PAP`s - Senasa

RESUMENEl presente Ensayo Interlaboratorio fue organizado por la Dirección deLaboratorios y Control Técnico perteneciente al Servicio Nacional de Sanidad yCalidad Agroalimentaria (SENASA, Argentina) en colaboración con la OficinaRegional de la FAO para América Latina y el Caribe, FAO/RLC. El objeto delmismo fue evaluar el estado actual de los laboratorios de la región en lo que serefiere al control de piensos por microscopía, en el marco de los programas deprevención de Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EET) y, teniendocomo referencia la legislación vigente en la Unión Europea.Participaron 13 laboratorios, de los cuales 10 pertenecen a los ServiciosOficiales y 3 a entidades privadas. Cada participante recibió cinco muestrasconformadas por diferentes matrices de origen vegetal y mineral, fortificadas conmaterias primas de origen animal como harina de carne y hueso y harina depescado.Tomando en consideración la heterogeneidad de las muestras preparadas,previo al envío de las mismas, fue realizado un estudio de homogeneidad paracada una de ellas.El ensayo mostró un 58 % de los laboratorios participantes con todos losresultados informados satisfactorios.En el resumen total, fueron informados un 90 % de resultadossatisfactorios para la identificación de fragmentos óseos terrestres y un 85 % parala identificación de fragmentos óseos de pescado.2 de 14

INTRODUCCIÓNLa Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) es una enfermedad mortalque afecta el sistema nervioso central de los bovinos adultos. Es aceptadomundialmente que el agente causal es una proteína infecciosa o prión,altamente resistente a la acción de distintos agentes físicos y químicos.Esta enfermedad reconocida por primera vez en Gran Bretaña en 1986 yasociada luego a la nueva variante de Creutzfeldt-Jakob (vCJD) en humanosha causado preocupación en muchos países, quienes han adoptado medidassanitarias con el objeto de prevenir su ingreso y/o diseminación.Diversos estudios científicos llegaron a la conclusión que la infección delganado bovino se produce por consumo de alimento conteniendo harinas decarne y hueso (HCH) contaminadas, derivando este hallazgo en la prohibiciónde alimentar el ganado con proteínas animales.En la actualidad, los programas de prevención y control se encuentranprincipalmente enfocados en prevenir el ingreso del agente tanto en lacadena de alimentación animal como humana. La metodología reconocidaoficialmente por Unión Europea para la identificación de componentes deorigen animal prohibidos (PAP´s) en piensos es la técnica de microscopía(Reglamento EC Nº 152/2009).La prohibición de utilización de proteínas de origen animal varía acordea la legislación establecida en cada país. En el presente estudio se evaluó lacapacidad de los laboratorios para detectar proteínas terrestres y/o depescado. Los resultados corresponden a un ensayo cualitativo Presencia oAusencia de componentes de origen animal.En este contexto, el presente ejercicio de intercomparación entrediversos Laboratorios permite mostrar el grado de avance de la región en laincorporación de esta técnica como herramienta para la prevención de laEEB.3 de 14

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS1. Material utilizado:· Materias primas de origen vegetal: Fueron utilizados afrechillo de trigo, sorgo,maíz pisingallo y girasol. Los mismos fueron suministrados, seleccionados ymolidos por el Departamento de Química y Micotoxinas de la CoordinaciónGeneral de Laboratorio Vegetal del Servicio Nacional de Sanidad y CalidadAgroalimentaria.· Materias primas de origen mineral: Fueron utilizados fosfato y sal gruesacomercial provenientes del stock de patrones del Departamento deEvaluación y Desarrollo de la Coordinación de Análisis de Productos yConexos, dependiente de la Coordinación General de Laboratorio Animal delmismo Organismo.· Materias primas de origen animal: Se utilizaron harina de carne y hueso45/50 y harina de pescado provenientes del stock de patrones delDepartamento de Evaluación y Desarrollo de la Coordinación de Análisis deProductos y Conexos, dependiente de la Coordinación General deLaboratorio Animal del mismo Organismo.2. Proceso de elaboración de las muestras:En la Figura 1 se observa el diagrama de preparación y rotulado de lasmuestras.Una primera matriz fue preparada utilizando materiales típicos presentesen los alimentos balanceados comerciales. Las materias primas utilizadas fuerontesteadas por microscopía para verificar ausencia de contaminación con PAP’s.A partir de dicha matriz se generaron dos submatrices. A una de ellas se leagregó sal comercial (A) y a la otra fosfatos (B).Las muestras finales (C, D y E) se prepararon siguiendo un proceso dedilución por agregados parciales de 50 g por vez de matriz sobre el total de laharina de carne y hueso 45/50 o harina de pescado utilizada en cada caso, conposterior mezclado y homogeneización manual en cada paso.Se prepararon un total de 23 muestras para cada tipo de muestra final(conformando los grupos A, B, C, D y E), rotuladas en forma consecutiva.4 de 14

Matriz generalPreparación por mezclado yhomogeneización de:· 2.5 kg maíz pisingallo· 2 kg sorgo· 1 kg afrechillo· 0.3 kg girasolMatriz APreparación por mezclado yhomogeneización de:· 3.4 kg matriz general· 0.1 kg sal gruesacomercialMatriz BPreparación por mezclado yhomogeneización de:· 2.4 kg matriz general· 0.05 kg fosfatoMuestra CUn kg de muestra al 1 %de harina de carne y hueso45/50 en matriz A.Muestra DUn kg de muestra al 1 %de harina de pescado enmatriz A.Muestra EUn kg de muestra al 0.5 %de harina de carne y hueso45/50 en matriz B.AMuestrasNº 1 a 23CMuestrasNº 70 a 92DMuestrasNº 93 a 115EMuestrasNº 24 a 46BMuestrasNº 47 a 69Figura 1: Diagrama de preparación y rotulado de las muestras3. Ensayo de homogeneidad:El estudio de homogeneidad fue realizado según el procedimiento basadoen la Norma ISO 13528 (2005). Para tal fin, un total de 10 muestras elegidasaleatoriamente de las 23 muestras envasadas para cada grupo de muestras (A,B, C, D y E) fueron analizadas por microscopía en el Laboratorio delDepartamento de Evaluación y Desarrollo de la Coordinación APAC del SENASA,obteniéndose los resultados detallados en la Tabla 1. Todas las muestraspreparadas a partir de las matrices A y B dieron resultados negativos. Lasmuestras fortificadas con 0.5% y 1% de harina de carne y hueso 45/50 dieron entodos los casos presencia de fragmentos óseos terrestres, mientras que en las5 de 14

muestras fortificadas con 1% de harina de pescado fueron observadosfragmentos óseos de pescado en cada una de ellas.Tabla 1: Resultados de los análisis realizados para el estudio dehomogeneidadGrupo demuestrasABCDEMuestras analizadas1-2-3-11-1314-15-18-19-2247-52-53-54-5861-62-63-66-6871-75-77-78-7984-85-86-88-8997-103-106-107-108109-111-113-114-11526-27-29-31-3237-42-44-45-46Partículas animalesTerrestresPescadoAusenciaAusenciaAusenciaAusenciaPresenciaAusenciaAusenciaPresenciaPresenciaAusencia4. Envío de las muestras:Un sobre con cinco frascos unívocamente identificados conteniendo cadauno aproximadamente 50 g de muestra, fue enviado a los laboratoriosparticipantes el 30 de junio de 2010. El Laboratorio 3 no retiró las muestrascorrespondientes.6 de 14

RESULTADOS1. Análisis de resultados:La fecha límite para el envío de los resultados fue el 31 de agosto de 2010.Todos los Laboratorios participantes que recibieron y/o retiraron las muestrasentregaron los resultados en tiempo y forma. En la Tabla 2 se detallan losresultados cualitativos informados por cada participante con su correspondienteevaluación.Según se observa en la Tabla 2, el 58 % de los laboratorios participantesinformaron todos los resultados satisfactorios (laboratorios 1, 6, 8, 10, 11 y 12). Ellaboratorio 7 sólo informa resultados para presencia o ausencia de componentesde origen animal terrestres, siendo satisfactorio para ese parámetro evaluado.Los resultados obtenidos para el total de muestras analizadas por loslaboratorios refleja un 90% de resultados satisfactorios en la identificación defragmentos óseos terrestres y un 85% para fragmentos óseos de pescado.En las muestras sin fortificar correspondientes a los grupos A y B seobservó un 92 % de resultados satisfactorios por ausencia de fragmentos óseosterrestres (el laboratorio 4 detectó presencia de fragmentos óseos en ambasmuestras) y un 86 % para la identificación de fragmentos óseos de pescado (ellaboratorio 4 identificó fragmentos óseos pesqueros en ambas muestras, mientrasque el laboratorio 9 sólo en la muestra B).En el caso de las muestras del grupo C (fortificadas con 1% de harina decarne y hueso 45/50), se observó un 92 % de resultados satisfactorios para laidentificación de fragmentos óseos terrestres (el laboratorio 5 informa ausencia delos mismos) y un 86 % para fragmentos óseos de pescado (los laboratorios 4 y 13informan presencia de partículas animales de pescado).Las muestras del grupo E (fortificadas con 0.5% de harina de carne yhueso 45/50) mostraron un 83 y 82 % de resultados satisfactorios, para el casode identificación de fragmentos terrestres y de pescado respectivamente (loslaboratorios 5 y 9 no detectaron partículas terrestres y los laboratorios 4 y 13detectaron partículas de origen pesquero).Por último, las muestras fortificadas con 1% de harina de pescado (GrupoD) mostraron un 92 % de resultados satisfactorios por ausencia de fragmentosóseos terrestres y un 91 % de resultados satisfactorios por presencia defragmentos de pescado ( el laboratorio 4 informó presencia de fragmentos óseosterrestres mientras que el laboratorio 2 informó ausencia de fragmentos óseos depescado).7 de 14

Tabla 2: Resultados informados y evaluación de los laboratorios participantesLaboratorio12MuestraGrupo de Partículas animales terrestres Partículas animales pescadomuestras Resultado Evaluación Resultado Evaluación8 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio34 E Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio48 B Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio87 C Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio100 D Ausencia Satisfactorio Presencia Satisfactorio21 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio36 E Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio67 B Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio92 C Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio93 D Ausencia Satisfactorio Ausencia No satisfactorio3 El Laboratorio no retiró las muestras para el Ensayo Interlaboratorio456789104 A Presencia No satisfactorio Presencia No satisfactorio25 E Presencia Satisfactorio Presencia No satisfactorio65 B Presencia No satisfactorio Presencia No satisfactorio91 C Presencia Satisfactorio Presencia No satisfactorio102 D Presencia No satisfactorio Presencia Satisfactorio7 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio43 E Ausencia No satisfactorio Ausencia Satisfactorio50 B Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio73 C Ausencia No satisfactorio Ausencia Satisfactorio105 D Ausencia Satisfactorio Presencia Satisfactorio23 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio38 E Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio57 B Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio82 C Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio95 D Ausencia Satisfactorio Presencia Satisfactorio12 A Ausencia Satisfactorio Sin resultados -----30 E Presencia Satisfactorio Sin resultados -----60 B Ausencia Satisfactorio Sin resultados -----80 C Presencia Satisfactorio Sin resultados -----101 D Ausencia Satisfactorio Sin resultados -----9 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio28 E Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio56 B Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio70 C Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio112 D Ausencia Satisfactorio Presencia Satisfactorio5 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio39 E Ausencia No satisfactorio Ausencia Satisfactorio64 B Ausencia Satisfactorio Presencia No satisfactorio74 C Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio99 D Ausencia Satisfactorio Presencia Satisfactorio17 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio24 E Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio51 B Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio72 C Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio110 D Ausencia Satisfactorio Presencia Satisfactorio8 de 14

Tabla 2 (continuación): Resultados informados y evaluación de los laboratoriosparticipantes11121310 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio35 E Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio59 B Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio83 C Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio104 D Ausencia Satisfactorio Presencia Satisfactorio6 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio41 E Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio55 B Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio76 C Presencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio94 D Ausencia Satisfactorio Presencia Satisfactorio16 A Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio33 E Presencia Satisfactorio Presencia No satisfactorio49 B Ausencia Satisfactorio Ausencia Satisfactorio90 C Presencia Satisfactorio Presencia No satisfactorio98 D Ausencia Satisfactorio Presencia Satisfactorio2. Análisis de datos adicionales:En las Tablas 3 y 4 se detallan los datos adicionales aportados por loslaboratorios.Cabe observar que el laboratorio 5 para la muestra de grupo C rotulada con elNº 73 informa ausencia de partículas animales terrestres (Tabla 2), sin embargoobserva más de 20 partículas de fragmentos óseos (Tabla 3).En relación al análisis de las metodologías utilizadas por los laboratoriosparticipantes, pueden realizarse las siguientes observaciones:· El cloroformo es utilizado como solvente de extracción por 10 de loslaboratorios participantes.· El Laboratorio 5 es el único que utiliza tetracloroetileno como solvente deextracción.· El laboratorio 9 utiliza tres solventes distintos, presentando valores bajos en elpeso del sedimento.· Los laboratorios 6, 7 y 9 informan seguir los lineamientos del Reglamento EC152/2009 sin modificaciones, sin embargo declaran la utilización decloroformo o mezcla de solventes como solvente de extracción.· Los laboratorios 7, 10, 11 y 13 utilizan más de 5 gramos de muestra pararealizar la extracción. De las evaluaciones obtenidas no parece observarse laexistencia de una correlación entre los resultados obtenidos y el peso demuestra utilizado.9 de 14

Laboratorio12Tabla 3: Datos adicionales informados por los laboratorios participantesMuestraGrupo demuestrasPeso de lamuestra (g)Peso delsedimento(g)Fragmentosóseos terrestresFragmentos óseosde pescadoOtras partículasorigen animal8 A 5.03 0.13 ninguno ninguno -----34 E 5.05 0.142 más de 20 ninguno -----48 B 5.05 0.102 ninguno ninguno -----87 C 5.03 0.116 más de 20 ninguno -----100 D 5.03 0.161 ninguno Más de 20dientes pescado,espinas21 A 5.00 0.256 ninguno ninguno -----36 E 5.02 0.206 5 a 20 ninguno -----67 B 5.03 0.171 ninguno ninguno -----92 C 5.10 0.243 más de 20 ninguno pelo (1)93 D 5.00 0.176 ninguno ninguno3 El Laboratorio no retiró las muestras para el Ensayo Interlaboratorio456789104 A 5.004 1.322 5 a 20 5 a 20 pelos, escama25 E 5.001 1.260 5 a 20 5 a 20 pelos, escama65 B 5.006 1.179 5 a 20 5 a 20 pelos, escama91 C 5.003 1.364 5 a 20 5 a 20 pelos, escama102 D 5.004 1.369 5 a 20 5 a 20 pelos, escama7 A 5 0.0923 ninguno ninguno Pelo43 E 5 0.1139 ninguno ninguno ninguno50 B 5 0.1718 ninguno ninguno escama73 C 5 0.214 más de 20 ninguno ninguna105 D 5 0.1329 ninguno 5 a 20 escamas23 A 5 0.184 ninguno ninguno -----38 E 5.01 0.114 más de 20 ninguno -----57 B 5 0.107 ninguno ninguno -----82 C 5 0.185 más de 20 ninguno -----95 D 5 0.133 ninguno más de 20 -----12 A 10.09 0.5 ninguno ----- -----30 E 10.03 0.327 más de 20 ----- -----60 B 10.06 0.218 ninguno ----- -----80 C 10.07 0.478 más de 20 ----- -----101 D 10.06 0.401 ninguno ----- -----9 A 5.01 0.194 ninguno ninguno -----28 E 5.02 0.217 más de 20 ninguno -----56 B 5.01 0.170 ninguno ninguno -----70 C 5.00 0.279 más de 20 ninguno -----112 D 5.00 0.297 ninguno menos de 5 escamas5 A 5 0 ninguno ninguno ninguno39 E 5 0.0082 ninguno ninguno carbohidratos (27)64 B 5 0.0562 ninguno 5 a 20 minerales (70)74 C 5 0.0031 más de 20 ninguno carbohidratos (11)99 D 5 0.0038 ninguno más de 20 ninguno17 A 10 0.367 ninguno ninguno ----- (1)24 E 10 0.261 más de 20 ninguno músculo (2)51 B 10 0.253 ninguno ninguno ----- (1)72 C 10 0.426 más de 20 ninguno músculo, pelo110 D 10 0.232 ninguno más de 20músculo,escama (1)(2)10 de 14

Laboratorio111213Tabla 3 (continuación): Datos adicionales informados por los laboratoriosparticipantesMuestraGrupo demuestrasPeso de lamuestra (g)Peso delsedimento(g)Fragmentosóseos terrestresFragmentos óseosde pescado(1) El laboratorio 10 informa plagamiento con ácaros. (2) El laboratorio 10 informa plagamiento con insectos.(3) El laboratorio 13 informa presencia de huevos de insectos.Otras partículasorigen animal10 A 10 0.383 ninguno ninguno -----35 E 10 0.397 más de 20 ninguno -----59 B 10 0.301 ninguno ninguno -----83 C 10 0.617 más de 20 ninguno -----104 D 10 0.381 ninguno más de 20 escamas6 A 5.0164 0.2308 ninguno ninguno -----41 E 5.0488 0.1633 5 a 20 ninguno -----55 B 5.0133 0.1769 ninguno ninguno -----76 C 5.0408 0.1754 menos de 5 ninguno -----94 D 5.0217 0.1223 ninguno 5 a 20 escamas16 A 15.4 0.36 ninguno ninguno -----33 E 14.75 0.34 más de 20 menos de 5 -----49 B 16.21 0.43 ninguno ninguno ----- (3)90 C 16.95 0.61 5 a 20 5 a 20 pelo98 D 15.8 0.5 ninguno más de 20 escama (3)Tabla 4: Métodos de análisis informados por los laboratorios participantesLaboratorio Método ValidadoAcreditado segúnISO 17025/2005Solvente de extracción utilizado1 EC Reglamento 152/2009 con modificaciones SI SI Cloroformo2 Propio SI SI Cloroformo3 El Laboratorio no retiró las muestras para el Ensayo Interlaboratorio4 EC Reglamento 152/2009 con modificaciones NO NO Cloroformo5 EC Reglamento 152/2009 NO NO tetracloroetileno6 EC Reglamento 152/2009 NO NO Cloroformo7 EC Reglamento 152/2009 SI NO Cloroformo8 EC Reglamento 152/2009 con modificaciones NO NO Cloroformo9 EC Reglamento 152/2009 NO NO Tetracloroetileno, etanol, acetona.10 EC Reglamento 152/2009 con modificaciones SI NO Cloroformo11 EC Reglamento 152/2009 con modificaciones SI NO Cloroformo12 EC Reglamento 152/2009 con modificaciones SI SI Cloroformo13 Propio SI NO Cloroformo11 de 14

CONCLUSIONESLa evaluación del presente ensayo, referido a la capacidad de loslaboratorios en la detección de proteínas animales prohibidas ha mostrado engeneral buenos resultados, considerando el alto número de países participantesde la región y los resultados obtenidos por los mismos.Este estudio tuvo dentro de sus propósitos evaluar el avance en laimplementación de la técnica de microscopía para detección de PAP´s en laregión (en seguimiento a las recomendaciones del Taller Regional, Costa Rica2009 – Proyecto FAO TCP / RLA / 3113 para la prevención de la EEB). Elensayo mostró un importante número de laboratorios participantes con todoslos resultados informados satisfactorios. De todas maneras, el 42% de losmismos no tiene aún la técnica validada y el 75% no tiene acreditado el ensayo.Es importante destacar que la mayoría de los laboratorios participan porprimera vez en un Ensayo Interlaboratorio para el análisis evaluado. Este hechoplantea la necesidad de dar continuidad a este tipo de intercomparaciones conel fin de que cada participante tenga la posibilidad de ser evaluado en superformance y para que los resultados obtenidos le sirvan en la búsqueda deuna mejora continua en el control analítico de piensos por microscopía.12 de 14

BIBLIOGRAFIA· Reglamento EC Nº 152/2009 del 27 de enero de 2009· Identificación de componentes de origen animal por microscopía – métodocualitativo, 2 – COA – ED – PCP Nº 040 v9, 01 de septiembre de 2009.· Norma ISO 13528:2005, Statistical methods for use in proficiency testing byinterlaboratory comparisons, 1º edición, 01 de septiembre de 2005.AGRADECIMIENTOS· Al Departamento de Química y Micotoxinas de la Coordinación General deLaboratorio Vegetal del Servicio Nacional de Sanidad y CalidadAgroalimentaria por el suministro de los patrones de origen vegetal.13 de 14

LABORATORIOS PARTICIPANTES· Argentina: Departamento Evaluación y Desarrollo, Coordinación APAC,DILAB, SENASA.· Argentina: Laboratorio Bioquímico Dres. Fueyo.· Argentina: Agro - Industrias Baires S.A.· Brasil: Laboratorio Nacional Agropecuario - LANAGRO –MG.· Chile: Laboratorio de Química Ambiental y Alimentaria - Departamento deLaboratorios, Servicio Agrícola y Ganadero, Ministerio Agricultura.· Costa Rica: Centro de Investigaciones en Nutrición animal.· Cuba: Centro Nacional de Higiene de los Alimentos, Instituto MedicinaVeterinaria.· Ecuador: Laboratorio de Análisis, Química y Microbiología de Alimentos yEpa.· Honduras: Laboratorio de Control de Calidad San José.· Panamá: Laboratorio De Diagnóstico e Investigación Dr. Gerardino Medina H.,Ministerio de Desarrollo Agropecuario.· Paraguay: Laboratorio Control Químico Trociuk & CIA AGISA, Paraguay.· Perú: Unidad del Centro de Diagnóstico de Sanidad del SENASA.· Uruguay: División de Laboratorios Veterinarios "Miguel C. Rubino"- SecciónPatología-Ministerio de Ganadería, Agricultura y Pesca.14 de 14