estrés crónico y plasticidad neuronal - IIB-INTECH - Universidad ...

Universidad Nacional de San MartínInstituto de Investigaciones Biotecnológicas-INTECH-CONICETLa familia de las proteínas proteolipídicas:estrés crónico y plasticidad neuronalLic. María Eugenia FernándezDirector: Dr. Alberto Carlos C. FraschTesis para optar al título de Doctora en Biología Molecular yBiotecnologíaOctubre de 2008

Resumenafectada en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico. Además, lasobreexpresión de esta proteína no induce la formación de filopodios en cultivos primariosde neuronas de hipocampo. Dado que la expresión de M6a se encuentra regulada por elestrés crónico y los antidepresivos, y debido a su rol en plasticidad sináptica, el gen quecodifica para la proteína M6a (GPM6A) representa un candidato a tener en cuenta enrelación a neuropatologías tales como la depresión. Es por ello que durante esta tesis inicióel estudio de polimorfismos en el gen GPM6A en muestras de pacientes con depresión.Los resultados descriptos en esta tesis sugieren que la disminución en la expresión deM6a y M6b podría ser, en parte, responsable de las alteraciones estructurales encontradasen el hipocampo de animales sometidos estrés crónico y que las proteínas proteolipídicasdeberían ser consideradas en enfermedades relacionadas al estrés tales como la depresión.2

SummarySUMMARYProlonged exposure to stressful situations can bring severe consequences for thebrain, conferring susceptibility to certain psychiatric disorders such as depression. Thehippocampal formation, which possesses a remarkable degree of plasticity, is particularlysensitive to stress. Morphological alterations have been described in the hippocampus ofdifferent animal models of chronic stress which include a reduction of apical dendriticbranching and total dendritic length in CA3 pyramidal neurons, as well as reorganizationwithin the mossy fiber terminals. Chronic stress has been also found to induce retraction ofthorny excrescences and loss of synapses in CA3 neurons. It is worth noting thatantidepressant treatment can prevent most of the described stress effects. The molecularpathways underlying the plastic alteration found in the hippocampus of chronically stressedanimals as well as the mechanisms involved in the therapeutic effect of antidepressantsremain largely unknown.Previous studies in our lab revealed that the expression of membrane glycoprotein 6a(M6a) in the hippocampus is modulated by chronic stress and antidepressant treatment.Therefore, the first aim of the present work was to study possible biological functions forM6a. Through gain and loss of function approaches in cultured hippocampal neurons, wefound that M6a is a key modulator for neurite outgrowth and filopodium/spine formationand it may also be involved in the establishment of synapses. In addition, the capacity ofM6a to induce filopodium formation was not confined to primary cultures of hippocampalneurons but was conserved in neuronal (N2a and PC12) and non-neuronal (COS-7) cell lines.M6a belongs to the family of proteolipid proteins. In mammals, other members of this familyinclude membrane glycoprotein 6b (M6b), PLP and its splice variant DM20. Then, weanalyzed other members of the proteolipid protein family we found that the expression ofmembrane glycoprotein 6b (M6b) and DM20 in the hippocampus is also regulated by chronicrestraint stress in mice. In addition, we showed that M6b and DM20 can also inducefilopodium formation in hippocampal neurons, N2a and COS-7 cells. On the other hand, PLPexpression was not found to be altered in the hippocampus of chronically stressed animals.Moreover, PLP overexpression does not induce filopodium formation in hippocampalneurons. Given M6a expression regulation by chronic stress and antidepressants, and due toits role in neuroplasticity, the gene coding for M6a (GPM6A) represents a candidate to betaken into account in neuropathologies such as depression. For this reason, in this work we3

Summaryalso started analyzing polymorphisms in GPM6A in samples of patients suffering fromdepression.Our results reveal that the down-regulation in the expression of M6a and M6b maybe in part responsible for the plastic alterations found in the hippocampus of chronicallystressed animals and that proteolipid proteins should be considered in stress relateddisorders such as depression.4

PublicacionesPUBLICACIONESParte de los resultados obtenidos en esta tesis han sido incluidos en los siguientesartículos:• “The stress-regulated protein M6a is a key modulator for neurite outgrowth andfilopodium/spine formation”. J. Alfonso*, ME. Fernández*, B. Cooper, G. Flugge, AC.Frasch. Proc Natl Acad Sci USA 2005 Nov 22; 102(47):17196-201.• “Conserved cellular function and stress-mediated regulation among members ofthe proteolipid protein family”. ME. Fernández, J. Alfonso, AC. Frasch. Manuscritoen preparación.*Contribución ecuánime5

AbreviaturasABREVIATURASACTH: hormona corticotrópicaADN: ácido desoxirribonucleicoADNc: ácido desoxirribonucleico copiaARN: ácido ribonucleicoARNm: ARN mensajeroBDNF: factor neurotrófico derivado del cerebroCA: Cornu AmmonisCDS: región codificanteCK2: proteína quinasa CK2CRF: factor liberador de la corticotrofinaGFP: proteína verde fluorescenteHPA: eje hipotalámico-pituitario-adrenalLTD: depresión a largo plazoLTP: potenciación a largo plazoM6a: glicoproteína de membrana 6aM6b: glicoproteína de membrana 6bN2a: neuroblastoma 2aPCR: reacción en cadena de la polimerasaPLP: proteína proteolipídicaPC12: feocromocitoma 12PKC: proteína quinasa CPVN: núcleo paraventricular del hipotálamoRT: retrotranscripciónSEM: error estándar de la mediaSNC: sistema nervioso centralTM: transmembrana6

ÍndiceÍNDICE1. INTRODUCCIÓN1.1 El estrés crónico1.2 Modelos animales de estrés crónico1.3 Efectos del estrés crónico sobre el hipocampo1.4 Genes regulados por el estrés y los antidepresivos1.5 La glicoproteína de membrana 6 (M6a) y la familia de las proteínasproteolipídicas (PLPs)1.6 Plasticidad neuronal101013141819212. OBJETIVOS263. RESULTADOS3.1 ESTUDIO FUNCIONAL DE LA GLICOPROTEÍNA M6a CUYA EXPRESIÓN EN ELHIPOCAMPO ES REGULADA POR EL ESTRÉS3.1.1 Localización de la proteína M6a en cultivos primarios de neuronas dehipocampo3.1.2 La sobreexpresión de M6a induce la formación de neuritas y defilopodios/espinas3.1.3 La reducción en los niveles de M6a produce una disminución en la densidadde filopodios/espinas y en el número de puntos de sinaptofisina3.1.4 Efectos de la sobreexpresión de M6a en líneas neuronales y no neuronales3.1.5 La localización de M6a no depende de la integridad del citoesqueleto deactina3.1.6 La formación de filopodios inducida por M6a no estaría mediada porproteínas GTPasas de la familia Rho3.1.7 La palmitoilación y la fosforilación en los loops extracelulares de M6a noserían necesarias para su función en la formación de filopodios2727272933363940417

Índice3.2 LA FAMILIA DE LAS PROTEÍNAS PROTEOLIPÍDICAS: REGULACIÓN POR EL ESTRÉSCRÓNICO Y ROL EN LA FORMACIÓN DE FILOPODIOS3.2.1 Homología entre los miembros de la familia de las PLPs3.2.2 Efectos del estrés crónico sobre la expresión de los miembros de la familia delas PLPs3.2.3 Isoformas de M6b3.2.4 Clonado y expresión de isoformas de M6b y PLP3.2.5 M6b y DM20 inducen la formación de filopodios en cultivos primarios deneuronas de hipocampo y en líneas celulares4545464850533.3 ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN EL GEN QUE CODIFICA PARA LA PROTEÍNAM6a (GPM6A) EN PACIENTES CON DEPRESIÓN594. DISCUSIÓN4.1 M6a y M6b podrían estar involucradas en el remodelado neuronal observado enel hipocampo de animales estresados crónicamente4.2 Evolución y homología funcional entre los miembros de la familia de lasproteínas proteolipídicas4.3 Mecanismos que subyacerían la formación de filopodios mediada por lasproteínas proteolipídicas4.4 M6a y la acción terapéutica de los antidepresivos4.5 Polimorfismo en GPM6A asociado a síntomas de depresión6162646669705. CONCLUSIONES GENERALES736. PERSPECTIVAS FUTURAS747. MATERIALES Y MÉTODOS7.1 Cultivos celulares7.2 Ensayos de inmunocitoquímica7.3 Ensayos de despolimerización de la F-actina, marcación de las membranascelulares e identificación de las células viables7.4 Construcción de los plásmidos utilizados en las transfecciones76767677778

Índice7.5 ARN de interferencia7.6 Transfección de los plásmidos y el ARN de interferencia7.7 Cuantificación de células, procesos neuronales y puntos de sinaptofisina7.8 Ensayos de activación de GTPasas7.9 Tratamiento de estrés7.10 Disección de los hipocampos y extracción del ARN total7.11 Purificación del ARN mensajero poli A+ y síntesis del ADN copia7.12 Ensayos de PCR en tiempo real7.13 Análisis de polimorfismos en el gen GPM6A en pacientes con depresión7979798283838484868. REFERENCIAS88AGRADECIMIENTOS1009

Introducción1. INTRODUCCIÓN1.1 El estrés crónicoEl estrés puede definirse como el estado en el que un organismo percibecomprometida su homeostasis. Se entiende, entonces, que la amenaza puede ser o no real yque la percepción del individuo juega un rol preponderante en la determinación del estadode estrés. Para que una situación sea considerada estresante, el individuo debe percibirlacomo alarmante, fuera de lo común y nociva u hostil (Kim et al. 2002).La respuesta al estrés involucra la activación de los sistemas endócrino, nervioso einmune. Así, se producen cambios comportamentales y fisiológicos que aumentan laprobabilidad del individuo de adaptarse a la situación estresante de modo tal de alcanzarnuevamente la homeostasis. Los cambios comportamentales incluyen mayor atención yeuforia mientras que dentro de las alteraciones fisiológicas se distinguen el aumento en eltono cardiovascular y el ritmo respiratorio; y la supresión de los procesos de digestión,crecimiento, reproducción e inmunidad (Smith et al. 2006).La percepción del estrés y la respuesta al mismo representan una ventaja para elindividuo ya que le permiten adaptarse a una situación dada. Sin embargo, la exposición asituaciones de estrés severas o prolongadas en el tiempo puede resultar dañina para elorganismo. En el humano y en otros mamíferos, la activación prolongada de la respuesta alestrés produce hipertrofia adrenal, atrofia del timo y nódulos linfáticos, supresión delsistema inmune y ulceraciones (Sorrells et al. 2007). Además, el estrés crónico o severoproduce daños en estructuras del sistema nervioso central como el hipocampo, la amígdala yla corteza prefrontal, con la consecuente alteración en los procesos de aprendizaje ymemoria (de Kloet et al. 2005). Se cree que los efectos nocivos de la respuesta al estrés sonel resultado de una desregulación de los sistemas hormonales y neuronales activadosdurante la misma.En los mamíferos, el eje hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA) es el principal sistemainvolucrado en la respuesta al estrés. Este sistema neuroendócrino -posee componentestanto neuronales como hormonales- se encuentra representado en la figura 1. Ante lapercepción de una situación de estrés, las neuronas del núcleo paraventricular (PVN) delhipotálamo sintetizan y secretan el factor liberador de la corticotrofina (CRF). Al unirse a sureceptor en la adenohipófisis, el CRF induce la liberación de la hormona corticotrópica(ACTH) al sistema circulatorio la cual actúa principalmente sobre las glándulas adrenales,10

Introducciónestimulando la liberación de glucocorticoides (Smith et al. 2006). Los glucocorticoides(cortisol en humanos y corticosterona en roedores) son hormonas esteroideas que medianlas respuestas cardiovascular y metabólica al estrés, caracterizadas por un incremento en lapresión arterial y en el ritmo cardíaco, y un aumento en la concentración de glucosa ensangre, alcanzado por medio de una movilización desde los sitios de reserva y una supresiónde actividades anabólicas, lo que representa una mayor disposición de energía (Sapolsky etal. 2000). De este modo, la activación del eje HPA ante un estado de estrés le permite alindividuo adaptarse a la nueva situación. Sin embargo, la hiperactivación de este sistemapuede resultar perjudicial para la salud del individuo por lo que éste se encuentra finamenteregulado. Se cree que la desregulación del eje HPA es responsable de los efectos nocivos dela exposición prolongada a situaciones de estrés.HipocampoHipocampoAmígdalaHipófisisGlucocorticoidesCorteza adrenalFigura 1. Eje hipotalámico-pituitario-adrenal. Las neuronas del núcleo paraventricular (PVN) del hipotálamointegran la información relevante al estrés mediante conexiones con la amígdala y el hipocampo, querepresentan aferentes excitatorios e inhibitorios respectivamente. Estas neuronas secretan el factor liberadorde la corticotrofina (CRF), el cual es transportado a través de los capilares del sistema circulatorio hacia lahipófisis. Las células corticotróficas de la adenohipófisis liberan adenocorticotrofina (ACTH) al torrentesanguíneo que al alcanzar la corteza de las glándulas suprarrenales, estimula la secreción de glucocorticoides.Además de otras numerosas funciones, los glucocorticoides inhiben la síntesis y liberación de CRF y ACTH,regulando su propia liberación. Niveles muy altos de glucocorticoides pueden resultar dañinos para lasneuronas del hipocampo, interfiriendo con el sistema de inhibición sobre el hipotálamo, produciéndose así unestado de hipercortisolemia. Adaptado de Nestler et.al., 2002.11

IntroducciónEl eje HPA se encuentra regulado tanto a nivel endócrino como a nivel neuronal. Encuanto a la regulación endócrina, niveles elevados de glucocorticoides inhiben la actividaddel sistema actuando sobre el hipotálamo y la hipófisis en un clásico modelo deretroalimentación negativa. A nivel neuronal, la actividad del eje HPA se encuentra reguladapor distintos circuitos neuronales: proyecciones aferentes del hipocampo inhiben laliberación de CRF en el PVN mientras que las inervaciones de la amígdala la estimulan (Smithet al. 2006).La hiperactividad del eje HPA es un hallazgo frecuente en animales sometidos aestrés crónico y en pacientes con depresión (Watanabe et al. 1992; Holsboer 2001; vanKampen et al. 2002; de Kloet et al. 2005). Se cree que el hipocampo juega un rolpreponderante en la desregulación de este sistema. Se ha demostrado que altos niveles deglucocorticoides pueden causar daños en las neuronas del hipocampo, lo que reduciría lainhibición que el hipocampo ejerce sobre el eje HPA. De este modo, se incrementarían losniveles de glucocorticoides, lo que aumentaría el daño en el hipocampo conformándose uncircuito patológico de retroalimentación positiva (Nestler et al. 2002).Varios estudios han demostrado una relación causal entre la exposición a situacionesde estrés y el desarrollo de la depresión (Kessler 1997; Kendler et al. 1999; Paykel 2001). Ladepresión es un trastorno del estado anímico en el cual los sentimientos de tristeza, pérdida,ira o frustración interfieren con la vida diaria durante un período prolongado. Conocida ensus inicios con el nombre de melancolía, término empleado por Hipócrates alrededor de 400años AC, los síntomas de la depresión aparecen descriptos en numerosos tratados médicosde la antigua Grecia (Nestler et al. 2002). En la actualidad, 121 millones de personas sufrende depresión mayor y esta enfermedad se ha convertido en la principal causa dediscapacidad a nivel mundial. Además, debido a la alta incidencia de suicidios en losenfermos, se estima que para el año 2020 la depresión ocupe el segundo lugar, detrás de lasenfermedades cardiovasculares, en el índice DALY (del inglés Disability Adsusted Life Years)que mide los años de vida saludables perdidos por muerte prematura o discapacidad(http://www.who.int/mental_health/management/depression/definition/en/).Los tratamientos para la depresión incluyen la administración de medicamentosantidepresivos, la psicoterapia y/o la terapia electroconvulsiva. En los últimos años se hanproducido pequeños avances en los tratamientos para esta enfermedad, especialmentedebido a la disminución de efectos secundarios de los medicamentos de segunda12

Introducciónconstantemente expuesto a claves olfativas, visuales y auditivas del individuo dominante,despliega un comportamiento típico de subordinación (van Kampen et al. 2002).La validez del modelo de estrés psicosocial crónico en T. belangeri como modelo dedepresión se encuentra asociada a dos características fundamentales. En primer lugar, lossíntomas que presentan los individuos subordinados son similares a los que presentan lospacientes con depresión, destacándose entre ellos la pérdida de peso y apetito, disturbiosen el sueño, y la reducción en la locomoción y el aseo. Además, se observa una altaconcentración de cortisol en sangre indicativo de una desregulación del eje HPA. Sinembargo, cabe mencionar que los síntomas clave en el diagnóstico de la depresión, como elestado de ánimo deprimido, la pérdida del interés o los pensamientos recurrentes demuerte no son evaluables en modelos animales. En segundo lugar, el tratamiento conantidepresivos como la clomipramina revierte los síntomas observados en los animalesestresados (van Kampen et al. 2002).Otro modelo de estrés crónico frecuentemente utilizado es el de inmovilización enroedores. El procedimiento, que se aplica tanto en ratones como en ratas, consiste en lainmovilización diaria del animal por confinamiento en tubos de plástico aireados porperíodos de entre cuatro y seis horas durante un lapso de tres semanas. Se ha demostradoque este tratamiento produce una disminución en la ganancia de peso, un aumento en elpeso de las glándulas adrenales indicativo de hipertrofia adrenal y un incremento en laconcentración de corticosterona en sangre que indica la desregulación del eje HPA(Watanabe et al. 1992).1.3 Efectos del estrés crónico sobre el hipocampoEl hipocampo es una de las estructuras cerebrales más afectadas en animalessometidos a estrés crónico. La formación hipocampal juega un rol clave en la memoriadeclarativa y en el proceso de aprendizaje (Manns et al. 2006) por lo que se cree que lasalteraciones encontradas en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico seríanresponsables de los problemas cognitivos que presentan los mismos (McEwen 2004).La formación hipocampal se encuentra en el lóbulo temporal medio y conforma elsistema límbico. Las neuronas del hipocampo se encuentran particularmente alineadas porlo que se pueden distinguir capas compuestas predominantemente por dendritas apicales,somas celulares, dendritas basales y axones. La formación hipocampal se encuentra divididaen regiones, denominadas las zonas Cornu Ammonis CA1-CA4, el giro dentado y el14

Introducciónsubiculum. Como se muestra en la figura 2, la información fluye en el hipocampo desde elgiro dentado, a través de las zonas CA3 y CA1, hacia el subiculum. La entrada de informaciónse produce principalmente a través de la vía perforante compuesta por axones provenientesde la corteza entorrinal que atraviesan el subiculum y llegan hasta las células granulares delgiro dentado donde establecen contacto sináptico. Los axones de las neuronas del girodentado conforman las fibras musgosas haciendo sinapsis con las neuronas piramidales de lazona CA3. La información luego fluye hacia las neuronas piramidales de la zona CA1 a travésde las fibras colaterales de Schaffer. Los axones de las neuronas de la zona CA1 proyectanhacia el subiculum y la corteza entorrinal constituyendo la principal vía de salida deinformación del hipocampo.Neuronaspiramidalesde la CA1Axones de las neuronas de la CA1(hacia subiculum y cortezaentorrinal)Fibras colaterales deSchafferCA1Neuronaspiramidalesde la CA3CA3GDFibras musgosasNeuronas granulares delgiro dentadoVía perforante(axones de lacorteza entorrinal)Figura 2. Vías sinápticas del hipocampo. La información ingresa al hipocampo a través de la víaperforante, que se origina en la corteza entorrinal y pasa por el subiculum hasta llegar a lascélulas granulares del giro dentado (GD). Los axones de estas células proyectan hacia lasdendritas de las neuronas piramidales de la zona CA3, constituyendo la vía de las fibrasmusgosas. Las neuronas de la zona CA3 envían colaterales excitatorios a las neuronas piramidalesde la zona CA1, formando la vía de las fibras colaterales de Schaffer. Finalmente, axones de lasneuronas de la zona CA1 proyectan al subiculum y las capas profundas de la corteza entorrinal,en la principal vía de salida de información del hipocampo. Existen vías secundarias de entrada ysalida de información del hipocampo que no se encuentran representadas.15

IntroducciónEl hipocampo posee una gran plasticidad neuronal, entendiéndose por ésta lacapacidad que tiene el sistema nervioso de remodelar los contactos entre neuronas y laeficiencia de sus sinapsis. Entre las bases celulares de la plasticidad neuronal en elhipocampo adulto, se encuentran los cambios en la eficiencia de las conexiones sinápticas,la formación de nuevas sinapsis así como también la eliminación de sinapsis preexistentes yla generación de nuevas neuronas (proceso conocido como neurogénesis). Estosmecanismos subyacen los procesos de aprendizaje y memoria, siendo la plasticidad neuronalde vital importancia para que el organismo responda a constantes cambios en el ambiente(McClung et al. 2008). Sin embargo, la neuroplasticidad no siempre resulta beneficiosa yaque alteraciones estructurales observadas en el hipocampo de animales sometidos a estréscrónico, así como en pacientes con depresión, han sido asociadas con problemas cognitivos(McEwen 2004).Entre las alteraciones más frecuentemente observadas en el hipocampo de animalesestresados crónicamente se encuentra la reducción en el largo y en la ramificación de lasdendritas apicales de las neuronas piramidales de la zona CA3. Este fenómeno ha sidoobservado tanto en individuos de la especie T. belangeri sometidos a estrés psicosocial comoen ratas estresadas por inmovilización (Watanabe et al. 1992; Magarinos et al. 1996).Resulta interesante destacar que el tratamiento con drogas antidepresivas como latianeptina previene las modificaciones estructurales mencionadas en ambos modelosanimales (Watanabe et al. 1992; Magarinos et al. 1999). Otros estudios de estrés crónico enroedores revelan, además, la retracción de estructuras tipo espinas y una disminución en elnúmero de sinapsis en la zona CA3 del hipocampo (Sousa et al. 2000; Sandi et al. 2003;Stewart et al. 2005). También se ha descripto una reorganización en las terminales de lasfibras musgosas caracterizada por una reducción en su superficie y en el número decontactos sinápticos con las neuronas piramidales de la zona CA3 en el hipocampo de ratasestresadas crónicamente (Magarinos et al. 1997; Sousa et al. 2000).La neurogénesis en el giro dentado del hipocampo también se encuentra moduladapor la exposición crónica al estrés y el tratamiento con antidepresivos. El estrés crónicosuprime la proliferación y supervivencia de nuevas neuronas granulares en el hipocamporatas y de machos adultos de la especie T. belangeri (Gould et al. 1997; Pham et al. 2003;Duman 2004; Heine et al. 2004). En contraste, la administración de drogas antidepresivasaumenta la neurogénesis en animales no estresados (Malberg et al. 2000; Manev et al. 2001)16

Introduccióny revierte el efecto inhibitorio observado en el hipocampo de animales sometidos a estréscrónico (Czeh et al. 2001).Las alteraciones observadas en el hipocampo de animales estresados crónicamente,como la retracción dendrítica y la inhibición de la neurogénesis, podrían explicar la reducciónen el volumen de la formación hipocampal encontrada en individuos de la especie T.belangeri sometidos a estrés psicosocial (Ohl et al. 2000). Además, la disminución en elvolumen del hipocampo observada en pacientes con depresión, la cual ha sido asociada aproblemas cognitivos (MacQueen et al. 2003), también podría responder a modificacionesestructurales como las mencionadas.Se cree que las alteraciones plásticas encontradas en el hipocampo de animalesestresados crónicamente son consecuencia de los elevados niveles de glucocorticoides.Diversos estudios han demostrado que la simple administración de corticosterona induce laretracción de las dendritas apicales de las neuronas piramidales de la zona CA3 e inhibe laneurogénesis en el giro dentado del hipocampo de rata (Woolley et al. 1990; Cameron et al.1994; Magarinos et al. 1995).El hipocampo posee una alta densidad de receptores para glucocorticoides, motivopor el cual esta estructura resultaría particularmente sensible a la acción de los mismos. Sehan descripto dos tipos de receptores para estas hormonas esteroideas, los cualescolocalizan en la formación hipocampal. Los receptores de tipo I o de mineralocorticoidesson de alta afinidad mientras que los receptores de tipo II o de glucocorticoides son de bajaafinidad. Los receptores de glucocorticoides, siendo de baja afinidad, son ocupados por lashormonas esteroideas solamente ante una alta concentración de las mismas. Por estemotivo, se cree que los receptores de tipo II mediarían los efectos provocados por altosniveles de glucocorticoides. Ambos tipos de receptores poseen una localizacióncitoplasmática, activándose y translocándose al núcleo ante la unión de sus ligandos. En elnúcleo, los complejos hormona-receptor regulan la transcripción de genes por distintas vías.Homodímeros y heterodímeros de los receptores se unen a los promotores de genes queposeen secuencias GRE (del inglés glucocorticoid responsive elements) activando oinhibiendo su transcripción según la secuencia GRE y el reclutamiento de factoresactivadores o represores. Además, monómeros de los receptores de tipo II pueden unirse aotros factores de transcripción inhibiendo su acción reprimiendo así la expresión de genes(De Kloet et al. 1998; de Kloet et al. 2005). La alteración en la expresión génica podría17

Introducciónsubyacer los mecanismos por los cuales altos niveles de glucocorticoides provocanremodelaciones estructurales en el hipocampo, como ser la retracción de dendritas o lainhibición de la neurogénesis. Se han identificado algunos genes cuya expresión en elhipocampo se encuentra regulada por glucocorticoides tales como el gen que codifica parael factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, del inglés, Brain Derived NeurotrophicFactor) y la neurotrofina 3 (Smith et al. 1995), isoformas polisialidadas de la molécula deadhesión neuronal PSA-NCAM (Rodriguez et al. 1998) y la proteína quinasa dependiente decalcio y calmodulina CaMK-VI (Vreugdenhil et al. 2001). Sin embargo, los mecanismosmoleculares responsables de las alteraciones plásticas mencionadas no han sido aúndilucidados.1.4 Genes regulados por el estrés y los antidepresivosLos mecanismos implicados en las alteraciones estructurales encontradas en elhipocampo de animales sometidos a estrés crónico todavía no han sido esclarecidos.Asimismo, los procesos involucrados en la acción terapéutica de los antidepresivos no hansido identificados. La comprensión de estos mecanismos podría resultar de gran utilidadpara el entendimiento y el tratamiento de enfermedades relacionadas al estrés como ladepresión. Los avances científicos tecnológicos, y en particular en la biología molecular,permiten hoy la identificación de genes cuya expresión se encuentra modulada por laexposición al estrés y la administración de drogas antidepresivas. La identificación de estosgenes es clave para entender las bases moleculares del estrés y el tratamiento conantidepresivos, motivo por el cual varios grupos de investigación, incluyendo nuestrolaboratorio, se han concentrado en su identificación.Varios genes de expresión diferencial en tratamientos de estrés y antidepresivos hansido identificados. Según la función de sus productos proteicos, los genes encontradospueden agruparse en categorías. Así, se han identificado genes relacionados al eje HPA comoson los receptores de glucocorticoides de tipo I y II y CRF; genes que codifican para factoresde transcripción o proteínas involucradas en la traducción de señales, por ejemplo CREB;factores de crecimiento o diferenciación neuronal como BDNF y NGF (del inglés, NerveGrowth Factor); proteínas involucradas en la sistemas de neurotransmisión tales como losreceptores de serotonina; y factores clave en la formación de sinapsis y terminacionesnerviosas como la sinaptofisina y la sinaptotagmina (Alfonso et al. 2005).18

IntroducciónA pesar de la gran cantidad de genes cuya expresión se encuentra modulada por elestrés y los antidepresivos identificados, las bases moleculares de las alteraciones plásticasobservadas en el hipocampo de animales estresados y de la acción terapéutica de losantidepresivos, no han sido del todo esclarecidas. Los mecanismos que subyacen ambosprocesos son complejos y, por consiguiente, se cree que todavía falta identificar un grannúmero de genes. Una vez identificados, el desafío será integrar toda la información paraentender las consecuencias celulares y fisiológicas de su expresión diferencial.1.5 La glicoproteína de membrana 6a (M6a) y la familia de las proteínas proteolipídicas(PLPs)Con el objeto de identificar genes cuya expresión se encuentra regulada por el estréscrónico, en nuestro laboratorio se utilizaron bibliotecas sustractivas que representan unmétodo no sesgado u orientado por una pre-selección de genes. Las bibliotecas sustractivasfueron construidas con muestras de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) provenientes dehipocampos de animales de la especie T. belangeri tratados crónicamente con cortisol yanimales sin tratar, utilizados como control (Alfonso et al. 2004). Luego, varios de los genesidentificados en las bibliotecas sustractivas fueron evaluados en el modelo de estréspsicosocial de T. belangeri confirmándose, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) entiempo real, la expresión diferencial de cinco genes (Alfonso et al. 2004). Entre los genesidentificados se distingue la glicoproteína de membrana 6a (M6a), cuya expresión resultódisminuida en el hipocampo de animales estresados psicosocialmente, siendo este efectorevertido por la admisitración de clomipramina (antidepresivo tricíclico que inhibe lacaptación neuronal de serotonina y noradrenalina). La expresión de M6a también seencontró reducida en ratones de distintas cepas y ambos sexos sometidos a estrés crónicopor inmovilización. De modo similar a lo observado en individuos de la especie T. belangeri,el tratamiento con tianeptina (antidepresivo atípico que activa la recaptación de serotonina)en ratones contrarrestó los efectos del estrés sobre los niveles de expresión de M6a en elhipocampo (Alfonso et al. 2006).La proteína M6a, de alta expresión en el sistema nervioso central (SNC), ha sidoidentificada hace más de 20 años (Yan et al. 1993). En estadíos embrionarios, M6a seexpresa en neuronas post-mitóticas del cerebro y la médula espinal, mientras que en elcerebro murino adulto, la expresión de M6a se observa en el hipocampo, la corteza cerebraly las células granulares del cerebelo (Yan et al. 1996). En el hipocampo de rata adulta, el19

IntroducciónARNm de M6a se encuentra en el soma de las neuronas granulares del giro dentado y en lasneuronas piramidales de las regiones CA1 y CA3. Sin embargo, la proteína no se localiza enlos cuerpos celulares, sino en regiones de alta densidad sináptica, como las terminaciones delas fibras musgosas y el hilus (Alfonso et al. 2005). En un trabajo reciente se demostró que enel cerebro de rata adulta la proteína M6a se localiza más específicamente en los axones delas neuronas del giro dentado que conforman la vía de las fibras musgosas (Cooper et al.2008).Al momento de iniciar este trabajo de tesis era escasa la información respecto a lafunción de M6a. Sólo existían dos trabajos que sugerían un rol para esta proteína en laextensión de neuritas y en la diferenciación neuronal (Lagenaur et al. 1992; Mukobata et al.2002). Mientras se realizaba esta tesis, se publicaron dos artículos sugiriendo un papel paraM6a en la endocitosis y el reciclado del receptor de opioides (Wu et al. 2007; Liang et al.2008). Por otro lado, publicaciones recientes sugieren que M6a tendría un rol clave en ladiferenciación neuronal a partir de células madres embrionarias (Michibata et al. 2008) y enla extensión de neuritas en células de la retina (Zhao et al. 2008). Además, resultainteresante destacar que se ha encontrado una asociación entre un polimorfismo en el genque codifica para la proteína M6a y un grupo de individuos con síntomas de depresión entrepacientes diagnosticados con esquizofrenia (Boks et al. 2007)M6a pertenece a la familia de las proteínas proteolipídicas (PLPs) que en mamíferostambién incluye a la glicoproteína de membrana 6b (M6b), y PLP, proteína que da nombre ala familia. (Yan et al. 1993). Estas proteínas presentan una alta homología entre sí y segúnmodelos de predicción topográfica comparten una estructura representada en la figura 3,compuesta por cuatro dominios transmembrana (TM), separados por tres loops hidrofílicos,con los extremos amino y carboxilo terminales en el citoplasma. (Popot et al. 1991; Yan et al.1993). La estructura propuesta para los miembros de la familia PLP se asemeja a la de lasproteínas pertenecientes a la gran familia de las tetraspaninas. Sin embargo, la secuenciaCCG (cisteína-cisteína-glicina) presente en el loop extracelular mayor del 100 % de lastetraspaninas no se encuentra en estas proteínas y no han sido clasificadas como miembrosde esta gran familia (Stipp et al. 2003).20

IntroducciónEC 2EC 1EXTRACELULARTM TM TM TM1 2 3 4INTRACELULARNH2ICCOOHFigura 3. Estructura propuesta para los miembros de la familia PLP. El esquema muestra laestructura de las PLPs según modelos de predicción topográfica. Se observan cuatro dominiostransmembrana (TM1-TM4), un loop extracelular menor (EC1), un loop intracelular (IC) y un loopextracelular mayor (EC2) con los extremos amino (NH2) y carboxilo (COOH) terminales dentro delcompartimiento intracelular.En el SNC, M6a sólo se expresa en neuronas, M6b tanto en neuronas como en glía yPLP sólo en glía (Yan et al. 1996). M6b fue identificada conjuntamente con M6a y varios añosdespués, distintas isoformas de M6b fueron descriptas (Werner et al. 2001). Sin embargo,hasta el momento no se le ha asignado función alguna a M6b. Por otro lado, PLP fueidentificada hace más de 50 años (Folch et al. 1951). PLP, y su variante de splicing DM20,constituyen las proteínas más abundantes en la mielina del SNC y se sabe que una de lasfunciones de estas proteínas es mantener la estructura y la integridad de la mielina (Duncanet al. 1987; Boison et al. 1994; Boison et al. 1995). Además, se les ha asignado a PLP y DM20un rol en la diferenciación y supervivencia de oligodendrocitos (Yang et al. 1997; Nadon etal. 1998). Asimismo, varios trabajos sugieren una función alternativa aún no identificada,especialmente para DM20 (Knapp 1996; Nadon et al. 1997).1.6 Plasticidad neuronalLa plasticidad neuronal, también conocida como neuroplasticidad, se refiere a lacapacidad del sistema nervioso de adaptarse y de cambiar a través del tiempo. Dado el rol21

Introducciónsugerido para M6a en la extensión de neuritas y diferenciación neuronal (Lagenaur et al.1992; Mukobata et al. 2002), esta proteína podría estar involucrada en procesos deplasticidad neuronal.Durante largo tiempo el cerebro adulto ha sido considerado estable e inmodificable,excepto por la declinación inevitable que ocurre con el envejecimiento. Sin embargo, existenhoy claras evidencias de cambios estructurales en el cerebro adulto que incluyen lageneración de nuevas neuronas y otras células cerebrales, así como la modificación en lasconexiones entre neuronas. Se distinguen dos tipos de plasticidad neuronal. La plasticidadestructural se refiere a alteraciones en la morfología de procesos neuronales (tanto axonescomo dendritas y principalmente sus espinas), la formación y eliminación de sinapsis, y lageneración de nuevas neuronas por el proceso denominado neurogénesis. La plasticidadsináptica, en cambio, describe las alteraciones en la transmisión sináptica a través decambios en la eficiencia de sinapsis preexistentes. Como se mencionó anteriormente, laplasticidad neuronal resulta clave para los procesos de aprendizaje y memoria,permitiéndole al individuo adaptarse a constantes cambios en el ambiente (McClung et al.2008).Las espinas dendríticas son pequeñas protrusiones que emergen de las dendritasneuronales y conforman el componente post sináptico de la gran mayoría de las sinapsisexcitatorias en el cerebro. Estas estructuras presentan un alto grado de plasticidadestructural y tanto la aparición y desaparición de espinas dendríticas, como cambiosmorfológicos en las mismas, han sido repetidamente reportados en el cerebro adulto deroedores (Alvarez et al. 2007; Harms et al. 2007). La vida media de estas espinas, o sea suestabilidad, aumenta conforme avanza la edad del individuo y varía según el área delcerebro estudiada (Trachtenberg et al. 2002; Holtmaat et al. 2005; Zuo et al. 2005). Sinembargo, espinas dendríticas mótiles y transientes son frecuentemente observadas en elcerebro de animales adultos. La mayoría de estas espinas son inestables y desaparecen alcorto tiempo de haber aparecido mientras que un reducido porcentaje de las mismasestablece contactos sinápticos permaneciendo estables durante, al menos, varios días (Zitoet al. 2004). Estudios in vivo han demostrado que la estabilidad de las espinas dendríticaspuede ser alterada por la estimulación y la deprivación sensorial. Asimismo, en sistemas invitro se ha demostrado que un aumento en la actividad sináptica resulta en alteraciones enel número y en la morfología de las espinas dendríticas (Alvarez et al. 2007; Harms et al.22

Introducción2007). Si bien se ha demostrado que durante el desarrollo las espinas dendríticas estáninvolucradas en el proceso de sinaptogénesis (Ziv et al. 1996; Fiala et al. 1998), lasconsecuencias funcionales de esta plasticidad estructural en el cerebro adulto no han sidoreveladas. Sin embargo, se especula que la plasticidad estructural en las espinas dendríticaspodría participar en procesos de formación y eliminación de sinapsis.Se han identificado varios componentes moleculares que regulan la formación y lamotilidad de las espinas. No resulta llamativo que la mayoría de estas moléculas actúe sobreel citoesqueleto de actina que constituye la base de la morfología y la estabilidad de laespina. En este sentido, miembros de la familias de GTPasas pequeñas (RhoA, Rac1 yCdc42), que son reguladores clave del citoesqueleto de actina, han sido implicados en laformación y en la morfología de las espinas dendríticas (Newey et al. 2005). Asimismo, variosreguladores y efectores de estas proteínas han sido identificados (Calabrese et al. 2006).Otras moléculas involucradas en la estructura y la estabilidad de las espinas son proteínasdel citoesqueleto como las profilina, cortactina, debrina y Homero (Kennedy et al. 2005) asícomo la neurabina y la espinofilina (Ryan et al. 2005). Además, la pérdida de la miosina Va yla miosina VI también altera el número y la longitud de las espinas (Takagishi et al. 1996;Osterweil et al. 2005).Recientemente, se ha observado plasticidad estructural en los axones de animalesadultos. En este sentido, distintos tipos de alteraciones morfológicas han sido descriptas. Enprimer lugar, se ha observado la ramificación lateral de los axones. Además, se hadeterminado la aparición y desaparición de botones sinápticos en passant en axonespreexistentes. Por último, se ha observado la remodelación de botones sinápticosterminales. Al igual que sucede con la plasticidad en las espinas dendríticas, el remodeladoen los axones disminuye con la edad y existe una gran variabilidad según la poblaciónneuronal estudiada. Además, la mayoría de los botones sinápticos que aparecen sontransientes y desaparecen a corto plazo. El remodelado estructural de los axones podríaprovocar un rearreglo en los contactos sinápticos que podría subyacer procesos deaprendizaje. En concordancia, se ha observado una expansión en las terminales de las fibrasmusgosas en la zona CA3 del hipocampo en animales sometidos a ensayos de aprendizajeespacial (Gogolla et al. 2007).23

IntroducciónLa neurogénesis, es decir, la generación de nuevas neuronas ha sido observada en elcerebro adulto de varios mamíferos incluyendo al hombre. Específicamente, este fenómenoha sido consistentemente reportado en dos regiones: en la zona sub-ventricular queproyecta hacia el bulbo olfatorio y en el giro dentado del hipocampo (van Praag et al. 2002;Carleton et al. 2003). El proceso de neurogénesis involucra la proliferación de célulasmultipotenciales, la migración y la maduración de la neurona. En el hipocampo, laproliferación ocurre en la zona subgranular, entre la capa de células granulares y el hilus. El50% de las células recién formadas mueren y desaparecen. Las sobrevivientes puedentransformarse en células neuronales o de la glía, según a donde migren y según la actividaden esa zona del cerebro en ese momento. En la neurogénesis hipocampal, los precursoresneuronales migran hacia la capa de las células granulares donde finalmente maduran,adquiriendo las características morfológicas y fisiológicas de una neurona granular adulta.Desde el momento que nace la célula hasta que se integra funcionalmente en el cerebrotranscurre más de un mes (Gage 2004).El proceso de neurogénesis se encuentra finamente regulado en sus distintas etapas.Se han identificado factores que regulan la proliferación tales como Sonic hedgehog(Mervaala et al. 2000), así como factores que influyen sobre el destino de la célula reciénformada, es decir la diferenciación hacia célula neuronal o de la glía. Por ejemplo, sedeterminó que la proteína BMP (del inglés, bone morphogenetic protein) promueve laconversión hacia células gliares mientras que Noggin estimula la diferenciación hacia célulasneuronales (Lim et al. 2000). Una vez que la célula comienza a diferenciarse hacia una célulaneuronal, otros factores resultan clave para su supervivencia y maduración entre los cualesse destacan los factores de crecimiento IGF (del inglés, insulin-like growth factor) y BDNF(Aberg et al. 2000; Chan et al. 2008). Los factores presentes en el nicho de maduración delos precursors neuronales resultan clave para la supervivencia y funcionalidad de las nuevascélulas. En concordancia, la remoción de células multipotenciales, su amplificación in vitro ytransplante en el cerebro adulto sólo resulta exitosa cuando la reinserción se realiza en lossitios donde la neurogénesis ocurre normalmente en el cerebro, es decir en el hipocampo yen el bulbo olfatorio (Gage 2000).La neurogénesis en el hipocampo también se encuentra regulada por factoresambientales. El traslado de un ratón de una jaula sencilla hacia un ambiente enriquecidoresulta en un incremento en el número de nuevas neuronas mediante una reducción en elnúmero de células que mueren (Brown et al. 2003). Además, se ha visto que los animales24

Introducciónque corren en una rueda muestran un aumento en el número de células que se dividen,resultando en un mayor número de nuevas neuronas (van Praag et al. 1999). Por otro lado,como se mencionó anteriormente, la exposición crónica a situaciones de estrés disminuye laneurogénesis en el hipocampo (Duman 2004).En la actualidad, es ampliamente aceptado que toda experiencia modifica elcomportamiento posterior a través de modificaciones en la transmisión sináptica. Laplasticidad sináptica se refiere específicamente a la modificación en la fuerza o eficacia de latransmisión sináptica dada por la actividad de la misma. En este sentido, la potenciación alargo plazo (LTP, del inglés, Long Term Potentiation) y la depresión a largo plazo (LTD, delinglés, Long Term Depression) describen cambios en la eficiencia de la transmisión sinápticaen respuesta a una estimulación dada y han sido propuestas como los mecanismosresponsables de la formación de la memoria. La LTP se produce ante una activación sinápticabreve e intensa. En cambio, la producción de una LTD requiere una estimulación más débil ydurante un período de tiempo más prolongado. Estos fenómenos han sido ampliamenteestudiados en cortes de hipocampo, principalmente en sinapsis excitatorias de la zona CA1,sin embargo, manifestaciones similares han sido observadas en sinapsis excitatorias envarias áreas del cerebro (Citri et al. 2008; McClung et al. 2008).Existe hoy extensa bibliografía describiendo los mecanismos que operan en elestablecimiento de la LTP y, en menor medida, la LTD. Resulta interesante destacar quevarios mecanismos moleculares son compartidos por ambos procesos (Citri et al. 2008). Elfactor de crecimiento BDNF ha demostrado ser clave en el establecimiento de la LTP (Hu etal. 2008). También se han identificado un gran número de genes cuya expresión mediaría losprocesos de LTP y LTD (McClung et al. 2008). Además de la modulación de la transcripciónmediada por factores de transcripción tales como CREB (del inglés, cAMP response elementbindingprotein), FosB y NF-B, eventos de traducción local a partir de transcriptospreexistentes en sinaptosomas han sido descriptos como resultado de la actividad sinápticay podrían ser clave en el establecimiento de la LTP y la LTD (Klann et al. 2004).Si bien la mayoría de los estudios de LTP y LTD han sido realizados in vitro,recientemente se ha demostrado la LTP in vivo en el hipocampo, encontrándose además unacorrelación con los procesos de aprendizaje y memoria (Pastalkova et al. 2006; Whitlock etal. 2006). Asimismo, eventos de LTD han sido observados en corteza somatosensorial enrespuesta a deprivación sensorial (Allen et al. 2003).25

Objetivos2. OBJETIVOSLa identificación y caracterización de genes del hipocampo cuya expresión seencuentra modulada por el estrés crónico podría resultar clave para el establecimiento delas bases moleculares del estrés. En nuestro laboratorio se ha identificado a M6a como unaproteína cuya expresión es regulada por tratamientos de estrés y antidepresivos. El objetivogeneral del presente trabajo fue caracterizar funcionalmente a M6a determinando, de serposible, las consecuencias celulares, fisiológicas y funcionales de la disminución en laexpresión de este gen bajo condiciones de estrés crónico. También se propuso analizar el rolde otros miembros de la familia de las PLP en relación al estrés. De este modo, se pretendiócontribuir al entendimiento de los mecanismos implicados en la respuesta al estrés crónico.Los objetivos particulares del presente trabajo de tesis fueron:• Caracterizar funcionalmente a M6a, investigando la función biológica de esta proteína enneuronas del hipocampo.• Evaluar el efecto del estrés crónico sobre el nivel de expresión en el hipocampo de otrosmiembros de la familia de las PLPs.• Estudiar si existe una función biológica conservada entre distintos miembros de la familiade las PLPs.• Evaluar si existe una asociación entre el gen que codifica para la proteína M6a (GPM6A) ypacientes con depresión.26

Resultados3. RESULTADOS3.1 ESTUDIO FUNCIONAL DE LA GLICOPROTEÍNA M6a CUYA EXPRESIÓN EN EL HIPOCAMPOES REGULADA POR EL ESTRÉSLa expresión de M6a en el hipocampo se encuentra regulada por el estrés crónico y eltratamiento con antidepresivos (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006). A pesar de suidentificación hace varios años, al iniciar este trabajo de tesis la función biológica de laproteína M6a era aún desconocida (Yan et al. 1993). Dos trabajos sugerían que M6a podríaestar involucrada en la extensión de neuritas y la diferenciación neuronal. Sin embargo, lasevidencias resultaban indirectas ya que se basaban en ensayos realizados en líneas celulares(Mukobata et al. 2002) o mediante la utilización de anticuerpos monoclonales anti M6acomo antagonistas de su función en cultivos de neuronas de cerebelo (Lagenaur et al. 1992).Nuestro objetivo fue entonces investigar la posible función biológica de M6a de forma tal deentender las consecuencias celulares y fisiológicas de la expresión diferencial de este genbajo condiciones de estrés crónico. Para ello, dada su alta expresión en neuronashipocampales (Yan et al. 1996; Alfonso et al. 2005), se decidió utilizar cultivos primarios deneuronas de hipocampo de embriones de rata.3.1.1 Localización subcelular de la proteína M6a en cultivos primarios de neuronas dehipocampoEn primer lugar, se determinó la localización subcelular de la proteína M6a endógenaen cultivos primarios de neuronas hipocampales. Se realizaron ensayos deinmunocitoquímica con un anticuerpo monoclonal contra la proteína M6a que muestran quela proteína se localiza tanto en la membrana plasmática del soma, así como en los procesosneuronales (figura 4 A). En estos procesos, la proteína se observa en protrusiones de lamembrana. La tinción de la actina con faloidina confirmó que dichas protrusiones,enriquecidas en M6a, son estructuras tipo filopodio (figura 4 B).27

ResultadosFigura 4. Localización de M6a en cultivos primarios de neuronas de hipocampo. A y B. Para determinar lalocalización de la proteína M6a endógena, neuronas de 5 días in vitro fueron marcadas porinmunocitoquímica con anticuerpos monoclonales anti M6a (verde) y con el marcador de F-actinafaloidina (rojo). Una imagen de la célula completa revela la presencia de M6a en la membrana del soma yen los procesos neuronales (A). La magnificación de un proceso neuronal muestra la presencia de M6a enprotrusiones de la membrana que contienen un citoesqueleto de actina (B). C. Para determinar lalocalización de la proteína de fusión, cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectadoscon la construcción GFP::M6a. La examinación de los cultivos fijados por microscopía confocal, revela quela proteína GFP::M6a se localiza en la membrana del soma y de los procesos (a). La examinación en detallede un proceso, revela que GFP::M6a se encuentra enriquecida en estructuras tipo filopodios/espinas (b).La marcación por inmunocitoquímica con anticuerpos anti MAP2 y anti Tau-1 revelan la presencia deGFP::M6a en dendritas y axones respectivamente (c y d). Barras = 10 m.A continuación, se determinó la localización de una proteína de fusión compuestapor GFP y M6a (GFP::M6a), que luego sería utilizada para estudiar la función celular de M6a.Para ello, se clonó la región codificante (CDS) del gen murino en un vector de expresióneucariota. El vector utilizado permite la expresión de la proteína de interés como proteína defusión a la proteína verde fluorescente (GFP) por lo que es posible visualizar la localizaciónde la misma. Para determinar si la localización de la proteína de fusión a GFP se correspondecon la localización de la proteína endógena, se transfectaron cultivos primarios de neuronasde hipocampo con la construcción GFP::M6a. La figura 4 C muestra que la proteína GFP::M6ase localiza principalmente en la membrana plasmática del soma y de los procesos (4 C a),encontrándose enriquecida en estructuras tipo filopodio (4 C b). Por lo tanto, la proteína defusión presenta una localización similar a la proteína M6a endógena. Además, se realizaronensayos de inmunocitoquímica con anticuerpos anti MAP2 y Tau-1 que son marcadores28

Resultadosespecíficos de dendrita y axón, respectivamente. Como se muestra en la figura 4 C, laproteína de fusión se localiza tanto en dendritas (4 C c) como en axones (4 C d).El patrón de expresión punteado observado en células que expresan GFP::M6a(figura 4 C) podría ser indicativo de una concentración de la proteína en estructuras de tipopre o post sinápticas. Es por ello que se realizaron ensayos de inmunocitoquímica conanticuerpos dirigidos contra las proteínas sinaptofisina y espinofilina que son marcadores devesículas pre y post sinápticas, respectivamente. La figura 5 muestra que M6a sólocolocaliza con estos marcadores pre y post sinápticos en forma ocasional. Por lo tanto, elpatrón de expresión punteado de M6a no responde a una concentración de la proteínaespecíficamente en estructuras pre o post sinápticas.AGFP::M6a Sinaptofisina SuperposiciónBEspinofilinaFigura 5. Colocalización entre GFP::M6a y marcadores pre y post sinápticos. Cultivosprimarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados con GFP::M6a después de 9-10 díasin vitro. Un día después, las neuronas fueron fijadas y marcadas con anticuerpos contra laproteína pre sináptica sinaptofisina (A) o post sináptica espinofilina (B). Las flechas verdes yrojas señalan ejemplos de localización independiente entre M6a y el marcador,respectivamente. Las flechas amarillas señalan casos de colocalización entre M6a y elmarcador. Barra = 10 m.3.1.2 La sobreexpresión de M6a induce la formación de neuritas y de filopodios/espinasCon el fin de determinar la función biológica de M6a, se realizaron ensayos desobreexpresión en cultivos primarios de neuronas de hipocampo. Estudios previos sugeríanun rol para M6a en la formación de neuritas (Lagenaur et al. 1992; Mukobata et al. 2002).Por lo tanto, para determinar si efectivamente M6a está involucrada en la extensión deneuritas, se transfectaron cultivos primarios de neuronas de hipocampo durante el primerdía de desarrollo in vitro con GFP::M6a o con un plásmido que sólo codifica para la expresiónde GFP utilizado como control. Las células fueron fijadas y las neuritas fueron marcadas porinmunocitoquímica con anticuerpos anti tubulina, 2 ó 3 días después de la transfección. Lafigura 6 A muestra imágenes representativas de una neurona control transfectada con GFP y29

Resultadosuna neurona que sobreexpresa M6a. El número de neuritas por célula fue luego cuantificadoen ambos tipos de células. Como se observa en la figura 6 B, la sobreexpresión de M6aaumenta significativamente el número de neuritas.ATubulinaBNeuritas / célulaNúmero de Neuritas15105**ControlSobreexpresión M6a0ControlM6aFigura 6. La sobreexpresión de M6a produce un aumento en el número de neuritas.Cultivos primarios de neuronas de hipocampo de 1 día in vitro fueron transfectados conGFP::M6a o GFP (control). A los 2 ó 3 días post transfección, las células fueron fijadas y lasneuritas fueron marcadas con anticuerpos anti tubulina (A). El número de neuritas porcélula fue cuantificado (B). El gráfico muestra la media + error estándar de la media (SEM),de entre 40 y 50 células por grupo provenientes de 3 experimentos independientes.**p

Resultadosmicroscopía de fluorescencia. Es por eso que las protrusiones fueron agrupadas bajo lacategoría de filopodios/espinas. Como se muestra en la figura 7 B, la sobreexpresión de M6aproduce un aumento en la densidad de filopodios/espinas de alrededor de un 100%. Losresultados muestran la densidad de filopodios/espinas medidos en segmentos de neuritas auna distancia menor a 50 m del soma. Dentro de esta distancia, la distribución defilopodios/espinas resultó uniforme ya que no se observaron diferencias entre la densidadobservada en segmentos de neuritas que sobreexpresan M6a a los 0 y a los 30 m del soma(9,8 ± 2,5 y 9,3 ± 2,8 respectivamente, n = 52, p = 0,49 calculado con Mann Whitney U-test).Los incrementos observados en el número de procesos y en la densidad de protrusiones enfragmentos de neuritas en neuronas que sobreexpresan M6a revelan que esta proteínaestaría involucrada en la formación de neuritas y filopodios/espinas.A B Densidad de filopodios/espinas250Protrusiones / 20 μm de neurita(% control)20015010050**ControlSobreexpresión M6a0ControlM6aFigura 7. La sobreexpresión de M6a aumenta la densidad de filopodios/espinas. Cultivosprimarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados a los 7 días in vitro con GFP::M6a oGFP (control). A los 2 ó 3 días post transfección, las células fueron incubadas con el marcador demembrana DiI y fijadas (A). El número de protrusiones en fragmentos de 20 m de neurita,dentro de una distancia menor a 50 m del soma, fue cuantificado (B). El gráfico muestra lamedia de número de protrusiones + SEM, expresado como porcentaje del control, de entre 65 y70 neuritas por grupo provenientes de 3 experimentos independientes. **p

Resultadostinción con MAP2 revela que las protrusiones se originan a partir de dendritas (figura 8 B).Además, la figura 8 C muestra que las protrusiones poseen acumulaciones de la proteínapost sináptica espinofilina. La tinción de axones con anticuerpos que reconocen la proteínaTau-1 parece indicar que los axones hacen contacto con las protrusiones de la membranainducidas por la sobreexpresión de M6a (figura 8 D). Por último, se observan acumulacionesde sinaptofisina sobre axones que harían contacto con protrusiones que sobreexpresan M6a(figuras 8 E y E´). Los sitios de contacto, donde se encuentran acumulaciones desinaptofisina, serían sitios de sinapsis, ya que se ha establecido una correlación entre laformación de sinapsis y acumulaciones de estructuras teñidas con anticuerpos que marcanvesículas sinápticas, como sinaptofisina (Fletcher et al. 1991). En conjunto, estos resultadosindican que las protrusiones dendríticas inducidas por la sobreexpresión de M6a haríancontacto con axones y participarían en la formación de sinapsis.AGFP::M6aSuperposiciónBCDEE´Figura 8. Caracterización de las protrusiones de membrana inducidas por la sobreexpresión deM6a. A los 7 días in vitro, cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados conGFP::M6a. Las células fueron luego fijadas y marcadas por inmunocitoquímica, 2 ó 3 días después dela transfección. El citoesqueleto de F-actina fue teñido con faloidina (A) y las dendritas fueron teñidascon anticuerpos anti MAP2 (B). La tinción con anticuerpos anti espinofilina marca vesículas postsinápticas (C). Los axones fueron marcados con anticuerpos anti Tau-1 (D). Vesículas pre sinápticasfueron teñidas con anticuerpos anti sinaptofisina (E). Una ampliación muestra acumulaciones desinaptofisina en sitios de aparente contacto con protrusiones que expresan M6a, que serían,presumiblemente, sitios de sinapsis (E´). Barra = 10 m.32

Resultados3.1.3 La reducción en los niveles de M6a produce una disminución en la densidad defilopodios/espinas y en el número de puntos de sinaptofisinaEn base a los resultados anteriores, se decidió comprobar el papel que M6a juega enla formación de filopodios/espinas por un método alternativo. Para ello, se realizaronexperimentos en los que se redujeron los niveles de expresión de M6a endógena en cultivosprimarios de neuronas de hipocampo mediante la técnica de ARN de interferencia. Laevaluación de los efectos de una reducción en los niveles de expresión de M6a resultaba dealta relevancia ya que en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico se observauna disminución en los niveles de expresión de M6a (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al.2006).En primer lugar, se confirmó que la utilización de pequeños oligonucleótidos de ARNde interferencia (siRNA, del inglés small interfering ribonucleic acid) resulta en unadisminución en los niveles de expresión de M6a. Para ello, cultivos primarios de neuronas dehipocampo fueron transfectados con fragmentos de ARN de 21 pb correspondientes a unfragmento de la secuencia codificante para M6a (M6a siRNA) o con fragmentos de ARNcorrespondientes a otra secuencia no relacionada utilizados como control. A los 3 días de latransfección, el ARNm de los cultivos fue purificado y se cuantificaron los niveles de ARNmde M6a por ensayos de retrotranscripción (RT) seguidos de PCR en tiempo real. La figura 9 Amuestra que el nivel de ARNm de M6a se encuentra reducido alrededor de un 60% en loscultivos tratados con el ARN de interferencia específico para M6a. Para determinar si losniveles de proteína también se encuentran afectados, neuronas de hipocampo fuerontransfectadas con siRNA M6a o con la secuencia control cada 2 ó 3 días de cultivo durante sudesarrollo in vitro. Después de 3 transfecciones, y luego de 9 días in vitro, las células fueronfijadas y sometidas a ensayos de inmunocitoquímica para la detección de M6a conanticuerpos monoclonales anti M6a. Como se muestra en la figura 9 B, lainmunorreactividad en los cultivos interferidos para M6a resultó notablemente menor a laobservada en los cultivos control. Por lo tanto, en cultivos primarios de hipocampo, lautilización de ARN de interferencia provoca una disminución en los niveles de ARNm y deproteína M6a.33

ResultadosAARNm M6aBProteína M6a100ControlM6a siRNANivel ARNm80604020**0ControlM6a siRNAFigura 9. El tratamiento con ARN de interferencia reduce los niveles de ARNm y proteína M6a. A.Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados con siRNA M6a o con la secuenciacontrol. A los 3 días post transfección, el ARNm fue purificado y los niveles de ARNm de M6a fuerondeterminados por RT-PCR en tiempo real. El gráfico muestra la media + SEM, de los valores de M6anormalizados con el gen de referencia b-actina, expresados como porcentaje del control, provenientesde 3 cultivos para cada grupo. **p

ResultadosUna vez determinada la eficiencia de la técnica de ARN de interferencia para reducirlos niveles de expresión de M6a en cultivos primarios de neuronas de hipocampo, seprosiguió con la evaluación de los efectos de la expresión diferencial de esta proteína.Cultivos de neuronas de hipocampo fueron transfectados cada 2 ó 3 días in vitro con M6asiRNA o con la secuencia control. A los 9 ó 10 días in vitro, las membranas de las neuronasfueron teñidas con DiI y las células fueron fijadas. La figura 11 A muestra imágenesrepresentativas de procesos neuronales tratados con M6a siRNA y con la secuencia control.Luego, el número de filopodios/espinas en fragmentos neuríticos de 20 m de extensión fuecuantificado. La figura 11 B muestra que la interferencia de la expresión de M6a resulta enuna disminución de alrededor de un 40 % en la densidad de filopodios/espinas. En unsegundo experimento, en el que se utilizó otro oligonucleótido de ARN de 21 pb quereconoce una secuencia de M6a distinta, se obtuvieron resultados similares: la densidad defilopodios/espinas en los cultivos interferidos para M6a resultó de un 68 ± 7 % encomparación con el control (n = 70, p < 0,005 calculado con Mann Whitney U-test).AControlBDensidad filopodios/espinasM6a siRNAProtrusiones / 20 m(% control)100806040200Control**M6a siRNAFigura 11. La disminución en los niveles de M6a produce una reducción en la densidad defilopodios/espinas. Neuronas de hipocampo fueron transfectados con M6a siRNA o con lasecuencia control cada 2 ó 3 días de cultivo in vitro. A los 9 ó 10 días in vitro, los cultivos fueronincubados con DiI para teñir las membranas y fijados (A). Luego, se determinó el número defilopodios/espinas en 20 m de neurita. El gráfico de la figura B muestra la media de cadagrupo + SEM, expresada como porcentaje de la media del control, de entre 75 y 95 neuritaspor grupo, provenientes de 3 experimentos independientes. ** p

Resultadoscorrelación entre el número de sinapsis y las acumulaciones de estructuras teñidas conanticuerpos que marcan vesículas sinápticas (Fletcher et al. 1991). Por ello, se realizaronensayos de inmunodetección con anticuerpos anti sinaptofisina como indicativos del númerode sinapsis. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron tratados con M6a siRNA ocon la secuencia control. Los cultivos fueron luego fijados y las acumulaciones desinaptofisina fueron marcados por inmunocitoquímica (figura 12 A). El número de puntos desinaptofisina en fragmentos de 20 m de neurita fue determinado. Como se muestra en elgráfico de la figura 12 B, la densidad de puntos de sinaptofisina es significativamente menoren los cultivos en los que la expresión de M6a fue interferida. Por lo tanto, la reducción delos niveles de expresión de M6a por ARN de interferencia produce una disminución en ladensidad de filopodios/espinas y puntos de sinaptofisina, que indicarían una disminución enel número de sinapsis. Estos resultados confirman, por un método alternativo a lasobreexpresión que M6a, que esta proteína tendría un rol determinante en la formación defilopodios/espinas en neuronas de hipocampo.AsinaptofisinaBDensidad de puntos de sinaptofisinaControlM6a siRNAPuntos / 20 m de neurita(% control)100806040200Control**M6a siRNAFigura 12. La reducción en los niveles de M6a resulta en una menor densidad de puntos desinaptofisina. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados cada 2 ó 3 días in vitrocon M6a siRNA o con la secuencia control. Los cultivos fueron fijados a los 9 ó 10 días in vitro, y lasacumulaciones de sinaptofisina fueron marcadas por inmunocitoquímica (A). Se determinó el número depuntos inmunorreactivos de sinaptofisina en fragmentos de 20 m de neurita. El gráfico de la figura Bmuestra la media de cada grupo + SEM, expresada como porcentaje de la media del control, de al menos55 neuritas por grupo provenientes de 3 experimentos independientes. ** p

Resultadosy PC12 sin diferenciar y cultivos de células no neuronales COS-7, fueron transfectados conGFP::M6a. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fueteñida con faloidina. Como se observa en la figura 13 A, la proteína GFP::M6a se encuentraenriquecida en estructuras tipo filopodio que poseen un citoesqueleto de actina en los trestipos celulares. Una vez diferenciados, los cultivos de N2a y PC12 presentan procesos con unalto número de filopodios. Sin embargo, en cultivos sin diferenciar se encuentran tantocélulas con filopodios como células sin filopodios. Los gráficos de la figura 13 B muestran queel porcentaje de células N2a y PC12 con filopodios es mayor entre las células transfectadascon GFP::M6a. Como control se utilizaron células no transfectadas de los mismospreparados. Estos experimentos demuestran que la sobreexpresión de M6a induce laformación de filopodios en líneas neuronales.AControlSobreexpresión M6aFigura 13. La sobreexpresiónPC12N2aCOS-7% células con filopodios10080**6040200ControlM6aF-actinaF-actinaGFP::M6a de M6a induce la formaciónde filopodios en células N2a,PC12 y COS-7. Cultivos decélulas neuronales N2a y PC12sin diferenciar y cultivos decélulas no neuronales COS-7fueron transfectados conGFP::M6a. Las células fueronfijadas 1 ó 2 días después de latransfección y la actina fueteñida con faloidina (A). Losgráficos de la figura BBPC12N2a% células con filopodios10080**6040200ControlM6a% células con filopodios100muestran el porcentaje deCOS-7células con filopodios. Como8060**40200ControlM6acontrol se utilizaron células sintransfectar del mismopreparado. Los resultados seencuentran expresados comomedia + SEM de por lo menosmenos 3 preparados de experimentos independientes. ** p

ResultadosDe modo similar, en la línea no neuronal COS-7 también se observa un aumento en elporcentaje de células con filopodios entre las células que sobreexpresan M6a (figura 13 B).Por lo tanto, M6a es capaz de inducir la formación de filopodios no sólo en cultivos primariosde neuronas de hipocampo y en cultivos de líneas neuronales sino también en células noneuronales.Con el fin de confirmar que la sobreexpresión de la glicoproteína M6a es responsablede la inducción de la formación de filopodios, se realizaron dos controles. En primer lugar,células N2a sin diferenciar fueron transfectadas con GFP. Las células fueron luego fijadas y laactina fue teñida con faloidina. La cuantificación reveló que no existen diferencias en elporcentaje de células con filopodios entre células transfectadas con GFP (42 ± 5 %) y célulasdel mismo preparado sin transfectar (40 ± 7 %) utilizadas como control (los resultados seencuentran expresados como media + SEM de 2 experimentos independientes, p = 0,75calculado con la prueba T de Student). Estos resultados demuestran que ni la transfecciónper se, ni la sobreexpresión de GFP, inducen la formación de filopodios. En un segundocontrol, se realizaron experimentos de transfección con una construcción que permite laexpresión de M6a y de GFP de forma independiente (GFP+M6a). De este modo, las célulastransfectadas son fácilmente reconocibles ya que expresan GFP, pero la proteína de interéses expresada sin adición de una proteína reportera. Como se muestra en la figura 14 A, lascélulas que expresan GFP resultan inmunorreactivas para M6a. Además, la marcación conanticuerpos monoclones anti M6a revela que la proteína M6a presenta la misma localizaciónque la proteína GFP::M6a, indicando que la adición de la proteína reportera no afecta a lalocalización de la proteína. En las fotos de la figura 14 B se observa que, a diferencia de lacélula no transfectada, la célula que expresa GFP y M6a muestra un gran número defilopodios al ser teñida con faloidina. Por último, como se muestra en el gráfico de la figura14 C, el porcentaje de células con filopodios es mayor en las células que sobreexpresanGFP+M6a que en las células no transfectadas. Por lo tanto, M6a per se es capaz de inducir laformación de filopodios y esta función, al igual que su localización, no depende de la adiciónde la proteína reportera GFP.38

ResultadosAGFPM6aCCélulas con filopodios100BGFPF-actina% células con filopodios80604020**0ControlM6aFigura 14. La sobreexpresión de M6a, independientemente de GFP, posee la misma localizacióne induce la formación de filopodios. Cultivos de células N2a sin diferenciar fueron transfectadoscon GFP+M6a. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y las células fueronmarcadas por inmunocitoquímica con anticuerpos monoclonales anti M6a (A) o la actina fueteñida con faloidina (B). Los preparados teñidos con actina fueron utilizados para determinar elporcentaje de células con filopodios. El gráfico de la figura C muestra los resultados obtenidos.Como control se utilizaron células sin transfectar del mismo preparado. Los resultados estánexpresados como media + SEM de 2 experimentos independientes. ** p

ResultadosAM6aF-actinaControlBControl Lat AGFP::M6aF-actinaCitocalasina DFigura 15. La localización de M6a en estructuras tipo filopodio no depende del citoesqueleto deactina. A. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo de 4 días in vitro fueron tratados conlatrunculina A (Lat A) para desestabilizar el citoesqueleto de actina. Los cultivos fueron luegofijados y la integridad del citoesqueleto de actina se determinó por tinción de la F-actina confaloidina (rojo) mientras que la localización de M6a se reveló por inmunocitoquímica conanticuerpos monoclonales anti M6a (verde). B. Cultivos de células N2a fueron transfectados conGFP::M6a. Al día siguiente, algunos preparados fueron incubados con el despolimerizante deactina citocalasina D. Los cultivos luego se fijaron y se tiñeron con faloidina para determinar laintegridad del citoesqueleto de actina (rojo). La localización de GFP::M6a se observa por lafluorescencia emitida por GFP (verde). Barra = 10 m.3.1.6 La formación de filopodios inducida por M6a no estaría mediada por proteínasGTPasas de la familia RhoLa sobreexpresión de M6a resulta en la formación de filopodios tanto en cultivosprimarios de neuronas de hipocampo y en las líneas celulares de fenotipo neuronal N2a yPC12 como en la línea no neuronal COS-7 (figuras 7 y 13). Por lo tanto, el mecanismo por elcual M6a induciría la formación de filopodios no sería exclusivo de células neuronales, sinoque se encontraría presente en distintos tipo celulares. En este sentido, las proteínasGTPasas pequeñas de la familia Rho (Rho, Rac y Cdc42) han sido involucradas en laregulación del citoesqueleto de actina durante la formación de filopodios en una ampliavariedad de células (Luo 2000; Ridley 2006). Es por ello que decidimos estudiar si laformación de filopodios inducida por la sobreexpresión de M6a estaría mediada por algunade estas GTPasas pequeñas. Para ello, se analizó por Western blot la cantidad de Cdc42, Rac140

Resultadosy RhoA activas (unidas a GTP) en cultivos que sobreexpresan M6a en comparación concultivos control. Cultivos de células N2a fueron utilizados como control (sin transfectar) otransfectados con GFP::M6a. A las 24 hs, se purificaron las proteínas Cdc42, Rac1 y RhoAactivas, es decir unidas a GTP, mediante incubación con esferas de agarosas unidas aldominio PBD de la proteína PAK que sólo une a las formas activas de Cdc42 y Rac1, o unidasal dominio RBD de la proteína Rhotekina que sólo une RhoA activa. Luego, se realizaronensayos de Western blot con anticuerpos específicos para cada GTPasa pequeña para asídeterminar la cantidad de proteína activa en las distintas muestras. Como control de carga,se determinó la cantidad de tubulina en los extractos utilizados para la purificación de lasproteínas GTPasas en estado activo. Como se observa en la figura 16, la cantidad de Cdc42,Rac1 y RhoA activas no varía entre cultivos control y cultivos que sobreexpresan M6a.Resultados similares fueron obtenidos en ensayos con células COS-7 (datos no mostrados).Estos ensayos indicarían que estas GTPasas pequeñas (Cdc42, Rac1 y RhoA) no mediarían loscambios morfológicos inducidos por la sobreexpresión de M6a.A B CTubulina Cdc42 activada TubulinaRac1 activada TubulinaRhoA activada(Control de carga)(Control de carga)(Control de carga)+ M6a C + M6a C M6a C M6a C M6a C M6a CFigura 16. La sobreexpresión de M6a no produce cambios detectables en la cantidad deCdc42, Rac1 o RhoA en estado activo. Cultivos de células N2a fueron transfectados conGFP::M6a (M6a), con Cdc42 constitutivamente activa utilizado como control positivo (+) o notransfectados y utilizados como control (C). A las 24 hs, los extractos proteicos fueronincubados con esferas de agarosa con el dominio PBD de la proteína PAK para purificar lasproteínas Cdc42 y Rac1 activas (unidas a GTP) o con el dominio RBD de la proteína Rhotekinapara purificar la proteína RhoA activa. Las fracciones purificadas fueron luego analizadas porWestern blot con anticuerpos anti Cdc42 (A), anti Rac1 (B) o anti RhoA (C). Además, sedeterminó con anticuerpos anti -tubulina la cantidad de tubulina en los extractos totalesutilizados para la purificación de las distintas proteínas GTPasas como control de carga.3.1.7 La palmitoilación y la fosforilación en los loops extracelulares de M6a no seríannecesarias para su función en la formación de filopodiosComo se mencionó anteriormente, según modelos de predicción topográfica basadosen la secuencia aminoacídica de M6a, esta proteína de 278 aminoácidos estaría compuestapor cuatro dominios transmembrana (TM) separados por tres loops hidrofílicos (dos41

Resultadosextracelulares y uno intracelular) con los extremos amino y carboxilo terminales en elcitoplasma. Como se muestra en la figura 17, el extremo amino terminal posee un posiblesitio de fosforilación para la proteína quinasa C (PKC) mientras que en el carboxilo terminalse encuentran dos posibles sitios de fosforilación, uno para la PKC y otro para la proteínaquinasa CK2 (CK2). En el loop extracelular menor se predicen tres sitios de fosforilación parala CK2, mientras que el loop extracelular mayor posee dos posibles sitios de N-glicosilación ytres posibles sitos de fosforilación para la CK2. En los loops extracelulares menor y mayor seencuentran dos y cuatro residuos de cisteína respectivamente, que podrían establecerpuentes disulfuro claves para el correcto plegamiento de la proteína. Además, en lasregiones adyacentes a la cara intracelular de la membrana plasmática se encuentran sietecisteínas que podrían ser blancos de palmitoilación.174CT184EXTRACELULAR4644CC60TTT1661641626776TNCCTSCN193195208192202INTRACELULARNH2TC 18C C 1710 14C 21 C C 125C122 246256S267ST268COOHFigura 17. Estructura propuesta para M6a y aminoácidos que podrían modular su función. Elesquema muestra la estructura de M6a según modelos de predicción topográfica. Se observan loscuatro dominios transmembrana, los dos loops extracelulares y el loop intracelular, así como losextremos amino y carboxilo terminal dentro del compartimiento intracelular. Se muestran losposibles sitios de fosforilación para PKC () y CK2 () y los posibles sitios de N-glicosilación ().Además, se destacan los residuos de cisteína en los loops extracelulares que estabilizarían laestructura mediante la formación de puentes disulfuro () y las cisteínas intracelulares que podríanser blancos de palmitoilación (). Los números indican la posición aminoacídica de los distintosresiduos.42

ResultadosLa estructura propuesta para M6a se asemeja a la de las proteínas pertenecientes ala gran familia de las tetraspaninas. M6a comparte con proteínas de esta familia el motivoTyr-Xaa-Xaa-ø (donde ø representa un aminoácido con residuo hidrofóbico) en el extremocarboxilo terminal y la presencia de siete cisteínas en regiones yuxtapuestas a la membranaque podrían ser palmitoiladas (Stipp et al. 2003). Para varios miembros de la gran familia delas tetraspaninas (CD9, CD81, CD82 y Cd151) la palmitoilación ha resultado ser clave para sulocalización e interacción con otras proteínas. Además, mutaciones en los sitios depalmitoilación en distintas tetraspaninas han sido asociadas a alteraciones en la morfologíacelular (Hemler 2005; Schneider et al. 2005). Es por ello, que se decidió realizar un estudiomutacional, en el cual se mutaron los siete residuos de cisteína que podrían ser blanco depalmitoilación, para luego evaluar la funcionalidad de la proteína resultante en la formaciónde filopodios. Por otra parte, la fosforilación mediada por CK2 en residuos extracelulares deproteínas de membrana ha sido involucrada en la regulación de la morfología celular y elcitoesqueleto de actina (Canton et al. 2006). Por este motivo, se estudió la capacidad dedistintas mutantes de la proteína M6a, donde se sustituyeron los aminoácidos extracelularesclave para la fosforilación por CK2, de inducir la formación de filopodios.Las distintas mutantes de M6a, fueron obtenidas mediante la técnica de mutagénesisdirigida. De este modo se realizó una séptuple mutante en los posibles sitios depalmitoilación en la cual los siete residuos de cisteína de presunta localización intracelularfueron sustituidos por residuos de serina (M6a C14S C17S C18S C21S C122S C125S C246S).Por otra parte, se construyeron simples y múltiples mutantes en los sitios extracelulares defosforilación intercambiando los residuos de treonina y serina por alaninas (M6a T60A, M6aT67A, M6a T76A, M6a T60A T67A T76A, M6a T166A, M6a T184A, M6a T193A S195A y M6aT166A T184 T193A S195A). Una vez obtenidas las distintas mutantes, se transfectaroncélulas N2a y cultivos primarios de neuronas de hipocampo. En ningún caso se observó uncambio en la localización subcelular de la proteína. Se procedió entonces a evaluar lacapacidad de las distintas proteínas de promover la formación de filopodios. Como seobserva en las figuras 18 A y B la séptuple mutante en los posibles sitios de palmitoilación asícomo las distintas mutantes en los sitios extracelulares de fosforilación poseen la mismacapacidad que M6a wild type para inducir la formación de filopodios tanto en la línea celularN2a como en cultivos primarios de neuronas de hipocampo. Por lo tanto, la palmitoilación yla fosforilación extracelular de M6a no mediarían los efectos en la formación de filopodios.43

ResultadosACélulas N2a con filopodios% células con filopodios100806040200** **** ******GFP M6a M6aM6aM6aM6aM6aPalmT60AT67AT76ACK2EC1**M6aT166A**M6aT184A**M6aT193AS195A**M6aCK2EC2BDensidad de filopodios en neuronas de hipocampoProtrusiones / 20 m(% control)200150100500** ******Control M6a M6aM6aM6aPalmCK2CK2EC1EC2Figura 18. Inducción de la formación de filopodios por mutantes de M6a en los posibles sitios depalmitoilación y fosforilación extracelular. A. Células N2a fueron transfectadas con GFP, M6a wild type olas distintas mutantes de M6a. Al día siguiente, las células fueron fijadas y la actina fue teñida confaloidina. El gráfico muestra el porcentaje de células con filopodios. Como control se utilizaron células sintransfectar del mismo preparado. Las barras blancas representan las células transfectadas con lasconstrucciones que se indican debajo de las mismas mientras que las barras negras representan lascélulas control sin transfectar provenientes de los mismos preparados. Los resultados están expresadoscomo media + SEM de al menos 7 preparados de 2 experimentos independientes. ** p

Resultados3.2 LA FAMILIA DE LAS PROTEÍNAS PROTEOLIPÍDICAS: REGULACIÓN POR EL ESTRÉSCRÓNICO Y ROL EN LA FORMACIÓN DE FILOPODIOSLa proteína M6a, cuya expresión en el hipocampo se encuentra modulada por laexposición a tratamientos de estrés crónico y la administración de drogas antidepresivas,pertenece a la familia de las proteínas proteolipídicas (PLPs). En mamíferos, esta familia estácompuesta por M6a, M6b y PLP/DM20. Como se mencionó anteriormente, estas proteínasmuestran una alta homología entre sí compartiendo, además, una estructura similar. Dada lasimilitud encontrada entre los distintos miembros que conforman la familia PLP, se decidióestudiar si la expresión de los otros miembros de la familia también se encuentra alterada enel hipocampo de animales estresados crónicamente. Asimismo, teniendo en cuenta el roldescripto para M6a en la formación de filopodios (figuras 7 y 13), se decidió investigar si estacapacidad se encuentra conservada en otros miembros de la familia PLP.3.2.1 Homología entre los miembros de la familia de las PLPsEn los mamíferos, la familia de las PLPs está constituida por M6a, M6b y PLP/DM20(Yan et al. 1993). De acuerdo con modelos de predicción estructural, estas proteínascomparten la estructura descripta en la figura 3 compuesta por cuatro dominiostransmembrana (TM) separados por tres loops hidrofílicos, con los extremos amino ycarboxilo terminales en el citoplasma. (Popot et al. 1991; Yan et al. 1993). En la figura 19 semuestra la identidad aminoacídica entre M6a, M6b, PLP y DM20 en la región comprendidapor los cuatro dominios TM, los loops extracelulares menor y mayor, y el loop intracelular.PLP y DM20 son distintas isoformas codificadas por un mismo gen que se generan por elsplicing alternativo del exón 3b. Al analizar la región completa, M6a muestra mayoridentidad con M6b que con DM20. Al poseer un dominio extra de 35 aminoácidos codificadopor el exón 3b, PLP presenta menor identidad con M6a. Al analizar cada región porseparado, se encuentran similitudes dispares. La identidad aminoacídica más elevada seobserva en el primer dominio TM, con valores de 82% para M6b y 67% para PLP y DM20 conrespecto a M6a. Mientras que en el loop intracelular y el segundo dominio TM estasproteínas aún comparten una alta identidad (con valores entre el 55 % y el 65 %), no seencuentran similitudes significativas en el loop extracelular menor y en el cuarto dominioTM. En el tercer dominio TM, solo se encuentra similitud entre M6a y M6b, mientras que enel loop extracelular mayor, sólo PLP y DM20 muestran similitud con M6a.45

ResultadosM6aEC 1 IC EC 2TM 1 TM 2 TM 3 TM 4EC 1 IC EC 2M6b TM 1 TM 2 TM 3 TM 4(51 %)SNS65 %SNS82 % 61 %48 %SNSEC 1 IC EC 2DM20 TM 1 TM 2 TM 3 TM 4(46 %)SNS 55 %32 %67 % 65 %SNSSNSEC 1IC 3bEC 2PLP TM 1 TM 2TM 3 TM 4 (38 %)SNS 55 %32 %67 % 65 %SNSSNSFigura 19. Identidad aminoacídica entre miembros de la familia de las PLPs. Esquemas que muestranla identidad aminoacídica en los dominios tansmembrana (TM), el loop extracelular menor (EC 1), elloop intracelular (IC) y el loop extracelular mayor (EC 2) de M6b, DM20 y PLP, relativa a M6a. Laidentidad relativa en cada dominio se muestra debajo de cada diagrama. La identidad en toda la regiónse muestra entre paréntesis. 3b: región codificada por el exón alternativo 3b. SNS: similitud nosignificativa.3.2.2 Efectos del estrés crónico sobre la expresión de los miembros de la familia de lasPLPsCon el objeto de evaluar el efecto del estrés sobre la expresión de genes de la familiade las PLPs en el hipocampo, se utilizó el modelo de estrés crónico por confinamiento enratones. Se realizaron ensayos de inmovilización de 4 horas por día, durante 21 días, conratones machos de la cepa C57BL/6. Durante la duración del experimento, los animalesestresados mostraron un menor aumento de peso que los animales control (control = 108,44± 2,64; estresados = 95,84 ± 1,70, los datos indican la media ± SEM de 9 animales por grupoexpresada como porcentaje del peso inicial, p < 0,01 calculado con la prueba T de Student).Estos resultados indican que el grupo de animales sujeto a inmovilización resultó realmenteafectado y concuerdan con lo reportado anteriormente para animales estresados con elmismo modelo de inmovilización (Magarinos et al. 1995).Una vez terminado el tratamiento de estrés se obtuvieron muestras de ARNm de loshipocampos de los ratones estresados y control. La cuantificación de los niveles de expresiónde los genes de interés se realizó por la técnica de RT-PCR en tiempo real. En concordanciacon experimentos anteriores, el nivel de expresión de M6a se encontró reducido en el46

Resultadoshipocampo de los animales estresados (figura 20 A). Como se muestra en la figura 20 B, losanimales sometidos a estrés crónico también mostraron una reducción en los niveles deexpresión de M6b en comparación con los animales control. Como se mencionó en laintroducción, y se detalla en la próxima sección, se han identificado varias isoformas de M6b(Werner et al. 2001). En la determinación de los niveles de expresión de M6b por PCR entiempo real (figura 20 B), se utilizaron oligonucleótidos en el extremo 3´UTR (del inglés,untranslated region) que amplifican todas las isoformas de M6b descriptas (figura 21). Por lotanto, la expresión del total de las isoformas de M6b se encuentra reducida en el hipocampode animales estresados crónicamente.AM6aBM6bCPLP / DM20100100100nivel ARNm80604020**nivel ARNm80604020**nivel ARNm806040200ControlEstrés0ControlEstrés0ControlEstrésD Expresión relativa E DM20 FPLP100100100nivel ARNm80604020nivel ARNm80604020*nivel ARNm806040200PLPDM200ControlEstrés0ControlEstrésFigura 20. Efectos del estrés crónico sobre la expresión de genes de la familia de las PLPs en elhipocampo. Ratones macho de la cepa C57BL/6 fueron crónicamente estresados (barras blancas) outilizados como control (barras negras). Muestras de ARNm de los hipocampos de los animalesfueron cuantificadas por RT-PCR en tiempo real. Los gráficos muestran los niveles de expresión deM6a (A), M6b (B), PLP/DM20 (C), DM20 (E) and PLP (F). Los niveles de expresión para cada individuofueron normalizados con el gen de referencia ciclofilina. Los resultados están expresados como lamedia de cada grupo + SEM proveniente de 9 animales por grupo y como porcentaje del grupocontrol. *p

ResultadosEn el caso de PLP y DM20, sus niveles de expresión fueron medidos, en un primermomento, con oligonucleótidos que amplificaban una región del extremo 3´UTR compartidapor ambas moléculas de ARNm, no habiéndose encontrado diferencias significativas entrelos animales estresados crónicamente y los animales control (figura 20 C). Al cuantificar laexpresión relativa de cada transcripto, se encontró que PLP se expresa alrededor de diezveces más que DM20 en el hipocampo de ratones adultos no estresados (figure 20 D).Entonces, se decidió determinar los niveles de expresión para cada isoforma en elhipocampo de animales control y estresados. Como se muestra en la figura 20 E, la expresiónde DM20 se encontró disminuida en los animales estresados. Por el contrario, la expresiónde PLP no se vio afectada en forma significativa por el tratamiento de estrés (figura 20 F).Por lo tanto, el estrés crónico disminuye la expresión de M6b y DM20 en el hipocampomientras que la expresión de PLP no se encontraría alterada.3.2.3 Isoformas de M6bVarias isoformas han sido descriptas para la proteína M6b (Werner et al. 2001). Lasdistintas isoformas de M6b son el resultado de la utilización de promotores alternativos parael inicio de la transcripción en combinación con eventos alternativos de splicing (figura 21).La presencia del dominio en el extremo amino de la proteína (representado en colornaranja en la figura 21 y presente en las isoformas M6b TMD, M6b TMD, M6bTMD, M6b TMD, M6b y M6b ) se encuentra determinada por el sitio de iniciode la transcripción utilizado. En tanto, el splicing alternativo es responsable de la presenciadel dominio en la región amino terminal de la proteína codificado por el exón II(representado en color amarillo en la figura 21 y presente en las isoformas M6b TMD,M6b TMD y M6b ), y de la inclusión del dominio (en M6b TMD, M6b TMD yM6b TMD) o el dominio (en M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD) en el extremocarboxilo de la proteína (representados en color violeta y fucsia, respectivamente, en lafigura 21). La inclusión del exón alternativo III genera ARNms que codifican para proteínasmás cortas (M6b y M6b ), sin los dominios TM y con el dominio en el extremocarboxilo terminal (representado en azul en la figura 21).48

ResultadosIa IV V VI VII VIII XTMDIb IV V VI VII VIII XTMDIb IIIV V VI VII VIII XTMDIa IV V VI VII VIII IXXTMDIb IV V VI VII VIII IXXTMDIb IIIV V VI VII VIIIIXXTMDIbIIIIVV VI VII VIIIIXXIbIIIIIIVV VI VII VIIIIXXFigura 21. Estructura de los ARNm de M6b y sus productos proteicos. El gen de M6b da origen a distintosARNm que codifican para 8 isoformas proteicas. Los exones se encuentran representados por rectángulosy los intrones por líneas. En colores se resaltadas las regiones codificantes. Los números romanos indicanel número de exón y a la derecha de cada esquema se incluye el nombre asignado a la isoforma proteicacodificada por cada ARNm. Los distintos ARNm son el resultado del uso alternativo de sitios de inicio de latranscripción (exones Ia y Ib) y eventos de splicing alternativo. Los exones IV-VIII codifican para losdominios transmembrana. Las flechas azules muestran la posición de los oligonucleótidos utilizados paradeterminar los niveles de expresión total de M6b por PCR en tiempo real en animales estresados ycontrol. Las flechas rojas indican la posición de los oligonucleótidos utilizados para determinar laexpresión relativa de distintas isoformas de M6b. Las flechas verdes representan la ubicación de losoligonucleótidos utilizados para amplificar las secuencias codificantes (CDS) de las distintas isoformas.Adaptado de Werner et al., 2001.Para estudiar la contribución relativa de las distintas isoformas de M6b al nivel totalde expresión de M6b, se determinaron los niveles de expresión de distintas isoformas en elhipocampo de animales no estresados. Se utilizaron oligonucleótidos específicos para laamplificación de los exón Ia (presente en los transcriptos que codifican para las isoformasM6b TMD y M6b TMD) y el exón Ib (presente en los ARNms que codifican para lasisoformas M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD, M6b y M6b ),que representan sitios alternativos del inicio de la transcripción; así como oligonucleótidos49

Resultadosespecíficos para la amplificación del exón III, que sólo se encuentra presente en los ARNmque codifican para las proteínas más cortas sin los dominios TM (M6b y M6b ). Comose muestra en la figura 22, se encontraron niveles similares de moléculas de ARNm con elexón Ia y el exón Ib, lo que podría ser indicativo de un uso similar de los promotoresalternativos en el hipocampo. Por el contrario, el nivel de expresión de isoformas con el exónIII resultó 8 órdenes de magnitud menor (figura 22), indicando que las isoformas de M6b sinlos dominios TM (M6b y M6b ) no se expresan significativamente en el hipocampo.Expresión relativa de isoformas de M6bnivel ARNmnivel ARNm100500,0000010M6b TMDM6b TMDM6b M6b Ia TMDM6b IB TMDM6b IIIM6b TMDM6b TMDM6b M6b exón Ia exón Ib exón IIIIsoformasPrimersFigura 22. Niveles de expresión relativa de isoformas de M6b en elhipocampo. Muestras de ARNm de hipocampo de ratón adulto fueroncuantificadas por RT-PCR en tiempo real utilizando oligonucleótidos queamplifican los exones Ia, Ib y III de M6b. Los resultados están expresadoscomo la media de cada grupo + SEM proveniente de 3 animales control ycomo porcentaje del exón Ib. La figura muestra todas las isoformasdescriptas en la literatura cuyos ARNm contienen los distintos exones(Werner et al. 2001).3.2.4 Clonado y expresión de isoformas de M6b y PLPEn las secciones anteriores se mostró que un miembro de la familia de las PLPs, laglicoproteína M6a, promueve la formación de neuritas y filopodios/espinas en cultivosprimarios de neuronas de hipocampo y en diversas líneas celulares (figuras 7 y 13). Por lotanto, se decidió evaluar la capacidad de los otros miembros de la familia PLP de inducir la50

Resultadosformación de filopodios. Para ello, se procedió con el clonado de las distintas isoformas deM6b y PLP. En el caso de M6b, de las ocho isoformas descriptas en la literatura (Werner etal. 2001), representadas en la figura 21, sólo cinco pudieron ser clonadas por RT-PCR a partirde ARNm de hipocampo de ratón adulto: M6b TMD, M6b TMD, M6b TMD, M6bTMD y M6b . Moléculas de ARNm conteniendo el exón alternativo II, que codifica parael dominio en la región citosólica N terminal de la proteína, no han podido seramplificadas, posiblemente debido a una baja expresión en el hipocampo de ratón adulto.También se clonaron por RT-PCR las secuencias codificantes para PLP y DM20. Lassecuencias codificantes para las distintas isoformas de M6b, PLP y DM20 fueron clonadascomo proteínas de fusión a GFP, para poder visualizar su localización y analizar su función.Cultivos primarios de neuronas de hipocampo y células N2a fueron transfectados con lasdistintas construcciones (figura 23). Como ha sido descripto para la proteína endógena(Werner et al. 2001), GFP::M6b TMD se observa en estructuras intracelulares y en lasuperficie de las neuronas (figura 23 a y b). Como se muestra en la figura 23 c, imágenes decélulas N2a transfectadas obtenidas por microscopía confocal sugieren una localización en lamembrana plasmática para la proteína de fusión GFP::M6b TMD. Las proteínas GFP::M6bTMD, GFP::M6b TMD y GFP::M6b TMD presentan la misma localización queGFP::M6b TMD (figura 23 d-l). La isoforma que no posee los sitios transmembrana,GFP::M6b , se localiza en el citoplasma (figura 23 m-o). Las proteínas GFP::PLP yGFP::DM20 también presentan una localización que concuerda con lo descripto para lasproteínas endógenas (Thomson et al. 1997). Ambas proteínas presentan una localizaciónsimilar que incluye tanto la presencia en estructuras intracelulares como una marcadaexpresión en la superficie celular, muy probablemente, la membrana plasmática. (figuras 23p-u). Por último, la proteína VSVG (del inglés, G protein of Vesicular Stomatitis Virus) ha sidoutilizada como proteína control de localización en la membrana plasmática (figura 22 v-x).51

ResultadosFigura 23. Localización celular de las isoformas de M6b y PLP. Los esquemas en la parte izquierda dela figura muestran una representación de las secuencias codificantes (CDS) que se clonaron comoproteínas de fusión a GFP. Cultivos primarios de neuronas de hipocampo y células N2a fuerontransfectados con las distintas construcciones. Imágenes obtenidas por microscopía confocalmuestran la localización de las proteínas de fusión en neuronas (a, d, g, j, m, p, s, v; magnificacionesb, e, h, k, n, q, t y w) y en células N2a (c, f, i, l, o, r, u y x). VSVG: proteína de membrana utilizada comocontrol. TMD: dominios transmembrana. 3b: exón alternativo presente en PLP y no en DM20. Barra =10 m.52

Resultados3.2.5 M6b y DM20 inducen la formación de filopodios en cultivos primarios de neuronasde hipocampo y en líneas celularesCon el fin de evaluar la capacidad de M6b de promover la formación de filopodios, sedecidió realizar ensayos de sobreexpresión con las distintas isoformas de M6b. Cultivosprimarios de neuronas de hipocampo fueron transfectados a los 7 días in vitro con GFP(control), GFP::M6a o las construcciones de GFP fusionadas a las distintas isoformas de M6bque contienen los dominios TM. Un día después de la transfección, las neuronas fueronfijadas y la actina fue teñida con faloidina (figura 24 A). Luego, se determinó el número deprotrusiones en fragmentos de 20 m de neurita. Como se muestra en la superposición de lafigura 24 A, las protrusiones poseen un citoesqueleto de actina, característico de losfilopodios. El gráfico de la figura 24 B muestra que las distintas isoformas de membrana deM6b inducen la formación de filopodios en forma similar a M6a.AF-actinaSuperposiciónGFPGFP::M6aGFP::M6b TMDGFP::M6b TMDGFP::M6b TMDGFP::M6b TMDBDensidad de filopofiosProtrusiones / 20 μm(% control)200150100500Control M6a M6bTMD** ** ** ** **M6bM6bM6bTMDTMDTMDFigura 24. La sobreexpresión de isoformasde membrana de M6b aumenta la densidadde filopodios. Cultivos primarios deneuronas de hipocampo fuerontransfectados a los 7 días in vitro con GFP,GFP::M6a, GFP::M6b TMD, GFP::M6bTMD, GFP::M6b TMD y GFP::M6bTMD. Un día después, las neuronasfueron fijadas y la actina fue teñida confaloidina (A). El número de protrusiones en20 m de neurita fue cuantificado (B). Elgráfico muestra la media + SEM, expresadacomo porcentaje del control (GFP), de por lomenos 80 neuritas por grupo. **p

ResultadosLuego, se analizó si PLP y DM20 eran capaces de modificar la densidad de filopodiosen neuronas hipocampales, con un diseño experimental similar al anterior. Cultivosprimarios de neuronas de hipocampo de 3 días in vitro fueron transfectados con GFP,GFP::M6b , VSVG::GFP, GFP::M6a, GFP::PLP o GFP::DM20. Al día siguiente, las célulasfueron fijadas y la actina fue teñida con faloidina (figura 25 A). La cuantificación del númerode protrusiones en 20 m de neurita reveló que la sobreexpresión de DM20 induce laformación de filopodios, aunque en menor medida que la sobreexpresión de M6a (figura 25B). Por el contrario, la sobreexpresión de PLP no produjo un aumento en la densidad defilopodios. Para evaluar la importancia de la localización en la membrana y/o de los dominiosTM, se utilizó la construcción que codifica para la expresión de la isoforma M6b que noposee los dominios TM. La sobreexpresión de GFP::M6b no produjo un aumento en ladensidad de filopodios, sugiriendo que la localización de M6b en la membrana plasmáticay/o la presencia de los dominios TM es crucial para su función en la formación de filopodios.Para comprobar que la sobreexpresión de cualquier proteína de membrana no es suficientepara promover el crecimiento de filopodios, se utilizó la proteína VSVG. La sobreexpresiónde VSVG::GFP no resultó en un aumento en la densidad de filopodios demostrando que elefecto es específico de las proteínas M6a, M6b y DM20.ABProtrusiones / 20 μm(% control)20015010050F-actinaSuperposiciónGFPGFP::M6b VSVG::GFPGFP::M6aGFP::PLPGFP::DM20Densidad de filopofios**#**Control M6b VSVG M6a PLP DM20Figura 25. La sobreexpresión de DM20, perono de PLP, induce la formación defilopodios. Después de 3 días in vitro,neuronas de hipocampo fuerontransfectadas con GFP, GFP::M6b ,VSVG::GFP, GFP::M6a, GFP::PLP oGFP::DM20. Al día siguiente, las neuronasfueron fijadas y la actina fue teñida confaloidina (A). El número de protrusiones en20 m de neurita fue cuantificado (B). Elgráfico muestra la media + SEM, expresadocomo porcentaje del control (GFP), de por lomenos 80 neuritas por grupo. **p

ResultadosPara estudiar la capacidad de M6b y DM20 de inducir la formación de filopodios enotras sistemas celulares, se realizaron ensayos de sobreexpresión en la línea neuronal N2a yla línea no neuronal COS-7 (figuras 26 y 27, respectivamente). Ambos cultivos fuerontransfectados con las mismas construcciones utilizadas en cultivos primarios de neuronas dehipocampo. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fuemarcada con faloidina para permitir la visualización de los filopodios (figuras 26 A y 27 A).Como se muestra en los gráficos de las figuras 26 B y 27 B, la sobreexpresión de GFP noresulta en un aumento en el porcentaje de células con filopodios en la línea neuronal N2a nien la línea no neuronal COS-7. Por el contrario, la sobreexpresión de M6a, de las isoformasde M6b que poseen dominios TM y de DM20, produjo un aumento en el porcentaje decélulas con filopodios. En ambas líneas celulares, las isoformas de membrana de M6b fueroncapaces de inducir la formación de filopodios de un modo similar a M6a. En concordanciacon lo hallado en cultivos primarios de neuronas de hipocampo, DM20 sólo indujolevemente la formación de filopodios en N2a en comparación con M6a (figura 26 B). Sinembargo, en células no neuronales COS-7, DM20 indujo la formación de filopodiosnotablemente, con valores similares a los obtenidos para M6a (figura 27 B). Por lo tanto, aligual que sucede para M6a, la capacidad de las isoformas de membrana de M6b y DM20 deinducir la formación de filopodios no se encuentra restringida a cultivos primarios deneuronas de hipocampo y cultivos de líneas neuronales (N2a) sino que también se observaen cultivos de células no neuronales (COS-7).De forma similar a lo realizado con la proteína M6a se construyeron vectores deexpresión que codifican para la expresión de las distintas isoformas de membrana de M6bde forma separada de GFP (GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD yGFP+M6b TMD). Así, las células transfectadas expresan GFP y son fácilmentereconocibles, pero la proteína de interés es expresada sin adición de la proteína reportera, loque podría alterar su función. Se realizaron ensayos de sobreexpresión en N2a con estasconstrucciones. Como se muestra en el gráfico de la figura 28, el porcentaje de células confilopodios es mayor en las células que sobreexpresan las distintas isoformas de M6b deforma independiente de GFP que en células sin transfectar. Por lo tanto, las distintasisoformas de membrana M6b son capaces de inducir la formación de filopodios por símismas, no estando la proteína reportera GFP involucrada en esta función.55

ResultadosACél. no transfectadaF-actinaGFPF-actinaGFP::M6aF-actinaGFP::M6b TMDF-actinaGFP::M6b TMDF-actinaGFP::M6b TMDF-actinaGFP::M6b TMDF-actinaGFP::DM20F-actinaBCélulas N2a con filopodios% cél. con filopodios100806040200** **GFP M6a M6bTMD*M6bTMD**M6bTMD**M6bTMD#**DM20Figura 26. Inducción de la formación de filopodios por M6b y DM20 en células N2a. Cultivos de célulasneuronales N2a sin diferenciar fueron transfectados con GFP (control negativo), GFP::M6a (controlpositivo), GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD o GFP::DM20. Lascélulas fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fue teñida con faloidina (A). Losgráficos de la figura B muestran el porcentaje de células con filopodios. Como control se utilizaron célulassin transfectar del mismo preparado. Las barras blancas representan las células transfectadas con lasconstrucciones que se indican debajo de las mismas mientras que las barras negras representan lascélulas control sin transfectar provenientes de los mismos preparados. Los resultados están expresadoscomo media + SEM de un mínimo de 6 preparados de al menos 2 experimentos independientes. *p

ResultadosACél. no transfectadaF-actinaGFPF-actinaGFP::M6aF-actinaGFP::M6b TMDF-actinaGFP::M6b TMDF-actinaGFP::M6b TMDF-actinaGFP::M6b TMDF-actinaGFP::DM20F-actinaBCélulas COS-7 con filopodios% cél. con filopodios100806040200** ** ** ****GFP M6a M6bM6bM6bM6bTMDTMDTMDTMD**DM20Figura 27. La sobreexpresión de M6b y DM20 induce la formación de filopodios en células COS-7.Cultivos de células COS-7 fueron transfectados con GFP (control negativo), GFP::M6a (control positivo),GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD o GFP::DM20. Las célulasfueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fue teñida con faloidina (A). Los gráficos dela figura B muestran el porcentaje de células con filopodios. Como control se utilizaron células sintransfectar del mismo preparado. Las barras blancas representan las células transfectadas con lasconstrucciones que se indican debajo de las mismas mientras que las barras negras representan lascélulas control sin transfectar provenientes de los mismos preparados. Los resultados están expresadoscomo media + SEM de un mínimo de 6 preparados de al menos 2 experimentos independientes. **p

Resultados% cél. con filopodios100806040200Células N2a con filopodios** ** ******GFP M6a M6bM6bM6bM6bTMDTMDTMDTMDFigura 28. La sobreexpresión de M6b, independientemente de GFP, induce la formación defilopodios. Cultivos de células N2a sin diferenciar fueron transfectados con GFP (control negativo),GFP::M6a (control positivo), GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD o GFP+M6bTMD. Las células fueron fijadas 1 ó 2 días después de la transfección y la actina fue teñida confaloidina para permitir la visualización de los filopodios. El gráfico muestra el porcentaje de célulascon filopodios. Como control se utilizaron células sin transfectar del mismo preparado. Las barrasblancas representan las células transfectadas con las construcciones que se indican debajo de lasmismas mientras que las barras negras representan las células control provenientes de los mismospreparados. Los resultados están expresados como media + SEM de un mínimo de 6 preparados deal menos 2 experimentos independientes. **p

Resultados3.3 ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN EL GEN QUE CODIFICA PARA LA PROTEÍNA M6a(GPM6A) EN PACIENTES CON DEPRESIÓNLa etiología de la depresión involucra tanto factores ambientales como genéticos(Fava et al. 2000). Los genes involucrados en la enfermedad no han sido todavíadeterminados. Sin embargo, se han hallado polimorfismos asociados a la patogénesis de ladepresión y/o comportamientos suicidas en genes relacionados con el crecimiento deneuritas y plasticidad sináptica, y en genes cuya expresión se encuentra modulada por elestrés y el tratamiento con antidepresivos (Bellivier et al. 1998; Kunugi et al. 2004; Tadokoroet al. 2005; van West et al. 2006; Iga et al. 2007; Sarchiapone et al. 2008). Dado el roldescripto en este trabajo para M6a en la extensión de procesos y en la plasticidad neuronal,y debido a la regulación de su expresión por tratamientos de estrés y antidepresivos (Alfonsoet al. 2004; Alfonso et al. 2006), decidimos analizar la secuencia correspondiente al gen quecodifica para la proteína M6a (GPM6A) en ADN genómico de pacientes con depresión.Muestras de ADN genómico de 28 personas (17 mujeres y 9 hombres) diagnosticadascon distintos tipos de depresión fueron utilizadas como molde en reacciones de PCR. En unprincipio se amplificaron las regiones correspondientes a todos los exones (secuenciaspresentes en el ARNm maduro) del gen GPM6A. Se analizaron estas regiones ya que unaalteración en los exones es más probable que altere la función y/o la expresión de laproteína. Los productos de amplificación fueron luego secuenciados y se analizó la existenciade alteraciones. Como se muestra en la figura 29 A, se han descripto 12 polimorfismos en losexones del gen GPM6A humano. La secuenciación de nuestras muestras no reveló laexistencia de ningún otro sitio polimórfico en estos exones. Mientras realizábamos estosestudios, se publicó una investigación en la que se asociaba un polimorfismo en el segundointrón del gen GPM6A (rs10520303) con un subgrupo de pacientes con síntomas depresivosdentro de una población de individuos diagnosticados con esquizofrenia (Boks et al. 2007).Por este motivo, también amplificamos y analizamos esta región en nuestras muestras. Lafigura 29 B muestra una tabla con las frecuencias genotípicas y alélicas en los distintos sitiospolimórficos obtenida para los pacientes con depresión y las frecuencias publicadas en labase de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information) para una población deorigen europeo (HapMap-CEU), ya que nuestras muestras analizadas provenían de pacientessuecos. Como se observa en la tabla de la figura 29, la mayoría de los sitios resultaron no serpolimórficos en la población estudiada. Para dos de estos sitios (polimorfismos 6 y 11 en lafigura 29), la base de datos tampoco muestra polimorfismos en la población de origen59

Resultadoseuropeo analizada. Para los otros sitios que no resultaron ser polimórficos en nuestramuestra no existe información acerca de la frecuencia alélica ni genotípica en las bases dedatos consultadas. En nuestras muestras, cinco sitios resultaron polimórficos. Para lospolimorfismos 8 y 9, no se tiene información sobre la frecuencia alélica ni genotípica enbases de datos. Por otro parte, para los otros tres sitios (polimorfismos 7, 12 y 13, esteúltimo recientemente asociado a síntomas de depresión en individuos diagnosticados conesquizofrenia) se observan frecuencias genotípicas y alélicas en bases de datos que difierende lo observado en nuestra muestra. Sin embargo, la población estudiada es muy reducida yse carecen de muestras control apropiadas para determinar estadísticamente si existe unaasociación entre alguno de estos polimorfismos y la depresión.A1 213345678 9 10 1112BSNPIdentificaciónFrecuencia genotípicaFrecuencia alélicaPacientes con depresión Base de datos Pacientes con depresión Base de datos1 rs11930023 1 AA ND 1 A ND2 rs11545191 1 CC ND 1 C ND3 rs11729990 1 AA ND 1 A ND4 rs11545192 1 AA ND 1 A ND5 rs11545193 1 TT ND 1 T ND6 rs1049820 1 GG 1 GG 1 G 1 G7 rs3733398 0,964 GG ; 0,036 GT 0,867 GG ; 0,1 GT ; 0,033 TT 0,982 G ; 0,018 T 0,917 G ; 0,083 T8 rs1049835 0,179 CC ; 0,5 CT ; 0,321 TT ND 0,571 T ; 0,429 C ND9 rs6820412 0,892 AA ; 0,107 CA ND 0,875 AA ; 0,125 AC ND10 rs11545194 1 CC ND 1 CC ND11 rs12499061 1 CC 1 CC 1 C 1 C12 rs17061725 0,892 TT ; 0,107 CT 0,967 TT; 0,033 CT 0,946 T ; 0,054 C 0,983 T ; 0,017 C13 rs10520303 0,821 GG ; 0,179 GC 0,9 GG ; 0,083 GC ; 0,017 CC 0,911 G ; 0,089 C 0,942 G ; 0,058 CFigura 29. Polimorfismos en el gen GPM6A humano. A. Esquema representando al gen GPM6A humano. Sedestacan los exones (rectángulos), intrones (líneas punteadas) y las regiones codificantes que codifican para laproteína M6a (rectángulos gris claro). Las flechas indican la posición de los polimorfismos descriptos en losexones y un polimorfismo intrónico (rs10520303) recientemente asociado a pacientes con síntomas dedepresión entre individuos diagnosticados con esquizofrenia. B. Tabla que resume las frecuencias genotípicas yalélicas determinadas en individuos suecos diagnosticados con distintos tipos de depresión (n = 28, de loscuales 21 pacientes fueron diagnosticados con depresión mayor; 3 con desorden depresivo tipo NOS, del inglés,Not Otherwise Specified; 2 con trastorno bipolar de tipo II; 1 con desorden esquizo-afectivo de tipo bipolar y 1con distimia). También se indican las frecuencias genotípicas y alélicas para una población de origen europeo(HapMap-CEU) publicada en la base de datos NCBI (National Center for Biotechnology Information). Lospolimorfismos cuya frecuencia genotípica y alélica en la muestra de pacientes con depresión difiere de lapublicada en base de datos se encuentran enmarcados en rojo. ND: información no disponible.60

Discusión4. DISCUSIÓNEn el presente trabajo se determinó que la proteína M6a, cuya expresión en elhipocampo se encuentra alterada por la exposición al estrés crónico, induce la formación deneuritas, filopodios/espinas y, probablemente, sinapsis. Luego, se extendió el análisis a otrosmiembros de la familia de las PLPs, estableciéndose que la expresión de M6b y DM20 en elhipocampo también se encuentra regulada por el estrés crónico. Además, se vio que M6b yDM20 comparten con M6a la capacidad de inducir la formación de filopodios. Finalmente seinició el estudio de polimorfismos en el gen GPM6A que podrían encontrarse asociados a ladepresión.Estudios previos en nuestro laboratorio habían determinado que la expresión delgen que codifica para la proteína M6a se encontraba alterada en diversos modelos animalesde estrés crónico y modulada por la administración de distintas drogas antidepresivas(Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006). Sin embargo, al inicio de este trabajo de tesis, eraescasa la información sobre la función biológica de la proteína M6a. Los resultados aquímostrados indican que, en cultivos primarios de neuronas de hipocampo, la proteína M6a seencuentra en la membrana del soma y los procesos neuronales, concentrándose enestructuras ricas en actina tipo filopodios (figura 4). La sobreexpresión de M6a induce laextensión de neuritas y la formación de filopodios/espinas en neuronas hipocampales(figuras 6 y 7). Por el contrario, una reducción en los niveles de M6a, provoca unadisminución en la densidad de filopodios/espinas y en el número de puntos de sinaptofisinaen cultivos primarios de neuronas de hipocampo (figuras 11 y 12). Por lo tanto, se presentósobrada evidencia experimental de que M6a tendría un rol determinante en el crecimientode neuritas y en la formación de filopodios/espinas pudiendo estar, además, involucrada enel establecimiento de sinapsis. Además, se estableció que la capacidad de M6a de inducir laformación de filopodios no se encuentra restringida a cultivos primarios de neuronas dehipocampo, sino que se extiende a cultivos celulares neuronales como N2a y PC12, y la líneano neuronal COS-7 (figura 13).Una vez identificada una función biológica de M6a, se extendió el análisis a otrosmiembros de la familia de las proteínas proteolipídicas: M6b y PLP/DM20. Así, se determinóque la expresión de M6b y DM20 también se encuentra reducida en el hipocampo deanimales sometidos a estrés crónico (figuras 20 B y 20 E). Por el contrario, la expresión dePLP, una variante de splicing de DM20, no se encuentra modulada por la exposición a estrés61

Discusióncrónico por confinamiento (figura 20 F). Al iniciar esta tesis, varias isoformas proteicas deM6b habían sido descriptas, sin embargo, ninguna función biológica les había sido asignada(Werner et al. 2001). En este trabajo se determinó que cuatro isoformas de M6b, quedifieren en sus extremos amino y carboxilo terminales pero que se localizan en la membranaplasmática ya que poseen los dominios TM, promueven la formación de filopodios encultivos primarios de neuronas de hipocampo, en células neuronales N2a y células noneuronales COS-7 (Figuras 24, 26 y 27). Por lo tanto, los extremos amino y carboxiloterminales de M6b no serían determinantes para esta función. Por otro lado, una isoformacitosólica que carece los dominios TM no induce la extensión de filopodios, demostrandoque las regiones TM y/o la localización en la membrana plasmática son esenciales para lafunción de M6b en la formación de filopodios (figura 25). La cuantificación de la expresiónde distintas isoformas de M6b reveló que en el hipocampo de ratón adulto, las isoformasque carecen los dominios TM se expresan de forma despreciable en comparación con lasisoformas de membrana (figura 22). Al analizar la capacidad de PLP y DM20 de inducir laextensión de filopodios, se vio que DM20 induce la formación de filopodios, aunque enmenor medida que M6a, en tanto que PLP no comparte esta función con los otros miembrosde la familia (figuras 25, 26 y 27). Nuestros resultados revelan, además, que la isoforma PLPse expresa aproximadamente 10 veces más que la isoforma DM20 en el hipocampo murinoadulto (figura 20 D).4.1 M6a y M6b podrían estar involucradas en el remodelado neuronal observado en elhipocampo de animales estresados crónicamenteEl estrés crónico induce alteraciones plásticas en el hipocampo, caracterizadas poruna disminución en la ramificación de las dendritas apicales y una reducción en el largo totalde las dendritas, así como por una marcada retracción de las espinas y una reducidadensidad sináptica en las neuronas piramidales de la zona CA3 (Watanabe et al. 1992;Magarinos et al. 1996; Sousa et al. 2000; Sandi et al. 2003; Stewart et al. 2005). También seha descripto en el hipocampo de animales estresados crónicamente, una reorganizaciónestructural en las terminaciones de las fibras musgosas, que incluye una reducción en susuperficie y en el número de sinapsis con las dendritas de las neuronas piramidales de la CA3(Magarinos et al. 1997; Sousa et al. 2000).La expresión de las glicoproteínas de membrana M6a y M6b se encuentra reducidaen el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico. En el presente trabajo se demostró62

Discusiónque, en cultivos primarios de neuronas hipocampales, la densidad de filopodios/espinas asícomo el número de puntos sinápticos se encuentran modulados por los niveles de expresiónde estas proteínas. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la disminución en losniveles de expresión de M6a y M6b podría ser, en parte, responsable de las alteracionesmorfológicas observadas en el hipocampo de animales estresados crónicamente. De acuerdocon esta hipótesis, M6a y M6b poseen una alta expresión en las neuronas piramidales de lazona CA3 del hipocampo y en las neuronas granulares del giro dentado de ratón adulto (Yanet al. 1996). En un trabajo reciente se demostró que, en el cerebro de rata adulta, laproteína M6a se localiza en los axones de las neuronas del giro dentado que conforman lavía de las fibras musgosas (Cooper et al. 2008). Estos axones, que constituyen la principalruta de comunicación entre el giro dentado y la zona CA3 del hipocampo, no estánmielinizados (Blackstad et al. 1961; Frotscher et al. 2006) y presentan protrusiones axonalesúnicas tipo filopodios (Acsady et al. 1998). Resulta interesante destacar que M6a estaríaenriquecida en estas protrusiones (Cooper et al. 2008). Por lo tanto, la disminución en laexpresión de M6a podría estar específicamente involucrada en la remodelación observadaen las terminales de las fibras musgosas de animales sometidos a estrés crónico. Asimismo,los aferentes glutamatérgicos de las fibras musgosas mediarían la atrofia de las neuronaspiramidales de la CA3 encontrada en animales estresados, ya que el daño es prevenido porel tratamiento con fenitoína, una droga que reduce la liberación de aminoácidos excitatorios(Watanabe et al. 1992), y por la administración de antagonistas de receptores de glutamatotipo NMDA (Magarinos et al. 1995). De este modo, las alteraciones en las dendritas de lasneuronas piramidales de la zona CA3 también podrían responder a la expresión diferencialde M6a en el hipocampo de animales estresados. La localización subcelular de la proteínaM6b no ha sido estudiada en el cerebro de animales adultos. Sin embargo, dada la expresióndel transcripto tanto en neuronas del giro dentado como de la zona CA3 (Yan et al. 1996),M6b podría estar involucrada en el remodelado de las fibras musgosas así como en lasmodificaciones de las dendritas de las neuronas piramidales de la zona CA3 observados en elhipocampo de animales estresados.Las consecuencias celulares de la expresión reducida de DM20 en el hipocampo deanimales estresados crónicamente aún deben ser evaluadas. Una relación directa entre laexpresión de DM20 y las alteraciones en las neuronas del hipocampo es difícil de concebir yaque DM20 no se expresaría en células neuronales (Verity et al. 1988; Yan et al. 1993; Yan etal. 1996).63

Discusión4.2 Evolución y homología funcional entre los miembros de la familia de las proteínasproteolipídicasNuestros resultados revelan que M6a, M6b y DM20 están involucradas en laformación de filopodios. La homología funcional encontrada entre estas tres proteínaspodría responder a la alta identidad aminoacídica que presentan, lo que podría explicarse entérminos de la evolución de los genes de la familia de las proteínas proteolipídicas. Como semuestra en la figura 30, se cree que las proteínas proteolipídicas evolucionaron a partir deun único gen ancestral presente en los bilaterados, emergiendo luego, en el linaje de losvertebrados, tres genes homólogos a M6a, M6b y PLP/DM20 de mamíferos (Schweitzer et al.2006). Por lo tanto, estas proteínas habrían evolucionado antes que la aparición de lamielina, por lo que su función en la mielinización fue adquirida tiempo después. Enconcordancia, DM20 (o su homólogo DM) emergió al mismo tiempo que la mielina,mientras que el dominio exclusivo de PLP, que incrementaría la eficiencia de inserción en lamielina (Trapp et al. 1997), fue adquirido con posterioridad. La alta identidad aminoacídicaentre DM20 y las proteínas neuronales M6a y M6b, podría explicar la homología funcionalen la inducción de la formación de filopodios y su regulación por estrés.Homo (3)Mus (3)Gallus(3) Xenopus (5) Danio (6) Squalus (3)Raja (3)Ciona (2) Caenorhabditis (1)Anopheles (1)Apis (1)Bombyx (1)Drosophila (1)Mamíferos Aves Anfibios Teleósteos PecesAgnatosAscidios Nematodos ArtrópodoscartilaginososTetrapodosVIVVertebrados con mandíbulaIIIVertebradosIICordadosIBilateradosFigura 30. Evolución de los genes de la familia de las proteínas proteolipídicas. El esquema muestra laevolución propuesta para los miembros de la familia de las PLPs. Los números entre paréntesis muestran lacantidad de genes de proteínas proteolipídicas en cada género. Las flechas muestran las duplicacionesgenómicas propuestas. Los números romanos indican pasos trascendentales en la evolución de los genes de lasproteínas proteolipídicas. I: gen ancestral. II: duplicación del genoma en los cordados tempranos, dando comoresultando 2 genes homólogos a M6a y M6b. III: emergencia del tercer gen que codifica para una proteínaproteolipídica en los vertebrados (homólogo a DM20), al tiempo que aparece la mielina. IV: incorporación deproteína homóloga a DM20 a la mielina. V: emergencia del exón específico de PLP en los tetrápodos. Adaptadode Schweitzer et al., 2006.64

DiscusiónSi bien los miembros de la familia de las proteínas proteolipídicas comparten una altaidentidad aminoacídica, su patrón espacial y temporal de expresión en el sistema nerviosomurino varía considerablemente. La expresión más temprana de M6a se observa enneuronas post mitóticas del cerebro y la médula espinal a partir del décimo día deldesarrollo embrionario (E10). Luego, en el cerebro adulto, M6a se expresa exclusivamenteen neuronas del hipocampo y de la corteza cerebral y en las células granulares del cerebelo(Yan et al. 1996). En contraste, durante el desarrollo embrionario, M6b se localiza en la zonaventricular de la médula espinal, encontrándose tanto en células neuronales hipocampales ycorticales, así como en la glía del cerebelo y de la corteza en el animal adulto (Yan et al.1996). Por otro lado, la expresión de PLP/DM20 se limita a oligodendrocitos (Yan et al.1996). Algunos estudios revelan la expresión de PLP/DM20, sólo a partir del primer día postnatal (P0) (Baron et al. 1993; Yan et al. 1996), mientras que otros la detectan en estadiosembrionarios (Ikenaka et al. 1992; Timsit et al. 1992; Yu et al. 1994).El desarrollo de las neuronas hipocampales in vitro se inicia con la extensión deneuritas del soma celular, especializándose luego estas extensiones en dendritas y axones(Dotti et al. 1988). Aunque el mecanismo por el cual las neuritas se desarrollan no seencuentra totalmente dilucidado, estudios recientes in vivo e in vitro muestran que laformación de filopodios es un paso clave para el inicio de la neuritogénesis en neuronascorticales (Dent et al. 2007; Kwiatkowski et al. 2007). La función en la extensión de neuritas yla formación de filopodios descripta para M6a y M6b en el presente trabajo y sus patronesde expresión sugieren que estas podrían estar involucradas en el desarrollo del sistemanervioso, más específicamente en los primeros pasos de la neuritogénesis, así como en lamaduración neuronal. En concordancia con nuestros resultados, estudios recientes handemostrado un rol para M6a en la extensión de neuritas en células neuronales de la retina(Zhao et al. 2008).En oligodendrocitos, la capacidad de M6b y DM20 de inducir la extensión de procesospodría ser necesaria en los primeros pasos de la mielinización, en donde el crecimiento deprocesos ha sido observado (Trapp et al. 1997). Por otro lado, hace tiempo que se concibeuna función alternativa para DM20, independiente a la de un componente estructural de lamielina o a la de un factor clave para la diferenciación y la supervivencia de los65

Discusiónoligodendrocitos (Knapp 1996; Nadon et al. 1997). Esta hipótesis se basa en la expresión deDM20 en células no mielinizantes como miocardiocitos, células embrionarias del sistemanervioso y neuroblastomas (Campagnoni et al. 1992; Ikenaka et al. 1992; Timsit et al. 1992).En concordancia, en el presente trabajo se describe una nueva función para la proteínaDM20 en la extensión de filopodios que no se encuentra restringida a células de fenotiponeuronal, sino que también se observa en células COS-7.4.3 Mecanismos que subyacerían la formación de filopodios mediada por las proteínasproteolipídicasLos miembros de la familia de las proteínas proteolipídicas han sido estudiados pormás de 50 años (Folch et al. 1951). Originalmente, fueron asociados con la extensión deprocesos hace 15 años (Lagenaur et al. 1992), y sólo han sido involucrados en la formaciónde filopodios recientemente en nuestro laboratorio (Alfonso et al. 2005). Los mecanismosmediante los cuales estas proteínas inducen la formación de filopodios son aúndesconocidos. Sin embargo, de acuerdo con el resultado de distintas investigaciones se hangenerado diversas especulaciones. Todas las proteínas proteolipídicas involucradas en laextensión de procesos son proteínas de membrana que compartirían una estructura queincluye dos loops extracelulares que podrían interactuar con ligandos externos. Estahipótesis se encuentra sustentada por la evidencia experimental que la incubación conanticuerpos anti M6a interfiere con la extensión de neuritas en cultivos neuronales(Lagenaur et al. 1992). Las proteínas proteolipídicas también podrían interactuar con otrasproteínas de membrana. En este sentido, se ha descripto que PLP/DM20 forma un complejocon integrinas en oligodendrocitos (Gudz et al. 2002). Además, se ha comprobado lainteracción de M6a con el receptor de opioides y se sugirió un rol para esta glicoproteínaen la regulación de la endocitosis y el tránsito intracelular de receptores acoplados aproteína G (Wu et al. 2007; Liang et al. 2008). En nuestro laboratorio, actualmente se estátrabajando en la identificación de proteínas que interactúan con M6a, tanto ligandosextracelulares, como proteínas de membrana y proteínas intracelulares.Las proteínas proteolipídicas podrían encontrarse asociadas a microdominios demembrana enriquecidos en lípidos (lipid rafts). De acuerdo con esta hipótesis, se haobservado la interacción de PLP/DM20 con membranas ricas en colesterol (Simons et al.2000). Los lipid rafts han sido asociados con el transporte intracelular de membranas y latraducción de señales (Simons et al. 1997; Simons et al. 2000). En este sentido, DM20 ha66

Discusiónsido involucrada en el transporte intracelular de distintas moléculas (Nadon et al. 1998) y laexpresión aberrante de PLP perturba la distribución celular del colesterol (Simons et al.2002), lo que ha sido asociado con una interferencia en el tráfico intracelular de proteínas(Butchbach et al. 2004). La presencia de M6a en fracciones de membranas ricas en lípidostipo lipid rafts está siendo actualmente evaluada en nuestro laboratorio.Se ha sugerido que M6a podría actuar como un canal de calcio (Mukobata et al.2002). En concordancia, alteraciones en la concentración de calcio intracelular han sidoinvolucradas en la regulación de la extensión de neuritas y en la actividad de filopodios y/oespinas (Lau et al. 1999; Nikonenko et al. 2002). Sin embargo, en la actualidad no existenevidencias suficientes para considerar que M6a sería un canal de calcio.Los procesos de formación y crecimiento de neuritas, filopodios y espinas, seencuentran gobernados por interacciones de adhesión celular y por las fuerzas resultantesde la polimerización del citoesqueleto de actina (Luo 2002). Se ha demostrado que proteínasinvolucradas en la estructura y dinámica de la actina pueden afectar la morfología de lasdendritas, el crecimiento de espinas y el establecimiento de sinapsis (Nakayama et al. 2000;Zhang et al. 2001; Penzes et al. 2003; Zito et al. 2004). Si bien los estudios realizados en estatesis muestran que M6a no interacciona directamente con los microfilamentos de actina, yaque la disrupción de los mismos no altera la localización de la proteína (figura 15), M6apodría estar interactuando con otras proteínas involucradas en la regulación delcitoesqueleto de actina. La familia de proteínas Rho GTPasas constituye una vía deseñalización asociada a la regulación del citoesqueleto de actina en diversos tipos celulares,incluyendo fibroblastos, células epiteliales y endoteliales, líneas neuronales y neuronas tantode animales vertebrados como de invertebrados (Hall 1998; Luo 2002). En este sentido, lasGTPasas pequeñas RhoA, Rac1 y Cdc42 han sido frecuentemente asociadas a la formación defilopodios y espinas (Luo 2000; Nakayama et al. 2000). Nuestros resultados indicarían que laformación de filopodios inducida por M6a no estaría mediada por ninguna de estas tresGTPasas pequeñas. Sin embargo, M6a podría estar actuando a través de otros miembros dela familia recientemente identificados, como Rif, RhoD, TC10 y Wrch1, que también han sidoinvolucrados en la remodelación del citoesqueleto de actina (Ridley 2006).Con el fin de identificar aminoácidos clave de la glicoproteína M6a en la formación defilopodios, nuestro laboratorio ha realizado un análisis de diversas mutantes de estaproteína. En primer lugar, se mutaron los posibles sitios intracelulares de fosforilación,construyéndose tanto mutantes simples para cada sitio, así como una mutante múltiple en67

Discusióndonde todos los posibles sitios de fosforilación en los extremos amino y carboxilo terminaleshan sido sustituidos. La sobreexpresión de todas estas mutantes de fosforilación, queconservan su localización en la membrana plasmática, induce la formación de filopodios deun modo similar a M6a wild type, tanto en cultivos primarios de neuronas de hipocampocomo en células N2a (Recúpero, M. resultados de nuestro laboratorio no publicados). Sinembargo, el análisis de cultivos de neuronas hipocampales vivos por microscopía de timelapse ha revelado que la motilidad de los filopodios inducidos por la mutante múltiple en lossitios intracelulares de fosforilación, es menor que la de las protrusiones promovidas por lasobreexpresión de M6a wild type (Brocco, M. resultados de nuestro laboratorio nopublicados). La motilidad de los filopodios y/o espinas es clave para la plasticidad sinápticaya que ha sido asociada con la formación de nuevas sinapsis (sinaptogénesis) y con elremodelado de conexiones sinápticas preexistentes (Dunaevsky et al. 2003). Estudios defosfoproteómica de sinaptosomas de corteza cerebral humana, comprobaron que M6a seencuentra fosforilada en el residuo S267 ubicado en el extremo carboxilo terminal(DeGiorgis et al. 2005). Según programas de predicción, este residuo sería un sitio defosforilación para PKC. En concordancia, los sitios intracelulares de fosforilación para PKChan sido propuestos como parte de un sistema de regulación para la función de M6a, ya queel tratamiento de células PC12 con inhibidores de la PKC anula el efecto de esta proteína enel incremento de calcio intracelular inducido por NGF (Mukobata et al. 2002).Con el objeto de evaluar si la glicosilación de M6a mediaría los efectos en lainducción de filopodios, se mutaron dos posibles sitios de N-glicosilación que se encuentranlocalizados en el loop extracelular mayor. Estudios preliminares en cultivos de neuronas dehipocampo y cultivos de células N2a muestran que la sobreexpresión de esta doble mutanteinduce la formación de filopodios en niveles comparables a M6a wild type. Resultadossimilares fueron obtenidos al mutar los residuos de cisteína presentes en el loop extracelularmenor. Estos sitios podrían resultar clave para el establecimiento de puentes disulfuro, loque podría ser necesario para el correcto plegamiento y función de la proteína. Sin embargo,los primeros ensayos con estas proteínas revelan que estas mutantes mantienen sulocalización celular, son reconocidas por el anticuerpo anti M6a e inducirían la formación defilopodios en forma semejante a M6a wild type. Por otro lado, la mutante M6a C164A,modificada en el loop extracelular mayor, presenta un cambio en la localización de laproteína, que queda retenida en el retículo, probablemente por una alteración en elplegamiento de la misma. Resulta interesante destacar que la mutación de dos cisteínas68

Discusiónpresentes en el loop extracelular mayor (M6a C174A C192A) da como resultado una proteínaque se localiza en la membrana plasmática pero que no es reconocida por el anticuerpo antiM6a. Esta mutante es incapaz de aumentar la densidad de filopodios en neuronashipocampales y en cultivos de N2a, sugiriendo un rol clave para la conformación del loopextracelular mayor en la formación de filopodios (Fuchsova, B. resultados de nuestrolaboratorio no publicados).Como se describió en este trabajo, las mutantes en los posibles sitios depalmitoilación y fosforilación extracelulares conservan su localización celular y la capacidadde inducir la formación de filopodios, indicando que estas modificaciones posttraduccionales no serían necesarias para esta función de M6a. Sin embargo, no se descartala relevancia de estas modificaciones para otras funciones tales como la motilidad de lasprotrusiones inducidas, como ha sido demostrado para la mutante en los sitios defosforilación intracelulares (Brocco, M. resultados de nuestro laboratorio no publicados), uotras propiedades aún no descriptas para M6a.Si bien representa un tema de activa investigación en nuestro laboratorio, elmecanismo por el cual las proteínas proteolipídicas inducen la formación de filopodios, noha sido aún esclarecido. El entendimiento de los procesos involucrados en la formación defilopodios por estas proteínas, sería importante, no sólo para comprender el funcionamientode las mismas, sino que también podría contribuir en la identificación de mecanismosmoleculares responsables de las alteraciones plásticas observadas en el hipocampo deanimales estresados y en la acción de drogas antidepresivas.4.4 M6a y la acción terapéutica de los antidepresivosA pesar de investigaciones realizadas durante décadas, los mecanismos que subyacenla acción terapéutica de los antidepresivos no han sido acabadamente dilucidados. Alidentificarse el mecanismo de acción agudo de los antidepresivos sobre la actividad de losneurotransmisores monoamínicos, se elaboró la teoría monoamínica de la depresión. Segúnesta teoría, la depresión es causada por una disfunción en las sinapsis serotoninérgicas ynoradrenérgicas (Owens 2004). Sin embargo, las drogas antidepresivas deben sersuministradas por períodos superiores a dos semanas para obtener resultados, lo que indicaque un aumento en la transmisión de sinapsis que involucran neurotransmisoresmonoamínicos per se no sería el único mecanismo por el cual estas drogas ejercen susefectos terapéuticos.69

DiscusiónEn los últimos años, se han formulado varias nuevas hipótesis acerca de la acciónterapéutica de las drogas antidepresivas que no resultan mutuamente excluyentes. Unahipótesis propuesta por Florian Holsboer y sus colaboradores establece la disrupción del ejeHPA como causa de la depresión y atribuye la acción terapéutica de los antidepresivos a lanormalización de dicho sistema (Holsboer et al. 1996; Holsboer 2000). Otros investigadoresproponen que la depresión podría estar relacionada a alteraciones en la plasticidadneuronal, que resulta revertida por el tratamiento con antidepresivos (Manji et al. 2001;Fuchs et al. 2004). La neurogénesis, un caso particular de plasticidad neuronal, ha sidoinvolucrada en la etiología de la depresión y en el mecanismo de acción de losantidepresivos en distintas publicaciones (Jacobs et al. 2000; Santarelli et al. 2003). Lahipótesis neurotrófica de la depresión y la acción de los antidepresivos sostiene que lasalteraciones neuroplásticas podrían ser consecuencia de una expresión diferencial deneurotrofinas (Duman et al. 1997; Duman 2004). Las nuevas hipótesis, que involucran laremodelación estructural, explicarían el retardo en la acción de los antidepresivos.Los resultados del presente trabajo concuerdan con las hipótesis que establecen a laplasticidad neuronal como base de la acción terapéutica de los antidepresivos. Enconcordancia, se ha demostrado que la proteína M6a, cuyos niveles de expresión seencuentra regulado por la administración de distintas drogas antidepresivas (Alfonso et al.2004; Alfonso et al. 2006), está involucrada en plasticidad neuronal ya que promueve laextensión de neuritas y la formación de filopodios/espinas (Alfonso et al. 2005). Resultaimportante destacar que las hipótesis que involucran a la plasticidad neuronal en la etiologíade la depresión y en la acción terapéutica de las drogas antidepresivas se basan encorrelaciones observadas entre individuos con depresión y/o tratamiento con antidepresivosy remodelación neuronal. Sin embargo, todavía se desconoce si las alteracionesestructurales son la causa, la consecuencia o simplemente correlacionan con los estados dedepresión y la acción de los antidepresivos.4.5 Polimorfismo en el gen GPM6A asociado a síntomas de depresiónLa depresión presenta en su etiología tanto factores ambientales como genéticos(Fava et al. 2000; Lesch 2004). Entre los determinantes ambientales, se destaca la exposicióna situaciones de estrés (Kessler 1997; Kendler et al. 1999; Paykel 2001). Las bases genéticasde la enfermedad aún constituyen un interrogante. Esto probablemente responda a laexistencia de un gran número de genes implicados, donde cada uno aporta un pequeño70

Discusióncomponente para el desarrollo de la patología (Burmeister 1999). Además, la participaciónde un factor ambiental, dificulta aún más la identificación del componente hereditario.Estudios de resonancia magnética han revelado una reducción selectiva del volumen delhipocampo en pacientes con depresión (Sheline et al. 1999; Bremner et al. 2000; Mervaalaet al. 2000; MacQueen et al. 2003; Sheline et al. 2003). La reducción en el volumen de laformación hipocampal podría deberse, en parte, a alteraciones en la morfología celular y laplasticidad neuronal. Por ello, se han investigado alteraciones en genes involucrados en elcrecimiento de neuritas y en plasticidad sináptica en relación a desórdenes depresivos. Así,se han descripto polimorfismos en el gen del receptor de neurotrofinas p75NTR (Kunugi etal. 2004), en el factor de crecimiento neuronal BDNF (Iga et al. 2007; Sarchiapone et al.2008) y en la proteína activadora de RhoGTPasa GMIP (Tadokoro et al. 2005) asociados a lapatogénesis de la depresión y/o a comportamientos suicidas. También se han examinadopolimorfismos en genes cuya expresión se encuentra modulada por el estrés y eltratamiento con antidepresivos. De este modo, se hallaron polimorfismos asociados a ladepresión en los genes que codifican para el transportador de serotonina 5HTT (Bellivier etal. 1998) y el receptor de glucocorticoides NR3C1 (van West et al. 2006).Dadas las características descriptas en el presente trabajo de tesis para la proteínaM6a y dada la regulación de su expresión por tratamientos de estrés y antidepresivosdescritos en nuestro laboratorio (Alfonso et al. 2004; Alfonso et al. 2006), el gen que codificapara la proteína M6a (GPM6A) representa un candidato a tener en cuenta en estudiosasociados a la depresión. De hecho, una publicación reveló la asociación entre unpolimorfismo en el segundo intrón del gen GPM6A y síntomas depresivos dentro de ungrupo de pacientes diagnosticados con esquizofrenia (Boks et al. 2007). De este modo seestableció, por primera vez, un vínculo de relevancia clínica entre M6a y los síntomas de ladepresión que ya había sido sugerido en nuestro laboratorio en base a los resultadosobtenidos durante el presente trabajo de tesis (Alfonso et al. 2005). El polimorfismoencontrado en los pacientes esquizofrénicos con síntomas de depresión podría alterar laexpresión y/o la función de la proteína. Sin embargo, esto aún no ha sido estudiado. En estatesis, se inició un estudio de polimorfismos en el gen GPM6A a partir de muestras de ADNgenómico de pacientes diagnosticados con depresión. En estas muestras se han encontradotres polimorfismos (incluyendo al descripto por Boks et al., 2007 en pacientes conesquizofrenia) cuya frecuencia genotípica y alélica difiere de la descripta en bases de datos(figura 29). Para determinar si realmente existe una asociación entre alguno de estos71

Discusiónpolimorfismos y la depresión, habría que estudiar la frecuencia genotípica y alélica de losmismos en una población control adecuada y, probablemente, en una muestra más ampliade pacientes con depresión.72

Conclusiones generales5. CONCLUSIONES GENERALESEl objetivo de este trabajo de tesis se centró en la caracterización funcional de laproteína M6a, cuya expresión en el hipocampo se encuentra modulada por la exposición alestrés crónico y la administración de drogas antidepresivas (Alfonso et al. 2004; Alfonso etal. 2006), así como en el estudio de M6b y PLP/DM20, otros miembros de la familia de lasPLPs a la cual M6a pertenece, de modo tal de contribuir al establecimiento de las basesmoleculares del estrés. Se ha demostrado que el estrés crónico produce alteracionesestructurales en el hipocampo que pueden ser revertidas por el tratamiento conantidepresivos. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen las modificacionesneuroplásticas y la acción de las drogas antidepresivas no han sido aún dilucidados. Lacomprensión de estos procesos podría resultar clave para el entendimiento y el tratamientode enfermedades relacionadas al estrés tales como la depresión.Las conclusiones del presente trabajo son:• Similar a lo descripto para M6a, la expresión de M6b y DM20 también se encuentrareducida en el hipocampo de animales sometidos a estrés crónico.• La proteína M6a juega un rol clave en la extensión de neuritas, la formación defilopodios/espinas, y muy probablemente en el establecimiento de sinapsis.• M6b y DM20 también inducen la formación de filopodios.• La expresión diferencial de las glicoproteínas de membrana M6a y M6b podría contribuira las alteraciones plásticas encontradas en el hipocampo de animales estresadoscrónicamente.En base a los resultados obtenidos, las proteínas proteolipídicas podrían estarinvolucradas en enfermedades relacionadas al estrés. Es por eso que iniciamos el estudio dela existencia de polimorfismos asociados a la depresión en el gen GPM6A. Como conclusión,creemos que las proteínas proteolipídicas deberían ser consideradas en trastornosrelacionados al estrés como la depresión.73

Perspectivas futuras6. PERSPECTIVAS FUTURASEn el presente trabajo se ha descripto un rol para las proteínas proteolipídicas en laplasticidad neuronal y se ha sugerido una relación entre estas proteínas y enfermedadesrelacionadas al estrés crónico tales como la depresión. El mecanismo de acción mediante elcual estas proteínas producen los efectos observados representa actualmente un tema deactiva investigación en nuestro laboratorio. Por un lado, se están realizando estudiosfuncionales con distintas mutantes de M6a de forma tal de identificar aminoácidos clavepara la función de M6a en la formación de filopodios. Además, mediante ensayos deinmunoprecipitación, se intenta identificar ligandos externos y/o internos de M6a de formatal de establecer efectores de la formación de filopodios/espinas y las vías de traducción deseñales involucradas en la función de esta proteína. Por otra parte, se está evaluando lapresencia de M6a en microdominios de membranas ricos en lípidos (lipid rafts), lo quepodría ser útil en la identificación de los mecanismos moleculares involucrados en la funciónde M6a. Asimismo, se está caracterizando más detalladamente las protrusiones inducidaspor M6a, analizando su estabilidad y su rol en la formación de sinapsis.En base a los resultados obtenidos nos resulta interesante estudiar la función de M6ay M6b in vivo. Actualmente se está evaluando la capacidad de estas proteínas de inducir laformación de filopodios y/o espinas en el cerebro de ratón mediante la inyección en elhipocampo de partículas virales que median la sobreexpresión de M6a y M6b. Además, seestán estudiando alteraciones fenotípicas y comportamentales en una línea hipomórficapara M6 (ortólogo a M6a) de Drosophila melanogster.Para evaluar la importancia de las proteínas proteolipídicas en el comportamiento demamíferos sería muy útil estudiar ratones con niveles de expresión nulos o reducidos (knockout y/o knock down) de M6a y/o M6b. Dado el rol descripto para estas proteínas en laformación de filopodios/espinas, se podrían realizar ensayos de memoria y/o aprendizaje, yaque sea ha descripto que la plasticidad neuronal es vital para estos procesos. También, dadala relación encontrada entre el estrés y la expresión de estas proteínas, sería relevanterealizar estudios de ansiedad y anhedonia, tanto en ratones que subexpresen como enratones que sobreexpresen M6a y/o M6b en el hipocampo. Por último, sería interesanteestudiar el efecto del estrés crónico en animales que expresen altos niveles de M6a y/oM6b.74

Perspectivas futurasLa expresión de M6a, M6b y DM20 se encuentra reducida en el hipocampo deanimales sometidos a estrés crónico. Los factores que regulan la expresión de estos genestodavía son deconocidos. Sería relevante conocer los mecanismos involucrados en laregulación de la expresión de estos genes. Es por ello que en nuestro laboratorio se haniniciado estudios con el fin de identificar la región promotora del gen GPM6A y los factoresde transcripción que regulan su expresión.Finalmente, sería importante continuar con los estudios de polimorfismos en losgenes que codifican para las proteínas protelipídicas en individuos con depresión. De estaforma, se podría confirmar la existencia de una asociación entre estas proteínas y ladepresión.75

Materiales y métodos7. MATERIALES Y MÉTODOS7.1 Cultivos celularesCultivos primarios de neuronas de hipocampoHipocampos de embriones de ratas Wistar, criadas en la Facultad de Veterinaria yAgronomía de la Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina, de 18-19 días degestación fueron removidos quirúrgicamente e incubados en solución de Hank’s con 0,25 %tripsina por 15 minutos a 37 o C. Los tejidos fueron luego disociados a través de pasajes porpipetas Pasteur afinadas, en MEM o Advanced MEM con 2 mM glutamina, 10 M piruvatode sodio, 100 U/ml penicilina y 100 g/ml estreptomicina (MEM 1X), con el agregado de 10% (v/v) suero equino. Las células fueron plaqueadas en cubreobjetos de vidrio previamenteincubados con 0,1 mg/ml poli-L-lisina hidrobromuro (Sigma, St.Louis, MO) y 20 g/llaminina (Gibco, Carlsbad, CA) a densidades de 20.000-50.000 células/cm 2 . Luego de 2-4 hslos medios fueron cambiados a MEM/N2 (MEM 1X con 1 g/l ovoalbúmina y suplemento B27de Gibco).Líneas celularesLas líneas N2a y COS-7 se cultivaron en D-MEM con 10 % (v/v) suero fetal bovino,penicilina y estreptomicina. Para las células PC12, el medio indicado fue suplementado con 5% suero de caballo y las células fueron mantenidas en placas tratadas con poli-L-lisina. Losmedios fueron cambiados cada 2-4 días. Para los ensayos de cuantificación del porcentaje decélulas con filopodios, se utilizó 20 % (v/v) de suero fetal bovino para evitar la diferenciaciónde las células.7.2 Ensayos de inmunocitoquímicaLas células fueron fijadas con PFA al 4 %, sacarosa al 4 % en PBS a temperaturaambiente durante 20 minutos y luego permeabilizadas con 0,1 % Triton X-100 en PBS por 2min. Los cultivos fueron bloqueados en 3 % BSA en PBS durante por lo menos 1 hora atemperatura ambiente seguido de la incubación con el anticuerpo primario en 3 % BSA enPBS a 4 o C por 14-16 hs y la subsiguiente incubación con el anticuerpo secundario (previolavado con PBS) a 37 o C por 1 hora. Los preparados fueron lavados con PBS y agua ymontados en portaobjetos con FluorSave Reagent (Calbiochem, San Diego, CA).76

Materiales y métodosLos anticuerpos primarios utilizados fueron: anti M6a IgG de rata monoclonal 1/250(Medical & Biological Laboratories Co., Ltd, Japan), faloidina conjugada a rodamina 1/1000(Molecular Probes) anti -tubulina IgG de ratón monoclonal 1/2000 (Sigma, St Louis, MO),suero de conejo anti sinaptofisina 1/500 (Synaptic Systems, Gottingen, Germany), suero deconejo anti espinofilina 1/500 (US Biological, MA, USA), anti-MAP2 IgG de ratón monoclonal1/200 (Sigma) y anti Tau-1 IgG de ratón monoclonal 1/500 (provisto gentilmente por L.I.Binder). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: anti IgG ratón conjugado a AlexaFluor 488 1/1000 (Molecular Probes, Eugene, OR) o a rodamina 1/2000 (Pierce, USA), antiIgG conejo conjugado a Alexa Fluor 350 1/200, a Alexa Fluor 488 1/1000 o a Alexa Fluor 5941/300 (Molecular Probes).7.3 Ensayos de despolimerización de la F-actina, marcación de las membranas celulares eidentificación de las células viablesPara desestabilizar el citoesqueleto de actina, los cultivos primarios de neuronasfueron tratados con 2,5 M latrunculina A (Sigma) durante 18 hs, y los cultivos de N2a concitocalasina D 5 M durante 5 hs. Para visualizar las membranas, las neuronas fuerontratadas con el colorante lipofílico DiI: perclorato de 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetrametilendocarbocianina DiOC18 (Molecular Probes) 1/1000 en PBS a 37 o C por 5minutos, luego lavadas en PBS, fijadas y montadas. Para identificar las células viables, loscultivos se incubaron en una solución del colorante Trypan-Blue en PBS durante 3 minutos yse contaron las células teñidas de azul y no teñidas en campos seleccionados al azar hasta 5minutos después de la tinción.7.4 Construcción de los plásmidos utilizados en las transfeccionesPara la expresión de proteínas fusionadas a GFP se utilizó el plásmido de expresióneucariota pEGFP-C1 (Clontech). Para la construcción GFP::M6a, se realizó la amplificación dela región codificante del gen M6a (desde el primer codón ATG hasta el codón stop, en total834 pb) utilizando como templado ADNc de hipocampo de ratón y oligonucleótidos 5’ y 3’con el agregado de secuencias para las enzimas de restricción Apa I y Kpn I, respectivamente.El fragmento M6a amplificado se insertó en fase en los sitios Apa I – Kpn I presentes en elsitio de clonado del vector (en la zona 3’ de la secuencia que codifica para la GFP).Para las construcciones GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD, GFP::M6b TMD,GFP::M6b TMD y GFP::M6b se diseñaron oligonucleótidos 5’ y 3’ que amplificaban la77

Materiales y métodosregión codificante de las distintas isoformas con el agregado de secuencias para las enzimasde restricción Xho I y Bam HI, respectivamente. Los fragmentos amplificados fueroninsertados en fase en los sitios Xho I y Bam HI presentes en el sitio de clonado del vector.Para las construcciones GFP::PLP y GFP::DM20, las regiones codificantes fueron amplificadascon oligonucleótidos 5’ y 3’ que amplificaban la región codificante de las distintas isoformascon el agregado de secuencias para las enzimas de restricción Xho I y Eco RI,respectivamente y clonadas en esos sitios presentes en el sitio de clonado del vector. Lasiguiente tabla muestra los oligonucleótidos utilizados.NombreSecuenciaM6a 5´ Kpn I 5´ GGT ACC ATG GAA GAG AAT ATG GAA GAA GGA 3´M6a 3´ Apa I 5´ GGG CCC TTA TGT GTA TGC ATT GAG CCG 3´M6b 5´ Xho I 5´CTC GAG CCA TGG GTT GCT TCG AAT GCT 3´M6b 5´ Xho I 5´CTC GAG GTA TGA AGC CAG CCA TGG AAA C 3´M6b 3´ Bam HI 5´ GGA TCC TTA AGT GTA AGA ATT GAG TTG TTC T 3´M6b 3´ Bam HI 5´ GGA TCC TTA GAA CTT AGT GCA GCA GTC TT 3´M6b 3´ Bam HI 5´ GGA TCC TTA GCA GTC CCA TCT TCC CA 3´PLP/DM20 5´ Xho I 5´GTC TCG AGC TAT GGG CTT GTT AGA GTG TTG 3´PLP/DM20 3´ Eco RI 5´ ACG AAT TCT CAG AAC TTG GTG CCT CG 3´Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de las secuencias de interés y su clonado comoproteína de fusión a GFP. Subrayadas se muestran las secuencias blanco de las enzimas de restricción. En itálicase indican los tripletes correspondientes a los codones que codifican para las metioninas iniciales y los codonesde terminación de la traducción.Para la construcción VSVG::GFP, el ADNc de VSVG (gentilmente provisto por el DrMaccioni, Universidad de Córdoba, Argentina) fue clonado en fase en los sitios Eco RI/BamHI presentes en el sitio de clonado del vector pEGFP-N1 (Clontech).Para la expresión de proteínas de forma independiente a GFP, se utilizó el vectorpEGFP-IRES2 (Clontech). Para la construcción GFP+M6a, la región codificante para la M6apreviamente clonada en el vector pGEMT-easy, fue obtenida a partir de la digestión de lossitios EcoRI del vector y se insertó en los sitios Eco RI del vector. Para las construccionesGFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD, GFP+M6b TMD y GFP+M6b TMD, las secuenciaspreviamente clonada en el vector pEGFP-C1 fueron digeridas con la enzimas Xho I y Bam HI yclonadas en esos mismos sitios presentes en el sitio de clonado del vector pEGFP-IRES2.78

Materiales y métodosTodas las secuencias fueron confirmadas por secuenciación automática antes de realizar lastransfecciones.Para la construcción de las distintas mutantes de M6a en los posibles sitios depalmitoilación y fosforilación se utilizó la siguiente estrategia: se diseñó un oligonucleótidosentido de aproximadamente 30 pb que incluía la secuencia que se deseaba mutarflanqueada por aproximadamente 15 pb en cada extremo. Además, se diseñó unoligonucleótido antisentido también de 30 pb complementario al oligonucleótido sentido apartir de la primera base río arriba de la mutación, de modo tal que este oligonucleótido nocontiene la mutación ni hibrida con esa parte de la secuencia. Estos oligonucleótidos sonutilizados en una PCR en donde se emplea como templado el plásmido con la secuencia quese desea mutar. Durante la PCR, se amplifica todo el plásmido. El producto de PCR es luegotratado con la enzima de restricción Dpn I que sólo digiere secuencias metiladas. Por lotanto, el templado de la PCR que, al provenir de un cultivo bacteriano, se encuentrametilado es digerido mientras que el producto de PCR con la mutación deseada, al noencontrarse metilado, no es degradado por la incubación con Dpn I. El producto de PCR,luego de tratado con Dpn I, es utilizado para transformar bacterias. Una vez obtenidas lascolonias, se purifica el ADN plasmídico y se confirma la presencia de la mutación deseadapor secuenciación. La tabla a continuación muestra los oligonucleótidos utilizados.NombreSecuenciaM6A C14S F 5´ AAGGACAGACACAGAAAGGGAGCTTCGAGTGCTGCATTA 3´M6a C14S R 5´ CCCTTTCTGTGTCTGTCCTTCTTCCATATT 3´M6a C17S C18S F 5´ CAGAAAGGGTGCTTCGAGAGCAGCATTAAATGCCTGGGAG 3´M6a C17S C18S R 5´ CTCGAAGCACCCTTTCTGTGTCTGTCCTTC 3´M6a C21S F 5´ GCTTCGAGTGCTGCATTAAAAGCCTGGGAGGTATTCCCT 3´M6a C21S R 5´ TTTAATGCAGCACTCGAAGCACCCTTTCTG 3´M6a C122S F 5´ GACTTCAAAATCACCACCAGTGGCAGATGTGTGAGC 3´M6a C122S R 5´ GGTGGTGATTTTGAAGTCTCCATAGAGAT 3´M6a C125S F 5´ AAATCACCACCTGTGGCAGAAGTGTGAGCGCTTGGTT 3´M6a C125S R 5´ TCTGCCACAGGTGGTGATTTTGAAGTCTC 3´M6a C246S F 5´ TGGGCCTATGTGAAAGATGCCAGCCGCATGCAGAAGTAC 3´M6a C246S R 5´ GGCATCTTTCACATAGGCCCAGTTGGCAGAC 3´M6a T60A F 5´ TGGAACAGTCAACATTCTGCAGGCCTACTTTGAGTTGGCAAG 3´M6a T60A R 5´ CTGCAGAATGTTGACTGTTCCAGAAAGGGCTTC 3´M6a T67A F 5´ CTACTTTGAGTTGGCAAGGGCTGCTGGAGACACACTGGATG 3´M6a T67A R 5´ CCTTGCCAACTCAAAGTAGGTCTGCAGAATG 3´79

Materiales y métodosM6a T76A F 5´ CTGGAGACACACTGGATGTTTTCGCTATGATTGACATCTTTAAGTATG 3´M6a T76A R 5´ GAAAACATCCAGTGTGTCTCCAGCAGTCCTTGCCAAC 3´M6a T166A F 5´ GACCATCTGCCGGAACACCGCTCTAGTGGAGGGAGCAAATC 3´M6a T166A R 5´ GGTGTTCCGGCAGATGGTCCACACATTGAAATAC 3´Tabla 2. Oligonucleótidos utilizados para la construcción de las distintas mutantes en los posibles sitios depalmitoilación y fosforilación. Subrayadas se muestran las bases que difieren de la secuencia original.7.5 ARN de interferenciaLos ARN doble cadena de 21 pb para M6a fueron sintetizados y adquiridos en laempresa Dharmacon (CO, USA). El diseño y la elección de la secuencia se realizaronmediante el programa ofrecido por el fabricante (www.dharmacon.com). Las secuenciasutilizadas fueron: 5’-AAG GAU GUG UGA AUC UAC UGA-3’ para M6a siRNA1 y 5'-AAC GGCUGC UUU CUU UGU CUA-3' para M6a siRNA2. Estas secuencias no poseen homología conningún otro ARNm conocido. Los siRNA control correspondieron a una mezcla de ARN doblecadena de 21 pb de secuencia homóloga a la región codificante de la GFP.7.6 Transfección de los plásmidos y el ARN de interferenciaPara las transfecciones celulares se usó el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen),siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizaron 2-3 g de ADN plasmídico o 40 pmolde siRNA, mezclados con 1 ó 2 l de Lipofectamina, para neuronas o líneas celulares,respectivamente, para cada pocillo de 2 cm 2 de superficie (placas de 24 pocillos). Para lasplacas de 10 cm de diámetro, utilizadas para los ensayos de activación de Rho GTPasas, seusaron 40 g de ADN plasmídico y 60 l de lipofectamina. Para los pocillos de 10 cm 2 desuperficie (placas de 6 pocillos) utilizadas para la cuantificación de ARNm de M6a en cultivostratados con siRNA, se utilizaron 200 pmol de siRNA y 5 l de lipofectamina. Las células seincubaron con las mezclas de transfección durante 4-6 hs y luego se cambió el medio decultivo.7.7 Cuantificación de células, procesos neuronales y puntos de sinaptofisinaPara calcular el número de neuritas primarias por célula, se cuantificaron lasestructuras marcadas con anticuerpos anti -tubulina. Se contaron entre 40 y 50 células porgrupo (transfectadas con GFP::M6a o GFP), provenientes de tres experimentos80

Materiales y métodosindependientes. Se calcularon las medias para el total de células y las diferencias fueronanalizadas estadísticamente por el test no paramétrico Mann Whitney U-test, de 2 colas.En los ensayos con M6a, la densidad de filopodios/espinas (el número deprotrusiones teñidas con el marcador de membrana DiI en fragmentos de 20 m de largo deneurita, seleccionados dentro de los 50 m desde el soma) se cuantificó en 65-70 procesosde diferentes neuronas por grupo, provenientes de tres experimentos independientes o en75-95 neuronas por grupo, de dos experimentos, en el caso de la sobreexpresión o lainterferencia, respectivamente. El número de puntos positivos para la marcación con elanticuerpo contra sinaptofisina, se cuantificó en fragmentos 20 m de neuritas, tomadosdesde el cuerpo celular. Se contaron 55-66 neuronas por grupo, provenientes de dosexperimentos independientes. En todos los casos, se calcularon las medias para el total deneuritas examinadas y las diferencias fueron analizadas estadísticamente por el test noparamétrico Mann Whitney U-test, de 2 colas.En el caso de las líneas celulares, en los ensayos con GFP::M6a se clasificaron 200,110 ó 130 células por grupo, de múltiples experimentos, para PC12, N2a o COS7,respectivamente. Las células fueron clasificadas de acuerdo a la presencia o ausencia defilopodios determinados por la tinción con faloidina y se calculó el porcentaje de células confilopodios por grupo. Como control se utilizaron células sin transfectar del mismo preparado.Se calcularon las medias de los porcentajes obtenidos en al menos tres preparados deexperimentos independientes y las diferencias estadísticas se analizaron con la prueba T deStudent. En los ensayos con GFP+M6a, se calcularon las medias de dos experimentosindependientes y las diferencias estadísticas se analizaron con la prueba T de Student.En los ensayos en los que se utilizaron las distintas mutantes de M6a, al emplearsecultivos de la línea celular N2a, se clasificaron al menos 40 células transfectadas y 40 célulassin transfectar en cada preparado en cuanto a si tenían o no filopodios, tal como lo revelabala tinción con faloidina. Se calcularon las medias de los porcentajes obtenidos en un mínimode 7 preparados de al menos 2 experimentos independientes y las diferencias estadísticas seanalizaron con la prueba T de Student. En los cultivos primarios de neuronas de hipocampo,se cuantificó el número de protrusiones en 20 m de largo de al menos 60 neuritas porgrupo. Se calcularon las medias para el total de neuritas analizadas y las diferencias fueronanalizadas estadísticamente por ANOVA de un factor seguido por la prueba de Dunnet paraefectos post hoc versus el control negativo GFP y versus M6a wild type.81

Materiales y métodosEn los ensayos con M6b, PLP y DM20, la densidad de filopodios/espinas (el númerode protrusiones en fragmentos de 20 m de largo de neurita) se cuantificó en al menos 80procesos de diferentes neuronas por grupo. Se calcularon las medias para el total deneuritas analizadas y las diferencias fueron analizadas estadísticamente por ANOVA de unfactor seguido por la prueba de Dunnet para efectos post hoc versus el control negativo GFPy versus M6a.Finalmente, en los ensayos con M6b y DM20 en las líneas N2a y COS7, se calculó elporcentaje de células con filopodios en al menos 40 células transfectadas y 40 células sintransfectar por preparado. Las medias de los porcentajes obtenidos en un mínimo de 6preparados de al menos 2 experimentos independientes y las diferencias estadísticas versusel control sin transfectar se analizaron con la prueba T de Student. También se comparó elincremento en el porcentaje de células con filopodios entre las células transfectadas conM6a, M6b y DM20.Todos los cálculos estadísticos se realizaron con el programa Analyse-it® de MicrosoftExcel.7.8 Ensayos de activación de GTPasasPor cada ensayo, 3 x 10 6 células N2a o COS-7 fueron plaqueadas en tres placas decultivo de 10 cm de diámetro, un día antes de la transfección. A las 24 hs de la transfección,se observó la eficiencia de transfección a través de la detección de fluorescencia. Los cultivosdonde por lo menos el 40% de las células mostraban señal fluorescente fueron utilizadospara los ensayos de purificación y detección de Cdc42, Rac1 o RhoA activas. Siguiendo lasinstrucciones del fabricante (Cytoskeleton Inc., CO, USA), las células fueron lisadas en elbuffer de lisis provisto, y centrifugadas 5 minutos a 8000 rpm a 4 o C. Las concentracionesproteicas de los sobrenadantes fueron cuantificadas con el reactivo de Bradford y cantidadessimilares de proteína total (entre 5 y 8 mg) para cada muestra, fueron incubadas por unahora a 4 o C en constante agitación con esferas de agarosa GST-PBD PAK (para cdc42 y Rac1)o RBD Rhotekin (para RhoA). Luego de la incubación, las esferas de agarosa fueron lavadas 3veces con el buffer de lavado y resuspendidas en buffer de Laemmli. Las proteínaspurificadas fueron ensayadas por Western blot con los anticuerpos comerciales primariosanti-Cdc42 en oveja 1/200, anti Rac1 en conejo 1/250 o anti-RhoA en ratón 1/250(Cytoskeleton) y secundarios anti IgG de oveja 1/5000 (Cytoskeleton), anti IgG de conejo1/8000 (Sigma) y anti IgG de ratón 1/8000 (Sigma) conjugados a peroxidasa. Como control82

Materiales y métodosde carga, los extractos totales fueron ensayados por Western blot con el anticuerpo primarioanti -tubulina IgG de ratón monoclonal 1/2000 (Sigma, St Louis, MO) y el anticuerposecundario anti IgG de ratón 1/8000 (Sigma) conjugado a peroxidasa. La detección de laseñal del anticuerpo secundario se llevó a cabo mediante quimioluminiscencia con elsustrato Super Signal (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce) yexposición en placas radiográficas (Kodak).7.9 Tratamiento de estrésSe utilizaron ratones machos de la cepa C57BL/6 de entre 2 y 3 meses de edadcriados en el Instituto de Investigaciones Biotecnológicas de la Universidad de San Martín(IIB-UNSAM), San Martín, Argentina. Los animales fueron mantenidos en grupo dentro de lasmismas jaulas, en habitaciones con temperatura controlada, ciclos de luz/oscuridad de 12horas y acceso libre al alimento y agua. Cada animal fue pesado antes y después de lostratamientos. Luego de 7 días sin tratamiento, los animales fueron inmovilizados 1 vez pordía durante 4 horas (desde las 11 hs hasta las 15 hs) en tubos de plástico ventilados (de 2,8cm de diámetro por 11,5 cm de largo) sin acceso a agua o alimento. El tratamiento de 21días consistió en 6 días de estrés seguido de un día sin estrés, durante 3 semanas. Losanimales control fueron mantenidos en las mismas condiciones que los gruposexperimentales, pero sin recibir ningún tratamiento.7.10 Disección de los hipocampos y extracción del ARN totalLos ratones fueron sacrificados un día después de la última sesión de estrés. Loscerebros fueron extraídos y colocados en hielo para la disección de los hipocampos quefueron congelados inmediatamente y guardados en nitrógeno líquido hasta su utilización.Los tejidos congelados fueron homogeneizados en reactivo de Trizol (Life Technologies, NY,USA) usando un homogeneizador manual. El ARN total fue purificado de los homogenatos deTrizol de acuerdo a las instrucciones del fabricante y almacenado a –70 o C. Para evaluar laintegridad del ARN, 2 l del ARN total fueron separados por electroforesis en gel de agarosaal 1 % con bromuro de etidio para la detección de las bandas correspondientes a lassubunidades pequeña y grande (18S y 28S) de ARN ribosomal, y descartar así sudegradación.83

Materiales y métodos7.11 Purificación del ARN mensajero poli A+ y síntesis del ADN copiaEl ARNm poli A+ fue aislado del ARN total con el kit PolyATract mRNA IsolationSystem (Promega, Madison, USA) implementando el protocolo sugerido por el fabricantepero con cantidades 10 veces menores de ARN total (10 g) y de cada reactivo en todos lospasos. El volumen final de elución del ARNm fue de 25 l, que luego fue guardado a –70 o C.Se utilizaron 4 l de ARNm como templado para la retrotranscripción con la enzimaSuperscript II (InvitrogenTM Life Technologies, NY, USA). Se incubó el ARNm conoligonucleótido poliT a 90 o C por 2 min y luego se conservó en hielo hasta el agregado de lamezcla de reacción seguido de la incubación a 42 o C por 1 hora. Los reactivos y susconcentraciones finales fueron: 1X Buffer de reacción, 10 mM DTT, 0,25 mM dNTPs, 200 Uenzima Superscript II, 50 ng/l Oligo dT. También se realizó un control negativo de latranscripción reversa sin enzima para descartar la presencia de ADN genómico en lasmuestras.7.12 Ensayos de PCR en tiempo realLas reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo en un equipo GeneAmp5700, Sequence Detection System (PE Biosystems) utilizándose el kit comercial SYBR GreenPCR Core Reagents (PE Biosystems). Cada reacción (volumen total 25 ó 12,5 l) se realizóutilizando como templado 4 l de ADNc diluido (diluciones entre 1/20 y 1/30 de la reacciónde transcripción reversa, según el experimento). Los reactivos se usaron en las siguientesconcentraciones finales: 1X SYBR Green Reaction Buffer; 3mM MgCl; 1mM dATP; 1mMdUTP; 1mM dGTP; 1mM dCTP; 0,3 M de cada primer; 0,01 U/ml UNG-Enzyme y 0,025 U/mlTaq Gold DNA Polymerase. Las reacciones se incuban primero a 50 o C por 2 minutos parapermitir la actividad uracil N’-glicosilasa de la UNG-Enzyme que inactiva cualquier templadode ADN que contenga residuos UTP, es decir, los que provienen de previas PCRs usandodUTP en vez de dTTP, y así evitar las contaminaciones por producto final. Luego se continúacon una incubación a 95 o C por 10 minutos, donde se inactiva la UNG-enzyme y se activa lapolimerasa (acoplada a un inhibidor termolábil), y el ciclado se realiza 40 veces a 95 o C por15 segundos (desnaturalización) y 60 o C por 1 minuto (hibridación y extensión de losprimers). Para verificar la amplificación de un producto único de PCR, todas las reacciones seanalizaron con el protocolo de disociación por temperatura luego del ciclo final de la PCR(Ririe et al. 1997).84

Materiales y métodosLos oligonucleótidos utilizados fueron diseñados usando el programa Primer Express1.5 (PE Biosystems). A continuación se muestran las secuencias de los mismos.NombreSecuenciaM6a sentido 5’ AAA TAA TGA TGT AGC CTG ACA AGA AAT TT 3’M6a antisentido 5’ AAT GCA CTT ACA CTG AAG GAG GAA T 3’M6b 3´UTR sentido 5´ AGC AGT GGA GGT GCT GTT AAG AGT 3´M6b 3´UTR antisentido 5´ GGC TTT AGA CAC CGC CTC TTC T 3´PLP/DM20 3´UTR sentido 5´AAT TGT TTA TCT CTT GTT TGG AGT TGT ATC 3´PLP/DM20 3´UTR antisentido 5´AGA ATC ATC CTC CAG GTC TTT CTG 3´PLP sentido 5´ GGC CTG AGC GCA ACG GTA 3´DM20 sentido 5´ GGC CTG AGC GCA ACG TTT G 3´PLP/DM20 antisentido 5´AGG AGC CAT ACA ACA GTC AG 3´M6b exón Ia sentido 5´ TCC CGT CAG TCT CCA ACC A 3´M6b exón Ia antisentido 5´ CCC AGA CAC TTG ATG CAG CA 3´,M6b exón Ib sentido 5´ TAT GGT CGC CTG CTC CTT G 3´M6b exón Ib antisentido 5´ CGC TCT GCC TAC TGG TCC A 3´M6b exón III sentido 5´ AAA TAG ATT CAG GAT GCC ACA CC 3´M6b exón III antisentido 5´ AGT TAG CAG TCC CAT CTT CCC A 3´Ciclofilina sentido 5’ AAG CAT ACA GGT CCT GGC ATC T 3’Ciclofilina antisentido 5’ CAT TCA GTC TTG GCA GTG CAG 3’G6PDH sentido 5’ TGA CCA ATT CCA TAC TCC ATG GT 3’G6PDH antisentido 5’ ATT CTA GCT GCT GTG CTT GCC T 3’Beta-actina sentido 5´ CAA CTT GAT GTA TGA AGG CTT TTG GT 3´Beta-actina antisentido 5´ ACT TTT ATT GGT CTC AAG TCA GTG TAC AG 3´Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados para las mediciones de PCR en tiempo real. G6PDH: glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa.La detección directa de los productos de PCR se monitoreó midiendo el incrementoen la fluorescencia causada por la unión del colorante SYBR Green a ADN doble cadena,como se describió previamente (Wittwer et al. 1997). Todas las cuantificaciones fueronnormalizadas utilizando como gen de referencia a la proteína ciclofilina, obteniéndoseesencialmente los mismos resultados al normalizar con el gen de referencia a la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). Cada experimento de cuantificación de RT-PCR se realizópor duplicado. Las medias de cada grupo fueron comparadas con el test T de Student, de 2colas, para analizar si las diferencias eran significativas estadísticamente con el programaAnalyse-it® para Microsoft Excel. Para la cuantificación de la expresión relativa de distintasisoformas, se utilizó la fórmula descripta por Plaffl (Pfaffl 2001).85

7.13 Análisis de polimorfismos en el gen GPM6A en pacientes con depresiónMateriales y métodosSe utilizaron muestras de ADN genómico de 28 pacientes (19 mujeres y 7 hombres)diagnosticados con distintos tipos de depresión provistas por la Dra. Elena Jazín de laUniversidad de Uppsala, Suecia. Las muestras corresponden a 21 pacientes diagnosticadoscon depresión mayor, 3 pacientes diagnósticos con desorden depresivo tipo NOS (del inglés,Not Otherwise Specified), 2 pacientes con trastorno bipolar de tipo II, 1 paciente condesorden esquizo-afectivo de tipo bipolar y 1 paciente con distimia.Las regiones correspondientes a los exones del gen GPM6A y una región de 300pbque flanquea el polimorfismo rs10520303 presente en el segundo intrón del gen fueronamplificadas por PCR utilizando la enzima Taq DNA polimerasa de Invitrogen®. La tabla acontinuación muestra los oligonucleótidos utilizados y el tamaño de los ampliconesobtenidos.Nombre Secuencia Tamaño del amplicónExón 1 F 5´ATAGGGTTTTTCCTTCCAGT 3´ 1050 pbExón 1 R 5´CCAAGAGAGAAACATTCATT 3´Exon 2 F 5´TTGTATGGTTGACCTGGTAT 3´ 385 pbExón 2 R 5´CCCCTAATCATTTAACACAT 3´Exón 3 F 5´AAAGAATCATGAGCATGTGA 3´ 360 pbExón 3 R 5´AGAAGGAAACGTTACTGTGT 3´Exón 4 F 5´TATAATGGAGCTTTGCAGAT 3´ 309 pbExón 4 R 5´TAGAGGCAGCTATGTAGGTA 3´Exón 5 F 5´AGATAAAATGGAACTTGCTT 3´ 232 pbExón 5 R 5´AATGAATGCTAAAATTCTGA 3´Exón 6 F 5´CTCGCTTTTATTTAAGATGT 3´ 242 pbExón 6 R 5´TCTCTACAAGCAAATAGCTT 3´Exón 7 CDS F 5´CGAAGACTTCTTTCGAGATA 3´ 762 pbExón 7 CDS R 5´TAATATGGCCACTGATCTTC 3´Exón 7 UTR1 F 5´ATGACTCTTGAAATATGGAA 3´ 739 pbExón 7 UTR1 R 5´TTCCTTTGATACAGGTACTT 3´Exón 7 UTR2 F 5´AAGTACCTGTATCAAAGGAA 3´ 832 pbExón 7 UTR2 R 5´CACACATAGGAAAGAGGAAT 3´Intrón 2 rs10520303 F 5´GGATAAGAAGTTGCACACTTC 3´ 300 pbIntrón 2 rs10320303 R 5´CATGTGGGAGCTGGCCTGA 3´Tabla 4. Oligonucleótidos utilizados y tamaño de los amplicones obtenidos en la amplificación de los exones yde una región intrónica conteniendo el polimorfismo rs10520303 del gen GPM6A humano.86

Materiales y métodosLos productos de PCR fueron secuenciados automáticamente con el secuenciador degeles de poliacrilamida ABI 377 y el secuenciador de capilares ABI 3130 de AppliedBiosystem®. Cada producto de PCR fue secuenciado al menos 2 veces, secuenciándose tantola hebra sentido como la antisentido. Los cromatogramas obtenidos fueron luego analizadoscon el programa Sequencher 4.7 de Gene Codes Corpotation para la identificación depolimorfismos.87

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AgradecimientosAGRADECIMIENTOS• A Carlos, por haberme permitido hacer el doctorado en su laboratorio, por habermeguiado pero al mismo tiempo dado libertad para trabajar y por intentar levantarme elánimo cuando las cosas no salían.• A Juan, por haberme recomendado que siguiera este camino y por acompañarmedurante todo el recorrido.• A Juli, quien me ensenó a trabajar en la mesada, pero principalmente por su actitudsiempre positiva.• A Marce quien me acompañió durante todo el doctorado guiándome en todos lossentidos.• A las que ya partieron dejando un vacío en el laboratorio: a Geo por todo lo compartido,a Adri por las charlas y a Vani por lo vivido incluyendo las horas de docencia.• A Paulita, por su companñía hasta tardes horas en el lab.• A Beatus, por compartir conmigo su cultura.• A Cami, por estar siempre dispuesta a dar una mano y por cuidarme.• A Fla, por su preocupacion y buena onda.• A los chicos del lab 3: a Lau y a Gri por las charlas y Ale y Javier por ayudarme cada vezque los hinché con algo.• A Su, Marilén y Adrián, por la buena onda y por los viernes dulces.• A Oscar, por matarme las ratas.• A los Campetella: a Juancito por compartir sus conocimientos cada vez que lo consulté ya Valen, Vir y Romi por la buena onda.• A Fer, por las secuencias, el paddle y las extrañas charlas.• A Carlos Arregui por su buena predisposición siempre que acudí por algún motivo.• A Mariana, por todas las charlas y las horas compartidas en cultivo.• A Mirna, por ayudarme cada vez que le pedí algo y con la major predisposición.• A Ernesto, por su ayuda para conseguir todo el material de trabajo y su buena onda.• A Nelly y a Tere, por llenarnos las cajitas con tips, por autoclavarme todo lo que necesitey por sacarme más de una sonrisa.• A Pablo, por su ayuda con la informática.• A Zulma, por ayudarme a mantener el orden y por la buena onda.100

Agradecimientos• A todos los del IIB que me ayudaron de una u otra forma.• A Elena Jazín y a Karolina Aberg, por las muestras y el análisis de polimorfismos.• A Ana de Genaro y a Luciana Frick, por las muestras de ARNm de animales estresados.• A Marce, Cami, Pao y Juan por ayudarme con la corrección de la tesis.• A los jurados, por aceptar ser parte de esta tesis.• Al CONICET y a la UNSAM por las becas otorgadas para realizar mi trabajo deinvestigación.• A Mati, por todos los papers que me mandó.• A Mary, mi amiguita de la Facu.• A Calu, por estar siempre.• Y a mi mamá, por su apoyo, por los viajes y por todos los momentos compatidos.101