56353-56356-Pastorex Staph Plus.pdf - BIO-RAD

PASTOREX TM STAPH-PLUS1 x 50 pruebas 563565 x 50 pruebas 56353PRUEBA DE AGLUTINACIÓN CON PARTICULAS DE LATEXPARA LA IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1- INTERES CLINICOPASTOREX TM STAPH-PLUS es una prueba rápida de aglutinación enportaobjetos para la detección simultánea de la afinidad para elfibrinógeno ("clumping factor"), de la proteína A y de los polisacáridoscapsulares de Staphylococcus aureus.2- RESUMEN Y EXPLICACIÓNEl Staphylococcus aureus es uno de los patógenos más frecuentes en lasmuestras clínicas. Para un control adecuado de los pacientes, es muyimportante poder distinguir rápidamente a esta especie de otros estafilococosmenos virulentos. La prueba, que detecta la producción de coagulasalibre, permite la identificación de Staphylococcus aureus (11, 12). Sinembargo, esta prueba tarda entre 4 y 24 horas y las variaciones delplasma entre un lote y otro pueden afectar a la reacción (16).Se han desarrollo reactivos de aglutinación que permiten detectar alStaphylococcus aureus de forma más rápida y más fiable (3). Estosensayos de aglutinación se constituyen de partículas de látexsensibilizadas con fibrinógeno y IgG con el fin de detectar el "clumpingfactor" y la proteína A, que son características bioquímicas del S. aureus.Se ha observado, sin embargo, que algunas cepas de Staphylococcusaureus (esencialmente las resistentes a la meticilina) no se aglutinan conestas pruebas (15).Un estudio de estas cepas muestra que todas ellas poseen un polisacáridocapsular (4). Así, es probable que esta cápsula de polisacárido, queenvuelve a toda la bacteria en determinadas condiciones (aislamiento enfresco, condiciones de cultivo, clones bacterianos), enmascare a laproteína A y al factor de afinidad para el fibrinógeno y, de este modo,impida la aglutinación de las partículas de látex sensibilizadasúnicamente con fibrinógeno e IgG.3- PRINCIPIOEl reactivo PASTOREX TM STAPH PLUS se diseñó para permitir la detecciónsimultánea de los tres componentes siguientes :1) el factor de afinidad para el fibrinógeno, también conocido comocoagulasa unida o "clumping factor";2) la proteína A, que muestra afinidad por el fragmento cristalizable (Fc)de las gamaglobulinas (IgG) y20

5- CONSERVACIÓNUna vez se ha abierto, todos los reactivos son estables hasta la fecha decaducidad indicada en la etiqueta, si se conservan a una temperatura deentre 2 y 8 ºC y en ausencia de contaminación microbiana.Conservar el frasco que contiene el reactivo de látex en posición vertical.NO CONGELAR NUNCA EL REACTIVO DE LÁTEX.6- MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO• Asa de cultivo para la toma de muestras de las colonias bacterianas.• Bolsa o recipiente desinfectante o autoclavable para desechar lascartulinas usadas.7- PRECAUCIONESEl kit PASTOREX TM STAPH-PLUS está diseñado únicamente para utilizarseen pruebas de confirmación en cultivos y no debe utilizarse en muestrasclínicas frescas.La calidad de los resultados depende del cumplimiento estricto de labuena práctica de laboratorio.• Todos los reactivos y la muestra deben utilizarse a una temperatura deentre 18 y 30º C• No tocar las superficies de reacción de la cartulina con los dedos.• Agitar los frascos de látex antes de utilizarlos.• Limpie la punta del frasco cuentagotas del reactivo a fin de obtenergotas bien calibradas.• Mantenga la botella de reactivo en posición vertical para depositar lasgotas.• Utilizar los bastoncillos de plastico del kit para mezclar el látex y lasuspensión de bacterias. No utilizar bastoncillos de madera.• Cambie la varilla de mezclado para cada reacción.• Tirar todas las asas de cultivo desechables y las cartulinas deaglutinación utilizadas en un recipiente autoclavable o desinfectante.No reutilizar las cartulinas de aglutinación.INSTRUCCIONES DE SALUD Y SEGURIDADRespete siempre las técnicas y precauciones establecidas relativas a laprotección contra riesgos microbiológicos22

• Los reactivos de látex y los testigos contienen azida sódica comoconservante. Se ha descrito que la azida sódica forma azidas deplomo o cobre en la fontanería de los laboratorios. Estas azidas sonexplosivas. Para evitar su formación, debe hacerse pasar un granvolumen de agua por el desagüe si se desechan en la pila lassoluciones que contienen azida después de la inactivación.• Evitar el contacto con los ojos, la piel y las mucosas.8- PROCEDIMIENTO1) PREPARACIÓN DE LAS MUESTRASLas muestras utilizadas con este kit deben ser puras y frescas. Serecomiendan los siguientes medios de aislamiento o equivalentes :Medios de gelosa- Gelosa tripto-caseína-soja- Gelosa Columbia + sangre de cordero- Gelosa Columbia- Gelosa con sangre- Medio Chapmann- Medio Baird-Parker con aditivosRealizar una tinción de Gram y pruebas de catalasa con losmicroorganismos cultivados. Las colonias en las que se utilice el reactivoPASTOREX TM STAPH-PLUS deben ser cocos Gram positivos, positivos paracatalasa.2) AGLUTINACIÓN REACCIÓN• Homogeneizar completamente el reactivo de látex por agitación.Mezclar con un "Vortex" si necesario.• Depositar una gota del reactivo de látex de prueba en uno de loscírculos de la cartulina de aglutinación.• Depositar una gota de reactivo de látex de control negativo en otro círculo.• Con un asa de cultivo o un bastoncillo de plastico, tomar 1 a 3 colonias decocos Gram positivos, positivos para catalasa y emulsionarlas en una gotade látex durante 10 segundos.• Repetir el paso 4 con el látex de control negativo.23

• Homogeneizar girando lentamente la cartulina. La lectura debehacerse durante los 30 segundos que siguen el principio de losmovimientos de la cartulina.• Evaluar los resultados de acuerdo con los siguientes criterios ydesechar la cartulina en un recipiente desinfectante. No reutilizarla.9- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOSReacción positivaLas reacciones positivas se manifiestan por la formación de agregadossolamente con el reactivo de prueba antes de 30 segundos a partir delmomento en que se comienza a girar la cartulina. Los agregados sondetectables a simple vista en condiciones normales de iluminación. Losagregados de partículas de látex pueden ser de varios tamaños, con unfondo rosa más o menos lechoso.La aparición de una reacción lenta y debil puede significar una reaccióninespecifica.Reacción negativaEn el caso de una reacción negativa, no se producirán agregados y lasuspensión conservará un aspecto lechoso.Resultados no interpretablesLa aglutinación de la suspensión con el reactivo de control negativoconstituye un resultado no interpretable. En caso de que esto suceda, laidentificación deberá realizarse por otro método, como las pruebas paradetectar la presencia de coagulasa libre o de DNAsa termoestable.10- CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBAEvaluar el reactivo de látex cada vez que se utilice comprobando laausencia de aglutinación al depositar el látex en la cartulina. El látexdebe comprobarse periódicamente con cepas previamente identificadasde Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis. El reactivo delátex de prueba debe aglutinarse en presencia de Staphylococcus aureuspero no con Staphylococcus epidermidis.24

S. aureus resistentes a la meticilinaComo se indica en la tabla 1, 217 de 217 cultivos aislados MRSA biendefinidos se identificaron adecuadamente con el kit PASTOREX TM STAPH-PLUS. Se calculó una sensibilidad del 100% para los cultivos MRSA conel PASTOREX TM STAPH-PLUS, una vez excluido el resultado nointerpretable, que representó el 0,4% de las cepas analizadas.S. aureus sensibles a la meticilinaLos 222 cultivos MSSA produjeron un resultado positivo con elPASTOREX TM STAPH-PLUS, como se muestra en la tabla 1. La sensibilidadobtenida con esta población de MSSA fue del 100%.Otros estafilococosTabla 2Rendimiento de PASTOREX TM STAPH-PLUS con otras cepas deestafilococosTotalPositivosNegativosEspecificidadrelativaOtras cepasde estafilococos138113799,3%Se analizaron también 138 cultivos aislados de estafilococos distintos deS. aureus, como S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis,S. saprophyticus, S. schleiferi, S. lugdunensis y otras especies, con el kitPASTOREX TM STAPH-PLUS. Se obtuvieron resultados negativos con 137 delos 138 cultivos, como se indica en la tabla 2. El resultado discrepante seidentificaron como S. lugdunensis y también resultaron positivo con unaprueba alternativa rápida.26

13. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOStaphylococcus lugdunensis y Staphylococcus schleiferi poseen un factorde afinidad para el fibrinógeno (7, 9) y pueden reaccionar con laprueba de detección del "clumping factor", dependiendo de las cepas ydel medio de aislamiento. Algunas cepas de estafilococos, en especial elStaphylococcus saprophyticus, pueden producir la agregacióninespecífica de las partículas de látex, por lo que se recomienda utilizarel látex de control suministrado con el kit cada vez que se realice laprueba con microorganismos. Los Staphylococcus intermedius yStaphylococcus hyicus, descritos en la patología animal, pero muyraramente aislados en el hombre, pueden mostrar una reacción positivacon las pruebas convencionales de coagulasa y por lo tanto,teóricamente, también pueden reaccionar con las pruebas de deteccióndel factor de afinidad para el fibrinógeno.Debe tenerse siempre en cuenta la posibilidad de que se produzcanreacciones cruzadas. Ciertos estreptococos poseen una proteína quemuestra afinidad por los fragmentos Fc de las inmunoglobulinas y, por lotanto, puede reaccionar con el látex. También se han descrito reaccionesinespecíficas de las técnicas de látex con varias especies, como Escherichiacoli y Candida albicans (17). Estas falsas reacciones positivas puedenevitarse si se realiza una tinción de Gram y una prueba de catalasa en lascolonias que se desea probar, antes de la prueba con látex.Si la cepa de Staphylococcus aureus aislada no produce el factor deafinidad para el fibrinógeno (clumping factor), la proteína A o lospolisacáridos capsulares contra los que se desarrollaron los anticuerposmonoclonales específicos, pueden producirse falsas reacciones negativas.Pueden producirse resultados falsos negativos con un inoculo insuficiente.

14- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES1. Boutonnier A., Nato F., Bouvet A., Lebrun L., Audurier A., Mazie J.C.,and Fournier J.M. Direct testing of blood cultures for detection of theserotype 5 and 8 capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus.J. Clin. Microbiol. 1989. 27: 989-993.2. Davies S. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: theevaluation of rapid agglutination methods, Br. J. Biomed. Sci., 1997,54:13-15.3.Esserts I., and Radebold K. Rapid and reliable identification ofStaphylococcus aureus by a latex agglutination test. J. Clin. Microbiol.1980. 641-643.4. Fournier J.M., Boutonnier A., and Bouvet A. Staphylococcus aureusstrains which are not identified by rapid agglutination methods are ofcapsular serotype 5. J. Clin. Microbiol. 1989. 27:1372-1374.5. Fournier J.M., Bouvet A., Boutonnier A., Audurier A., Goldstein F.,Pierre J., Bure A., Lebrun L., and Hochkeppel H.K. Predominance ofcapsular polysaccharide type 5 among oxacillin-resistantStaphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol. 1987. 25:1932-1934.6. Fournier J.M., Hannon K., Moreau M., Karakawa W.W., and VannW.F. Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcusaureus. Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 1987. 138:561-567.7. Freney J., Brun Y., Bes M., Meugnier H., Grimont F., Grimont P.A.D.,Nervi C., and Fleurette J. Staphylococcus lugdunensis sp. No. andStaphylococcus schleifer sp. Nov., two species form human clinicalspecimen. J. Clin. Microbiol. 1989. 38:2110-2111.8. Hochkeppel H.K., Braun D.G., Vischer W., Imm A., Sutter S., StaeubliU., Guggenheim R., Kaplan E.L., Boutonnier A., and Fournier J.M.Serotyping and electron microscopy studies of Staphylococcus aureusclinical isolates with monoclonal antibodies to capsular polysaccharidetypes 5 and 8. J. Clin. Microbiol. 1987. 25:526-530.9.Jean Pierre H., Darbas H., Jean-Roussenq A., and Boyer G.Pathogenicity in T cases of Staphylococcus schleiferi, a recentlydescribed species.10. Karakawa W.W., Fournier J.M., Vann W.F., Arbeit R., Schneerson,R.S. and Robbins. J.B. Method for the serological typing of thecapsular polysaccharides of Staphylococcus aureus. J. Clin. Microbiol.,1985, 22:445-447.17

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