HAV Ab S

HAV AbSCada diente está sensibilizado en dos áreas activas:punto superior — anticuerpo monoclonal contra HAV(Control Interno)punto inferior — anticuerpos de conejo anti IgG e IgM humanoLa Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos. Cada filacontiene una solución reactiva lista para utilizarse en cada etapa delensayo. La prueba se realiza en etapas, moviendo el Peine de filaen fila, con un período de incubación en cada etapa.Al inicio de la prueba, las muestras de suero o plasma sonprediluidas 1:50 y agregadas al diluyente en los pocillos de la fila Ade la Bandeja de Desarrollo. El Peine es entonces insertado en lospocillos de la fila A. El IgG e IgM serán capturados por losanticuerpos anti-IgG y anti-IgM en los puntos inferiores de los dientesdel Peine (Figura 1). Los componentes no unidos son lavados en lafila B. En la fila C, los anticuerpos IgG e IgM anti-HAV capturados enlos dientes, reaccionarán con el antígeno HAV. De manerasimultánea el antígeno HAV se unirá también al anticuerpo anti-HAVen el punto superior (Control Interno). En la fila D, el antígeno HAVunido reaccionará con el anticuerpo monoclonalanti-HAV marcado con fosfatasa alcalina (FA). En la fila E, loscomponentes no unidos serán eliminados mediante un lavado. En lafila F, la fosfatasa alcalina unida reaccionará con componentescromogénicos. Los resultados podrán observarse como puntos azulgrisáceo en la superficie de los dientes del Peine.anti IgG e IgM humanoCaptura de anticuerpos;2 horas / 37º CHAVReacción anti-HAV - HAV;30 minutos / 37º CCódigo: 60456002Para uso diagnóstico in vitro solamenteUso PrevistoFormato: 3 x12 pruebasEl kit ImmunoComb ® II HAV Ab es una prueba rápida diseñada parala determinación semi cuantitativa de anticuerpos para el virus de lahepatitis A (HAV) en el suero o plasma humano. Treinta y seispruebas pueden ser realizadas con un kit.IntroducciónLa hepatitis A es una enfermedad frecuente en la población humana,causada por el virus de la hepatitis A (HAV). Luego de un período deincubación de 14-40 días, la infección HAV se manifiesta máscomúnmente por ictericia, debido a una inflamación aguda del hígadoy el subsecuente incremento de la concentración de bilirrubina en lasangre. Aún no se han registrado casos de infección crónica.La hepatitis A es endémica en todas partes del mundo. Suepidemiología está muy influenciada por el nivel de sanidad e higienelocal. La transmisión ocurre por vía fecal oral. Se excretan una grancantidad de virus (hasta 10 8 unidades infecciosas por gramo) en lasheces unos pocos días antes de que se presenten los síntomas clínicoso la ictericia. La diseminación del virus es entonces facilitada porcontacto directo o por consumo de agua o alimentos contaminados.Actualmente, la profilaxis exitosa de la hepatitis A se logra porinmunización pasiva con inmunoglobulinas humanas anti-HAV.Además, recientemente se han desarrollado vacunas contra el HAV.Varias causas de origen viral (por ejemplo virus de hepatitis B y C) ode origen no viral, pueden ocasionar hepatitis. Consecuentemente,el diagnóstico de la infección HAV basado en los síntomas clínicosy en el análisis bioquímico de las funciones hepáticas únicamente,es muy difícil. Sin embargo, el inmunodiagnóstico, permite laidentificación del agente etiológico.El ensayo HAV Ab facilita la determinación del estado inmune de losindividuos luego de haber sido expuestos al HAV o a la vacuna de lahepatitis A. La detección de los anticuerpos anti-HAV en ausenciade anticuerpos anti-HAV tipo IgM, indica infección previa con HAV oque la vacuna tuvo éxito. En general, se considera que un título de10 IU/L representa la concentración mínima de anticuerpo anti-HAVindicando la inmunización del individuo.Principio del EnsayoLa prueba ImmunoComb ® II HAV Ab es un ensayoinmuno-enzimático de fase sólida (EIA), basado en el principio deinmunocaptura. La fase sólida es un Peine con 12 proyecciones(dientes).Conjugadoα HAVsubstratocromogénicoFigura 1. Principio de la PruebaUnión del Conjugado20 minutos / 37º CReacción enzimática10 minutos / 37º CEl equipo incluye un Control Positivo (con anticuerpos anti-HAV) y unControl Negativo, para ser incluidos en cada corrida del ensayo, paraconfirmar la validez de la prueba. Al terminar la prueba, el dienteutilizado con el Control Positivo deberá mostrar 2 puntos de color azulgrisáceo. El diente usado con el Control Negativo deberá mostrar elpunto superior y un punto inferior muy ténue o ausencia del mismo. Elpunto superior deberá aparecer también en todos los otros dientes,para confirmar que el equipo funciona apropiadamente y que laprueba se llevó a cabo correctamente.Contenido del KitPeinesEl kit contiene 3 Peines de plástico. Cada uno tiene 12 dientes, undiente para cada prueba (Figura 2). Cada diente está sensibilizadoen dos áreas reactivas:punto superior — anticuerpo monoclonal contra el virus de lahepatitis A (Control Interno)punto inferior — anticuerpos de conejo anti IgG e IgM humano56 56 56 56 56 56 56 56 56 56 56 56Figura 2. PeineImmunoComb ® IIControl InternoAnti-IgG e IgM humanosLos Peines se proporcionan en empaques de aluminio quecontienen una bolsa desecante.Bandejas de DesarrolloEl kit contiene 3 Bandejas de Desarrollo cubiertas con papel dealuminio. Cada Bandeja de Desarrollo (Figura 3) contiene todoslos reactivos necesarios para la prueba. La Bandeja de Desarrolloconsta de 6 filas (A-F) con 12 pocillos cada una.60456002/S11/OR/CE 1

Procedimiento de la PruebaEl contenido de cada fila es el siguiente:Fila A diluyente de la muestra* A menos que sea archivado para consulta posteriorFila B solución de lavadoFila C Antígeno HAVFila D anticuerpo anti-HAV monoclonal marcado confosfatasa alcalinaFila E solución de lavadoFila F solución de sustrato cromogénico conteniendo5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIF) y azulde nitrotetrazolio (ANTZ)Figura 3. Bandeja de DesarrolloControl Positivo – 1 frasco (tapa roja) de 0.2 ml de plasmahumano inactivado por calor, diluido a un título de 100 IU/L paraanticuerpos anti HAV.Control Negativo – 1 frasco (tapa verde) de 0.2 ml de plasma humanodiluído, inactivado por calor, negativo para anticuerpos anti-HAV.Diluyente de la muestra – 1 frasco de 20 ml de diluyente.Perforador – para perforar el papel de aluminio que cubre lospocillos de la Bandeja de Desarrollo.CombScale – Para leer los resultados de la prueba.Seguridad y Precauciones• Los materiales de origen humano usados en la preparción del kitfueron analizados y no se encontraron reactivos para antígeno desuperficie de hepatitis B, ni para anticuerpos contra HIV ni paravirus de Hepatitis C. Ya que ningún método de prueba puedegarantizar por completo la ausencia de contaminación viral, todaslas soluciones de referencia y todas las muestras humanas debenser manejadas como si fueran potencialmente infecciosas.• Use guantes quirúrgicos y ropa de laboratorio. Siga losImmunoComb ® IIprocedimientos de laboratorio aceptados para el trabajo consuero o plasma humano.• No pipetee con la boca.56 56 56 56 56 56 56 56 56 56 56 56• Deseche todas las muestras, los Peines utilizados, Bandejasde Desarrollo y otros materiales utilizados con el kit comodesechos biocontaminantes.• No mezcle los reactivos de lotes diferentes.• No use el kit después de la fecha de caducidad.Conservación y estabilidad del kit• El kit es enviado a 2-8º C. Durante el transporte el kit puedeser conservado a menos de 30º C durante cortos períodos deFigura 4. Fraccionamiento del PeineInstrucciones de la Pruebatiempo que no excedan de 48 horas. Los controles internosindican que el kit no ha sido dañado durante el transporte.• Conservar el kit en su caja original a 2-8º C.• No congelar el kit.• Después de abrir el kit inicialmente, los componentes debenser conservados a 2-8º C.• El funcionamiento del kit después de su apertura inicial, esestable hasta la fecha de caducidad del mismo si seconserva a 2-8º C.• Después del uso inicial, el peine y la bandeja de reactivos nopueden ser utilizados más de tres veces.Manejo de las Muestras• Es posible usar suero o plasma en la prueba.• Las muestras pueden ser almacenadas por 7 días atemperaturas de 2° a 8°C antes de la prueba. Para almacenarlas muestras por más de 7 días, congélelas a -20°C o atemperaturas más bajas.• Todas las muestras congeladas deben centrifugarse a 10.000rpm, por 5 minutos a temperatura ambiente. Removercuidadosamente el líquido sobrenadante. Si se forma unacapa de lípidos en la superficie, asegurese de tomar lamuestra del líquido claro debajo de la capa. Evite congelar ydescongelar repetidamente.• Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato sódico no hanmostrado tener efecto sobre los resultados del test.Equipo Necesario• Pipetas de precisión ajustables con puntas desechables concapacidad de dispensar 10 µl, 25 µl y 490 µl• Tijeras• Cronómetro de laboratorio o reloj• MicrotubosPreparación de la Prueba1. Equilibre todos los reactivos y las muestras a temperaturaambiente y realice la prueba a temperatura ambiente(22° - 26°C).2. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37°Cdurante 45 minutos.3. Cubra la mesa de trabajo con papel absorbente para serdesechado desecho biocontaminante al concluir la prueba.4. Mezcle los reactivos sacudiendo la Bandeja de Desarrollo.Nota: No retire la cubierta de aluminio de la Bandeja de Desarrollo. Sólocuando lo indiquen las instrucciones de la prueba, rompa la cubiertautilizando la punta desechable de la pipeta o el perforador.Preparación del PeinePrecaución: Para asegurar el buen funcionamiento de la prueba, notoque los dientes del Peine.1. Abra el empaque de aluminio por el borde marcado. Retire el Peine.2. Es posible utilizar todo el Peine y la Bandeja de Desarrollo o sólouna parte. Para utilizar una parte del Peine:a. Determine cuantos dientes necesita para analizar lasmuestras y controles. Necesita un diente para cadaprueba. Cada diente muestra el número de código delequipo "56", para permitir la identificación de los dientesseparados.b. Doble y rompa el Peine verticalmente o córtelo con tijeras(ver Figura 4) para desprender el número necesario dedientes (Nro. de pruebas mas 2 controles).c. Regrese la parte del Peine que no utilizó al empaque dealuminio (con la bolsa desecante). Cierre fuertemente elempaque, por ejemplo, con un clip, para mantenerloseco. Almacene el Peine en la caja original del equipo atemperaturas de 2-8°C para su uso posterior.Predilución de muestras y controles1. Vacíe 490µl de la muestra diluyente en un microtubo, para cadamuestra y control.2. Agregue a cada microtubo 10 µl de una muestra o del controlpositivo o negativo proporcionados en el equipo. Mezcle lasolución, vaciando y volviendo a llenar varias veces.Captura del anticuerpo (Fila A de la Bandeja de Desarrollo)Nota: Lleve a cabo las incubaciones a 37°C. Las etapas de lavadodeben llevarse a cabo a temperatura ambiente (22-26°C).3. Pipetee 25µl de la muestra prediluida. Perfore la cubierta dealuminio de un pocillo de la fila A de la Bandeja de Desarrollocon la punta de la pipeta o con el perforador y vacíe la muestraen el fondo del pocillo. Mezcle la solución, rellenando yvaciando varias veces. Deseche la punta de la pipeta.4. Repita el paso 3 para las otras muestras prediluídas y los doscontroles prediluídos. Utilice un nuevo pocillo de la fila A ycambie las puntas de la pipeta para cada muestra o control.5. a. Inserte el Peine (con el lado impreso hacia usted) en lospocillos de la fila A que contienen las muestras y controles.Mezcle: retire e inserte el Peine en los pocillos variasveces.b. Deje el Peine en la fila A e incube durante dos horas a37°C. Programe el reloj. Mezcle 3 veces mas (cada 30min.) durante la incubacion. Casi al final de las dos horas,perfore la cubierta de aluminio de la fila B utilizando elperforador. No abra más pocillos de los necesarios.c. Al final de las dos horas, saque el Peine de la fila A. Absorbael líquido adherido a las puntas de los dientes con un papelabsorbente limpio. No toque la superficie frontal del diente.60456002/S11/OR/CE 2

Reacción cruzadaReacción cruzada con muestras posiitivas de hepatitis causadaspor agentes tales como Antígeno de superficie de la hepatitis B,virus de la hepatitis C, VIH-1 y VIH-2 se encontraroninsignificantes.InterferenciaNo se observó interferencia en muestras hemolisadas(hemoglobina hasta 10 mg/ml), lipémicas (Colesterol hasta 281.6mg/dL; Triglicéridos hasta 381.0 mg/dL) y bilirubina alta (hasta 20mg/dl).BibliografiaBlaine H. 1991. Hepatitis A virus. In: Viral Hepatitis. (Hollinger FB,Purcell, RH, Robinson WS, Gerin JL, Ticehurst J, eds. RavenPress, New York. pp 1-37.Decker R, Ling CM, Overby L, Frösner GG, Boggs J. 1976.Serology of transmission of hepatitis A in humans. J Infect Dis139:74-82.Dienstag JL, Krugman S, Wong DC, Purcell RH. 1976.Comparison of serological tests for antibody to hepatitis A antigenusing coded specimens from individuals infected with MS-1 strain ofhepatitis A virus. Infect Immun 14:1000-1003.Duermeyer W, Van der Veen J, Koster B. 1978. ELISA inhepatitis A. Lancet 1:823-824.Frösner GG, Papaevangelou G, Butler R, Iwarson S, LindholmA, Courource-Pauty AM. 1979. Antibody against hepatitis A inseven european countries. I. Comparison of prevalence data indifferent age groups. Am J Epidemiol 110:63-69.Herrera JL. 1994. Serological diagnosis of viral hepatitis. S Med J87:677-684.Kiyasu PK, Caldwell SH. 1993. Diagnosis and treatment of themajor hepatotropic viruses. Am J Med Sci 306:248-261.Szmuness W, Dienstag JL, Purcell RH, Harley EJ, Stevens CE,Wong DC. 1976. Distribution of antibody to hepatitis A antigen inurban adult populations. N Engl J Med 295: 755-759.Zaaijer HL, Leentvaart-Kuijpers A, Rotman H and Lelie PN. 1993.Hepatitis A antibody titres after infection and immunization:Implications for passive and active immunization. J Med Virol 40:22-27.Version: 60456002/S11/OR/CE(03/2009)Leyenda de los símbolosCARDPLATECONTROL +CONTROL -DILPERFORATORCOMBSCALEImmunoComb ® tarjetaBandejas de DesarrolloControl positivoControl negativoDiluyente de la muestraPerforadorCombScale Consulte las instrucciones de usoAtención,ver instrucciones de usoIVDProducto sanitario para diagnósticoin vitroLimite de temperaturaΣnContenido suficiente para n ensayosFabricanteRepresentante autorizado en laComunidad EuropeaREFLOTNúmero de catálogoCódigo de loteFecha de caducidadNúmero de serie60456002/S11/OR/CE 4

Resumen de los Principales Procedimientos de la Prueba1 2 3 4Preincubación de la Bandeja deDesarrollo: 45 minutos a 37°CExtraer y prediluir lasmuestras y controlesAgregar muestras ycontroles prediluídos ala Fila A. Mezclar.Sacar el Peine de suempaque.5 6 7 8Insertar el Peine y mezclar en laFila A. Incubar a 37° C.Perforación de la fila BAbsorber el líquidoadherido a los dientesInsertar el Peine y agitaren la fila B. Incubar.Después de mezclar/agitar e incubar en lasfilas C, D y E …Reacción de color en laFila F9ResultadosResumen del Procedimiento de la PruebaLas instrucciones abreviadas abajo son para los usuarios experimentados en el uso del kitImmunoComb ® II HAV Ab.(Para instrucciones detalladas, favor referirse al texto completo)1. Incube la Bandeja de Desarrollo en una incubadora a 37°C durante 45 minutos.2. Prediluya 10 µl de cada muestra y control mezclando con 490 µl de diluyente de lamuestra.3. Vacíe 25 µl de cada muestra y control prediluídos en los pocillos de la fila A de laBandeja de Desarrollo y mezcle.4. Inserte el Peine en la fila A, mezcle y continúe como se describe en la tabla 1.Tabla 1. Resumen del Procedimientos de la PruebaPaso Fila Proceder como sigueCaptura de anticuerpos A Mezcle; incube 2 horas a 37°C; absorba.Lavado B Agite; incube 2 minutos; absorba.Reacción antígeno-anticuerpo C Mezcle; incube 30 minutos a 37°C; absorba.Unión del conjugado D Mezcle; incube 20 minutos a 37°C; absorba.Lavado E Agite; incube 2 minutos; absorba.Cromógeno F Mezcle; incube 10 minutos a 37°C.Detención de la reacción E incube 1 minuto; seque al aire.102Manera de romper el Peine160456002/S11/OR/CE 5