Degradación de pared celular en frutillas. Análisis de ... - IIB-INTECH

Universidad Nacional deGeneral San MartínTesis para optar por el Título de Doctor en Biología Molecular yBiotecnología de la Universidad Nacional de General San MartínDegradación de pared celular en frutillas. Análisis desus componentes, evolución de la actividad enzimática yexpresión de genes asociadosHernán Guillermo RosliDirector: Dr. Gustavo Adolfo MartínezCo-director: Dr. Pedro Marcos CivelloIIB-INTECH (Chascomús)Diciembre de 2007

ÍNDICEI. INTRODUCCIÓN....................................................................................................11. Historia........................................................................................................................22. Generalidades ..............................................................................................................33. Maduración de frutos....................................................................................................53.1. Actividad respiratoria.........................................................................................63.2. Pigmentos.........................................................................................................73.3. Azúcares y ácidos simples ..................................................................................83.4. Compuestos volátiles .........................................................................................84. Regulación de la maduración ........................................................................................95. Pared celular.............................................................................................................. 125.1. Componentes de la pared celular ..................................................................... 125.1.1 Celulosa................................................................................................ 125.1.2. Hemicelulosas ...................................................................................... 135.1.3. Pectinas............................................................................................... 145.1.4. Proteínas estructurales ......................................................................... 175.2. Disposición espacial de los componentes de la pared celular .............................. 175.3. Interacciones entre los distintos componentes de la pared celular ...................... 185.4. Cambios en la pared celular durante la maduración........................................... 215.4.1. Depolimerización de poliurónidos .......................................................... 215.4.2. Pérdida de galactanos y arabinanos....................................................... 225.4.3. Demetilación de pectinas ...................................................................... 225.4.4. Solubilización de pectinas ..................................................................... 235.4.5. Depolimerización de hemicelulosas........................................................ 235.4.6. Depolimerización de celulosa................................................................. 245.4.7. Síntesis de componentes de pared ........................................................ 246. Proteínas de modificación de la pared celular ............................................................... 256.1. Poligalacturonasas........................................................................................... 256.2. Pectin metilesterasas ....................................................................................... 256.3. Pectato liasas.................................................................................................. 266.4. Xiloglucano endotransglicosilasas ..................................................................... 276.5. Expansinas...................................................................................................... 276.6. Endo-1,4-β-D-glucanasas................................................................................. 286.7. β-D-galactosidasas .......................................................................................... 29

ÍNDICE6.8. α-L-arabinofuranosidasas ................................................................................. 306.9. Endo-β-1,4-D-xilanasas o 1,4-β-xilano endohidrolasas ....................................... 306.10. β-D-xilosidasas .............................................................................................. 316.11. Otras enzimas ............................................................................................... 31II. HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS.............................................................33III. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………………351. Material vegetal.......................................................................................................... 362. Medida de la firmeza .................................................................................................. 363. Aislamiento de polisacáridos de la pared celular ........................................................... 364. Extracción y cuantificación de pectinas ........................................................................ 365. Extracción y cuantificación de hemicelulosas y celulosa................................................. 376. Cromatografía de exclusión molecular.......................................................................... 376.1. Pectinas.......................................................................................................... 376.2. Hemicelulosas ................................................................................................. 377. Preparación de extractos y medida de actividad de enzimas de modificación de pared celular....... 387.1. Pectin metilesterasa (PME)............................................................................... 387.2. Poligalacturonasa (PG)..................................................................................... 397.3. Endo-β-1,4-glucanasa (EGasa) ......................................................................... 397.4. Xilanasa (Xnasa) ............................................................................................. 407.5. β-xilosidasa (β-xil)........................................................................................... 407.6. β-galactosidasa (β-gal) .................................................................................... 417.7. α-L-arabinofuranosidasa (α-L-ara) .................................................................... 418. Cromatografía de exclusión molecular de proteínas con actividad α-L-ara ...................... 429. Clonado del ADNc de α-L-arabinofuranosidasa ............................................................. 4210. Aislamiento de ARN total y análisis de expresión de α-L-ara mediante Northern-blot..... 4311. RT-PCR semicuantitativa ........................................................................................... 4412. Análisis de secuencias y filogenia............................................................................... 4613. Análisis estadístico.................................................................................................... 47

ÍNDICEIV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………………48SECCIÓN A. COMPONENTES DE LA PARED CELULAR…………………………………………..………..491. Firmeza de los frutos…..………………………………………………………………………………………….502. Residuo insoluble en alcohol (RIA) .............................................................................. 513. Pectinas..................................................................................................................... 523.1. Pectinas totales ............................................................................................... 533.2. Pectinas solubles en agua (PSA)....................................................................... 533.3. Pectinas solubles en EDTA (PSE) ...................................................................... 553.4. Pectinas solubles en HCl (PSH)......................................................................... 564. Hemicelulosas ............................................................................................................ 585. Celulosa..................................................................................................................... 596. Masa molecular de fracciones de la pared celular ......................................................... 596.1. Masa molecular de pectinas ............................................................................. 596.2. Masa molecular de hemicelulosas ..................................................................... 617. Discusión ................................................................................................................... 63SECCIÓN B. ENZIMAS DE DEGRADACIÓN DE LA PARED CELULAR………………………………….691. Pectin metilesterasa ................................................................................................... 702. Poligalacturonasa ....................................................................................................... 703. Endoglucanasa........................................................................................................... 714. Xilanasa..................................................................................................................... 735. β-D-xilosidasa ............................................................................................................ 736. β-galactosidasa .......................................................................................................... 747. α-L-arabinofuranosidasa ............................................................................................. 748. Discusión ................................................................................................................... 77SECCIÓN C. α-L-ARABINOFURANOSIDASA: GENES Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA……..………..851. Masa molecular de proteínas con actividad α-L-ara ....................................................... 862. Clonado de un fragmento de α-L-ara ........................................................................... 863. Expresión de FaAras en diferentes tejidos y estadios .................................................... 874. Actividad α-L-ara ........................................................................................................ 885. Clonado y análisis de la secuencia de FaAras................................................................ 896. Análisis de expresión por RT-PCR ................................................................................ 937. Discusión ................................................................................................................... 96

ÍNDICEV. CONSIDERACIONES FINALES………………………………………………………………99VI. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..……….103VII. PUBLICACIONES…………………………………………………………………………..118

INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN1. HistoriaUno de los primeros registros que se tienen respecto del cultivo de frutillas data del1300 cuando en Francia se hicieron los primeros transplantes de los bosques a los jardines.Se trataba de la frutilla silvestre denominada Fragaria vesca. La planta era apreciadafundamentalmente como ornamental, debido a que poseía flores atractivas, más que por lautilización de su fruto con fines gastronómicos. Una de las más antiguas ilustracionesbotánicas data del 1485, y fue publicada en Mainz Herbarius por un empleado de Gutenberg.Hacia el 1500 las referencias de su cultivo fueron más frecuentes y se le atribuían a la plantapropiedades medicinales. Asimismo, se describían otras variedades agrupadas dentro de lasfrutillas silvestres: Fragaria moschata y Fragaria viridis. Una característica distintiva de lasfrutillas europeas de esa época era que poseían frutos de tamaño pequeño.Alrededor del 1600 se introdujo en Europa la especie Fragaria virginiana provenientedel este de los Estados Unidos, que sería precursora de la actual frutilla comercial. Aunquedicha especie contaba con un mayor tamaño que las cultivadas en Europa hasta entonces,Fragaria vesca continuó siendo la más cultivada durante muchos años.A principios del 1700, el ingeniero Amédée François Frézier, perteneciente a unaexpedición en nombre del rey Luis XIV de Francia transportó, entre otras cosas, especímenesde frutilla cultivados por los indígenas de la zona (Mapuche y Huilliche). Esta especie,denominada Fragaria chiloensis, crece en la costa centro y sur de Chile y se interna en laCordillera de los Andes. También se la puede hallar en el este de la Argentina, en lasprovincias de Neuquén, Chubut y Río Negro. F. chiloensis posee un fruto de mayor tamañoque el de la frutilla europea, hecho que despertó el interés de los botánicos de la época. Sólocinco plantas de F. chiloensis arribaron a Francia, todas estas femeninas, por lo que sóloeventualmente se obtuvieron frutos en los jardines botánicos. Duchesne en 1766, pudoresolver el problema, poniendo en contacto estas plantas femeninas de F. chiloensis conotros individuos hermafroditas de F. virginiana. Haciendo cruzas entre F. virginiana y F.chiloensis, Duchesne generó el híbrido Fragaria x ananassa, que a través de sucesivosensayos daría origen a la actual frutilla comercial. Por la robustez de la planta, así como porlas sobresalientes características de los frutos, este híbrido no tardó en imponerse por sobrelas otras especies. Si bien las primeras variedades de F. x ananassa se originaron en Francia,entre fines del 1700 y 1800 se generaron variedades en Inglaterra que fueronposteriormente adoptadas en el resto de Europa y América. Este trabajo realizado enInglaterra es la base de las cientos de variedades que disfrutamos actualmente (Darrow,1999).2

INTRODUCCIÓN2. GeneralidadesLa frutilla pertenece a la Familia Rosáseas, Subfamilia Rosoideas y género Fragaria.Dentro de este género se han descrito más de 150 especies, las cuales se encuentranampliamente distribuidas en el mundo. Cada especie posee frutos con tamaño, color,firmeza, aroma y forma característicos. A su vez, estas especies difieren en la ploidía. TantoF. vesca como F. viridis son diploides, F. moschata es hexaploide, mientras que F. chiloensisy F. virginiana son octaploides.El tallo en una planta de frutilla, al que se denomina corona, es de tamaño reducido.De éste se generan tanto las hojas, como las inflorescencias y los estolones. Estos últimosson brotes delgados, largos y rastreros que se desarrollan en gran número, dependiendo delas condiciones ambientales. El extremo de cada estolón, en el que se halla una roseta dehojas, emite raíces al entrar en contacto con la tierra, con lo que se origina una nueva plantade caracteres idénticos a los de la planta madre.Si bien la planta de frutilla puede permanecer viable y fructificar durante varios años,debido a que con las sucesivas temporadas se observa una merma en la producción, encultivos con fines económicos se emplean plantas de hasta dos años de edad.Desde el punto de vista botánico, un fruto verdadero se define como el órgano queresulta de la transformación del tejido ovárico de una flor, que contiene en su interior a lasemilla proveniente del desarrollo del óvulo. En este sentido, la frutilla (Fragaria x ananassa,Duch.) se considera un falso fruto por provenir del desarrollo del receptáculo y no de lasparedes del ovario. En rigor los frutos verdaderos son los aquenios, los cuales se encuentranen la superficie del receptáculo y están ligados al mismo a través de conexiones vasculares.Un fruto mediano puede contener entre 150 y 200 aquenios, pudiendo llegar a poseer hasta400, en caso de un fruto de gran tamaño.La frutilla pertenece a un grupo denominado “frutos blandos” o berries, junto conframbuesas, grosellas, moras, arándanos, etc. (Green, 1971). Este grupo está integrado porfrutos de distintas especies que comparten características comunes, tales como pequeñotamaño, textura delicada, coloración intensa y una vida útil postcosecha acotada. Los frutosfrescos son muy apreciados por los consumidores, sin embargo su rápido deterioropostcosecha determina que una parte importante de la producción sea destinada alprocesamiento para la obtención de jaleas, yogures, salsas, etc. Los frutos blandos de mayorimportancia económica a nivel mundial son las frutillas, junto con las frambuesas, losarándanos y grosellas. Sin embargo, la producción mundial de frutilla supera ampliamente laproducción del resto de los berries tomados en conjunto (Fig. 1). Al analizar la producción3

INTRODUCCIÓNmundial en la última década, se puede apreciar que la de frutilla aumentó un 47%, mientrasque la de los otros berries en conjunto aumentó en menor proporción (35%).Producción mundial (miles de Ton)400035003000250020001500FrutillaOtros frutos blandos10001997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006AñoFigura 1: Producción mundial de frutillas, y de otros frutos blandos en conjunto enlos últimos 10 años (adaptado de FAOSTAT, 2007). Se muestra la producción mundial(expresada en miles de Ton) de frutilla y otros frutos blandos, que incluyenframbuesa, arándanos, grosellas y otros berries de menor importancia comercial.Cuando se analizan los niveles de producción de frutillas en Latinoamérica durante losúltimos años, se puede apreciar que la producción en conjunto si bien aumentó, se mantuvoentre un 6 y 7% de los niveles mundiales (Tabla I). El mayor productor de Latinoamérica esMéjico y lo siguen Chile, Colombia y Perú. Por su parte, Argentina se encuentra con nivelesde producción medios dentro de este grupo de países y con una tendencia de leve aumentoaño tras año.Los frutos de tipo carnoso, como la frutilla, poseen un conjunto de propiedades ycaracterísticas que hacen que los mismos sean atractivos para el consumo por parte delhombre. Estas características son adquiridas por el fruto durante el proceso de maduración,durante el cual se producen notables cambios fisiológicos y bioquímicos. En las siguientessecciones se discutirán en detalle los distintos eventos que ocurren durante la maduración defrutos carnosos.4

INTRODUCCIÓNTabla I: Producción de frutillas (en Ton) de los principales países productores deLatinoamérica durante los últimos años (Adaptado de FAOSTAT, 2007). Se muestraademás, la producción total en Latinoamérica (L.A.) y la producción mundial.País 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006Argentina 8.500 8.500 8.500 9.000 9.000 9.054 9.128 9.128Bolivia 1.700 1.800 1.810 1.815 1.817 1.954 2.038 2.038Brasil 2.500 2.600 2.600 2.700 2.700 2.745 2.786 2.786Chile 20.000 21.000 22.500 24.000 25.000 25.200 25.600 25.600Colombia 15.734 19.142 22.934 23.293 26.591 22.878 21.696 21.696Guatemala 6.736 6.577 6.700 6.700 6.700 7.525 8.008 8.008Méjico 137.736 141.130 130.688 142.245 150.261 177.230 162.627 191.843Paraguay 2.255 1.843 3.094 3.249 3.661 3.509 3.600 3.380Perú 12.449 12.536 10.254 18.199 24.927 20.649 17.430 17.430Venezuela 7.888 7.255 8.612 9.155 12.212 10.824 12.112 11.993Total L.A. 218.351 225.398 220.777 245.235 267.864 284.587 268.578 297.439Total mundial 3.202.951 3.293.462 3.222.210 3.244.835 3.359.332 3.666.692 3.796.159 4.081.6613. Maduración de frutosUna vez que se han producido la polinización y fertilización de la flor, comienza unaetapa denominada desarrollo, caracterizada por un crecimiento y alargamiento del fruto, lacual es seguida por una fase de maduración. En frutilla, hasta pasada una semana desde lacaída de los pétalos, el incremento en el tamaño del fruto se debe principalmente a unaumento abrupto en la cantidad de células. A continuación y hasta el final de la maduración,el número de células se mantiene relativamente constante, pero se observa un aumento enel tamaño de las mismas (Knee y col., 1977). El fruto de frutilla crece rápidamente,alcanzando su tamaño máximo y maduración completa alrededor de 30 días luego de lacaída de los pétalos, dependiendo de las condiciones ambientales (luz, temperatura,contenido de nutrientes, etc.). En general, el aumento del tamaño de un fruto en función deltiempo puede adoptar la forma de una: a) curva sigmoidea simple como en manzana, palta,melón y naranja; b) curva sigmoidea doble como es el caso de damascos, higos, uvas yciruelas. En frutillas, la tendencia del aumento del tamaño depende del cultivar analizado,siendo en algunos casos simple y en otros doble sigmoidea (Manning, 1993).5

INTRODUCCIÓNComo se mencionó, una vez completado el desarrollo, se inicia el proceso demaduración. Ésta se define como el conjunto de cambios fisicoquímicos, característicos decada fruto, que ocurre desde la finalización de la etapa de desarrollo hasta el inicio de lasenescencia. Los cambios que se observan incluyen: modificación de los parámetrosasociados a la actividad respiratoria, cambio de color por degradación de pigmentosexistentes y síntesis de nuevos pigmentos, cambios en la textura que determinan elablandamiento del fruto, y la producción de sabor y aroma distintivos que afectan lapalatabilidad del producto (Manning, 1993). En frutos como el tomate, la delimitación entrelas etapas del desarrollo y la maduración está determinada por el cese del crecimiento entamaño del fruto (estadio verde maduro). En frutilla, en cambio, existe una superposiciónentre el desarrollo y la maduración debido a que el crecimiento del fruto continúa aúncuando la degradación de clorofilas está muy avanzada y la síntesis de antocianinas ya hacomenzado. Debido a este solapamiento entre el desarrollo y la maduración en frutilla, eshabitual la inclusión de estadios finales del desarrollo en el estudio global de la maduración.Una característica importante de la planta de frutilla es que en el período defructificación coexisten en una misma planta frutos con distinto grado de maduración. Esdecir que en un cultivo se pueden hallar simultáneamente frutos en diversos estadios demaduración. Basándose en el tamaño y color superficial, los frutos pueden ser clasificadosen: verdes (pequeños o grandes), blancos y, de acuerdo al porcentaje de rojo superficial, en25, 50, 75 y 100% rojo (Fig. 2).Vp Vg B 25%R 50%R 75%R 100%RFigura 2: Clasificación en distintos estadios de madurez, de acuerdo con el tamaño ycolor superficial de los frutos. Vp, verde pequeño; Vg, verde grande; B, blanco;25%R a 100%R, 25 a 100% rojo superficial, respectivamente.3.1. Actividad respiratoriaLos frutos son definidos fisiológicamente en base a la presencia (climatéricos) oausencia (no climatéricos) de un aumento en la respiración y en la síntesis de la hormonagaseosa etileno al comienzo de la maduración (Lelievre y col., 1997). Dentro de los frutosclimatéricos se destacan el tomate, la manzana y la banana, entre otros. La frutilla, la uva y6

INTRODUCCIÓNlos cítricos son capaces de madurar en ausencia de un aumento en la producción de etileno,por lo que se agrupan dentro de los frutos no climatéricos.Los principales sustratos respiratorios durante la maduración son azúcares y ácidosorgánicos, siendo los primeros los predominantes. Ambos sustratos se encuentransecuestrados dentro de la vacuola, y contribuyen significativamente al sabor que se percibedel fruto como un todo. En frutilla y frambuesa, los azúcares más abundantes son sacarosa,glucosa y fructosa, y componen el 99% del total de los azúcares en el fruto maduro. El ácidoorgánico más abundante en frutilla es el cítrico (Famiani y col., 2005), aunque el ácidomálico es el que está mayormente involucrado en la respiración (Tucker, 1993).La frutilla ha sido considerada clásicamente como un exponente de fruto noclimatérico, dado que la respiración decrece paulatinamente a lo largo de la maduración, sinpresentar un pico en la actividad respiratoria (Leshem, 1986; Abeles y Takeda, 1990). Sinembargo, trabajos más recientes ponen en duda la pertenencia de la frutilla al grupo de losfrutos no climatéricos (Trainotti, 2005; Iannetta y col., 2006). En la sección 4 se describemás detalladamente el potencial rol del etileno en la maduración de frutilla.3.2. PigmentosEl cambio de coloración es uno de los rasgos más característicos de la maduración delos frutos. El mismo puede estar ocasionado por la degradación de clorofilas y unaconsecuente manifestación del color de otros pigmentos que se hallaban en el fruto pero queestaban enmascarados (fundamentalmente β-carotenos). Sin embargo, en la mayoría de losfrutos la degradación de clorofilas va acompañada de un incremento en la concentración deotros pigmentos, en general antocianinas o carotenoides.Los carotenoides, localizados en cloroplastos o cromoplastos, son los responsables decolores rojos, naranjas y amarillos de gran parte de los frutos. Son compuestos terpenoidesliposolubles, entre los que se destacan el β-caroteno y el licopeno. Pueden formar parte delsistema fotosintético y ser desenmascarados al degradarse las clorofilas, como es el caso debananas y peras. Alternativamente puede existir una importante síntesis de novo durante latransformación del cloroplasto en cromoplasto, como ocurre en durazno, tomate y pimiento.Las antocianinas son compuestos flavonoides responsables del color característico delos frutos blandos, manzanas, cerezas y ciruelas. Pueden conferir colores que van del rojo alazul, el cual a su vez está determinado por el pH del medio y por la presencia de metalescon los que tienen la capacidad de formar complejos. A diferencia de los carotenoides, sonhidrosolubles, se localizan en la vacuola (Timberlake, 1981) e incluyen un grupo de7

INTRODUCCIÓNmoléculas más diverso. En frutilla se han detectado al menos 25 antocianinas distintas (daSilva y col., 2007), aunque la más abundante es pelargonidin-3-glucósido (Van Buren, 1970).Las antocianinas son sintetizadas a través de la ruta de los fenilpropanoides, cuyo precursores la fenilalanina. La primera enzima en actuar en esta ruta sobre dicho precursor es lafenilalanina amonio-liasa (PAL). En frutillas, la actividad PAL aumenta considerablementeconforme el fruto madura (Given y col., 1988a; Jaakola y col., 2002) y dicho incremento secorrelaciona con un aumento en el contenido de antocianinas. Asimismo, durante lamaduración de este fruto el aumento en los niveles de antocianinas va acompañado de undescenso de clorofilas y de carotenoides (Woodward, 1972; Given y col., 1988a).3.3. Azúcares y ácidos simplesLos azúcares son los principales componentes solubles presentes en los frutosblandos. Estos compuestos, además de contribuir en distintas rutas metabólicas centrales,cumplen un rol importante en la determinación del sabor del fruto (Manning, 1993). Losazúcares mayoritarios encontrados en distintas variedades de frutillas maduras son glucosa(1,4 a 3,1%), fructosa (1,7 a 3,5%) y sacarosa (0,2 a 2,5%). El contenido de azúcaressolubles totales expresados como miligramos de azúcar por fruto, aumenta al progresar lamaduración (Woodward, 1972).Al igual que los azúcares, los ácidos orgánicos contribuyen al sabor del fruto. Larelación entre el contenido de azúcares y el contenido de ácidos es frecuentemente utilizadacomo índice de aceptabilidad y calidad de los frutos. Se ha descrito un aumento en elcontenido de ácidos orgánicos por fruto durante el desarrollo y la maduración de frutilla(Woodward, 1972). Los ácidos orgánicos más abundantes en este fruto son: cítrico (420 a1.240 mg %), málico (90 a 680 mg %) y ascórbico (26 a 120 mg %). El contenido de esteúltimo ácido, de conocida importancia nutricional, aumenta conforme el fruto madura. Se hademostrado que el precursor de la síntesis del ácido L-ascórbico en frutilla es el ácido D-galacturónico (componente mayoritario de las pectinas) y que la expresión de la enzima D-galacturónico reductasa correlaciona con los niveles de este ácido en el fruto (Agius y col.,2003).3.4. Compuestos volátilesCada fruto posee una “huella dactilar” de compuestos volátiles, cuya combinación leconfiere su aroma característico. Es tan particular este patrón de abundancias relativas demoléculas volátiles, que se han encontrado diferencias aun comparando distintos cultivares8

INTRODUCCIÓNde frutilla (Dirinck y col., 1981). En el caso de frutilla se han descrito al menos 360 moléculasque contribuyen al aroma de la misma (Menager y col., 2004). Si bien se han detectadotanto ésteres como alcoholes y carbonilos (Dirinck y col., 1981), los primeros son lospredominantes en frutilla (Menager y col., 2004). Debido a que poseen umbrales depercepción bajos y a que sus concentraciones son altas en varios cultivares analizados, elfuraneol (2,5-dimetil-4-hidroxi-3(2H)-furanona) y el mesifurano (2,5-dimetil-4-metoxi-3(2H)-furanona) son considerados como los principales contribuyentes al aroma de frutilla(Menager y col., 2004).4. Regulación de la maduraciónComo se mencionó anteriormente, los frutos pueden ser clasificados en climatéricos yno climatéricos según su patrón de producción de la hormona gaseosa etileno y el cambio enla tasa respiratoria durante la maduración. En este sentido, la frutilla ha sido clasificadadentro del grupo de los frutos no climatéricos, debido a la baja producción de etileno y a laausencia de un pico de consumo de oxígeno o producción de CO 2 provenientes de larespiración. Es por ello que se han propuesto otros reguladores como responsablesprincipales del control del desarrollo y la maduración, tales como las auxinas, el ácidoabscísico, las giberelinas y las citoquininas. En el caso de frutilla, el principal sitio deproducción de moléculas reguladoras del crecimiento es el aquenio (Nitsch, 1950; Kano yTadashi, 1979). Debido a que los aquenios se disponen superficialmente, éstos pueden serremovidos con relativa facilidad con el objeto de discontinuar el suministro de reguladoreshacia el receptáculo, por lo cual se dispone de una herramienta sencilla y útil para el estudiode la regulación hormonal del desarrollo y la maduración de frutilla.Las auxinas son un grupo de moléculas reguladoras del crecimiento que fueronprimeramente involucradas en el crecimiento de células presentes en brotes y elconsecuente alargamiento de los mismos en la dirección del eje longitudinal (Thimann,1969). La auxina más abundante es el ácido 3-indol-acético (AIA) y es sintetizado tanto porplantas como por bacterias, hongos y algas (Moore, 1979). Aunque pueden coexistir en untejido distintos derivados conjugados del AIA, la forma libre sería la que tendría mayoractividad como regulador del crecimiento. En los frutos los niveles de auxinas son elevadosdurante el desarrollo, reflejando su intervención en la estimulación del crecimiento. Enfrutilla, la presencia de auxinas (producidas por los aquenios) es esencial para la expansióndel receptáculo durante el desarrollo del fruto (Nitsch, 1950). Al remover los aquenios defrutos entre 4 y 21 días luego de la polinización se logra disminuir la expansión del9

INTRODUCCIÓNreceptáculo, fenómeno que puede ser revertido por la adición de auxinas sintéticas (Nitsch,1955). Las auxinas producidas en los aquenios también afectan la maduración. Si se retiranlos aquenios de una mitad del fruto en un estadio verde grande, se puede observar unaaceleración de la maduración (medida como producción de antocianinas, pérdida de firmezay disminución del contenido de clorofila) en la mitad deaquenada respecto a la mitad intacta(Given y col., 1988b). Si bien los niveles de las auxinas son elevados durante el desarrollo, alcomenzar y avanzar la maduración los valores descienden, lo que está de acuerdo con lahipótesis de que éstas reprimen la maduración. En particular, el contenido de AIA libre en elreceptáculo es elevado durante un período corto del desarrollo y luego desciendemarcadamente al avanzar la maduración (Archbold y Dennis, 1984).El ácido abscísico (ABA), cuya estructura se asemeja a la porción terminal de ciertoscarotenoides, es sintetizado en cloroplastos y otros plástidos. Se ha registrado un aumentoen el contenido de ABA durante la maduración tanto de frutos climatéricos (peras, paltas,tomates y duraznos) como de frutos no-climatéricos (cítricos, uvas y frutillas) (Leshem y col.,1986). En frutilla, el ABA se acumula en los aquenios durante la maduración, sin aumentarsustancialmente en el receptáculo (Archbold y Dennis, 1984). Al cultivar receptáculos in vitroen un medio suplementado con ABA, se pudo observar una disminución en el tiemporequerido para la maduración completa (Kano y Asahira, 1981). En un trabajo más reciente,el tratamiento de frutos enteros con ABA provocó un incremento de parámetros asociados ala maduración, tales como: desarrollo de color por incremento en el contenido deantocianinas, aumento en la actividad PAL y descenso de la firmeza del fruto (Jiang y Joyce,2003). Es de destacar que el tratamiento con ABA en este caso, indujo a su vez un aumentoen la producción de etileno que podría contribuir a los cambios observados. De este modo,es probable que la estimulación de la maduración por la aplicación exógena de ABA estésolapada con la acción del etileno generado como consecuencia del tratamiento.Las giberelinas y citoquininas contribuyen probablemente a la regulación de lamaduración en frutilla, aunque se encuentran en menor concentración que las auxinas y elABA (Perkins-Veazie, 1995). Las giberelinas están constituídas por una familia de ácidosditerpeno (se han descrito al menos 100 compuestos relacionados) cuya síntesis es llevada acabo en diferentes plástidos y en el citosol. Se las ha asociado al control del crecimiento detallos, a la iniciación floral en algunas plantas y a la promoción del establecimiento de frutosy de la germinación. La aplicación exógena de ácido giberélico (GA 3 ) en frutillas cosechadasprovoca una disminución de la actividad respiratoria, menor acumulación de antocianinas ymenor degradación de clorofilas, que en conjunto indican un retraso en la maduración10

INTRODUCCIÓN(Martínez y col., 1996). Las citoquininas, moléculas derivadas de bases nitrogenadas, hansido asociadas a la inducción de mitosis en callos en presencia de auxinas, a la promoción dela formación de raíces o tallos dependiendo de su relación molar con auxinas, al retraso en lasenescencia de hojas y a la expansión de cotiledones (Cleland, 1996). Este grupo demoléculas ha sido poco estudiado en relación al desarrollo y la maduración de frutos. Se creeque las citoquininas interaccionarían con otra clase de hormonas vegetales en la estimulacióny coordinación del desarrollo del fruto (Ozga y Reinecke, 2003). En el caso de frutilla, seregistró un aumento en la actividad de citoquininas y de giberelinas durante el inicio deldesarrollo, con un máximo luego de 7 días postantesis (Lis y col., 1978).Si bien la frutilla ha sido clásicamente agrupada dentro de los frutos no climatéricos,existe controversia respecto de su inclusión dentro de este grupo, dado que a lo largo deltiempo las experiencias para determinar el rol del etileno han arrojado resultadoscontradictorios. El nivel de producción de etileno en este fruto es de 20 a 2.000 veces menorque los encontrados en frutos típicamente climatéricos (Iannetta y col., 2006). Al administrarinhibidores de la síntesis o de la acción del etileno a través del pedúnculo de frutos enestadio verde grande, no se observaron diferencias en el contenido de antocianinas ni deactividad PAL, entre frutos tratados y controles (Given y col., 1988b). Sin embargo, laaplicación de diversos inhibidores de la acción del etileno, como permanganato de potasio(Kim y Willis, 1998) y 1-metilciclopropeno (1-MCP) (Ku y col., 1999) ha demostrado serefectiva para extender la vida poscosecha de frutos cosechados con madurez comercial(Iannetta y col., 2006). A su vez, se ha hallado al menos un miembro (FaPE1) de una familiade genes involucrados en la modificación de la pared celular (pectin metilesterasas, PME)que posee un dominio de respuesta al etileno (Castillejo y col., 2004). Más recientemente sehan clonado genes que codifican para enzimas de biosíntesis (FaACO1 y FaACO2) y proteínasinvolucradas en la percepción (FaEtr1, FaEtr2 y FaErs1) de etileno, cuyas expresiones hansido detectadas tanto en tejidos vegetativos como durante el desarrollo y la maduración delfruto (Trainotti, 2005). Finalmente, en un estudio reciente realizado con frutos aún en laplanta se halló que en el estadio rojo maduro la producción de etileno estuvo caracterizadapor una acumulación cíclica no-diurna que coincidiría con un climaterio respiratorio (Iannettay col., 2006). El análisis conjunto de estos resultados sugiere que la maquinaria de síntesis yde percepción de etileno en frutilla sería funcional, y que existen genes asociados a lamaduración cuya expresión es influenciada por esta hormona. Sin embargo, la influencia deletileno en la regulación de la maduración sería menor que la ejercida por las auxinas, el ABAy los demás reguladores hormonales.11

INTRODUCCIÓN5. Pared celularLas paredes celulares que rodean las células vegetales son estructuras complejas ydinámicas, compuestas principalmente por polisacáridos de alto peso molecular, proteínasaltamente glicosiladas y eventualmente, lignina (Somerville y col., 2004). Poseen lacapacidad de determinar la forma celular, otorgar estabilidad mecánica, mantener unidas lascélulas en un tejido, modular el crecimiento celular y constituir una barrera ante el ataque depatógenos. Tanto la estructura como la composición y las propiedades de la pared celularcambian a lo largo de la vida de la célula. Las nuevas paredes celulares, denominadasprimarias, son generadas durante la división celular y rápidamente aumentan su áreasuperficial cuando ocurre la expansión celular. Separando células contiguas se encuentra ladenominada lámina media cuya composición es característica y constituye la interfase entrelas paredes celulares de dichas células. Durante su diferenciación, cierto tipo de células(como las que se hallan en el tejido xilemático o en tejidos de sostén como elesclerénquima) generan por debajo de la pared primaria, una pared secundaria. Esta clasede paredes está asociada a la especialización que sufren las células, por lo que lacomposición de estas paredes secundarias es variable según el tipo de célula. Por ejemplo,las fibras de algodón están constituidas por 98% de celulosa, mientras que en otro tipo decélulas pueden existir moléculas no celulósicas tales como diferentes clases de polisacáridos,proteínas y moléculas con residuos aromáticos (fundamentalmente lignina) (Carpita yMcCann, 2000). La pared celular primaria (PCP), que es la que se halla frutos, posee unescaso o nulo contenido de compuestos aromáticos y, a diferencia de las paredessecundarias, está altamente hidratada (65% de agua). Dicho componente acuoso contienesolutos y proteínas solubles, que incluyen enzimas (Brummell, 2006).Los componentes que forman parte de la PCP son: celulosa, hemicelulosas, pectinas yproteínas estructurales. A continuación se describen en detalle cada uno de estoscomponentes:5.1. Componentes de la pared celular5.1.1. Celulosa: Se encuentra formada por cadenas lineales de β-1,4-glucanos, las cuales sedisponen conformando microfibrillas, de alrededor de 3 nm de diámetro y que generalmenteconsisten de 36 de estas cadenas lineales ubicadas paralelamente (Somerville, 2006). Se hadescrito la existencia de complejos enzimáticos de celulosa-sintasa unidos a la membranaplasmática, responsables de la síntesis y el ensamblaje de las microfibrillas. Estos complejos12

INTRODUCCIÓNpueden ser visualizados como rosetas hexaméricas de 25-30 nm de diámetro (Lerouxel ycol., 2006). A partir de cada subunidad de esta roseta, se postula que son extrudidasmúltiples cadenas de β-1,4-glucanos que se unen conformando microfibrillas por fuera de lamembrana plasmática, como consecuencia de la interacción por puentes de hidrógeno entredichas cadenas de glucanos (Somerville y col., 2004). La zona interna de las microfibrilllasposee una estructura cristalina que excluye las moléculas de agua, mientras que las capasmás externas son más amorfas y permitirían el entrecruzamiento con otros componentes dela pared celular (Pauly y col., 1999). Es de destacar que la deposición de las microfibrillas enla pared celular está caracterizada por una orientación controlada. En las paredes primarias,su orientación es generalmente perpendicular al eje de elongación celular (Lerouxel y col.,2006), restringiendo el hinchamiento lateral y permitiendo la expansión longitudinal(Somerville y col., 2004).5.1.2. Hemicelulosas: Este grupo de moléculas está compuesto por polisacáridos que seasocian con las microfibrillas de celulosa para formar una matriz entrecruzada. Son neutras olevemente ácidas, están formadas por azúcares neutros y no poseen ácido galacturónico. Lasíntesis de esta clase de moléculas está mucho menos estudiada que la de la celulosa; seríansintetizadas en el Golgi y depositadas en la pared celular vía vesículas secretorias. Las clasesprincipales de hemicelulosas halladas en la PCP son:a) xiloglucanos (XG): Son cadenas de β-1,4-glucanos con sustituciones de residuosde D-xilosa, algunas de las cuales están sustituidas a su vez por β-D-galactosa yeventualmente α-L-fucosa (Fig. 3).GalGal-β(1→2)--β(1→2)-XilXilXilXilXil-α(1→6)--α(1→6)--β(1→4)-Glc -β(1→4)-Glc -β(1→4)- Glc -β(1→4)-Glc -β(1→4)-Glc-β(1→4)-Glc -β(1→4)-Glc-β(1→4)-Glc -β(1→4)--α(1→6)--α(1→6)--α(1→6)-Glu D-glucosa Xil D-xilosa Gal D-galactosaFigura 3: Representación esquemática del xiloglucano. Adaptado de Somerville ycol., 2004.13

INTRODUCCIÓNb) glucomananos: Son moléculas con regiones alternantes de β-1,4-glucanos y β-1,4-mananos, con ocasionales residuos de α-D-galactosa como cadenas laterales.c) xilanos: Son polímeros compuestos por una cadena principal de residuos xilosilounidos por enlaces β-1,4, sustituidos con residuos de ácido α-D-glucurónico y de α-L-arabinosa (Fig. 4).AGlAra-α(1→2)-Xil -β(1→4)-Xil -β(1→4)- Xil -β(1→4)-Xil -β(1→4)-Xil-β(1→4)-Xil -β(1→4)-Xil -β(1→4)--α(1→2)-Xil -β(1→4)-AGl Ácido D-glucurónico Xil D-xilosa Ara L-arabinosaFigura 4: Representación esquemática del xilano. Adaptado de Somerville y col.,2004.5.1.3. Pectinas: Es un conjunto heterogéneo de polímeros altamente hidratados, ricos enácido α-D-galacturónico (AG) (Carpita y McCann, 2000). Este grupo está compuesto por 17monosacáridos distintos y su síntesis involucraría al menos 53 glicosil transferasas diferenteslocalizadas en el aparato de Golgi (Ridley y col., 2001). En general, las pectinas son el grupode componentes mayoritarios en la pared celular de los frutos y pueden llegar a conformar lamitad del contenido polimérico de la pared (Brummell, 2006). Se han aislado tres tipos depolisacáridos pécticos a partir de las PCP:a) homogalacturonanos (HG): Cadena lineal de ácido α-1,4-galacturónico. Puedepresentar metil-esterificación en C-6 y eventualmente grupos acetilo en C-2 o C-3(Fig. 5). Serían sintetizados con un alto porcentaje de grupos carboxilosesterificados con residuos metilos (lo cual disminuye la repulsión entre polímeros)(Carpita y McCann, 2000) y una vez ubicados en la pared celular, por acción deesterasas quedaría libre el grupo carboxilo (ver Sección 6.2.). Estos polisacáridos14

INTRODUCCIÓNestán presentes en toda la pared primaria, y son el componente mayoritario de lalámina media (Jarvis y col., 2003).-α(1→4)-AG -α(1→4)-AG -α(1→4)- AG-α(1→4)-AG -α(1→4)-AG-α(1→4)-AG -α(1→4)-AG-α(1→4)-AG -α(1→4)--α(1→4)- AGAGÁcido D-galacturónico, algunos se muestranmetil esterificados ( )Figura 5: Representación esquemática del homogalacturonano (HG). Adaptado deSomerville y col., 2004.b) ramnogalacturonanos tipo I (RG I): Polímeros que contienen repeticiones deldisacárido [→2)-α-L-rhamnosa-(1→4)-α-L-ácido galacturónico-(1→] n , donde npuede alcanzar valores cercanos a 100 (McNeil y col., 1980). Entre 20 y 80% de losresiduos de ramnosa pueden estar sustituidos en el C-4. Esta sustitución puedeconsistir de un único residuo de β-D-galactosa, o de una cadena polimérica dearabinogalactanos I o arabinanos (Fig. 6).-α(1→2)-Rha -α(1→4)-AG -α(1→2)- Rha -α(1→4)-AG -α(1→2)-Rha-α(1→4)-AG -α(1→2)-Rha-α(1→4)-AG -α(1→2)-Ara -α(1→3)-Ara -α(1→3)--α(1→5)- -α(1→5)--α(1→5)--α(1→4)-AraAraAraarabinanoGalAra-α(1→3)-GalarabinogalactanoAraAra-α(1→3)--α(1→5)--β(1→4)- -β(1→4)--β(1→4)--β(1→4)-GalGalGal-β(1→4)--β(1→4)-Rha L-ramnosaAGÁcido D-galacturónicoGal D-galactosaAra L-arabinosaFigura 6: Representación esquemática del ramnogalacturonano tipo I (RG I).Adaptado de Somerville y col., 2004.15

INTRODUCCIÓNLos arabinogalactanos I están compuestos por una cadena principal de D-galactosaunida por enlaces β-1,4 y pueden existir eventuales sustituciones de L-arabinosamediante uniones α-1,3 (Ridley y col., 2001). Los arabinanos está compuestosexclusivamente por L-arabinosa, con una cadena principal con uniones α-1,5 quepuede estar sustituida con α-L-arabinosa-(1→2)-α-L-arabinosa-(1→3) y/o α-Larabinosa-(1→3)-α-L-arabinosa-(1→3)(Ridley y col., 2001). Existen zonas de losRG I con abundantes arabinogalactanos y arabinanos, conformando regiones muyramificadas (“hairy”) de las pectinas (Vincken y col., 2003).c) galacturonanos sustituidos: Lo componen un grupo diverso de polisacáridos quecontienen una cadena principal lineal de residuos de ácido α-D-galacturónico unidospor enlaces α-1,4. Los ramnogalacturonanos de tipo II (RG II) pertenecen a estegrupo de galacturonanos y están ampliamente distribuidos en las paredes celularesprimarias de plantas superiores (O'Neill y col., 2004). A pesar de sus nombressimilares, los RG I y RG II, difieren marcadamente en su estructura. Los RG IIposeen una cadena principal de al menos 7 residuos de ácido galacturónico unidospor enlaces α-1,4 y tienen una característica estructura altamente ramificada. Lascadenas laterales encontradas pueden ser de nona, octa o disacáridos, e incluyenresiduos de D-apiosa, L-fucosa, L-ramnosa, ácido 3-deoxo-D-lyxo-heptulósico, entreotros (Somerville y col., 2004). Asimismo, pertenecen a este grupo degalacturonanos sustituidos los xilogalacturonanos , que contienen residuos de β-Dxilosaunidos al C-3 de la cadena principal (Ridley y col., 2001).XilXilXilXil-β(1→3)--β(1→3)--β(1→3)--α(1→4)-AG -α(1→4)-AG -α(1→4)- AG-α(1→4)-AG -α(1→4)-AG-α(1→4)-AG -α(1→4)-AG-α(1→4)--β(1→3)-AG -α(1→4)-AG Ácido D-galacturónico Xil D-xilosaFigura 7: Representación esquemática del xilogalacturonano. Adaptado deSomerville y col., 2004.16

INTRODUCCIÓN5.1.4. Proteínas estructurales: Son los componentes de la pared celular menos abundantes ya su vez menos estudiados. Se caracterizan por ser glicoproteínas ricas en ciertosaminoácidos, lo cual permite su clasificación en: HPGP (glicoproteínas ricas enhidroxiprolina), PGP (glicoproteínas ricas en prolina) y GGP (glicoproteínas ricas en glicina)(Carpita y McCann, 2000).5.2. Disposición espacial de los componentes de la pared celularSi bien la composición química de los polímeros que componen la pared celular hasido descrita en detalle, no existe un modelo definitivo acerca de la disposicióntridimensional de estos componentes. El modelo más aceptado, propone que lasmicrofibrillas de celulosa estarían entrecruzadas por xiloglucanos y que las pectinas estaríanocupando los espacios libres (Cosgrove, 2001). En la figura 8, se esquematiza dicho modelo.Se observa por sobre la PCP la lámina media, que es una zona rica en pectinas entre lasparedes primarias de dos células y que proporciona conexiones intercelulares (Jarvis y col.,2003).LáminamediaPectinasPared celularprimariaMembranaplasmáticaCelulosaHemicelulosasFigura 8: Modelo aceptado de la pared celular, adaptado de Smith, 2001. Seaprecian las hemicelulosas (líneas de color rojo) entrecruzando microfibrillas decelulosa (cilindros de color celeste). Las pectinas (líneas irregulares de color negro) sedisponen ocupando los espacios entre la red celulosa-hemicelulosa. Por sobre la PCPse observa la lámina media.17

INTRODUCCIÓN5.3. Interacciones entre los componentes de la pared celular:Es importante tener en cuenta el tipo de interacciones que existen entre los polímerosque componen la pared para comprender más profundamente la estructura y propiedades dela misma y el aporte que puede hacer cada grupo de moléculas. Asimismo, el conocimientode dichas interacciones permite el desarrollo de metodologías adecuadas para la extracciónde fracciones enriquecidas en determinado tipo de polímeros para su posterior análisis.Las microfibrillas de celulosa interaccionarían con el resto de los componentes de lapared celular mediante puentes de hidrógeno. Estudios recientes demostraron que, enalgunas plantas, sólo una pequeña fracción (alrededor del 8%) de la superficie de lasmicrofibrillas estaría en contacto directo con los xiloglucanos (Bootten y col., 2004). Se hapodido demostrar la interacción entre las cadenas laterales de pectinas y celulosa in vitro(Zykwinska y col., 2005). En particular, la mayor interacción encontrada fue entre losarabinanos no ramificados y la celulosa, alcanzando una afinidad de adsorción comparablecon la del xiloglucano.A su vez se hallaron claras evidencias de la existencia de interacciones covalentesentre xiloglucanos (hemicelulosas) y pectinas (Thompson y Fry, 2000; Popper y Fry, 2005)en varias especies. Se propuso además la existencia de interacciones covalentes entrecomponentes pécticos (Ridley y col., 2001; Vincken y col., 2003). Los RG II tienen lapotencialidad de interaccionar de a pares a través de uniones covalentes borato-diéster (Fig.9). Este enlace se forma entre OH-2 y OH-3 de los residuos de D-apiosa de cada subunidadmonomérica de RG II (Ridley y col., 2001). La formación de dímeros de RG II es un procesoque se da in vitro en ausencia de catalizadores proteicos.RG IICadena lateralCadena lateralRG IIFigura 9: Los RG II pueden interaccionar a través de enlaces borato diéster. Seobserva el átomo de B central y los residuos de D-apiosa, presentes en las cadenaslaterales de los RG II. (Adaptado de Vincken y col., 2003).18

INTRODUCCIÓNOtro tipo de interacciones existentes entre componentes de la pared celular son lasinteracciones iónicas. La capacidad de formar este enlace iónico es una característica de lospolímeros pécticos. Las moléculas de homogalacturonanos pueden interaccionar entre sí através de puentes iónicos de Ca +2 (Fig. 10). Este tipo de interacción requiere que el C-6 delos residuos de ácido galacturónico se encuentre no esterificado. Es más, se requerirían almenos 10 residuos no esterificados contiguos para que se diera un entrecruzamiento estableentre cadenas (Liners y col., 1992).Figura 10: Interacción a través de puentes de Ca +2 entre grupos carboxilos noesterificados de dos cadenas de homogalacturonanos (Adaptado de Vincken y col.,2003). Los iones Ca 2+ se representan como esferas.En la figura 11 se resumen los tipos de interacciones que existirían entre los distintoscomponentes de la pared. Es de destacar que las pectinas pueden interaccionar a través deuna mayor diversidad de enlaces que los restantes polímeros presentes en la pared celular.Más aún, las pectinas son los componentes con mayor probabilidad de formación de fuertesenlaces covalentes.CelulosaPte. de HHemicelulosasPte. de HPte. de HCovalentesPectinasPte. de HIónicasCovalentesFigura 11: Esquema de los componentes de la pared celular y las posiblesinteracciones entre los mismos. Pte de H, representa interacciones tipo puente dehidrógeno.19

INTRODUCCIÓNUna práctica habitual utilizada para el estudio de los componentes de pared es elaislamiento de la misma y la posterior extracción secuencial de distintas fraccionesbasándose en su solubilidad diferencial (Brummell, 2006). Primeramente, para aislar lasparedes celulares de cierto tejido, se somete a éste a una ebullición en etanol absoluto yposteriormente se realiza una filtración (Fig. 12). Debido a que los polímeros permaneceninsolubles en este alcohol, el sólido resultante está compuesto fundamentalmente por lasparedes celulares que se hallaban en el tejido tratado. Suele denominarse a este residuo,residuo insoluble en alcohol (RIA). A continuación es posible realizar la extracción del RIAcon agua para solubilizar las pectinas con interacciones más débiles (pectinas solubles enagua, PSA), seguida de una extracción con agentes quelantes para secuestrar los iones ysolubilizar las pectinas con interacción a través de puentes de Ca 2+ (pectinas solubles enEDTA, PSE). Luego, puede realizarse una extracción con Na 2 CO 3 o HCl en caliente parahidrolizar los enlaces covalentes y liberar las pectinas ligadas mediante dicho tipo de unión(pectinas solubles en Na 2 CO 3 o HCl, PSH en este último caso).TejidovegetalEbull. etanolRIAExtracción aguaExtracción EDTAExtracción HClExtracción NaOHCel: Fracción enriquecida encelulosaPSA: Fracción enriquecida enpectinas de interacción débilPSE: Fracción enriquecida enpectinas de interacción iónicaPSH: Fracción enriquecida enpectinas de interacción covalenteHem: Fracción enriquecida enhemicelulosasFigura 12: Marcha de extracción de la pared celular y sus distintos componentes. Eltejido es homogeneizado con etanol y llevado a reflujo. El sólido resultante de lafiltración, residuo insoluble en alcohol (RIA), está compuesto principalmente por lasparedes celulares presentes en el tejido. La extracción secuencial con agua, EDTA yHCl permite la solubilización de pectinas de interacción débil, iónica y covalente,respectivamente. Mediante el tratamiento con NaOH del residuo resultante de laextracción de pectinas, se solubilizan las hemicelulosas (Hem). El residuo sólido finalestá conformado por celulosa (Cel).20

INTRODUCCIÓNPara la solubilización de hemicelulosas habitualmente se utiliza solución alcalina diluida(hemicelulosas débilmente unidas) y solución alcalina concentrada (hemicelulosasfuertemente unidas). Es de destacar que la extracción directa con una solución alcalinaconcentrada, permite la solubilización de ambas fracciones de hemiculosas (fracciónenriquecida en hemicelulosas, Hem). El residuo remanente de esta última extracción estácompuesto predominantemente por celulosa (Cel). Si bien esta marcha de extracción permitela obtención de fracciones enriquecidas en cierto tipo particular de moléculas, éstas puedencontener pequeñas cantidades de otros polímeros por lo que en realidad consisten enmezclas de distintos polímeros coextraídos (Brummell, 2006).5.4. Cambios en la pared celular durante la maduraciónLos distintos componentes de la pared sufren modificaciones como consecuencia dela acción de diversas enzimas y proteínas (ver Sección 6 para una descripción detallada).Esta modificación en la pared celular está fuertemente asociada a los cambios de texturacaracterísticos de los frutos durante su maduración.5.4.1. Depolimerización de poliurónidosLos polímeros pécticos pueden sufrir depolimerización con una consecuente reducciónde su masa molecular. El grado de depolimerización observado en cada fracción péctica noes el mismo cuando se comparan distintas especies (Brummell, 2006). En gran cantidad detrabajos se analizó la depolimerización de fracciones de pectinas que incluyen tantopoliurónidos solubles en agua como en agentes quelantes, es decir pectinas de interaccióndébil e iónica, respectivamente. Esta fracción estaría compuesta fundamentalmente porhomogalacturonanos, aunque también pueden estar presentes en menor proporción RG I yRG II (Brummell, 2006). En especies como pimiento (Harpster y col., 2002a), banana (Wadey col., 1992) y manzana (Yoshioka y col., 1992)) se observó una leve depolimerización deestas fracciones. En palta (Huber y O'Donoghue, 1993) el grado de depolimerización fuealto, mientras que en tomate (Huber y O'Donoghue, 1993; Brummell y Labavitch, 1997) y endurazno (Brummell y col., 2004) fue intermedio.Luego de que los polímeros pécticos solubles en agua y agentes quelantes han sidoremovidos, la extracción con Na 2 CO 3 o HCl solubiliza una fracción de poliurónidos queestarían unidos a la pared a través de enlaces éster, los cuales son hidrolizados por dichosagentes solubilizantes. Este extracto generalmente contiene ramnosa, que es uncomponente principal de los RG I, y un mayor contenido de arabinosa y galactosa, típicos de21

INTRODUCCIÓNlas cadenas laterales de los RG I (Redgwell y col., 1991; Rose y col., 1998a; Brummell y col.,2004). Es de notar que en la mayoría de los trabajos no se ha analizado el grado dedepolimerización que sufren este tipo de polímeros pécticos, lo cual puede llevar ageneralizaciones incorrectas respecto del grado de modificación de las pectinas en ciertosfrutos. En los pocos casos en los que se estudió esta fracción (tomate (Brummell yLabavitch, 1997), melón (Rose y col., 1998a) y durazno (Brummell y col., 2004)), no se hanobservado grandes cambios en el perfil de masas moleculares; sin embargo, es probable queesto sea consecuencia del empleo de métodos drásticos durante la extracción de estafracción (Brummell, 2006). Es decir que como consecuencia del proceso de aislamiento deesta fracción, es posible que los polímeros sean modificados y que esto enmascarediferencias existentes entre distintos estadios de la maduración.5.4.2. Pérdida de galactanos y arabinanosLa mayoría de la galactosa y arabinosa de las PCP se encuentra presente en 1,4-β-Dgalactanos,1,5-α-L-arabinanos o arabinogalactanos ramificados, formando parte de lasramificaciones de los RG I. La pérdida de galactosa y arabinosa poliméricas es un procesoque ocurre comúnmente durante la maduración de la mayoría de los frutos (Gross y Sams,1984; Redgwell y col., 1997a). Ambos azúcares son hallados en todas las fracciones depectinas, pero se encuentran preferentemente en las fracciones solubles en álcalis. Sinembargo, suelen quedar remanentes de estos azúcares en el residuo insoluble luego de laextracción con álcali, correspondiente a la celulosa (Seymour y col., 1990; Redgwell y col.,1997a). Esto sugiere que parte de los RG I estarían íntima y fuertemente integrados a lapared a través de sus cadenas laterales y/o su cadena principal (Redgwell y col., 1997a;Zykwinska y col., 2005).5.4.3. Demetilación de pectinasLos HG inicialmente son sintetizados y secretados a la pared celular con un alto gradode metilesterificación (Carpita y McCann, 2000), el cual disminuye durante el desarrollodebido a la acción de enzimas apoplásticas. La reducción del grado de metilación es unacaracterística común durante el desarrollo vegetal y es particularmente notable en lamaduración de frutos (Brummell, 2006). Asociada a este proceso se encuentra la pectinmetilesterasa (PME), que cataliza la hidrólisis de dichos ésteres (ver Sección 6.2). Comoconsecuencia de la acción de esta enzima se genera metanol y el C-6 del AG que interveníaen el grupo éster, se transforma en un grupo carboxilo con la capacidad de formar puentes22

INTRODUCCIÓNiónicos. La demetilación de las pectinas modifica significativamente el grado de hidratación yla solubilidad de las mismas. Igualmente, el grado de metilación afecta la afinidad queposeen ciertas enzimas pectinolíticas por los polímeros pécticos (Pressey y Avants, 1982;Seymour y col., 1987; Koch y Nevins, 1989; Wakabayashi y col., 2000; Wakabayashi y col.,2003). Las condiciones del medio apoplástico también son afectadas por este proceso dedemetilación ya que la ionización del grupo carboxilo que se genera (en H + y carboxilato)modifica el pH y el balance iónico. Además se generan superficies con carga eléctrica quepueden alterar el movimiento de otros componentes cargados de la pared y el apoplasto(Grignon y Sentenac, 1991).5.4.4. Solubilización de pectinasEn la mayoría de los frutos se observa un aumento en la cantidad de poliurónidos quecomponen las fracciones solubles en agua y en agentes quelantes durante la maduración(proceso denominado “solubilización de pectinas”). Este fenómeno ha sido descrito en kiwi,palta, papaya, tomate y durazno, entre otros (Redgwell y col., 1992; Huber y O'Donoghue,1993; Lazan y col., 1995; Brummell y Labavitch, 1997; Wakabayashi y col., 2000; Brummelly col., 2004). Los mecanismos por los cuales ciertos polisacáridos pasan a formar parte defracciones con interacciones más débiles con los demás componentes no han sidocompletamente dilucidados. En algunos casos, como en tomate, esta solubilización ha sidovinculada a la depolimerización de poliurónidos (Giovannoni y col., 1989). En otros, comokiwi, melón y durazno, se registró un aumento en la solubilidad sin depolimerizacióndetectable (Dawson y col., 1992; Redgwell y col., 1992; Rose y col., 1998a; Brummell y col.,2004). La desesterificación de pectinas tampoco parece ser la causa primaria de susolubilización (Wakabayashi y col., 2000). Al menos en frutilla, se ha propuesto que lasolubilización de las pectinas estaría asociada a la degradación de las cadenas lateralespresentes en las mismas (Koh y Melton, 2002).Del mismo modo, no se conoce con certeza si la solubilización previa de los polímerospécticos es necesaria para que ocurra la depolimerización, aunque en la mayoría de lasespecies la solubilización comienza en etapas tempranas de la maduración (Brummell, 2006).5.4.5. Depolimerización de hemicelulosasSe ha descrito una disminución en las masas moleculares de las fracciones quecomponen los polímeros con la capacidad de ser extraídos con álcali (glucanos de matriz;principalmente hemicelulosas) en frutilla (Huber, 1984), tomate (Tong y Gross, 1988;23

INTRODUCCIÓNMaclachlan y Brady, 1994; Brummell y col., 1999a), melón (McCollum y col., 1989; Rose ycol., 1998a), kiwi (Redgwell y col., 1991), palta (O'Donoghue y Huber, 1992), kaki (Cutillas-Iturralde y col., 1994) y durazno (Brummell y col., 2004), etc. Según algunos autores, esteproceso sería uno de los que más contribuye a la disminución de la rigidez de las paredescelulares y el ablandamiento del fruto (Brummell, 2006). Sin embargo hasta el momento laslíneas antisentido o sobreexpresantes de genes involucrados en la depolimerización de losxiloglucanos han rendido frutos sin diferencias de firmeza con los controles (Wooley y col.,2001; Harpster y col., 2002a; Harpster y col., 2002b; Palomer y col., 2006).5.4.6. Depolimerización de celulosaDebido a su insolubilidad en los solventes utilizados habitualmente, la realización deestudios mediante exclusión molecular de la fracción celulósica ha sido un gran desafío ysólo existen escasos trabajos al respecto. La mínima información disponible sugiere que ladepolimerización de celulosa no sería un aspecto central en la maduración de frutos. Sinembargo, la depolimerización de tan solo algunas pocas cadenas externas de β-1,4-glucanosque la componen podrían tener un gran efecto en la propiedades de la pared celular, ya quepodrían incluir zonas de interacción con otros componentes (Brummell, 2006).5.4.7. Síntesis de componentes de paredLa síntesis de los distintos componentes de la pared celular es un proceso necesariopara el desarrollo del fruto. Sin embargo, se ha podido demostrar mediante la utilización demonosacáridos marcados, la existencia de síntesis de novo de polímeros de pared aúnpasada la etapa de desarrollo y avanzada la maduración (Mitcham y col., 1989; Greve yLabavitch, 1991). Se detectó incorporación en polímeros pertenecientes a todas lasfracciones de la pared celular, lo que reflejaría que no habría síntesis particular de alguno delos componentes. Normalmente, se asume que los polímeros de baja masa molecularprovienen en muchos casos de la depolimerización de ciertas fracciones de la pared. Se hapropuesto que los polímeros sintetizados de novo en estadios avanzados de maduraciónpodrían contribuir o formar parte de estas fracciones de baja masa molecular. Sin embargo,no se conoce el aporte que pueden hacer estos nuevos polímeros en la estructura de lapared celular del fruto durante su maduración (Brummell, 2006). En el caso de frutilla se hapodido detectar la incorporación de glucosa marcada hasta los 20 días luego de la caída delos pétalos, que correspondería a estadios iniciales de la maduración (Knee y col., 1977).24

INTRODUCCIÓN6. Proteínas de modificación de la pared celularLas modificaciones que sufre la pared celular a lo largo del desarrollo y la maduraciónde los frutos (descrita en la Sección 5.4) ocurren fundamentalmente como consecuencia dela acción de una gran cantidad de enzimas y proteínas sobre la misma. Si bien se hanpropuesto mecanismos de modificación alternativos, tales como la hidrólisis de polímeros porla acción de radicales libres (Fry, 1998), ha prevalecido el concepto de que sería este grupode proteínas y enzimas el principal responsable. Es de destacar que cada uno de estos tiposde enzimas está representado por familias de genes, cuya expresión puede coincidir encierto estadio. El hecho que habitualmente sea la expresión de más de un gen la causa decierta actividad enzimática, sugiere mecanismos redundantes tendientes al ablandamientodel fruto. A continuación se describen en detalle las enzimas y proteínas mejorcaracterizadas.6.1. Poligalacturonasas (PGs)Son un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de las uniones α-1,4 entreresiduos de ácido galacturónico (Fig. 13), característico de los polímeros pécticos. En fruto sehan descrito tanto endo- (EC 3.2.1.15) como exo-poligalacturonasas (EC 3.2.1.67) (Fischer yBennett, 1991). Las PGs actúan fundamentalmente sobre los homogalacturonanos, loscuales son sintetizados y secretados al espacio apoplástico con un alto grado de metilesterificación (Carpita y McCann, 2000). Un cierto grado de demetilación sería necesario paraque los HGs puedan ser hidrolizados por endo-PG, por lo que la actividad in vivo estaríainfluenciada por una previa acción de pectin metilesterasas (ver sección 6.2) (Pressey yAvants, 1982; Seymour y col., 1987; Koch y Nevins, 1989; Wakabayashi y col., 2000;Wakabayashi y col., 2003). En frutilla, la existencia de expresión y actividad PG fue motivode controversias. En estudios realizados con el cultivar Dover no se pudo detectar actividadPG, por lo que se propuso la ausencia de PG en frutilla (Huber, 1984). Posteriormente, sehallaron tres isoformas con actividad PG en la variedad Toyonaka (Nogata y col., 1993), uncultivar con frutos particularmente blandos. Hasta el momento se han obtenido varios clonesasociados a PG en frutilla: spG (Redondo-Nevado y col., 2001), D15 y B4 (Salentijn y col.,2003), FaPG1 y T-PG (Villarreal y col., 2007).6.2. Pectin metilesterasas (PMEs, EC 3.1.1.11)Catalizan la hidrólisis de metil ésteres del C-6 de residuos de ácido galacturónico, locual genera la demetilación de las pectinas (Fig. 13). Esta demetilación facilitaría la25

INTRODUCCIÓNformación de puentes de Ca +2 entre polímeros pécticos que permitiría un refuerzo de laestructura de la pared. Se cree que algunas isoformas de PMEs actúan en forma localizada,es decir que demetilarían zonas específicas y acotadas. Sin embargo se ha descrito lapresencia en tejidos vegetales de pectinas con demetilación aleatoria (Willats y col., 2001),lo que sugiere la presencia de PME con la capacidad de actuar de esta manera, tal como lohacen ciertas isoformas fúngicas (Phan y col., 2007). Dado que por un lado las PMEs actúanpermitiendo la formación de puentes de Ca +2 y por otro vuelven más susceptibles a lospolímeros pécticos a la degradación por PG, aparentemente PME intervendría tanto en elrefuerzo como en el debilitamiento de la pared dependiendo de su modo de acción (Phan ycol., 2007). En frutilla se ha descrito actividad PME detectable (Barnes y Patchett, 1976) queaumenta durante la maduración y desciende en estadios de sobremaduración. Másrecientemente se han clonado y caracterizado cuatro genes que codifican PMEs, FaPE1 aFaPE4, pero sólamente FaPE1 está asociada a la maduración (Castillejo y col., 2004).Pectin metilesterasaEndo poligalacturonasa-α(1→4)-AG -α(1→4)-AG -α(1→4)- AG -α(1→4)-AG -α(1→4)-AG-α(1→4)-AG -α(1→4)-AG-α(1→4)-AG -α(1→4)-Exo poligalacturonasaPectato liasaAGÁcido D-galacturónico, algunos se muestranmetil esterificados ( )Figura 13: Principales enzimas que actúan sobre el homogalacturonano. Algunosresiduos de ácido galacturónico (AG) se encuentran metil esterificados. Adaptado deSomerville y col., 2004.6.3. Pectato liasas (PLs, EC 4.2.2.2)Intervienen en la degradación de pectinas en los mismos sitios que PG pero medianteun mecanismo de reacción distinto (Fig. 13). La ruptura de la cadena dehomogalacturonanos no ocurre a través de un proceso hidrolítico, sino que la catálisis seproduce por una reacción de β-eliminación, la cual introduce una insaturación C4-C5 en elextremo no reductor del producto de reacción (Sozzi y Civello, 2005). Las PLs han sidoestudiadas extensamente en bacterias patogénicas capaces de causar depolimerización depectinas y la consecuente maceración de los tejidos vegetales (Hernissat y col., 1995). Adiferencia de la gran cantidad de trabajos referentes al rol de PG en la maduración de frutos,existen escasos estudios acerca de PL (Jiménez-Bermúdez y col., 2002). En frutilla se han26

INTRODUCCIÓNdescrito tres genes putativos que codifican para PLs (plA, plB y plC). Los transcriptos de lostres genes fueron sólo detectados en fruto y la expresión génica fue baja en estadios deldesarrollo, pero fue mayor a partir del estadio blanco (Benítez-Burraco y col., 2003). Si bienla actividad PL no ha podido detectarse en frutilla hasta el momento, líneas sobreexpresandoconstitutivamente el antisentido de la plC rindieron frutos con mayor firmeza que loscontroles (Jiménez-Bermúdez y col., 2002).6.4. Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC 2.4.1.207)Se ha demostrado que estas enzimas hidrolizan las cadenas principales β-1,4-glucanode los xiloglucanos (actuando como donante) y transfieren el fragmento conteniendo elextremo reductor generado, a otro polímero de xiloglucano (que actúa como aceptor) o aoligosacáridos resultantes de la acción de endoglucanasas (EGasas, ver Sección 6.6) sobre elxiloglucano (Sozzi y Civello, 2005). Se ha detectado actividad XET en frutos tales comotomate (Maclachlan y Brady, 1994), kiwi (Redgwell y Fry, 1993; Percy y col., 1996) ymanzana (Percy y col., 1996). En kiwi se encontró una distribución heterogénea de losniveles de actividad en distintas zonas del fruto. Notablemente, se hallaron altos niveles deactividad en estadios tempranos del desarrollo (coincidente con una gran expansión celular),que descendieron y luego aumentaron simultáneamente con la aparición del climaterio(Percy y col., 1996). En tomate se generaron líneas con expresión de genes XET antisentido.Al expresar el transgen antisentido correspondiente a un gen XET que predomina durante eldesarrollo se obtuvieron frutos de tomate más pequeños, hecho que está de acuerdo con lasuposición que XET intervendría en la expansión celular y en el crecimiento del fruto (Asaday col., 1999). En cambio, líneas antisentido para un gen XET específico de la maduración,bajo el control de un promotor inducido durante la misma, rindieron frutos sin diferencia enfirmeza con los controles (Brummell y Harpster, 2001). En frutilla no se ha descrito hasta elmomento actividad o expresión XET.6.5. Expansinas (Exps)Es una familia de proteínas cuya función sería la de interrumpir las interaccionespuente de hidrógeno existentes entre las microfibrillas de celulosa y glucanos no celulósicos,permitiendo la relajación de la estructura que forma la pared celular. Además de este efectodirecto sobre la estructura de la pared, se ha propuesto que la acción de las expansinasfacilitaría el acceso de otras enzimas presentes a sus sustratos, contribuyendo de este modoal desmantelamiento de la pared celular (Cosgrove, 2000). No se ha demostrado que posean27

INTRODUCCIÓNactividad transglicosilasa o hidrolasa, y su actividad puede ser puesta de manifiesto sólo porsu efecto sobre las propiedades biomecánicas de tejidos vegetales (Cosgrove, 2000; Vicentey col., 2007). Claramente, la actividad de las Exps permite la relajación de la pared celular,por lo que han sido asociadas a procesos que involucran crecimiento y/o expansión celular,tales como elongación de hipocótilos (McQueen-Mason y col., 1992) o coleóptilos (Cosgrovey Li, 1993), desarrollo de hojas jóvenes (Keller y Cosgrove, 1995), y desarrollo y maduraciónde frutos (Rose y col., 1997; Brummell y col., 1999b; Civello y col., 1999; Hiwasa y col.,2003), entre otros. En frutilla se han caracterizado siete expansinas, FaEXP1 a FaEXP7.Dentro de éstas, FaEXP2 y FaEXP5 poseen una expresión asociada a fruto, que aumentaconforme avanza la maduración. En particular, la expresión de FaEXP1, FaEXP2 y FaEXP5 esmás temprana o intensa en cultivares de frutilla con menor firmeza, lo que indicaría unacierta correlación entre la expresión de estos genes y la tasa de ablandamiento (Dotto y col.,2006).6.6. Endo-1,4-β-D-glucanasas (EGasas, EC 3.2.1.4)Estas enzimas catalizan la endo-hidrólisis de polímeros que contienen residuosglucosilo contiguos unidos por enlaces β-1,4. Durante un tiempo fueron erróneamentedenominadas “celulasas” por analogía con aquellas de origen fúngico, pero hasta elmomento no se ha podido demostrar su actividad sobre celulosa cristalina. Las EGasas soncapaces de hidrolizar in vitro la carboximetilcelulosa (CMC), un derivado soluble de lacelulosa. Se pudo demostrar actividad de EGasas, purificadas a partir de palta, sobre variascarboxi e hidroximetilcelulosas, xiloglucano y mezclas de β-1,3 y β-1,4 glucanos (Hatfield yNevins, 1986). De estos polímeros ensayados, sólo el xiloglucano forma parte de la paredcelular de este fruto (Fig. 14). Sin embargo, EGasas aisladas de zonas de abscisión de porotono fueron activas sobre el xiloglucano (Durbin y Lewis, 1988). En rigor, las actividades EGasaque han sido halladas en frutos deberían denominarse CMCelulasas, dado que la CMC es elsustrato típicamente utilizado (Vicente y col., 2007). En frutilla se ha descrito la presencia dedos genes codificantes para Egasa, Cel1 y Cel2. La expresión del primero fue sólo detectadaen fruto y la misma aumenta durante la maduración (Manning, 1998). En el caso de Cel2, laexpresión fue detectada desde estadios tempranos del desarrollo y también en tejidosvegetativos (Llop-Tous y col., 1999). Con respecto a la actividad EGasa, se encontró queésta es baja en el desarrollo y estadios tempranos de la maduración, pero que aumentaconstantemente entre estadios intermedios y el sobremaduro (Manning, 1998). En el casoparticular de Cel1, se logró generar la proteína recombinante a partir del correspondiente28

INTRODUCCIÓNclon y se determinó que la misma es capaz de hidrolizar CMC de distinto grado deviscosidad, xiloglucano y celulosa fibrosa insoluble (Palomer y col., 2004).GalGalβ-galactosidasaXilXilXilXilXilα-xilosidasa-α(1→6)--α(1→6)--β(1→4)-Glc -β(1→4)-Glc -β(1→4)- Glc-β(1→4)-Glc -β(1→4)-Glc-β(1→4)-Glc -β(1→4)-Glc-β(1→4)-Glc -β(1→4)--α(1→6)--β(1→2)--β(1→2)--α(1→6)--α(1→6)-Endo β-1,4-glucanasaGlu D-glucosa Xil D-xilosa Gal D-galactosaFigura 14: Esquema del xiloglucano incluyendo los sitios de acción de algunas de lasenzimas que lo modifican. Adaptado de Somerville y col., 2004.6.7. β-D-galactosidasas (β-Gals, EC 3.2.1.23)Estas enzimas son exo-hidrolasas que catalizan la hidrólisis de residuos β-Dgalactosiloterminales de los extremos no reductores de β-D-galactósidos (Lashbrook, 2005).Los sustratos in vivo de estas enzimas serían β-1,4-galactanos no ramificados presentes encadenas laterales de RG I (Fig. 15) y ciertos residuos β-D-galactosilo pertenecientes asustituciones que contienen los xiloglucanos (Fig. 14). Se han descrito y caracterizado β-Galsen una gran cantidad de frutos (Sozzi y Civello, 2005), aunque nunca se ha hallado actividadendo en plantas superiores (Smith y col., 1998; Tateishi y col., 2007). En frutilla se hanestudiado tres genes putativos codificantes para β-Gals, Faβgal1, Faβgal2 y Faβgal3. Laexpresión de los tres pudo ser detectada tanto en frutos como en tejidos vegetativos,aunque sólo en el caso de Faβgal1 la expresión aumentó conforme avanzó la maduración(Trainotti y col., 2001). La actividad β-Gal se estudió únicamente en el cultivar Chandler, y lamisma fue indetectable o muy baja en estadios de desarrollo, pero aumentó notablemente alcomenzar la maduración (Trainotti y col., 2001).29

INTRODUCCIÓN-α(1→2)-Rha -α(1→4)-AG -α(1→2)- Rha-α(1→4)-AG -α(1→2)-Rha-α(1→4)-AG -α(1→2)-Rha-α(1→4)-AG -α(1→2)-Ara -α(1→3)-Ara -α(1→3)--α(1→5)- -α(1→5)--α(1→5)--α(1→4)-AraAraAraarabinanoGalβ-galactosidasaAra-α(1→3)-Galarabinogalactanoα-L-arabinofuranosidasaAraAra-α(1→3)--α(1→5)--β(1→4)- -β(1→4)--β(1→4)--β(1→4)-GalGalGal-β(1→4)--β(1→4)-Rha L-ramnosaAGÁcido D-galacturónicoGal D-galactosaAra L-arabinosaFigura 15: Representación esquemática del ramnogalacturonano I (RG I), junto conel sitio de acción de algunas de las enzimas intervinientes en su modificación.Adaptado de Somerville y col., 2004.6.8. α-L-arabinofuranosidasas (α-L-aras, EC 3.2.1.55)Son exo-hidrolasas que intervienen en la remoción de residuos terminales α-Larabinofuranosilono reductores de varios homopolisacáridos (arabinanos) yheteropolisacáridos (arabinogalactanos, arabinoxilanos, arabinoxiloglucanos,glucuronoarabinoxilanos, etc.) de polímeros pécticos y hemicelulósicos, así como de distintosglucoconjugados (Sozzi y Civello, 2005). En las figuras 15 y 16 se muestran los sitios deacción sobre el RG I y los (glucuronoarabino) xilanos, respectivamente. Su actividad ha sidodetectada durante la maduración de un gran número de frutos: pera japonesa (Tateishi ycol., 1996; Tateishi y col., 2005), manzana (Yoshioka y col., 1995; Goulao y col., 2007),durazno (Brummell y col., 2004; Jin y col., 2006), tomate (Sozzi y col., 2002a; Itai y col.,2003), banana (Zhuang y col., 2007), entre otros. No se ha informado la existencia deactividad o expresión α-L-ara en frutilla hasta la fecha.6.9. Endo-β-1,4-D-xilanasas o 1,4-β-xilano endohidrolasas (Xasas, EC 3.2.1.8)Estas enzimas serían responsables de la hidrólisis interna de los enlaces β-1,4 entreresiduos de xilosa que forman parte de los xilanos (Fig. 16), principalmente en las zonasdonde éstos no se encuentran sustituidos por residuos de arabinosa (Cleemput y col., 1997).30

INTRODUCCIÓNSe ha registrado actividad Xasa en palta, la cual no varía durante el almacenaje de frutosmaduros a lo largo de 8 días (Ronen y col., 1991). No se ha descrito actividad o expresiónXasa en frutilla hasta el momento.AGlxilanasaAraXil -β(1→4)-Xil -β(1→4)- Xil-β(1→4)-Xil -β(1→4)-Xil-β(1→4)-Xil -β(1→4)-Xil-β(1→4)-Xil -β(1→4)--α(1→2)--α(1→2)-α-L-arabinofuranosidasaβ-xilosidasaAGl Ácido D-glucurónico Xil D-xilosa Ara L-arabinosaFigura 16: Representación esquemática del (glucuronoarabino) xilano y de losposibles sitios de acción de las enzimas más caracterizadas que están involucradas ensu modificación. Adaptado de Somerville y col., 2004.6.10. β-D-xilosidasas (β-xils, EC 3.2.1.37)Son enzimas capaces de hidrolizar enlaces terminales β-1,4 entre residuos de xilosadel extremo no reductor. Es decir son enzimas de actividad exo y tendrían como sustratoxilo-oligosacáridos (Cleemput y col., 1997), productos de la acción de las Xasas sobre losxilanos (Fig. 16). Se ha descrito actividad β-xil en frutos de carozo (Bouranis y Niavis, 1992),palta (Ronen y col., 1991), oliva (Fernández-Bolaños y col., 1995), tomate (Itai y col., 2003),pera japonesa (Itai y col., 1999) y frutilla (Martínez y col., 2004). Particularmente en esteúltimo caso, se ha identificado un gen putativo codificante para β-xil (FaXyl1) cuya expresiónfue predominantemente asociada al receptáculo (Martínez y col., 2004).6.11. Otras enzimasExiste una gran cantidad de enzimas que han sido menos estudiadas y caracterizadasque las ya mencionadas, y que intervendrían, junto con las anteriores, en la modificación dela pared celular durante la maduración de frutos. Las ramnogalacturonano I hidrolasas yliasas (RGasas), tendrían la capacidad de hidrolizar enlaces internos de la cadena principal delos RG I. Si bien se han identificado varias RGasas fúngicas, se ha prestado escasa atencióna su intervención en la maduración (Vicente y col., 2007). Componen además este grupo deenzimas escasamente estudiadas las acetiltransferasas, α-glucosidasas, α-galactosidasas, β-manosidasas, β-1,4-endomananasas, etc.31

INTRODUCCIÓNA pesar del número creciente de trabajos relacionados con la degradación de la paredcelular en frutillas, aún no está claramente establecido cuál o cuáles son los mecanismosinvolucrados y/o relevantes en el proceso. Determinar las bases bioquímicas de los mismossería de central importancia para establecer estrategias que permitan detener o lentificar ladegradación de la pared y, de esta manera, prolongar la vida postcosecha de frutillas, con laconsecuente disminución de pérdidas económicas durante este período.32

HIPÓTESIS DE TRABAJO Y OBJETIVOS

Hipótesis de trabajo:La hipótesis a validar es que la diferencia en las velocidades de ablandamiento dedistintas variedades de frutillas se debe a la degradación diferencial de algún o algunos delos componentes de la pared celular, lo cual reflejaría la acción específica de alguna/s de lasenzimas involucradas en dicha degradación.Objetivos:a. generales: profundizar en el conocimiento de los mecanismos involucrados en elablandamiento de frutillas.b. particulares:‣ Analizar los cambios en los distintos componentes de la pared celular durante lamaduración de variedades de frutillas con diferente patrón de ablandamiento.‣ Estudiar la actividad de diferentes enzimas y proteínas involucradas en ladegradación de la pared celular.‣ Caracterizar la actividad y expresión génica de α-L-arabinofuranosidasa a lo largo dela maduración.

MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES Y MÉTODOS1. Material vegetalSe utilizaron frutillas (Fragaria x ananassa Duch.) obtenidas de cultivos locales (LaPlata, Provincia de Buenos Aires, Argentina). Los tres cultivares empleados, que seseleccionaron en base a diferentes características de ablandamiento durante el desarrollo yla maduración, fueron: Camarosa, Pájaro y Toyonaka. Los frutos se cosecharon y seclasificaron según su tamaño y color superficial en verde pequeño (Vp), verde grande (Vg),blanco (B), 25% rojo (25%R), 50% rojo (50%R), 75% rojo (75%R) y 100% rojo (100%R).A su vez, se utilizaron tejidos tales como pétalo (P), hoja (H), sépalo (S) y aquenios de frutosVg y 75%R. Las muestras se lavaron, secaron, cuartearon y congelaron con N 2 líquido.Inmediatamente se almacenaron a -80 °C hasta su uso.2. Medida de la firmezaLa firmeza se midió usando un Texture Analyzer (TA.XT2, Stable Micro SystemsTexture Technologies, Scarsdale, NY) provisto de una sonda plana de 3 mm de diámetro.Cada fruto se penetró 7 mm a una velocidad de 0,5 mm s -1 y se registró la fuerza máximadesarrollada durante el ensayo. Cada fruto se midió por duplicado en zonas opuestas a lolargo de su plano ecuatorial. Se analizaron 30 frutos de cada cultivar en cada estadio.3. Aislamiento de polisacáridos de pared celularLos polisacáridos totales de pared celular se obtuvieron como residuo insoluble enalcohol (RIA) de acuerdo con d´Amour y col. (1993), con algunas modificaciones.Aproximadamente 10 g de frutos congelados se homogeneizaron con 4 volúmenes de etanolabsoluto y la mezcla se hirvió con reflujo durante 30 min. El homogenato se filtró y elresiduo sólido se lavó tres veces con 15 ml de etanol absoluto. Posteriormente, el residuo sesecó durante 14 h a 37 °C y se determinó el peso.4. Extracción y cuantificación de pectinasLos poliurónidos se aislaron de acuerdo con d´Amour y col. (1993) y Nara y col.,(Nara y col., 2001) con algunas modificaciones. Cien mg de RIA se suspendieron en 100 mlde agua destilada y se agitaron durante 14 h a 20 °C. La suspensión se filtró y el sólido selavó 3 veces con 10 ml de agua destilada. Los filtrados se denominaron pectinas solubles enagua (PSA). El residuo se resuspendió en 100 ml de acetato de sodio 0,05 M conteniendoEDTA 0,04 M, pH 4,5 y se agitó durante 4 h a 20 °C. El homogenato se filtró y el sólidoresultante se lavó 3 veces con la misma solución. Los filtrados se rotularon como pectinassolubles en EDTA (PSE). El sólido proveniente de la extracción previa se resuspendió en HCl36

MATERIALES Y MÉTODOS0,05 M y se sometió a agitación a una temperatura de 100 °C durante 1 h. Luego deenfriados, las suspensiones se filtraron y el residuo se lavó 3 veces con 7 ml de HCl 0,05 M.Los filtrados se denominaron pectinas solubles en HCl (PSH). Se estimó la concentración deácidos urónicos de cada fracción por el método del 2-fenilfenol (Blumenkrantz y Asboe-Hansen, 1973) usando ácido galacturónico (AG) 1 mM (Fluka) para construir una curva decalibración. El contenido de azúcares neutros (AN) de cada fracción se estimó por el métodode antrona utilizando glucosa como estándar (d´Amour y col., 1993).5. Extracción y cuantificación de hemicelulosas y celulosaEl residuo resultante de la extracción de pectinas se agitó durante 8 h con 100 ml deNaOH 4 M a 20 °C. El homogenato se filtró y lavó con 5 ml de NaOH 4 M. Los filtrados,compuestos fundamentalmente por hemicelulosas, se denominaron Hem y el sólidoremanente, celulosa (Cel). El contenido de ambas fracciones se midió mediante una hidrólisiscon H 2 SO 4 66% v/v a 37 °C durante 60 min y seguidamente se llevó a cabo la cuantificaciónmediante el método de antrona (d´Amour y col., 1993). Se utilizaron cantidades variables deglucosa 40 mg % para construir una curva de calibración.6. Cromatografía de exclusión molecular6.1 PectinasMuestras de PSH conteniendo 2 mg de pectinas (como equivalentes de AG) sedializaron contra 20 volúmenes de agua destilada durante 16 h, se liofilizaron yresuspendieron en 4 ml de solución reguladora A (acetato de sodio/ácido acético 0,05 M,EDTA 50 mM, NaCl 0,05 M, pH 5,0). En el caso de las muestras de PSA, directamente seliofilizó el volumen conteniendo 2 mg de pectinas (equivalentes de AG) y se resuspendió en4 ml de solución reguladora A. Los extractos concentrados se cargaron en una columna de97 x 1,5 cm empacada con Sephacryl S-400 previamente equilibrada con solución A. Laelución se realizó con la misma solución reguladora A, operando a un flujo constante de 1 mlmin -1 . Se colectaron fracciones de 2 ml y se cuantificó el contenido de AG en cada fraccióncomo se describe en la sección 4.6.2 HemicelulosasMuestras de Hem conteniendo 2 mg de hemicelulosas (como equivalentes deglucosa) se neutralizaron con HCl 12 M y se dializaron contra 20 volúmenes de aguadestilada durante 16 h, realizando al menos tres cambios de solvente. A continuación, las37

MATERIALES Y MÉTODOSmuestras se liofilizaron y el sólido obtenido se disolvió en 4 ml de solución reguladora B(citrato de sodio 0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 5,5). Los extractos se cargaron en una columna de97 x 1,5 cm empacada con Sephacryl S-400 previamente equilibrada con solución B. Laelución se realizó con la misma solución reguladora B, operando a un flujo constante de 1 mlmin -1 . Se colectaron fracciones de 2 ml y se cuantificó el contenido de glucosa en cadafracción como se describe en la sección 5.7. Preparación de extractos y medida de la actividad de enzimas de modificación de paredcelularTodas las etapas (homogeneización, centrifugación, incubación) durante lapreparación de cada uno de los extractos se realizaron entre 0 y 4 °C. Se prepararon dosextractos independientes para cada estadio de cada cultivar y se realizaron cinéticas porduplicado. Cada cinética incluyó la extracción de alícuotas de mezcla de reacción a cuatrotiempos distintos (incluyendo una alícuota a tiempo cero), excepto en la cinética para PME. Apartir de cada una de estas muestras se hicieron determinaciones colorimétricas porduplicado. En todos los casos se realizaron los blancos de reacción correspondientes, loscuales se contemplaron para el cálculo de los valores de actividad informados en losresultados.7.1. Pectin metilesterasa (PME)Frutos congelados (10 g) se homogeneizaron en un Omni-Mixer (OCI Instruments)con 30 ml de NaCl 1 M, PVPP 1% como solución de extracción. La mezcla se incubó durante4 h a 4 °C con agitación y posteriormente se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min. Sedescartó el sólido y el pH de la solución se ajustó a 7,5 con NaOH 2 M. El extracto resultantese utilizó para determinar la actividad PME (EC. 3.1.1.11) espectrofotométricamente(Hagerman y Austin, 1986). La mezcla de reacción preparada contuvo 600 μl de pectinas defrutos cítricos (Sigma) 1% p/v (pH 7,5), 150 μl de azul de bromotimol 0,01% p/v en soluciónde fosfato de potasio 0,003 M (pH 7,5) y 100 μl de extracto. La cinética se realizó a 37 °C,monitoreando el cambio en la absorbancia a 620 nm cada 30 seg durante 15 min. Comoconsecuencia de la hidrólisis del enlace éster se genera metanol, y el C-6 presente en losresiduos de ácido galacturónico de las pectinas se transforma en un grupo carboxilo. Ladisociación de este grupo carboxilo genera protones que producen un descenso en el pH delmedio de reacción, el cual es responsable del viraje del indicador. Por su parte, el viraje delindicador (desde el azul hacia el amarillo) hace que la absorbancia a 620 nm descienda. Se38

MATERIALES Y MÉTODOSpreparó una curva de calibración con cantidades variables de ácido D(+)-galacturónico 1 mM(Fluka).7.2. Poligalacturonasa (PG)La metodología utilizada para la estimación de la actividad PG total se adaptó deNogata y col. (1993). Durante la puesta a punto de los protocolos de extracción y actividadPG se emplearon extractos de tomate como control. Diez gramos de frutos congelados sehomogeneizaron con 30 ml de solución reguladora acetato de sodio/ácido acético 0,05 M,PVPP 1% p/v (pH 6,0). La mezcla se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min y se descartó elsobrenadante. El residuo sólido se lavó con 30 ml de acetato de sodio/ácido acético 0,05 M(pH 6,0) y luego se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min. Se descartó el sobrenadante y elpaso de lavado se repitió una vez más. El residuo sólido resultante del segundo lavado seextrajo con 20 ml de acetato de sodio/ácido acético 0,05 M (pH 6,0), NaCl 1 M con agitacióna 4 °C durante 3 h. Se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min y se dializó el sobrenadantedurante 14 h contra 20 volúmenes de solución de acetato de sodio/ácido acético 0,05 M, pH6,0. El extracto dializado se utilizó para la determinación de la actividad poligalacturonasatotal (tanto endo como exo). Se preparó una mezcla de reacción conteniendo 700 μl deácido poligalacturónico 0,3% p/v disuelto en solución reguladora acetato de sodio/ácidoacético 0,05 M (pH 6,0) y 700 μl de extracto. La cinética se llevó a cabo a 37 °C, se tomaronalícuotas a las 0, 6, 12 y 24 h y se congelaron inmediatamente con nitrógeno líquido parainterrumpir la reacción. Se cuantificó el ácido galacturónico liberado por el método de la 2-cianoacetamida (Gross, 1982) y se realizó una curva de calibración utilizando cantidadesvariables de ácido galacturónico 1 mM (Fluka).7.3. Endo-β-1,4-glucanasa (EGasa)Se homogeneizaron 10 g de tejido con 30 ml de solución reguladora acetato desodio/ácido acético 0,05 M, PVPP 1% p/v, pH 6,0. La mezcla se centrifugó a 12.000 x gdurante 30 min y se descartó el sobrenadante. El residuo sólido se lavó con 30 ml de acetatode sodio/ácido acético 0,05 M (pH 6,0) y luego se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min.Se descartó el sobrenadante y el paso de lavado se repitió una vez más. El residuoresultante del segundo lavado se extrajo con 20 ml de acetato de sodio/ácido acético 0,05 M(pH 6,0), NaCl 1 M con agitación a 4 °C durante 4 h. Se centrifugó a 12.000 x g durante 30min y el sobrenadante se utilizó como extracto para la determinación de la actividad EG(Vicente y col., 2005), utilizando la siguiente mezcla de reacción: 500 μl carboximetil celulosa2% p/v en solución de acetato de sodio/ácido acético 0,05 M (pH 6,0) y 1.500 μl de39

MATERIALES Y MÉTODOSextracto. La incubación se llevó a cabo a 37 °C, se extrajeron alícuotas de 350 μl a 0, 11, 23y 27 h y la reacción se detuvo por congelamiento con nitrógeno líquido y posterioralmacenamiento a -20 °C hasta la cuantificación. Los residuos reductores generados secuantificaron mediante el método descrito por Miller (1959) que utiliza una solución de ácido3,5-dinitro salicílico (141,6 ml de agua en los que se disolvieron 1,06 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico, 1,98 g de NaOH, 30,6 g de tartrato de sodio y potasio, 0,709 g de fenol y 0,83 g demetabisulfito de sodio). Se utilizó glucosa 3 mM en cantidades variables, para la elaboraciónde una curva de calibración.7.4. Xilanasa (Xnasa)Se homogeneizaron 10 g de frutos congelados con 30 ml de solución reguladoraacetato de sodio/ácido acético 0,05 M, PVPP 1% p/p (pH 6,0). La mezcla se centrifugó a12.000 x g durante 30 min y se descartó el sobrenadante. El residuo sólido se lavó con 30 mlde acetato de sodio/ácido acético 0,05 M (pH 6,0) y luego se centrifugó a 12.000 x gdurante 30 min. Se descartó el sobrenadante y el paso de lavado se repitió una vez más. Elresiduo sólido resultante del segundo lavado se extrajo con 20 ml de acetato de sodio/ácidoacético 0,05 M (pH 6,0), NaCl 1 M con agitación a 4 °C durante 3 h. Se centrifugó a 12.000 xg durante 30 min y el sobrenadante se utilizó como extracto para la determinación de laactividad xilanasa (EC 3.2.1.8). Se preparó una mezcla de reacción con 700 μl de xilano deavena 0,5% p/v disuelto en acetato de sodio/ácido acético 0,1 M (pH 4,5) y 700 μl deextracto. La cinética se realizó a 37 °C, se tomaron alícuotas de 300 μl a las 0, 12, 18, 24 h yse interrumpió la reacción por congelamiento con nitrógeno líquido. Los residuos reductoresgenerados se detectaron por el método del ácido 3,5-dinitro salicílico (Miller, 1959), tal comose describió en el punto 7.3.7.5. β-xilosidasa (β-xil)Frutos congelados (10 g) se homogeneizaron con 30 ml de solución reguladoraacetato de sodio/ácido acético 0,05 M, NaCl 1 M, PVPP 1% p/v, pH 6. La suspensiónobtenida se agitó durante 3 h a 4 °C y luego se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min. Seseparó el sobrenadante y se utilizó como extracto para la determinación de la actividad β-xilosidasa (EC 3.2.1.37) (Martínez y col., 2004). Se incubó a 55 °C la siguiente mezcla dereacción: 320 μl p-nitrofenil-β-D-xilopiranósido 0,01 M en solución reguladora acetato desodio/ácido acético 0,05 M (pH 5,0) y 430 μl de extracto. Se tomaron alícuotas de 175 μl alas 0, 1, 2 y 4 h, se detuvo la reacción por congelamiento con nitrógeno líquido yposteriormente se almacenó a -20 °C hasta la cuantificación. Finalizada la cinética, a 50 μl40

MATERIALES Y MÉTODOSde alícuota de mezcla de reacción se le adicionaron 150 μl de TRIS 1% p/v y seguidamentese midió la absorbancia a 410 nm. Se generó una curva de calibración con cantidadesvariables de p-nitrofenol 1mM (Merck).7.6. β-galactosidasa (β-Gal)Diez gramos de frutos se homogeneizaron con 30 ml de solución reguladora acetatode sodio/ácido acético 0,05 M, NaCl 1 M, PVPP 1% p/v, pH 6. La suspensión se agitó durante2 h a 4 °C y luego se centrifugó a 12.000 x g durante 30 min. El sobrenadante se utilizócomo extracto para la determinación de actividad β-galactosidasa (EC 3.2.1.23) (Trainotti ycol., 2001). La cinética se llevó a cabo a 37 °C, y la mezcla de reacción contuvo: 450 μlacetato de sodio/ácido acético 0,05 M (pH 4,5), 350 μl de p-nitrofenil-β-D-galactopiranósido(Sigma) 0,03 M disuelto en la misma solución reguladora y 1,2 ml de extracto. Se tomaronalícuotas de la mezcla de reacción (150 μl) a 0, 20, 40 y 60 min, se interrumpió la reacciónpor adición de 500 μl de Na 2 CO 3 0,4 M y se reservó a 4 °C hasta el momento de lacuantificación espectrofotométrica. La cantidad de p-nitrofenol liberada se estimó por medidade la absorbancia a 410 nm. Se preparó una curva de calibración con cantidades variables dep-nitrofenol 1 mM (Merck).7.7. α-L-arabinofuranosidasa (α-L-ara)Dado que la actividad α-L-ara no se había descrito hasta el momento, se ensayarondistintas composiciones de la solución de extracción en base a los conocimientosbibliográficos de otras especies. Se realizaron extracciones con soluciones que incluían o noTriton X-100 0,05% v/v, combinadas con presencia o ausencia de ZnCl 2 1 mM. Se practicaronademás dos tiempos de extracción, 4 y 14 h. El protocolo optimizado para la extracción ycuantificación de la actividad α-L-Ara de frutilla se detalla a continuación. Se homogeneizaron10 g de tejido con 30 ml de solución de extracción acetato de sodio/ácido acético 0,05 M (pH6,0), NaCl 1 M, Triton X-100 0,05% v/v, EDTA 0,01 M, PMSF 2 mM, PVPP 1% p/v. Lasuspensión resultante se colocó durante 4 h en un agitador orbital a 4 °C y luego secentrifugó a 12.000 x g durante 30 min. El sobrenadante se utilizó para la determinación dela actividad α-L-Ara (EC 3.2.1.55) usando 4-nitrofenil-α-L-arabinofuranósido como sustratode acuerdo con Tateishi y col. (1996), con mínimas modificaciones. Se preparó una mezclade reacción conteniendo 300 μl de sustrato disuelto en solución reguladora ácidocítrico/citrato de sodio 0,15 M (pH 4,5) y 250 μl de extracto. La mezcla se incubó a 37 °C, setomaron alícuotas de 130 μl a los 0, 15, 30 y 45 min y se congelaron con nitrógeno líquidocon el objeto de detener la reacción. Para realizar la detección del p-nitrofenol generado, se41

MATERIALES Y MÉTODOSadicionaron 150 μl de Na 2 CO 3 0,4 M a 50 μl de mezcla de reacción. Se registró la absorbanciaa 410 nm y se construyó una curva de calibración con p-nitrofenol 1 mM (Fluka) comoestándar.8. Cromatografía de exclusión molecular de proteínas con actividad α-L-arabinofuranosidasaFrutos congelados del cultivar Toyonaka en estadios B y 100%R se homogeneizaronen un Omni-Mixer con 90 ml de solución reguladora acetato de sodio/ácido acético 0,05 M(pH 6,0), cisteína 0,01 M, EDTA 0,01 M, PMSF 2 mM, PVPP 1% p/v. La suspensión resultantese centrifugó a 12.000 x g durante 30 min, se descartó el sobrenadante y el residuo sólido selavó con 90 ml de acetato de sodio/ácido acético 0,05 M (pH 6,0), cisteína 0,01 M, EDTA0,01 M, PMSF 2 mM. Se centrifugó a 12.000 x g durante 15 min y se descartó elsobrenadante. Este paso se repitió una vez más y el residuo sólido resultante se extrajodurante 4 h con agitación con acetato de sodio/ácido acético 0,05 M (pH 6,0), cisteína 0,01M, EDTA 0,01 M, PMSF 2 mM, azida de sodio 0,01 M, NaCl 1 M y Triton X-100 0,05% v/v.Luego de una centrifugación a 12.000 x g durante 30 min, el sobrenadante se dializó contra20 volúmenes de solución reguladora acetato de sodio/ácido acético 0,05 M (pH 6,0), EDTA0,01 M durante 3 h, con un reemplazo de la solución reguladora. Al extracto dializado se leagregó acetona hasta una concentración final de 20% v/v. Se dejó con agitación suavedurante 15 min y se centrifugó durante 20 min a 9.000 x g. El sobrenadante se separó y sereajustó la concentración final de acetona al 60% v/v. Se centrifugó, se eliminó elsobrenadante y el residuo obtenido se disolvió en 3 ml de solución reguladora ácidocítrico/citrato de sodio 0,15 M (pH 4,5), NaCl 1 M. Un volumen de 1,7 ml del extractoproteico se fraccionó en una columna (40 x 1,6 cm) empacada con Sephacryl S-100, preequilibradacon la solución reguladora anterior. La columna se eluyó con la misma soluciónreguladora a un flujo constante de 0,4 ml min -1 . Se colectaron fracciones de 0,8 ml deleluato, y 0,2 ml de cada una de ellas se utilizaron para ensayar la actividad α-L-ara tal comose describió en el punto 7.7.9. Clonado del ADNc de α-L-arabinofuranosidasaSe diseñó un par de cebadores para la amplificación de secuencias putativas de α-Larautilizando el programa CODEHOP, disponible para su utilización on-line (Rose y col.,1998b), (L2Ara y R2Ara, ver Tabla II) usando las secuencias de otras especies vegetalesdisponibles en el GenBank. Se utilizó una biblioteca de ADNc proveniente de frutillas enestadios entre 25%R y 75%R (cv Chandler) (Civello y col., 1999) como molde para lasreacciones de amplificación por PCR. El programa de temperaturas empleado fue: 1 ciclo de42

MATERIALES Y MÉTODOS4 min a 95 °C; 30 ciclos de 1 min a 95 °C, 1 min a 50 °C, 1 min a 72 °C; 1 ciclo de 7 min a72 °C. El producto de amplificación se analizó en un gel de agarosa 1,2% p/v, se extrajo dela banda del gel mediante el kit GFX (Amersham Biosciences, Little ChalfontBuckinghamshire, UK) y se clonó en el plásmido pGEM-T easy vector (Promega, Madison,WI). Se procedió a la secuenciación (Servicio de Secuenciación de ADN, Instituto deInvestigaciones Biotecnológicas, UNSAM) del fragmento clonado para confirmar suhomología con α-L-aras presentes en el GenBank. Este fragmento se empleó en lageneración de una sonda (SONDA S, Tabla II) para la búsqueda en la biblioteca de ADNc defruto ya mencionada. Para ello se plaquearon 4,2 x 10 5 ufc y se dejaron en contacto conmembranas de nailon Hybond-N+ (Amersham-Pharmacia) durante 2 min para transferir lasplacas de lisis a la misma. Los ácidos nucleicos presentes en las membranas se fijaronmediante irradiación con luz ultravioleta (UV-Stratalinker, Stratagene) y las membranas seprehibridaron durante 4 h a 42 °C con una solución conteniendo formamida 50% v/v, SSPE6x, solución Denhart 5x, ADN de esperma de salmón desnaturalizado 150 μg ml -1 y SDS0,5% p/v. Seguidamente, se adicionó la SONDA S marcada con 32 P y se realizó unahibridación de las membranas durante 14 h a 42 °C. Las membranas se lavaron una vezdurante 30 min a 42 °C y dos veces durante 30 min a 50 °C, con 25 ml de SSC 1x y SDS0,1% p/v. Una vez lavadas, las membranas se expusieron a placas radiográficas (X-OMATAR, Kodak) con una pantalla intensificadora a -80 °C. Las placas se procesaron para surevelado de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Las placas de lisis que hibridizaroncon la sonda marcada se sometieron a dos rondas adicionales de búsqueda para supurificación. A continuación se procedió a la escisión del fagémido de acuerdo a lasinstrucciones para la manipulación de la biblioteca (Stratagene) y los clones se secuenciaronmediante el servicio de Macrogen (Seúl, Corea del Sur).10. Aislamiento de ARN total y análisis de expresión de α-L- ara mediante Northern-blotSe aisló ARN total a partir de frutos en diferentes estadios, y de otros tejidos comopecíolo, hoja, sépalo y aquenios de frutos Vg y 75%R, mediante el método del boratocaliente (Wan y Wilkins, 1994). Cada muestra de ARN (10 μg) se analizó en geldesnaturalizante de agarosa 1,1% p/v y formaldehido 1% v/v. Posteriormente, se transfirióel ARN por capilaridad a una membrana de nailon Hybond-N+ (Amersham-Pharmacia). Losácidos nucleicos se fijaron a las mismas mediante irradiación con luz ultravioleta (UV-Stratalinker, Stratagene). Las membranas se prehibridaron durante 4 h a 42 °C con unasolución conteniendo formamida 50% v/v, SSPE 6x, solución de Denhart 5x, ADN deesperma de salmón desnaturalizado 150 μg ml -1 y SDS 0,5% p/v. Con el producto purificado43

MATERIALES Y MÉTODOSde la correspondiente PCR (ver Tabla II) se sintetizó la sonda denominada SONDA S,utilizada en este ensayo de Northern-blot. Se adicionó dicha sonda marcada con 32 P y lasmembranas se hibridaron durante 14 h a 42 °C Las membranas se lavaron una vez durante30 min a 42 °C y dos veces durante 30 min a 50 °C, con 25 ml de SSC 1x y SDS 0,1% p/v.Una vez lavadas, las membranas se expusieron a placas radiográficas (X-OMAT AR, Kodak)con una pantalla intensificadora a una temperatura de -80 °C. Las placas se procesaron parasu revelado de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Como control de carga se utilizóARN r teñido con bromuro de etidio.Tabla II: Nomenclatura y secuencia de los cebadores utilizados para lageneración de sondas. Se aclara además, el molde empleado, el tamaño delproducto de PCR purificado y el nombre dado a la sonda sintetizada con dichoproducto.Cebador Secuencia Molde TamañoL2AraR2AraAra 1DAra 1R5’-GACCAAAGGCTTTTGTTTCTGARTAYGCNGT-3’5’-GAATAACCTTATTTGGTTCATTAAAAGAATTYTCRTCCAT-3’5’-TCGGGCTTGAGAAAAACAGCG-3’5’-GAGATAGAGGAAGAATCAGCG-3’BibliotecaADNc fruto25-75%RBibliotecaADNc fruto25-75%RNombresonda528 pb SONDA S558 pb SONDA 1Ara 2DAra 2R5’-GAGTACTTCCACTGTGTTCC-3’5’-GTGCAGAAAGTCCAACATCC-3’BibliotecaADNc fruto25-75%R507 pb SONDA 2Rib 5Rib 35’-ACCGTAGTAATTCTAGAGCT-3’5’-AGAGATAGAGGAAGAATTAGTG-3’BibliotecaADNc fruto25-75%R200 pb SONDA R11. RT-PCR semicuantitativaSe sintetizó una primera hebra de ADNc usando la siguiente mezcla de reacción: 1 μgde ARN total, dNTPs 0,03 mM, 1 μl de transcriptasa reversa (Moloney murine leukemia virusreverse transcriptase; 200 U μl -1 ), 5 μl de solución reguladora de reacción 5x (Tris-HCl 250mM, KCl 375 mM, MgCl 2 15 mM, DTT 50 mM, pH 8,3) y 330 pmoles de cebadores al azar(Biodynamics, Argentina) en un volumen total de 25 μl. La mezcla se incubó durante 1,5 h a38 °C. Se utilizó ARN total de frutos de los cultivares Camarosa y Toyonaka en los estadiosVp, B, 50%R, 75%R y 100%R. Se realizó una amplificación por PCR con 2,4 μl de producto44

MATERIALES Y MÉTODOSde transcripción reversa como molde, 4 μl de solución reguladora 10x Taq polimerasa (KCl500 mM, Tris-HCl 100 mM, MgCl 2 , pH 9), dNTPs 50 μM, 1 U Taq polimerasa (Promega) ycebadores 0,1 μM, en un volumen total de 40 µl. Para cada par de cebadores, se realizarongradientes de concentración de MgCl 2 y temperatura de anillado, utilizando plásmidospurificados (miniprep) de cada clon como molde, a una concentración final de 0,62 pM, conel objetivo de determinar las condiciones en las que no ocurriera amplificación cruzada. En elcaso de los tres pares de cebadores se obtuvieron resultados óptimos cuando se empleóMgCl 2 a una concentración final de 0,5 mM. Para FaAra1 se emplearon los cebadoresFaAra1L y FaAra1R (ver Tabla III) y se utilizó el siguiente programa de temperatura: un ciclode 5 min a 95,0 ºC; 23, 27, 31 o 35 ciclos de 45 s a 95,0 ºC, 1 min a 60,0 ºC, 1 min a 72,0ºC; un ciclo a 72,0 ºC durante 7 min. En el caso de FaAra2, los cebadores utilizados fueronFaAra2L y FaAra2R (ver Tabla III) y el programa de temperaturas consistió en: un ciclo de 5min a 95,0 ºC; 23, 27, 31 o 35 ciclos de 45 s a 95,0 ºC, 1 min a 62,5 ºC, 1 min a 72,0 ºC;un ciclo a 72,0 ºC durante 7 min. Para FaAra3 se emplearon los cebadores FaAra3L yFaAra3R (ver Tabla III) y el programa elegido consistió en: un ciclo de 5 min a 95,0 ºC; 31,34, 37 o 40 ciclos de 45 s a 95,0 ºC, 1 min a 60,0 ºC, 1 min a 72,0 ºC; un ciclo a 72,0 ºCdurante 7 min. Para realizar la corrección de cantidad de molde empleada en la PCR, seutilizó ARNr 18S de frutilla utilizando los cebadores Rib5 y Rib3 (ver Tabla II). En este caso lamezcla de PCR contuvo MgCl 2 1,5 mM, dNTPs 50 μM y 0,3 μM de cada cebador. Lascondiciones de amplificación fueron: 5 min a 95,0 ºC; 16, 20, 24 o 28 ciclos de 45 s a 95,0ºC, 1 min a 62,0 ºC, 1 min a 72,0 ºC y un ciclo de 7 min a 72,0 ºC. Los productos de PCR seresolvieron en geles de agarosa 0,7% p/v. Los geles se sumergieron en solución dedesnaturalización (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M) durante 30 min con agitación suave y luego ensolución de neutralización (NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5) durante 30 min. Se transfirióel ADN por capilaridad a una membrana de nailon Hybond-N+ (Amersham Biosciences). Losácidos nucleicos presentes en las membranas se fijaron a las mismas mediante irradiacióncon luz ultravioleta (70.000 μJoule cm -2 , UV-Stratalinker, Stratagene). Las membranas seprehibridaron durante 4 h a 42 °C con una solución conteniendo formamida 50% v/v, SSPE6x, solución de Denhart 5x, ADN de esperma de salmón desnaturalizado 150 μg ml -1 y SDS0,5% p/v. Para la detección de FaAra1 y FaAra2, se empleó la SONDA 1, mientras que en elcaso de FaAra3 se utilizó la SONDA 2 (ver Tabla II). Seguidamente, se adicionó lacorrespondiente sonda marcada con 32 P y las membranas se hibridaron durante 14 h a 42°C. Las membranas se lavaron una vez durante 30 min a 42 °C y dos veces durante 30 mina 50 °C, con 25 ml de SSC 1x y SDS 0,1% p/v. Una vez lavadas, las membranas seexpusieron a placas radiográficas (X-OMAT AR, Kodak) con una pantalla intensificadora a -8045

MATERIALES Y MÉTODOS°C. Las placas se procesaron para su revelado de acuerdo a las especificaciones delfabricante. Se escanearon las placas y se analizaron con el programa Gel-Pro Analyzer(Media Cybernetics, Maryland, EEUU) para determinar el rango de ciclo para los cuáles elproducto de la amplificación siguiera un patrón lineal. Se eligieron los ciclos 24, 31 y 37 paraARN r 18S, FaAra1-FaAra2 y FaAra3, respectivamente. La cuantificación de la intensidad delas bandas en el ciclo 24 del ARN r 18S, permitió corregir diferencias en la cantidad de molde(RT) utilizado en cada una de las RT-PCR. Es decir, que seguidamente se realizaron nuevosgeles con los productos de FaAra1, FaAra2, FaAra3 y 18S, en los ciclos elegidos para cadauno, teniendo en cuenta correcciones según diferencias en la cantidad de molde utilizada. Seprocedió como se describió anteriormente para transferir el DNA y generar membranas quese hibridaron con su correspondiente sonda radiactiva. Una vez que se comprobó que lascantidades de amplificación de 18S eran similares en todos los estadios en ambas variedadesestudiadas, fue posible la comparación de las intensidades de las tres FaAras entre estadiosy cultivares.Tabla III: Cebadores utilizados para el estudio de expresión génica deFaAras por RT-PCR semicuantitativa. Se muestra la secuencia de cada unojunto con el tamaño del producto de PCR.Cebador Secuencia TamañoFaAra1LFaAra1RFaAra2LFaAra2RFaAra3LFaAra3R5’-TCGGGCTTGAGAAAAACAGTG-3’5’-AGAGATAGAGGAAGAATTAGTG-3’5’-TCGGGCTTGAGAAAAACAGCG-3’5’-GAGATAGAGGAAGAATCAGCG-3’5’-GAGTACTTCCACTGTGTTCC-3’5’-GTGCAGAAAGTCCAACATCC-3’559 pb558 pb506 pb12. Análisis de secuencias y filogeniaSe realizó un alineamiento de las secuencias proteicas putativas de FaAra1, FaAra2 yFaAra3 con otras α-L-aras presentes en el GenBank. Para generar dicho alineamiento seempleó el método ClustalW (Thompson y col., 1994) utilizando el servicio GenomeNet de lapágina web de la Universidad de Kyoto (http://align.genome.jp). Para el análisis filogenético46

MATERIALES Y MÉTODOSse utilizó el programa MEGA3 (Kumar y col., 2004). El análisis de reconstrucción se llevó acabo por el método de Neighbour-Joining, con modelo de corrección amino Poisson y unbootstrap con 1025 replicados.13. Análisis estadísticoLos datos del contenido de componentes de pared y actividades enzimáticas seanalizaron por el método ANOVA y las medias se compararon por el test LSD con un nivel deconfianza de 0,05. Se representan con letra distinta, diferencias significativas entre lasmedias de distintos cultivares al ser comparadas en un mismo estadio. En la Fig. 14, en laque se observa el contenido de pectinas y AN totales, se muestra la desviación estándarasociada a cada valor.47

SECCIÓN A: Componentes de la pared celular

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celular1. Firmeza de los frutosEn frutilla la transición entre el final del desarrollo y el comienzo de la maduración noestá tan claramente delimitada como ocurre en otros frutos. Es por ello que para el análisisde la maduración se incluyen frutos en estadios muy inmaduros, correspondientes al final deldesarrollo e inicio de la maduración propiamente dicha.Con el objeto de estudiar frutos provenientes de variedades con firmezascontrastantes se estimó la firmeza de los mismos mediante un ensayo de penetrometría.Este ensayo permite registrar la resistencia que ejerce el fruto al avance de una sonda quese mueve con una cierta velocidad hasta una distancia prefijada. Si bien la firmeza de losfrutos descendió a lo largo del desarrollo y la maduración, se observó que dicha disminuciónfue más pronunciada en estadios tempranos en las tres variedades estudiadas (Fig. 17).20aCamarosaPájaroToyonakaFirmeza (N)1510bca50b acabac b acbc b cVg B 25%R 50%R 75%R 100%REstadioFigura 17: Variación de la firmeza de los frutos en tres variedades de frutilla duranteel desarrollo y la maduración. Cada fruto se penetró y se registró la fuerza máximadesarrollada durante el ensayo. Los estadios analizados incluyeron: verde grande(Vg), blanco (B) y 25, 50, 75 y 100% rojo superficial (25%R, 50%R, 75%R y 100%R,respectivamente). Letras distintas representan diferencias significativas entre lasmedias de distintos cultivares al ser comparadas en un mismo estadio (P= 0,05).La firmeza del cultivar Camarosa fue mayor que la de Pájaro y la de este últimomayor que la de Toyonaka en todos los estadios estudiados. Pájaro y Toyonaka tuvieron losdescensos más pronunciados entre los estadios verde grande (Vg) y blanco (B), con50

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularporcentajes de descenso del 75 y 78% respectivamente. En el caso de Camarosa, el mayordescenso se observó entre los estadios B y 25% rojo (25%R) y fue del 68%. Un ejemploclaro de las diferencias entre cultivares es que la firmeza de Camarosa en el estadio 100%rojo (100%R) fue similar o mayor a la de Toyonaka en el estadio 25% rojo (25%R).2. Residuo insoluble en alcoholLa cuantificación del residuo insoluble en alcohol (RIA) permite estimar el contenidode pared celular presente en el fruto. Al analizar este contenido en función de la masa detejido, se observó una disminución durante el desarrollo y la maduración de los trescultivares estudiados (Fig. 18). El contenido de RIA en el cultivar más firme (Camarosa), fuemayor que el que se halló en el más blando (Toyonaka) en todos los estadios excepto en el100%R. Sin embargo, los contenidos de RIA en la variedad de firmeza intermedia (Pájaro)fueron similares a los de Toyonaka en todos los estadios, salvo en el verde pequeño (Vp).12aCamarosaPájaroToyonaka10 bmg RIA / 100 mg fruto8642caabbab bab b aaa0Vp Vg B 50% R 100% REstadioFigura 18: Variación del contenido de residuo insoluble en alcohol (RIA) durante eldesarrollo y la maduración de frutos de tres cultivares. Se homogeneizaron frutos conetanol absoluto y la mezcla se hirvió con reflujo. El homogenato se filtró, el residuose secó y se determinó el peso del mismo. Letras distintas representan diferenciassignificativas entre las medias de distintos cultivares al ser comparadas en un mismoestadio (P= 0,05).51

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celular3. PectinasSe llevó a cabo una marcha de extracciones secuenciales con el fin de aislar ycaracterizar distintas fracciones de pectinas (solubles en agua, PSA; solubles en EDTA, PSE;solubles en HCl, PSH), hemicelulosas y celulosa. La cuantificación del ácido galacturónico(AG) en las fracciones pécticas permitió estimar el contenido de pectinas en cada una deellas. Los polímeros pécticos pueden contener ramificaciones compuestas fundamentalmentepor azúcares neutros (AN). Es decir que la cuantificación de dichos azúcares en lasfracciones de pectinas permitió la estimación del grado de ramificación de las mismas. Losresultados, tanto del contenido de AG como de AN, se analizan expresados en base a masade fruto y a masa de RIA.mg AG / 100 mg fruto1,81,51,20,90,60,3ACamarosaPájaroToyonakaCCamarosaPájaroToyonaka0,70,60,50,40,30,20,1mg gluc / 100 mg frutomg AG / 100 mg RIA0,0252015105BDVp Vg B 50%R 100%REstadio0,0 87654321mg gluc / 100 mg RIA0Vp Vg B 50%R 100%RVp Vg B 50%R 100%R0EstadioEstadioFigura 19: Cambios en el contenido total de pectinas en el desarrollo y lamaduración de frutilla. A, contenido de AG cada 100 mg de fruto; B, contenido de AGcada 100 mg de RIA; C, contenido de AN (como equivalentes de glucosa) cada 100mg de fruto; D, contenido de AN (como equivalentes de glucosa) cada 100 mg deRIA. En cada caso se muestra la media y la desviación estándar.52

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celular3.1. Pectinas totalesEl contenido total de ácido galacturónico (AG), que representa la sumatoria de lascantidades de AG presentes en las fracciones PSA, PSE y PSH, expresado en base a la masade fruto descendió durante el desarrollo y la maduración de los tres cultives estudiados (Fig.19 A). En todos los estadios, el contenido de pectinas en Camarosa fue el mayor. Sinembargo, al expresar la cantidad de AG en relación a la masa de RIA (Fig. 19 B), se observóun aumento entre Vp y B en las tres variedades. Este aumento fue más precoz en Camarosaque en los otros dos cultivares, siendo más pronunciado entre Vp y Vg. En estadiosintermedios de la maduración no se observaron grandes diferencias en la cantidad depectinas, aunque al avanzar al estadio 100%R los valores en Toyonaka fueron claramenteinferiores.El contenido de AN expresado por masa de fruto descendió en los tres cultivares alprogresar de Vp a 100%R (Fig. 19 C) y en este caso, los valores en Camarosa fueronsuperiores a los de los otros dos cultivares. La tendencia fue completamente distinta cuandose expresó la cantidad de AN por masa de RIA (Fig. 19 D). Si bien este contenido no varió engran medida a lo largo de los estadios analizados, en Camarosa los valores fueron mayoresque los de Pájaro y Toyonaka.3.2. PSAEsta fracción de pectinas, que puede extraerse con agua a partir del RIA, representafundamentalmente polímeros pécticos que interaccionan débilmente con el resto de loscomponentes de la pared celular. El contenido de AG en esta fracción de pectinas (referido amasa de fruto fresco) aumentó en los tres cultivares a lo largo de la maduración (Fig. 20 A).En todos los casos los menores niveles fueron observados en el estadio Vp. Los valores enCamarosa y Pájaro fueron similares en el estadio Vp, mientras que los de Toyonaka fueronmenores que los de ambos. La diferencia más clara se observó en Vg, donde los valores deCamarosa fueron mayores que los de Pájaro y éstos a su vez mayores que los de Toyonaka.El porcentaje de aumento entre Vp y Vg fue de 152, 35 y 54% para Camarosa, Pájaro yToyonaka, respectivamente. Al pasar de Vg a B, el contenido de AG en esta fracción semantuvo constante en Camarosa, aumentó ligeramente en Pájaro y se duplicó en Toyonaka,de modo que el contenido de AG en PSA fue semejante en los tres cultivares. Entre B y50%R los valores permanecieron relativamente constantes, sin embargo se observó undescenso en el progreso entre el 50%R y 100%R. En este último estadio, el contenido enCamarosa superó al de Pájaro y Toyonaka.53

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularLos valores de AG también fueron analizados en base a la masa de RIA (Fig. 20 B).En los tres cultivares se observó un aumento durante el desarrollo y maduración, partiendode bajos niveles iniciales en el estadio Vp. Al progresar al estadio Vg, los niveles del cultivarmás firme, Camarosa, duplicaron los del cultivar más blando, Toyonaka, mientras que seencontraron niveles intermedios en la variedad Pájaro. Entre Vg y B los contenidos en lastres variedades aumentaron significativamente, sin embargo los porcentajes de aumentofueron claramente distintos: 36, 126 y 363% para Camarosa, Pájaro y Toyonaka,respectivamente. En 50%R los valores de AG fueron similares en las tres variedades, pero alprogresar a 100%R, los niveles en Toyonaka descendieron alcanzando valores menores quelos observados en los otros cultivares.mg AG / 100 mg fruto0,50,40,30,20,1aCamarosaPájaroToyonakaababcAaabbabbabbaababcCCamarosaPájaroToyonakaaaaabbb b bb0,250,200,150,100,05mg gluc / 100 mg frutomg AG / 100 mg RIA0,0161412108642abaabcBcbaa a aaababbabcDab babba a a0,001,61,41,21,00,80,60,40,2mol gluc / mol AG0Vp Vg B 50%R 100%RVp Vg B 50%R 100%REstadioEstadioFigura 20: Cambios en el contenido de PSA en el desarrollo y la maduración defrutilla. A, contenido de AG cada 100 mg de fruto; B, contenido de AG cada 100 mgde RIA; C, contenido de AN cada 100 mg de fruto; D, relación molar entre AN (comoequivalentes de glucosa) y AG. Letras distintas representan diferencias significativasentre medias de cultivares distintos al ser comparadas en un mismo estadio (P=0,05).0,0Los niveles de azúcares neutros (AN) en la fracción PSA fueron mayores en el estadioVp, respecto a los demás estadios, en las tres variedades estudiadas. Los menores valores sehallaron en Toyonaka (Fig. 20 C), siendo cercanos a la mitad de los hallados en Camarosa.54

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularEntre Vp y Vg el contenido de AN descendió en las tres variedades, sin embargo en Pájaro yToyonaka, desde este estadio en adelante el contenido se mantuvo bajo y constante hasta lafinalización de la maduración. Por su parte, los niveles en Camarosa descendieronprogresivamente hasta el estadio 100%R. De todas maneras, en este último estadio sehallaron valores de AN mayores que los de Toyonaka.Otra forma en que se puede expresar el contenido de AN en cierta fracción depectinas, es mediante la relación molar entre glucosa y AG. Esta relación permite una mejorinterpretación del grado de ramificación que poseen las pectinas. Es decir, que cuanto mayorsea el cociente en cierta fracción de pectinas, mayor será el grado de grado de ramificaciónde los polímeros que la componen. Los mayores valores de relación molar fueronencontrados en los estadios iniciales del desarrollo (Vp), siendo los de Camarosa mayoresque los de las otras dos variedades (Fig. 20 D). Entre Vp y Vg la relación descendióabruptamente en las tres variedades, detectándose valores en Camarosa mayores que enPájaro y en este último mayores que en Toyonaka. Desde Vg hasta la finalización de lamaduración, la relación en los tres cultivares se mantuvo en valores bajos, sin gran variacióny alcanzando niveles similares en el 100%R.3.3. PSEComo se describió previamente, las pectinas tienen la capacidad de interaccionarentre sí a través de puentes iónicos (fundamentalmente puentes de Ca 2+ ). La extracción conagentes quelantes como el EDTA, permite solubilizar aquellos polímeros pécticos queinteraccionan con el resto de los componentes de la pared a través de tales interacciones. Elcontenido de AG de esta fracción, expresado en base a masa de fruto, fue el menorcomparado con el de las otras dos fracciones de pectinas (PSA y PSH). En estadios inicialesdel desarrollo (Vp) se observaron claras diferencias entre cultivares (Fig. 21 A). En Pájaro losniveles fueron 2 y 10 veces superiores a los registrados en Camarosa y Toyonaka,respectivamente. Entre Vp y Vg, los valores de Camarosa y Toyonaka aumentaron al doble,mientras que en Pájaro se observó un descenso. Al progresar de Vg a 100%R, los valores deCamarosa y Pájaro fueron similares y descendieron constantemente. En el caso deToyonaka, el contenido de AG tuvo un leve descenso a lo largo de dicha progresión, pero losvalores se mantuvieron cercanos a la mitad de los observados en los otros dos cultivares.En la figura 21 B se muestran los contenidos de AG expresados en base a la masa deRIA. En el estadio Vp los valores registrados en Pájaro fueron superiores a los de Camarosay los de esta última, superiores a los de Toyonaka. Al progresar al estadio Vg los contenidos55

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularde los tres cultivares aumentaron, pero los valores de Toyonaka continuaron siendomenores. El contenido de AG de las tres variedades se mantuvo relativamente constanteentre los estadios Vg y 50%R, siendo el de Toyonaka aproximadamente la mitad delcorrespondiente a las otras dos variedades. Al continuar la maduración, tanto en Camarosacomo en Toyonaka los valores descendieron, mientras que en Pájaro se mantuvieronconstantes. El contenido de AG en 100%R en Pájaro fue mayor que el de los otros doscultivares.mg AG / 100 mg fruto0,250,200,150,100,05bacAa abaaba abCamarosaPájaroToyonakaaababcBaabaabaabbac3,53,02,52,01,51,00,5mg AG / 100 mg RIA0,00Vp Vg B 50%R 100%RVp Vg B 50%R 100%R0,0EstadioEstadioFigura 21: Cambios en el contenido de PSE durante el desarrollo y la maduración defrutilla. A, contenido de AG cada 100 mg de fruto; B, contenido de AG cada 100 mgde RIA. Letras distintas representan diferencias significativas entre medias dediferentes cultivares al ser comparadas en un mismo estadio (P= 0,05).Dado que el contenido de la fracción PSE fue bajo, no fue posible la cuantificación delos AN presentes en la misma. Se realizaron diferentes intentos, pero dado que la cantidadde AN a cuantificar fue cercana al límite de detección del método empleado, el error en lasdeterminaciones fue elevado.3.4. PSHEsta fracción de pectinas, que tiene la capacidad de interaccionar a través de unionescovalentes, puede ser liberada de la matriz de la pared celular mediante el tratamiento conHCl en caliente. Expresado en base a la masa de fruto fresco, el contenido de AG de estafracción descendió claramente a lo largo de la maduración (Fig. 22 A). Los contenidos dePájaro y Toyonaka fueron similares en todos los estadios e inferiores a los de Camarosa.La cantidad de AG expresada en base a la masa de RIA en esta fracción (Fig. 22 B)disminuyó durante el desarrollo y la maduración, excepto entre Vp y Vg donde los niveles enCamarosa aumentaron y en las otras dos variedades se mantuvieron constantes. Los valores56

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularencontrados para Camarosa fueron superiores a los de los otros dos cultivares a partir delestadio B. En el 100%R el contenido en Toyonaka fue el más bajo, el de Camarosa el menory el de Pájaro intermedio.mg AG / 100 mg fruto1,41,21,00,80,60,40,2abbaAab b ab b b bCamarosaPájaroToyonakaab babbabbaCCamarosaPájaroToyonakaab b ab b b b0,40,30,20,1mg gluc / 100 mg frutomg AG / 100 mg RIA0,01412108642ababaabbaBcab b b abca a aa a aa aaDababaaa0,00,40,30,20,1mol gluc / mol AG0Vp Vg B 50%R 100%RVp Vg B 50%R 100%R0,0EstadioEstadioFigura 22: Cambios en el contenido de PSH en el desarrollo y la maduración defrutilla. A, contenido de AG cada 100 mg de fruto; B, contenido de AG cada 100 mgde RIA; C, contenido de AN cada 100 mg de fruto; D, relación molar entre AN (comoequivalentes de glucosa) y AG. Letras distintas representan diferencias significativasentre medias de distintos cultivares al ser comparadas en un mismo estadio (P=0,05).El contenido de AN en la fracción PSH, expresado por masa de fruto fresco,descendió en los tres cultivares (Fig. 22 C). Los niveles detectados en Camarosa fueronmayores, y cercanos al doble, que los encontrados en las otras dos variedades.El cociente molar entre AN y AG en la fracción PSH se muestra en la figura 22 D. Sepudo observar que no hubo gran variación a lo largo de los estadios analizados, así comotampoco hubo diferencias entre cultivares. Sólo se detectó un leve aumento en el cocienteAN/AG entre el estadio B y el 100%R en los tres cultivares.57

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celular4. HemicelulosasUna vez que se ha realizado la extracción de las pectinas del RIA, el tratamiento conálcali del residuo sólido resultante de dicha extracción permite la solubilización de lashemicelulosas (Hem). El contenido de Hem expresado en función de la masa de fruto frescodescendió durante el desarrollo y la maduración (Fig. 23 A). Se detectó un mayor contenidoen Camarosa respecto a Toyonaka en todos los estadios analizados. Los valores encontradosen Pájaro fueron intermedios en estadios iniciales del desarrollo, sin embargo promediandola maduración se igualaron con los de Camarosa y llegaron a ser superiores en el 100%R..mg gluc / 100 mg fruto0,30 aCamarosaAPájaroToyonaka0,25ab0,200,150,100,05baabab baabbacaabbab bCabba a aCamarosaPájaroToyonakaa a a2,52,01,51,00,5mg gluc / 100 mg frutomg gluc / 100 mg RIA0,003,02,52,01,51,00,5aaaaaaBaa aabaabaaabbaaaDaabbaaaabab0,02015105mg gluc / 100 mg RIA0,0Vp Vg B 50%R 100%RVp Vg B 50%R 100%R0EstadioEstadioFigura 23: Variación en el contenido de hemicelulosas y celulosa a lo largo deldesarrollo y la maduración de frutilla. A, contenido de hemicelulosas (comoequivalentes de glucosa) cada 100 mg de fruto; B, contenido de hemicelulosas (comoequivalentes de glucosa) cada 100 mg de RIA; C, contenido de celulosa (comoequivalentes de glucosa) cada 100 mg de fruto; D, contenido de celulosa (comoequivalentes de glucosa) cada 100 mg de RIA. Letras distintas representandiferencias significativas entre medias de distintos cultivares al ser comparadas en unmismo estadio (P= 0,05).En la figura 23 B se muestra el contenido de Hem en función de la cantidad de RIA.No se observó cambio en el contenido ni diferencia entre cultivares al progresar de Vp a B. Apartir del estadio B los niveles en Camarosa y Toyonaka descendieron claramente, sin58

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularembargo en Pájaro se mantuvieron elevados alcanzando valores que duplicaron a los de lasdos primeras variedades.5. CelulosaEl residuo sólido que permanece luego del proceso de solubilización de hemicelulosas,está compuesto fundamentalmente por celulosa (Cel). La cantidad de Cel por masa de fruto(Fig. 23 C) fue mayor en Camarosa que en Toyonaka en los tres primeros estadios, mientrasque no se observaron diferencias entre cultivares en los estadios 50 y 100%R. En las tresvariedades se observó un marcado descenso a lo largo de los estadios analizados.El contenido de Cel, expresado en base a la masa de RIA, disminuyó a lo largo deldesarrollo y la maduración (Fig. 23 D) sin grandes diferencias entre cultivares6. Masa molecular de fracciones de la pared celularUna de las estrategias para el estudio de la modificación de los componentes de lapared celular durante el desarrollo y la maduración de frutos, involucra el análisis de ladistribución de masas moleculares de cada fracción mediante la técnica de cromatografía deexclusión molecular. Si la distribución de masas de los polímeros que componen ciertafracción se desplaza hacia zonas de menores masas moleculares al pasar de un estadio aotro, esto implica que dichos polímeros han sido depolimerizados. Cuanto mayor sea elgrado de depolimerización de un componente, menor será el aporte que hará éste a laestructura de la pared celular.6.1 Masa molecular de pectinasDe acuerdo a lo descrito previamente, se utilizó cromatografía de exclusión molecularpara analizar las distribuciones de masas moleculares de las fracciones PSA y PSH, enestadios iniciales del desarrollo (Vp) y final de la maduración (100%R). En el caso de PSA, seencontró un único pico agudo en volúmenes cercanos a los 70 ml (Fig. 24). Si bien ladistribución tuvo un leve corrimiento hacia zonas de menor masa molecular en las tresvariedades (entre 80 y 100 ml), este corrimiento fue más evidente en Toyonaka (Fig. 24 C),el cultivar más blando.59

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celular0,750,60AVoCamarosa VpCamarosa 100%RDO (520 nm)0,450,300,150,000,60BPájaro VpPájaro 100%RDO (520 nm)0,450,300,150,000,60CToyonaka VpToyonaka 100%RDO (520 nm)0,450,300,150,0040 60 80 100 120Volumen (mL)Figura 24: Perfiles de exclusión molecular de PSA en dos estadios (Vp y 100%R),fraccionadas utilizando una columna empacada con Sephacryl S-400. Se cuantificó elAG mediante el método del 2-fenilfenol en fracciones de 2 ml. A, Camarosa; B,Pájaro; C, Toyonaka. Vo, volumen muerto (56 ml).En el caso de la fracción PSH, se observó una distribución de masas molecularesclaramente más amplia que la de PSA (Fig. 25) con un máximo en aproximadamente 75 ml.En Camarosa no se registró cambio en la distribución entre Vp y 100%R, mientras que enPájaro se detectó un leve corrimiento hacia menores masas moleculares. En cambio, enToyonaka, se observó un importante desplazamiento de la distribución hacia menores masasmoleculares (Fig. 25 C).60

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celular0,4AVoVtCamarosa VpCamarosa 100%R0,3DO (520 nm)0,20,10,00,3BPájaro VpPájaro 100 %RDO (520 nm)0,20,10,00,3CToyonaka VpToyonaka 100%RDO (520 nm)0,20,10,030 60 90 120 150 180 210Volumen (mL)Figura 25: Perfiles de exclusión molecular de PSH en dos estadios (Vp y 100%R),fraccionadas utilizando una columna empacada con Sephacryl S-400. Se cuantificó elAG mediante el método del 2-fenilfenol en fracciones de 2 ml. A, Camarosa; B,Pájaro; C, Toyonaka. Vo, volumen muerto (56 ml); Vt, volumen total (171 ml).6.2 Masa molecular de hemicelulosasEn la figura 26 se presentan los resultados de cromatografías de exclusión molecularpara la fracción de hemicelulosas. Esta fracción tuvo una distribución con una amplitudsimilar a la de PSH, aunque más desplazada hacia zonas de menores masas moleculares. Engeneral, se observa en los cromatogramas la presencia de dos picos, uno agudoaproximadamente a los 120 ml y otro más ancho alrededor de 110 ml. En el caso deCamarosa y Toyonaka, se registró un pico adicional en el estadio Vp en volúmenes cercanos61

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celulara 70 ml, el cual estuvo ausente en el estadio 100%R. En Pájaro no se observaron diferenciasapreciables entre los perfiles observados en los estadios analizados. No se pudo estableceruna relación entre la firmeza de los cultivares y la modificación del perfil de exclusión paraesta fracción de pared.VoVt0,18 Camarosa VpCamarosa 100%R0,15ADO (620 nm)0,120,090,060,030,12BPájaro VpPájaro 100%RDO (620 nm)0,090,060,030,000,18CToyonaka VpToyonaka 100%RDO (620 nm)0,150,120,090,060,0330 60 90 120 150 180Volumen (mL)Figura 26: Perfiles de exclusión molecular de Hem en dos estadios (Vp y 100%R),fraccionadas utilizando una columna empacada con Sephacryl S-400. Se cuantificaronlos azúcares totales mediante el método de antrona en fracciones de 2 ml. A,Camarosa; B, Pájaro; C, Toyonaka. Vo, volumen muerto (56 ml); Vt, volumen total(171 ml).62

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celular7. DiscusiónEl ablandamiento que sufren los frutos durante la maduración es en parteconsecuencia de la pérdida de rigidez de la pared celular ocasionada por la degradación demuchos de sus componentes. En nuestro caso, se detectó un ablandamiento continuo a lolargo del desarrollo y de la maduración en los tres cultivares de frutilla estudiados, el cual seasoció fuertemente a un descenso en el contenido total de pared celular (residuo insolubleen alcohol, RIA). Resultados similares fueron descritos en el cultivar de frutilla Dover (Huber,1984) y en otros frutos como cereza (Batisse y col., 1996), damasco (Femenia y col., 1998)y mango (Mitcham y McDonald, 1992). Sin embargo, no se detectó una correlación claraentre la firmeza y el contenido de RIA al comparar diferentes variedades. Por ejemplo,aunque la firmeza de Pájaro fue más elevada que la de Toyonaka, no se encontrarondiferencias en el contenido de RIA en dichas variedades entre los estadios Vg y 100%R(Figs. 17 y 18). Es más, en el estadio 100%R Camarosa fue más firme que Toyonaka, perono se observaron diferencias en el contenido de pared entre estos cultivares. Estosresultados sugieren que existen otros factores, además del contenido total de pared celular,que determinan las diferencias de firmeza entre cultivares.Las pectinas son el componente mayoritario dentro de los polímeros que formanparte de la pared celular de los frutos. Como se mencionó anteriormente, los polímerospécticos son un grupo de macromoléculas compuesto por una gran diversidad de azúcares,lo que les confiere la capacidad de establecer diferentes tipos de interacciones entre sí y conel resto de los componentes. En las tres variedades de frutillas estudiadas en el presentetrabajo, se detectó un aumento en el contenido de pectinas totales referido a la masa de RIAentre el Vp y el B (Fig. 19 B), lo cual sugiere que ciertos polímeros conteniendo ácidogalacturónico (AG) estarían siendo activamente sintetizados. Al respecto, Knee y col. (1977)reportaron que en frutilla la síntesis de poliurónidos continúa hasta el estadio B. Sinembargo, al expresar el contenido de pectinas totales en función de la masa de fruto fresco(Fig. 19 A), se observó un descenso en el pasaje de Vp a 100%R. Posiblemente el aumentode masa y captación de agua en el fruto durante el desarrollo y la maduración hayaenmascarado un aumento neto de la cantidad de pectinas por fruto. En consecuencia, no sepudo apreciar un aumento del contenido de AG en relación a la masa de fruto fresco.Analizando el contenido de AG expresado por masa de RIA entre los estadios Vp y B en cadauna de las fracciones de pectinas, se observó un aumento sólo en PSA (pectinas solubles enagua) y PSE (pectinas solubles en EDTA) (Fig. 20 B y 21 B). El aporte de esta última fracciónal aumento de pectinas totales sería considerablemente menor que el de PSA debido a que63

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularsu contenido es claramente inferior. Estos resultados sugieren que el incremento en elcontenido de AG total se debería a la síntesis de novo, principalmente de componentes queaportan a la fracción de pectinas de unión lábil, es decir las que pertenecen a la fracciónPSA. Otra posibilidad sería que en este período hubiera síntesis de componentes de PSE yPSH (pectinas solubles en HCl), pero que simultáneamente en este mismo intervalo existierauna conversión o transformación de estas fracciones hacia especies pertenecientes a PSA.Independientemente de que exista síntesis de novo de polímeros que componen PSA, entreel estadio Vg y el B se observó un descenso del contenido de PSH (Fig. 22 B) que podríaexplicar en parte el incremento de PSA entre dichos estadios (por un cambio en el tipo deinteracciones predominantes). Es evidente que en etapas del desarrollo e iniciales de lamaduración, en proporción predominan las pectinas de interacción más fuerte (PSH),mientras que avanzada la maduración la relación se invierte y predominan las pectinas deinteracción más débil (PSA).Una hipótesis aceptada respecto de las fracciones de pectinas, es que a lo largo de lamaduración parte de los polímeros que componían el conjunto de moléculas en las quepredominaban las interacciones covalentes (PSH, en este caso), por la acción de enzimas demodificación, pasan a formar parte de fracciones en las que prevalecen interacciones másdébiles (PSE y PSA) (Brummell, 2006). En tomate y palta ocurre un aumento de lospoliurónidos solubles en Na 2 CO 3 a expensas de la fracción PSA (Carrington y col., 1993;Wakabayashi y col., 2000). Igualmente, en melón las fracciones solubles en agua y agentesquelantes aumentan, en tanto que la cantidad de poliurónidos solubles en Na 2 CO 3disminuyen (Rose y col., 1998a). En las variedades Camarosa y Pájaro se observó unaacumulación neta de PSA (expresado por masa de RIA) continua hasta el final de lamaduración (Fig. 20 B). Estas nuevas PSA detectadas en estadios avanzados de lamaduración, probablemente provengan de la conversión de polímeros que previamenteformaban parte de la fracción PSH en lugar de ser generadas por síntesis de novo, la cual nofue detectada en estadios avanzados de la maduración (Knee y col., 1977). En melónCharentais se propuso que la degradación de cadenas laterales de pectinas unidascovalentemente (extraídas con Na 2 CO 3 0,05 M) incrementaría la solubilidad de las pectinasen agua (Rose y col., 1998a). Sólo en Toyonaka se observó un descenso del contenido depectinas totales entre 50%R y 100%R (Fig. 19 B), sin acumulación neta de ninguna de lasfracciones de pectinas (Fig. 20 B, 21 B, 22 B). Esto implica que dichas fracciones de pectinasen el cultivar más blando sufrirían catabolismo y depolimerización hacia el final de la64

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularmaduración. Los resultados de los experimentos de cromatografía de exclusión molecularapoyarían esta hipótesis (Fig. 24 y 25).En conjunto estos resultados sugieren que el metabolismo de los componentes depared es distinto en los diferentes estadios, existiendo un balance entre síntesis ydegradación en estadios iniciales (Vp y B), y predominando la solubilización y degradaciónhacia el final de la maduración.Las cadenas laterales de las pectinas en frutilla están compuestas principalmente porazúcares neutros, entre los cuales predominan arabinosa y galactosa (Gross y Sams, 1984;Nogata y col., 1996; Koh y Melton, 2002). El cociente molar entre los azúcares neutros (AN)y el AG refleja el grado de ramificación que presenta la población de moléculas de unadeterminada fracción y permite una estimación de la capacidad de interacción con otrospolímeros (Batisse y col., 1996). En la fracción PSA, la relación molar entre AN y AG en elestadio Vp tuvo valores cercanos o superiores a la unidad lo que refleja que la cantidad deazúcares que forman parte de las ramificaciones es comparable a la que está presente en lascadenas principales de los polímeros que componen esta fracción. Al realizar unacomparación entre variedades, este cociente fue mayor en el cultivar más firme a lo largo deldesarrollo y en gran parte de la maduración (Fig. 20 D), sugiriendo la existencia depolímeros con un mayor grado de ramificación. Resultados similares se describieron encereza, donde se halló una menor relación AN/AG en cultivares blandos respecto a cultivarescrujientes (Batisse y col., 1996). La relación AN/AG disminuyó en los tres cultivaresestudiados al avanzar la maduración (Fig. 20 D), alcanzando valores similares a losreportados para el cultivar Yolo (Koh y Melton, 2002). No se detectaron diferencias entrevariedades en el estadio 100%R. El hecho que este cociente descendiera durante eldesarrollo y comienzo de la maduración podría explicarse suponiendo que las pectinas queson sintetizadas de novo durante este período fueran fundamentalmentehomogalacturonanos (Knee y col., 1977). Es decir que la fracción PSA aumentaría debido aun incremento en el contenido de homogalacturonanos (polímeros pécticos ricos en AG perocon escasos AN por no contener ramificaciones), lo cual haría descender la relación AN/AGdicha fracción. Otra posibilidad sería que las cadenas laterales fueran hidrolizadas porenzimas como β-galactosidasas o α-arabinofuranosidasas, con la consiguiente eliminación deazúcares neutros y reducción del cociente AN/AG. Se han descrito genes codificantes para β-galactosidasas en frutilla (Tong y Gross, 1988; Trainotti y col., 2001), y para uno de ellos(Faβgal1) se registró un aumento en la expresión durante la maduración. En varios cultivaresde frutilla se describió una pérdida de arabinosa (Gross y Sams, 1984; Nogata y col., 1996;65

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularRedgwell y col., 1997a; Koh y Melton, 2002) y se postuló que la solubilización de pectinaspodría estar asociada a una eliminación gradual de cadenas laterales de arabinanos (Koh yMelton, 2002).En la fracción PSH, el cociente AN/AG se mantuvo relativamente constante, sindiferencias entre cultivares y con un leve aumento hacia el final de la maduración (Fig. 22D). Este aumento podría explicarse si la tasa de remoción de los residuos de las cadenasprincipales de las pectinas (fundamentalmente AG) fuera mayor que la tasa de eliminaciónde los AN presentes en las cadenas laterales.Al comparar los perfiles de exclusión molecular de la fracción PSA entre estadios Vp y100%R, si bien no se observaron modificaciones importantes de los mismos que pudieranasociarse a una depolimerización, el desplazamiento más evidente, aunque leve, se observóen Toyonaka (Fig. 24 C). En trabajos previos se ha reportado la ausencia dedepolimerización detectable en la fracción soluble en agua en los cultivares Dover (Huber,1984) y Pájaro (Redgwell y col., 1997a), pero en Toyonaka se observó una pequeñadepolimerización (Nogata y col., 1996). Esta leve depolimerización es coincidente con ladisminución en el contenido de PSA detectado en la variedad Toyonaka durante el pasaje de50%R a 100%R (Fig. 20 B).En la fracción PSH se hallaron diferencias más notorias, entre variedades, en el gradode desplazamiento de la distribución de masas moleculares. En los cultivares Camarosa yPájaro no se observaron diferencias marcadas en dicha distribución al comparar estadiosextremos (Vp y 100%R). Sin embargo, en Toyonaka se observó un claro desplazamiento dedicha distribución hacia menores masas moleculares (Fig. 25 C). Hasta la fecha no se habíareportado ningún estudio que hubiera analizado la depolimerización de pectinas unidascovalentemente en frutilla. Nuestros resultados demuestran una importante depolimerizaciónde esta fracción de pectinas en Toyonaka y sugieren que la misma podría ser un sustratoputativo para las poligalacturonasas (PG). Durante años se postuló la ausencia de actividadPG en frutilla (Barnes y Patchett, 1976; Huber, 1984), probablemente debido a la bajaactividad de la misma y a la ausencia de depolimerización en las fracciones de pectinasanalizadas. Sin embargo, en el año 1993, se reportó la presencia de PG, justamente en elcultivar Toyonaka (Nogata y col., 1993).La pérdida de celulosa (Cel) y hemicelulosas (Hem) durante la maduración se hadescrito en gran cantidad de frutos (Brummell y Harpster, 2001) y particularmente en frutilla(Koh y Melton, 2002). En el presente trabajo, se encontró un descenso en el contenido deestas dos fracciones a lo largo de los estadios analizados. En el caso de las Hem, se pudo66

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularobservar que son un componente minoritario de la pared celular que no presenta grandescambios (expresado por masa de RIA, Fig. 23 B) hasta alcanzar estadios avanzados demaduración. No es posible establecer una clara correlación entre el contenido de Hem pormasa de RIA y el grado de firmeza de los distintos cultivares. Por ejemplo, en los trescultivares analizados los niveles de hemicelulosas fueron similares en estadios en los que sehallaron marcadas diferencias en la firmeza de los frutos (estadios Vg, B; Figs. 17 y 23 B). Asu vez, en el estadio 100%R el mayor contenido de Hem se observó en el cultivar de firmezaintermedia (Pájaro), con valores que duplicaron a los de las otras dos variedades. Estehecho, sumado a su baja proporción comparado con los demás componentes de la paredcelular, sugiere que el contenido de Hem no sería uno de los principales determinantes de lafirmeza en frutilla. Por otro lado, líneas transgénicas en las que prácticamente se suprimió laexpresión y actividad de endo-β-1,4-endoglucanasa, produjeron frutos con firmezas similaresa las de los controles (Wooley y col., 2001; Palomer y col., 2006). De acuerdo con nuestrosresultados, la fracción Hem no sufre gran depolimerización en ninguno de los cultivaresanalizados, al contrario de lo propuesto previamente para los cultivares Dover (Huber, 1984)y Toyonaka (Nogata y col., 1996). En el primer caso las diferencias podrían atribuirse tanto ala utilización de otro cultivar, como al empleo un protocolo diferente para el aislamiento de lafracción de hemicelulosas. En ambos trabajos, se removieron las pectinas de las paredes conuna solución que contenía EDTA y luego se procedió a la solubilización de la fracción Hemcon una solución de NaOH 4N. Es decir que probablemente, al no haber removido laspectinas de interacción covalente previamente a la solubilización de las hemicelulosas, éstashayan sido coextraídas. Por lo tanto, el posterior análisis mediante exclusión molecular de lashemicelulosas debió haber estado interferido por la presencia de polímeros pécticos. Envarios frutos, tales como pimiento (Harpster y col., 2002a), tomate (cv Ailsa Craig)(Brummell y col., 1999a), durazno (Brummell, 2006) y palta (O'Donoghue y Huber, 1992), seha demostrado una significativa depolimerización de hemicelulosas, mientras que en otrosfrutos como melón (Rose y col., 1998a) y la variedad Rutgers de tomate (Tong y Gross,1988), se observaron pequeños cambios en la distribución de masas moleculares de estoscomponentes a lo largo de la maduración.Al analizar la progresión del contenido de celulosa (Cel), se observó un descenso enlos tres cultivares, aunque no se detectaron claras diferencias entre ellos para un mismoestadio de maduración (Fig. 23). Estudios previos utilizando la técnica de RMN sugirieron quela frutilla posee una cantidad muy baja de celulosa cristalina, la cual se mantendría67

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN A: Componentes de la pared celularinalterada durante la maduración, sugiriendo una implicancia menor en el ablandamiento delfruto (Koh y col., 1997; Koh y Melton, 2002).68

SECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celular

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celularLos cambios que se observan en los componentes de la pared celular durante eldesarrollo y la maduración están vinculados a la actividad de grupos de proteínas y enzimasque accionan conjuntamente. Se estudió la actividad in vitro de enzimas que actúan sobrepectinas (PME, PG), hemicelulosas (EGasa, Xnasa) y sobre ambas (β-gal, β-xil, α-L-ara).1. Pectin metilesterasa (PME)En los tres cultivares analizados la menor actividad PME se observó en frutosinmaduros (Vg); a su vez, en dicho estadio, la mayor actividad se encontró en la variedadPájaro y la menor en Toyonaka, correspondiendo a Camarosa un valor intermedio (Fig. 27).Entre Vg y B, la actividad PME aumentó aproximadamente al triple en las tres variedadesensayadas. Entre B y 100%R, la actividad PME tanto en Camarosa como en Toyonakadescendió paulatinamente. En cambio, en Pájaro la actividad permaneció aproximadamenteconstante entre dichos estadios, por lo cual la actividad PME en este cultivar fue superior a lamedida en las otras dos variedades tanto en el 50%R como en el 100%R.86CamarosaPájaroToyonakaaaaabbnkatal / g fruto4bcaa2ac0Vg B 50%R 100%REstadioFigura 27: Cambios en la actividad PME durante el desarrollo y la maduración defrutillas. Se utilizaron pectinas de frutos cítricos como sustrato y la reacción fuepuesta de manifiesto mediante en cambio de absorbancia a 620 nm comoconsecuencia del viraje de un indicador ácido-base (azul de bromotimol). Letrasdistintas representan diferencias significativas entre medias de distintos cultivares alser comparadas en un mismo estadio (P= 0,05).2. Poligalacturonasa (PG)Durante la puesta a punto del protocolo de extracción y medida de la actividad PG, seutilizó como control pericarpio de tomate en madurez comercial. La actividad PG detectada70

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celularen frutilla fue baja, con valores cercanos al 10% del obtenido en tomate (datos nomostrados). Hacia el final del desarrollo y comienzo de la maduración (estadios Vg y B), laactividad PG se mantuvo baja, sin grandes cambios en magnitud y sin marcadas diferenciasentre cultivares (Fig. 28). Sin embargo, en el 50%R los niveles en Pájaro y Toyonakaduplicaron a los de Camarosa. Hacia el final de la maduración, la actividad PG en el cultivarmás blando fue mayor que la que se registró en los otros dos cultivares.54CamarosaPájaroToyonakabbpkatal / g fruto32aaaaaabaa1a0Vg B 50%R 100%REstadioFigura 28: Cambios en la actividad PG total durante el desarrollo y la maduración defrutilla. Como sustrato se empleó ácido poligalacturónico y el ácido galacturónicoliberado se cuantificó por el método de la 2-cianoacetamida. Letras distintasrepresentan diferencias significativas entre medias de distintos cultivares al sercomparadas en un mismo estadio (P= 0,05).3. Endoglucanasa (EGasa)En la figura 29 se muestra la variación de la actividad de EGasa a lo largo deldesarrollo y la maduración de tres variedades de frutillas. Se observó que dicha actividad semantuvo baja, cercana al límite de detección, entre Vg y 50%R en el caso de Camarosa yPájaro. En Toyonaka si bien entre el Vg y el B también tuvo valores bajos, ya en el 50%R seregistró un nivel claramente superior al de las otras dos variedades. La actividad EGasa seincrementó notablemente en los tres cultivares hacia el final de la maduración,principalmente en Toyonaka en el que se encontró el triple de la actividad medida en losotros dos cultivares.71

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celular1412CamarosaPájaroToyonakac10pkatal / g fruto864cb20baaaabbaVg B 50%R 100%REstadioFigura 29: Cambios en la actividad EGasa durante el desarrollo y la maduración defrutilla. Como sustrato se empleó carboximetil celulosa. Para la cuantificación de losresiduos reductores generados, se utilizó el método del 3,5-dinitro salicílico. Letrasdistintas representan diferencias significativas entre medias de distintos cultivares alser comparadas en un mismo estadio (P= 0,05).10CamarosaPájaroToyonakaaccpkatal / g fruto864aaaaaabab20Vg B 50%R 100%REstadioFigura 30: Cambios en la actividad Xnasa durante el desarrollo y la maduración defrutilla. Como sustrato se empleó xilano de avena y los residuos reductoresgenerados se cuantificaron mediante el método del 3,5-dinitro salicílico. Letrasdistintas representan diferencias significativas entre medias de distintos cultivares alser comparadas en un mismo estadio (P= 0,05).72

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celular4. Xilanasa (Xnasa)El perfil de actividades Xnasa, obtenido para los cultivares estudiados, se muestra enla figura 30. Entre los estadios Vg y B la actividad se duplicó en las tres variedades y no seencontraron diferencias significativas entre cultivares. Desde el B en adelante, los niveles deactividad en Toyonaka crecieron levemente y luego se mantuvieron constantes. En el casode Camarosa, los valores descendieron entre el B y el 100%R y fueron claramente menoresque los de Toyonaka. En Pájaro, los valores fueron intermedios respecto a las otras dosvariedades.5. β-D-xilosidasa (β-xil)La actividad β-xil fue detectada en todos los estadios analizados (Fig. 31) y fue mayoren el fruto más blando, Toyonaka. En los tres cultivares se observó un aumento de actividadentre Vg y B, y luego un descenso entre B y 50%R. A partir del 50%R, los valores deToyonaka se duplicaron, mientras que los de las otras variedades aumentaron, pero enmenor proporción. Los valores máximos de actividad en Pájaro y Toyonaka se observaron en100%R, mientras que en Camarosa el máximo de actividad se detectó en el estadio B.2520CamarosaPájaroToyonakacpkatal / g fruto1510babbb5aaaaaa0Vg B 50%R 100%REstadioFigura 31: Cambios en la actividad β-xil durante el desarrollo y la maduración defrutilla. Como sustrato se empleó p-nitrofenil-β-D-xilopiranósido. El p-nitrofenolgenerado se cuantificó mediante alcalinización y medida de absorbancia a 410 nm.Letras distintas representan diferencias significativas entre medias de distintoscultivares al ser comparadas en un mismo estadio (P= 0,05).73

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celular6. β-galactosidasa (β-gal)La actividad β-gal fue detectable en todos lo estadios analizados en los tres cultivares(Fig. 32). En el estadio Vg, la actividad en Pájaro y Toyonaka fue cercana al doble de laobservada en Camarosa. Al avanzar la maduración, los valores en el cultivar más blando(Toyonaka) aumentaron constantemente alcanzando los niveles más elevados, mientras quelos de Camarosa se mantuvieron bajos y sin cambios. La actividad en Pájaro tuvo valoresintermedios respecto a los otros dos cultivares.200 CamarosaPájaroToyonaka150cbbpkatal / g fruto100bcabcaba50a0Vg B 50%R 100%REstadioFigura 32: Cambios en la actividad β-gal durante el desarrollo y la maduración defrutilla. Como sustrato se empleó p-nitrofenil-β-D-galactopiranósido. El p-nitrofenolgenerado se cuantificó mediante alcalinización y medida de absorbancia a 410 nm.Letras distintas representan diferencias significativas entre medias de distintoscultivares al ser comparadas en un mismo estadio (P= 0,05).7. Actividad α-L-arabinofuranosidasa (α-L-ara)La actividad de α-L-ara no había sido previamente detectada en frutilla, por lo cualfue necesario llevar a cabo distintos protocolos a fin de optimizar la extracción de la enzima.Utilizando frutos del cultivar Toyonaka en estadio 75%R se ensayaron diferentescomposiciones de soluciones reguladoras de extracción conteniendo o no ZnCl 2 y Triton X-100 0,05% v/v, de acuerdo a datos basados en trabajos previos realizados en tomate (Sozziy col., 2002a) y pera japonesa (Tateishi y col., 2005). La presencia del detergente fueesencial para lograr una extracción óptima de la enzima, pero la presencia de la sal de Zn 2+no modificó la actividad obtenida (Tabla IV).Una vez seleccionada la composición de la solución de extracción, se evaluó si losvalores de actividad eran influidos por el tiempo de extracción. Para ello se ensayaron74

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celulardistintos tiempos de extracción (4 y 14 h). En la tabla V se muestran los resultados para losdos cultivares de firmezas extremas en tres estadios de maduración. Se vio que el aumentodel tiempo de extracción a 14 h provocó una menor eficiencia en la recuperación deactividad α-L-ara, fundamentalmente en Toyonaka. En Camarosa no se encontrarondiferencias salvo en el estadio 75%R. Es de destacar que no fue posible detectar actividaden extractos de estadios más tempranos de maduración, con 14 h de extracción. En estecaso los extractos tenían mayor turbidez, probablemente debido a la solubilización decomponentes de pared celular, que no pudo ser eliminada completamente aún con unaexhaustiva centrifugación.Tabla IV: Actividad enzimática de α-L-ara proveniente de extractos preparados defrutos Toyonaka en 75%R mediante soluciones de extracción de distinta composición.Como sustrato se empleó p-nitrofenil-α-L-arabinofuranósido. El p-nitrofenol generadose cuantificó mediante alcalinización y medida de absorbancia a 410 nm. Losresultados son expresados en pkatal / gr de fruto.ZnCl 2 (mM)0 1Triton X-100 0 23,5 23,5(% v/v) 0,05 45,7 47,3Tabla V: Actividad enzimática α-L-ara en extractos obtenidos con dos tiempos deextracción. Se prepararon extractos de los dos cultivares de firmezas extremas, endistintos estadios. Los resultados se expresaron en pkatal / gr de fruto. Letrasdistintas representan diferencias significativas al comparar las medias de los dostiempos de extracción, en cada estadio de cada variedad (P= 0,05)Cultivar Estadio Extracción 4 h Extracción 14 hCamarosaToyonaka50%R 17,1 a 16,3 a75%R 22,1 a 16,4 b100%R 28,2 a 26,7 a50%R 41,9 a 19,1 b75%R 40,6 a 17,6 b100%R 53,2 a 29,4 bEn base a estos resultados, se establecieron las condiciones de extracción adecuadaspara la determinación de la actividad α-L-ara en los tres cultivares de firmezas contrastantes.75

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celularEl protocolo elegido incluyó el empleo de Tritón X-100 0,05% v/v y un paso de extracción de4 h (Ver Materiales, sección 7.7.). Se observó un aumento en la actividad α-L-ara alprogresar de Vg a 100%R en todos los casos (Fig. 33). En el estadio Vg, los valores deToyonaka fueron superiores a los de Camarosa y Pájaro, cuyos niveles estuvieron cerca dellímite de detección del método. Al inicio de la maduración (estadio B), las actividades enPájaro y Toyonaka fueron similares y duplicaron a los hallados en Camarosa. Entre B y elfinal de la maduración, los niveles de actividad aumentaron en las tres variedades pero elincremento fue mayor en el cultivar más blando.6050CamarosaPájaroToyonakabpkatal / g fruto403020bbabcaa10ba0aVg B 50%R 100%REstadio madurezFigura 33: Cambios en la actividad α-L-ara durante el desarrollo y la maduración defrutilla. Sustrato y colorimetría empleados se indican en la leyenda de la Tabla IV.Letras distintas representan diferencias significativas entre medias de distintoscultivares al ser comparadas en un mismo estadio (P= 0,05).Dada la relevancia propuesta del metabolismo de arabinosa durante la maduración defrutilla (Koh y Melton, 2002) y el hecho de que hasta el momento no se había descrito laactividad ni la expresión de α-L-ara en este fruto, se decidió continuar con un análisis másdetallado de la misma. Este análisis involucró a las dos variedades de firmezas extremas,Camarosa y Toyonaka. Además se incluyó un mayor número estadios con el objeto deobtener un mayor grado de detalle en los niveles de actividad y expresión a lo largo deldesarrollo y la maduración. Se realizó a su vez, el estudio del tamaño de las proteínas conactividad α-L-ara mediante cromatografía de exclusión molecular y una búsqueda ycaracterización de la expresión de genes putativos que codifican para α-L-aras.76

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celular8. DiscusiónEl catabolismo de la pared celular es llevado a cabo por numerosas enzimas yproteínas que en conjunto conducen a una serie de modificaciones en los polímeros que lacomponen. Estos cambios incluyen: solubilización y demetilación de pectinas,depolimerización de pectinas y hemicelulosas, pérdida de azúcares neutros, etc. En elpresente trabajo, se analizó la actividad in vitro de enzimas que actúan sobre pectinas (PME,PG), sobre hemicelulosas (EGasa, Xnasa) y sobre ambas (β-gal, β-xil, α-L-ara). Es dedestacar que la actividad medida probablemente sea producto de la intervención simultáneade distintas isoformas de cada una de las enzimas, dado que este tipo de enzimas suelenconformar familias de proteínas que se expresan simultáneamente en un cierto estadio. Estehecho posiblemente refleje un cierto grado de redundancia en los procesos tendientes alcambio de textura que sufren los frutos al madurar, de modo de garantizar el deterioro finaldel mismo y la propagación de sus semillas.Si bien la medida de actividades in vitro es de gran utilidad, los resultados deben serevaluados con ciertos recaudos ya que éstas no necesariamente son el reflejo de lo queocurre in muro. En primer lugar, durante la preparación de los extractos se pueden estarperdiendo cofactores, iones o inhibidores que están presentes en el apoplasto y que por lotanto estarán ausentes en la reacción in vitro. A su vez, las condiciones de cinética talescomo pH y temperatura generalmente se eligen en base a los parámetros óptimos paracierta enzima, los cuales pueden diferir con los hallados en el apoplasto. Habitualmente seemplean como sustratos moléculas o polímeros artificiales. Estos sustratos, si bien poseenlos mismos tipos de enlaces que son hidrolizados por las correspondientes enzimas, puedenposeer un grado de accesibilidad distinto al que tienen los polímeros in muro.Dentro de las enzimas analizadas que modifican las pectinas se encuentra PME. Eneste caso se detectó un aumento de la actividad entre el desarrollo y el comienzo de lamaduración en los tres cultivares. La tendencia es coincidente con la observada en el cultivarRedgauntlet (Barnes y Patchett, 1976). En ese trabajo también se analizó la actividad enfrutos sobremaduros (cosechados en el estadio rojo y dejados madurar durante tres días) enlos que se observó un descenso, tal como ocurrió en nuestro caso entre el 50 y 100%R enCamarosa y Toyonaka (Fig. 27). Considerando todas las enzimas analizadas, PME fue la quetuvo una inducción más temprana con valores máximos para Camarosa y Toyonaka en elestadio B. En el caso de Pájaro, la inducción fue también temprana pero la actividad semantuvo constante y elevada hasta alcanzar el 100%R. Una mayor actividad PME debería77

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celularproducir mayor cantidad de grupos carboxilato libres en los polímeros pécticos que a su veztendrían la capacidad de interaccionar a través de iones Ca +2 , generando un mayorcontenido de pectinas iónicamente unidas (PSE). Precisamente, en este cultivar el contenidode PSE fue mayor que el detectado en los otros dos cultivares en el estadio 100%R (Fig. 21).El efecto que puede tener sobre la firmeza una mayor actividad PME durante la maduraciónaún no está claramente establecido. Si bien una mayor actividad aumentaría la probabilidadde formación de puentes de Ca 2+ (lo cual estabilizaría la estructura de la pared), por otrolado haría que las enzimas pectinolíticas (PG y PL) tuvieran una mayor afinidad por sussustratos. En el caso de tomate se ha descrito en fruto la expresión de tres isoformas dePME, denominadas PE1, PE2 y PE3 (Tucker y col., 1982), aunque la isoforma predominantedurante la maduración es PE2. Se obtuvieron líneas de tomate con expresión de PE2antisentido (Tieman y col., 1992; Hall y col., 1993), en las cuales se observó una reducciónde la actividad PME a menos del 10% de la actividad que poseían los frutos salvajes. Estareducción en la actividad total, fue fundamentalmente atribuida a un descenso en laexpresión de PE2, ya que la expresión de las otras dos isoformas no se vio modificada. Lamenor actividad PME durante la maduración pudo asociarse a un aumento en el tamañomolecular y grado de metilación de los polímeros pécticos (Tieman y col., 1992), sinembargo no se observaron cambios en el proceso de maduración (evaluando la degradaciónde clorofilas, acumulación de licopeno y síntesis de etileno). Tampoco se detectarondiferencias en la firmeza entre los frutos antisentido y los controles, aunque sí se vioafectada la integridad de los tejidos durante la senescencia de los primeros (Tieman yHanda, 1994). Sin embargo cuando se generaron líneas antisentido para la isoforma PE1,que es la predominante durante el desarrollo del fruto, éstas rindieron frutos con una mayorfirmeza que los controles (Phan y col., 2007). En frutilla se han descrito hasta el momentocuatro genes que codifican para PMEs, FaPE1 a FaPE4. La expresión de FaPE1, es específicade fruto y en el cultivar Chandler aumenta abruptamente entre el final del desarrollo y elcomienzo de la maduración (Castillejo y col., 2004). Este aumento podría correlacionarse conel incremento de la actividad PME entre los estadios Vg y B, hallado en los tres cultivaresestudiados en este trabajo (Fig. 27). La expresión de FaPE1 a lo largo de la maduración, sibien es detectable en todos los estadios estudiados, tuvo un patrón de intensidad oscilante,con un máximo en el estadio 50%R (estadio F6 en el trabajo original de Castillejo y col.,2004). El análisis de la regulación hormonal de dicho gen arrojó resultados poco usualespara genes involucrados en la maduración, cuya expresión es habitualmente reprimida porlas auxinas (Given y col., 1988b). La remoción de los aquenios en frutos verdes (fuente de78

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celularauxinas endógenas) reprimió la expresión de FaPE1, mientras que el tratamiento con unaauxina sintética promovió la expresión. Por otra parte, la aplicación de etileno a frutosmaduros provocó una inhibición de la expresión de este gen. Los autores proponen queFaPE1 estaría involucrado en los cambios de textura que ocurren durante la senescencia defrutilla. El incremento en la concentración de etileno que ocurre durante la senescencia(Perkins-Veazie, 1995; Iannetta y col., 2000) reprimiría la expresión de FaPE1 con lo que lospolímeros pécticos tendrían una menor capacidad de formación de puentes de Ca 2+ , y por lotanto se debilitaría la estructura de la pared.Otra familia de enzimas involucradas en la degradación de pectinas son laspoligalacturonasas (PGs). En el presente trabajo se utilizó tejido de tomate con madurezcomercial como control positivo durante la puesta a punto del protocolo de extracción ydeterminación de la actividad PG. En frutilla, los niveles detectados de actividad PG fueronun orden de magnitud menor que los medidos en tomate. En consecuencia, para su medidafue necesario que las cinéticas se realizaran durante intervalos de tiempo prolongados, dehasta 24 h, de modo coincidente a lo realizado en trabajos previos (Nogata y col., 1993). Esmás, estos bajos niveles podrían explicar los escasos reportes de detección de actividad PGen frutilla y la existencia de trabajos informando la ausencia de actividad (Barnes y Patchett,1976; Huber, 1984). La tendencia en los niveles de actividad (creciente, en nuestro caso)para el cultivar Toyonaka (Fig. 28) se contradice con los resultados de un trabajo previo, enel que la actividad detectada en este mismo cultivar fue alta durante el desarrollo del fruto yse redujo en estadios más avanzados de la maduración (Nogata y col., 1996).Probablemente las diferencias se deban a la utilización de distintos protocolos de extraccióny de cinética. Por ejemplo, en dicho trabajo realizaron una extracción de 12 h con ocasionalagitación, mientras que en nuestro caso fue con agitación constante y durante 3 h. Deacuerdo con nuestra experiencia este tiempo fue suficiente para recuperar el máximo deactividad. Se podría suponer que un extenso tiempo de extracción en ausencia de inhibidoresde proteasas en la solución puede perjudicar la recuperación y posterior estimación de laactividad. En nuestro caso, se observó un incremento de actividad PG durante lamaduración. Este aumento fue más tardío en Camarosa y menos importante que elobservado en Toyonaka, el cultivar más blando. Estos resultados están de acuerdo con elanálisis de la expresión de genes codificantes para PGs realizado con las mismas variedades(Villarreal y col., 2007). En dicho trabajo se analizó la expresión de dos genes denominadosFaPG1 y T-PG. El primero codificaría para una proteína funcional, mientras que el segundoposee una deleción de 85 pb que resulta en un cambio en el marco de lectura lo que79

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celularproduciría una proteína truncada y posiblemente inactiva. En el mismo trabajo se demostróque en Toyonaka predomina la expresión de FaPG1 por sobre la expresión de T-PG, mientrasque lo inverso se observó en Camarosa, y en Selva (ambos, cultivares con frutos de firmezaelevada). Además, las diferencias en los niveles de actividad PG se relacionan con losdiferentes grados de depolimerización de pectinas observados en los distintos cultivares,tanto en las fracciones PSA (Fig. 24) como en las PSH (Fig. 25). Es decir que en el cultivarmás blando se observó una mayor depolimerización de pectinas, que podría estarrelacionado con que dicho cultivar presentó mayores valores de actividad PG. Es de destacarque PG no es la única enzima vinculada con el proceso de depolimerización de pectinas. Laotra enzima que podría estar implicada en tal modificación es la pectato liasa (PL), cuyaactividad no ha podido ser detectada en frutilla ni en éste, ni en ningún trabajo previo,probablemente por razones operacionales. Si bien no existen reportes de medida de laactividad PL en frutilla, líneas que codifican para el antisentido de una de las PL descritas,rindieron frutos con mayor firmeza que aquellos provenientes de plantas controles (Jiménez-Bermúdez y col., 2002). Este hecho pone de manifiesto la importancia de los polímerospécticos en el mantenimiento de la estructura de la pared celular, y por lo tanto en lafirmeza, al menos en frutilla.Entre las enzimas que actúan sobre hemicelulosas, se analizó la actividad in vitro deendo-β-1,4-glucanasa (EGasa) y xilanasa (Xnasa). En el caso de EGasa se detectó una muybaja actividad y, al igual que con PG, se debieron realizar cinéticas durante lapsos de tiempoconsiderables para su adecuada detección. La tendencia fue común en las tres variedades:indetectable o muy baja actividad durante el desarrollo y gran parte de la maduración, y altaactividad en estadios de madurez avanzados (Fig. 29). Tal como se mencionó previamente,se ha propuesto que el sustrato in muro de esta enzima sería el xiloglucano (que es lahemicelulosa más abundante), ya que no se ha podido demostrar su acción sobre la celulosacristalina (Vicente y col., 2007). La actividad EGasa en frutilla estaría determinada al menospor dos genes, Cel1 y Cel2. La expresión del primero es específica de fruto y se incrementadurante la maduración (Manning, 1998). En el caso de Cel2, se halló que el gen se expresa apartir de estadios tempranos del desarrollo y también en tejidos vegetativos (Llop-Tous ycol., 1999). En trabajos independientes utilizando líneas antisentido para Cel1 (Wooley y col.,2001; Palomer y col., 2006) se generaron plantas que rindieron frutos con una reducción enla cantidad de proteína y en los niveles de actividad EGasa in vitro. Sin embargo, no sedetectaron diferencias al comparar la firmeza de los frutos de las plantas antisentido con lade los frutos controles sin transformar. En las líneas antisentido, la actividad EGasa fue80

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celularreducida pero no nula, y la actividad medida pudo ser consecuencia de la expresión de Cel2.Estos resultados podrían sugerir que la actividad residual en las líneas antisentido seríasuficiente para el ablandamiento del fruto en el caso que EGasa fuera determinante paradicho ablandamiento. Otra posibilidad es que la actividad EGasa y la consecuentedegradación de hemicelulosas no sea importante en el ablandamiento de frutilla. De todasmaneras, sería interesante obtener plantas transgénicas con Cel1 y Cel2 suprimidassimultáneamente. Sin embargo, no fue posible obtener frutos a partir de plantas consupresión de la expresión de Cel2, lo que estaría sugiriendo un rol importante de este gen enel desarrollo del fruto previo a la maduración (Palomer y col., 2006). Por otro lado Harpster ycol. (2002) sobreexpresaron constitutivamente en tomate un gen que codifica para unaEGasa de pimiento característica de la maduración, lograron mayores actividades EGasa,pero no detectaron cambios en el grado de depolimerización de las hemicelulosas ni en lafirmeza de los frutos. En nuestro caso, las bajas actividades detectables en gran parte deldesarrollo y la maduración, junto con la ausencia de grandes cambios en la distribución demasas moleculares de la fracción de hemicelulosas (Fig. 26) en los tres cultivares analizados,indicarían que el metabolismo de hemicelulosas no sería central en la determinación de lafirmeza en frutilla.Otra de las enzimas asociadas al metabolismo de hemicelulosas estudiada en elpresente trabajo es la Xnasa. Los escasos reportes disponibles caracterizando dicha actividaden frutos, incluyen pera japonesa (Yamaki y Kakiuchi, 1979) y palta (Ronen y col., 1991).Según nuestro conocimiento, este es el primer trabajo que describe la actividad Xnasadurante la maduración de frutilla. Al comparar las tendencias entre cultivares, las diferenciasse detectaron en estadios intermedios y hacia el final de la maduración (Fig. 30), guardandosus niveles una relación con las firmezas de los frutos.Para que ocurra una completa degradación de los xilanos durante la maduración,probablemente se requiera la acción coordinada de Xnasas y de β-D-xilosidasas (β-xils)(Sozzi y Civello, 2005). Se propone que las Xnasas catalizarían la hidrólisis interna de estepolímero, mientras que las β-xils (de actividad exo) liberarían residuos de xilosa desde elextremo no reductor a partir de los fragmentos generados por la primera. La β-xil no sóloactuaría sobre los xilanos sino que lo haría también sobre cierta fracción de pectinasdenominadas xilogalacturonanos (Bustamante y col., 2006). Es decir que esta enzima tendríala capacidad de modificar tanto polímeros pécticos como hemicelulósicos. Si bien en frutillano se ha comprobado directamente la existencia de xilanos en la pared celular, se hainformado que en la fracción de hemicelulosas existe una relación elevada de xilosa:glucosa81

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celular(Huber, 1984; Nogata y col., 1996; Koh y Melton, 2002), lo que sugiere la existencia depolímeros que contienen xilosa en dicha fracción (Bustamante y col., 2006). Este azúcar a suvez también puede encontrarse, aunque en menor proporción, en distintas fracciones depectinas, lo que podría atribuirse a la existencia de xilogalacturonanos (Bustamante y col.,2006). Los niveles de actividad β-xil en Toyonaka, el cultivar más blando, fueron mayoresque los medidos en las demás variedades durante todos los estadios analizados (Fig. 31).Estos resultados están de acuerdo con aquellos obtenidos por Bustamante y col. (2006),quienes utilizando los mismos cultivares estudiaron la expresión génica de la única β-xildescrita en frutilla (FaXil1), así como la acumulación de la proteína durante la maduración.Tanto la expresión como la acumulación de la proteína fueron mayores en el cultivar másblando.La galactosa es uno de los azúcares neutros cuyo contenido en la pared disminuyenotablemente durante la maduración de varios frutos, tales como tomate, pimiento, durazno,manzana, pera y frutilla, entre otros (Gross y Sams, 1984; Redgwell y col., 1997a). Trabajosrealizados en el cultivar Yolo permitieron detectar galactosa en todas las fracciones de lapared (Koh y Melton, 2002), aunque este azúcar predominó en la fracción de pectinassolubilizadas con Na 2 CO 3 , es decir, pectinas en las que prevalescen las interaccionescovalentes (equivalentes a la fracción PSH analizada en este trabajo). En nuestro caso, seobservó un aumento de la actividad β-gal durante la maduración, el cual fue más importanteen el cultivar más blando (Fig. 32). Se ha propuesto que en frutilla la actividad β-gal sería laresultante de la acción coordinada de al menos tres genes, Faβgal1, Faβgal2 y Faβgal3(Trainotti y col., 2001). En ese estudio, realizado en el cultivar Chandler, no se detectóactividad in vitro en estadios iniciales del desarrollo (Vp), aunque sí se comprobó laexpresión génica de las tres isoformas. En dicho cultivar la actividad fue detectable a partirdel estadio Vg (al igual que en los tres cultivares analizados en el presente trabajo) y latendencia observada a lo largo de la maduración fue similar a la hallada en nuestro casopara Camarosa. Una característica interesante de Faβgal1 y Faβgal2 es que ambas contienenen sus secuencias regiones que guardan homología con lectinas animales, lo que permitiríael anclaje a zonas específicas de su sustrato con un consecuente incremento en la eficienciade hidrólisis (Trainotti y col., 2001).Dentro de los azúcares neutros que componen las distintas fracciones de la paredcelular de frutilla, se destaca la arabinosa no sólo por su alto contenido, sino porque es unode los azúcares que en mayor proporción es eliminado de la pared durante la maduración(Gross y Sams, 1984; Koh y Melton, 2002). Se cree que esta disminución en el contenido de82

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celulararabinosa se debería al desmantelamiento de las cadenas laterales de fracciones de pectinasaltamente ramificadas. Es por ello que se sugiere que las cadenas laterales (arabinanos)cumplirían un rol estructural en el mantenimiento de la arquitectura de la pared celular enfrutilla (Koh y Melton, 2002). A pesar de haberse detectado actividad α-L-ara en grancantidad de frutos (Tateishi y col., 2005) y de haberse sugerido la importancia delmetabolismo de arabinosa en frutilla (Koh y Melton, 2002), no se había reportado laexistencia de dicha actividad en este fruto. Los sustratos in vivo propuestos para las α-L-arasserían residuos α-L-arabinofuranosilo de las cadenas laterales de las pectinas y de ciertospolímeros hemicelulósicos minoritarios (como el arabinoxilano). En fruto de tomate se hanfraccionado tres isoformas α-L-ara mediante exclusión molecular (α-Af I, α-Af II y α-Af III)(Sozzi y col., 2002b). En particular, se demostró que α-Af I es una isoforma Zn 2+dependiente, cuya actividad se incrementa por la presencia de dicho ión al realizar la cinéticain vitro. Teniendo en cuenta estos antecedentes se ensayaron diferentes soluciones deextracción (conteniendo o no ZnCl 2 ) en frutilla. Se encontró que la actividad α-L-ara no seafectó por la presencia de Zn 2+ (Tabla IV). La actividad α-L-ara se incrementó durante eldesarrollo y maduración de frutillas. Esta tendencia fue también descrita para una isoformade α-L-ara en tomate (Sozzi y col., 2002b), durazno (Brummell y col., 2004; Jin y col., 2006),damasco (Cardarelli y col., 2002), y palta (Tateishi y col., 2001), entre otros. En frutilla lapérdida de arabinosa es evidenciada tempranamente durante el proceso de maduración;esto es, entre el estadio B y el rosa (equivalente a un 50%R de la clasificación empleada enel presente trabajo) ya se observa un descenso del contenido de arabinosa en algunas de lasfracciones que componen la pared celular (Gross y Sams, 1984; Redgwell y col., 1997a; Kohy Melton, 2002). Particularmente, se describió un descenso en la cantidad de estos residuosen aquellas pectinas unidas covalentemente. Bajo la luz de estos resultados no era ilógicosuponer la presencia tanto de actividad de enzimas hidrolíticas con la capacidad de liberararabinosa como de genes que codifiquen para α-L-aras. En nuestro caso al comparar lasactividades en distintos cultivares, si bien la tendencia fue similar, el cultivar más blandoalcanzó valores cercanos al doble de aquellos medidos en la variedad más firme (Fig. 33). Elhecho que la actividad α-L-ara en Toyonaka fuera mayor que en Camarosa, se puederelacionar a una mayor disminución en el contenido de pectinas unidas covalentemente (Fig.22 B) junto con una solubilización de pectinas más temprana en el primer cultivar (Fig. 20B). Diferentes perfiles de actividad fueron también descritos al comparar distintas variedadesde otras especies. En tomate, la actividad en el cultivar VF36 aumentó al progresar lamaduración (Sozzi y col., 2002a), mientras que en Ailsa Craig la actividad tuvo una tendencia83

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN B: Enzimas de degradación de la pared celularclaramente descendente (Itai y col., 2003). Un trabajo reciente comparó dos tipos de peras(europeas y chinas), con texturas diferentes: una que se ablanda adquiriendo una texturasimilar a la de una frutilla madura (“melting”) y otra que adquiere una textura crocante(“crisp”) como la de una manzana (Mwaniki y col., 2007). Al analizar las peras crocantes, nose pudo establecer correlación entre la actividad α-L-ara y el ablandamiento. Sin embargo,para las peras de tipo “melting” hubo una correlación entre la actividad α-L-ara, laproducción de etileno climatérico y el concomitante descenso en la firmeza de los frutos.84

Sección C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividadenzimática

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimática1. Masa molecular de proteínas con actividad α-L-araCon el objeto de caracterizar el tamaño de las proteínas con actividad α-L-ara, seprepararon extractos enzimáticos a partir de frutos de la variedad Toyonaka en estadios B y100%R, los cuales se analizaron mediante cromatografía de exclusión molecular (Fig. 34). Laactividad α-L-ara se encontró distribuida en un único pico comprendido entre 50 y 70 kDa.No se observó modificación en la distribución de masas moleculares al comparar los perfilesobtenidos a partir de extractos proteicos generados con los dos estadios mencionados.67kDa43kDa25kDa13.7kDa0.100.08Actividad Toyonaka BActividad Toyonaka 100%RDO 2800.300.25μmol pNPhOH h -1 fracción -10.060.040.020.200.150.100.05DO 2800.0030 40 50 60 70 80 90Volumen (mL)Figura 34: Perfiles de exclusión molecular en Sephacryl S-100 de proteínas conactividad α-L-ara en estadios B y 100%R del cultivar Toyonaka. Los extractosproteicos fueron previamente concentrados por precipitación con acetona. Serecogieron fracciones de 800 μl sobre las que se ensayó la actividad tal como seindica en la leyenda de la Tabla IV. Se indican los volúmenes de elución y la masa delos patrones de masa molecular.0.002. Clonado de un fragmento de α-L-aras de frutilla (FaAras)Se utilizaron secuencias de α-L-aras de otras especies para el diseño de cebadoresdegenerados (L2Ara y R2Ara, ver Tabla II) mediante el programa CODEHOP (Rose y col.,1998b). Se ensayaron diferentes condiciones de PCR hasta lograr una buena amplificación.No fue posible obtener amplificación en las condiciones empleadas utilizando ADNc de frutocomo molde, pero sí cuando se utilizó una biblioteca de ADNc proveniente de frutillas enestadios entre 25 y 75%R (cv Chandler) con la que se contaba en el laboratorio (Civello ycol., 1999). El producto de PCR se resolvió en gel de agarosa, se purificó y se clonó.86

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimáticaMediante la secuenciación del mismo se confirmó que la secuencia de este fragmento de 528pb guardaba una alta homología con la de otras α-L-aras de plantas. Este fragmento seempleó como molde para la síntesis de la SONDA S (ver Tabla II) con la que se realizarontanto el análisis de expresión génica mediante Northern-blot, como la búsqueda en labiblioteca de ADNc de fruto, con el objetivo de aislar FaAras putativas.3. Expresión de FaAras en diferentes tejidos y estadiosLa expresión génica de FaAras fue analizada según la abundancia de ARNm en tejidosvegetativos y en frutos en desarrollo y durante la maduración. Para la detección de FaArasse utilizó la SONDA S (ver Tabla II), marcada con 32 P. Se observó una fuerte hibridación enreceptáculo de estadio 75%R, y sólo se detectó una leve señal en los demás tejidosanalizados (Fig. 35). El tejido con mayor señal fue sépalo, aunque fue mucho más tenue quela del receptáculo 75%R. Este patrón sugiere que si bien se detectó una leve hibridación detranscriptos correspondientes a FaAra en diversos tejidos, ésta se expresaríapredominantemente en el fruto.AquenioFrutoP H S Vg 75%R 75%RrRNAFigura 35: Expresión génica de FaAra en diferentes tejidos por Northern-blot. Seempleó ARN total (10 μg) de pétalo (P), hoja (H), sépalo (S), aquenios de frutos Vg y75%R y receptáculo en estadio 75%R. Para la detección se empleó la SONDA S (verTabla II, Materiales) marcada con 32 P y se utilizó ARNr teñido con bromuro de etidiocomo control de carga.Cuando se analizó la expresión génica durante el desarrollo y la maduración (Fig. 36),se detectó señal en todos los estadios en ambos cultivares estudiados. Se observó unaintensa señal en Camarosa en el estadio Vp que disminuyó al progresar hasta B. Al pasar deB a 50%R se registró un claro aumento en la intensidad, la cual siguió en aumento hasta elfinal de la maduración (Fig. 36 B). En Toyonaka, la reducción de la expresión de FaArasentre Vp y B fue menos marcada que la observada en Camarosa, pero el aumento entre B y50%R fue mayor. Entre 50%R y 100%R, la expresión de FaAra en Toyonaka se mantuvoelevada y relativamente constante.87

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimáticaAVp B 50%R 75%R 100%RBCamarosaToyonaka2,0CamarosaToyonakarRNArRNA1,81,61,41,21,0Intensidad relativa0,8Vp B 50%R 75%R 100%REstadioFigura 36: Expresión génica de FaAras en distintos estadios en dos cultivares. A,Análisis por Northern-blot empleando 10 μg de ARN total y la SONDA S para ladetección. En el panel superior se muestra Camarosa y en el inferior Toyonaka. Comocontrol de carga se utilizó RNAr teñido con bromuro de etidio. B, Intensidadesrelativas de hibridación. Se cuantificó la intensidad de las señales con un analizadorde imágenes y se hicieron relativas a la intensidad hallada en el estadio B en cadacultivar.4. Actividad α-L-ara en distintos estadiosComo se mencionó previamente, en esta etapa del trabajo se aumentó el número deestadios analizados con el objeto de obtener un mayor grado de detalle en la caracterizaciónde α-L-ara durante el desarrollo y la maduración. En la figura 37 se muestran los niveles deactividad hallados en los dos cultivares de firmezas extremas.6050CamarosaToyonakabpkatal / g fruto403020bababa10a0N.D.Vp B 50%R 75%R 100%REstadioFigura 37: Cambios en la actividad α-L-ara durante el desarrollo y la maduración defrutilla. El sustrato y la colorimetría utilizados se indican en la leyenda de la Tabla IV.Letras distintas representan diferencias significativas entre medias de distintoscultivares al ser comparadas en un mismo estadio (P= 0,05). ND, no detectado.88

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimáticaNo fue posible detectar actividad en el estadio Vp en ninguno de los cultivares, perosí a partir del estadio B. Los valores hallados en Camarosa aumentaron constantemente a lolargo de la maduración. En Toyonaka la tendencia fue distinta, con un aumento claro entre By 50%R, sin cambio entre 50%R y 75%R y con un nuevo incremento hacia el final de lamaduración. Es de destacar que en todos los estadios analizados, la actividad detectada enToyonaka fue cercana al doble de la registrada en Camarosa.5. Clonado y análisis de la secuencia de α-L-aras de frutilla (FaAras)Con el propósito de hallar FaAras putativas, se realizó una búsqueda en unabiblioteca de ADNc generada a partir de frutos (Civello y col., 1999) utilizando la SONDA S.Se aislaron tres clones positivos que al ser secuenciados se comprobó que codificaban paraα-L-aras putativas, por lo que fueron denominados: FaAra1, FaAra2 y FaAra3. Dada lasimilitud que presentaban las tres FaAras, y a fines de minimizar errores de secuenciación,se secuenciaron varias copias de cada clon al menos por triplicado. Si bien las tres FaArastenían una alta similitud de secuencia en la zona codificante, se encontraron diferenciasimportantes en la región 5’ no traducible, especialmente en la porción más distante delcomienzo del marco abierto de lectura. También se observaron diferencias de secuenciaentre los tres clones en las regiones 3’ no traducibles.Por comparación de secuencias, se encontró que las FaAras tenían similitud con otrasα-L-aras de plantas presentes en el GenBank: Prunus persica (ABF22680), Malus domestica(AAP97437), Pyrus communis (BAF42035) y Pyrus pyrifolia (BAC99303), conporcentajes de identidad entre 78 y 84%.El clon de FaAra1 tuvo una longitud total de 2.328 pb, incluyendo una región 5’ notraducible de 142 pb (Fig. 38), un marco abierto de lectura de 1.989 pb, y una porción de197 pb previa a la secuencia poli(A+). Para este clon se predijo una proteína inmadura de663 aminoácidos.En el caso del clon FaAra2, éste tuvo una longitud de 2.380 pb que incluyó unaregión 5’ no traducible de 254 pb (Fig. 38), un marco abierto de lectura de 1.995 pb y 131pb previas a la región poli(A+). A partir de su secuencia, se predijo una proteína inmadurade 665 aminoácidos.El clon obtenido para FaAra3 contó con 2.504 pb. Realizando el análisis de lasecuencia se encontró una región 5’ no traducible de 259 pb (Fig. 38). El marco abierto delectura de 1.446 pb estaba interrumpido por un codón de terminación, el cual se encuentrapresente dentro de un inserto de 45 pb no hallado en los otros dos clones. A continuación de89

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimáticaeste codón de terminación, la secuencia continuó 588 pb antes de alcanzar la región 3’ notraducible de 211 pb. La traducción del marco de lectura abierto más próximo al extremo 5’resultó en una proteína inmadura de 482 aminoácidos. Es de destacar que, a continuaciónde la inserción hallada en esta secuencia, la traducción en el mismo marco de lectura resultóen una secuencia de aminoácidos similar a la observada en las otras dos FaAras.FaAra1142 1989 197FaAra2254 1995 131FaAra3259 1446 588 21145Figura 38: Representación esquemática de la secuencia nucleotídica de FaAras. Seindica dentro de cada bloque el tamaño de la región que representa en pb. Losextremos 5’ y 3’ no traducibles se muestran como bloques de color gris y amarillo,respectivamente. En verde se indican los marcos abiertos de lectura. Se muestra elinserto hallado sólo en FaAra3 (rojo), dentro del que se encuentra el codón determinación del marco de lectura. En azul, fragmento de FaAra3 desde el codón determinación hasta extremo 3’ no traducible.Las secuencias aminoacídicas predichas fueron alineadas con las secuencias de α-Larasde otras especies de frutos (Fig. 39). Dicho alineamiento puso de manifiesto lapresencia de un gran número de residuos conservados dentro de este grupo de frutos.Incluidos dentro de estos residuos conservados, se determinó la presencia de cuatro sitios deN-glicosilación para FaAra1 y FaAra2, y tres sitios para FaAra3 (Fig. 39). Se ha propuestopara este grupo de proteínas, la intervención de dos residuos Glu en la catálisis: un residuoácido y otro nucleófilo (Fulton y Cobbett, 2003). Se pudo comprobar la existencia de ambosresiduos en las tres FaAras y en las otras proteínas de especies relacionadas. Utilizando losprogramas PSORT (Nakai y Kanehisa, 1991) y TargetP (Emanuelsson y col., 2000) se predijoque las tres proteínas putativas serían exportadas al apoplasto, indicando que las enzimastendrían como sustrato componentes de la pared celular. La presencia de un péptido señalfue predicha para las tres proteínas, y su eliminación produciría proteínas de 70,5, 70,4 y 51kDa, para FaAra1, FaAra2 y FaAra3 respectivamente.90

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimática10 20 30 40 50 60 70 80FaAra1 ----------MGVLEVLLCCCLVLPCFAVEVQTAQLIVDASQASGRPISPTLFGLFFEEINHAGAGGLWAELVNNRGFEA 70FaAra2 --------MGVLDVLLCCCCCLVLPCFAVEAQTAQLIVDASQASGRPISPTLFGLFFEEINHAGAGGLWAELVNNRGFEA 72FaAra3 ----------MGVLEVLLCCCLVLPCFAVEVQTAQLIVDASQASGRPISPTLFGLFFEEINHAGAGGLWAELVNNRGFEA 70M. domestica MGSCKSPHVVLLLHVLLCSVYRCFAIGVDANQTANLLIDASQASARPISDTLFGIFFEEINHAGAGGVWAELVSNRGFEA 80P communis MGSCKSPHIVLLLYVLLCSVYRCFAIGVDANQTANLLIDASQASARPISDTLFGIFFEEINHAGAGGVWAELVSNRGFEA 80P persica MGSRKSPHVVLLLYVLVCFVYQSFAIGVDTNQTAKLLVDASEASGRPISETLFGIFFEEINHAGAGGLWAELVSNRGFEA 8090 100 110 120 130 140 150 160FaAra1 GGPNTPSNIDPWSIIGSESSLLVSTDRSSCFERNKVALRMEVLCDSQGANICPAGGVGIYNPGFWGMNVEKGKTYSVTLY 150FaAra2 GGPNTPSNIDPWSIIGSESSLLVSTDRSSCFERNKVALRMEVLCDSQGANICPAGGVGIYNPGFWGMNVEKGKTYSVTLY 152FaAra3 GGPNTPSNIDPWSIIGSESSLLVSTDRSSCFERNKVALRMEVLCDSQGANICPAGGVGIYNPGFWGMNVEKGKTYSVTLY 150M. domestica GGPNTPSNIDPWAIIGNESSLIVSTDRSSCFDRNKVALRMEVLCDTQGANSCPAGGVGIYNPGFWGMNIEKGKTYNAVLY 160P communis GGPNTPSNIDPWAIIGNESFLIVSTDRSSCFDRNKVALRMEVLCDTQGANSCPAGGVGIYNPGFWGMNIEKGKTYNTVLY 160P persica GGPNVPSNIDPWSIIGNESSLIVSTDRSSCFDRNKVALRIEVLCDSQGASSCPDGGVGIYNPGFWGMNIEKGKTYSVVLY 160170 180 190 200 210 220 230 240FaAra1 VRSSGAINVSVSLTSSNGLQTLAAENIMASVSEVSNWTKFNVLLEAKGTNPSSRLQLTTARKGLIWFDQVSAMPLDTYKG 230FaAra2 VRSSGAINVSVSLTSSNGLQTLAAENIMASVSEVSNWTKFNVLLVAKGTNPSSRLQLTTARKGLIWFDQVSAMPLDTYKG 232FaAra3 VRSSGAINVSVSLTSSNGLQTLAAENIMASVSEVSNWTKFNVLLEAKGTNPSSRLQLTTARKGLIWFDQVSAMPLDTYMG 230M. domestica VRSSGSINVSVSLTGSDGLQKLAAANIIASGSEVSNWTKFEVQLKAQGTNPNSRLQLTTTSKGVIWFDQVSAIPLDTYKG 240P communis VRSSGSINVSVSLTGSDGLQKLAAANIIASGSEVSNWTKFEVQLIAQGTNPNSRLQLTTTSKGVIWFDQVSAIPLDTYKG 240P persica VRSSGSINVSVSLTGSDGLQKLAAANIIASDSEVSNWTKVEVMLEAQGTNPNSRLQLTTTRKGFIWFDQVSVMPLDTYKG 240250 260 270 280 290 300 310 320FaAra1 HGFRKDLVDMLADMKPQFLRFPGGCFVEGEWLRNAFRWKETIGQWEERTGHFGDVWMYWTDDGLGYFEFLQLAEDLGTLP 310FaAra2 HGFRKDLVDMLADMKPQFLRFPGGCFVEGEWLRNAFRWKETIGQWEERPGHFGDVWMYWTDDGLGYFEFLQLAEDLGTRP 312FaAra3 HGFRKDLVDMLAYMKPQFLRFPGGCFVEGEWLRNAFRWKETIGQWQERPGHFGDVWMYWTDDGLGYFEFLQLAEDLGTRP 310M. domestica HGFRKDLVQMLADLKPRFFRFPGGCFVEGEWLRNAFRWKETIGPWEERPGHFGDVWMYWTDDGLGYFEFLQLSEDLGSLP 320P communis HGFRKDLVQMLADLKPQFFRFPGGCFVEGEWLRNAFRWKETIGPWEERPGHFGDVWMYWTDDGLGYFEFLQLSEDLGSLP 320P persica HGFRKDLVEMLEDLKPQFIRFPGGCFVEGEWLRNAFRWKETIGPWEERPGHFGDVWMYWTDDGIGYFEFLQLAEDLGTLP 320330 340 350 360 370 380 390 400FaAra1 IWVFNNGISHNDQVDTSNILPFVQEALDGIEFARGSPDSSWGSIRATMGHPEPFDLRYVAVGNEDCGKKNYQGNYLKFYS 390FaAra2 IWVFNNGISHNDQVDTSNILPFVQEALDGIEFATGSPDSTWGSIRAAMGHPEPFDLRYVAVGNEDCGKKNYRGNYLKFYS 392FaAra3 IWVFNNGISHNDQVDTSNILPFVQEALDGIEFARGSPDSSWGSIRATMGHPEPFDLRYVAVGNEDCGKKNYRGNYLKFYS 390M. domestica IWVFNNGISHNDQVDTSSVLPFVQEALDGIEFARGSPNSTWGSLRAAMGHPEPFDLRYVAIGNEDCGKKNYRGNYLKFYS 400P communis IWVFNNGISHNDQVDTSSVLPFVQEALDGIEFARGSPNSTWGSLRAAMGHPEPFDLRYVAIGNEDCGKKNYRGNYLKFFS 400P persica IWVFNNGISHTDQVDTSSVLPFVQEALDGLEFARGSPNSTWGSLRAAMGHPEPFDLRYVAIGNEDCGKKNYLGNYLKFYS 400410 420 430 440 450 460 470 480FaAra1 AIKHAYPDIQIISNCDGSSHPLDHPADLYDFHVYTSASNMFSMAHQFDRTPRKGPKAFVSEYAVTGKDAGGGSLLAALAE 470FaAra2 AIKHAYPDIQIISNCDGSSHPLDHPADLYDFHVYTSASNMFSMAHQFDRTPRKGPKAFVSEYAVTGKDAGGGSLLAALAE 472FaAra3 AIKRAYPDIQIISNCDGSSHPLDHPADLYDFHVYTSASNMFLMAHQFDRTPRKGPKAFVSEYAVTGKDAGGGSLLAALAE 470M. domestica AIRNAYPDIKMISNCDGSSRQLDHPADMYDFHIYTSASNLFSMANHFDHTSRNGPKAFVSEYAVTGKDAGRGSLLAALAE 480P communis AIRNAYPDIKMISNCDGSSRQLDHPADMYDFHIYTSASNLFSMANHFDHTSRNGPKAFVSEYAVTGKDAGRGSLLAALAE 480P persica AIKRAYPDIKMISNCDGSSRKLDHPADLYDFHVNTDAKNMFSMAHQFDHTSRSGPKAFVSEYAVTGKDAGTGSLLAALGV 480490 500 510 520 530 540 550 560FaAra1 AGFLIGLEKN---------------SDVVEMASYAPLFVNANNKRWSPDAIVFNSSQLYGTPSYWVQCFFSESSGATIFN 535FaAra2 AGFLIGLEKN---------------SDVVEMASYAPLFVNANNKRWSPDAIVFNSSQLYGTPSYWVQCFFSESSGATIFN 537FaAra3 AGFLIGLEKNSY.VLPLCSSPSINCSDVVEMASYAPLFVNANNKRWSPDAIVFNSSQLYGTPSYWVQCFFSESSGATIFN 549M. domestica AGFLIGLEKN---------------SDIVEMASYAPLFVNTHDRRWNPDAIVFDSSQLYGTPSYWVQCLFNESSGATLYN 545P communis AGFLIGLEKN---------------SDIVEMASYAPLFVNTHDRRWNPDAIVFDSSQLYGTPSYWVQCLFNESSGATLYN 545P persica AGFLIGLEKN---------------SDVVEMACYAPLFVNANNRRWNPDAIVFNSSHLYGTPSYWVQRLFNESSGATIFN 545570 580 590 600 610 620 630 640FaAra1 ATLQTESSTSLLASAILWKSSEDQKTYLRIKIVNFGSNIVNLRIRVDGLEPNSVSMSGSTKTVLTSKNVMDENSFDEPKK 615FaAra2 ATLQTESSTSLLASAILWKSSEDQKTYLRIKIVNFGSNIVNLRIRVDGLEPNSVSMSGSTKTVLTSKNVMDENSFDEPKK 617FaAra3 ATLQIESSTSLLASAILWKSSEDQKTYLRIKIVNFGSNIVNLRIRVDGLEPNSVSMSGSTKTVLTSKNVMDENSFDEPKK 629M. domestica STLQMNSSTSLLASAISWQNSENENTYLRIKVVNLGTYTVNLKVFVDGLEPNSVSLSGSTKTVLTSNNQMDENSFNEPKK 625P communis STLQMNSSTSLLASAISWQNSENENTYLRIKVVNLGTNTVNLQVFVDGLEPNSISLSGSTKTVLTSNNQMDENSFNDPTK 625P persica ATLQTNLSTSLLASAISWKNSENGNSYLRIKIVNFGTNIVNLKIAVDGLEPNSINLSESTKTVLTSTNLMDENSFNEPKK 625650 660 670 680 690FaAra1 VIPNLGLLENAG---EEMDVGLSAHSFTSIDLLVEPSHLTTGTNSSSISSS--- 663FaAra2 VIPNLGLLENAG---EEMDVGLSAHSFTSIDLLVEPSHLTTGADSSSISSS--- 665FaAra3 VIPNLGLLENAG---EEMDVGLSAHSFTSIDLLVEPSHLTTGADSSSISSS--- 677M. domestica VIPKRSLLESAG---EEMEVVISPRSFTSIDLLMESSDVIRTTGADSVSVSSI- 675P communis VIPKQSLLESAG---EEMEVVISPRSFTSIDLLMESSDIIRTTGADSVSVSSI- 675P persica VIPNRILLEKAGEDGEDMEVAISPRSFTTIDFLIESS-FIRTTGADSVSVSSI- 677Figura 39: Alineamiento de las secuencias proteicas predichas para FaAras con α-Larasde manzana (Malus domestica, AAP97437), pera (Pyrus communis, BAF42035) ydurazno (Prunus persica, ABF22680). El alineamiento se generó con el métodoClustalW (Thompson y col., 1994). Los aminoácidos se numeraron de acuerdo con laestructura primaria de las proteínas, con residuos idénticos y similares representadosen cajas color negro y gris, respectivamente. Los péptidos señal de las FaAras seindican recuadrados. Símbolos: , sitios putativos de N-glicosilación; , posición delcodón de terminación de FaAra3; ▲, residuos ácidos catalíticos (Glu-374/Glu-376) yresiduos nucleófilos catalíticos (Glu-451/Glu-453).91

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimáticaSe realizó un análisis adicional de las secuencias proteicas con el objetivo de hallardominios conservados típicos de este grupo de hidrolasas (Fig. 40). En las tres FaAras seencontró un módulo de unión a carbohidratos (CBD) CMB_4_9 (pfam 02018), entre losaminoácidos 60 y 224 para FaAra1 y FaAra3, y entre 62 y 126 para FaAra2. Por su parte, enFaAra1 y FaAra2 se detectó además un dominio C-terminal de Alfa-L-arabinofuranosidasas(Alpha-L-AF_C, de aproximadamente 200 residuos) entre las posiciones 450 y 638, y 452 y640 respectivamente. Una porción mínima de este dominio fue hallada en FaAra3.FaAra1CBD_4_9Alpha-L-AF_CFaAra2CBD_4_9Alpha-L-AF_CFaAra3CBD_4_9Figura 40: Representación esquemática de la estructura primaria predicha para lastres FaAras (representadas como proteínas sin péptido señal) y los dominiosconservados hallados: módulo de unión a carbohidratos (CBD_4_9, cajas color rojo) ydominio terminal C-terminal de Alfa-L-arabinofuranosidasas (Alpha-L-AF_C, cajascolor azul). Se muestra en el borde superior una escala de residuos de aminoácidos ycon triángulos (▲) los dos residuos de Glu intervinientes en la catálisis.Se construyó un árbol filogenético utilizando alineamientos de secuencias de glicosilhidrolasas (GH) pertenecientes a las familias 3, 43 y 51 (http://www.cazy.org, (Coutinho yHenrissat, 1999)) (Fig. 41). Se comprobó que las proteínas FaAras deducidas se agruparonjunto con miembros de la familia GH 51 (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY) y no con aquellospertenecientes a la familia GH 3, en la cual se agrupan α-L-aras bifuncionales(arabinofuranosidasa/xilosidasa) y xilosidasas putativas.92

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimática85100α-arabinosidase Alpha-arabinosidase 1 Pyrus communis 1 Pyrus coBAF42035Pyrus pyrifolia (putativa putative α-L-arabinofuranosidasa) alphBAC99303GH 5195Malus domestica (putativa putative α-L-arabinofuranosidasa) alphAAP974379999Prunus persica (putativa putative α-L-arabinofuranosidasa) alphaABF22680FaAra1.pro5794100FaAra3.proFaAra2.proARA-1 Lycopersicon esculentum esculentumAAL18931100ASD2 (A. Arabidopsis thaliana) α-L-arabinofuranosidasa thaliana alphAY243510100A. A thaliana putative α-L-arabinofuranosidasa alpha-L-arabiAAF19575AXAH-II (Hordeum hordeum vulgare) Arabinoxilan arabinofuranohidrolasa AAK21880100A. A thaliana flia 43 (putativa AT3G49880.proβ-xilosidasa) At3g49880A. A thaliana flia 43AT5G67540.pro(putativa β-xilosidasa) At5g67540GH 4398PpARF2 pPARF2 (Pyrus pyrifolia) α-L-arafasa/β-D-xilosidasa alpha-AB195230GH 3100FaXyl1 (Fragaria ananassa) β-D-xilosidasa betaAAS17751100A. A thaliana (putative beta-xylosidaβ-D-xilosidasa) AY120767ARA-I (Hordeum vulgare) α-L-arafasa/β-D-xilosidasa alpha-LAY02925994LeXYL1 LEXYL1 (Solanum lycopersicum) putativa pβ-D-xilosidasa AB0295910Figura 41: Análisis filogenético incluyendo miembros de las familias 3, 43 y 51 deglicosil hidrolasas de plantas. Los números de acceso del GenBank se indican alcostado del nombre de la proteína. El dendograma se construyó usando el métodoClustalW (Thompson y col., 1994) para generar un alineamiento que se sometió alanálisis de reconstrucción de filogenia (método de Neighbor-Joining, correcciónmodelo amino Poisson y bootstrap con 1025 replicados).6. Análisis de expresión por RT-PCREl elevado grado de semejanza entre las secuencias nucleotídicas de las tres FaArassugirió que mediante la técnica de Northern-blot se había detectado, al menos, la expresióngénica de las tres FaAras. Dada la dificultad de analizar mediante esta técnica la expresiónde cada una de ellas, se recurrió a la técnica de RT-PCR semicuantitativa para poderdistinguir la expresión individual de cada FaAra.Con el objeto de establecer si los cebadores usados para el estudio por RT-PCR eranespecíficos para cada gen en particular, se realizaron reacciones de PCR utilizando todas lascombinaciones posibles de pares de cebadores y moldes (minipreps). Se emplearon lascondiciones (programa de PCR, concentración MgCl 2 y cebadores) y número de cicloselegidos para cada par de cebadores. Una vez optimizadas las condiciones de amplificación,93

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimáticano se detectó amplificación cruzada aún empleando sondas radiactivas para la detección(Fig. 42), indicando que sería posible analizar la expresión de cada gen por separado.Molde (miniprep)CebadoresFaAra1 FaAra1FaAra2 FaAra2FaAra3 FaAra3FaAra1 FaAra1FaAra2 FaAra2FaAra3 FaAra3FaAra1 FaAra1FaAra2 FaAra2FaAra3 FaAra3FaAra1 L/RFaAra2 L/RFaAra3 L/R3 µl 9 µl 26 µlVolumen prod. PCR sembradoFigura 42: Comprobación de la especificidad de amplificación y detección de FaAras.Con cada par de cebadores se realizaron tres PCR (en las condiciones establecidaspara cada par) empleando como molde, miniprep de cada uno de los tres clones deFaAra. Distintos volúmenes de producto de PCR (3, 9 y 26 μl) fueron resueltos engeles de agarosa, el ADN se transfirió a membranas de nailon y se fijó a las mismascon luz UV. Para la hibridación de FaAra 1 y FaAra2 se empleó la SONDA 1, mientrasque la SONDA 2 se utilizó para FaAra3 (ver Tabla II en Materiales).Una vez determinada la especificidad de las condiciones de amplificación para cadagen particular de FaAra, se procedió al análisis de su expresión por RT-PCR en los cultivaresCamarosa y Toyonaka. La señal de expresión de FaAra1 se detectó en todos los estadios enambos cultivares (Fig. 43). En Camarosa, la intensidad de la señal aumentó entre Vp y B, semantuvo relativamente constante entre B y 50%R, y descendió hacia el final de lamaduración. La expresión de este gen fue elevada en el estadio Vp del cultivar más blando,Toyonaka, pero disminuyó al pasar al estadio B. Entre B y 75%R, la expresión aumentóclaramente, pero descendió abruptamente hacia el final de la maduración. La expresión deFaAra1 en el estadio 100%R fue comparable en ambos cultivares.También se halló expresión génica de FaAra2 en todos los estadios en las dosvariedades, sin embargo las tendencias fueron completamente distintas (Fig. 43). Mientrasque el nivel de expresión en Camarosa se mantuvo relativamente constante o con un levedescenso a lo largo de la maduración, en Toyonaka se observó un máximo de expresión enel estadio 50%R, alcanzando valores superiores a los registrados para el primer cultivar.Finalmente, el análisis de FaAra3 indicó una expresión detectable en todos losestadios analizados. La intensidad de expresión relativa en Toyonaka fue alta en Vp,94

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimáticadescendió hasta valores mínimos en B, y a partir de este estadio aumentó alcanzandovalores máximos en el 100%R. En cambio, en Camarosa la expresión fue máxima en el frutoB y luego descendió durante la maduración, alcanzando valores muy inferiores a los deToyonaka.FaAra1CamToyAVp B 50% R 75% R 100% RCamToyB3002001000600FaAra2CamToy400200300FaAra3CamToy15018SCamToy0Vp B 50%R 75%R 100%REstadioVp B 50% R 75% R 100% RFigura 43: Análisis de la expresión de las FaAras durante el desarrollo y lamaduración de frutilla. A, Expresión de FaAra1, FaAra2 y FaAra3 en Camarosa (Cam)y Toyonaka (Toy). Las sondas empleadas fueron: SONDA 1 para FaAra 1 y FaAra2,SONDA 2 para FaAra3 y SONDA R para el 18S (ver Tabla II en Materiales). En elpanel inferior se muestra la expresión del gen 18S, utilizado como control de carga.B, Perfiles de expresión obtenidos mediante la relativización de las intensidadesrespecto del control de carga.95

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimática7. DiscusiónLa pérdida de arabinosa es un rasgo característico de los cambios que ocurren en lapared celular durante la maduración de frutillas (Gross y Sams, 1984; Redgwell y col.,1997b; Koh y Melton, 2002). Estos cambios sugieren fuertemente la presencia de enzimasque lleven a cabo la catálisis del proceso. En este sentido, en el presente trabajo se detectóla presencia de enzimas y genes probablemente responsables de la liberación de arabinosa apartir de polímeros pécticos y hemicelulosas.La búsqueda de genes codificantes para α-L-arabinofuranosidasas permitió el clonadode tres de ellos (FaAra1, FaAra2 y FaAra3). Las tres FaAras contaron con escasas diferenciasde secuencia en sus regiones codificantes, pero se observaron diferencias importantes en lasregiones no traducibles, lo que permite suponer que fueron clonados tres genes distintos. Enfrutilla, se obtuvieron resultados similares al estudiar genes de β-1,3-glucanasa (Shi y col.,2006), cuyas secuencias en las regiones codificantes fueron muy similares si biencorresponden a dos genes diferentes. El grado de similitud detectado en las FaAras condujoa suponer que el ensayo de expresión génica mediante Northern-blot (empleando la SONDAS) detectaba la expresión de las tres FaAras analizadas en este trabajo, así como la de otrasposibles FaAras aun no descritas.Mediante el estudio de la expresión génica en distintos tejidos se observó que laexpresión de FaAras fue muy baja o nula en tejidos vegetativos (Fig. 35), sugiriendo unpatrón de expresión prácticamente específico de fruto y un rol putativo de α-L-aras en lamodificación de la pared celular durante el desarrollo y la maduración. Las metodologías deNorthern-blot (Fig. 36) y RT-PCR semicuantitativa (Fig. 43) permitieron detectar la expresiónde los genes que codifican para FaAras, en todos los estadios de desarrollo y madurez tantoen Camarosa como en Toyonaka. Sin embargo, no se pudo detectar actividad enzimática α-L-ara en estadios tempranos del desarrollo (Vp) en ninguno de los cultivares estudiados, aunutilizando distintos protocolos de extracción. Esta discrepancia podría deberse a posiblesmecanismos de regulación post-transcripcional de la enzima, a la presencia de inhibidores dela actividad o a la existencia de dificultades técnicas. Un fenómeno similar fue descrito alestudiar la expresión y actividad β-galactosidasa (β-gal) en el cultivar Chandler de frutilla(Trainotti y col., 2001). En dicho trabajo se halló una expresión génica elevada de al menostres isoformas de β-gal en el estadio Vp, pero no se pudo detectar la correspondienteactividad in vitro. La existencia de una regulación post-transcripcional fue propuesta paraotras enzimas en diferentes frutos. En tomate, se estudió una endo-(1,4)-β-mananasa(LeMAN 4) durante la maduración (Carrington y col., 2002). El ARNm correspondiente a esta96

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimáticaenzima fue detectado en el estadio verde maduro, aumentó en frutos donde se habíainiciado la acumulación de licopenos (estadio “breaker”) y se mantuvo con niveles elevadosen estadios más avanzados. Sin embargo, la actividad fue casi indetectable en estadiostempranos y no aumentó significativamente sino hasta alcanzar los estadios rosado y rojo.Los autores propusieron que este comportamiento podría deberse a un mecanismo deregulación post-transcripcional de la enzima. Más recientemente se investigó un gen depoligalacturonasa (PG) en Prunus domestica (Pd-PG1) y se encontró una falta de correlaciónentre la expresión génica y la actividad total PG, que podría ser explicada por la presencia demás de un gen codificante para PG y/o regulación post-transcripcional (Iglesias-Fernández ycol., 2007). Otro posible mecanismo de regulación post-transcripcional sería la acción deinhibidores, que podrían haber sido extraídos junto con las enzimas y que ejercerían suacción inhibitoria aun durante los ensayos de actividad in vitro. En kiwi se describió laexistencia de un inhibidor de la enzima pectin metilesterasa (Balestrieri y col., 1990). Setrata de un inhibidor competitivo de naturaleza glicoproteica capaz de ejercer su acción, enun amplio rango de pH (3,5-7,5) y sobre la actividad PME de kiwi y de otras especies comonaranja, tomate, manzana, banana y papa.El análisis de la expresión génica por RT-PCR de cada uno de los genes estudiados eneste trabajo mostró que los transcriptos de las tres FaAras están presentes en amboscultivares durante el desarrollo y la maduración, lo que concuerda con los resultados delanálisis por Northern blot. El estudio de la expresión individual de cada FaAra permitióencontrar diferencias entre los perfiles de Camarosa y Toyonaka a través de la maduración,especialmente en FaAra2 y FaAra3. La expresión de dichos transcriptos descendióligeramente durante la maduración en Camarosa, en tanto que en Toyonaka se detectó unamáxima expresión en el 50%R para FaAra2 y un claro aumento para FaAra3 a partir delestadio B (Fig. 43).Las secuencias de las tres FaAras aisladas en este trabajo tuvieron homología desecuencia con α-L-aras descritas en otras especies. Dos de las α-L-aras putativas (FaAra1 yFaAra2) al ser traducidas resultaron en proteínas probablemente funcionales. En cambio,FaAra3 contiene un codón de terminación que provocaría la síntesis de una proteína máspequeña. Tanto en la secuencia proteica predicha para FaAra1 como para FaAra2 se halló unmódulo de unión a carbohidratos (CBD) y un dominio C-terminal típico de esta familia dehidrolasas. La presencia del codón de terminación en FaAra3 provocaría la pérdida de esteúltimo dominio característico de α-L-aras en la proteína madura pero la conservación delmódulo CBD. En este grupo de enzimas se ha propuesto la intervención de dos residuos Glu97

RESULTADOS Y DISCUSIÓNSECCIÓN C: α‐L‐arabinofuranosidasa: genes y actividad enzimáticaen la catálisis: un residuo ácido y otro nucleófilo (Fulton y Cobbett, 2003). Ambos residuosestarían presentes en esta proteína más pequeña (Figs. 39 y 40), por lo que es probable queFaAra3 también codifique para una enzima funcional.Las masas moleculares estimadas para FaAra1 y FaAra2, de acuerdo al análisispredictivo de las secuencias de ADNc, fueron de aproximadamente 70 kDa, mientras que laproteína madura FaAra3 tendría una masa de 51 kDa. En tomate se pudieron resolver tresisoformas entre 160 y 12 kDa utilizando cromatografía de exclusión molecular (Sozzi y col.,2002b). En nuestro caso, utilizando una metodología similar se encontró una distribuciónamplia con masas moleculares comprendidas entre 50 y 70 kDa con un máximo en 60 kDa,que no permitió la discriminación entre posibles isoenzimas de distinta masa molecular endicho rango. En otros sistemas, como α-L-ara en pera (Tateishi y col., 2005) y β-xilosidasaen frutilla (Bustamante y col., 2006), se han encontrado discrepancias entre la masamolecular predicha para la proteína madura a partir de la secuencia de ADNc y laefectivamente medida por SDS-PAGE o cromatografía de exclusión molecular. Presuntamentehabría un corte post-traduccional en la región C-terminal de la cadena polipeptídica queexplicaría las menores masas registradas para las proteínas activas (Lee y col., 2003). Aúnen el caso de que se descartara la funcionalidad de FaAra3, este fenómeno permitiríaexplicar la existencia de fracciones proteicas con actividad α-L-ara de menores masas que laspredichas a partir del ADNc.Las α-L-aras han sido incluidas en cinco familias de glicosil hidrolasas (GH; familias 3,43, 51, 54 y 62). Algunas α-L-aras tienen la particularidad de ser bifuncionales y actuartambién como β-xilosidasas por lo que habitualmente son incluidas en la familia 3, quetambién incluye β-xilosidasas sin actividad α-L-ara. En nuestro caso, las tres FaAras seagruparon junto con otras α-L-aras pertenecientes a la familia GH 51, que no incluye α-Larasbifuncionales. El patrón de expresión de los genes agrupados dentro de la familia de lasGH 51 no es el mismo si se comparan las tendencias halladas durante la maduración dedistintos frutos. Por ejemplo, LeARF1 de tomate se expresa más intensamente durante eldesarrollo y hasta la formación del fruto verde maduro. Desde ese estadio en adelante, laexpresión desciende marcadamente y es muy baja durante toda la maduración (Itai y col.,2003). Por el contrario, en pera china y europea se detectaron bajos niveles de transcriptosde PcARF1 en frutos inmaduros, pero la acumulación de los mismos se incrementó durantela maduración en ambos frutos (Mwaniki y col., 2007).98

CONSIDERACIONES FINALES99

CONSIDERACIONES FINALESLos frutos blandos, dentro de los que se incluye a la frutilla, son proclives a tener unavida poscosecha reducida. Este fenómeno es consecuencia principalmente de la pérdida defirmeza característica de estos frutos. El ablandamiento, si bien es una propiedad que seduceal consumidor, es la causa de grandes pérdidas económicas. Como se mencionóanteriormente, dicha pérdida de firmeza está estrechamente ligada a las modificaciones quesufre la pared celular durante la maduración. A su vez, este desmantelamiento de la paredtorna a los frutos más vulnerables al ataque de patógenos, lo cual acota aún más su vidaposcosecha. De este modo, una mayor comprensión de las reacciones y enzimasinvolucradas en la reestructuración de la pared celular y en el ablandamiento del fruto es,particularmente en frutilla, de gran relevancia por sus posibles implicancias en la selecciónde cultivares y de estrategias de manejo poscosecha.Dentro de las variedades comerciales de frutilla se pueden hallar cultivares quepresenten patrones altamente contrastantes de ablandamiento. Esta característica fueutilizada como estrategia para detectar diferencias en el metabolismo de la pared celularentre cultivares que pudieran explicar las distintas tasas de ablandamiento. Con tal fin, seestudiaron: la variación en el contenido y composición de los distintos componentes de lapared celular, los cambios en los niveles de las actividades de enzimas involucradas en lamodificación de la misma y particularmente dentro de éstas, el clonado y análisis de laexpresión de α-L-arabinofuranosidasas.La pared celular le otorga rigidez a los tejidos vegetales y, en consecuencia,contribuye a la firmeza de los frutos. Sin embargo, el análisis de las distintas variedades defrutillas permitió comprobar que la cantidad de pared celular que contiene un fruto en ciertoestadio de maduración no es el único factor que determina la firmeza del mismo. Lacomposición y grado de polimerización de sus moléculas componentes es también relevante.El estudio en particular de estas fracciones determinó que las fracciones de hemicelulosas ycelulosa tendrían una incidencia menor en la determinación de la firmeza en frutilla. En elcaso de las primeras, su contenido fue bajo respecto a las otras fracciones, no fue posibleestablecer una correlación entre la firmeza de cada cultivar y la cantidad de hemicelulosas, yno se detectaron cambios en el grado de depolimerización de estas fracciones. Similarmente,no pudo relacionarse el contenido de celulosa con las diferencias de firmeza observadasentre cultivares.Por el contrario, las mayores diferencias entre variedades se hallaron en lasfracciones de pectinas, las cuales, a su vez, se pudieron correlacionar con las variaciones defirmeza de los frutos correspondientes. En el cultivar más blando se observó una100

CONSIDERACIONES FINALESsolubilización de pectinas más temprana y un descenso del contenido de pectinas solubles enagua hacia el final de la maduración; hecho que podría vincularse a la depolimerizaciónobservada en la fracción PSA de este cultivar. El contenido de PSE fue el menor comparadocon el de las otras dos fracciones de pectinas y dicho contenido no pudo relacionarse con lafirmeza. Finalmente, la fracción de pectinas covalentemente unidas (PSH) guardó unaestrecha relación con la firmeza. Se detectó un menor contenido de esta fracción y un mayorgrado de depolimerización de la misma a lo largo de la maduración en la variedad menosfirme.Del análisis de la actividad in vitro de las enzimas de degradación de pared celular sedesprende que los niveles de actividad de todas las enzimas ensayadas, excepto PME, esmayor en frutos provenientes del cultivar más blando. Esto sugiere que las diferencias defirmeza observadas en diferentes cultivares se originan probablemente en diferencias deactividad de un número considerable de enzimas, más que de una enzima en particular, quese expresan en estadios más tempranos o en mayor proporción durante la maduración en loscultivares blandos. Sin embargo, a pesar de los aumentos registrados en las actividades delas enzimas que actuarían sobre hemicelulosas, su acción no se vería reflejada por cambiosimportantes en el metabolismo correspondiente. Por el contrario, de particular interés seríanaquellas enzimas que actúan sobre las pectinas (PME, PG, β-gal, β-xil y α-L-ara).Puntualmente, las diferencias en los niveles de actividad de PG se relacionaron con losdiferentes grados de depolimerización de pectinas observados en los tres cultivares,otorgando a esta enzima un probable rol central en la determinación de la firmeza del fruto.Otra característica relevante del metabolismo de pectinas es la pérdida de azúcaresneutros. En frutillas, se pudo relacionar este proceso a la solubilización de las mismasdurante la maduración. Asociada a dicho proceso, se encuentra un aumento de la actividadβ-gal y α-L-ara en todas las variedades, aunque este aumento fue más importante en elcultivar más blando. En el caso particular de α-L-ara, su actividad y expresión génica nohabían sido descritas hasta el momento en frutilla. Se aislaron tres clones que codifican paraα-L-aras putativas de frutilla (FaAra1, FaAra2 y FaAra3), cuya expresión fundamentalmenteestá restringida al receptáculo. El patrón de expresión de estos genes no permitió explicartotalmente el perfil de actividad α-L-ara hallada in vitro, lo cual sugiere la existenciamecanismos de regulación post transcripción o traducción, dificultades operativas en ladeterminación de la actividad y/o la presencia de otras isoformas no halladas en estetrabajo.101

CONSIDERACIONES FINALESLos estudios del metabolismo de pared celular de los frutos son altamente complejosdado que los mismos requieren el análisis de: los componentes de la pared y sus cambios,las posibles enzimas y proteínas que llevan a cabo dichos cambios y los genes que codificanpara dichas enzimas y proteínas. A esto debemos sumarle que los cambios que ocurren en lapared pueden ser (o son) distintos cuando se analizan diferentes especies. Finalmente, lacomplejidad puede ser aún mayor si diferentes variedades de una misma especie poseencomportamientos contrastantes. Numerosos estudios acerca del metabolismo de la pared enfrutos han conducido a generalizaciones a partir de investigaciones realizadas en una solavariedad. En este sentido, la primera conclusión general que se puede extraer del presentetrabajo es que, al menos en frutilla, existen diferencias notorias en los contenidos ycaracterísticas de los polímeros que componen la pared celular y en el perfil de expresión deenzimas y genes relacionados a la degradación de la misma, en cultivares con característicascontrastantes de firmeza. Por lo tanto, el tipo de cultivar utilizado en un estudio determinadoes un factor muy importante al momento de generar conclusiones respecto alablandamiento, y probablemente otros procesos, durante la maduración de este fruto. Detodas maneras, el análisis de distintas variedades en frutilla permitiría realizar correlacionesentre los diferentes metabolismos de pared y la firmeza de dichos cultivares. Este análisiscondujo a la segunda conclusión general del trabajo, la cual indica que, a diferencia de loque se venía sosteniendo, el metabolismo de pectinas tendría un rol importante en ladeterminación de la firmeza en frutilla, por lo cual las diferentes enzimas involucradas endicho proceso serían potenciales candidatas para su manipulación biotecnológica con finesde controlar el excesivo ablandamiento.102

BIBLIOGRAFÍA103

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PUBLICACIONES118

PUBLICACIONESLos resultados mostrados en la presente Tesis, han sido publicados de forma parcialen las siguientes revistas internacionales con referato y actas de congresos:A. Revistas internacionales con referato:- “Changes in cell wall composition of three Fragaria x ananassa cultivars with differentsoftening rate during ripening”Rosli HG, Civello PM, Martínez GAPlant Physiology and Biochemistry (2004) 42: 823-831.- “β-Xylosidase in strawberry fruit: Isolation of a full-length gene and analysis of itsexpression and enzymatic activity in cultivars with contrasting fruit firmness”Bustamante CA, Rosli HG, Civello PM, Martínez GAPlant Science (2006) 171: 497-504.- “Polygalacturonase activity and expression of related genes during ripening ofstrawberry cultivars with contrasting fruit firmness”Villarreal NM, Rosli HG, Martínez GA, Civello PMEn prensa Postharvest Biology and Technology desde 24 julio de 2007.- “Cloning of three α-L-arabinofuranosidase genes from strawberry and characterizationof their expression and enzymatic activity in cultivars with contrasting firmness”Rosli HG, Civello PM, Martínez GAEnviado para su publicación en Phytochemisty.-. “Cell wall hydrolases activities during ripening of strawberry fruit from cultivars withcontrasting firmness”Rosli HG, Civello PM, Martínez GAEn redacción.B. Actas de Congresos y Reuniones Científicas con referato:- “Análisis de la composición de la pared celular de variedades de frutillas con distintavelocidad de ablandamiento”Rosli HG, Civello PM, Martínez GAXI Reunión latinoamericana de Fisiología Vegetal. XXIV Reunión Argentina de FisiologíaVegetal. I Congreso Uruguayo de Fisiología Vegetal.Octubre 2002. Punta del Este, Uruguay.- “Estudio de la pared celular de variedades de frutillas con velocidades deablandamiento contrastantes”Rosli HG, Civello PM, Martínez GAJornadas de Fisiología Vegetal.Abril de 2003. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA, Buenos Aires.119

PUBLICACIONES- “Estudio comparativo de pectinas en variedades de frutillas con distinta velocidad deablandamiento”Rosli HG, Civello PM, Martínez GAI Jornadas de Biología y Tecnología de Postcosecha.Septiembre de 2003. CIDCA, UNLP, La Plata.- “Cell wall degrading enzymes during ripening of strawberry fruit”Rosli HG, Civello PM, Martínez GAXXXIX Reunión Nacional de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica yBiología Molecular (SAIB).Noviembre de 2003. Bariloche.- “Caracterización de la actividad β-xilosidasa durante la maduración de frutilla”Bustamante CA, Rosli H G, Civello PM, Martínez GAXXV Reunión Argentina de Fisiología Vegetal.Septiembre de 2004. Santa Rosa, La Pampa.- “Metabolismo de pectinas durante la maduración de frutillas”Rosli HG, Villarreal NM, Martínez GA, Civello PMXXV Reunión Argentina de Fisiología Vegetal.Septiembre de 2004. Santa Rosa, La Pampa.- “Differential expression of genes and enzymes involved in cell wall degradation duringripening of strawberry cultivars”Martínez GA, Rosli HG, Villarreal NM, Bustamante CA, Dotto MC, Civello PMPost Harvest Fruit, the path to success.Noviembre de 2004. Universidad de Talca, Chile.- “α-arabinofuranosidase in strawberry fruit”Rosli HG, Civello PM, Martínez GAXLI Reunión Nacional de la Sociedad Argentina de Investigación en Bioquímica yBiología Molecular (SAIB).Diciembre de 2005. Pinamar, Buenos Aires.- “Expresión de genes codificantes para α-L-arabinofuranosidasa (α-L-ara) durante lamaduración de frutilla”Rosli HG, Civello PM, Martínez GAXXVI Reunión de la Asociación Argentina de Fisiología Vegetal.Octubre de 2006. Chascomús, Buenos Aires.120