accion de diferentes toxinas de anemonas sobre canales de sodio ...

ACCIÓN DE TOXINAS DE ANÉMONAS SOBRE CANALES DE SODIO.A. Garateix 1 , E. Salceda 2 , H. Salazar 2 , A. Aneiros 1 , L. Beress 3 , E. Soto 21 Centro de Bioactivos Marinos, CITMA, La Habana, Cuba, Tlf. 881 1298,e-mail: cebimar@infomed.sld.cu; 2 Instituto de Fisiología, BUAP, Puebla, México;3 Instituto de Toxicología, Kiel, Alemania.RESUMENLas denominadas toxinas de sitio 3 comprenden un grupo de péptidos con gran diversidadestructural, obtenidos a partir de anémonas marinas y escorpiones, que se enlazan alcanal de Na + activado por voltaje, produciendo un enlentecimiento en el proceso deinactivación de esta corriente. En este trabajo se presentan los resultados de lacaracterización farmacológica de 3 toxinas obtenidas a partir de las anémonasAnthopleura elegantissima (APC) y Bunodosoma granulifera (BgII y BgIII). Se comparanlas secuencias aminoacídicas de estos polipéptidos y se estudian sus efectos encondiciones de imposición de corriente y voltaje. Estas toxinas se aplicaron externamentesobre neuronas en cultivo aisladas a partir de ganglios de las raíces dorsales de rata.Todos estos compuestos aumentan la duración de los potenciales de acción y actúan deforma selectiva enlenteciendo el proceso de inactivación de la corriente de sodio sensiblea tetrodotoxina (TTX-S). Estas toxinas no afectan de forma significativa el proceso deactivación. Aunque estos polipéptidos ejercen el mismo efecto farmacológico, muestranafinidades diferentes en su unión al canal de Na + y presentan algunas peculiaridades ensu modo de acción. Los valores de IC 50 fueron: APC 1.25 ±1.07 μM; BgII 4.1±1.2 μM yBgIII 11.9 ±1.4 μM. Diferentes estudios han destacado la importancia de determinadosresiduos aminoacídicos en la actividad de las toxinas de anémonas con acción sobrecanales de Na + . Las toxinas estudiadas en este trabajo presentan la mayoría de losaminoácidos a los que se ha atribuido un papel importante en la interacción toxinareceptor.Sin embargo, se observan diferencias estructurales entre estas toxinas quepodrían correlacionarse con las diferencias observadas en cuanto a su afinidad por elcanal. El residuo Val 13, un aminoácido hidrofóbico, que se encuentra presente solo enAPC, en lugar de Pro 13, un residuo importante en la toxinas de anémonas, podríacontribuir significativamente en la mayor potencia de esta toxina. La presencia de Asp enposición 16 en lugar de Asn, en BgIII, podría afectar la potencia de esta toxina.PC: toxinas marinas, canales de sodio, farmacología marina

INTRODUCCIÓNLos canales de sodio constituyen un “blanco” importante para varias toxinas de origennatural que se unen a diferentes sitios de estas proteínas. Estos compuestos hancontribuido al conocimiento de la estructura y función de estos canales. Al denominadositio 3 del canal de sodio se unen las toxinas de anémonas y las toxinas alfa de escorpión,y se encuentra parcialmente formado por residuos aminoacídicos del lazo extracelularubicado entre los segmentos S3 y S4 en el cuarto dominio homólogo del canal (Rogers etal., 1996, Benzinger et al., 1997, 1998). Está en discusión la contribución al sitio receptorde la región extracelular entre los segmentos S5 y S6 en los dominios D1 y D4 (Thomseny Catterall 1989).Las toxinas de anémonas son polipéptidos con una masa molecular cercana a los 5 KDa,que actúan desde el lado extracelular de la membrana. Estos compuestos enlentecen elproceso de inactivación de los canales de Na + , sin afectar el proceso de activación deesta corriente, inhibiendo el movimiento del segmento S4 del dominio IV (Sheets et al.,1999). Se ha demostrado que el ácido glutámico 1613 del canal de sodio del cerebro derata o el Asp 1612 del canal de sodio cardíaco en el segmento transmembrana S3 deldominio IV, así como siete residuos adicionales del lazo extracelular entre los segmentosS3 y S4 de la subunidad alfa del canal de Na + , son los determinantes críticos para la uniónde estas toxinas (Denac et al., 2000).En el presente estudio se emplearon tres toxinas obtenidas a partir de las anémonasAnthopleura elegantissima (APC) y Bunodosoma granulifera (BgII y BgIII). Estas toxinasestán constituidas por 47 aminoácidos y aunque pertenecen al grupo de las toxinas tipo Ino muestran homologías significativas en cuanto a su secuencia. En estudios previosrealizados por nuestro grupo se describe la acción de estos compuestos sobre lascorrientes de sodio TTX-S. En el presente trabajo se comparan sus accionesfarmacológicas así como sus potencias, teniendo en cuenta las diferencias en sucomposición aminoacídica.MATERIALES Y MÉTODOSAPC, BgII y BgIII fueron aisladas y purificadas a partir de las anémonas Anthopleuraelegantissima y Bunodosoma granulífera como ha sido descrito previamente (Loret etal.,1994, Bruhn et al., 2001, Goudet et al., 2001,).

Los experimentos se realizaron con células en cultivo primario obtenidas de ganglios de laraíz dorsal de ratas Wistar (4-10 días) de ambos sexos de acuerdo con el procedimientodescrito por Salceda y col. (2002).Para el registro de las corrientes iónicas se empleó la técnica de patch clamp en laconfiguración de célula completa. (Hamill et al., 1981), Las pipetas de registro seelaboraron con capilares de borosilicato (TW 120-3, WPI), utilizando un estirador depipetas (P80/Pc, Sutter) y sus resistencias fueron de 0.9-1.8 MΩ.Para la medición de las corrientes iónicas se empleó un amplificador Axopatch-1D (AxonInstruments). La generación de los pulsos comando y el muestreo de los datos fuecontrolado por el programa Pclamp 8.0 (Axon Instruments) usando un sistema deadquisición de datos de 16 bits. (Digidata 1320A, Axon instruments). Las señales sefiltraron con un filtro pasa-bajo a 5 KHz y fueron digitalizadas a 20 KHz. Las corrientescapacitivas y de pérdida fueron sustraídas digitalmente con el método P/2. Lacapacitancia y la resistencia en serie (80%) se compensaron electrónicamente. Aquellosexperimentos en los que el error en el voltaje debido a resistencia en serie nocompensada excedía los 5 mV fueron rechazados. Para valores menores a los 5 mV nose hicieron correcciones.El registro electrofisiológico se realizó entre las 2 y 8 horas después de haber sembradolas células.Para los experimentos de imposición de corriente (current clamp) las soluciones tuvieronla siguiente composición (mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 3.6 CaCl 2 , 1.2 MgCl 2 , 10 Hepes,pH=7.4 ajustado con NaOH. La pipeta se llenó con una solución (mM) 3 NaCl, 145 KCl,0.1 CaCl 2 , 5 Hepes, pH=7.4 ajustado con KOH.Para el registro de las corrientes iónicas las células se mantuvieron en soluciónextracelular con la siguiente composición (en mM): 20 NaCl, 1 MgCl 2 , 1.8 CaCl 2 , 45cloruro de tetraetilamonio, 10 de 4-aminopiridina y 5 Hepes. El pH de la solución se ajustóa 7.4 con HCl y la osmolaridad se ajustó a 290 mOsm usando dextrosa. La soluciónintracelular tuvo la siguiente composición (en mM): 10 NaCl, 100 CsF, 30 CsCl, 10 TEA-Cl, 8 EGTA y 5 Hepes. El pH de esta solución se ajustaba a 7.3 con CsOH. Laosmolaridad se ajustó a 300 mOsm. Se usó flúor en la solución intracelular con el objetivode bloquear las corrientes de Ca +2 (Kostyuk y col. 1975).El tipo de corriente de sodio presente en la célula bajo estudio se determinó antes decada experimento. De acuerdo con el criterio utilizado por Strachan et al. (1999), soloaquellas células con corrientes de sodio persistentes

de estado estable, fueron aceptadas para determinar los efectos de las toxinas sobre lascorrientes de sodio TTX-S. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente(23-25 0 C).Los registros se analizaron usando el programa Pclamp 8.0 (Axon Instruments) y Origin6.0 (Microcal Software, Northampton, MA). Las diferencias estadísticas se determinaronusando la prueba de la t de Student (p< 0.05). El ajuste de las curvas se realizó con elmétodo de los mínimos cuadrados. Los datos numéricos se presentan como la media ±ESpara al menos 4 medidas.Una descripción más detallada de los métodos puede encontrarse en el trabajo deSalceda y col. (2002).RESULTADOSLas neuronas de los ganglios de las raíces dorsales de ratas de 4-10 días de nacidaspresentan dos tipos de corrientes de sodio: sensibles y resistentes a TTX. La proporciónde dichas corrientes depende de la edad del animal y del tamaño celular. Con eldesarrollo ontogenético hay prevalencia del tipo TTX-S. En el presente estudio seemplearon un total de 189 neuronas con una capacitancia media de 53.18 ± 17.29 pFEn condiciones de current clamp la aplicación de pulsos despolarizantes de corriente de 1nA, 2.5 mseg y frecuencia de 0.125 Hz, provoca la generación de potenciales de acción(PA) con una duración aproximada entre 5-8 ms y una amplitud de alrededor de 100 mV(Figura 1A). La aplicación de estas toxinas (10 μM) produce efectos cualitativamentesimilares consistentes en un aumento en la duración de los potenciales de acción queresulta alrededor de 8 veces mayor en el caso de la toxina APC (Figura 1A). Este efectoes atribuíble a un enlentecimiento en el proceso de inactivación de la corriente de sodiocomo puede observarse en la Figura 1B. En este caso, las corrientes fueron evocadas apartir de un potencial impuesto de -100 mV y un pulso de prueba a -10 mV con unaduración de 40 ms. En todos los casos, a concentraciones de 10 μM, se observa unenlentecimiento en el proceso de inactivación de la corriente de Na + que provoca un 107.3± 18.14 % (SE) de cambio de la constante de tiempo de inactivación por aplicación deAPC (n= 15). El lavado de la preparación con solución normal produce una recuperaciónparcial de la corriente. Los efectos de las toxinas sobre la amplitud de la corriente de Na +fueron variables pero estos cambios no resultaron significativos (t de student, p

Estas toxinas no actúan sobre las corrientes de Na + resistentes a TTX (datos nomostrados).Los efectos de las toxinas sobre la dependencia de voltaje de la inactivación de estadoestable fueron evaluados con un protocolo de doble pulso convencional con prepulsoscondicionantes a partir de -120 mV por 40 ms, en pasos de 10 mV, seguidos por un pulsode prueba a -10 mV, cada 8s. El parámetro de inactivación de estado estable (h α ) fuecalculado dividiendo la corriente alcanzada después de un prepulso dado, por la máximacorriente alcanzada en el potencial de prueba. Los resultados de esta operación fuerongraficados como función del potencial del prepulso y se ajustaron con una función deBolztmann de la forma siguiente:h∞=⎛V1 + exp⎜⎝1− Vpre 1/ 2 inactk⎞⎟⎠donde V pre es el potencial de prepulso, V 1/2inact es el potencial de prepulso al cual h α esigual a 0.5 y k es la pendiente de la curva en el punto medio. Para todas las toxinas (10μM) se observa un desplazamiento a la izquierda en la dependencia de voltaje, apotenciales más hiperpolarizados. La V 1/2 inact en condiciones control fue de -63.77±0.75mV, mientras que en presencia de APC, BgII y BgIII fue de -73.4± 0.9 mV; -73± 0.9 mV y-69± 1.4 respectivamente. La pendiente en condiciones control fue de 9.2± 0.54, mientrasque en presencia de APC, BgII y BgIII resultó de 9.9± 0.7; 8.8± 0.8 y 10± 1.6respectivamente.En la figura 1D se presentan las curvas concentración-respuesta para cada toxina. Lascorrientes de sodio se evocaron empleando un protocolo consistente en un pulso únicodespolarizante a –10 mV por 40 ms a partir de un potencial impuesto de –100 mV,repetido cada 8 s. Para la construcción de la curva concentración-respuesta se seleccionóun trazo de corriente en condiciones control y otro que representara el efecto máximoejercido por la toxina (siempre en un tiempo menor a los 3 minutos). El efecto de lastoxinas se evaluó calculando el % de cambio de la constante de tiempo de la inactivaciónmedido entre el 90% después del pico máximo de corriente y los 5 ms realizando unajuste exponencial simple. Estos compuestos afectan el curso temporal del proceso deinactivación en forma dependiente de la concentración, sin cambios significativos sobre elcurso temporal de la activación ni sobre el pico de corriente. Los datos se graficaron como

función de la concentración de la toxina y sobre la curva resultante se ajustó la siguientefunción:yAA − A2 1= 1 +( LogIC50−x)⋅P1+10Donde: A 1 es el valor mínimo en el eje y, A 2 es el valor máximo en el eje y, LogIC 50 es elvalor en el eje X cuando se alcanza la respuesta media entre A 1 y A 2 y P es la pendientede Hill.El curso del proceso de inactivación de la corriente pudo ser descrito con una funciónexponencial simple antes y después de la aplicación de las toxinas (coeficiente decorrelación 0.95). Los valores de IC 50 fueron: APC 1.25 ±1.07 µM, BgII 4.1±1.2 µM, y 11.9±1.4 µM para BgIII. El efecto máximo producido por la aplicación de ambas toxinas sealcanza muy rápido, generalmente dentro del primer minuto después de la perfusión delas toxinas y una vez alcanzado se mantuvo estable.No se observaron efectos significativos sobre el curso temporal del proceso de activación(Prueba t, p

AC1.00.8+70 mV-120 m V40 m s40 m s-10 m VAPC 10 μ M (80s)0.6BControl10 m s20 m V0.4ControlAPC0.2BgIIB g III0.0-1 2 0-1 0 0-8 0 -6 0 -4 0 -2 0 0D240ControlAPC 10 μ M40 m s-10 m V-100 m V2 nA5 m s200Increase in τ h(% )16012080400-7 -6 -5 -4Log[Toxin] (M )Figura 1-Efecto de toxinas en condiciones de fijación de corriente y voltaje.A-Efecto de APC (10 µM) sobre los potenciales de acción (PA) de neuronas en cultivoaisladas de ganglios de la raíz dorsal de ratas en condiciones de fijación de corriente. LosPA fueron evocados por estímulos despolarizantes de corriente de 1nA, 2.5 mseg yfrecuencia de 0.125 Hz en ausencia y presencia de toxinas. B- Los registros representantrazos superpuestos antes y después de la aplicación de la toxina APC (10 µM). Nóteseque la toxina produce un marcado enlentecimiento en el proceso de inactivación de lacorriente de Na + . C-Efectos de las toxinas sobre la inactivación de estado estable de lacorriente de Na + de acuerdo a como se describe en el texto. Los valores de V 1/2 y k paracada toxina aparecen en el texto D- Curvas concentración-respuesta de los efectos deAPC (n=26; cuadrados abiertos), BgII (n=87; triángulos llenos) y BgIII (n=22; círculosllenos). Los asteriscos denotan la significación de los efectos en relación con loscontroles. (Prueba t de Student; p

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2122 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 404142 43 44 45 46 47GVPCLCDSDGPSVRGNTLSGILWLAGCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQAnthopleura elegantissima (Toxina APC; Bruhn et al., 2001)GASCRCDSDGPTSRGNTLTGTLWLIG CPSGWHNCRGSGPFIGYCCKQBunosodoma granulifera (Toxina BgII; Loret et al., 1994)GASCRCDSDGPTSRGDTLTGTLWLIGCPSGWHNCRGSGPFIGYCCKQBunosodoma granulifera (Toxina BgIII; Loret et al., 1994)Figura 2- Comparación de las secuencias de aminoácidos de APC, BgII y BgIII.

DISCUSIÓNEn este estudio se muestra la acción electrofisiológica de 3 toxinas de anémonas tipo Isobre neuronas de ganglios de la raíz dorsal de rata. Estas toxinas incrementan laduración del potencial de acción y enlentencen el proceso de inactivación de la corrientede Na + TTX-S. Las toxinas no alteran de forma significativa el curso temporal del procesode activación de esta corriente. Parece que estas toxinas afectan los cambiosconformacionales requeridos para la inactivación rápida del canal posiblemente alcombinarse con el sitio receptor 3 de la superficie extracelular del canal de Na + .La magnitud del efecto sobre el proceso de inactivación es diferente para cada toxina; elorden de la potencia de acuerdo a la IC 50 fue de APC> BgII >BgIII.La presencia de APC, BgII y BgIII, produjo un desplazamiento significativo en la curva deinactivación, indicando que una fracción de canales está inactivada en el reposo.Los efectos sobre las amplitudes de las corrientes fueron variables. En algunosexperimentos se observó un incremento en la amplitud pico de la corriente de Na + enpresencia de las toxinas. Esto es, probablemente, consecuencia del enlentecimiento en elproceso de inactivación. Similarmente, se observa un incremento en la amplitud de lospotenciales de acción. Un incremento en el pico de corriente de Na + ha sido observadopara toxinas de C. gigantea (Pelhate et al., 1976; Salgado y Kem 1992) y A. sulcata(Rathmayer 1979).En todos los casos, los efectos de las toxinas sobre el proceso de inactivación tienenlugar muy rápido (entre los 2 min.) y estos cambios fueron parcialmente reversiblesdespués del lavado con solución normal. La reversibilidad de la acción de las toxinas deanémonas sobre canales de Na + de vertebrados e insectos es reportada por diferentesautores (Rathmayer y Beress 1976; Salgado y Kem 1992), mientras que los efectos detoxinas sobre canales de Na + de crustáceos son de naturaleza irreversible (Rathmayer yBeress 1976; Salgado y Kem 1992).Estas toxinas no actúan sobre las corrientes de Na + resistentes a TTX.El curso temporal de la recuperación de la inactivación de la corriente de Na+ encoondiciones control fue el mismo que en presencia de la toxina (Datos no mostrados).A pesar de las similitudes ya referidas entre las toxinas estudiadas en este trabajo, sepresentan diferencias en sus potencias que podrían estar determinadas por lacomposición aminoacídica de cada toxina.Algunos estudios realizados con diferentes toxinas, fundamentalmente obtenidas a partirde Anthopleura sp., han intentado determinar el papel de residuos específicos en el

enlace con el canal. Con este propósito se realizaron mutaciones de las toxinasAnthopleurinas (Khera et al., 1995; Khera y Blumenthal 1996; Dias Kadambi et al., 1996;Kelso y Blumenthal 1998) o de diferentes canales de sodio (Benzinger et al., 1997). Engeneral, los aminoácidos básicos de las toxinas y los residuos acídicos del dominio I y IVde la subunidad alfa del canal de sodio han sido implicados en la interacción toxinareceptor.La carencia de información acerca de la estructura tridimensional de la toxinas estudiadasno nos permite explicar claramente la relación estructura-función entre estas toxinas y elsitio receptor. Sin embargo, tomando en cuenta investigaciones previas realizadas conotras toxinas de anémonas podemos analizar comparativamente nuestros resultados.La composición aminoacídica de las tres toxinas estudiadas revela algunas diferenciasentre ellas (Figura 2).Se ha sugerido que la interacción entre Lys-37 de las toxinas de anémonas y Asp 1612del canal de Na + cardíaco o el correspondiente residuo Glu-1613 del canal de Na +neuronal representa una relación funcional altamente conservada (Benzinger et al., 1998).Aunque algunas toxinas de anémonas tienen un residuo positivo en o adyacente a laposición 37, de las toxinas estudiadas solo APC tiene una His positiva en esta posición, locual podría explicar la mayor potencia de esta toxina en comparación con las otras.De acuerdo con Seibert et al. (2003) existirían algunos residuos de aminoácidos que sonimportantes en la actividad de ApB (de Anthopleura xanthogrammica) : Arg 12, Arg 14,Leu 18, Gly 10, Gly 15 y Gly 20. Por otra parte, el residuo acídico Asp en posiciones 7 y 9es esencial para la expresión de la actividad biológica (Khera y Blumenthal, 1996).Los residuos de aminoácidos mencionados anteriormente están presentes en todas lasanémonas estudiadas, excepto en posición 12, donde aparece una Ser en APC y una Thren BgII y BgIII en lugar de Arg. Sin embargo, esto no parece afectar su actividad, puestoque ha sido demostrado que la Arg 12 de ApB representa un sitio importante para definirla discriminación de isoformas del canal de Na + por las toxinas de anémonas (Gallagher yBlumenthal 1994).Asn 16 es un residuo muy conservado entre las toxinas tipo I y parece estar relacionadocon la toxicidad y los efectos biológicos (Loret et al., 1994). Este residuo, ausente enBgIII, se reemplaza por Asp, lo cual introduce una carga adicional negativa produciendouna disminución en la potencia biológica que puede estar relacionada con un cambio en lainteracción electrostática con el canal de Na + (Loret et al., 1994).

Además, Pro 13 parece jugar un papel importante en el enlace al canal (Kelso et al.,1996). Este aminoácido parece participar en la orientación relativa de los residuoscatiónicos dentro del lazo entre los residuos 9-8, incrementando así la interacción con elcanal (Kelso et al., 1996). En APC está presente un residuo hidrofóbico en esta posición:Val mientras que en BgII y BgIII se encuentra una Ser. La presencia de Val en posición13 podría incrementar la superficie hidrofóbica de la molécula y, consecuentemente,incrementar la interacción toxina-receptor.Trp 33 contribuye significativamente a la afinidad de ApB por el canal (Dias Kadambi etal., 1996). Es reemplazado por Asn en APC, BgII y BgIII.Los principios que determinan la relación “canal-toxina” aún deben ser esclarecidos endetalle. Las toxinas de anémonas y las toxinas alfa de escorpión con acción sobre canalesde sodio se enlazan a elementos que se solapan en el sitio receptor 3 de la superficieextracelular del canal de Na + y producen efectos similares (Rogers et al., 1996). Lastoxinas con acción sobre canales de potasio constituyen un ejemplo de convergenciaevolutiva (Menes et al., 1998). Aunque no poseemos los elementos suficientes conrelación a las homologías estructurales de las toxinas de sodio, resultaría plausible pensarque estos animales venenosos, filogenéticamente distantes, puedan sintetizar toxinas norelacionadas estructuralmente pero capaces de reconocer un sitio “blanco” similar en eldenominado sitio 3 de este canal. Las toxinas de escorpión han sido más estudiadas y seha propuesto que los residuos cargados positivamente (Lys 8, Arg 18, Lys 62 y Arg 64) yun par de residuos aromáticos (Tyr 10 y Phe 17) son elementos importantes para lainteracción directa con el canal de sodio, para el arreglo espacial de la toxina y laformación de un potencial eléctrico involucrado en el reconocimiento del canal de Na +(Zilberberg et al., 1997). Con relación a las toxinas de anémonas, además de lacontribución de los residuos de aminoácidos anteriormente citados en el enlace de lastoxinas al canal, parece claro que la presencia de los aminoácidos básicos e hidrofóbicosjuega un papel importante en la interacción toxina-receptor.

REFERENCIASBenzinger G.R., Drum C.L., Chen L.Q., Kallen R.G., Hanck D.A., Hanck D. (1997)Differences in the binding sites of two site-3 sodium channel toxins. Pflugers Arch.434 (6), 742-9.Benzinger G.R., Blumenthal M., and Hanck D.A. (1998) A specific interaction between thecardiac sodium channel and site-3 toxin Anthopleurin B. The Journal of BiologicalChemistry 273 (1), 80-4.Brunh T., Schaller C., Schulze C., Sanchez Rodriguez J., Dannmeier C., Ravens U.,Heubach J. F., Eckhard K., Schmidmayer J., Schmidt H., Aneiros A., Wachter andBéress L. (2001) Isolation and characterization of five neurotoxic and cardiotoxicpolypeptides from the sea anemone Anthopleura elegantissima. Toxicon 39, 693-702.Denac H., Mevissen M. and Scholtysik G. (2000) Structure, function and pharmacology ofvoltage-gated sodium channels. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol. 362, 453-479.Dias Kadambi B.L., Drum C.L., Hanck D. A., and Blumenthal K.M. (1996) Leucine 18, ahydrophobic residue essential for high affinity binding of anthopleurin B to thevoltage-sensitive sodiuum channel. J. Biol Chem. 271 (16), 9422-8.Gallagher M.J. and Blumenthal K.M. (1994) Importance of the unique cationic residuesarginine 12 and lysine 49 in the activity of the cardiotonic polypeptide anthopleurin B.J. Biol. Chem. 269 (1), 254-9.Goudet, C., Ferrer, T., Galan, L., Artiles, A., Batista, C.F.V., Possani, L.D., Alvarez, J.,Aneiros, A. & Tytgat, J. (2001), Characterization of two Bunodosoma granuliferatoxins active on cardiac sodium channels. British Journal of Pharmacology. 134,1195-1206.Hamill, O.P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B. and Sigworth, F.J. (1981), Improvedpatch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell-freemembrane patches, Pflügers Archiv, 391, 85-100.Kelso G.J., Drum C.L., Hanck D.A. and Blumenthal K.M. (1996) Role for Pro-13 indirecting high-affinity binding of anthopleurin B to the voltage-sensitive sodiumchannel. Biochemistry 35 (45), 14157-64.

Kelso G.J., and Blumenthal K. M. (1998) Identification and characterization of novelsodium channel toxins from the sea anemone Anthopleura xanthogrammica. Toxicon36(1), 41-51.Khera P.K., Benzinger G.R., Lipkind G., Drum C.L., Hanck D.A. and Blumenthal K.M.(1995) Multiple cationic residues of anthopleurin B that determine high affinity andchannel isoform discrimination. Biochemistry. 34 (27), 8533-41.Khera P.K. and Blumenthal K. M. (1996) Importance of highly conserved anionic residuesand electrostatic interactions in the activity and structure of the cardiotonicpolypeptide anthopleurin B. Biochemistry 35 (11), 3503-7.Kostyuk P.G., Krishtal O.A. and Pidoplichko V.I. (1975)- Intracellular dialysis of nerve cells:Effect of intracellular fluoride and phosphate on the inward current. Nature London,257, 691-3.Loret E., Menéndez Soto del Valle R., Mansuelle P., Sampieri F. and Rochat H. (1994)Positively charged amino acid residues located similarly in sea anemone andscorpion toxins. 269 (24) 16785-8.Ménez, A. (1998) Functional architectures of animal toxins: a clue to drug design?.Toxicon36 (11), 1557-1572.Pelhate, M., Hue B. and Sattelle (1976) Pharmacological properties of axonal sodiumchannels in the cockroach Periplaneta americana L. Slowing of sodium currentturnoff by Condylactis toxin. J. Exp. Biol. 83, 49-58.Rathmayer W. (1979) Sea anemone toxins: tools in the study of excitable membranes.Advances in Cytopharmacology. 3, 335-344. edited by Ceccarelli and F. Clementi.Raven Press, New York.Rathmayer W and Beress L. (1976) The effect of toxins from Anemonia sulcata(Coelenterata) on Neuromuscular Transmission and Nerve Action potentials in theCrayfish (Astacus leptodactylus). J. Comp. Physiol. 109, 373-382.Rogers J., Qu Y., Tanada T., Scheuer and Catterall W. (1996)- Molecular determinants ofhigh affiinity binding of alpha scorpion toxin and sea anemone toxin in the S3-S4extracellular loop in domain IV of the Na + channel alpha subunit. The Journal ofBiological Chemistry. 271 (27), 15950-15962.Salceda E., Garateix A. and Soto E. (2003) The sea anemone toxins BgII and BgIIIprolong the inactivation time course of the tetrodotoxin-sensitive sodium current inrat dorsal root ganglion neurons. The Journal of Physiology and ExperimentalTherapeutics. 303 (3), 1067-1074.

Salgado V. and Kem W. (1992) Actions of three structurally distinct sea anemone toxinson crustacean and insect sodium channels. Toxicon, 30 (11), 1365-1381.Seibert A., Liu J., Hanck D.A., Blumenthal K.M. (2003) Arg-14 loop of site 3 anemonetoxins: effects of glycine on replacement on toxin affinity. Biochemistry, 42 (49),14515-21.Sheets M., Kyle J.W., Kallen R.J.and Hanck D. (1999) The Na channel voltage sensorassociated with inactivation is localized to the external charged residues of domainIV, S4. Biophysical Journal, 77, 747-757.Strachan L.C., Lewis R.J. and Nicholson G.M. (1999). Differential actions of pacificciguatoxin-1 on sodium channel subtypes in mammalian sensory neurons. J.Pharmacol. 288 (1), 379-388.Thomsen W. J. and Catterall W.A. (1989) Localization of the receptor site for alphascorpiontoxins by antibody mapping-implications for sodium channel topology. Proc,Natl. Acad. Sci. USA. 86, 10161-5.Zilberberg N., Froy O., Loret E., Cestele S., Arad D., Gordon D. and Gurevitz M. (1997)Identification of structural elements of a scorpion alpha-neurotoxin important forreceptor site recognition. J. Biol. Chem. 272 (23), 14810-6.

A P C 1 0 μ M ( 8 050 m s20 m VC ontrolControl150APC 10 μMAPC 10 μM(180 s)2 nA5 msIncremento en τ h(%)12510075502500 30 60 90 120 150 180Tiempo (s)

1.00.80.640 m s+70 m V-120 m V40 m s-10 m V0.40.2ControlAPCBgIIBgIII0.0-1 2 0-100-80-60-40-20 0

240200In c re a s e in τ h(% )16012080400-7 -6 -5 -4Log[Toxin] (M )