Una señal es una molécula o una propiedad física (ej. fuerza) que ...

Una señal es una molécula o una propiedad física (ej. fuerza) que influye sobre elfuncionamiento de la célula. Cada tipo celular expresa un conjunto de receptores específicos que definenla naturaleza de las señales extracelulares que pueden sensar. Las señales extracelulares son convertidas en señales intracelulares(ej. fosforilación, síntesis de segundos mensajeros, etc). Enzimas, canales y proteínas adaptadores participan en la generación y propagaciónde las señales intracelulares. Las proteínas de señalización poseen una estructura y función modular. Las vías de señalización usualmente se interconectan formando redes. En los puntos de interconexión o nodos la información es integrada. Las proteínas adaptadores o ¨scaffolds¨ ensamblan complejos de señalización. Los complejos facilitan la segregación espacial y la especificidad de la señalización. Redes de señalización regulan los diferentes sistemas moleculares funcionales de la célula,por ej. el secretor, el citoesqueleto, el involucrado en la transcripción, etc.

Señales extracelulares controlan funciones fundamentales de la célulaproliferationsurvivalapoptosisHanahan & Weinberg, Cell 2000

‣ bacterias- sensado de nutrientes (operon lac)- quimiotaxis‣ eucariotas unicelulares (levaduras, Dictyostelium)- sensado de feromonas (factores de apareamiento)- quimiotaxis‣ eucariotas pluricelulares- gran complejidad de señales (hormonas, citoquinas, adhesión, etc)

Señales reguladoras de motilidad (quimiotácticas) en bacteriasLas bacterias flageladas sensan y responden a gradientes de moléculas atractoras o repelentes.Receptores en la superficie sensan y transmiten información a moléculas que regulan la respuesta.La respuesta alterna entre movimientos direccionados (A) o al azar (B).El receptor quimiotáctico(sensor)interacciona con la histidin-quinasaCheA (transmisor) mediante la proteínaadaptadora CheW. El receptor no ocupadoo unido a un repelente induce la autofosforilaciónde CheA. CheA transfiereel fosfato a CheY (regulador). CheYfosforilado se une al motorflagelar e induce su rotación en sentidohorario. La señalización finaliza por laactividad de la fosfatasa CheZ. La uniónde una molécula atractante inhibe laactivación de CheA y favorece larotación en sentido anti-horario.transmembranechemoreceptorA: movimiento direccionado(gradiente de atractante)B: movimiento al azar(rotación en sentido horario)sentidohorariomovimiento al azarAlberts et al, BMC 2002

Señales inductoras de motilidad en neutrófilos humanosPéptidos con N-formil-metionina (fMLP) secretados por bacterias estimulan receptores acoplados a proteínas Gen la superficie de neutrófilos induciendo una respuesta quimiotáctica, y la liberación de microbicidasliberación de una pequeña cantidad deformil-Met-Leu-Phe (fMLP) con unamicropipeta.polarizaciónmigraciónhacia la fuentede péptidovideo disponible a:http://www.biochemweb.org/fenteany/research/cell_migration/movement_movies.htmlAlberts et al, BMC 2002

Señales reguladoras del apareamientoen levadurasLas células haploides de levadura secretan un factor deapareamiento específico (feromonas) a o α que estimula receptoresacoplados a proteínas G en células que secretan el factoralternativo. Esto induce la polarización de las células estimuladas yel crecimiento hacia la fuente del estímulo.no estimuladasestimuladas(polarización)Alberts et al, BMC 2002; Lodish et al, MCB 2004

Principios generales relacionados con la señalización celular‣ Síntesis de las señales‣ Liberación o exposición al medio extracelular‣ Transporte hasta la célula blanco (si se trata de una señal soluble)‣ Detección de la señal por receptores de la célula blanco‣ Respuesta celular (cambio en el metabolismo, movilidad, función, etc)‣ Eliminación de la señal y terminación de la respuesta celular

Las señales extracelulares actúan en diferentes rangos espacialesAUTOCRINEPermite coordinar la función de grupos de células,p. ej. las amebas de Dyctiostelium por el cAMP.Alberts et al, BMC 2002

Las señales extracelulares actúan en diferentes rangos temporalesminutos, horasmilisegundosseñalización endócrina- lenta- receptores de álta afinidad- hormonas en baja concentraciónseñalización sináptica- rápida- receptores de baja afinidad- neurotransmisores en áltaconcentraciónUniones en hendidura: permitenel pasaje rápido de pequeñasmoléculas señal entre célulasadyacentes. Ej: Ca++ y cAMPAlberts et al, BMC 2002

Diferentes combinaciones de señales inducen distintas respuestasen un mismo tipo celularAlberts et al, BMC 2002

Una señal puede inducir diferentes respuestasen distintos tipos celularessecreciónrelajacióncontracciónAlberts et al, BMC 2002

Las señales extracelulares estimulan receptoresde superficie o intracelularesAlberts et al, BMC 2002

La transducción de la señal puede regular procesosen el citoplasma y/o nuclearesintegrinasEGFRLas integrinas y el EGFR activan vías deseñalización que regulan la organizacióny dinámica del citoesqueleto (efectoscitoplasmáticos) y la transcripción de genesinvolucrados en el ciclo celular (efectosnucleares).Src/FAKRho/Rac/Cdc42GTPasasGrb2Rascitoesqueletode actinaErkciclinas D, c-myc

El receptor de glucocorticoides es citoplasmático y su estimulacióndirectamente regula transcripción de diversos genesEl receptor de glucocorticoides (GR) posee una estructura modular y es retenido en el citosol unido a proteínasinhibidoras. La unión a a la hormona (ej. cortisol) provoca la disociación de las proteínas inhibidoras, ladimerización del receptor y su translocación al núcleo donde activa la transcripción de numerosos genes blanco.AD: activation domainDBD: DNA Binding DomainLBD: Ligand Binding DomainLodish et al MCB 2004

Diferentes receptores pueden activar vías deseñalización intracelulares comunes

La respuesta celular máxima puede alcanzarsea concentraciones no saturantes de ligandoEsto puede explicarse en parte porque diferentes receptores pueden inducir lamisma respuesta en la célula. Por ejemplo, el glucagon, ACTH y epinefrinase unen a receptores acoplados a proteínas G que inducen la síntesis de AMPc.

El número y afinidad de receptores en la superficie puedencuantificarse empleando ligandos radioactivosLos receptores muestran una cinética de unión al ligando que es saturable (A). Por el contrario, la unión del ligando a sitiosinespecíficos (C) no es saturable dentro del mismo rango de concentración. La unión específica (B) resulta de (A) – (C).De la curva B se puede determinar el número de receptores por célula y su afinidad por el ligando (Kd). El valor de Kdrepresenta la concentración de ligando que satura el 50% de los receptores. El valor de Kd ≈ 1/afinidad.K D=[L] x [R][L-R]Alberts et al, BMC 2002

Los receptores desuperficie son dediversos tiposreceptor nicotinico

Mecanismos moleculares involucrados en la transmisión de señalesCambios alostéricos/interacciones Modificaciones covalentes co-localizaciónRasRafrasPLCγrasPLCγLodish et al MCB 2004

Molecular “switch”: Estructura de Ras unido a GDP, Sos y GTPRas presenta dos partes móviles o switches I y II. (a) El switch I interacciona con el GDP y es (b)desplazado por una alfa hélice (naranja) de Sos, facilitando la liberación del GDP. (c) El GTP interaccionacon los switches I y II y estabiliza la conformación activa.Lodish et al MCB 2004

La fosforilación/defosforilación y la unión/hidrólisis de GTP confierenpropiedades de interruptores moleculares a ciertas proteínasLos interruptores moleculares existen en dos estados: activo, en el cual transmiten la señal a otra proteína; einactivo, en el cual no transmiten señales. Ejemplos son las proteínas activadas por fosforilación o por unióna GTP. Proteína-kinasas y fosfatasas, GEFs y GAPs regulan la conversión entre estados, respectivamente.interruptores molecularesAlberts et al, BMC 2002

El recambio o “turnover” de una señalinfluye sobre el estado de estimulaciónSeñales lábiles permiten rápidos ajustes de su concentración intracelular.estímuloAestímuloBduración(min)Los gráficos muestran los cambios de concentración de moléculas señal con diferentes tasas de recambio en función del tiemposuponiendo que un estímulo disminuye (A) o incrementa (B) su tasa de síntesis por un factor de 10. En ambos casos se observaque las moléculas de mayor recambio (menor duración, en rojo) permiten el ajuste más rápido de su concentración intracelular.(min)Alberts et al, BMC 2002

En el mismo tipo celular, la diferente duración de una señalpuede contribuir a respuestas biológicas diferentesEn las células PC12, la activación breve de la MAP kinasa Erk producida por la estimulacióncon EGF induce la proliferación. En contraste, la activación persistente de Erk producida porla estimulación con NGF induce una diferenciación tipo neuronal.proliferacióndiferenciaciónMarshall, Cell 1995

La respuesta a un estímulo puede ser gradual o abruptaAEn la fase G1 de levaduras, (A) Sic1 se une e inhibe a la enzima Cdk1, la cual es necesaria para dar comienzo a la fase S.A lo largo de G1, Sic1 es gradualmente fosforilado en múltiples sitios por Cdk-ciclinas de fase G1. Al superar un umbral defosforilación al final de G1, Sic es reconocido por el complejo SCF, que lo ubiquitina y promueve su degradación. Ladegradaciónabrupta de Sic1 actúa como un “switch” que dispara la duplicación masiva del DNA (respuesta ultrasensible). En contraste(B),el factor de transcripción Gcn4 es reconocido por el complejo SCF cuando es fosforilado en un solo sitio. Esta condición permiteuna respuesta gradual en la tasa de transcripción de los genes regulados por Gcn4.BCrespuestarespuesta[s][s]Pawson, FEBSlett 2001

La unión al ligando frecuentemente provoca laagregación de receptores en la membranaLa oligomerización de los receptores de Fc y TCR estimulados induce su partición en rafts lipídicos (1)donde son fosforilados por kinasas (2). Los receptores fosforilados reclutan kinasas citosólicas adicionales(ej. Syk, ZAP) (3) que fosforilan proteínas adaptadoras (ej. LAT) (4) que amplifican la señal.macrophage ordendritic cellmast cellSecuencia que muestra la formación de una sinapsis inmunológica.péptido-MHC (verde) y la molécula de adhesión ICAM (rojo).Simons & Toomre, NRMCB2000Grakoui et al Science 1999

La agregación de integrinas induce su anclaje al citoesqueleto y laformación de complejos de señalizaciónFibras de actina (rojo) ancladas a lasadhesiones focales formadas poragregación de integrinas (verde, flechas).ligando multivalentekinasa inactivakinasa activaseñalizaciónAcumulación defosfotirosina enlos agregados deintegrinas revelala actividad dekinasas (flechas).

En las placas neuromusculares los receptores de acetilcolinase agregan y maximizan la transmisión de la señal en la sinapsisDurante el desarrollo, los terminales nerviosos de las motoneuronassecretan la glicoproteína agrina, la cual es esencial para la agregaciónde los receptores de acetilcolina (puntos rojos) en las fibras musculares.Terminales axonales de motoneuronas (verde) yagregación de receptores de acetilcolina (rojo) enlas placas terminales de las uniones neuromusculares.(Lichtman & Sanes, 2003)

La transmisión de la señal intracelular dependede proteínas con diversas funciones

Las diferentes funciones de las proteínas de señalización dependende su estructura modularMódulos de interacción y sus ligandos.hy: indica residuos hidrofóbicosPawson & Scott, Science 1997Pawson & Nash, TICB 2001

Los dominios SH2 se unen específicamente asecuencias cortas que contienen fosfotirosinaEl dominio SH2 de la kinasa Srccontribuye a la formación deuna interacción intramolecularque autoinhibe la enzima.Proteínas de señalización se unen al receptorde PDFG activo mediante dominios SH2SrcSH2La secuencia óptima de reconocimientodel dominio SH2 de Src es pYEEI

La especificidad de los diferentesdominios SH2 es determinada por lafosfotirosina y residuos adyacenteshacia el extremo carboxilopYIPLPDLas superficies de los dominios SH2 de PLCγ, Src y Grb2se muestran en azul, y los fosfopéptidos en amarillo. Lafosfotirosina se localiza a la derecha. En la PLCγ, la Ile +1del péptido encaja en un surco formado por Cys (en verde).En el SH2 de Src, esta Cys es reemplazada por Tyr (en verde)lo cual genera una superficie plana que selecciona poraminoácidos cargados en las posiciones +1 y +2. Un bolsilloformado en parte por Thr (en rojo) acomoda la cadena lateralhidrofóbica de isoleucina en posición +3. En Grb2, el lugar de laThr es ocupado por Trp (en rojo) lo cual obliga al doblado(β-turn) del fosfopéptido.pYEEIEl reemplazo de la Cys por Tyr en el dominio SH2 de la PLCγcambia la especificidad de reconocimiento, haciéndose similara la del dominio SH2 de Src. El reemplazo Thr Trp enSH2-Src cambia la especificidad hacia el SH2 de Grb2.pYVNVPawson & Nash, Genes Dev 2000

Los dominios SH3 reconocen secuencias cortas ricas en prolinasLos ligandos de los dominios SH3 (~ 60 residuos de longitud) pueden ser de dos tipos:tipo I (+xxPxxP) y tipo II (PxxPx+). El signo + representa un aminoácido básico.ArgProProtipo IItipo IModelo que ilustra dos péptidos conteniendo prolinas (en amarillo) y la topología de la región de interaccióncorrespondiente en un dominio SH3. La arginina del péptido (en rojo) interacciona con aminoácidos ácidosdel dominio SH3 (en azul). Las prolinas se acomodan en surcos del dominio SH3 (en verde).

Los dominios PDZ interaccionan con motivos delterminal carboxilo de numerosas proteínasLos dominios PDZ (~ 90 residuos de longitud) reconocen secuencias de 3 aminoácidos en el terminal carboxilode las proteínas blanco. Se encuentran en varias proteínas de “scaffold” que organizan la post-sinapsis.algunos dominios PDZ unenla secuencia Ser/Thr-X-ɸ oɸ-X-ɸ en la proteína blanco.Superficie del dominio PDZ de la proteína de “scaffolding” PSD-95 y el péptido KQTSV (enrojo). Las regiones de la superficie que contactan el péptido se muestran en colores.Lodish et al MCB2004

Los dominios PH (¨Plectrin homology¨) permiten la asociación deproteínas de señalización con la membrana plasmáticaLos dominios PH reconocen fosfoinosítidos fosforilados localizados en la hemicapa citosólica de la membranaplasmática. Ejemplos de proteínas con dominios PH son la PLC, Akt, dinamina, Sos, BARK, etc.ABVisualización de la relocalización de la GFP fusionada a un dominio PH como consecuencia de la estimulación de laenzima PI3K que produce PIP3 en la membrana. La flecha indica la acumulación de la proteína-PH-GFP en la superficie.

Las proteínas adaptadoras exhiben varios módulos de interacción yacoplan a los receptores con vías de señalización específicasGrb2 es una proteína adaptadora que acopla elreceptor activado del EGF con Sos en la vía deseñalización de ras-MAPK. Para ello emplea undominio SH2 y dos dominios SH3.rasGDPrasGTPGDPactivaciónde MAPK

La proteína adaptadora Grb2 puede acoplar un receptor activofosforilado en tirosina, con múltiples vías de señalización

Las proteínas de “scaffolding” organizan ensambles molecularesen subdominios celulares, facilitando la transmisión de la señalEn la pre-sinapsis, las proteínas adaptadoras Piccolo y Bassoon organizan una región especializada de la membranapre-sináptica donde las vesículas sinápticas se anclan y estan listas para fusionarse a la membrana plasmática (zona activa).En la post-sinapsis, la proteína adaptadora PSD-95 contribuye al ensamble de la densidad post-sináptica (PSD).pre-sinapsispost-sinapsisSV, vesículas sinápticas; VGCC, canales de calcio activados por voltaje; NMDAR, AMPAR, mGluR, son receptores deneurotransmisores en la postsinapsis.Li & Sheng, NRMCB 2003

La proteína de anclaje “scaffold” PSD-95 contribuye al agregadode receptores de neurotransmisores en la post-sinapsisMediante dos dominios PDZ y un dominio SH3, la proteína PSD-95 ancla receptores diferentes y proteínasde señalización en la post-sinapsis. Mediante el dominio de guanilato kinasa (GuK), PSD-95 ancla elcomplejo al citoesqueleto de actina, a través de un puente formado por ankirina y otras proteínas.Los dominios PDZ se encuentran en mas de 600 proteínas. Se unen a secuencias cortas (~ 3-5 aa) del carboxilo terminal denumerosos receptores y canales. Algunos dominios PDZ reconocen la secuencia Ser/Thr-X-Φ, donde Φ es un residuo hidrofóbico.

Proteínas de scaffold facilitan el ensamble de complejosde señalización específicosEn células de mamíferos las proteínas deandamiaje JIP y Ksr coordinan la activaciónde la MAP kinasa JNK y Erk, respectivamente.En levaduras las proteínas de andamiaje Ste5 y Pbs2 organizan víasde señalización en respuesta a estímulos diferentes. Ste5 recluta unacombinación de proteínas involucradas en la respuesta de apareamientomientras que Pbs2 organiza la respuesta al estrés hiperosmótico.activación por estrés (ej. ER),citoquinas (TNF), etc.activación por factoresde crecimiento (ej. EGF).RafMEKKsrMAPKKKMAPKK(MAPK)(MAPK)Erk(MAPK)(MAPK)fosforilación de c-juny activación de larespuesta al estrés.Pawson & Nash Genes Dev 2000fosforilación de Rsky TCF. Activación dela proliferación.programatranscripcionalque activa elapareamimento.programatranscripcionalde respuesta alestrés hiperosmótico.Lodish et al MCB 2000

RECEPTORES ACOPLADOS APROTEÍNAS G Y SUS EFECTORESLos receptores acoplados a proteínas G constituyen la familia mas numerosa demoléculas de señalización,con ~ 1.000 genes (de ~ 30.000) en el genoma humano.Incluye receptores para numerosas hormonas y neurotransmisores, receptores deluz (rodopsinas) y de olor. Respecto de las proteínas G, el genoma humanocodifica 27 subunidades G α , 5 G β y 13 G γ .proteínas G heterotriméricas βγαα s estimula la adenilato ciclasaα i inhibe la adenilato ciclasaα q activa la fosfolipasa Cβα 12/13 regula canales de Na + /K +

Diferentes proteínas G acoplan el receptor a efectores específicos que pueden serenzimas o proteínas que forman un canal iónicoG α Subclass*EffectAssociated EffectorProtein2nd MessengerG s(activación)Adenylyl cyclaseCa 2+ channelcAMPCa 2+G i(inhibición)Na + channelChange inmembrane potentialAdenylyl cyclasecAMPK + channelChange inmembrane potentialCa 2+ channelCa 2+G q Phospholipase CβIP 3 , DAGG oPhospholipase CβIP 3 , DAGCa 2+ channelCa 2+G t cGMPphosphodiesterasecGMPG bγPhospholipase CβIP 3 , DAGAdenylyl cyclasecAMP* A given G α may be associated with more than one effector protein. To date, only onemajor G sα has been identified, but multiple G qα and G iα proteins have been described. Insome cases (not indicated in this table) effector proteins are regulated by coincidentbinding to G a and G bγ .KEY: = stimulation; ? = inhibition. IP 3 = inositol 1,4,5-trisphosphate; DAG = 1,2-diacylglycerol.

La activación de la proteína G modula la actividad de un efectorLa proteína G trimérica αβγ inactiva esta unida a GDP y se asocia a la membrana mediante ácidos grasos.La interacción de una subunidad Gα con receptores activos (1, 2) inducen un cambio conformacional quefacilita el intercambio del GDP por GTP y su disociación del complejo Gβγ (3). La conformación de lasubunidad Gα-GTP le permite interaccionar y regular la actividad de un efector (4). La hidrólisis del GTPinduce la disociación de Gα del efector y la inactivación del efector (5).Lodish et al MCB2004

Tipos de segundos mensajerosLa unión del ligando (primer mensajero) al receptor acoplado a proteínas G promueve el incremento(o disminución) en la concentración de moléculas de vida media corta denominados segundos mensajeros.activa PKAactiva PKG y abrecanales catiónicosen bastones de la retinaactiva PKCabre canales decalcio en el RECa 2+controla la actividadde kinasas, fosfatasas

La subunidad G αs activa la adenilato ciclasa y estimula la síntesisde cAMP a partir de ATPDiagrama de la estructura de la adenil ciclasa de mamíferossíntesis del cAMP

Toxinas bacterianas modifican irreversiblemente proteínas G queactivan la AC (ej. toxina del cólera)CFTR. El canal seabre cuando eldominio regulador (R)es fosforilado por PKAy el dominio de unión anucleótido (NBD) hidrolizael ATP unido.Cholera toxinGαsAdenilatoCyclasecAMPPKACFTREn células intestinalesproduce una pérdida deNa + and Cl -CFTR: Cystic Fibrosis TransmembraneConductance Regulator

El cAMP activa la proteína-kinasa A (PKA)La PKA es una kinasa citosólica que fosforila residuos Ser/Thr dentro de la secuencia: X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/Thr)-Φ. En su estado inactivo es un tetrámero con dos subunidades reguladoras y dos catalíticas.Se han descripto 4 subunidades R (RIα, RIβ, RIIα, RIIβ) y 3 subunidades C (α, β, γ). Las subunidades Rmantienen inhibida la enzima e interaccionan con AKAPs. La unión del cAMP a las subunidades R ocurrede manera cooperativa e induce la disociación de las subunidades catalíticas en su forma activa.RRCCLa actividad de fosfodiesterasas degrada el AMPc y por lo tanto inhibe la activación de PKA.AKAPs: A-Kinase Anchoring ProteinsAlberts et al, BMC 2002

La activación de la PKA puede visualizarse en la célula viva mediante FRETFRET: Fluorescence Resonance Energy TransferEl biosensor de FRET consta de la YFP,un péptido substrato de la PKA, un dominiode unión al substrato fosforilado en serina(14-3-3), y la CFP. Para medir el FRET, lascélulas se iluminan con una luz que excita a laCFP (433 nm) y se registra la emisión de luzde la YFP (527 nm).no FRETexcitación433 nm emission emisión476 nmSFRETemisiónexcitación433 nmArg/Lys-rich siteRespuesta celular del biosensor. Observe el cambio en la relación YFP/CFP cuando se agregauna droga (Fsk) que activa la adenilato ciclasa (representada por transición de color azul al rojo).Esta activación es abolida cuando la serina del substrato se reemplaza por alanina (S475A).escala que representalos valores de YFP/CFPcon diferentes colores.Zhang et al PNAS 2001

La actividad de PKA es restringida espacialmente porproteínas de anclaje “scaffold” denominadas AKAPsLas AKAPs (A-kinase anchoring proteins) son una familia de proteínas de “scaffold” que retienen la PKA ensubcompartimientos celulares específicos, restringiendo espacialmente la actividad de la enzima. Laconcentración de cAMP y la activación de PKA es limitada por la acción de fosfodiesterasas (PDE).Representación de un complejo de señalizaciónformado por una AKAP típica. Una región de laAKAP (1) interacciona con las subunidadesR de la PKA, otro dominio (2) retieneel complejo a una estructura citoplasmáticaespecífica (ej. centrosoma, membrana del Golgi,etc) y otros sitios (3) se asocian con fosfatasaso kinasas implicadas en la vía de señalización.

La PKA regula diferentes procesos dependiendo del tipo celular(ej. metabolismo del glucógeno en hepatocitos y miocitos)glucagonGCPRACactiveglicógenosintasainactivecAMPfosfatasaactivePKAinactiveactiveinactiveLodish et al MCB2004

Las subunidades catalíticas de la PKA se translocan al núcleo yestimulan la transcripción de diversos genesLa subunidad C activa entra al núcleo pordifusión. En el núcleo su actividad termina porla unión de un inhibidor y es exportada al citosol.Los genes regulados por vías de señalizacióndependiente de cAMP poseen en su promotorun sitio CRE. PKA fosforila el factor detranscripción CREB nuclear, promoviendo suasociación con el coactivador CBP/P300 y elensamble del complejo de transcripción queregula la expresión de genes blanco(ej. somatostatina).CRE: c-AMP Response ElementCREB: CRE BindingCBP: CREB Binding ProteinLodish et al MCB2004

Los procesos de señalización vía cascadas de fosforilación amplificanla señal extracelular inicial en varios órdenes de magnitudLodish et al MCB2004

La subunidad Gαq activa la enzima fosfolipasa C, isoforma β, quecliva PIP2 y produce los mensajeros secundarios IP3 y DAGIP3: Inositol 1,4,5-triphosphateDAG: diacyl glycerolAlberts et al, BMC 2002

Reacción catalizada por la enzima PLCβ y γLa PLCβ/γ corta el PIP2 antes del grupo fosfato (flecha). La isoforma γ de la PLC se asocia areceptores tirosina-kinasa de transmembrana como por ejemplo el EGFR (ver mas adelante).PLC-β y γAlberts et al, BMC 2002

El IP3 induce un aumento del calcio citosólicoEl IP3 es una molécula soluble que se uney abre canales de calcio en la membranadel RE (2), facilitando el movimiento decalcio del RE al citosol (3). El calcio actúacomo un mensajero secundario reclutandola PKC a la membrana plasmática (4)donde es activada por el DAG (5). La PKCfosforila varias enzimas y receptoresmodulando su actividad (6). La deplecióndel calcio del RE estimula el influjo decalcio extracelular (7).(6) Uno de los substratos de la PKC es la glycógeno sintasa,la cual es inhibida por la PKC. La PKC fosforila factoresde transcripción que estimulan la proliferación.Lodish et al MCB2004

El DAG y el calcio son requeridos para activar la PKCEl DAG y el calcio son requeridos para la asociación de la PKC a la membrana plasmática y para su activación.El dominio C2 de la PKC requiere de calcio para su interacción con los fosfolípidos de la membrana. Losdominios C1 interaccionan con el DAG de la membrana. La asociación de la PKC a la membrana induceun cambio conformacional que desplaza el pseudo-substrato del sitio activo permitiendo la catálisis.Existen numerosas isoformas de PKC implicadas en la regulación de diversos procesos celulares. La PKCfosforila e inhibe receptores acoplados a proteínas G y al EGFR, otras isoformas activan la vía de la MAPK, etc.

La concentración de calcio citosólico es rápidamenteajustada a niveles basalesLa concentración de calcio libre en el citosol es mantenida por debajo de 200 nM. En este procesointervienen proteínas transportadoras de calcio de la membrana plasmática, RE y mitocondrias.Exportación de calcio al medio extracelular.Alberts et al MBC 2000

Calmodulina es una proteína citosólica que une calcioy modula la actividad de varias enzimascalmodulinaUn aumento de Ca++ >500 nM induce su unión cooperativa a calmodulina.Cuatro iones calcio se unen por molécula de calmodulina. El complejo exhibeuna conformación activa que le permite interaccionar y activar diversas enzimas.proteína efectoraej. CaMK IILas kinasas activadas por complejos calmodulina-calcio seconocen como CaM kinases. Ejemplos:-MLCK MLC contracción actino-miosina- fosforilasa kinasa glucogenólisis-CaM-KII tyrosine hydroxylase catecolaminas (Adr, DA, etc)otras enzimas activadas por calmodulina-Ca++ son:- cAMP fosfodiesterasa 5´- AMP-Ca 2+ -ATPasa disminución del Ca 2+ citosólico- calcineurina NFAT- NO sintasa NO (nitric oxide)

El óxido nítrico (NO) es un gas que actúa como señalEl NO es un mediador local (acción paracrina) que difunde a través de la membrana y se une y activaproteínas receptoras intracelulares con actividad de guanilato ciclasa. El cGMP formado activa la PKG yesta inhibe la interacción actina-miosina promoviendo la relajación de la célula muscular.Lodish et al MCB2004

Las variaciones espacio-temporales en la concentración de calciointracelular pueden ser visualizadas en células vivasEl compuesto fluorescente Fura-2 permitedeterminar los niveles de calcio intracelular.El pico de excitación varía si no tiene unido(360nm) o si tiene unido (340nm) calcio. Elgráfico muestra que el rango de mediciónútil es entre 0-1 μM. Las medicionesexpresan los cocientes de emisión a 510nmcuando el compuesto es excitado con luz de340 y 380nm.expectro de excitación de Fura-2Gradiente de concentración de calcio(rojo max., azul mín) en dendritas deuna neurona de Purkinje estimulada.dendritassomaaxónLa secuencia muestra la propagación de un pico de calcio intracelular como consecuencia de la estimulación dereceptores acoplados a proteínas Gαq. Los máximos niveles de calcio se muestran en anaranjado y los mínimos en azul.Biochemistry, Berg, Tymoczko, Stryer

célula bastónde la retinaLa rodopsina es un receptor de luz acoplado a proteínas GτGτ activa una cGMP fosfodiesterasa asociada a los discos membranosos del segmento externo.rodopsinaEn obscuridad canales catiónicos regulados por cGMPpermiten la entrada de Na+ y Ca2+ y la depolarizaciónparcial de la membrana. La activación de rodopsina porluz induce la degradación del cGMP , el cierre de loscanales catiónicos y la hiperpolarización de la membrana.hiperpolarizaciónLodish et al MCB2000

Una misma señal puede inducir respuestas diferentesLa acetilcolina induce la relajación del músculo cardíaco (A) y la contracción del músculo esquelético (B).En las células cardíacas, la acetilcolina estimula receptores muscarínicos, los cuales activan unaproteína G que provoca la apertura de canales de potasio y la hiperpolarización de la membranaplasmática, disminuyendo la contracción. En la célula muscular esquelética la acetilcolina estimulareceptores nicotínicos los cuales facilitan la entrada de Na + , la depolarización y contracción.A. músculo cardíaco B. placa neuromuscularRelajaciónContracciónLodish et al MCB2004

Las proteínas tubby responden a la activación de receptoresacoplados a proteínas G α0 y G αqTubby es una familia de factores detranscripción asociados a fosfoinosítidosfosforilados (ej. PIP2) en la membranaplasmática. Hormonas que estimulanreceptores asociados a G 0y G qactivan laPLC y la hidrólisis del PIP2 (1). Estoprovoca la disociación de Tubby y sutranslocación al núcleo donde regula latranscripción.Lodish et al MCB2004

La estimulación prolongada de receptores acoplados a proteínas Gatenúa la respuesta del receptor (desensibilización).Los receptores pueden desensibilizarse por:• fosforilación (PKA, PKC, GRK).• internalización (β-arrestinas).• degradación en lisosomas.reversibleirreversibleMecanismos adicionales que terminan la señalización iniciada por receptoresacoplados a proteínas G involucran la estimulación de la hidrólisis del GTPde la proteína G, lo cual puede ser mediado por los mismos efectores o porproteínas RGS (Regulator of G protein Signaling).

Desensibilización de receptores por fosforilaciónLa activación prolongada de PKA, PKC, etc. provoca la fosforilación inespecífica de receptoresasociados a subunidades Gα (desensibilización heteróloga). En contraste, las kinasas GRK seactivan por, y fosforilan solo a receptores activos. Por ej. la GRK BARK es activada por el receptorβ-adrenérgico estimulado al cual fosforila y desensibiliza (desensibilización homóloga).PPP PPPP PdesensibilizaciónheterólogadesensibilizaciónhomólogaGRK: G-coupled Receptor Kinases

Las Beta arrestinas se unen a los receptores fosforilados y contribuyen asu desensibilización y eventualmente a su degradaciónLas arrestinas unidas a los receptores fosforilados bloquean la asociación y activación de lasubunidad Gα. Las β-arrestinas además interaccionan con AP2 y clatrina promoviendo laendocitosis y la disminución del número de receptores en la superficie. Los receptoresinternalizados son defosforilados y reciclados a la superficie o degradados en los lisosomas.Lodish et al MCB2004

RECEPTORES ASOCIADOS AKINASAS CITOSÓLICAS‣ receptores de citoquinas (interferon, eritropoietina, interleukinas)‣ receptores de adhesión (caderinas, integrinas, CAMs)‣ receptores de células T (TCR)citoquinas: son una familia de proteínas extracelulares que regulan el crecimiento ydiferenciación de tipos celulares específicos, particularmente del sistema hematopoyéticoe inmune. Ej. Eritropoietina maduración de eritrocitos; IL2 proliferación de células T

La estimulación de varios receptores de citoquinas activanlas tirosín-kinasas asociadas JAKsJAK se asocia constitutivamente a varios receptores de citoquinas. En ausencia de estimulación la actividad deJAK es basal. La estimulación de los receptores provoca su dimerización y facilita la autofosforilación de JAK,lo cual a su vez incrementa su actividad. JAK activa fosforila tirosinas en el dominio citosólico del receptor.(Ej. EpoR, prolactin R)JAK: JAnus Kinase o Just Another KinaseLodish et al MCB2004

JAK fosforila a los factores de transcripción STATslos cuales se translocan al núcleo y regulan transcripciónLa proteínas STAT citosólicas se unen al receptorfosforiladoa través de su dominio SH2. En el complejo, STAT esfosforilada por JAK, evento que induce su disociación delreceptor, y la formación de homodímeros medianteinteracciones SH2-fosfotirosina recíprocas. La formadimérica STAT expone una NLS y se transloca al núcleodonde activa la transcripción de varios genes blanco.STAT: Signal Transducers and Activators of TranscriptionLodish et al MCB2004

La estimulación de receptores usualmente activavarias vías de señalización paralelasLa activación del receptor de eritropoyetina activa 4 vías de señalización paralelasque regulan la transcripción de diferentes grupos de genes. La consecuencia de estaseñalización es la amplificación y diferenciación de precursores de eritrocitos.Lodish et al MCB2004

Fosfatasas y SOCS terminan la actividad de los receptores de citoquinasUn mecanismo rápido (defosforilación) y otro mas lento (síntesis de SOCS)controlan la duración de la señalización intracelular inducida por citoquinas.SHP1 es una fosfatasa de tirosina que estáautoinhibida en el citosol. La fosforilacióninducida por estimulación recluta SHP1 a lamembrana e induce su activación ydefosforilación de JAK. PTP1B es otra fosfatasaque defosforila JAK2 y también STATs.La expresión de las proteínas SOCS esinducida por STATs. SOCS se unen a travésde dominios SH2 a las fosfotirosinas de JAKy del receptor. Las proteínas SOCS tambiénposeen dominios que reclutan E3 ubiquitinaligasa y promueven la degradación de JAKsy los receptores en los proteosomas.SOCS: Suppresor Of Cytokine SignalingLodish et al MCB2004

La estimulación de receptores de adhesión activan lastirosín-kinasas citosólicas FAK y SrcSrc y FAK se autofosforilan en respuesta ala estimulación de integrinas. Src y FAKactivan vías de señalización quepromueven 1) proliferación a travésde la vía de Ras y la MAPK; 2) inhibenla apoptosis a través de la vía de PI3K yAKT; y 3) promueven la migracióncelular a través de la activación de las rhoGTPasas (rho, rac y Cdc42).Varias fosfatasas, ej. Csk ySHP2 defosforilan e inhibena Src y FAK, respectivamente.(ver también figura 17)Csk SHP2(-) (-)integrinas Src FAK Grb2 Sos RasCooper, Biol Cel 2nd Ed

La estimulación de receptores multi-subunidades del sistema inmuneinduce la activación de kinasas de SrcLa estimulación de los receptores de Fc (FcR) y de células T (TCR) induce su partición en rafts lipídicos (1) y su fosforilaciónpor kinasas de la familia de Src (Lyn, Lck, Fyn) (2). Los receptores son fosforilados en motivos con tirosina de acuerdo ala secuencia consenso [YxxI/L (7-8 aminoacidos) YxxI/L]. Estos motivos se conocen como ITAM (ImmunoreceptorTyrosine-based Activation Motif) y se encuentran en varios receptores con múltiples subunidades del sistema inmune.Simons & Toomre, NRMCB2000

RECEPTORES CON ACTIVIDADENZIMATICA INTRINSECA‣ receptores con actividad de tirosín kinasa (ej. EGF, NGF, Ephrins)‣ receptores con actividad de Ser/Thr kinasa (ej. TGFβ)Los receptores con actividad de tirosín kinasa, RTKs, poseen un dominio extracelular que une alligando y un dominio intracelular que posee la actividad catalítica. Los ligandos de los RTKs sonpéptidos/proteínas que se encuentran solubles o asociados a la membrana de plasmática.

El genoma humano codifica para ~ 58 receptores de transmembranacon actividad de tirosín-kinasa agrupados en 20 familiasHunter, Nature 2001

La unión del ligando al dominio extracelular induce la activación yautofosforilación del dominio tirosín-kinasa citosólicoLos receptores existen en un estado monomérico con actividad de tirosín-kinasa basal (1). La unión del ligando provoca ladimerización y autofosforilación del receptor (2). La autofosforilación activa el dominio catalítico el cual fosforila variastirosinas del dominio citosólico, generando sitios de unión para proteínas de señalización con dominios SH2 o PTB (3).SH2dimerización y autofosforilaciónde Tyrdel dominio catalíticofosforilación detirosinas adicionalesLodish et al MCB2004

La asociación de distintas moléculas de señalización al receptor fosforiladopermite la diversificación de la señal intracelularEl EGFR fosforilado induce el reclutamiento de varias moléculas de señalización. La fosfolipasa Cγ, la tirosín kinasa c-Ably las proteínas adaptadoras Grb2 y Shc se unen a fosfotirosinas específicas del receptor mediante dominios SH2 y PTB.PLCγpYC-AblpYGrb2 Grb2 ShcPLCγpY pY pY pYdominioextracelular992 1045 1068 1086 1148 1173dominio intracelularmembrana

Fosfatasas defosforilan y desensibilizan al receptorLa PTP1B es una fosfatasa de tirosina que defosforila al EGFR, IR y a otros receptores con actividad tirosín-kinasa.EGFRPTP1BpYpYpY pY pY pYdominioextracelular992 1045 1068 1086 1148 1173dominio intracelularmembrana

La endocitosis es otro mecanismo que termina con la señalizaciónEn ausencia de ligando, el EGFR se endocita con una cinética relativamente lenta. La unión del EGF al receptor incrementaen 5-10 veces la velocidad de endocitosis. Aproximadamente un 50% del complejo EGF-EGFR es derivado a lisosomas.recicladodegradaciónLa degradación de los receptoresdisminuye transitoriamente lacapacidad de las células pararesponder al estímulo extracelular.

Ciertos receptores tirosín-kinasa fosforilados reclutan y activan la PLCγLa fosfolipasa Cγ se une al receptor fosforilado mediante dominios SH2. El receptor activo fosforila yactiva la PLCγ promoviendo la síntesis de los segundos mensajeros IP3 y DAG a partir de PIP2.Estructura modular de la PLCγCooper, Biol Cel. 2002

La PLCβ y PLCγ catalizan la formación de IP3 y DAGLa PI-3K cataliza la fosforilación de fosfoinosítidos en posición 3PTEN PTEN PTEN

La PI-3K se une a receptores tirosina-kinasa autofosforiladosy permite la activación de AKTLa PI-3K (Phosphoinositido-3 kinase) es activada en la membrana plasmática donde es reclutada mediante interaccionespY-SH2. PI-3K fosforila fosfolípido-inositoles en posición 3. Los productos PI(3,4)P2 y PI(3,4,5)P3 son reconocidos pordominios PH (pleckstrin homology) en proteínas de señalización (ej. PDK1 y PKB = Akt).SH2PTEN(fosfatasa)mutaciones de PTENpromueven el desarrollode cáncerPDK1: Phoshoinositide-Dependent Kinase-1PKB/Akt: Protein Kinase B/producto del oncogen v-aktAlberts et al MBC 2000

La activación de la kinasa PKB = Akt ocurre en la membranaEn células no estimuladas PKB existe en el citosol en una conformación inactiva, estabilizada por la interaccióndel dominio PH con residuos del dominio catalítico. La estimulación de receptores que activan la PI-3K permite lasíntesis de PI(3,4)P2 y PI(3,4,5)P3 los cuales sirven de sitio de anclaje para los dominios PH de PKB y PDK1.PKB es activada por el cambio conformacional del dominio pH y por la fosforilación mediada por PDK1.PI-3KLodish et al MCB2004

El receptor de insulina disminuye la glucosa sanguíneamediante una vía que involucra a PI-3KAdipocitos transfectadoscon GLUT4-GFP. Note latranslocación a la membranadespués de la estimulación.+Saltiel & Kahn Nature 2001

Varios receptores con actividad de tirosina kinasaactivan la GTPasa ras y la vía de la MAPK ErkLa unión de Grb2 y Sos acoplael receptor a Ras inactivoLa unión del ligando provoca ladimerización y autofosforilaciónde los receptoresSos promueve el intercambiodel GDP por GTP en Ras.Ras-GTP activo se disocia de SosLodish et al MCB2004

Ras es activado en la membrana plasmáticaRas se ancla a la membrana por ácidos grasos agregados post-traducción. Mutantesde ras que no pueden anclarse a la membrana son incapaces de activar al efector Raf.membranecytosol

Ras activa una cascada de Ser/Thr kinasas que incluye la MAP kinasa Erk1. La activación de ras (ras-GDP ras-GTP) recluta a raf a la membrana2. En células no estimuladas, Raf existe en una conformación inactiva en el citosol,estabilizada por proteínas 14-3-3. La unión de Raf a ras-GTP induce un cambioconformacional en Raf que es crítico para la activación del dominio kinasa3. Raf activo fosforila y activa a MEK4. MEK es una kinasa dual que fosforila y activa a la MAPKen organismos multicelulares existen 3 subfamilias de MAPKs:- Erk ("Extracellular regulated kinases")- JNK ("c-Jun N-terminus kinase")- p38Lodish et al MCB2004

La activación de la MAP kinasa requiere de la fosforilación dualde una treonina y una tirosina en el lóbulo catalíticoLodish et al MCB2004

La MAPK activa se transloca al núcleo y activafactores de transcripción nuclearesLa MAPK Erk activa forma un dímero que fosforila la kinasap90RSK en el citosol. Ambas kinasas activas se translocanal núcleo donde fosforilan y activan factores de transcripción.Erk activa TCF (¨Ternary Complex Factor¨) y pp90RSKactiva el factor de transcripción SRF (¨Serum ResponseFactor¨). Ambos, TCF y SRF fosforilados forman un complejotrimérico que se une a secuencias de DNA que estimulan laexpresión de genes como por ej. c-Fos y c-Jun.

La regulación extracelular de diferentes procesos fundamentales enS. cerevisiae es mediada a través de distintas MAP kinasasAlberts et al MBC 2002

Proteínas adaptadoras facilitan el ensamble de complejosde señalización que activan MAP kinasas específicasEn células de mamíferos las proteínasadaptadoras JIP y Ksr coordinan la activaciónde la MAP kinasa JNK y Erk, respectivamente.En levaduras las proteínas adaptadoras Ste5 y Pbs2 organizan víasde señalización en respuesta a estímulos diferentes. Ste5 recluta unacombinación de proteínas involucradas en la respuesta de apareamientomientras que Pbs2 organiza la respuesta al estrés hiperosmótico.activación por estrés (ej. ER),citoquinas (TNF), etc.activación por factoresde crecimiento (ej. EGF).RafMEKKsrMAPKKKMAPKK(MAPK)(MAPK)Erk(MAPK)(MAPK)fosforilación de c-juny activación de larespuesta al estrés.Pawson & Nash Genes Dev 2000fosforilación de Rsky TCF. Activación dela proliferación.programatranscripcionalque activa elapareamimento.programatranscripcionalde respuesta alestrés hiperosmótico.Lodish et al MCB 2000

Kinasas y GTPasas integran señales de distintos receptoresFAKSrcintegrinasPDproliferación, apoptosis, diferenciación, n, metabolismo, etcAlberts et al MBC 2002, modific

Los receptores de TGF-β son Ser/Thr-kinasas que directamenteactivan factores de transcripción citosólicos (Smads)TGF: Transforming Growth FactorEl receptor de TGF-β consiste de tres proteínas de transmembrana, RI, RII y RIII. RIII es un proteoglicano que se une y concentrael TGF-β en la membrana (1a). RI y RII tienen un dominio de Ser/Thr kinasa en su región citosólica; RII esta siempre activa. Launión del TGF-β a RII y RIII (1a y 1b) induce la formación del trímero RI/RII/RIII lo cual permite la fosforilación y activación de RIpor RII (2). RI fosforila a una R-Smad (3) la cual expone una NLS y forma un complejo con Smad4 y con β-importinas (4). Elcomplejo se transloca al núcleo (5) donde se asocia al factor de transcripción TFE3 (7) y regula la transcripción de genes blanco.La fosforilación del dominio MH2 de R-Smad por RI provocasu disociación de MH1 y la exposición de una NLS.Lodish et al MCB2004expresión de genes anti-proliferativos (inhibidores deproteasas, inhibidores de Cdks), supresión de c-myc.

Algunas vías de señalización involucran eventos proteolíticos. Ej. NF-κBEl NF-κB es un factor de transcripción heterodimérico expresado en la mayoría de las células, y que normalmente estasecuestrado en el citosol por el inhibidor I-κBα. Citokinas inflamatorias como el TNFα e interleukina-1 estimulan receptoresque activan kinasas citosólicas (TAK1 (1)). TAK1 fosforila y activa una kinasa (2a) que fosforila al inhibidor I-κBα (3).El I-κBα fosforilado es substrato de una E3 ubiquitina ligasa que lo marca para su degradación en el proteasoma (4, 5).El NF-κB libre (6) expone una NLS que media su translocación al núcleo donde activa numerosos genes.Lodish et al MCB2004

La proteólisis de Notch genera un fragmento proteico que contribuye aespecificar el fenotipo celular durante el desarrolloNotch y Delta son proteínas de transmembrana involucradas en un mecanismo de diferenciación celular denominado¨inhibición lateral¨ en el cual células adyacentes equivalentes (a) adquieren fenotipos diferentes (b). La interacción de losdominios extracelulares de Notch y Delta (1) activa la proteólisis de Notch por proteasas asociadas a la membrana (2). Elfragmento intracelular de Notch (3) se transloca al núcleo e inactiva la expresión de genes proneurales.progenitor neuralLodish et al MCB2004

La proteólisis de β-catenina es inhibida por la estimulaciónmediada por WntEn ausencia de estimulación β-catenina es reclutada en un complejo con axina y APC en el cual es fosforilada por la kinasaGSK-3β. El residuo fosforilado es reconocido por una E3 ubiquitina ligasa que marca la β-catenina para su degradación en elproteosoma. El factor extracelular Wnt estimula al receptor frizzled (B), y activa una vía que inhibe la GSK-3β, permitiendo laacumulación de β-catenina en el citosol y su translocación al núcleo donde regula la expresión de genes.proteasomadegradation

Sistema de señalización en plantasRespuesta al etilenoEl etileno es un gas que actúa como un importante factor regulador del crecimiento en plantas. Los receptores de etilenoposeen actividad de histidin-kinasa en su dominio citosólico. En ausencia de etileno la kinasa es activa y se autofosforila enhistidina. El fosfato luego es transferido a un aspártico en otra región del receptor. El receptor fosforilado activa una cascada dekinasas similar a la de la MAPK que inhibe la transcripción de genes activados por el etileno. La unión del etileno al receptorinactiva esta señalización y promueve la expresión génica.

Sistema de señalización en plantasSensado de luzLos fitocromos median el crecimiento y desarrollode las plantas en respuesta a luz roja.Las fototropinas optimizan el proceso defotosíntesis regulando el fototropismo,apertura de estomas y localización decloroplastos. Son Ser/Thr kinasas asociadasa membranas, los dominios LOV sensan laluz a través de FMN.Los receptores de luz mas estudiados en plantas son los fitocromos. Losfitocromos son Ser/Thr-kinasas diméricas que se activan con luz roja y seinactivan con luz roja (600-800 nm). La activación resulta de suautofosforilación. Los fitocromos activos se translocan al núcleo dondeinteraccionan con otras proteínas y regulan la transcripción. Loscriptocromos y fototropinas son otros fotosensores proteicos queresponden a la luz azul (320-500 nm).Kimura & Kagawa 2006