de la reacción, ya que su C 1se encontraría en la misma posición que el C 2del enediol, y eldoble enlace presente en este último entre el C 1y el C 2estaría siendo mimetizado por la unión entre elC 1y el oxígeno del carboxilato del 4-fosfoeritronato [Pasti y col; 2002]. Dardonville y col; [2003] haninformado que dos de los inhibidores diseñados para la 6PGDH de T. brucei, un 2,4-dideoxi análogodel 6PG y un 2-metil 4-deoxi (también análogo del 6PG), presentaron una moderada toxicidad in vitrocontra amastigotes de T. cruzi. Recientemente, y en un intento de mejorar estos análogos de intermediariospara hacerlos más estables y aumentar su permeabilidad a través de membranas, Dardonville y col;[2004], han diseñado análogos del 3-ceto 6PG que poseen un grupo sulfóxido en el C 3que mimetiza lapolarización del doble enlace entre el C 3y el oxígeno del mencionado ceto derivado, como así tambiéncompuestos conteniendo ácido hidroxámico. El ácido 4 fosfo-D-eritronohidroxámico mimetizaría el 1,2enediol intermediario de alta energía mencionado anteriormente. Estos últimos compuestos mostraronser potentes inhibidores contra la enzima de T. brucei con constantes de inhibición del orden nanomolar, sin embargo, estudios de toxicidad in vitro llevados a cabo con amastigotes de T. cruzi mostraronque ninguno de ellos es efectivo contra este parásito.Los inhibidores probados para la 6PGDH de T. cruzi en este trabajo de Tesis pertenecen al grupo delos primeros que fueron desarrollados para la enzima de T. brucei. Si bien hoy en día, tal como semencionó con anterioridad, se cuenta con compuestos mejorados en cuanto a estabilidad, permeabilidada membranas y eficiencia de inhibición, la prueba de estos inhibidores básicos continúa siendo deimportancia para poder evaluar la factibilidad del uso de aquellos que han sido mejorados. De estamanera, se ensayó la inhibición de la 6PGDH de T. cruzi por 2 deoxi-6 fosfogluconato (2d-6PG), y 4-fosfoeritronato (4PE). Tal como se mencionó con anterioridad, el primero es un análogo del 6PG por loque se comportó como un inhibidor de tipo competitivo con respecto a dicho sustrato, presentando un

Resultados 6PGDH - 110valor de K ide 13.4 µM. Este resultado mostró que, al igual que para la enzima de T. brucei, la 6PGDHde T. cruzi posee buena afinidad para este compuesto (si se lo compara con la enzima de oveja cuyo K ies de 770 µM), pero dicho valor de K ies demasiado elevado para ser considerado un buen inhibidor(Fig.19). El 4PE en cambio, es un análogo del enediol intermediario que se comportó también como unCinética de inhibición por 2 deoxi 6-fosfogluconato (2d-6PG)1/V (µmol -1 .min. ml)s/2d-6PG3 µM 2d-6pgPendiente8 µM 2d-6PG12 µM 2d-6PG−K iK i : 13.4 µM[2d-6PG] µM1/[6PG] (µM -1 )Fig.19. Cinética de inhibición de la 6PGDH recombinante doble mutante de T. cruzi por 2 deoxi 6-fosfogluconato(2d-6PG) con respecto al 6PG.inhibidor de tipo competitivo con respecto al 6PG presentando un valor de de K ide 0.16 µM (Fig.20).Este compuesto podría ser considerado como un muy buen inhibidor lo que indicaría que al igual quepara la enzima de T. brucei, los análogos de los estados de transición de la enzima son muy promisorioscomo potenciales inhibidores, ya que a demás de trabajar en el orden nano molar, poseen altaespecificidad por las enzimas de tripanosomátidos ya que la 6PGDH de oveja presentó un valor de K ipara dicho compuesto de 10.7 µM. Cabe aclarar que estos inhibidores no fueron probados in vivopor tratarse de azúcares fosfato que, tal como se mencionó con anterioridad no poseen la capacidad deatravesar membranas.

Resultados 6PGDH - 111Cinética de inhibición por 4-fosfo eritronato (4P-E).Pendientes/ 4P-EFig.20. Cinética de inhibición de la 6PGDH recombinante doble mutante de T. cruzi por 4 fosfo eritronato (4P-E) con respecto al 6PG.Localización subcelular de la 6PGDH de T. cruzi.La secuencia aminoacídica derivada a partir del gen de la 6PGDH de T. cruzi, no mostró ningún motivocorrespondiente a ninguna de las dos señales de reclutamiento glicosomal PTS 1o PTS 2en el extremocarboxilo o amino terminal de la proteína, respectivamente. Sin embargo, se detectó una posible señalinterna de tipo PTS 1(SHL) presente en un loop expuesto al solvente (residuos 248-250) pertenecientesal dominio central, todo hélice de la enzima. Un hallazgo similar se realizó en la 6PGDH de Leismaniadonde se detectó también una señal interna de tipo PTS 1(AKL) correspondiente a los residuos deaminoácidos 416-418 [Greenblat y col; 2002]. En la misma ubicación, la 6PGDH de T. brucei presentala señal SKL (residuos 420-422) mientras que la 6PGDH de T. cruzi posee el tripéptido SKT, que noestá descripto como una de las variantes funcionales del tripéptido canónico SKL (ver Fig.3). Resultadosde fraccionamiento subcelular llevados a cabo en epimastigotes del clon CL Brener [Maugeri y col;2004], sugirieron que la mayor parte de la 6PGDH presente en dicho estadío es citosólica, sin embargo,la presencia de un pequeño componente glicosomal para la enzima no fue descartado. Con la finalidadde definir la localización subcelular de dicha enzima en los distintos estadíos del clon CL Brener de T.cruzi, se llevaron a cabo inmunofluorescencias indirectas de acuerdo al protocolo descripto en Materialesy Métodos. Para ello se utilizaron anticuerpos policlonales anti 6PGDH recombinante desarrollados en

Resultados 6PGDH - 112AGliNKGliBKNCKNDGliNK

Resultados 6PGDH - 113Fig.21. Inmunofluorescencias indirectas correspondientes a los distintos estadíos del ciclo de vida de T. cruzi.Como primer anticuerpo se utilizó anti-6PGDH desarrollado en ratón 1/100, y como segundo anticuerpo anti mouse-Alexa Fluor ® 488 (verde). El núcleo y kinetoplasto se presentan teñidos con DAPI (azul). Panel A: Epimastigotes deT. cruzi clon CL Brener. Panel B: tripomastigote metacíclico. Panel C: Amastigotes. Panel D: tripomastigote de cultivo.En todos los casos, la figura de la izquierda (en canal gris) muestra la señal correspondiente a la 6PGDH de T. cruzi,la figura central ( también en canal gris) corresponde a la imagen de núcleo (N) y kinetoplasto (K), y por último lafigura de la izquierda muestra la superposición en color de las imágenes anteriores. Algunos de los gránulos que seconsideran potenciales glicosomas se encuentran señalados como (Gli). (Las fotografías no se presentan en escala).A B CFig.22. Estudio de co-localización de la 6PGDH de T. cruzi con PPDK (marcador glicosomal) porinmunofluorescencia indirecta. Epimastigote de T. cruzi clon CL Brener inmunomarcado con: Panel A: anti-6PGDHde ratón 1/100, utilizando como segundo anticuerpo anti mouse- Alexa Fluor ® 488 (verde); Panel B: anti PPDK deratón, en una dilución 1/100. Dichos experimentos mostraron que en los cuatro estadíos del parásito laenzima posee una localización esencialmente citosólica, sin embargo, en epimastigotes y tripomastigotesde cultivo se detectó también señal en una especie de gránulos distribuídos al azar a lo largo del cuerpodel parásito (Fig. 21), en un patrón muy similar al correspondiente a los glicosomas de T. cruzi [Quiñonesy col; 2004]. Para determinar la identidad de dichas estructuras, se llevaron a cabo estudios de colocalizaciónde los anticuerpos anti 6PGDH con anticuerpos desarrollados contra una enzima marcadorade glicosoma. En el caso particular de este trabajo de Tesis se utilizaron anticuerpos policlonales antipiruvato fosfato di kinasa (PPDK) de T. brucei, desarrollados en conejo en dilución 1/500 (cortesía delDr. F. Bringaud). En dichos ensayos, las señales correspondientes a los segundos anticuerpos, antiratón-Alexa Fluor 488 y anti conejo-Alexa Fluor 546, se solaparon completamente en las estructurasgranulares antes mencionadas (Fig. 22), confirmándose de esta manera que al menos una fracción de la6PGDH de T. cruzi se encuentra compartimentalizada en los glicosomas.

Discusión 6PGDH - 114DiscusiónAl igual que la 6PGDH de T. brucei y Leishmania, la 6PGDH de T. cruzi clon CL Brener se encuentracodificada por un único gen y la proteína derivada a partir del mismo, a diferencia de la de mamíferos,posee un extremo C-terminal altamente cargado que cumple un rol fundamental en la dimerización y porlo tanto en la estabilización de la enzima. La 6PGDH de T. cruzi, a pesar de poseer un 78 % deidentidad con respecto a la mutaciones sitio dirigidas permitió aumentar la estabilidad de la enzima sinafectar los parámetros cinéticos de la misma. Debido a que la inactivación por disociación de la 6PGDHde T. cruzi depende también de la concentración de proteínas, probablemente la actividad de la enzimain vivo no se vea afectada, ya que su entorno proteico la protege de este fenómeno.El efecto de la presencia de un agente reductor sobre la actividad de la 6PGDH de T. cruzi estaríarelacionado con la conservación (en su estado reducido) de uno o varios grupos sulfhidrilo importantes,como fue informado para la 6PGDH de Candida utilis [Rippa y col; 1978]. Si bien la necesidad delagregado de un agente reductor luego de las purificaciones por columnas de afinidad a quelatos metálicos(IMAC) es una característica común a casi todos los protocolos de purificación de proteínasrecombinantes, en el caso particular de la 6PGDH de T. cruzi, el efecto benéfico del agregado de DTTa las muestras que contenían la enzima, se observó también para la proteína nativa. Como se mencionóanteriormente, se encontraron diferencias por la necesidad de la presencia de un agente reductor para laconservación de la actividad enzimática entre la enzima salvaje y la doble mutante. Esto podría explicarseen base a lo siguiente: la 6PGDH de T. cruzi posee 7 residuos de cisteína por monómero, 5 de loscuales pertenecen al dominio todo hélice, y por lo tanto se encuentran ocultos en la interfase del dímero.Las débiles interacciones entre los monómeros presentes en la enzima salvaje no mutada, (nativa yrecombinante) podrían resultar en una mayor exposición de dichas cisteínas, y por lo tanto hacerlas mássensibles a la oxidación. Debido a que en la enzima doble mutante las interacciones entre los monómerosson más fuertes, los residuos de cisteína antes mencionados estarían menos expuestos, por lo que elagregado de un agente reductor deja de ser un factor crucial para la preservación de la actividad de lamisma. Siguiendo el mismo razonamiento, el efecto de pérdida de actividad enzimática por la presenciade altas concentraciones de imidazol, podría deberse a interferencia con el puente salino Asp 464 →His253. Dicha interferencia, en la enzima no mutada que posee naturalmente 3 puentes genera un efectodesestabilizador muy pronunciado, en la doble mutante, en cambio, dicho efecto se atenúa bastante yaque posee dos puentes salinos adicionales.

Discusión 6PGDH - 115Con respecto a los parámetros cinéticos, se pudo determinar que la mutación de los residuos deaminoácidos V244D y C257R, llevados a cabo con la finalidad de estabilizar la proteína recombinante,no afectaron la afinidad de la enzima por su sustrato o cofactor ya que se obtuvieron valores de K mreales y aparentes muy similares para la enzima doble mutante, no mutada y nativa. El valor de K mparael NADP es mayor que aquel obtenido para la enzima de T. brucei [Hanau y col; 1996], sin embargo,es significativamente más bajo que el informado para la enzima humana [Pearse y col; 1975]. Laconstante de afinidad por el 6PG correspondiente a la 6PGDH de T. cruzi fue, en cambio,significativamente mayor que la determinada para la enzima de T. brucei y del mismo orden que lainformada para su homólogo de eritrocitos humanos, [Tabla.2]. Las causas de tan marcada diferenciaT. cruzi T. brucei Oveja HumanaK m k cat k cat /K m K m k cat k cat /K m K m k cat k cat /K m K m k cat k cat /K m6PG 18 98 5.4 3.5 27 7.7 16 21 1.3 20 13 0.7NADP 4.9 98 20 1.5 27 18 7 21 3 30 13 0.4Tabla2. Comparación de parámetros cinéticos de 6PGDHs de distintas especies. Los valores de K mson del ordenµM, las K catse expresan en seg -1. Todos los parámetros se determinaron a pH 7.5.entre ambas enzimas parasitarias no han sido establecidas ya que todos los residuos de aminoácidosinvolucrados en la formación del sitio de unión de sustrato se encuentran estrictamente conservados, nopudiendo descartase sin embargo la presencia de variaciones en la ubicación espacial de dichos residuoscomo así también en los residuos de aminoácidos circundantes que participen en la orientación de lamolécula de sustrato en el sitio activo.Con respecto al mecanismo de reacción, la 6PGDH de T. cruzi parece trabajar por medio de unmecanismo secuencial al azar de equilibrio rápido, al igual que la enzima de T. brucei [Hanau y col;1996] y Candida utilis [Berdis y col 1993]. Estudios iniciales llevados a cabo por Topham y col[1986] para determinar el mecanismo de reacción de la 6PGDH de oveja mostraron que este varía conla solución amortiguadora utilizada. De esta manera, utilizando soluciones de fosfato el mecanismo dereacción resultó ser secuencial ordenado siendo el NADP el sustrato conductor, y en trietanolamina,

Discusión 6PGDH - 116en cambio, la reacción se inicia fundamentalmente a través del complejo enzima-6PG. Sin embargo,estudios posteriores de inhibición por producto llevados a cabo por Price y col [1996], (utilizandocomo solución amortiguadora 100 mM Hepes), mostraron un mecanismo de reacción para la 6PGDHde oveja de tipo secuencial al azar de equilibrio rápido. Ante todo lo expuesto surge que, si bien solonos fue posible sugerir el mecanismo de reacción para la 6PGDH de T. cruzi (debido a la imposibilidadde llevar a cabo un estudio completo de inhibición por producto para la enzima), el mismo se encontraríaen concordancia con aquellos informados para sus homólogos de otras especies.Con respecto a la localización subcelular, los resultados obtenidos indican que parte de la 6PGDH de T.cruzi se encontraría dentro del glicosoma, en buena correlación con los experimentos de fraccionamientosubcelular llevados a cabo por Maugeri y Cazzulo; [2004] con epimastigotes de T. cruzi clon CLBrener (ver introducción). Esto hace suponer que la señal interna tipo PTS 1detectada en la secuenciade la 6PGDH de T. cruzi estaría siendo funcional, aunque con baja eficiencia ya que la enzima poseeuna localización mayoritariamente citosólica. Este no sería un caso único de localización bipartita (citosólicay glicosomal) de una proteína codificada por un único gen, ya que una observación similar se realizópara la glucosa fosfato isomerasa de Leishmania (ver introducción). Si bien la presencia de la G6PDHde T. cruzi en glicosomas no pudo ser confirmada debido a la imposibilidad de llevar a cabo estudios deco-localizacion con la PPDK tal como se mencionó con anterioridad; su presencia dentro de dichasorganelas no puede ser descartada. De esta manera, la razón de la presencia de ambas deshidrogenasasde la rama oxidativa de la vía de las pentosas fosfato dentro de los glicosomas podría explicarse por lanecesidad, dentro de dicha organela, de una fuente de NADPH necesario para llevar a cabo las reaccionesde metabolización de hidroperóxidos de fosfolípidos y ácidos grasos por parte de la peroxidasaglicosomal dependiente de glutatión TcGPXI que forma parte del sistema tripanotiona-tripanotionareductasa y cuyo rol fundamental es la protección de membranas del estrés oxidativo. Por otro lado, larama oxidativa de la vía de las pentosas también podría estar suministrando a dichas organelas la Ru-5Pnecesaria para la síntesis de purinas y pirimidinas que se lleva a cabo en dichos compartimentos. Si bienla presencia de la 6-fosfoglucono lactonasa dentro de los glicosomas no ha sido confirmada, su presenciadentro de dichas organelas no sería crucial, ya que la apertura del anillo de la γ 6-fosfo glucono lactonaes un proceso que puede ocurrir espontáneamente, aún en ausencia de la enzima. Por lo tanto, una ramaoxidativa de la vía de las pentosas incompleta, en ausencia de la 6PGL, sería probablemente menoseficiente, pero potencialmente funcional.Más allá de las diferencias mencionadas, las enzimas de T. cruzi y T. brucei presentan algunascaracterísticas en común, como ser la alta afinidad por su cofactor que se ve reflejada en los bajos

Discusión 6PGDH - 117valores de K mpara el NADP obtenidos; y a pesar de que difieren de manera pronunciada en la afinidadpor su sustrato presentan un comportamiento muy similar en la respuesta a los inhibidores. Esto últimose vio reflejado en el valor de K ipara el 4P-E (0.16 µM) obtenido para la enzima de T. cruzi, que esprácticamente idéntico al obtenido para la enzima de T. brucei (0.14 µM). Esto indica que a pesar de ladiferencia en la afinidad por el sustrato mencionada anteriormente, la utilización de inhibidores que seananálogos a los intermediarios de reacción permiten salvar dichas diferencias haciendo muy promisoria laextrapolación a la 6PGDH de T. cruzi de aquellos compuestos diseñados para inhibir a la enzima de T.brucei.

Conclusiones generales.

Conclusiones generales - 118Conclusiones generales.Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa.*Dentro del genoma de T. cruzi clon CL Brener existen varias copias del gen de la G6PDH (quepudieron ser separadas en tres grupos) como así también dos pseudo genes que codifican para proteínasinactivas.*Dichos genes se encuentran distribuídos en tres de los cromosomas del parásito y hemos podidoestablecer que existe conservación en el entorno genético de algunos de ellos (sintenía) con respecto asus homólogos de T. brucei y Leishmania.*En todas las secuencias genómicas analizadas como así también aquellas correspondientes a ADNcopiahemos detectado dos codones de iniciación de la traducción separados uno de otro por 111 pb sugiriendola posibilidad del inicio de la traducción a partir de cualquiera de ellos pudiéndose generar una proteínade 518 o 555 residuos de aminoácidos.*Pudimos determinar que ambas enzimas (G6PDH cortay G6PDH larga) son activas ya que pudieron serexpresadas en E. coli como proteínas recombinantes con actividad de G6PDH. Sin embargo presentarondiferencias en sus parámetros cinéticos y en su sensibilidad a la presencia de DTT.*La G6PDH larga, al igual que la G6PDH nativa, y de manera similar a la G6PDH de cloroplastos deplantas superiores, sufrió una marcada inactivación en presencia de DTT sugiriendo que ambas cisteínaspresentes en la extensión amino terminal de dicha proteína estarían formando un puente disulfuro necesariopara la conservación de la actividad de la enzima.*La G6PDH cortapresentó mayor afinidad por su sustrato que la G6PDH larga(K map 76 y 199 µMrespectivamente), siendo este último valor más similar al correspondiente a la G6PDH nativa determinadoen extractos totales de epimastigotes de T. cruzi.

Conclusiones generales - 119*Se detectó actividad diferencial correspondiente a la G6PDH en extractos totales de los distintosestadíos del ciclo de vida de T. cruzi, siendo esta mas elevada en aquellas formas del parásito que seencuentran naturalmente sometidas a estrés oxidativo. Dichas medidas de actividad enzimática tuvieronbuena correlación con los niveles de G6PDH (detectada por Western blot) como así también con losniveles de ARN mcorrespondientes a la enzima.*Con respecto a la localización subcelular de la proteína pudimos confirmar que la enzima posee unalocalización esencialmente citosólica, aunque también hemos confirmado su presencia en el aparato deGolgi (en epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos). En amastigotes, tripomastigotes de cultivo ytripomastigotes metacíclicos hemos detectado también señal correspondiente a la proteína en unos gránulosde mayor tamaño que potencialmente podrían ser glicosomas.*Mediante experimentos de generación de estrés oxidativo con H 2O 2llevados a cabo en tripomastigotesmetacíclicos pudimos determinar que la G6PDH forma parte de un mecanismo inducible en respuesta alestrés que sería funcional en dicho estadío del ciclo de vida del parásito y no en epimastigotes. Estodemostró que la G6PDH puede jugar realmente un rol muy importante en la respuesta al estrés oxidativo,al menos en las formas del parásito que naturalmente se encuentran sometidas a estrés.6-fosfogluconato deshidrogenasa.*La 6-fosfogluconato deshidrogenasa (6PGDH) se encuentra codificada por un único gen dentro delgenoma de T. cruzi clon CL Brener.*Dicha enzima pudo ser expresada como una proteína soluble y activa en E. coli que resultó sermarcadamente inestable al igual que la 6PGDH nativa de T. cruzi.*Debido a la naturaleza dimérica de dicha enzima propusimos que la inestabilidad de la misma podríadeberse a la ausencia de dos de los cinco puentes salinos que se encuentran estabilizando a su homólogode T. brucei.

Conclusiones generales - 120*Mediante mutagénesis sitio dirigida pudimos restablecer dichos puentes en la 6PGDH de T. cruzigenerándose así una enzima marcadamente más estable que la salvaje, cuyos parámetros cinéticosfueron totalmente comparables con los determinados para esta última como así también con loscorrespondientes a la enzima nativa.*La 6PGDH doble mutante resultó entonces ser una herramienta muy útil para llevar a cabo la determinacióndel posible mecanismo de reacción de la enzima como así también para ensayos de inhibición.*A partir de estos últimos pudimos determinar que la 6PGDH de T. cruzi posee un comportamientocinético muy similar al de su homólogo de T. brucei siendo altamente factible la extrapolación de losinhibidores específicos desarrollados para la 6PGDH de este parásito.*Con respecto a la localización subcelular de la 6PGDH de T. cruzi pudimos concluir que si bien laenzima posee una localización esencialmente citoplasmática, en epimastigotes y tripomastigotes de cultivopudimos detectarla también en glicosomas sigiriendo que la señal de interna tipo PTS1 sería funcional.De acuerdo con esto podemos concluir que ambas deshidrogenasas de la vía de las pentosas fosfatopueden ser consideradas como posibles blancos de quimioterapia para el tratamiento de la enfermedadde Chagas. De acuerdo con los experimentos presentados, la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa de T.cruzi parecería cumplir un rol importante en la defensa del parásito contra el estrés oxidativo por lo queuna inhibición selectiva de la misma podría generar parásitos más susceptibles a dicho estrés quepotencialmente tendrían menor capacidad de sobrevivir a la infección o como formas intracelulares.Por su parte la 6-fosfogluconato deshidrogenasa de T. cruzi ha presentado un comportamiento cinéticomuy similar al determinado para la 6PGDH de T. brucei y marcadamente distinto al de su homólogo deoveja por lo que, teniendo en cuenta la potencial letalidad de la carencia de 6PGDH, dicha enzima seconvierte en un blanco muy promisorio para el desarrollo de inhibidores específicos para la enzima.

Materiales y Métodos.

Materiales y Métodos - 121Cultivo de parásitos y obtención de extractos libres de células.Epimastigotes de los clones CL Brener y Dm28c, y de las cepas Tul 2 y RA, fueron cultivados en medioaxénico, cosechados posteriormente por centrifugación a 3500 g durante 10 min. y lavados con 50 mMTris-HCl pH 7.5, de acuerdo al método descripto por Cazzulo y col [1985]. Los tripomastigotesmetacíclicos fueron obtenidos mediante la diferenciación espontánea de epimastigotes del clon Cl Brenera 28 ºC, y posterior purificación por cromatografía de intercambio iónico (DEAE-celulosa) [De Souza;1983]. Los amastigotes y tripomastigotes de cultivo fueron obtenidos mediante la infección de monocapasde células Vero con tripomastigotes del clon CL Brener [Andrews y col; 1982]. Los extractos libres decélulas de los diferentes estadíos mencionados más arriba, fueron obtenidos por sonicación o porcongelamiento y descongelamiento. Este último procedimiento se llevó a cabo mediante tres ciclos decongelado a -20 ºC y posterior descongelado en amortiguador Tris-HCl 50 mM pH 7.5, 0.5 mM ditiotreitol(DTT), en presencia de inhibidores de proteasas: 0.5 mM tosil-lisil-clorometil cetona (TLCK) y0.1 mM E64. La lisis por sonicación se realizó mediante la aplicación a la suspensión de parásitos detres pulsos de 20 seg. de duración cada uno, al 60% de la potencia máxima del sonicador (Branson450). Las suspensiones fueron luego centrifugadas a 20.000xg durante 10 min. a 4 ºC. Los sobrenadantesasí obtenidos fueron inmediatamente utilizados para la determinación de la actividad enzimática de6PGDH y G6PDH.Purificación parcial de la 6PGDH de T. cruzi nativa.La 6PGDH nativa fue parcialmente purificada a partir de un extracto libre de células de epimastigotesdel clon CL Brener obtenido por sonicación, tal como se describió anteriormente. Dicho extracto fueinmediatamente sembrado en una columna de afinidad general, Blue-Sepharosa, pre-equilibrada con50 mM Tris-HCl, 4 mM DTT pH 7.5. Las proteínas unidas de manera inespecífica a la matriz fueroneluidas mediante lavados con el mismo amortiguador conteniendo 50 mM ClNa. La elución de la 6PGDHse llevó a cabo utilizando la solución amortiguadora antes mencionada, conteniendo en esta oportunidad250 mM ClNa. Dicho eluído fue rápidamente desalado en una columna de Sephadex ® -G25 M PD-10

Materiales y Métodos - 122(Amersham Biosciences), y posteriormente aplicado a una columna de 2´-5’ ADP Sepharosa ® 4B(Amersham Biosciences) pre-equilibrada con 50 mM Tris-HCl, 4 mM DTT pH 7.5. Dicha columna fueposteriormente lavada con el mismo amortiguador para eliminar el material unido inespecíficamente, y laelución de la 6PGDH se efectuó en presencia de 500 mM ClNa. Todos los pasos de purificación sellevaron a cabo a 4ºC y se monitorearon mediante la determinación de actividad enzimática de 6PGDH.Preparación de los plásmidos.*Mini preparación de los plásmidos.Las mini preparaciones de pGEMT-Easy se llevaron a cabo a partir de cultivos de E. coli tanto de lacepa XL1Blue como de la cepa DH5α. Las mini preparaciones de pET28a(+) (plásmido utilizadopara la expresión de las proteínas recombinantes mencionadas en este trabajo de Tesis) se llevaron acabo únicamente a partir de cultivos de E. coli de la cepa XL1 Blue.Los plásmidos rutinariamente se prepararon mediante el protocolo de lisis alcalina, que involucra lossiguientes pasos: 1) resuspensión del pellet bacteriano en 50 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8conteniendo 100 µg.ml -1 de RNAsa, 2) lisis celular mediante el agregado de una solución 200 mMNaOH, 1% SDS, 3) precipitación del ADN genómico mediante el agregado de AcK 3 M pH 5.5 yposterior centrifugación a 14.000 rpm durante 30 min. A continuación se realiza la precipitación delplásmido por medio de la adición de 2.5 volúmenes de isopropanol y centrifugación a 14.000 rpmdurante 30 min. El plásmido así precipitado se lava con etanol 70 % y posteriormente se resuspende enagua Milli Q autoclavada. En caso de ser necesario un plásmido de alta pureza (para secuenciación) alprotocolo antes descripto se le adiciona un paso más que implica una nueva precipitación del plásmido.Esto se realiza mediante el agregado (al plásmido purificado tal como se describió con anterioridad) depolietilén glicol (PEG 8000) 6,5 % concentración final y ClNa 400 mM concentración final, su incubaciónen hielo durante 40 min y posterior centrifugación a 14.000 rpm durante 30 min. Finalmente el plásmidoprecipitado se lava con etanol 70 % y se lo resuspende en agua Milli Q autoclavada.*Preparación de plásmidos para transfectar.Los plásmidos pTEX-GFP, y pTEX-G6PDH-GFP, se purificaron a partir de 250 ml de cultivo decélulas (DH5α) crecidas en medio LB en presencia de 50 µg.ml -1 de ampicilina, por medio de columnas

Materiales y Métodos - 123de intercambio aniónico QIAGEN–tip 500 (QIAGEN) de acuerdo a las instrucciones provistas por elfabricante.Ligaciones.Todas las ligaciones llevadas a cabo en este trabajo de Tesis, se realizaron de manera rutinaria a 16ºCdurante toda la noche utilizando 0.4 U ADN ligasa del bacteriofago T4 (Promega) y una relación inserto:vector (3:1) en la solución amortiguadora correspondiente a la enzima.Preparación de bacterias competentes, electrocompetentes y transformación.*Preparación de bacterias competentes.La preparación de bacterias competentes de las distintas cepas de E.coli utilizadas (DH5α, XL1Blue,BL21 codon Plus (DE3)) se llevó cabo de acuerdo al protocolo que se describe a continuación: se picauna colonia de la cepa de E. coli elegida y se inocula medio LB estéril conteniendo el antibiótico para elcual dichas bacterias posean resistencia natural. El cultivo se crece a 28 ºC hasta un valor de DO 600 mnde 0.6 y a continuación las bacterias se cosechan por centrifugación 2500 rpm durante 10 min.Posteriormente se las resuspende en una solución conteniendo 15 mM CaCl 2, 55 mM Cl 2Mg, 250 mMMnCl 2en 10 mM Hepes, se las incuba durante 10 min en hielo y se centrifuga nuevamente. Por último seresuspende el pellet bacteriano en la solución antes mencionada conteniendo DMSO 7 % concentraciónfinal, se vuelven a incubar durante 10 min en hielo, se alicuotan y se congelan a – 70 ºC hasta su uso.*Preparación de bacterias electrocompetentes.La preparación de bacterias electrocompetentes de la cepa de E. coli XL1 Blue, se llevó a cabo deacuerdo al siguiente protocolo: se prepara un precultivo de dichas bacterias inoculando medio SOBestéril conteniendo 20 µg/ml de tetraciclina con una única colonia y se creciendo toda la noche a 37 ºC.Al día siguiente se realiza una dilución 1/1000 de dicho cultivo en SOB conteniendo el mismo antibióticoy se crece a 37ºC hasta una DO 600 mnde 0.6. Posteriormente se cosechan las bacterias mediantecentrifugación a 1250x g durante 10 min, se descarta el sobrenadante y el pellet se lava mediante su

Materiales y Métodos - 124resuspención en el mismo volumen de glicerol 10 % estéril. Se vuelven a centrifugar las bacterias, sedescarta el sobrenadante y el pellet se resuspende ahora en la mitad del volumen inicial de glicerol 10 %y se centrifuga nuevamente. Dicho procedimiento se repite una vez más resuspendiendo el pellet bacterianoen ¼ del volumen inicial. Las bacterias así lavadas finalmente se resuspenden a razón de 0.5 ml deglicerol 10 % estéril por cada 100 ml de cultivo inicial, se fraccionan en pequeños volúmenes y secongelan a –70 ºC hasta su uso.*Transformación bacteriana mediante shock térmico.Este método de transformación se utilizó rutinariamente para la transformación de las distintas cepas deE. coli con plásmidos superenrrollados y se llevó a cabo de acuerdo al método que se describe acontinuación: 50 µl de bacterias compententes se ponen en contacto con el plásmido durante 30 min. (enhielo) en tubos de polipropileno (Falcon ® de 15 ml). Posteriormente se las somete al shock térmicomediante su incubación durante 45 seg a 42 ºC. A continuación se enfrian las bacterias en hielo, se lesadiciona 800 µl de medio de cultivo estéril, se incuban a 37 ºC durante 1 hora, y se plaquean en LB agarconteniendo el anticuerpo específico.*Transformación bacteriana mediante electroporación.Este método se utilizó esencialmente para la transformación de E. coli con productos de ligación y sellevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo: se ponen en contacto 30 µl de bacterias (preparadas talcomo se describió anteriormente) con 2 µl de plásmido en un tubo eppendorf estéril, se homogenizabien y se incuba durante 3 min en hielo. Luego se coloca dicha mezcla en la cubeta de electroporaciónpreviamente enfriada y se electroporan las bacterias mediante un único pulso de 2.5 kV (para cubetascon un paso de 0.2 cm de longitud). Inmediatamente después se adicionan 500 µl de SOB estéril dentrode la cubeta de electroporación, se resuspenden las bacterias, se las trasvasa a un tubo Falcon de 15 mlde capacidad (estéril), se recuperan a 37 ºC durante 1h y se plaquean en LB agar conteniendo elanticuerpo específico.Expresión y purificación de proteínas recombinantes.*Expresión de las G6PDH cortay G6PDH largarecombinantes.

Materiales y Métodos - 125Con la finalidad de obtener la G6PDH recombinante de T. cruzi en su forma corta (de 1557 pb delongitud) y en su forma larga (de 1668 pb) ambos genes fueron clonados en el vector de expresiónPET28a (+) bajo el control del promotor T7Lac, que dirige la producción de la proteína recombinantecon un tracto de 6 residuos de histidina en su extremo amino terminal. De esta manera, ambas enzimasfueron expresadas en E. coli de la cepa BL21 codon Plus (DE3) de acuerdo al siguiente protocolo: seprepara un precultivo a partir de una única colonia de dichas bacterias transformadas con el vector deexpresión PET28a (+)-Tc G6PDH cortao PET28a (+)-Tc G6PDH larga, en medio LB conteniendo 50µg.ml -1 kanamicina y 10 µg.ml -1 cloramfenicol. Posteriormente se realiza una dilución 1:50 de dichoprecultivo en el mismo medio conteniendo los antibióticos antes mencionados. Se crece el cultivo a 37ºC hasta una densidad óptica de 0.6 a 600 nm, luego de lo cual se agrega isopropil-β-D-tiogalactopiranósido(IPTG) 0.5 mM concentración final y se induce la expresión de la proteína recombinante a 28 ºCdurante 3 hs. Posteriormente se cosechan las bacterias por centrifugación a 3000 x g durante 10 min. yel pellet se resuspende en solución amortiguadora de lisis: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM ClNa, 0.1% Tritón X100, 2 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF), 10 µM leupeptina y lisozima 1 mg.ml -1concentración final. Una vez llevada a cabo la lisis bacteriana, el ADN se digiere mediante la incubacióncon desoxirribonucleasa I (DNasa I) durante 30 min. Luego se centrifuga la muestra a 20.000 x gdurante 25 min. para obtener el extracto libre de células (todos estos procedimientos se llevan a cabo a4 ºC).La eficiencia en la expresión de las proteínas recombinantes se analizó inicialmente mediante lacomparación de actividades específicas y patrón de proteínas en geles de poliacrilamida entre extractostotales (libres de células) de bacterias transformadas con el vector de expresión conteniendo el inserto:PET28a (+)-Tc G6PDH a las cuales se les agregó IPTG para inducir la expresión de la proteínarecombinante, y los extractos obtenidos a partir de cultivos controles. Usualmente se realizan dos tiposde controles: 1) inducidos, provenientes de bacterias transformadas con el vector de expresión sininserto PET 28a (+) a las cuales se les agrega IPTG ; y 2) no inducidos, provenientes de bacteriastransformadas con el vector de expresión conteniendo el inserto PET28a (+)-Tc G6PDH, pero a lascuales no se les agrega IPTG.*Purificación de la G6PDH cortay G6PDH largarecombinantes.La purificación de las proteínas recombinantes se llevó a cabo por medio de cromatografía de afinidada quelatos metálicos de acuerdo al siguiente protocolo: el extracto libre de células se siembra en unacolumna de Ni 2+ ProBondTM (Invitrogen) equilibrada en 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM ClNa. Las

Materiales y Métodos - 126proteínas unidas de manera inespecífica a la matriz se eliminan mediante sucesivos lavados con la soluciónamortiguadora antes mencionada conteniendo 80 mM imidazol. La elución de las G6PDHs recombinantesse lleva a cabo mediante el pasaje a través de la columna del mismo amortiguador conteniendo 300 mMimidazol. Todos los pasos de purificación se llevan a cabo a 4ºC y el perfil de elución se monitoreamediante la determinación de actividad enzimática. La pureza de las GPGDHs obtenidas se analizamediante geles de poliacrilamida teñidos con nitrato de plata.*Expresión y purificación de la 6PGDH recombinante de T. cruzi.Al igual que para la G6PDH de T. cruzi, la 6PGDH fue expresada en E. coli BL21 codon Plus (DE3)utilizando el PET28a (+) como vector de expresión. El protocolo de inducción utilizado en este caso fueesencialmente el mismo que el antes descripto para la GPGDH de T. cruzi, con la excepción de que enlugar de llevar a cabo la inducción en medio LB a 28 ºC, en este caso dicho procedimiento se llevó acabo en medio mínimo M9 a 18 ºC, para disminuir la formación de cuerpos de inclusión. La lisis bacteriana,al igual que la purificación de la proteína recombinante por columna de Ni 2+ , se llevaron a cabo deacuerdo al protocolo antes mencionado, exceptuando la eliminación de las proteínas unidas de manerainespecífica a la matriz (que en este caso se llevó a cabo mediante sucesivos lavados con 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 500 mM ClNa conteniendo 50 mM imidazol). La elución de la proteína recombinante serealizó utilizando el amortiguador antes mencionado conteniendo 100 o 300 mM imidazol. En el casoparticular de esta enzima el agregado de un agente reductor (4 mM DTT) inmediatamente después de laelución fue estrictamente necesario para prevenir e incluso revertir la inactivación de la enzima poroxidación.Electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE).Los geles de poliacrilamida se llevaron a cabo rutinariamente en condiciones desnaturalizantes de acuerdoa la técnica descripta por Laemmli en 1970. Las muestran son desnaturalizadas antes de su siembramediante el agregado de 0.1% SDS, 100 mM DTT en Tris-HCl pH 6.8 y su posterior calentamiento a100 ºC durante 5 min. Los marcadores de peso molecular utilizados de rutina fueron: BSA (66 kDa),ovoalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa) y tripsinógeno (24 kDa).

Materiales y Métodos - 127Tinción de geles de poliacrilamida.*Tinción con Coomasie Brillant Blue.La tinción de geles de poliacrilamida mediante ésta técnica permite la detección de cantidades relativamentealtas de proteína ya que posee baja sensibilidad (el límite de detección es de aproximadamente 500 ngde proteína). Si bien no constituye un criterio seguro de pureza, debido a que es un método sencillo yrápido es ampliamente utilizado en el seguimiento de sucesivos pasos de purificación enzimática y parala determinación de masa molecular aparente de subunidad de acuerdo al método descripto por Weberand Osborn [1969]. La tinción se llevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo: una vez finalizada laelectroforesis, se incuba el gel durante 10 min en una solución 50 % metanol y 10 % de ácido acéticopara posteriormente ponerlo en contacto durante 30 min con una solución de Coomasie Brilliant BlueR250 al 0.2%, disuelto en 30% de metanol y 10% de ácido acético. A continuación se lleva a cabo eldesteñido del gel mediante su incubación en una solución de 30% de metanol y 10% de ácido acéticorealizando sucesivos cambios cada 15 minutos.*Tinción con nitrato de plata.Este método de tinción es mucho más sensible que el antes mencionado ya que permite la detección depicogramos de proteína, y esto hace que sea considerado un buen criterio de pureza. Dicha tinción serealizó de acuerdo al siguiente protocolo: al igual que para el método anterior, una vez finalizada laelectroforesis, se incuba el gel en 50 % de metanol – 10 % de ácido acético durante 10 min, luego se locoloca en 7 % metanol - 5 % de ácido acético durante otros 10 min, y a continuación se lo lava conagua bidestilada. Posteriormente se realiza la fijación de las proteínas al gel mediante su incubacióndurante 15 min en una solución de glutaraldehido al 10%, luego de lo cual se descarta dicha solución yse lava exhaustivamente durante 90 min con agua bidestilada realizando numerosos cambios. Por últimose incuba el gel en una solución de plata amoniacal (AgNO 30.8%, NaOH 0.02N, NH 31.4% en agua)durante 10 min, se lava con agua bidestilada y se revela con una solución de 0.05 mg.ml -1 ácido cítricoy 0.02 % formaldehído. El desarrollo de color se detiene mediante la acidificación con ácido acético al50 %.

Materiales y Métodos - 128Digestión tríptica en gel de la 6PGDH recombinante de T.cruzi.La digestión tríptica en gel de la 6PGDH de T. cruzi se llevó a cabo de acuerdo al protocolo que sedescribe a continuación: las proteínas a ser analizadas (previamente reducidas y alquiladas coniodoacetamida) se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida, se tiñe el gel con CoomasieBrilliant Blue tal como se describió anteriormente (utilizando reactivos de alta calidad) y se recortan lasbandas correspondientes a dichas proteínas. Los bloques de gel recortados se colocan en tubos eppendorfy se lavan dos veces con 200 µl de bicarbonato de amonio 0.2 M en 50 % de acetonitrilo durante 20min. Posteriormente se secan completamente bajo una corriente de nitrógeno y se re-hidratan medianteel agregado de 5 µl de bicarbonato de amonio 0.2 M en 0.02% de Tween 20. Se adicionan 5 µl de unasolución de tripsina 0.1 µg/µl, se continúa la re-hidratación del gel mediante el agregado de pequeñasalícuotas de bicarbonato de amonio 0.2 M y se incuba durante toda la noche a 30 ºC. Al día siguiente selleva a cabo la inactivación de la proteasa mediante el agregado de 1/10 del volumen de ácido trifluoroacético 10% y se separa el sobrenadante. Posteriormente se lleva a cabo la extracción de los péptidosgenerados mediante la incubación de los tozos de gel con 150 µl de 0.1 % ácido trifluoro acético en 60% de acetonitrilo durante 30 min a 30 ºC (este proceso se repite dos veces y se combinan ambossobrenadantes). A continuación se evapora la fase orgánica en speed-vac, y la muestra queda lista paraser analizada.Electrotransferencia de proteínas y Western blot.La electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa Hybond ECL (Amersham Biosciences),se llevó a cabo de acuerdo el siguiente protocolo: una vez finalizada la electroforesis, se equilibra el gely la membrana de nitrocelulosa en la siguiente solución amortiguadora: 20 mM Tris pH 7.6, 150 mMglicina, 20 % metanol, durante 2-3 min. La transferencia se realiza a 80 mA constantes durante 1h. 15min. o a 200 mA durante 2 hs en el amortiguador antes mencionado (las primeras condiciones se aplicana geles de 1 mm de espesor, y las segundas a geles de 1.5 mm.). Una vez finalizada la transferencia, laeficiencia del proceso se verifica mediante la tinción de las membranas con una solución de Rojo Ponceaual 0.5 % en 5 % TCA.

Materiales y Métodos - 129*Western-blots.Los western blots se realizaron de acuerdo al protocolo que se detalla a continuación: inicialmente selleva a cabo el bloqueo de las membranas de nitrocelulosa mediante su incubación durante 30 min conuna solución conteniendo 3 % de leche descremada y 2 % de glicina en TBS. Luego, se incuban losfiltros en presencia del primer anticuerpo, diluido en solución de bloqueo (dicha dilución, como asítambién el tiempo de incubación, dependen exclusivamente del suero a utilizar, y de la muestra a seranalizada). Posteriormente se procede a la eliminación de los anticuerpos unidos de manera inespecíficaa la membrana mediante una serie de lavados que se detallan a continuación: 1) se realizan dos lavadosde 10 min. cada uno con TBS, 2) se efectúa un lavado de 10 min. exactos con una solución de NP40al 0.05% en TBS, y por último, 3) se realizan dos lavados adicionales de 10 min cada uno con TBS(para eliminar cualquier resto de detergente de la membrana). Posteriormente se incuban los filtros conun anticuerpo capaz de reconocer la porción Fc de los primeros anticuerpos utilizados. Este usualmentese encuentra acoplado a enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa, que permiten llevar a caboel revelado de las membranas mediante su incubación con el sustrato específico para dichas enzimas. Enel caso particular de este trabajo de Tesis se utilizaron rutinariamente como segundos anticuerpos,sueros de cabra anti-conejo o anti-ratón conjugados a peroxidasa (Sigma), diluidos 1/10.000 ensolución de bloqueo. El revelado de las membranas se llevó a cabo por quimioluminiscencia mediante laincubación de los filtros con SuperSignal ® West Pico Chemiluminescent Substrate (PIERCE), y la posteriorsensibilización de placas AGFA GP-BU New Medical X-Ray Film durante 30min.Obtención de anticuerpos anti G6PDH y 6PGDH.Los anticuerpos específicos contra la G6PDH y la 6PGDH de T. cruzi se obtuvieron mediante lainmunización de ratones y conejos con las proteínas recombinantes purificadas. Los animales seinmunizaron mediante la aplicación de 4 dosis de 100 µg de proteína recombinante cada 21 días (conejos)y 10 µg cada 15 días (ratones). En ambos casos dichas proteínas se administraron emulsionadas conadyuvante de Freund, completo para la primera inoculación, e incompleto para las demás. Diez díasdespués de la cuarta dosis los animales fueron sangrados a blanco y el suero fue separado del paqueteglobular mediante centrifugación a 2000 rpm durante 10 min.

Materiales y Métodos - 130Purificación de anticuerpos específicos anti-G6PDH.*Acople de la G6PDH recombinante a la matriz.Los anticuerpos específicos anti-G6PDH se purificaron por cromatografía de afinidad mediante el acoplede la G6PDH recombinante de T. cruzi purificada a matrices de Sepharosa 4-B activada con bromurode cianógeno. Esto se llevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo: se resuspende la cantidad deseadade resina en HCl 1 mM teniendo en cuenta que por cada 1g de resina seca se obtienen aproximadamente3.5 ml de matriz y que ésta posee una capacidad de unión de entre 5-10 mg de proteína.ml -1 . Se lava laresina con dicha solución durante 15 min. y posteriormente se la equilibra con 10 volúmenes de soluciónamortiguadora de acople (0.1 M NaHCO 3pH 8.3, 0.5 M ClNa) mantenida a 4ºC. Este proceso deberealizarse rápidamente para prevenir la hidrólisis alcalina de los grupos reactivos de la matriz. Luego sela incuba durante 2 hs. con la proteína a ser acoplada disuelta en dicha solución amortiguadora ytranscurrido el tiempo de incubación se realizan sucesivos lavados de la matriz para eliminar la proteínano unida. Posteriormente se procede a realizar el bloqueo de los grupos reactivos que no hayan unidoproteína, mediante la incubación de la matriz durante 2 hs. con una amina primaria (usualmente se utilizauna solución de glicina 0.2 M pH 8). Por último se lleva a cabo la eliminación de aquellas proteínas quese hayan unido de manera no covalente a matriz. Esto se realiza mediante el lavado de la misma con 10volúmenes de una solución de acetato de sodio 0.1 M, ClNa 0.5 M pH 4, seguida por 10 volúmenes de0.1 M NaHCO 30.5 M ClNa pH 8.3. Este procedimiento se repite tres veces luego de lo cual seconsidera que la matriz está lista para ser utilizada.*Purificación de anticuerpos mediante cromatografía de afinidad.Este proceso se llevó a cabo utilizando la matriz de afinidad preparada en el párrafo anterior. Previamentea su utilización la matriz se cargó en una columna plástica (BIO-RAD), se lavó mediante el pasaje de 10volúmenes de columna de PBS y otros 10 volúmenes de glicina 0.1 M pH 2.5 y finalmente se la equilibróen el primero. La purificación de los anticuerpos propiamente dicha se llevó a cabo de acuerdo alsiguiente protocolo: el suero conteniendo los anticuerpos a ser purificados se diluye 1/2 en PBS, se losiembra 3 veces en la columna y posteriormente se realiza la eliminación de anticuerpos unidos demanera inespecífica mediante al lavado exhaustivo de la matriz con la misma solución amortiguadora(este procedimiento se continúa hasta obtener un valor constante de A ). A continuación se realiza la280nmelución de los anticuerpos específicos mediante el pasaje a través de la columna de glicina 0.1M pH2.5. Para evitar la alteración de los anticuerpos debida a la marcada acidez de dicha solución

Materiales y Métodos - 131amortiguadora, las fracciones eluídas se colectan sobre Tris-HCl 2 M pH 8.3 para neutralizarinmediatamente la solución. En el caso particular de este trabajo de Tesis, los anticuerpos anti G6PDHse purificaron a partir de suero de conejo. Las fracciones eluídas (de 300 µl cada una), se colectaronsobre 150 µl de Tris-HCl 2 M pH 8.3. El perfil de elución de la columna se monitoreó mediante A 280 nm.Posteriormente los eluídos fueron dializados en PBS en presencia de azida sódica 0.5 % durante 3 hs,y se conservaron a 4 ºC hasta su uso.Determinación de masa molecular aparente por filtración en gel.*Determinación de la masa molecular aparente de la G6PDH cortaactiva de T.cruzi.La masa molecular de la G6PDH cortaactiva de T. cruzi, se llevó a cabo por filtración en gel en unacolumna Bio-Sil SEC 250 (BIO-RAD). Como eluyente se utilizó el siguiente amortiguador: Tris-HCl 50mM, 0.5 mM ClNa, pH 7.0. La calibración se efectuó utilizando como marcadores de peso molecular:tiroglubulina (670 kDa), gamma globulina (158 kDa), ovoalbúmina (44 kDa), mioglobina (17kDa), y Blue Dextran. Las muestras y estándares de masa molecular se resolvieron a un flujo de 0.7ml.min -1 , y el perfil de elución de la columna se monitoreó por A 280 nmy determinación de actividadenzimática.*Determinación de la masa molecular aparente de la 6PGDH activa de T. cruzi.La determinación de la masa molecular de la 6PGDH activa de T. cruzi se llevó a cabo por filtración engel en una columna Superdex G 200 XK 16/40 (Amersham Biosciences) grado preparativo, de 53 mlde matriz. Como eluyente se utilizó la siguiente solución amortiguadora: Tris-HCl 50 mM , 0.5 mMClNa, 4 mM DTT, pH 7.6. La calibración de dicha columna se efectuó utilizando como marcadores depeso molecular: citocromo c (12.4 kDa), mioglobina (17 kDa), anhidrasa carbónica (29 kDa),ovoalbúmina (44 kDa), seroalbúmina bovina (66 kDa), alcohol deshidrogenasa (150 kDa), β-amilasa(200 kDa), y Blue Dextran. Las muestras y estándares de masa molecular se resolvieron a un flujo de0.8 ml.min -1 , y el perfil de elución de la columna se monitoreó por absorbancia a 280 nm y determinaciónde actividad enzimática.

Materiales y Métodos - 132Ensayos enzimáticos.*Determinación de actividad de la G6PDH de T. cruzi.La actividad de la G6PDH de T. cruzi se determinó rutinariamente en la dirección de la oxidación de laG6P, monitoreando la reducción del NADP a 340 nm [Cronin y col; 1989] en un espectrofotómetroBeckman DU ® Series 600, a temperatura constante (30 ºC). Para determinaciones de actividad enzimáticacon la enzima purificada, la mezcla de reacción estándar utilizada contenía 50 mM trietanolamina pH7.5, 5 mM Cl2Mg, 0.5 mM NADP y 1 mM G6P. En el caso de extractos totales o fracciones parcialmentepurificadas donde tanto la 6PGDH como la G6PDH se encontraban presentes, la actividad de estaúltima se determinó mediante la diferencia entre el valor de actividad obtenido con una mezcla dereacción conteniendo ambos sustratos (6PG y G6P) y aquel derivado de una mezcla de reacción quesolo contenía 6PG como sustrato.*Determinación de pH óptimo para la G6PDH cortade T. cruzi.Para la determinación del pH óptimo para la actividad de la G6PDH cortarecombinante de T. cruzi, serealizaron medidas espectrofotométricas de la actividad de la enzima purificada por columna de Ni 2+ enun rango real de pH de 6 a 9.8 a concentración saturante de ambos sustratos, 1 mM G6P y 0.5 mMNADP utilizando las soluciones amortiguadoras que se detallan a continuación: citrato de sodio pH 6 y6.4; trietanolamina/HCl pH 7.0 a 8.4, y glicina/NaOH pH 8.8 a 9.8.*Determinación de los parámetros cinéticos de la G6PDH cortay G6PDH largade T. cruzi.Los parámetros cinéticos correspondientes a la G6PDH cortarecombinante de T. cruzi fueron determinadosen presencia y en ausencia de DTT. Las muestras analizadas en presencia del agente reductor se incubarondurante 10 min con 62.5 mM DTT, y posteriormente se realizaron las determinaciones de actividadenzimática. El K maparente para la G6P se determinó variando la concentración de dicho sustrato entre30 y 1000 µM (manteniendo el NADP en concentración saturante, 500 µM). El K maparente paraNADP, por su parte, se determinó variando su concentración entre 1 y 500 µM (manteniendo la G6P aconcentración saturante, 1 mM). Estas medidas se llevaron a cabo en un espectrofluorómetro Aminco-Bowman Series 2, midiendo la emisión de fluorescencia del NADPH (longitud de onda de excitación340 nm, longitud de onda de emisión 450 nm), a temperatura constante (30 ºC). Las unidades arbitrariasde intensidad de fluorescencia fueron convertidas en cantidades µmolares de NADPH, mediante la

Materiales y Métodos - 133calibración del instrumento, a cada sensibilidad utilizada, con soluciones de NADPH de concentraciónconocida.El K maparente para sustrato y cofactor correspondiente a la G6PDH largade T. cruzi se llevó a caboutilizando el mismo rango de concentraciones utilizado para la G6PDH cortacon la excepción de quedichas determinaciones se realizaron únicamente en ausencia del agente reductor y las medidas se realizaronen espectrofotómetro. En las mismas condiciones se determinó el K maparente para G6P correspondientea la G6PDH nativaen extracto total de epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener.Antes de llevar a cabo estas determinaciones tanto el NADP como la G6P fueron valorados. La titulacióndel NADP se llevó a cabo de manera directa de acuerdo al siguiente modo: se preparó una solución 50mM en agua bidestilada de dicho compuesto, se realizó una dilución 1/1000 del mismo, y se determinóla absorbancia de dicha solución a 259 nm. Luego, utilizando el coeficiente de extinción molar delNADP (18µmoles -1 .ml) fue posible obtener la concentración real de la solución preparada. La titulaciónde la G6P en cambio, se llevó a cabo por un método indirecto, ya que dicho sustrato no puede serdetectado espectrofotométricamente. Para esto se utilizó la propia reacción llevada a cabo por la G6PDH,midiendo la aparición de NADPH a 340 nm. Se trabajó con concentraciones bajas de 6PG(aproximadamente 80 µM) y un exceso de G6PDH (se utilizó G6PDH de Leuconostoc mesenteroidesSIGMA). Se midió la A 340 nminicial (antes del agregado de la G6P y en presencia de la enzima), y la Afinal, luego de alcanzada la meseta por consumo total del sustrato. Por último se realizó el cociente340 nmde la diferencia entre los dos valores de A obtenidos y el coeficiente de extinción molar del NADPH(6.22 µmoles -1 .ml ) obteniéndose así los µmoles NADPH generados durante la reacción, que tienencorrelación directa con los µmoles de sustrato (G6P) consumidos, ya que la presente reacción es1mol:1mol.*Determinación de actividad de la 6PGDH de T. cruziLas determinaciones de actividad enzimática se llevaron a cabo en la dirección de la decarboxilaciónoxidativa del 6-fosfogluconato (6PG), monitoreando la reducción del NADP a 340 nm [Cronin y col;1989]. Rutinariamente las medidas se llevaron a cabo en un espectrofotómetro Beckman DU ® Series600, a temperatura constante (30ºC), utilizando cubetas de cuarzo de 100 µl de capacidad. Las mezclasde reacción estándar contenían: 50 mM trietanolamina pH 7.5, 5 mM Cl 2Mg, 0.5 mM NADP y 1 mM6PG.

Materiales y Métodos - 134*Determinación de pH óptimo para la 6PGDH de T. cruziPara la determinación del pH óptimo para la actividad de la 6PGDH recombinante mutada de T. cruzi,se realizaron medidas espectrofotométricas de la actividad de la enzima en un rango real de pH de 6.3a 9.7 a concentración saturante de ambos sustratos, 1 mM 6PG y 0.5 mM NADP. Esto se llevó a caboutilizando la enzima recombinante purificada por columna de Ni 2+ (tal como se describe más arriba), enpresencia de diferentes soluciones amortiguadoras: citrato de sodio pH 6; imidazol/HCl pH 6.3 y 6.8;trietanolamina/HCl pH 7.5 y 8.4, y glicina/NaOH pH 8.8 y 9.8. Todas ellas se utilizaron a unaconcentración final de 50 mM. Para descartar efectos de inhibición o activación de la enzima por lacomposición de los diferentes amortiguadores utilizados, se combinaron todos ellos a una concentraciónde 50 mM cada uno, para determinar la actividad de la enzima a pH 7.5 y 7.8. Los valores asíobtenidos fueron comparados con los alcanzados mediante la utilización de soluciones del mismo valorde pH pero de un único componente. Los estudios de la estabilidad de la enzima a los distintos valoresde pH se llevaron a cabo incubando la proteína recombinante, durante 10 min a 4 ºC en la mezcla dereacción conteniendo todos los reactivos excepto el 6PG, e iniciando la reacción mediante el agregadode dicho sustrato. En todos los casos el pH real de la reacción se determinó en muestras simuladasconteniendo todos sus componentes excepto la enzima.*Determinación de los valores de K maparentes y reales para la 6PGDH de T. cruzi. Perfiles deinhibición.Para la determinación del K maparente, para ambos sustratos, de ambas enzimas recombinantes (salvajey doble mutante) y de la enzima nativa parcialmente purificada, las concentraciones de 6PG y NADPse variaron entre 3 y 90 µM, y entre 2 y 40 µM, respectivamente. En ambos casos el otro sustrato semantuvo a una concentración fija: 500 µM NADP, y 1 mM 6PG. Dichos ensayos se llevaron a caboutilizando como amortiguador 50 mM trietanolamina pH 7.5, en un espectrofluorómetro Aminco-Bowman Series 2, midiendo la emisión de fluorescencia del NADPH (longitud de onda de excitación340 nm, longitud de onda de emisión 450 nm), a temperatura constante (30 ºC). Las unidades arbitrariasde intensidad de fluorescencia fueron convertidas en cantidades µmolares de NADPH, mediante lacalibración del instrumento, a cada sensibilidad utilizada, con soluciones de NADPH de concentraciónconocida. Los ensayos cinéticos llevados a cabo para la determinación de los valores de K mreal parasustrato y cofactor de la 6PGDH recombinante de T. cruzi, se realizaron variando las concentracionesde 6PG entre 15 y 90 µM, manteniendo el NADP en 4 concentraciones fijas (6, 12, 24 y 36 µM). Los

Materiales y Métodos - 135valores de K mreal se determinaron a partir de los gráficos secundarios de las pendientes y ordenadas laorigen de las rectas obtenidas a partir de las representaciones de Lineweaver-BurkA su vez, para llevar a cabo la determinación de los parámetros cinéticos de la enzima, los sustratosfueron previamente valorados. El NADP se tituló de manera directa tal como se describió anteriormente.La titulación del 6PG en cambio, se llevó a cabo por un método indirecto, ya que dicho sustrato nopuede ser detectado espectrofotométricamente. Para esto se utilizó la propia reacción llevada a cabopor la 6PGDH, midiendo la aparición de NADPH a 340 nm. Se trabajó con concentraciones bajas de6PG (aproximadamente 160 µM) y un exceso de 6PGDH. Se midió la A 340 nminicial (antes del agregadodel 6PG, y en presencia de la enzima), y la A 340 nmfinal, luego de alcanzada la meseta por consumo totaldel sustrato. Por último se realizó el cociente de la diferencia entre los dos valores de A obtenidos y elcoeficiente de extinción molar del NADPH (6.22 µmoles -1 .ml ) obteniéndose así los µmoles NADPHgenerados durante la reacción, que tienen correlación directa con los µmoles de sustrato (6PG)consumidos, ya que la presente reacción es 1mol:1mol.*Estudios de inhibición.Se estudió el efecto inhibitorio de varios compuestos sobre la actividad de la 6PGDH de T. cruzi. Estose llevó a cabo mediante la determinación de actividad enzimática (en presencia de distintasconcentraciones del agente inhibidor), variando las concentraciones de 6PG o NADP + mientras semantenía el otro sustrato en cantidades saturantes. Estas medidas también fueron llevadas a cabo enespectrofluorómetro a temperatura constante 30 ºC, utilizando trietanolamina 50 mM pH 7.5 comoamortiguador.Determinación de concentración proteica.La determinación de la concentración de proteínas de los distintos tipos de muestras analizados se llevóa cabo por el método de Bradford [1996], utilizando seroalbúmina bovina (BSA) como estándar.

Materiales y Métodos - 136Modelado molecular de la 6PGDH de T. cruzi.El modelado molecular de la G6PDH de T. cruzi se llevó a cabo utilizando la estructura tridimensionalde cada uno de los monómeros de la 6PGDH de T. brucei como templado (códigos ExPDB: 1PGJA y1PGJB), utilizando el servidor automático de modelado de proteínas por homología (SWISS-MODEL)[Guex y col; 1997] [Peitsh; 1995] [Peitsh; 1996].Preparación del ARN total de parásitos mediante el método de TRIZOL ®El ARN total de los distintos estadíos de T. cruzi clon Cl Brener se extrajo de acuerdo al siguienteprotocolo: 10 9 epimastigotes lavados con PBS o bien 10 9 tripomastigotes metacíclicos, tripomastigotesde cultivo o amastigotes se resuspenden en 3 ml o 1 ml respectivamente de reactivo de TRIZOL ®(GIBCO BRL, Life Technologies) que es una solución homogénea de fenol e isotiocianato de guanidinio.Dicho reactivo produce la lisis celular manteniendo en todo momento la integridad del ARN. Una vezresuspendidos los parásitos se los incuba durante 5 min a temperatura ambiente para permitir la disociacióncompleta de los complejos nucleoproteína. Posteriormente se agregan 0.2 ml de cloroformo por cada 1ml de TRIZOL ® se agita vigorosamente durante 15 seg, se incuba la muestra en hielo de 2 a 3 min. yluego se centrifuga a 12.000 x g durante 15 min a 4 ºC. Se separa el sobrenadante (fase acuosa) quecontiene el ARN y se lo precipita mediante el agregado de isopropanol, en una relación de 0.5 ml dedicho compuesto por cada 1 ml de TRIZOL ® utilizado. Se incuba la muestra en hielo 10 min. yposteriormente se la centrifuga a 12.000 x g durante 20 min. Se remueve el sobrenadante y se lava elprecipitado con etanol 75 %. Se seca brevemente el pellet y luego se resuspende el ARN en 25 mMEDTA, 0.1 % SDS. La cuantificación del ARN obtenido se realiza midiendo la absorbancia de lamuestra a 280 y 260 nm. Es deseable que la relación A 260/A 280sea mayor a 1.8, lo que indica bajocontenido proteico en la muestra, y buena solubilización de la misma. La integridad del ARN purificadose corrobora mediante electroforesis en geles de agarosa (1.2-1.5 %).

Materiales y Métodos - 137Transcripción reversa, síntesis de la primera hebra de ADNc.A partir del ARN total de parásitos extraído tal como se detalló anteriormente, se realizó la síntesis de laprimera hebra de ADNc. Esto se llevó a cabo se acuerdo al siguiente protocolo: se incuban 5 µg deARN total, con 500 ng de un oligonucleótido anti sentido durante 10 min. a 72 ºC, posteriormente seenfría la muestra y se agrega DTT, dNTPs y 200 U de la transcriptasa reversa SuperScript II (GIBCOBRL) en la solución amortiguadora correspondiente a la enzima, se incuba a 42 ºC durante 60 min, yfinalmente se detiene la reacción mediante el calentamiento de la muestra a 90ºC durante 10 min. ElADN casí sintetizado se conserva a -20ºC hasta su uso.Preparación de ADN total de T. cruzi .El ADN total de epimastigotes de T.cruzi clon CL Brener se extrajo de acuerdo al siguiente protocolo:se cosechan los parásitos por centrifugación a 3500 rpm durante 10 min, se lava el pellet con soluciónamortiguadora Tris HCl 10 mM pH 7.6, y se lo resuspende (a razón de 10 ml de solución por cada 1 gr.de pellet) en el mismo amortiguador conteniendo 100 mM ClNa; 100 mM EDTA y 1 % SDS paraproducir la lisis celular. Posteriormente se agrega proteinasa K a una concentración final de 100 µg.ml -1y se incuba toda la noche a 50 ºC luego de lo cual se agrega RNAsa, concentración final 100 µg.ml -1 ,y se incuba durante 2 hs más a 37 ºC. Por último se realiza la eliminación de las proteínas presentes enla muestra mediante sucesivas extracciones con fenol (equilibrado en Tris-HCl pH 8), y fenol:cloroformo(1:1). Esto se repite hasta la completa desaparición de la interfase blanca (proteica), presente entre lafase acuosa y la orgánica. Posteriormente se realiza una última extracción con 1 volumen de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), y se precipita el ADN con 2.5 volúmenes de etanol 100%. El precipitado selava con etanol 70% y se resuspende en agua milli Q autoclavada. La cuantificación del ADN obtenidose realiza mediante la determinación de A 260nm.

Materiales y Métodos - 138Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).Rutinariamente las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 50 µl, utilizando 0.2 Ude Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen, Life Technologies) por reacción (en la soluciónamortiguadora provista por el fabricante). La concentración de Cl 2Mg se ajustó a cada reacción enparticular, siendo sin embargo 1.5 mM la concentración final más utilizada. Cada reacción de PCRcontenía además 240 ng de cada uno de los oligonucleótidos, y 0.2 mM de cada uno de losdeoxinucleósidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP, dGTP). Las condiciones generales de las reaccionesllevadas a cabo, involucran los siguientes pasos: 1) Desnaturalización del ADN por calentamiento a 94ºC durante 5 min. 2) Ciclado (por lo general se utilizaron 35 ciclos) y comprende 3 pasos: A-desnaturalización a 94 ºC durante 45 seg. B-Pegado del oligonucleótido, (la temperatura utilizadaestá relacionada con la longitud y composición del mismo) durante 45 seg. y C-Elongación a 72 ºC (eltiempo de elongación depende del tamaño del inserto a amplificar, y se lo calcula a razón de 1 min porcada kpb). 3) Extensión final, a 72 ºC durante 10 min.*Colony PCR.La técnica de colony PCR es un método rápido de detección de presencia de inserto en un determinadoplásmido, a partir de colonias bacterianas individuales crecidas en LB-agar en presencia de antibiótico.Dicha técnica se llevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo: se pica parte de la colonia con unapunta de pipeta estéril, y se la resuspende en agua Milli Q autoclavada. Se lisan las bacterias mediantecalentamiento a 90-100 ºC durante 10 min., y luego se centrifuga 10 min a 14.000 rpm . 5µl delsobrenadante se utilizan como molde para llevar a cabo la reacción de PCR de acuerdo al protocoloantes mencionado, con la excepción de que el volumen final de la reacción se reduce a 25 µl.*Mutación del gen de 6PGDH.El gen de la 6PGDH de T. cruzi clonado en el vector de expresión pET28a(+) fue sometido a dosmutaciones por PCR mediante la utilización del kit QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis(Stratagene). Mediante este método es posible realizar mutaciones puntuales dentro de una secuenciade ADN sin la necesidad de poseer un vector específico; es un método rápido que se lleva a cabo encuatro pasos y posee una eficiencia mayor al 80 %. Esta técnica se realizó de acuerdo al siguienteprotocolo: para cada mutación se diseñaron dos oligonucleótidos totalmente complementarios entre siconteniendo la base a ser mutada en el centro de dicha secuencia. De esta manera, para la mutación

Materiales y Métodos - 139C257R, se utilizó el siguiente oligonucleótido: 5´-GAACACGTCAAGGACCGTATTGGTTCTAAAG-3´ y su complementario. El que se muestra a continuación, en cambio, fue utilizado para realizar lamutación V244D 5´-GCGCGTGCCAAGGATGCGGATGGCAGC-3´ (en ambos casos la base sujetaa reemplazo se marca con negrita). La reacción de PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones:como molde se utilizaron 10 ng de plásmido purificado por la técnica de mini prep a partir de bacteriascon capacidad de metilar el ADN, 125 ng de cada uno de los oligonucleótidos antes mencionados, 0.2mM de cada uno de los dNTPs, y 2.5 U de Pfu Turbo DNA polimerasa (Stratagene), en el buffer dereacción para la enzima. En estas condiciones la polimerasa replica ambas hebras del plásmido con altafidelidad, a razón de 2 min/kpb, sin desplazar a los oligonucleótidos que contienen la mutación. Estosúltimos son extendidos durante el tiempo de ciclado generándose así un plásmido mutado no circular, yaque posee un corte entre el extremo 5´ del oligonucleótido, y el 3´del plásmido amplificado. Una vezfinalizado el ciclado, el producto de PCR se trata durante 1 hora a 37ºC con 10 U de la enzima Dpn I,que posee la capacidad de degradar el ADN metilado y hemi metilado, (en este caso degradará el ADNdel plásmido parental, no mutado). Posteriormente se transforman E.coli XL1-Blue con 1 µl del productoanterior, para llevar a cabo la circularización del plásmido, ya que dichas bacterias poseen los mecanismosnecesarios de reparación del ADN. A continuación se corrobora la presencia de la mutación mediantesecuenciación. Para el caso de la 6PGDH de T. cruzi, las mutaciones se realizaron de a una por vez. Enprimera instancia se llevó a cabo la mutación V244D, una vez confirmada, dicho plásmido se utilizócomo molde para la segunda mutación C257R. El plásmido doble mutante así obtenido fue utilizadopara transformar E. coli BL21 Codon Plus, para llevar a cabo la expresión de la proteína recombinantetal como se explica más adelante.Digestión de ADN genómico con enzimas de restricción.El ADN genómico obtenido tal como se mencionó anteriormente fue sometido a digestión con enzimasde restricción de acuerdo al siguiente protocolo: se colocan 5 µg de ADN total por reacción en presenciade la solución amortiguadora correspondiente a la enzima de restricción a utilizar y seroalbúmina bovina(si es necesario) en un volumen final de 27 µl. Se incuba de 5-10 min a 65 ºC hasta obtener unacompleta homogenización de la muestra, y luego se la coloca en hielo durante 30 min. Posteriormente seagrega 1µl de la enzima de restricción diluida 1/2 en su respectivo amortiguador, se homogeniza y seincuba a la temperatura de trabajo de la enzima durante 1 hora luego de lo cual se adiciona nuevamente

Materiales y Métodos - 1401µl de la enzima diluida 1/2 y se incuba durante 3 hs más a la misma temperatura. Para asegurar unadigestión completa del ADN, se agrega 1µl de la enzima sin diluir, se homogeniza nuevamente la muestray se incuba durante toda la noche. La inactivación de las enzimas se lleva a cabo por calentamiento a 65ºC durante 10 min o mediante extracciones de la muestra con fenol-cloroformo. La eficiencia de ladigestión se verifica mediante electroforesis en geles de agarosa 0.8 %.Marcación de sondas por PCR.Las sondas utilizadas en los experimentos de Southern blot y Northern blot, fueron marcadas por PCRcon dCTP 32 de acuerdo al siguiente protocolo: el fragmento de DNA a ser utilizado como sonda seamplifica mediante una reacción de PCR convencional (fría) y se lo purifica a partir de geles de agarosamediante QIAEX II Agarose gel extraction kit (QIAGEN ® ). 10 ng del fragmento purificado se utilizancomo molde para llevar a cabo la PCR radiactiva donde se utilizan 200 ng de cada uno de losoligonucleótidos especificos, dATP, dGTP y dTTP a una concentración de 1 µM final cada uno, 1.5 mMCl 2Mg, 50 µCi de dCTP 32 y 0.2 U de Taq DNA polimerasa recombinante (Invitrogen, Life Technologies)en el amortiguador correspondiente a la enzima. Una vez finalizada la amplificación se procede a laseparación de la sonda de los nucleótidos libres mediante columnas de filtración en gel de Sephadex-G50 equilibradas en amortiguador TE. Previo a su inyección la sonda se desnaturaliza durante 5 min a95ºC.Southern blot.La técnica de Southern blot se llevó a cabo de acuerdo al protocolo descripto en Sambrook y col[1989]: los fragmentos de ADN genómico obtenidos mediante digestión con enzimas de restricción, seseparan electroforéticamente en geles de agarosa 0.8 % de 0.5 cm de espesor, conteniendo bromuro deetidio. La electroforesis se lleva a cabo en amortiguador TBE 0.5 x a 2 V/cm. Una vez finalizada lamisma, se fotografía el gel y se lo coloca en una solución desnaturalizante (0.5 N NaOH, 1.5 M ClNa)durante 45 min. Posteriormente se lleva a cabo la neutralización del gel mediante su incubación durante50 min en una solución de Tris HCl 1 M, pH 7.4, 1.5 M ClNa. Los fragmentos de ADN son

Materiales y Métodos - 141posteriormente transferidos a membranas de Nylon (Hybond TM N + , Amersham LIFE SCIENCE), porcapilaridad, durante toda la noche, utilizando como amortiguador SSC 10X. Una vez finalizado el tiempode transferencia, se enjuaga el filtro con una solución SSC 2x y se fija el ADN a la membrana mediantesu exposición a luz ultravioleta (en el caso particular de este trabajo de Tesis esto se llevó a cabomediante la utilización de un aparato CL 1000 utraviolet crosslinker UVP y la intensidad de la luzultravioleta utilizada fue de 120.000 µJ/cm 2 durante 30 seg). A continuación se lleva a cabo la prehibridizaciónde la membrana (para evitar el pegado inespecífico de la sonda) mediante su incubaciónen una solución conteniendo 6 X SSC, 1 % SDS, 10 X reactivo de Denhardt y 250 µg.ml -1 de ADN deesperma de salmón desnaturalizado (Sigma) durante 3 hs a 65 C. Posteriormente se inyecta la sonda yse incuba toda la noche en baño termostatizado. La temperatura de incubación de este paso depende dela naturaleza de la sonda (para el caso particular de sondas homólogas la temperatura usualmente utilizadaes 64 ºC). Una vez finalizada la hibridización se procede llevar a cabo sucesivos lavados de la membranamediante la utilización de una solución 0.2 X SSC, 0.1 % de SDS a 63 ºC (en condiciones de altaastringencia). Posteriormente se realiza la detección de la señal mediante la sensibilización de placasradiograficas AGFA GP-BU New Medical X-Ray Film.Northern blotLa técnica de Northern blot se llevó a cabo de acuerdo al protocolo descripto por Fourney y col[1978]: el ARN total extraído tal como se describió anteriormente, es separado por electroforesis encondiciones desnaturalizantes, en geles de agarosa 1.5 % conteniendo 0.66 M de formaldehído. Secolocan de 10-30 µg de RNA total por muestra disuelto en una solución conteniendo formamidadeionizada, formaldehído, glicerol, bromuro de etidio y azul de bromofenol, en MOPS 10 x comosolución amortiguadora. La electroforesis se lleva a cabo en dicho amortiguador a 80V constantesdurante 4-5 hs. Una vez finalizada la misma, se fotografía el gel, y posteriormente se lo equilibra durante40 min. en 10 x SSC para posteriormente llevar a cabo la transferencia. Esta última se realiza pordifusión pasiva durante toda la noche utilizando membranas de Nylon (Hybond TM N + , Amersham LIFESCIENCE), de acuerdo al mismo protocolo antes descripto para la técnica de Southern blot, al igualque la fijación del ARN a la membrana, la pre-hibridización , hibridización y lavado de los filtros.

Materiales y Métodos - 142Electroforesis en campo pulsante (Pulse Field gel electrophoresis)La separación de los cromosomas de epimastigotes de T. cruzi, clon CL Brener mediante electroforesisen campo pulsante se llevó a cabo de acuerdo al siguiente protocolo:*Preparación de las muestras.Se cosechan epimastigotes de T. cruzi del clon CL Brener mediante centrifugación, se los lava conPBS-G y se los resuspende en la misma solución amortiguadora a una concentración de 10 9 células/ml.Luego los parásitos se diluyen en igual volumen de agarosa de bajo punto de fusión al 1 % y se losdistribuye en soportes pre-armados (BIO-RAD) a razón de 40 x 10 6 células por pocillo. Una vezsolidificados los bloques de agarosa son tratados con solución amortiguadora de lisis: 0.5 M EDTA pH9.5, 1 % Sarcosil, 20 mg.ml -1 de proteinasa K durante 48 hs a 50 ºC, para llevar cabo la lisis celular y ladegradación de las proteínas. Posteriormente los bloques son lavados con 10 mM Tris-HCl pH 8, y sonfinalmente almacenados en 0.5 M EDTA pH 8 a 4 ºC hasta su uso.*Electroforesis y detección de los genes de la G6PDH de T. cruzi.La separación de los cromosomas obtenidos en el paso anterior se llevó a cabo en un gel de agarosa 1.2% a 14 ºC en un aparato CHEF-DR ® III Pulse Field Electrophoresis System (BIO-RAD) utilizandocomo solución amortiguadora TBE 0.5 X. La corrida electroforética se llevó a cabo a 4 V.cm -1 deacuerdo a los siguientes parámetros: Bloque 1) Tiempo de corrida: 24 hs, ángulo 120º, tiempo de rampa60-120 seg. Bloque 2) Tiempo de corrida: 24 hs, ángulo 120º, tiempo de rampa 120-350 seg. Una vezfinalizada la electroforesis, los cromosomas fueron teñidos con bromuro de etidio y fotografiados. Antesde llevar a cabo la desnaturalización del ADN, se realizó la depurinación del mismo mediante la incubacióndel gel en presencia de una solución 0.2 N de HCl, (esto se lleva a cabo con la finalidad de fragmentarel ADN para favorecer su transferencia). Posteriormente el gel se lavó con agua deionizada durante 5min, y se realizó la desnaturalización y neutralización del mismo tal como se describe en el protocolo deSouthern blot. Finalmente se llevó a cabo la transferencia a membranas de Nylon (Hybond TM N + ,Amersham LIFE SCIENCE) por difusión pasiva tal como se describió anteriormente. El bloqueo,hibridización y lavado de los filtros se llevó a cabo tal como se describió en los protocolos de Southernblot y Northern blot.

Materiales y Métodos - 143Microscopía de fluorescencia.* Inmunofluorescencia indirecta utilizando segundos anticuerpos acoplados a fluoróforos.Las inmunofluorescencias indirectas correspondientes a los distintos estadíos del ciclo de vida de T.cruzi, se llevaron acabo de acuerdo al siguiente protocolo: cubreobjetos de 20 mm x 20 mm(MARIENFELD) previamente lavados con metanol son tratados durante 10 min con una solución0.25 mg.ml -1 de poli-L-lisina. Se retira dicha solución y se colocan 200 µl de una suspensión de parásitos2.5 x10 6 .ml -1 en PBS durante 10 min para llevar a cabo la adhesión de las células a la superficie delvidrio. Luego se realiza la fijación de los parásitos mediante su incubación durante 10 minutos con unasolución de paraformaldehído al 4% y posteriormente se lavan los preparados con 200 µl de PBS (dosveces). Luego se los incuba en presencia de ClNH 425 mM durante 10 min (para disminuir la señal defondo del paraformaldehido) y se los lava nuevamente con PBS. A continuación se lleva a cabo elbloqueo de los preparados, mediante su incubación durante 30 min con una solución conteniendo 2 %de BSA, 2% del suero normal (del animal a partir del cual se obtuvieron los segundos anticuerpos) y 0.1% saponina en PBS (este detergente se adiciona para permeabilizar la membrana celular). Posteriormentese realiza la incubación de los parásitos con el primer anticuerpo (diluído en solución de bloqueo)durante 1 hora, luego de lo cual se lavan exhaustivamente los preparados por inmersión para llevar acabo a continuación, la incubación (durante 1 hora) con el segundo anticuerpo y 4’,6’-diamidino-2fenilindol (DAPI), diluídos también en solución de bloqueo. Este último es un agente utilizado para lamarcación del ADN nuclear y mitocondrial debido a su capacidad de unirse específicamente al ADN.Por último, se lleva a cabo un lavado exhaustivo de los preparados con PBS, y finalmente se los montasobre portaobjetos con 15 µl de Fluor Save (CALBIOCHEM ® ).Los preparados controles se realizan de acuerdo al protocolo antes mencionado con la excepción deque en lugar del primer anticuerpo, se coloca suero normal del animal a partir del cual éstos fueronobtenidos.En el caso particular de este trabajo de Tesis los segundos anticuerpos utilizados (en dilución 1/1000)fueron anti conejo o anti ratón obtenidos en cabra conjugados con isotiocianato de fluoresceína o tetrametilrodamina (Alexa Fluor ® 488 o 546 (H+L) highly cross adsorbed ) Molecular Probes. Para la marcaciónde núcleo y kinetoplasto se utilizó DAPI-dilactato (Molecular Probes) en una concentración final de 5µg.ml -1 . Las imágenes fueron adquiridas en un microscopio Nikon Eclipse E600, mediante una cámaradigital Spot RT Slider Modelo Nº 2.3.1 (Diagnostic Instruments Inc; USA).

Materiales y Métodos - 144*Marcación del bolsillo flagelar de epimastigotes de T. cruzi y co-localización con la G6PDH.Para llevar a cabo la marcación del bolsillo flagelar de epimastigotes de T. cruzi, 10 7 parásitos(resuspendidos en 1 ml de medio BHT sin suero), se incuban durante 15 seg a temperatura ambientecon 100 µg de Concanavalina-A conjugada con tetrametil rodamina (Molecular Probes). A continuaciónse lleva a cabo la fijación de los mismos mediante su incubación durante 10 min con una solución deparaformaldehído 4% luego de lo cual los parásitos son adheridos a cubre-objetos pre-tratados conpoli-L-lisina tal como se describió anteriormente. A partir de este punto se continúa con el protocoloconvencional de inmunofluorescencia antes mencionado.*Marcación de aparato de Golgi en epimastigotes de T. cruzi y co-localización con la G6PDH.Para realizar la marcación del complejo de Golgi de epimastigotes de T. cruzi, 10 7 parásitos (resuspendidosen 1 ml de medio BHT sin suero) se incuban durante 1h a 4 ºC, en presencia de BODIPY ® TR C 5-ceramida complejada con BSA (Molecular Probes) a una concentración final de 5 µM. Posteriormentelos parásitos se lavan con BHT sin suero, y se incuban durante 30 min a 28 ºC, para permitir la acumulaciónde la ceramida en el complejo de Golgi. A continuación los parásitos se fijan con paraformaldehído 4 %como se describió anteriormente y se adhieren a cubreobjetos pretratados con poli-L-lisina. Luego selleva a cabo la inmunolocalización de la G6PDH de T. cruzi de acuerdo al protocolo convencional deinmunofluorescencia antes mencionado.Transfección de epimastigotes de T. cruzi clon CL Brener.Epimastigotes de T. cruzi clon Cl Brener fueron transfectados con el vector pTEX-GFP y pTEX-G6PDH corta-GFP, de acuerdo al siguiente protocolo: se cultivan los parásitos en medio BHT suplementadocon 10 % de suero fetal bovino a 28 ºC. Una vez alcanzada la fase logarítmica de crecimiento secosechan por centrifugación a 3500 g durante 10 min y se los resuspende en el mismo medio (sin suero)a una concentración de 8 x 10 8 células.ml -1 . A continuación 350 µl de la suspensión de parásitos seincuban durante 10 min en hielo en presencia de 40 µg de plásmido para posteriormente llevar a cabo laelectroporación mediante la aplicación de un pulso único de 335 V, 1400 µfaradios y 24 ohms. Lascélulas asi electroporadas se incuban durante 5 min. en hielo y luego se diluyen hasta un volumen final de3 ml en BHT suplementado con 10 % de suero fetal bovino. 48 hs. después de la transfección se agrega

Materiales y Métodos - 145G418 (Geneticina, GIBCO) a una concentración final de 50 µg.ml -1 . Los transformantes se seleccionangradualmente mediante el aumento en la concentración del antibiótico hasta llegar a una concentraciónfinal de 100 µg.ml -1 a las cuatro semanas. En los parásitos controles, el ADN plasmídico fue reeemplazadopor agua. Para la detección de los transformantes por inmunofluorescencia, 5 x 10 5 parásitos de cadauno de los cultivos fueron adheridos a cubreobjetos previamente tratados con poli-L-lisina, para luegollevar a cabo la fijación de los mismos y marcación del ADN nuclear y mitocondrial, tal como se describiócon anterioridad. En el caso de las co-localizaciones con el aparato de Golgi, los parásitos transfectadosfueron incubados con BODIPY ® TR C 5-ceramida complejada con BSA (Molecular Probes) de acuerdoal protocolo descripto más arriba.Análisis de la expresión de la G6PDH frente a estrés oxidativo en epimastigotes ytripomastigotes metacíclicos de T. cruzi.La expresión de la G6PDH en respuesta a condiciones de estrés oxidativo generado por H 2O 2se llevóa cabo con epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos de T. cruzi purificados por cromatografía deintercambio iónico (DEAE-celulosa). Debido a que el H 2O 2puede reaccionar con distintos componentesde los medios de cultivo convencionales haciendo imposible determinar la concentración real de dichocompuesto en la solución, los experimentos se llevaron a cabo incubando los parásitos en una soluciónamortiguadora denominada IB (5 mM ClK, 80 mM ClNa, 2 mM Cl 2Mg, 16.2 mM Na 2HPO 4, 3.8 mMNaH 2PO 4, 50 mM glucosa, pH 7.4, 0.15 % seroalbúmina bovina (W/V)) conteniendo 200 mg/L derojo fenol (este último compuesto se utiliza como indicador de la reacción enzimática empleada para ladeterminación de la concentración de H 2O 2en la solución). Esto se llevó a cabo tal como se detalla acontinuación: se prepara una curva de calibración en solución amortiguadora IB con distintasconcentraciones de H 2O 2a partir de una solución stock previamente titulada mediante la determinaciónde absorbancia a 230 nm (coeficiente de extinción molar 81 M -1 .cm). 100 µl correspondientes a cadauno de los puntos de la curva de calibración se colocan en tubos eppendorf a los cuales se les adiciona1 µl de una solución (12 mg/ml) de peroxidasa equina (SIGMA) y se incuba a 37 ºC durante 5 min luegode lo cual se detiene la reacción mediante el agregado de 2 µl de NaOH 2 M y se determina A 610 nm. Laconcentración real de H 2O 2en la solución conteniendo los parásitos se lleva a cabo a partir de la curvade calibración antes mencionada La determinación de su valor de A 610 nmse realiza de acuerdo alprotocolo mencionado con anterioridad con la excepción de que previamente al agregado de la peroxidasa

Materiales y Métodos - 146la muestra se centrifuga a 5000 rpm durante 10 min para precipitar los parásitos y llevar a cabo lasdeterminaciones con el sobrenadante.Los experimentos de estrés oxidativo propiamente dichos se llevaron a cabo de acuerdo al protocoloque se detalla a continuación: epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos purificados (previamentelavados dos veces con solución amortiguadora IB) se resuspenden en dicha solución a razón de 10 7células/ml. 14 ml de la suspensión de parásitos (1.4 x10 8 células) se centrifugan a 4000 rpm durante 5min, se descarta el sobrenadante, el pellet se lava dos veces con Tris HCl 50 mM pH7.6, 1 mM EDTA,100 µM E64 y 0.5 mM TLCK, y se congela a –70 ºC hasta su procesamiento (este punto es consideradoT0). Otros 80 µl de la suspensión se separan para llevar a cabo inmunofluorescencias de acuerdo alprotocolo descripto con anterioridad. Al resto de la suspensión de parásitos se le adiciona H 2O 2hastauna concentración final de 20 o 70 µM para epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos respectivamente.Inmediatamente después 100 µl de la misma se toman para la determinación de la concentración inicialreal de H 2O 2de acuerdo al protocolo mencionado con anterioridad. Este procedimiento se repite cada30 min a lo largo de todo el experimento para seguir la disminución en la [H 2O 2] debido al metabolismocelular. En los experimentos llevados a cabo con trimastigotes metacíclicos a las 4, 5 y 6 hs posterioresa la adición del H 2O 2se separan 14 ml de muestra se precipitan los parásitos por centrifugación (talcomo se mencionó anteriormente), se lava el pellet con Tris HCl 50 mM pH7.6, 1 mM EDTA, 100 µME64 y 0.5 mM TLCK, y se congela a –70 ºC hasta su procesamiento. También en cada uno de dichosintervalos de tiempo se aíslan 80 µl de muestra para llevar a cabo inmunofluorescencias. Una vez finalizadaesta parte del experimento se realiza la obtención de los extractos totales libres de células de cada unode los pellets de parásitos mediante congelamiento y descongelamiento. Se determina la actividadcorrespondiente a la 6PGDH y G6PDH como así también la concentración de proteína total en lasmismas. Finalmente se siembran los extractos totales en geles de poliacrilamida 7.5 %, se los transfierea filtros de nitrocelulosa y se llevan a cabo ensayos de Western Blot. Los experimentos controles serealizaron mediante la incubación de los parásitos en solución amortiguadora IB pero en ausencia deH 2O 2. Las muestras se tomaron a los mismos intervalos de tiempo y se analizaron mediante ladeterminación de actividad enzimática para ambas deshidrogenasas.

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Notas