Revista de la Sociedad Española de Proteómica - Severo Ochoa ...

PROTEÓMICARevista de la Sociedad Española de Proteómicahttp://www.cbm.uam.es/seprot/ Número 6 – Diciembre 2010II Jornadas Bienales de Jóvenes Investigadores en ProteómicaCórdoba, 11 y 12 de febrero de 2010

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 2Sede social: Instituto de Biomedicina de Valencia, C.S J.C.c/. Jaime Roig, 11. 46010 ValenciaTel: 96 339 l778 - Fax 96 369 0800C.I.F.: G-97465629.Nº Registro Nacional de Asociaciones: 584180.http:/twww.cbm.uam.es/seprotJunta Directiva:Fernando J. CorralesPresidenteCIMA — Universidad de Navarra, Pamplonafjcorrales@unav.csFernando Vivanco.VicepresidenteUniversidad Complutense.Fundación Jiménez Díaz, Madridfvivanco@fjd.esPROTEÓMICARevista de la Sociedad Españolade ProteómicaManuel M. Sánchez del Pino.SecretarioCentro de Investigación Príncipe Felipe.Valenciamspino@cipf.esEliandre de Oliveira.TesoreraPlataforma de Proteómica, Parc Cientificde Barcelonaeoliveira@pcb.ub.catEDITORES RESPONSABI.ES:Jesús V. JorrínJesús VázquezNúmero 6, Diciembre 2010VocalesIgnacio Casal.CIB, CSIC. Madridicasal@cib.csic.esConcha Gil.Universidad Complutense de Madridconchagil@farm.ucm.esJuan Pablo Albar.CNB, UAM, CSIC, Madridjpalbar@cnb.csic.esJesús Jorrín.Universidad de Córdobabf1jonoj@uco.esJesús VázquezCBMSO, CSIC-UAM, Madridjvazquez@cbm.uam.esJuanjo Calvete.IBV, CSIC, Valenciajcalvete@ibv.csic.esCOMITÉ EDITORIAL:Juan Pablo AlbarJuan J. CalveteMontserrat CarrascalIgnacio CasalFernando CorralesÁngel GarcíaConcha GilAna María Maldonado AlconadaAntonio Martínez RuizLucía MonteolivaÁngela MorenoEliandre de OliveiraManuel Sánchez del PinoFernando VivancoÁngel García.Universidad de Santiago de Compostelaangel.garcia@usc.esLucia Monteoliva.Universidad Complutense de Madridluciamon@farm.ucm.esMontserrat Carrascal.IIBB, CSIC, IDIBAPS, Barcelonamontserrat.carrascal@gmail.comCORRESPONDENCIA EDITORIAL:Jesús V. Jorrín. Novo (Dpto. de Bioquímica y BiologíaMolecular, Universidad de Córdoba. Campus deRabanales. Ed. Severo Ochoa (C6). 14071 Córdoba.E-mail:bf1jonoj@uco.es)EDITA:SEPROT

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 3PROTEÓMICA. Revista de la Sociedad Española de ProteómicaEditada por: Sociedad Española de ProteómicaPeriodicidad: Semestral (dos números por año, enero-febrero y julio-septiembre).Contenidos: se publicarán artículos originales, comunicaciones breves, artículos de revisión, artículos de difusión,tutoriales, opiniones, notas, resumen de tesis doctorales, y comentarios sobre cualquier aspecto relacionado con laproteómica. Se priorizarán artículos originales sobre aspectos metodológicos o de aplicación al estudio de sistemasbiológicos. Incluye información sobre nuestra Sociedad, personas, grupos e instituciones que la componen.Idioma: será el castellano, aunque se admiten contribuciones en otras lenguas, preferentemente inglés.Distribución: España y Latinoamérica, aunque pretendemos que tenga un carácter internacional mediantela distribución a otros países. Se enviarán, sin coste alguno, a los socios de la SEProt, Unidades y Servicios.así como a instituciones y organizaciones públicas o privadas miembros de la sociedad o con actividadrelevante en el campo de la proteómica.Publicación: una versión "on-line" que aparecerá en la página web de la SEProt y de la Universidad de CórdobaEditores responsables: Jesús V. Jorrín Novo y Jesús VázquezComité editorial: Juan Pablo Albar, Juan J. Calvete, Montserrat Carrascal, Ignacio Casal, Fernando Corrales, ÁngelGarcía, Concha Gil, Ana María Maldonado Alconada, Antonio Martínez Ruiz, Lucia Monteoliva, Ángela Moreno,Eliandre de Oliveira. Manuel Sánchez del Pino y Fernando VivancoCorrespondencia Editorial:Jesús V. Jorrín NovoDpto. de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba Campus de Rabanales, Ed. Severo Ochoa (C6)14071 Córdoba E-mail:bf1jonoj@uco.esInstrucciones a los autores:http://www.cbm.uam.es/seprot/Envío de los manuscritos:Mediante correo electrónico (bfljonoj@uco.es).I.S.S.N.: 1888-0096Depósito Legal CO-1005-07Edita: SEPROT (Sociedad Española de Proteómica)www.cbm.uam.es/seprotDiseño ymaquetación: Joaquín González de Mingo (i62gomij@uco.es)Imagen dela portada: Virginia Sánchez Quiles (CIMA)

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 4INDICE DE CONTENIDOSEditorialJesús V. Jorrín Novo6Carta del PresidenteFernando Corrales7Noticias de la SEProtManuel Sánchez del Pino9ProteoRed se transforma en la plataforma en red de proteómica delInstituto de Salud Carlos III, ProteoRed-ISCIII.María Dolores Segura y Juan Pablo Albar11Las Becas SEProt: contribución de la SEProt a la formación de los jóvenesinvestigadores en proteómicaLucia Monteoliva16III Jornadas Bienales de Jóvenes Investigadores en ProteómicaÁngel García Alonso18II JORNADAS BIENALES DE JÓVENES INVESTIGADORES ENPROTEÓMICABalance de las II Jornadas Bienales de Jóvenes Investigadores enProteómica, Córdoba 2010Sira Echevarría Zomeño, Raquel González, Jesús Vázquez y Ana M.Maldonado Alconada20Sesión de bioinformáticaSalvador Martínez de Bartolomé, Pedro Navarro23Sesión de proteómica de biomarcadores y patologías humanasÁngel García, Cristina Ruiz26Sesión de modificaciones postraduccionalesAntonio Martínez-Ruiz, Marina Gay, Pablo Martínez-Acedo, MontserratCarrascal31

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 5Sesión de proteómica cuantitativaMiren J. Omaetxebarría, Eva Rodríguez Suárez35Sesión de proteómica microbiana y de parásitos, S.O.S., ¿nos podéisayudar?Aida Pitarch1, Antonio Marcilla, Ana Oleaga y Manuel J. Rodríguez Ortega40Sesión de proteómica vegetal y animalLuis Valledor y Federico Valverde51ARTÍCULOS ORIGINALES 57La membrana vitelina de embriones bovinos, un modelo experimental deinterés para estudios proteómicos. Análisis del perfil proteico medianteelectroforesis bidimensionalÁlvaro Carlos Galdos-Riveros, Ana Rita Toledo-Piza, Durvanei Augusto María,Ronaldo Zucatelli Mendonça, María Angélica Miglino57SAIDE: A Semi-Automated Interface for Hydrogen/Deuterium ExchangeMass SpectrometryMaría T. Villar, Danny E. Miller, Aron W. Fenton and Antonio Artigues63GRUPOS DE INVESTIGACIÓN 70Ciencia de la Carne y ProteómicaMiguel Ángel Sentandreu Vicente70TESIS DOCTORALES 73Caracterización de marcadores peptídicos específicos para la identificaciónde especies de langostinos de interés comercialIgnacio Ortea García73Instrucciones a los autores 75PoetómicaJesús Vázquez77

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 6EDITORIALProteómica: ¿sueño o pesadilla?La editorial de este número, como la de los anteriores, se escribe atendiendo a una fórmulaen el que figuran dos constantes (o tres): el del retraso en ver la luz (debería haber aparecido afinales del año pasado) y el de la angustia por el compromiso no cumplido (unamos el de la soledady el folio vacío). Lo que se concibió como un sueño, el de un proyecto muy ambicioso y prioritariopara la SEProt, se está convirtiendo en una utopía y, quizás una pesadilla para algunos. Es por elloque la SEProt, a través de su Junta Directiva, y sus asociados, debe replantearse el proyecto, y, másimportante, el grupo de personas responsables de hacerlo realidad. No es un proyecto de una ovarias personas, sino de un grupo. Yo, por mi parte, empiezo a pensar que haría mejor en contribuircon manuscritos que preocuparme única y exclusivamente de su edición, persecución a posiblesautores, búsqueda de financiación, etc…Este número se ha montado a base del excelente trabajo de los Jóvenes Investigadores enproteómica con contribuciones en las que se resume y discute el desarrollo de cada una de lassesiones de las pasadas II Jornadas. Gracias a todos ellos, y, en especial, a Ana Maldonado. Apartede las secciones generales con manuscritos de nuestro presidente, secretario, y algunos de losvocales, se incluyen dos artículos originales de grupos latinoamericanos, el primero sobre lamembrana vitelina de embriones bovinos, y el segundo sobre estudios de cambios de conformacióny dinámica de proteómica. Esperemos, en futuros números contar con más artículos de gruposlatinoamericanos; al fin y al cabo la difusión al continente hermano es uno de los motivos quejustifican la revista.Como siempre, muchas gracias a los que hacéis posible que a pesar de las dudas, sigamospensando que merece la pena, que la utopía nos acerca a lo excelente, aunque andemos aún lejos.Jesús V. Jorrín Novo

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 7CARTA DEL PRESIDENTEDe Córdoba a Segovia, pasando por EstorilComo bien sabéis, se acaba de celebrar el 4º Congreso de la EuPA en Estoril cuyaspresentaciones, grabadas en video, podréis consultar en breve desde la página web de la EuPA(http://www.eupa.org/). No es mi intención contaros los pormenores de los excelentes trabajospresentados, pero si quisiera dedicar unas líneas a comentar algunos aspectos que me han parecidode interés general. En primer lugar, el desarrollo de nuevos métodos bioinformáticos y la aplicaciónde otros ya conocidos en entornos como la genómica al análisis e interpretación de experimentos deproteómica a gran escala, así como su integración con otras fuentes de información como expresióngénica, metabolómica, interacción, etc. Muchas de las herramientas son de libre acceso, lo que abuen seguro contribuirá a su uso generalizado y, en consecuencia, dinamizará su perfeccionamiento.Estas aproximaciones sintéticas impulsan de manera muy significativa la generación de hipótesisfuncionales a partir de las colecciones de datos generadas. Sin embargo, es evidente que lashipótesis han de ser convertidas en tesis mediante experimentos de validación. En este sentido, esunánime la aceptación de la técnica denominada SRM (Selected Reaction Monitoring) comométodo relativamente sencillo y eficaz que permite la detección y cuantificación de un péptidomediante la monitorización de transiciones específicas. Su eficacia incluso en el contexto dematrices complejas como los fluidos biológicos, postulan a este método como un candidatoprometedor en la búsqueda de biomarcadores en el sentido amplio de la palabra. Es importantecomentar, por lo que pueda significar en un futuro próximo, que se adoptó una postura bastantecrítica hacia los estudios basados en la identificación de biomarcadores de potencial aplicación en elseguimiento, diagnóstico o tratamiento de enfermedades. La razón es la falta de experimentos quevaliden los rasgos que diferencian las limitadas series de individuos analizadas, algo que resultabastante lógico. En general, los experimentos son excelentes desde un punto de vista técnico, lavalidez de los postulados biomarcadores y, por lo tanto, su alcance en cuanto a la aplicación enclínica, depende del análisis de miles de muestras, proceso en el que podemos encontrarlimitaciones a dos niveles: disponer de un método que permita realizar los análisis masivos y elacceso a muestras debidamente recogidas, almacenadas y documentadas. En cuanto al método, elSRM emerge como una posible alternativa a los métodos clásicos basados en la inmunodetección dela proteína de interés. La disponibilidad de muestras depende en gran medida de la creación debiobancos altamente especializados que deberían promoverse a través de iniciativas de alcancenacional, como ya está ocurriendo en algunos países. En mi opinión, el conocimiento detallado delas bases moleculares de los procesos patogénicos mediante la combinación de modelosexperimentales de enfermedad, sistemas in vitro fácilmente manipulables, muestras humanas ymétodos de análisis tan eficaces como los disponibles hoy en día aportarán una información robustade la que emanarán de forma natural las aplicaciones biomédicas.Otro de los temas estrella, lejos de las sesiones canónicas, ha sido el recientemente lanzadoHuman Proteome Project, iniciativa que se hizo pública en el congreso de la HUPO celebrado elmes pasado en Sidney. El objetivo final es identificar y cuantificar al menos la especie proteicaproducto mayoritario de cada gen, en cada uno de los más de 230 tipos celulares distintos queconstituyen nuestro organismo. Es un trabajo de enormes proporciones que se plantea a diez añosvista y que realizarán equipos de investigación pluridisciplinares que elegirán su parcela de trabajo,básicamente el cromosoma en el que se trabajará de forma individual o consorciada paracaracterizar las proteínas codificadas por los genes que los integran. En una segunda fase seinvestigarán las alteraciones que cursan con la progresión de enfermedades. Se propone basar elanálisis en SRM y generar los datos en formatos que permitan su intercambio y una total

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 8integración. Los detalles se pueden consultar en la página web de la HUPO(http://www.hupo.org/research/hpp/). En Europa se están gestando algunas propuestas y quizásalgunos de nosotros queramos formar parte de esta interesante iniciativa.En cuanto a esta nuestra sociedad, dejamos atrás unas excelentes Jornadas de Córdoba, sobrelas tendréis puntual y detallada información en este número y nos aprestamos ya a una nuevaedición de nuestro congreso, la cuarta. En esta ocasión nos marchamos a Segovia donde a buenseguro volveremos a hacer historia y seremos recordados junto con obras tan memorables como elAcueducto, el Alcázar o la Catedral. Además de los aspectos mundanos que endulzan tales eventos,la calidad de la ciencia que en ellos se destila, es imán para propios y extraños, como indica elelenco de invitados que podéis consultar ya en la página web ya disponible(http://www.seprot2011.es). No es de extrañar tal éxito de convocatoria, porque el trabajo realizadodurante estos últimos años tanto a nivel individual como a través de iniciativas coordinadas (comoProteoRed o la propia SEProt) ha situado a la proteómica española a un excelente nivel. En otroorden de cosas, tenemos que felicitar a Juan Pablo Albar por su reciente elección como miembro dela Junta Directiva de la HUPO. Otra buena noticia, ha sido la elección de la candidatura de Madridpor la Junta Directiva de la EuPA como sede del congreso EuPA-HUPO que se celebrará en 2014.Nuestra candidatura fue seleccionada entre 4 excelentes propuestas que incluían a Estocolmo,Dublín y Moscú. Ahora sólo queda esperar que la HUPO de su aprobación; cabe la posibilidad deque se presente algún candidato adicional. Dadas las fechas, quiero recordaros que estamos cerca decerrar el plazo de la convocatoria de becas de diciembre. Os animo a emplearlas para ayudaros afinanciar la asistencia a cursos, estancias cortas en otros laboratorios y, eventualmente, paraasistencia a algún congreso, aunque las dos primeras actividades serán priorizadas por el comité deselección. Finalmente, quiero agradecer a Jesús Jorrín por su generoso esfuerzo que hace posibleque tengáis en la mano este nuevo número de la revista Proteómica. No dejéis de mandar vuestrasreflexiones, comentarios sobre trabajos que os hayan parecido interesantes, resúmenes de vuestrastesis y cualquier otra contribución que se os ocurra.Nos vemos en Segovia, donde si miráis al horizonte, hacia Mujer Muerta, en el fríoatardecer veréis, según cuenta la leyenda, como, surcando los cielos, se acercan los dos hermanos abesar a la madre que se sacrificó para evitar una guerra fratricida.Fernando Corrales

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 9NOTICIAS DE LA SEPROTTodos sabéis que en la página web de laSEProt (http://www.cbm.uam.es/seprot) sepuede encontrar información puntual del día adía de la Sociedad, incluidas noticias y anunciossobre cursos, congresos, ofertas del trabajo oconvocatorias de becas. Ahora simplementeresaltaremos algunos de los aspectos mássobresalientes y de mayor interés para laSociedad que se han tratado en las dosreuniones que la Junta Directiva (JD) ha tenidoeste año. La primera tuvo lugar en Córdoba el11 de febrero, durante las II Jornadas Bienales yla segunda en Madrid, el 30 de junio.Los congresos son, probablemente, elevento más importante dentro del calendario deuna sociedad y tenemos algunas noticias sobreeste tema. El 4º Congreso de la SEProt está yapróximo. Juan Pablo Albar, Concha Gil y elresto del comité organizador nos proponen unassesiones con mayor orientación metodológicaque en congresos anteriores, de acuerdo con eltema principal del congreso: New Trends inProteomics. El excelente programa científico asícomo su emplazamiento en el Parador deTurismo de Segovia hacen prever una granasistencia al congreso. Podéis encontrarinformación en la web de la SEProt(http://www2.cbm.uam.es/seprot/congresos/).Desde aquí agradecemos el esfuerzo de losorganizadores así como a las distintas entidadesque colaboran en este evento, sobre en estosdifíciles momentos.Este año tuvimos las II JornadasBienales de Proteómica en Córdoba que, comoquedó reflejado en el número 5 de Proteómica,fueron un éxito. En dichas jornadas se lanzó elguante para la organización de la próximaedición en 2012 y este fue recogido por CristinaRuiz-Romero y Ángel García. Su sólidapropuesta cuenta con el respaldo unánime de laJD y seguro que con el de todos los socios. Asípues, la sede de las III Jornadas deProteómica en 2012 será Santiago deCompostela. No sabemos si ese año será santo ono, lo que sí sabemos es que habrá unaperegrinación proteómica a Santiago. Por tanto,animamos a los más jóvenes a que vayanpreparando la mochila con trabajo eimaginación como en ediciones anteriores.Sin abandonar el tema de los congresos,este año la EuPA debe elegir la sede para elcongreso conjunto EuPA/HUPO de 2014. Enopinión de la JD se trata de un evento de lamáxima relevancia para la comunidadproteómica internacional cuya organizaciónsupondría el reconocimiento de la SEProt al másalto nivel. Por tanto, dispuestos a no perder laoportunidad, se decidió formalizar lacandidatura MADRID 2014 para competir conotras candidaturas como la de Dublín oEstocolmo. La propuesta está encabezada porConcha Gil como chairperson y Juan PabloAlbar, Juanjo Calvete y Fernando Corralescomo co-chairs. La elección se ha realizado enel 4º Congreso de la EuPA que se celebra enEstoril mientras se escriben estas líneas. ANDTHE WINNER IS… MADRID 2014!!! Ahorasólo falta que, como es de esperar, la HUPOacepte la propuesta de la EuPA para que seaoficial. Esta decisión de la EuPA, que nos debellenar de satisfacción a todos, supone un enormeespaldarazo a la labor desarrollada por la SEProtdesde sus inicios y el reconocimiento del buentrabajo realizado por las personas responsablesde la candidatura. Ahora hay que empezar atrabajar para que MADRID 2014 sea todo unéxito.El tema de las becas es recurrente en lasreuniones de la JD de la SEProt. Un importanteobjetivo de la Sociedad es la formación de lossocios más jóvenes. Por ello, el bajo número desolicitudes presentadas en las convocatorias seconsidera como un resultado negativo que ponede manifiesto la poca repercusión que tienen lasbecas entre los socios. Este año hubo unaconvocatoria extraordinaria para promover laasistencia al 4º Congreso de la EuPA de Estorilque tuvo una mejor respuesta. Esperemos queno se trate de un caso aislado y que se mantengaen futuras convocatorias. Aprovechamos parafelicitar a las personas que han obtenido ayudasy animar a los socios más jóvenes a que lassoliciten.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 10Las relaciones con otras organizacionestambién ocupan un puesto importante ennuestras actividades. Un asunto que la SEProtha seguido de cerca ha sido la situación deProteoRed, como no podía ser de otra maneraya que afecta a muchos socios. Como sabéis,ProteoRed fue una de las plataformastecnológicas creadas por Genoma España. Ladecisión de esta fundación de no seguirfinanciando las plataformas cogió por sorpresa alos integrantes de ProteoRed y, en general, atodo la sociedad proteómica. Tras el sustoinicial y gracias al trabajo del coordinador yotros miembros de ProteoRed, la historia hatenido un final feliz. A partir de junio de 2010ProteoRed pasó a ser financiada por el Institutode Salud Carlos III, con lo que la continuidad deesta plataforma parece estar asegurada.Esperemos que por muchos años.También se ha discutido en algunareunión sobre la buena acogida que estáteniendo Journal of Proteomics, la revistaoficial de la EuPA y por tanto también de laSEProt. Se preveía un índice de impacto inicialentre 3 y 4, que finalmente ha sido 3,851. Noestá nada mal para una revista recién llegada,sobre todo si tenemos en cuenta que Proteomics,sólidamente consolidada en el área, tiene uníndice de impacto de 4,426. No cabe duda deque Juanjo Calvete es uno de los máximosresponsables de estos buenos resultados.Aunque no está directamenterelacionado con los asuntos tratados en la JD,creo que debemos mencionar el nombramientode Juan Pablo Albar para ocupar un puesto en laJunta Directiva de la HUPO durante lospróximos tres años.Quedan otros temas en los que se estátrabajando como son la edición de unamonografía en castellano sobre proteómica o laparticipación de empresas en la JD, pero eso lodejaremos para otra ocasión. No nos gustaríaterminar sin agradecer el trabajo que realizaFUNDECOR, y en especial María TeresaMontero, al frente de la Secretaría Técnica. Subuena disposición y eficaz gestión contribuyende manera decisiva en la buena marcha yfuncionamiento de la Sociedad.Manuel Sánchez del Pino

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 11ProteoRed se transforma en la plataforma en red de proteómica del Instituto deSalud Carlos III, ProteoRed-ISCIII.María Dolores Segura y Juan Pablo AlbarProteoRed, Centro Nacional de Biotecnología-CSICBreve recorrido por la historia de ProteoRedEn el año 2005 comenzó la andadura deProteoRed, bajo el nombre acuñado por laFundación Genoma España de InstitutoNacional de Proteómica y con la financiacióndicha fundación. En el periodo comprendidoentre su puesta en marcha, en septiembre de2005, y el 31 de mayo de 2010, ProteoRedobtuvo una financiación global de 7,1 millonesde euros y consiguió cumplir con creces susobjetivos iniciales. Estos objetivos consistían encoordinar, integrar y desarrollar los servicios deProteómica ya existentes que pasaron a formarparte de la plataforma, apoyar el desarrollo de lainvestigación en Proteómica en España yproveer de servicios a la comunidadinvestigadora.Prueba de la consecución de susobjetivos es la calificación obtenida porProteoRed en la evaluación que llevó a cabo enjunio de 2008 un prestigioso panel internacionalde expertos. La evaluación que el tribunal hizode la actividad de ProteoRed fue―extremadamente positiva‖ y en el informe de lamisma se recoge una felicitación expresa a losintegrantes de ProteoRed por sus logros.ProteoRed ha sido además reconocida enimportantes foros internacionales, entre ellos laHUPO y la EUPA, como un ejemplo único decolaboración entre grupos de investigacióndiversos y de eficiencia en el aprovechamientode los limitados recursos técnicos y humanosdisponibles. También el informe final deProteoRed por parte de su Comité CientíficoAsesor, constituido por reconocidosprofesionales del campo de la proteómica, queha realizado un seguimiento de las actividadesde ProteoRed a lo largo del tiempo transcurridodesde su constitución, fue extremadamentepositivo. Dicho informe señala que la actividadde ProteoRed y la atmósfera de colaboracióncreada entre los servicios integrantes de laplataforma han contribuido de manera decisiva―al fortalecimiento de la investigaciónproteómica en España y a situar a España comoun participante importante en el campo de juegode la proteómica internacional‖.Sin embargo, y a pesar de que ningúnindicio hacía pensar que se iba a producir estasituación, el 20 de julio de 2009 la FundaciónGenoma España comunicó oficialmente alCoordinador General de ProteoRed la decisiónde que dicha Fundación pasaría a orientar susactividades a la promoción y transferencia detecnología y dejaría de financiar las cuatroplataformas tecnológicas que había financiado ygestionado hasta ese momento, a saber: elBanco Nacional de ADN (BancoADN), elCentro Nacional de Genotipado (CeGen), elInstituto Nacional de Bioinformática (INB) y elInstituto Nacional de Proteómica (ProteoRed).En la práctica, esto suponía que ProteoRedquedaría sin financiación a partir del 1 de juniode 2010.Una vez superada la sorpresa inicial, losmiembros de ProteoRed pusieron manos a laobra para intentar buscar una fuente alternativade financiación de sus actividades, en elconvencimiento de que estas actividadesrevertían en beneficio de la ciencia española engeneral y de la proteómica en particular. Paraello, se creó un ―Comité de Acción‖ formadopor el Coordinador General de ProteoRed yotros 6 miembros de la plataforma, para intentardar difusión a la situación de ProteoRed yconseguir apoyos para intentar impedir ladesaparición de la misma y que se diluyeran losrecursos y el esfuerzo invertidos en la creacióny puesta en marcha de la plataforma.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 12Fruto de los esfuerzos coordinados por elComité de Acción, se obtuvieron cartas deapoyo a ProteoRed procedentes de losDirectores, Rectores y Vicerrectores de todas lasinstituciones miembro de ProteoRed, así comode otros Centros de Investigación, SociedadesCientíficas, empresas y personalidadesespañoles; también se recogieron cartas deapoyo del Dr. Peter Roepstorff, en nombre delComité Científico Asesor de ProteoRed, y deimportantes personalidades del campo de laproteómica como el Dr. Samir Hanash, miembrodel HUPO Council que había formado parte delComité Evaluador de ProteoRed mencionadoanteriormente, el Dr. Henning Hermjakob, delEMBL-EBI, o el Dr. Garry Corthals, chair delComité de Educación de la EUPA. Asimismo,en septiembre de 2009 se publicaron artículosen La Vanguardia y el Diario Médico en los quese explicaba la actividad de ProteoRed y lasituación por la que estaba pasando. Más tarde,en enero de 2010, aparecería una carta enNature en la que también se hacía pública lasituación de ProteoRed. En este tiempo semantuvieron reuniones tanto con representantesde Genoma España como con representantes deotras instituciones, entre ellas el Instituto deSalud Carlos III.En diciembre de 2009 se convocó unareunión de representantes de todos los serviciosintegrantes de ProteoRed para informarles de lasituación y decidir el camino a seguir. Dichareunión tuvo lugar en el Parque Científico deBarcelona el 4 de diciembre de 2009. Laconclusión más importante de la misma fue elcompromiso de todos los miembros deProteoRed de mantener la estructura de grupoaún en ausencia de financiación, con unaactividad mínima que podría consistir, al menos,en la participación de los miembros en losexperimentos multicentro del ABRF,determinantes para el desarrollo yestandarización de protocolos de los serviciosde ProteoRed, uno de los puntos fuertes de laplataforma, además de una reunión anual paradiscutir los resultados. No obstante estecompromiso, la intención era seguir haciendo loposible para intentar mantener la estructura yactividades de ProteoRed en toda su extensión.Afortunadamente, en los últimos días dediciembre de 2009 el Coordinador General deProteoRed, Juan Pablo Albar, recibió unallamada del Dr. D. José Jerónimo Navas,Director del Instituto de Salud Carlos III(ISCIII), en la que se le comunicaba que dichainstitución pasaría a hacerse cargo de ProteoReda partir del 1 de junio de 2010.Comenzaba así una nueva etapa en latrayectoria de ProteoRed, que todos losmiembros afrontan con nuevos proyectos eilusiones renovadas. En esta nueva etapa elInstituto Nacional de Proteómica, ProteoRed,pasa a llamarse Plataforma en Red deProteómica Carlos III, ProteoRed-ISCIII, y sepretende acentuar la orientación biomédica desus actividades.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 13Situación actual.ProteoRed está constituida por 19servicios de Proteómica repartidos por todaEspaña y tiene una estructura nodal (Figura 1).El conjunto de los laboratorios deProteoRed conforma una plataforma de altatecnología capaz de responder a las cuestionesmás complejas de la proteómicaEn cuanto a su actividad, ProteoRed seestructura en siete grupos de trabajoconstituidos con el fin de alcanzar los objetivosde la plataforma. Estos objetivos consisten enFigura 1. Estructura geográfica de ProteoRed.coordinar, integrar y desarrollar los servicios deproteómica de la red para apoyar el desarrollode la investigación en proteómica en España,proveer de servicios a la comunidadinvestigadora y, al mismo tiempo, desarrollarnuevas aplicaciones tecnológicas.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 14Los siete grupos de trabajo son Grupo de trabajo 1: Desarrollotecnológico y estandarización deProtocolos. Dirigido por el Dr. AlbertoParadela del Centro Nacional deTecnología, CSIC.Grupo de trabajo 2: Recogida y manejode muestras. Dirigido por el Dr.Francesc Canals del Hospital Valld´Hebron. Grupo de trabajo 3: Soportebioinformático. Dirigido por el Dr. JuanPablo Albar del Centro Nacional deTecnología, CSIC.Grupo de trabajo 4: Organizaciónfuncional de los servicios de proteómicay coordinación de las escalas de precios.Dirigido por La Dra. Eliandre deOliveira, del Parque Científico deBarcelona. Grupo de trabajo 5: Educación,formación y difusión. Dirigido por laDra. Concha Gil, de la UniversidadComplutense de Madrid. Grupo de trabajo 6:Internacionalización. Dirigido por el Dr.José María Mato, del CIC bioGUNE. Grupo de trabajo 7: Proteómicabiomédica. Dirigido por el Dr. FranciscoJ. Blanco, del INIBIC-ComplejoHospitalario Universitario A Coruña.Como resultado de estas actividades,ProteoRed ha conseguido una gran visibilidadtanto nacional como internacional. Prueba deello es la asistencia a la última reunión delGrupo de Trabajo 2 de ProteoRed, que tuvolugar el pasado marzo en Salamanca, del Dr.Bruno Domon (Institute of Molecular SystemsBiology, ETH) y la Dra. Kathryn Lilley(Cambridge University). Como resultado de estaexperiencia Kathryn Lilley publicó un artículoen ABRF Communications (ABRFCommunications Volume 1, Issue 2, 17-18). Enel mismo número aparece un artículo titulado―ABRF in the heart of ProteoRed” (ABRFCommunications Volume 1, Issue 2, 25-26),articulo co-participado por varios miembros deProteoRed. Asimismo, el Coordinador Generalde ProteoRed ha sido invitado a dar una charlaen el próximo congreso de la ABRF en SanAntonio, Texas en la que expondrá losresultados obtenidos por todos los miembros deProteoRed y algunos grupos invitados en elSexto Experimento Multicentro de ProteoRed(PME-6). Experimento multicentro que en estaocasión trata de evaluar la robustez de los flujosde trabajo en los distintos laboratorios paraidentificar unas proteínas previamenteintroducidas ―spikes‖ en una matriz proteicacompleja con reporte de datos cumplimentandolos formularios MIAPE alojados en nuestraaplicación web: MIAPE Generator Toolhttp://www.proteored.org/PME6_Reporting.asp.Por otro lado y ahondando en la visibilidadexterior de ProteoRed cabría destacar la recienteelección del coordinador general de ProteoRedcomo miembro del Consejo de Dirección delHUPO Council para el periodo 2011-2013.Proyección de futuroLa Estrategia Nacional de Ciencia yTecnología (ENCYT), es el elemento deconsenso y vertebración de las políticas deciencia y tecnología de España, tanto nacionalescomo autonómicas. La ENCYT fija su horizontetemporal en de trabajo en 2015, periodo quecubre los dos próximos cuatrienios deprogramación del Plan Nacional (2008-2011 y2012-2015). Entre sus objetivos estratégicosmás importantes se sitúa la promoción de lasinfraestructuras científicas, estimulando lassinergias entre los diferentes sistemas regionalesy promoviendo la cohesión científica ytecnológica interterritorial en el conjunto delPlan Nacional.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 15Dentro del VI Plan Nacional, el objetivogeneral de la acción estratégica en salud (AES),radica en generar conocimiento para preservar lasalud y el bienestar de la ciudadanía, reforzandoe incrementando para ello la competitividad ycapacidad de I+D+I del Sistema Nacional deSalud (SNS) y de las empresas relacionadas conel sector.Una de las cinco líneas prioritarias de laAES es la investigación en tecnologíasmoleculares y celulares de aplicación a la saludhumana. En este ámbito, cobran especialrelevancia las plataformas de tecnologías―ómicas‖ (genómica, proteómica,bioinformática y bancos de material genético).Estas tecnologías permiten el avance de lainvestigación orientada al paciente mediante lageneración y análisis de los datos relacionadoscon las enfermedades más prevalentes. De estaforma, no solo aumenta el potencial detransferencia de tecnología a la práctica clínica,sino que también se favorece la generación denuevas hipótesis de investigación biomédicadesde la realidad asistencial.En su nueva etapa, la Plataforma en Redde Proteómica Carlos III (ProteoRed-ISCIII)pretende ajustar sus objetivos a los previstos enla Acción estratégica de Salud del Plan Nacionalde I+D+I, siendo su objetivo fundamentalofrecer servicios de proteómica que aportensoluciones a las necesidades que se planteen enel desarrollo y ejecución de proyectos quetienen un enfoque genómico y proteómico.En este contexto, la Plataforma en Redde Proteómica Carlos IIII, ProteoRed-ISCIII,pretende potenciar su orientación biomédica yen concreto se propone:Generar el conocimiento en proteómicanecesario para que los centros localespuedan funcionar con las mayoresgarantías.Formar especialistas en proteómica. Colaborar y dar soporte técnicocientíficoa los proyectos de Biomedicinay Ciencias de la Salud a nivel estatal,comportándose como una plataforma deservicios.Fomentar el desarrollo y competitividadde las empresas con actividad en estesector en España.Internacionalizar todas sus actividades.La realización de las funciones descritastendrá como objetivo la consolidación de laPlataforma en Red de Proteómica Carlos III(ProteoRed-ISCIII), como instrumento quegenerará y aplicará soluciones en el ámbito de laproteómica a las necesidades que se plantean enel desarrollo y ejecución de proyectos deBiomedicina y Ciencias de la Salud.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 16Las Becas SEProt: contribución de la SEProt a la formación de los jóvenesinvestigadores en proteómicaLucia MonteolivaDpto. Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid. VocalResponsable de becasLas Becas SEProt son una de lasprincipales actividades de la Sociedad Españolade Proteómica. Estas becas están concebidascomo una contribución para la formación al másalto nivel de los jóvenes investigadoresespañoles en el área de la Proteómica,financiado la realización de actividades quetengan ese objetivo de formación. La concesiónde estas becas desde el año 2007, ha posibilitadola asistencia de estudiantes/investigadores en elárea de la Proteómica a distintos cursosinternacionales de especialización en aspectosconcretos de la tecnología Proteómica, así comoa Congresos Internacionales. Las actividadesfinanciadas, así como el número de becassolicitadas y concedidas durante el año 2009 yel 2010 hasta la fecha se muestran en la tabla.A pesar del gran beneficio supone paralos socios más jóvenes el disfrute de estas becas,en las primeras convocatorias se recibieron unnúmeros muy bajo de solicitudes. Esto podríaestar motivado por un problema dedesconocimiento entre los investigadores o porotro tipo de cuestiones más prácticas, como quealgunos de los posibles peticionarios nocumplieran los requisitos exigidos. Para intentarpaliar esta situación se han realizado distintasactuaciones. Por una parte, se ha realizado unalabor de difusión que parece que empieza a darsus frutos; ya que, como puede observarse en latabla, en este año 2010 el número de solicitudesha aumentado notablemente. Además, porprimera vez en las convocatorias de este año,ese número ha sido mayor el que número debecas que podían ser concedidas de acuerdo alpresupuesto. Por otra parte, también se hanrevisado los requisitos exigidos para solicitar lasbecas en posteriores convocatorias, de modoque sin perder el espíritu de conceder las becas acandidatos jóvenes, estudiantes y socios de laSEProt, no fuesen demasiado restrictivos. Así,en la nueva convocatoria de becas que sepublicará para la convocatoria de diciembre de2010 se han modificado algunos puntos: Con respecto a la juventud, en lasanteriores convocatorias se restringía laedad de los solicitantes, exigiendo unafecha de nacimiento posterior al 31 deDiciembre de 1978. Debido a que cadadía resulta más difícil establecer unaedad hasta la que un persona puedeconsiderarse joven, el límite de edad seha eliminado. Sin embargo, dentro de losCriterios de Evaluación de lassolicitudes, se establece que se priorizaráa los socios jóvenes estudiantes. Con respecto a la antigüedad en laSociedad, en las anteriores convocatoriasse exigía como requisito ser miembro dela SEProt con un mínimo de 1 año deantigüedad. Debido a qué este requisitopodría excluir a estudiantes de doctoradode primer año, también se ha eliminadode la nueva convocatoria. Por supuestoque se mantiene como requisito sermiembro de la SEProt y hallarse alcorriente de la cuota y además, dentro delos Criterios de Evaluación de lassolicitudes, se establece que se priorizarála antigüedad como socio. Respecto a las actividades susceptiblesde financiación en la Convocatoriasordinarias, no se han introducidocambios sustanciales. Se priorizan lassolicitudes que impliquen la realizaciónde estancias de investigación con finesformativos o la participación en cursos oworkshops de especialización enProteómica. La asistencia a congresos yreuniones científicas tiene consideraciónsecundaria.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 17Con estas modificaciones se pretendeaumentar el número de socios que puedabeneficiarse de las ventajas de obtener una beca.Como se acaba de comentar, dentro delas actividades susceptibles de financiación quese priorizan se encuentran las de estancias deinvestigación o la participación en cursos oworkshops de especialización en Proteómica.Sin embargo, hay que resaltar que como seobserva en la tabla, la mayoría de las becas sesolicitan para asistir a distintos cursosinternacionales. Por el momento, no se hasolicitado ninguna beca para la realización deuna estancia de investigación. Con respecto a laasistencia a congresos, en las convocatoriasordinarias se considera en segundo lugar. Noobstante, en julio de 2010 de maneraextraordinaria se han convocado y concedidodos becas para la asistencia al cuarto Congresode la Sociedad Europea de Proteómica, ―4thEuPA Meeting‖, que tuvo lugar en Estoril enOctubre de 2010. Dicha convocatoria tuvo granaceptación, a pesar del corto plazo depresentación de solicitudes, debido a laoportunidad que representaba para losestudiantes de conocer a grandes científicosinternacionales que trabajan en Proteómica, asícomo las novedades tecnológicas del área. Es dedestacar que mediante con la concesión de todaslas becas de la SEProt, esta Sociedad científicaestá contribuyendo de manera muy notable a laelevada formación de los futuros científicosespañoles en el campo Proteómica.Para concluir, simplemente recordar quetoda la información relativa a las becas seencuentra disponible en la página web de laSociedad Española de Proteómica(http:www.cbm.uam.es/seprot/becas/becas.htm).ConvocatoriaSolicitudesBecasconcedidasActividades financiadasIV ConvocatoriaJunio 20094 4 ―3rd European Summer School in Proteomic basics‖V ConvocatoriaDiciembre 20093 2―Advanced Proteomics Data Analysis Course‖―Bioinformatic Tools for Quantitative Proteomics‖VI ConvocatoriaJunio 20106 5―4th European Summer School in Proteomic basics‖―MaxQuant Summer School 2010‖―EuPA-Course Day and 4 th EUPA Meeting‖Convocatoriaextraordinaria9 2 ―4th EuPA Meeting‖

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 18III Jornadas Bienales de Jóvenes Investigadores en ProteómicaÁngel García AlonsoDepartamento de Farmacología, Universidade de de Santiago de CompostelaQueridos colegas y amigos:Es para mí un placer y unaresponsabilidad el llevar a cabo la organizaciónde las III Jornadas Bienales, que tendrán lugaren Santiago de Compostela en febrero de 2012.Como habréis podido comprobar en el balancellevado a cabo por Ana Maldonado y JesúsVázquez, las Jornadas de Córdoba han sido todoun éxito de participación, con contribucionescientíficas más que relevantes, y han dejado portanto el listón muy alto.Tras la experiencia de Sitges y Córdoba,pienso que es el momento de consolidar lafilosofía que debe regir las Jornadas. Esimportante resaltar que no se trata de que seancomo otro congreso más; para eso ya está elcongreso de nuestra sociedad. Se trata de quesean un foro de discusión para jóvenesinvestigadores, que dé lugar a debatesenriquecedores que sirvan para aclarar dudas yfomentar interacciones. Por tanto, laparticipación de todos los asistentes es clave.Obviamente es un reto cumplir estos objetivosen día y medio con un número de participantescercano a 200 como sucedió en Córdoba. Sinembargo, Ana Maldonado ha demostrado que esposible resolver bien ese reto organizativo y hamarcado el camino a seguir. Pienso que elorganizar diferentes sesiones dando libertad alos coordinadores de las mismas ha sido unabuena idea que importaremos en las IIIJornadas. El objetivo en cualquier caso será quecada sesión dedique entre un cuarto y un terciode su tiempo a debate y discusión entre losponentes, con la participación de los demásasistentes. Ello significará que el éxito de cadasesión recaerá en gran medida en el trabajo delos coordinadores que deberán seleccionar lasmejores comunicaciones y presentar cuestionesque motiven debate y discusión.Así mismo, los coordinadores de cadasesión harán balance de las contribucionescientíficas a la misma, resaltando aquellostrabajos más relevantes presentados en forma depóster y que por cuestiones de tiempo no sehayan podido presentar de forma oral.Considero importante evitar que las sesionesqueden muy densas, por tanto el número decomunicaciones orales debe ser acorde eltiempo disponible, aspecto que funcionó muybien en Córdoba.Por supuesto, y aunque aún falta más deun año para las Jornadas, confío en que las casascomerciales sigan brindando su apoyo a esteevento. Es mi intención que tengan laposibilidad de interaccionar al máximo con losparticipantes.Aunque el Comité Organizador estarácentrado en Santiago, también cuento para estemenester con Cristina Ruiz, del HospitalUniversitario de A Coruña. Esperamossinceramente estar a la altura de lascircunstancias y que paséis un par de díasinolvidables en Santiago, ciudad acogedora ycon amplia tradición en este tipo de eventos.Aunque llueva, y en febrero no sería deextrañar, la piedra de Santiago brilla de maneraespecial bajo la lluvia convirtiendo el caminarpor su casco viejo en una experiencia única.Además, las Jornadas se celebrarán en laFacultad de Medicina, a un paso de la Praza doObradoiro, con lo que será aun más fácildisfrutar de los encantos de esta ciudadPatrimonio de la Humanidad.Me despido ya animándoos a quevengáis a Santiago de Compostela en 2012 y ensu día participéis bien como coordinadores desesiones o enviando vuestros trabajos. Juntosconseguiremos que las Jornadas Bienalescontinúen por la senda del éxito.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 19II JORNADAS BIENALES DE JÓVENESINVESTIGADORES EN PROTEÓMICALa organización de las Jornadas y la edición de este número especial han corrido acargo de los siguientes investigadores:Ana María Maldonado Alconada (Universidad de Córdoba)Sira Echevarría Zomeño (Universidad de Córdoba)Raquel González (Universidad de Córdoba)Jesús Vázquez (CBM-SO, UAM, Madrid)Montse Carrascal (CSIC-UAB, Barcelona)Ángel García (Universidad de Santiago de Compostela)Marina Gay (CSIC-UAB, Barcelona)Antonio Marcilla (Universidad de Valencia)Salvador Martínez (CNB-CSIC)Pablo Martínez-Acedo (CBM-SO-UAM )Antonio Martínez-Ruiz (Hospital de La Princesa, Madrid)Ángela Moreno (IAS-CSIC, Córdoba)Pedro Navarro (CBM-SO-UAM)Ana Oleaga (CSIC, Salamanca)Miren J. Omaetxebarría (Universidad País Vasco)Aida Pitarch (Universidad Complutense Madrid)Manuel Rodríguez (Universidad de Córdoba)Eva Rodríguez-Suarez (CIC-Biogune)Cristina Ruíz (INIBIC — A Coruña)Luis Valledor (Universidad de Oviedo)Federico Valverde (CSIC Sevilla)

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 20Balance de las II Jornadas Bienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica,Córdoba 20101 Sira Echevarría Zomeño, 1 Raquel González, 2 Jesús Vázquez y 1 Ana M. Maldonado Alconada1Grupo de Proteómica y Bioquímica Agroforestal, Departamento de Bioquímica y BiologiaMolecular, Universidad de Córdoba2CBMSO, CSIC-UAM, MadridDurante los días 11 y 12 de febrero deeste año celebramos en Córdoba, en el edificiodel Rectorado de la Universidad, las II JornadasBienales de Jóvenes Investigadores enProteómica. Desde el primer momento hubo ungran interés en participar de forma activa enestas Jornadas. A esto, sin duda, colaboróademás del éxito de la anterior convocatoria, losbuenos recuerdos que guardan muchos de lossocios de otros eventos organizadospreviamente en Córdoba, y la estrecha relaciónde esta ciudad con la SEProt y la Proteómica.Sin exagerar, nos habremos intercambiadocientos de correos analizando diversaspropuestas sobre las posibles sesionescientíficas y la forma en las que se podían llevara cabo para facilitar la máxima participación yfomentar el debate y la discusión. A medida quese acercaba la fecha de la celebración de lasJornadas, la euforia por el éxito inicial de laconvocatoria dio paso a un ―periodo de pánico‖debido a que el número de participantesinscritos siguió aumentando hasta el último díaen que estuvo abierto el plazo de inscripción.Nuestra preocupación respondía en primer lugara las cuestiones logísticas relacionadas con lasinstalaciones de que disponíamos y la dificultadde cuadrar las previsiones que habíamos hechoinicialmente. A este respecto queremosagradecer de nuevo a la Universidad deCórdoba, no sólo su cuantiosa ayuda económicay el hecho de habernos cedido el edificio delrectorado, sino también la profesionalidad y laexcelente disposición del personal encargado delos medios audiovisuales, la conserjería y laseguridad. En segundo lugar, otro quebradero decabeza fue el intento de evitar que el elevadonúmero de participantes impidiera que lasJornadas se desarrollasen de acuerdo al formatode organización previsto. Pues, ¿cómo darcabida en tan sólo día y medio al gran númerode comunicaciones recibidas sin renunciar a laesencia de las Jornadas? Los coordinadores delas sesiones científicas tuvieron que hacer―encaje de bolillos‖ para que se vieranreflejados en sus respectivas sesiones losprincipales temas de interés, las novedades, losretos y las limitaciones técnicas en sus áreasrespectivas y el mayor número de trabajosposibles. Gracias a su iniciativa, y a la intensalabor realizada antes y durante la celebración delas Jornadas se pudo conservar el espíritupráctico, dinámico y participativo con el que sehabían enfocado estas Jornadas.El número final de asistentes fue de 199,provenientes de laboratorios de más de 35centros de investigación, Universidades yHospitales distribuidos por toda la geografíaespañola, incluyendo a representantes dediversos Servicios de Proteómica y de un grannúmero de casas comerciales. Entre losparticipantes había investigadorespertenecientes tanto a grupos ya consolidadosen la investigación en Proteómica, como alaboratorios que han apostado recientemente porla Proteómica como herramienta en su campo deinvestigación.En total se presentaron 88comunicaciones, recogidas en el número 5 de larevista Proteómica, distribuidas entre las 6sesiones científicas en las que finalmente estuvoestructurado el programa científico: Sesión deBioinformática, 7; Marcadores y PatologíasHumanas, 23; ModificacionesPostraduccionales, 13; Proteómica Cuantitativa,8; Proteómica Microbiana y de Parásitos, 23, yProteómica Vegetal y Animal, 14. Con objeto defacilitar la discusión y la difusión, la mayoría delos participantes optó por presentar sus trabajosen formato póster (un total de 76),independientemente de que algunos casos se

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 21seleccionaran también para comunicación oral.Uno de los principales puntos de discusión fuedecidir el criterio a seguir para elaborar unprograma lo más equilibrado posible, así comoel tiempo asignado a cada una de las sesiones.Aunque en un primer momento se pensó enasignar un tiempo proporcional al número decomunicaciones adscritas a cada sesión,finalmente se consensuó que todas tuvieran unaduración similar, dado que el menor número decomunicaciones en un área determinada podríadeberse a las dificultades técnicas ometodológicas de abordar determinadosestudios. Esto supuso un esfuerzo extra para loscoordinadores de las sesiones con mayornúmero de trabajos, la de Marcadores yPatologías Humanas, y la de ProteómicaMicrobiana y de Parásitos.La principal novedad de estas Jornadasfue el ―formato libre‖ que permitía a loscoordinadores decidir cómo organizar ydesarrollar cada sesión, de manera que mejorsirvieran a los objetivos de las Jornadas,considerándose prioritario contemplar tiemposuficiente para la discusión y el debate. Así, laSesión de Bioinformática, coordinada porSalvador Martínez de Bartolomé y PedroNavarro, consistió en una mesa redonda paradar a conocer y debatir temas y responder aproblemas concretos relacionados con el análisisinformático de los datos obtenidos enexperimentos de proteómica. El hecho de quelos temas a debate hubieran sido elegidospreviamente mediante votación por los socios,hizo que esta ―sesión a la carta‖ fueraespecialmente provechosa.La sesión de Marcadores y PatologíasHumanas, coordinada por Ángel García yCristina Ruíz, puso de manifiesto la cantidad ycalidad de la investigación realizada enbiomedicina usando la Proteómica comoherramienta. Las novedosas estrategias ymetodologías presentadas podrían extrapolarse aotras áreas de la investigación en el futuro.Además se presentaron y discutieron ejemplosde su aplicación práctica para el estudio depatologías concretas así como los retos ylimitaciones actuales. La sesión de ProteómicaVegetal y Animal, coordinada por FedericoValverde y Luis Valledor, consistió enpresentación oral de 5 comunicacionesseleccionadas que abordaban estudios tanto deinvestigación básica como aplicada en distintasespecies vegetales y animales. Finalmente seabrió una discusión sobre el uso de laProteómica en la investigación de la biologíaanimal y vegetal, haciendo hincapié en lasprincipales limitaciones específicas de este tipode material de estudio, que ha retrasado laaplicación de esta metodología en estas áreas.En la sesión de ModificacionesPostraduccionales, coordinada por MontserratCarrascal, Antonio Martínez Ruiz, Marina Gayy Pablo Martínez-Acedo, se presentaron 7trabajos en los que se analizaron las etapas claveen el estudio de estas modificaciones,incluyendo la preparación de la muestra, lametodología empleada para su estudio y elanálisis de los datos obtenidos. Estasexposiciones dieron pie para discutir estosaspectos en relación con los distintos tipos demodificaciones estudiadas, poniéndose demanifiesto las limitaciones técnicas para llevar acabo este tipo de análisis y para la interpretaciónde los resultados a nivel fisiológico. Uno de losretos de la Proteómica actual son los estudioscuantitativos, fundamentales para comprenderlos procesos fisiológicos incluyendo los estadospatológicos y la respuesta a situaciones deestrés. En la sesión de Proteómica Cuantitativa,coordinada por Miren Josu Omaetxebarría yEva Rodríguez Suárez, se ofreció una visión delas distintas aproximaciones experimentalesutilizadas en este campo a través de lapresentación de distintas comunicaciones y suposterior discusión, incluyendo el uso dereactivos químicos, el fraccionamiento de lamuestra, el análisis mediante espectrometría demasas y las herramientas bioinformáticasnecesarias.En la sesión de Proteómica Microbiana yde Parásitos, coordinada por Aida Pitarch,Antonio Marcilla, Ana Oleaga y ManuelRodríguez Ortega, se fueron desgranado losprincipales problemas y limitaciones a los quese debe hacer frente en los estudios deproteómica en general y, especialmente, en losde proteómica de microbios y parásitos, a través

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 22la exposición de 7 trabajos seleccionados quedieron paso a enriquecedoras discusiones. Fueuna sesión muy participativa, a pesar de quepara muchos la noche anterior fue muy corta(como lo documentan numerosas fotos).Tal y como se había anunciado seconvocaron dos premios dotados con 300€, unode ellos a la mejor comunicación en formatooral o en póster, y dada la novedad en cuanto alformato libre de las sesiones, el otro a la sesiónmás participativa y enriquecedora. El primerpremio, patrocinado por Applied Biosystems-Analytical Technologies, en principio un premioúnico, se dividió finalmente en dos debido a laimposibilidad del jurado para elegir entre losdos finalistas. Mario Ferrer Navarro obtuvo elpremio a la Mejor Comunicación Oral por eltrabajo titulado ―Comparative proteomicanalysis of collection and clinical-isolate strainsof Stenotrophomonas maltophilia‖, y MiguelÁngel Sentandreu y cols. obtuvieron el Premioal Mejor Póster por el trabajo titulado ―Laproteómica como vía para determinar el origenanimal de los productos cárnicos‖. El premio ala Mejor Sesión estuvo patrocinado por ThermoScientific y se concedió a Aida Pitarch, AnaOleaga, Antonio Marcilla y Manuel RodríguezOrtega, coordinadores de la Sesión deProteómica Microbiana y de Parásitos.La participación de las casascomerciales, Thermo Scientific, AgilentTechnologies, Waters, Applied Biosystems, Bio-Rad, Isogen, Bruker, Beckman-Coulter-Izasa,Sigma y Nucliber resultó como siemprefundamental, y agradecemos especialmente sugenerosidad en esta época de incertidumbreeconómica. Dado el componente práctico deestas Jornadas, su aportación científica ha sidoparticularmente relevante a la hora deproporcionar soporte técnico en respuesta a lasdemandas de los investigadores.Un comentario recurrente sobre lasreuniones de la SEProt es el ―buen ambiente‖que se respira en cualquiera de los eventosorganizados por la Sociedad. A pesar de losmomentos de desasosiego y de los nervios paraque todo saliera bien, hemos disfrutadomuchísimo y guardamos unos recuerdosentrañables de la preparación de estas Jornadas.Ha sido un placer trabajar en estas condiciones,contando con el apoyo incondicional de la JuntaDirectiva. Ángela Moreno, a pesar de suinsistencia en que su nombre no constara enningún sitio, ha sido parte activa y fundamentalde estas Jornadas, eso lo sabemos todos. Porotro lado, FUNDECOR, con Mª Teresa Monteroal frente de la secretaría técnica, ha realizado unexcelente trabajo; Mª Carmen y RemediosMolina Ruiz se propusieron, y lo consiguieroncon creces, que la faceta social de las Jornadasfuera un éxito. En el aspecto científico, lacalidad de los trabajos presentados quedóreflejada en el Nº 5 de la revista, y en el númeroactual los coordinadores comentan el devenir desus sesiones, los temas de discusión y lasconclusiones alcanzadas. Creemos que estasJornadas han cumplido el objetivo propuesto deservir como foro de comunicación entre losgrupos que usan la proteómica en suinvestigación, y esperamos que hayan resultadofructíferas. Si ha sido así es gracias al trabajo delos coordinadores y a la actitud entusiasta yparticipativa de todos vosotros, que sois los quehabéis conseguido esta ―buena atmósfera‖. Porsupuesto, agradecemos también las críticasconstructivas, que son fundamentales para podermejorar en eventos futuros.Finalmente, durante la clausura seanunció la candidatura para las próximasJornadas en Santiago de Compostela presentadapor Cristina Ruiz-Romero y Ángel García, queha sido seleccionada por unanimidad en laúltima reunión de la Junta Directiva de lasociedad. De modo que, pasando por Segovia,nos volveremos a ver en Santiago en 2012.¡Ánimo, Cristina y Ángel.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 23Sesión de bioinformáticaCoordinadores: 1 Salvador Martínez de Bartolomé, 2 Pedro Navarro1ProteoRed, Centro Nacional de Biotecnología - CSIC, Cantoblanco, Madrid, Spain2Instituto de Biología de Sistemas Moleculares (IMSB), Instituto Federal Suizo de Tecnología(ETH), Zürich, SuizaResumenEn las pasadas II Jornadas de JóvenesInvestigadores en Proteómica, celebradas enCórdoba, tuvo lugar una fructífera sesión deBioinformática, organizada como una mesaredonda, en la que diversos temas relacionadoscon el análisis bioinformático en Proteómica,votados por los socios de la SEProt, fueronintroducidos por expertos de forma que seprodujera un debate alrededor de ellos.La sesión de bioinformática de las IIJornadas de Jóvenes Investigadores enProteómica fue organizada en un formato demesa redonda que permitiera participar a todoslos asistentes de una forma activa. Para que lasesión transcurriera de la manera másprovechosa posible, previamente a las jornadasse organizó una votación online entre losmiembros de la SEProt de los posibles temas demayor interés, como son: herramientas debiología de sistemas, análisis de resultados deproteómica cuantitativa, software libre enproteómica, combinación de motores debúsqueda, estándares de representación deexperimentos y estándares para almacenamientoe intercambio de datos proteómicos. Teniendoen cuenta el interés mostrado en las votacionespor cada uno de estos temas, se trató invitar adiferentes jóvenes investigadores de la SEProt,expertos conocedores de alguno o algunos dedichos temas y así poder responder a cualquierpregunta que pudiera surgir en torno a ellos.Alberto Medina nos presentó unaintroducción a las FPA (Functional ProteomicsAnnotations), anotaciones que proveen a losinvestigadores de algunas claves biológicasrelacionadas con la proteína o péptido quecontenga este tipo de anotación. Las FPApueden ser producidas de manera manual, o demanera automática: ambos métodos producendesafíos interesantes, como planteó Alberto ensu presentación del tema, ya que existe un grannúmero de bases de datos que almacenaninformación de Proteómica, con multitud dereferencias cruzadas entre ellas. Además, cadabase de datos utiliza índices propios, con lo queel intercambio entre bases de datos exige unmapeo entre palabras clave e índices que nosiempre es trivial. Alberto se pregunta si esrealmente posible obtener los mismos datosdesde sitios diferentes, y si existen flujos detrabajo que permitan esta recuperación de lainformación. Uno de los sistemas que permiteuna recuperación automática de FPAs es PIKE[1], un sistema web que permite unacomprobación de la información recuperada, asícomo un análisis de datos mediante clustering, yanálisis mediante las FPA de dominios,pathways e interacciones entre proteínas, peroAlberto plantea a la audiencia si realmentepodemos confiar en este tipo de sistemas, ycómo podemos obtener de ellos datos fiables (omedir su fiabilidad), ya que existe una grandependencia de las fuentes de bases de datosdesde donde éstos son adquiridos.Juan Antonio Vizcaíno fue invitadocomo experto en estándares en Proteómica.Actualmente, la enorme cantidad deinformación accesible desde PubMed no estásiendo aprovechada al máximo debido a ladificultad de compartir información endiferentes formatos, lo que dificulta lascomparaciones inter-experimentales e interlaboratorios.El uso de estándares puedepermitirnos comparaciones de metodología, deprotocolos y de instrumentos, aunque lasituación actual no es la mejor posible, ya queaún existe una cierta desconexión entre losdiversos fabricantes de equipos deespectrometría de masas (Agilent, Waters, AB,Thermo…), los motores de búsqueda más

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 24utilizados (Phenyx, Mascot, ProteinPilot,SEQUEST…), y los repositorios de informacióntales como PeptideAtlas [2], theGPMdb [3] yPRIDE [4], de forma que aún se utilizandiferentes formatos, tanto en la entrada de datos,como en la obtención de resultados.Afortunadamente, esta situación está cambiandopoco a poco, de forma que cada uno de losorganismos involucrados es más consciente dela necesidad de utilizar estándares, siguiendotres principios fundamentales: la informacióndebe estar disponible, con lo que deben existirmétodos y/o herramientas que permitan accedera toda la información que corresponda a, porejemplo, una proteína o un experimentoconcreto (la base de datos PRIDE es un buenejemplo de almacenamiento y disponibilidad dedatos proteómicos basado en un estándar), lainformación debe poder ser recuperadafácilmente, y para ello deben utilizarse formatosestándar que garanticen una comprensibilidaduniversal de los datos y, además, la informacióngenerada y almacenada debe ser suficientementeexplicativa, para lo cual se define la mínimainformación necesaria para describir unexperimento proteómico (MIAPE [5]). Lainiciativa HUPO-PSI [6] trata de ayudar en elcumplimiento de estas dos últimas premisas,desarrollando formatos estándar,representaciones de datos y anotacionesestándar, definiendo las directrices MIAPE einvolucrando en estos desarrollos a productoresde datos, proveedores de bases de datos,desarrolladores de software y editores de lasprincipales revistas científicas y proteómicas.Hasta el momento, esta iniciativa hadesarrollado de manera exitosa documentos deespecificación MIAPEs y conjuntos devocabularios controlados (ontologías) enProteómica, así como diversos estándares dedatos, como el mzML [7], que reúne la mismainformación sobre la adquisición de datos enespectrometría de masas contenida en losformatos, más antiguos, mzData y mzXML [8],añadiendo además un vocabulario controlado.Otro formato recientemente desarrollado, elmzIdentML, está destinado a la expresión deresultados en motores de búsqueda, lo quepermite la comparación de resultados de losmotores de búsqueda más conocidos, aunqueactualmente la información contenida en esteformato sea exclusivamente cualitativa. En elmomento se está trabajando duramente enencontrar una buena solución para expresarresultados de Proteómica cuantitativa en unformato estándar (mzQuantML).El ponente Alex Campos, experto ensoftware libre aplicado en Proteómica, resumióun número interesante de aplicaciones gratuitasde conversión de formatos propietarios aformatos estándar, tales como ProteoWizard [9].Además, propuso algunas alternativas desoftware que permiten realizar extracción depicos, y cuantificación, tanto basada en marcajecon isótopos estables como sin marcar(OpenMS [10], SuperHirn [11]), y preguntó a laaudiencia por los diversos programas queutilizaban habitualmente, generando uninteresante debate sobre las diferentesalternativas entre los laboratorios de la SEProt,problemas de conversión de datos, y métodospara intercambiar información de resultados deProteómica cualitativa y cuantitativa entrelaboratorios colaboradores.Por último, Marco Trevisan nos recordóque los formatos XML no deben ser utilizadosen general como métodos de almacenamiento dedatos, práctica habitual en muchos laboratorios,y que el almacenamiento de datos debe serrealizado en formatos específicos dealmacenamiento de datos, como son las bases dedatos. En la discusión posterior se comentó queel formato XML nació de facto como unformato de intercambio de información, y nuncacomo un método de almacenamiento, con lo quedebería respetarse esta filosofía de trabajo.Los organizadores de esta sesión y losponentes de la misma queremos agradecer atodos los asistentes a la sesión su altaparticipación durante la mesa redonda, ydeseamos que haya sido provechosa para susintereses. Deseamos así mismo que el nivelcientífico mostrado durante todas las Jornadasse mantenga en próximas citas, y felicitamos alos organizadores de Córdoba por su excelentetrabajo. ¡Hasta la próxima!

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 25Referencias[1] Medina-Aunon JA, Paradela A, Macht M,Thiele H, Corthals G y Albar JP. PIKE:discovering biological information fromproteomics data. PROTEOMICS. 2010Sep;10(18):3262-71.[2] Desiere F, Deutsch EW, King NL,Nesvizhskii AI, Mallick P, Eng J, et al.The PeptideAtlas project. Nucl. AcidsRes. 2006;34:D655-58.[3] Craig R, Cortens JC, Fenyo D y Beavis RC.Using annotated peptide mass spectrumlibraries for protein identification. JProteome Res 2006;5:1843-9.[4] Jones P, Cote RG, Martens L, Quinn AF,Taylor CF, Derache W, et al. PRIDE: apublic repository of protein and peptideidentifications for the proteomicscommunity. Nucl. Acids Res.2006;34:D659-63.[5] Taylor C, Paton N, Lilley K, Binz P-A,Julian R, Jones A, et al. The minimuminformation about a proteomicsexperiment (MIAPE). NatureBiotechnology 2007;25:887-93.[6] Orchard S, Hermjakob H y Apweiler R. Theproteomics standards initiative.PROTEOMICS 2003;3:1374-6.[7] Deutsch E. mzML: A single, unifying dataformat for mass spectrometer output.PROTEOMICS 2008;8:2776-77.[8] Pedrioli PG, Eng JK, Hubley R, VogelzangM, Deutsch EW, Raught B, et al. Acommon open representation of massspectrometry data and its application toproteomics research. Nat Biotechnol2004;22:1459-66.[9] Kessner D, Chambers M, Burke R, Agus D yMallick P. ProteoWizard: open sourcesoftware for rapid proteomics toolsdevelopment.Bioinformatics2008;24:2534-6.[10] Kohlbacher O, Reinert K, Gropl C, LangeE, Pfeifer N, Schulz-Trieglaff O, et al.TOPP--the OpenMS proteomicspipeline. Bioinformatics 2007;23:e191-7.[11] Mueller LN, Rinner O, Schmidt A, LetarteS, Bodenmiller B, Brusniak MY, et al.SuperHirn - a novel tool for highresolution LC-MS-based peptide/proteinprofiling. PROTEOMICS 2007;7:3470-80.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 26Sesión de proteómica de biomarcadores y patologías humanasCoordinadores: 1 Ángel García, 2 Cristina Ruiz1Departamento de Farmacoloxía; Universidade de de Santiago de Compostela2Laboratorio de investigación Osteoarticular y del Envejecimiento, INIBIC-CH Universitario ACoruña.La sesión 3 de las II Jornadas Bienalesde Jóvenes Investigadores en Proteómica estuvoenfocada en la aplicación de estrategiasproteómicas para el estudio de patologíashumanas y la búsqueda de biomarcadoresproteicos de las mismas.La nutrida participación, con 8presentaciones orales y 14 en formato de póster,ya prometía a priori que iba a tratarse de unasesión intensa, y no decepcionó. Además, lagran calidad de los trabajos presentados, quecombinaban originales estrategias técnicas coninteligentes diseños experimentales, dio idea delgran nivel existente en proteómica biomédica.Las temáticas fueron de lo más variado,abarcando desde avances tecnológicos concretoshasta aplicaciones prácticas en diferentescampos biomédicos: cáncer, cardiovascular,artritis, obesidad, etc.Con el fin de promover el debate, lapresentación de las comunicaciones orales serepartió en dos fases: una más centrada enestrategias de búsqueda o validación debiomarcadores de potencial interés clínico, yotra enfocada en estudios de patogénesis dedistintas enfermedades. Cada fase concluyó conun periodo de discusión en el que se trataba deresumir la información presentada y discutir losproblemas relacionados con la proteómicaclínica.Detección de biomarcadores en fluidosbiológicos1. Empleo de arrays de proteínasLa primera participante de la sesión fueIngrid Babel, del Centro de InvestigacionesBiológicas (Madrid), la cual nos presentó unainteresante estrategia para la búsqueda deautoanticuerpos en sueros de pacientes concáncer colorrectal (CCR) que puedan tenerutilidad como biomarcadores. Se trata de unaalternativa a los arrays de proteínas clásicos,que se basa en el empleo de librerías de fagosT7 que contienen cDNA de tejido de pacientescon CCR. Estos fagos se imprimen sobresoportes de nitrocelulosa, que a continuaciónson cribados con sueros de pacientes con CCR,con el fin de identificar aquellos péptidosdesplegados en la superficie de los fagosreconocidos por autoanticuerpos específicos deCCR. Para completar el estudio, se verificómediante ELISA la inmunoreactividad de 5fagos homólogos a proteínas conocidas.2. Estratégias de proteómica dirigida (MRM)Los experimentos de proteómica al azarpara el descubrimiento de péptidos o proteínascon potencial como biomarcadores deben iracompañados del diseño de estrategias dirigidas,con el fin de poder verificar su utilidadbiomarcadora en un número más amplio demuestras. Una estrategia muy empleada en estecampo, y que se basa en espectrometría demasas, es la técnica de Multiple ReactionMonitoring (MRM). Antonio Serna, deABSciex, presentó la tecnología que dispone suempresa para la realización de estudios MRM.Este tipo de estudios han mostrado ya suutilidad para el análisis cuantitativo debiomarcadores, debido a su granreproducibilidad, rango dinámico y límites dedetección, y por ello aparecen como unaalternativa prometedora para la cuantificaciónde proteínas en líquidos biológicos que evita lanecesidad de anticuerpos específicos y posibilitaanálisis múltiples (de más de 100 proteínassimultáneamente).

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 273. Estudio proteómico de fluidos biológicos:un ejemplo con la orinaLa presentación de Marina Rigau, delInstitut de Recerca (Barcelona), nos mostró atodos un ejemplo de estrategia proteómica parabúsqueda de biomarcadores en orina. Tras unprocesamiento de las muestras con ProteoMiner(de Bio-Rad), realizó un estudio diferencialmediante 2D-DIGE, y validó la posible utilidadbiomarcadora de 15 candidatos mediante MRM.El empleo de ProteoMiner en esteestudio fue objeto de discusión posterior ya que,además del de Marina, había otros dos trabajosque presentaban este procesamiento comométodo para reducir el rango dinámico de lasmuestras.4. Nuevas estrategias basadas en MALDIprofiling para búsqueda de biomarcadoresA continuación, Francesco Tortorella, delos laboratorios Bio-Rad, nos presentó elsistema Lucid, que comercializa su empresa.Este sistema combina la estrategia de separaciónmediante cromatografía de retención(empleando los ProteinChips de SELDI) conespectrometría de masas de alta resolución detipo MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF. De estemodo, la especificidad de las superficies de loschips permite limpiar la muestra directamente ysimplificar muestras complejas, mientras que elanálisis posterior con espectrometría de masasen tándem posibilita la identificación de lospicos diferenciales en los perfiles de MALDI.Esto constituye una gran ventaja frente a lasclásicas estrategias de SELDI-TOF, en la que nose identificaban los péptidos y por tanto no eraposible obtener información biológica acerca delos cambios en los espectros de masas.5. Discusión general: el problema del rangodinámicoLas preguntas y cuestiones surgidas enlas presentaciones de esta primera parte de lasesión se englobaron en un periodo de discusióngeneral, en el que el tema principal fue elproblema del gran rango dinámico de lasproteínas presentes en las muestras queclásicamente se utilizan para la búsqueda debiomarcadores. Los fluidos biológicos humanosson excelentes fuentes de biomarcadoresproteicos, ya que se encuentran en contacto conla mayoría de los tejidos, incorporandoproteínas secretadas o liberadas por ellos quepueden detectarse sin necesidad de biopsia. Elplasma (o suero) tiene la gran ventaja de su fácilobtención, pero también la desventaja de queaquellas proteínas liberadas por un tejido o tipocelular específico (que son las que tienen mayorpotencial como biomarcadores) se diluyen,haciéndose muchas veces indetectables con losmétodos disponibles en la actualidad. Por ello,también hay gran interés en el análisis de otrotipo de fluidos (denominados ―proximales‖) queentran en contacto con uno o pocos tejidos, enlos que se espera una menor dilución.De todas formas, sea cual sea el fluidosobre el que se realice la búsqueda debiomarcadores, éstos aparecerán típicamente abajas concentraciones, siendo difícil sudetección por la presencia de otras proteínasmás abundantes que los enmascaran. Comoestrategias para resolver este problema desensibilidad se encuentran las técnicas deproteómica dirigida (MRM, SISCAPA, etc.),pero en el caso de realizar estudios al azar laúnica alternativa consiste en enriquecer lasmuestras en estas proteínas menos abundantes,empleando productos como el ProteoMiner oeliminando las proteínas más abundantes deplasma mediante cromatografía de afinidad.Varios de los pósters presentados en la sesióntrataron este tema, y la conclusión es quecualquier tratamiento altera la cuantificaciónposterior. En el caso del ProteoMiner, sediscutió su uso en estudios cuantitativos, ya quealtera las proporciones de las proteínas de formaglobal, y algún participante propuso su empleoúnicamente en análisis cualitativos de lasmuestras. Por su parte, la depleción mediantecromatografía de afinidad tiene como principaldesventaja que muchas proteínas pueden sereliminadas de forma inespecífica por suinteracción con proteínas abundantes como laalbúmina.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 28Estudios de patologías humanas medianteabordajes proteómicos.1. Estudio de biomarcadores plaquetarios ensíndrome coronario agudoLa sección de proteómica aplicada alestudio de patologías humanas comenzó con lacharla de Andrés F. Parguiña, del Departamentode Farmacología de la Universidad de Santiagode Compostela, quien nos presentó un análisisdel proteoma plaquetario en pacientes consíndrome coronario agudo (SCA), patología enla que las plaquetas juegan un papelfundamental y que es principal causa de muerteen el mundo occidental. Este trabajo se basó en2-DE de alta resolución para la separación deproteínas y MALDI-TOF/TOF para suidentificación. El análisis de imagen fue con elsoftware Ludesi REDFIN (Suecia) y lasvalidaciones mediante western blot. Sedetectaron 55 puntos en el gel que variaban deforma significativa entre plaquetas de un grupode 18 pacientes con SCA sin elevación delsegmento ST en el electrocardiograma(SCASEST) y un grupo control constituido por10 pacientes con cardiopatía isquémica crónicaestable. Los grupos se cotejaron de manera queno hubiese diferencias significativas en cuanto aedad, sexo y tratamientos. Las proteínasidentificadas se correspondían a 30 genesdiferentes y la mayoría de las mismas pertenecíaa los siguientes grupos funcionales:señalización, citoesqueleto y rutas de secreción /vesículas. Esto concuerda con la idea de unamayor activación plaquetaria en los pacientesSCASEST, y se confirmó con el descenso delnúmero de diferencias en estudios deseguimiento de los pacientes. Este estudio abreun campo de investigación para explorar elpapel de proteínas plaquetarias en la patogénesisdel SCA, así como para la búsqueda debiomarcadores secretados por las plaquetas quepuedan ser de utilidad en dicha enfermedad.2. Visión proteómica de la estenosis valvularaórticaLa siguiente presentación corrió a cargode Tatiana Martín-Rojas, del laboratorio defisiopatología vascular del Hospital Nacional deParapléjicos de Toledo. La charla se centró en elestudio de la estenosis aórtica (EA) valvulardesde un punto de vista proteómico. La EAdegenerativa es una enfermedad de elevadaprevalencia en los países desarrollados y es laresponsable del mayor número de reemplazosaórticos. Debido a que las proteínas quecomponen las válvulas aórticas son esencialespara el correcto funcionamiento de éstas, suidentificación y caracterización es de granrelevancia. En este trabajo se comparó elproteoma de válvulas aórticas procedentes depacientes sometidos a reemplazo valvularaórtico con el de válvulas aórticas sanasprocedentes de necropsias. El análisisproteómico diferencial fue mediante 2D-DIGE yla identificación de proteínas mediante MALDI-TOF/TOF. Se encontraron 51 spots que variabanentre grupos, que se correspondían a 18 genesdiferentes. Las validaciones fueron mediantewestern blot e inmunohistoquímica.3. Empleo de SILAC como técnicacuantitativa para estudios de patogénesis yfarmacoproteómica in vitroValentina Calamia, del Instituto deInvestigación Biomédica de A Coruña (INIBIC),mostró a continuación una aplicación de latécnica cuantitativa de SILAC en estudios deproteómica biomédica. Esta estrategia se basaen el marcaje metabólico diferencial de célulasen cultivo con aminoácidos que presentanisótopos estables, lo que permite llevar a caboanálisis de proteómica cuantitativa. Comoejemplo de la utilidad de esta técnica enestudios in vitro, la presentación mostró laestandarización del marcaje de condrocitos, queson las únicas células presentes en el cartílagoarticular humano y responsables delmantenimiento de la integridad del tejido. Unavez estandarizada la técnica, se aplicó paraevaluar el efecto de una citoquinaproinflamatoria, la interleuquina-1β, sobre elperfil de proteínas secretadas por loscondrocitos. Esta estrategia posibilitó laidentificación de un gran número decomponentes de la matriz extracelular delcartílago, lo que da idea de la utilidad delestudio de los secretomas como reflejo de los

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 29procesos de remodelación de los tejidos. Elanálisis cuantitativo demostró el desequilibrioque la citoquina (un mediador esencial en lapatogénesis de la artrosis) produce entre losprocesos anabólicos y catabólicos delcondrocito, incrementando la síntesis demetaloproteasas y otras citoquinasinflamatorias. El empleo de este modeloposibilitará la realización de análisisfarmacoproteómicos en el futuro, con el fin deevaluar el efecto de compuestos con potencialacción terapéutica en artrosis.4. Análisis proteómico diferencial de célulashepáticas tras depleción de prohibitinaLa última charla de la sesión corrió acargo de Virginia Sánchez-Quilés, del CIMA(Universidad de Navarra). La prohibitina 1(Phb1) es una proteína que juega un papelfundamental en el mantenimiento de lahomeostasis hepática. En este trabajo se silencióla expresión de Phb1 en la línea celular humanade carcinoma de hígado PLC/PRF 5 mediantesiRNAs. Se llevó a cabo un estudio proteómicodiferencial mediante DIGE y espectrometría demasas para explorar los mecanismosinvolucrados en la respuesta de las células PLCa la disminución de la actividad de Phb1. Losestudios de validación fueron mediante westernblot. La principal conclusión fue que elsilenciamiento de Phb1 en la línea celularPLC/PRF5 condujo a un aumento de apoptosis ya una disminución de la proliferación celular.5. Discusión general: Obtención de muestrasclínicas para análisis proteómicos.La sesión concluyó con una discusiónsobre aspectos fundamentales a la hora deplantear un estudio de proteómica clínica. Eldebate fue muy participativo y quedó clara laimportancia de llevar a cabo una recogida yalmacenamiento de muestras riguroso paraevitar que los estudios estuvieran sesgados porla presencia de contaminantes, o por artefactosdebido a que no todas las muestras incluidas enun estudio fuesen tratadas por igual. En el casode suero o plasma, es fundamental que todas lasmuestras se hayan obtenido con un mismoprotocolo y que se almacenen adecuadamente a-80 o C. Así mismo, las muestras deben seralicuotadas para evitarse en la medida de loposible un elevado número de congelaciones/descongelaciones, lo cual debe serconvenientemente controlado. En cuanto alestudio de tejidos, debe asegurarse con elpatólogo correspondiente que se está obteniendoel tejido adecuado para nuestro estudio y que elmismo ha sido convenientemente ―lavado‖ paraevitar contaminaciones, por ejemplo, con restosde sangre o plasma. Para todo lo anterior esclave una buena coordinación entreinvestigadores básicos y clínicos. Lasenfermeras o cirujanos encargados de la toma demuestra deben estar advertidos de laimportancia de una adecuada recogida demuestra para el estudio que se llevará a cabo. Lainvestigación translacional a este nivel sólopuede tener éxito si existe buena voluntad ycoordinación entre el equipo multidisciplinarque involucra a clínicos e investigadoresbásicos. Ello es también fundamental a la horade plantear los grupos objetos de estudio: laelección de grupos de pacientes controladecuados es clave; debe tenerse en cuenta lapatología a estudiar, los tipos de pacientes, y sustratamientos. Sin una adecuada supervisiónclínica de estos factores, el estudio quedarácomprometido, al dar lugar a resultados difícilesde interpretar. El debate fue muy participativo ytodo el mundo coincidió en el reto que suponellevar a cabo estudios de proteómica clínicarigurosos y reproducibles, y que sería deseableque se estableciesen unas guías claras queayudasen a conseguir dicho objetivo.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 30Conclusión finalLa sesión de biomarcadores y patologíashumanas fue de las más extensas de lasJornadas. El número y calidad de los trabajospresentados hizo muy difícil la selección decomunicaciones orales, las cuales dieron unabuena visión de lo que se está haciendo a nivelnacional, y en el seno de la SEProt, en un áreaclaramente en expansión. Debemos en cualquiercaso tener en cuenta que la proteómica clínicapresenta todavía muchos retos de procedimientoy tecnológicos que se deben afrontar paragarantizar que una proporción cada vez mayorde los trabajos publicados tengan su reflejo enuna mejora real del tratamiento / predicción dela patología concreta objeto de estudio.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 31Sesión de modificaciones postraduccionalesCoordinadores: 1 Antonio Martínez-Ruiz, 2 Marina Gay, 3 Pablo Martínez-Acedo, 2 MontserratCarrascal1Servicio de Inmunología, Hospital de La Princesa, Instituto de Investigación Sanitaria Princesa(IP), Madrid, España2Laboratorio de Proteómica CSIC/UAB, IIBB-CSIC-IDIBAPS, Edificio M-UAB, Barcelona,España3 Protein Chemistry & Proteomics Laboratory, CBM, CSIC-Universidad Autónoma de Madrid.Cantoblanco, Madrid, EspañaIntroducciónLas modificaciones postraduccionales delas proteínas juegan un papel muy importante encasi todos los aspectos de la función celular. Sucaracterización es de gran importancia paracomprender los mecanismos celulares, tanto losfisiológicos como los implicados en situacionespatológicas. Existe un gran número demodificaciones y según el tipo de modificación,los procedimientos utilizados, y por tanto elflujo de trabajo, varían en cualquiera de lasetapas del procedimiento. En nuestra sesiónquisimos ordenar las presentaciones en tresgrupos en función de la etapa que en cadatrabajo se consideraba clave para lacaracterización de la modificación.Consideramos tres puntos clave en laidentificación de modificaciones postraduccionales:(1) preparación de la muestra, (2)estrategias analíticas y (3) procesamiento de losdatos (Ver gráfico).De esta manera evitábamos la meraclasificación por el tipo de modificación que seestudiaba, intentando destacar los aspectoscomunes a distintas modificaciones que puedencompartir aproximaciones metodológicasrelativamente similares.1. Preparación de la muestraEn este apartado se agruparon lostrabajos en los que la obtención de la muestra, elmarcaje específico o el enriquecimiento de lospéptidos o proteínas modificadas eran la partefundamental de la estrategia experimental. Estostrabajos incluían modificaciones redox encisteínas (S-nitrosilación y oxidacionesreversibles por DTT), carbonilación yfosforilación.En la primera comunicación, Laura M.López-Sánchez, del Hospital Reina Sofía enCórdoba, presentó su trabajo sobre un modelode daño hepático por colestasis inducida en elque observan que la inhibición de la síntesis deóxido nítrico reduce el daño [1]. Mediante latécnica de biotin switch (un protocolo en trespasos para reducir y biotinilar específicamentecisteínas nitrosiladas) consiguen marcarselectivamente las proteínas que sufren S-nitrosilación (formación de nitrosotioles,R-S-N=O, en cisteínas). De esa manera seevaluaron los niveles globales de proteínas S-nitrosiladas, observando un aumento en losanimales con la lesión inducida, pero no tantoen los animales lesionados y tratados con

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 32inhibidor. Además, se describen 25 proteínasque pueden ser dianas de S-nitrosilación en loshígados lesionados, lo que abre el paso aestudios más detallados.Sarela García-Santamarina, de laUniversitat Pompeu Fabra en Barcelona,aborda el estudio de modificaciones oxidativasreversibles e irreversibles enSchizosaccharomyces pombe sometidas a estrésoxidativo por H 2 O 2 o por deleción de genes dela respuesta antioxidante [2]. El estudio de laformación de carbonilos en proteínas se lleva acabo mediante derivatización específica conhidrazidas y su posterior detección medianteinmunodetección o fluorescencia. Así, localizanlas proteínas modificadas mediantesolapamiento de los perfiles 2DE derivados dela tinción específica con la señal de proteínatotal. Por otro lado, también mediantederivatización de las cisteínas conprocedimientos similares al biotin switch,consiguen detectar un aumento en oxidacionesen cisteínas reversibles por DTT (incluyendopuentes disulfuro y sulfenilaciones) en ambassituaciones de estrés oxidativo. Utilizando en laderivatización los reactivos ICAT, cuantificanlas cisteínas oxidadas en dos muestras distintas,con lo que pueden estudiar mejor la relevanciade estas modificaciones en estrés oxidativointrínseco y extrínseco.Daniel Tello, del Hospital de La Princesaen Madrid, nos mostró el desarrollo de nuevasmetodologías para la detección de cisteínasmodificadas empleando derivatizaciones conreactivos fluorescentes (fluorescence switch) y2DE [3]. Empleando ascorbato como reductor,marcan de forma selectiva cisteínas nitrosiladas,identificando dianas de esta modificación trasun tratamiento con nitrosotiol, o dianas dedesnitrosilación por la ruta de la tiorredoxina.Además, mediante reducción con DTT,observaron oxidaciones reversibles en cisteínas,un procedimiento que se puede aplicar endistintos contextos, no sólo de daño oxidativo,sino también de señalización, como la respuestaa hipoxia. Finalmente planteó posibles mejorascomo son la utilización de varios fluoróforospara analizar varias muestras, o la necesidad decambiar los protocolos de análisis respecto a lospaquetes de software empleados para 2DE.Ana Maldonado-Alconada y SiraEchevarría-Zomeño (de la Universidad deCórdoba), además de organizar estupendamentelas Jornadas y estar atentas a todos los detallesde estos días, tuvieron tiempo de presentar ensendos pósters sus resultados en cuanto alestudio de modificaciones redox de cisteínas enplantas. Ana presentó un estudio en el que sedescriben proteínas S-nitrosiladas(S-nitrosiloma ó S-nitrosoproteoma) en larespuesta defensiva en Arabidopsis thalianaempleando el biotin switch, consiguiendoidentificar más de 100 proteínas susceptibles deser modificadas [4]. Por su parte, Sira nosmostró diferentes aproximacionesmetodológicas dirigidas a estudiar el estadoredox de cisteínas en muestras vegetalesmarcando de forma diferencial los residuosreducidos y oxidados [5]. Para ello, seemplearon derivatizaciones fluorescentes(DIGE) y con isótopos (ICAT, paracuantificación en MS), mostrando lasdificultades de estas aproximaciones y lanecesidad de incorporar controles que evalúenbien la eficiencia de marcaje de los distintosestados de la cisteína. Con este mismo objetivo,Brian McDonagh, también de la Universidad deCórdoba, presentó en un póster otrametodología distinta utilizando el marcajeiTRAQ sobre una proteína modelo [6].Y finalmente, Nerea Osinalde, de laUniversidad del País Vasco, presentó en unpóster la identificación de un nuevo punto defosforilación en el factor de transcripción E2F1[7]. En este caso utilizó una metodología de―doble enriquecimiento‖ a partir de extractoscelulares que consistía en la inmunoprecipitaciónde la proteína y el posteriorenriquecimiento selectivo de los péptidostrípticos fosforilados con columnas de óxido detitanio. Se puede destacar la importancia delresultado dado que se trata de una fosforilaciónendógena en un factor de transcripción, unaproteína poco abundante pero cuya regulaciónpor modificación postraduccional puede sermuy importante funcionalmente.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 33Estrategias analíticasEn cuatro de los trabajos presentados, laoptimización de la estrategia analítica utilizandotécnicas de separación de péptidos y proteínasacopladas al análisis por espectrometría demasas, era el paso clave en la identificación dela modificación.María Ramírez-Boo, del UniversityMedical Center de Ginebra, nos mostró unestudio dirigido a la identificación ycuantificación de proteínas glicosiladas ensangre [8]. El trabajo incluye el marcaje de lamuestra con 13 C 6 -glucosa y el posteriorenriquecimiento en péptidos glicosiladosmediante cromatografía de afinidad porboronatos. El análisis de estos péptidosglicosilados mediante espectrometría de masasimplicó un barrido HCD-MS 2 y un CID-MS 3sobre pérdidas neutras específicas de péptidosque contienen glucosa (162.05 y 84.04 Da). Lainformación cuantitativa se obtuvo a partir delas áreas de los cromatogramas de iones de losprecursores. Esta estrategia la aplicaron conéxito a muestras de plasma humano y a lisadosde eritrocitos, identificando hasta 161 puntos deglicosilación.Albert Casanovas, de la Universidad deBarcelona, presentó un trabajo sobre lapotencial nitración de la lipoproteína lipasa(LPL) de rata in vivo en respuesta a laadministración de lipopolisacárido [9]. Lanitración global de la proteína se determinómediante western-blot anti-nitrotirosina. Para laidentificación de las tirosinas nitradas se realizó,en primer lugar, una comparación de tresestrategias distintas de fragmentación medianteMS/MS estableciendo el método que conseguíadetectar un mayor número de tirosinas nitradas:análisis mediante MS/MS secuencial siguiendouna lista de iones predefinida y derivada de lasmasas de los potenciales péptidos modificados.Así, se consiguieron identificar por primera vezpéptidos nitrados tanto in vitro como in vivo enla LPL, sugiriendo nuevos mecanismos deregulación de dicha proteína.En cuanto a la aportación de las casascomerciales a nuestra sesión, Keith Compson,de Waters Corporation, mostró métodosalternativos de fragmentación (ETD), y estudiosde movilidad de iones para la identificación demodificaciones postraduccionales en unespectrómetro de masas qTOF [10], mientrasque Isidro Masana, de Agilent Technologies,presentó una nueva tecnología para el análisisselectivo de fosfopéptidos mediante LC-MS[11]. Se trata de un chip que incluye unacolumna de enriquecimiento empaquetada conRP1-TiO 2 -RP2 y que permite en un soloexperimento el análisis por separado de péptidosfosforilados y no fosforilados.Procesamiento de datosDebido a la utilización de métodos deenriquecimiento y de barridos específicos elprocesamiento de los datos aumentasensiblemente en complejidad respecto a otrosanálisis proteómicos, siendo actualmente unpaso fundamental en el flujo de trabajo.Recibimos dos resúmenes en estasección. Anabel Marina, del CBM, nos mostrólas dificultades que supone la caracterización deS-glutationilación de proteínas a nivel deproteoma [12]. Analizaron distintas muestras entres condiciones: sin agente reductor, tratadascon glutatión y tratada con glutatión disulfuro.Usando el motor de búsqueda SEQUESTidentificaron un alto número de péptidos conglutationilación, tanto en las muestras tratadascomo sin tratar. Sin embargo, cuando analizaronmanualmente los espectros de MS/MS conmayor puntuación detectaron que lasidentificaciones de péptidos modificados en lasmuestras no tratadas eran incorrectas mientrasque en las muestras tratadas eran correctas. Estamala asignación automática podría derivar delhecho de que este tipo de péptidos son en sugran mayoría especies M+3H + lo que complicasu patrón de fragmentación y que además setrata de espectros con un alto nivel de ruido.Estos resultados ponen en evidencia que laidentificación de péptidos con S-glutationilaciónes un proceso que aun requiere de un análisismás detallado para poder realizar estudios agran escala.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 34David Ovelleiro, del Laboratorio deProteómica CSIC/UAB, nos presentó el flujo detrabajo desarrollado para la caracterizacióncualitativa y cuantitativa del fosfoproteoma[13]. El trabajo se centra en la resolución de losproblemas derivados del trabajo con unsubproteoma, del cálculo lo más automáticoposible de las identificaciones correctas y de lacorrecta asignación del punto de fosforilacióndentro de secuencias peptídicas que contienenvarios sitios potenciales. También nos mostrólas mejoras en la fiabilidad de lasidentificaciones mediante la utilización dediversos motores de búsqueda en paralelo y nosdio unas pinceladas sobre los posibles formatosde almacenamiento de los datos, un tema queactualmente todavía no se ha estandarizado.Referencias[1]. López-Sánchez, L., et al., La inhibición dela síntesis de óxido nítrico durante lacolestasis inducida experimentalmentereduce la lesión hepatocelular al facilitarla homeostasis de nitrosotioles.Proteómica 2010; 5: 86.[2]. García-Santamarina, S., S. Boronat, and E.Hidalgo, Analysis of reversible andirreversible protein modifications uponoxidative stress in Schizosaccharomycespombe by proteomic approaches.Proteómica 2010; 5: 91.[3]. Tello, D., R. Fernández-Rodríguez, and A.Martínez-Ruiz, Desarrollo demetodologías para la detección demodificaciones postraduccionales encisteínas (S-nitrosilación y oxidación)mediante aproximaciones proteómicasbasadas en marcaje fluorescente yelectroforesis bidimensional. Proteómica2010; 5: 90.[4]. Maldonado, A., et al., Deciphering the S-Nitrosylome of Arabidopsis thalianaduring the defense response. Proteómica2010; 5: 83.[5]. Echevarría-Zomeño, S., et al.,Aproximaciones metodológicas para elestudio del estado redox (tiol-disulfuro)de proteínas en muestras vegetales.Proteómica 2010; 5: 81.[6]. McDonagh, B., A. Padilla, and J. Bárcena,Application of iTRAQ reagents torelatively quantify the reversible redoxstate of cysteines. Proteómica,Proteómica 2010; 5: 93.[7]. Osinalde, N., et al., Identification of a newphosphorylation site in E2F1transcription factor. Proteómica 2010; 5:77.[8]. Ramírez-Boo, M., et al., Strategies forproteomic analysis of blood glycatedproteins. Proteómica 2010; 5: 72.[9]. Casanovas, A., et al., La lipoproteína lipasade rata se nitra in vivo en respuesta a laadministración de lipopolisacarido.Proteómica 2010; 5: 91.[10]. Compson, K., et al., Liquidchromatography - electron transferdissociation and ion mobility studies ona QTOF mass spectrometer. Proteómica2010; 5: 71.[11]. Massana, I., et al., HPLC - FosfoChip unanueva tecnología para el análisisselectivo de fosfopéptidos medianteLC/MS. Proteómica 2010; 5: 75.[12]. Morato, E., S. Echevarría-Zomeño, and A.Marina, Caracterización de S-glutionilación de proteínas a nivel deproteoma. Dificultades. Proteómica2010; 5: 85.[13]. Ovelleiro, D., M. Carrascal, and J. Abian,Establecimiento de un flujo de trabajoefectivo en la caracterización cualitativay cuantitativa del fosfoproteoma.Proteómica 2010; 5: 79.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 35Sesión de proteómica cuantitativaCoordinadores: 1 Miren J. Omaetxebarría, 2 Eva Rodríguez-Suárez1 Department of Biochemistry and Molecular Biology. University of the Basque Country. Leioa,Spain,2 Proteomics Unit, CIC bioGUNE, CIBERehd, ProteoRed, Technology Park of Bizkaia, Derio,SpainEl día 11 de Febrero de 2010, se dioinicio en la Universidad de Córdoba a las IIJornadas Bienales de Jóvenes Investigadores enProteómica. Las Jornadas se estructuraron enseis sesiones que abarcaban los diferentescampos en el desarrollo tecnológico de técnicasproteómicas.La sesión inaugural correspondió a lasesión sobre Proteómica Cuantitativacoordinada por Eva Rodríguez-Suárez (CICbioGUNE) y Miren Josu Omaetxebarría(UPV/EHU).La proteómica emergió como unadisciplina robusta para el análisis cualitativo delproteoma. La andadura de la proteómica se forjócon la generación de listados de proteínaspresentes en diferentes sistemas biológicos, locual indudablemente impulsó el avance denuevas y mejores técnicas analíticas ybioinformáticas necesarias en aquel momento.Todo ello contribuyó al avance en lainvestigación proteómica y se comenzaron a darpasos hacia una nueva dimensión: el análisiscuantitativo de los proteomas que permitiría elanálisis diferencial de la abundancia deproteínas entre diferentes muestras, pudiendoobtenerse, por ejemplo, informacióncomparativa entre muestras de pacientes sanos yenfermos. Durante años, los gelesbidimensionales han proporcionado informacióncualitativa así como cuantitativa a la hora decomparar diferentes muestras o condiciones ensistemas biológicos bajo estudio. Aún hoy endía, esta técnica es utilizada en miles delaboratorios con resultados excelentes, más sicabe con el advenimiento de la técnica DIGEque ha permitido solventar los problemas dereproducibilidad ligados previamente a estametodología. Sin embargo, el desarrollo detécnicas gel-free orientadas a la proteómicacuantitativa ha supuesto un avance cualitativo ycuantitativo importante. No hay más que repararen los títulos de las comunicaciones recibidas enla sesión de proteómica cuantitativa paraconcluir que la repercusión que las distintastécnicas de proteómica cuantitativa va a tener enla biología molecular clásica y en la búsquedade biomarcadores es inminente. Lacuantificación de cambios en las proteínas esclave a la hora de entender las alteracionesbiológicas de los sistemas y para eldescubrimiento de biomarcadores. Actualmente,la cromatografía de fase reversa en tándem a laespectrometría de masas (HPLC-MS/MS) estásiendo utilizada con éxito para la cuantificaciónde mezclas complejas de proteínas. Sinembargo, los resultados no son óptimos debidoen gran medida al gran rango dinámico quepresentan las muestras y la falta de algoritmosfidedignos que faciliten la cuantificación.Las diferentes contribucionespresentaron resultados cuantitativos obtenidos apartir del análisis de muestras diversasutilizando técnicas de marcaje isobárico comoiTRAQ (Luz Valero, Joan Josep Bech Serra,Juan Casado-Vela), marcaje no isobárico comoICPL (Joan Josep Bech-Serra), varios métodoslabel-free (Kerman Aloria-MS E , Alex Campos-Spectral Counting, Joan Josep Bech-Serra-Progenesis LC-MS software) o el más utilizadoen validación de biomarcadores, SRM otargeted proteomics (Madalina Opperman yIsidre Masana). No podemos olvidar laimportancia del tratamiento estadístico de datosy la necesidad de desarrollar modelosestadísticos válidos en esta materia. MarcoTrevisán-Herraz presentó un nuevo modeloestadístico extrapolable a diferentes métodos demarcaje isotópico y diferentes espectrómetrosde masas.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 36Comentar además que el número decontribuciones fue relativamente bajo (8)evidenciando el carácter novedoso del tema y ladificultad ligada a este tipo de metodología.La sesión se organizó de manera que las5 presentaciones orales fueron de 15 minutos(10 minutos en el caso de casas comerciales)todo ello con el fin de favorecer la discusión,para la cual se dedicaron 25 minutos. Dichadiscusión fue introducida y moderada por lascoordinadoras valiéndose para ello de unarevisión bibliográfica hecha con anterioridad ala sesión de modo que diversos artículosrelevantes en el campo de la proteómicacuantitativa fueron presentados y comentadoscon el fin de promover el debate.A continuación comentaremosbrevemente las diferentes contribuciones a estasesión de proteómica cuantitativa ymencionaremos los puntos que mayor interéssuscitaron durante la discusión.Presentaciones orales1. “Soluciones a Retos Analíticos enProteómica Cuantitativa y Validación deBiomarcadores”Isidro Masana.Agilent Technologies – BarcelonaIsidro Mansana nos presentó las últimasinnovaciones de instrumentación y software queha desarrollado Agilent para el análisiscuantitativo de péptidos mediante triplecuadrupolos. Un método de validación enProteómica cada vez más extendido es el―targeted MS‖ para la detección y cuantificaciónde péptidos pre-seleccionados en muestrascomplejas. Los triple cuadrupolos ofrecen laposibilidad de desarrollar métodos de SRM(single reaction monitoring) o MRM (multiplereaction monitoring) en los que el tercercuadrupolo se usa en un modo de no escaneo yse concentra en la medida de los analitos predeterminadosincrementando el límite dedetección. Las ventajas de este método es que elpéptido de interés se ve menos afectado por lacomplejidad de la muestra o el ruido; hay unlímite de detección bajo y un mayor rangodinámico; es más reproducible porque no seadquiere datos redundantes para el análisis yproporciona un cuantificación absoluta precisade los péptidos que se quieren validar.2. “Luces y sombras de la cuantificación coniTRAQ”María Luz Valero.Laboratorio de Proteómica. Centro deInvestigación Príncipe Felipe. Avda. Autopistadel Saler 16. 46012 Valencia.Durante esta presentación oral sediscutió el marcaje isobárico con iTRAQ. Pese aque este marcaje isobárico se lleva utilizandomás de seis años, las últimas publicaciones enrevistas especializadas apuntan a que haycaracterísticas intrínsecas de la cuantificaciónrelativa a este marcaje isobárico que se hanignorado durante todo este tiempo y se debentener en cuenta a la hora de analizar resultadosderivados de un experimento iTRAQ. Lacontribución de péptidos isobáricos a un mismoset de iones reporteros provoca que noaparezcan ratios grandes utilizando esta técnica(flatening effect). La mayoría de las proteínas endos muestras complejas a comparar están en unarelación 1:1 y al co-eluir los reporterosprovocan un descenso en el ratio total de lasproteínas que exhiben grandes cambios.Asimismo, el hecho de que los iones reporterosde baja intensidad en un marcaje 8-plex (119 y121) necesiten un número elevado de péptidospara poder lograr una cuantificación fiabledesfavorece la cuantificación de las muestrasmarcadas con estos tags. En esta brillanteexposición de la Dr. Luz-Valero repasamos estasy otras desventajas de este marcaje isobárico.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 373. “Evaluation of MS E based proteinquantification method”Kerman AloriaProteomics Core Facility-SGIker (ProteoRed).University of the Basque Country. 48940 Leioa.Dentro de las diferentes estrategias parael análisis cuantitativo de muestras biológicas,las técnicas label-free han emergido como unaalternativa prometedora a los métodos basadosen marcaje isotópicos. La innovadorametodología MS E o ―data independentacquisition‖ desarrollada por WatersCorporation fue uno de los temas tratados en lasesión que nos concierne. Como contraposiciónal DDA, en MS E no se selecciona un precursorpara su posterior fragmentación sino que seutilizan energías de colisión alternantes (alta ybaja energía) de modo que se fragmentan todoslos precursores en un determinado tiempo deretención. Una sola carrera nos daráinformación exacta de la masa del precursor ysus fragmentos que serán utilizados para suidentificación, además de medir la intensidaddel precursor, dato que será utilizado para lacuantificación relativa entre proteínas presentesen dos muestras a comparar. Dicha metodologíase evaluó en una muestra conocida;posteriormente se llevó a cabo la cuantificaciónrelativa de extractos totales de proteína delinfocitos salvajes frente a linfocitos E2F2 -/- .Los resultados obtenidos demuestran la robustezy reproducibilidad de la metodología MS E parala cuantificación relativa en muestras complejas.4. “Desarrollo de un Modelo EstadísticoUniversal para Proteómica CuantitativaMediante Marcaje Isotópico Estable”Marco Trevisan-Herraz.Laboratorio de Química de Proteínas yProteómica, Centro de Biología Molecular―Severo Ochoa‖ (CSIC-UAM), Madrid(CBMSO)La necesidad de desarrollar modelosestadísticos para el tratamiento de datos deexperimentos de proteómica cuantitativa basadaen marcaje isotópico es evidente. En ellaboratorio de J. Vázquez han desarrolladorecientemente un nuevo modelo estadísticojerárquico de efectos aleatorios para el análisisde los datos de expresión diferencial obtenidospor marcaje con 18 O/ 16 O y espectrometría demasas en trampa iónica lineal. Avanzando enesta dirección se ha abordado un proyectocooperativo a gran escala entre varios grupos deinvestigación con el objetivo de extrapolardicho modelo estadístico, de forma general, alos métodos de marcaje isotópico más comunes(SILAC y iTRAQ), y a otros espectrómetros demasas. Los resultados presentados mostraron lavalidez de forma universal del modeloestadístico jerárquico para todos los tipos demarcaje y todos los espectrómetros de masasutilizados, obteniéndose distribuciones quesuperan los test de normalidad a nivel demedida, a nivel de péptido y a nivel de proteína.Este modelo global ha sido implementado en laplataforma informática QuiXoT, en la que sehan desarrollado interfaces para la entrada dedatos obtenidos por diferentes motores debúsqueda, equipos y métodos de marcaje.5. ―Triple Quadrupole Mass Spectrometry-Based Peptide Assays Using Intelligent SRM(iSRM)”Madalina Oppermann.Thermo Fisher ScientificMadalina Oppermann, de un modoanálogo a Isidro Masana, nos presentó lasúltimas innovaciones de instrumentación ysoftware que ha desarrollado Thermo FisherScientific para el análisis cuantitativo depéptidos mediante triples cuadrupolos utilizandola metodología SRM (targeted proteomics) quetan prometedores resultados está generando.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 38Posters6. “iTRAQ-based quantitative analysis ofprotein mixtures with large fold change anddynamic range”Juan Casado-Vela 1 ; María José Martínez-Esteso 2 ; Eva Rodríguez 1 ; Eva Borrás 3 ; FelixElortza 1 and Roque Bru-Martínez 2.1 Proteomics Platform. CIC bioGUNE,CIBERehd, ProteoRed. Technology Park ofBizkaia, Building 800. Derio, Spain.2Grupo de Proteómica y Genómica Funcionalde Plantas. Departamento de Agroquímica yBioquímica. Facultad de Ciencias. Universidadde Alicante. Spain3Servicio Proteómica. Universidad PompeuFabra. Parc de Recerca Biomèdica deBarcelona. Dr. Aiguader 88. 08003 Barcelona,SpainDos muestras de cuatro y ocho proteínasson cuantitativamente evaluadas usando isobaricTags for Relative and Absolute Quantification(iTRAQ). En concordancia con lo descrito en lapresentación oral de la Dr. Luz-Valero sealcanza un fold range de 100 dependiendo delión reportero utilizado. También se describe laestrategia utilizada para analizar este estándar enun Orbitrap LTQ usando fragmentación de altaenergía de colisión (HCD).7. “Label-free Quantitative Approaches inCSF Biomarker Discovery”Alex Campos 1 , Jacques Borg 2 , Claudio Diema 3 ,Marta Vilaseca 3 , Eliandre Oliveira 11Proteomics Platform, Barcelona Science Park,Barcelona, Spain2Neurochemistry Lab, Faculty of Medicine,Saint Etienne, France3Mass Spectrometry Core Facility, Institute forResearch in Biomedicine, Barcelona, SpainMuestras de fluido cerebrospinal seutilizan para buscar biomarcadores deenfermedades neurodegenerativas. Estrategiasde inmunodepleción de las proteínas másabundantes, cromatografía multi-dimensional anivel de proteína y péptido y cuantificación librede marcaje (spectral counting method) secombinan en este trabajo.8. “A comparison of quantitative proteomicsmethodologies on a differential experimenton test samples”Joan Josep Bech-Serra, Núria Colomé, MartaMonge, Francesc Canals.Laboratori de Proteòmica, Programa de Recercaen Oncologia Mèdica. Institut de Recerca.Hospital Vall d’Hebron, BarcelonaCon el fin de valorar y contrastar elcomportamiento de diferentes métodos deproteómica cuantitativa, se prepararon ycompararon cuantitativamente dos muestrasestándares. Las muestras consistían en unamatriz de proteínas citoplasmáticas deEscherichia coli de complejidad media(alrededor de 100 proteínas), a la cual seañadieron 4 proteínas de mamífero en diferentescantidades, en rangos desde fmol a pmol pormicrogramo de proteína total. Los ratios de lasproteínas añadidas a la matriz entre las dosmuestras iban desde 1.5:1 a 5:1.Las mencionadas muestras se analizaronmediante diferentes metodologías:- 2D-DIGE (4 réplicas técnicas x 2D gel/muestra)- ICPL (a nivel de proteína y de péptido) (LC-MS)- iTRAQ 8-plex (LC-MALDI)- Label-free (cuatro carreras LC-MS de ladigestión tríptica de cada muestra; análisismediante el software Progenesis LC-MS)Los resultados de todos los métodosmencionados fueron evaluados a nivel dereproducibilidad y exactitud. Además tanto elcomportamiento y la robustez de cada uno delos métodos empleados fueron discutidos.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 39DiscusiónDos temas acapararon la mayor parte dela discusión de esta sesión de Proteómicacuantitativa: el marcaje isobárico con iTRAQ yla cuantificación label-free. Las desventajas ylimitaciones de iTRAQ comentadas en lapresentación de Luz Valero fueron discutidas enprofundidad. Además de lo mencionadoanteriormente, se discutió sobre la imposibilidadde diferenciar péptidos que proviene de distintasisoformas que se identifican como una únicaproteína.También se discutió sobre losrequerimientos principales para poder llevar acabo un experimento de cuantificación libre demarcaje con éxito, esto es, una cromatografíareproducible y resolutiva que permita solaparespectros de distintas muestras e instrumentosde alta precisión y amplio rango dinámico. Untema de debate generalizado tanto para usuariosde marcaje isotópico como para usuarios decuantificación libre de marcaje es la necesidadde desarrollar software libre que permitaintegrar datos obtenidos con instrumentos dedistintas casas comerciales.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 40Sesión de proteómica microbiana y de parásitosS.O.S., ¿nos podéis ayudar?1 Aida Pitarch, 2 Antonio Marcilla, 3 Ana Oleaga y 4 Manuel J. Rodríguez-Ortega1Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid eInstituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS)2Departamento de Biología Celular y Parasitología, Facultat de Farmàcia, Universitat de València3Laboratorio de Parasitología Animal, IRNASA, CSIC, Salamanca4Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Veterinaria, Universidad deCórdobaCon este título se inició la sesión 5 de lasII Jornadas Bienales de Jóvenes Investigadoresen Proteómica. A pesar de realizarse a primerahora de la mañana siguiente a la cena de lareunión, por cierto en un ambiente excelente,logramos una audiencia nutrida y participativa.El formato con el que planteamos la sesión fueinnovador: presentar los problemas proteómicosde jóvenes investigadores en el campo de lamicrobiología y parasitología, y esperar unarespuesta dinámica de los expertos presentes enla sesión. Desde luego el devenir de la sesión nodecepcionó, siendo la más participativa con 7comunicaciones orales y 16 en póster. Con estafórmula hemos salido de las presentacionesclásicas de resultados (que por cierto se puedenseguir en las respectivas publicaciones), y llegara la discusión de problemas en un ambientedistendido, refiriendo cada cual las dificultadescon las que se encuentra a diario. Creemos, nosin poca inmodestia, que esta sesión ha traídouna bocanada más de aire fresco a unas jornadasde por sí interesantes, ágiles y participativas. Yla guinda del pastel fue el reconocimiento porparte de la organización a dicho esfuerzoconcediéndonos el premio a la mejor sesión dedichas jornadas. Antes de nada muchísimasgracias al jurado y a Thermo Scientific,patrocinadora de dicho premio.1. Las enfermedades desatendidas, ¿tambiénen proteómica?Como introducción a la sesión, y paradespertarnos un poco (la conciencia, y tambiénde la resaca de la noche anterior), AntonioMarcilla nos introdujo en la problemática de lasenfermedades desatendidas, o tambiéndenominadas olvidadas. Hizo hincapié en queestas enfermedades definidas así por laOrganización Mundial de la Salud carecen deatención tanto en los medios de comunicacióncomo en la implementación de programas decontrol y en la dotación de fondos parainvestigación. Remarcó además que el que esténcausadas en su mayor parte por organismoshuérfanos (así se les denomina a aquéllos quecarecen de proyecto de secuenciación de sugenoma) hace aún más arduo y difícil suestudio, en especial el proteómico. Pensamosque los avances en ciencia y tecnología debentener como objetivo final ayudar a las personasa tener una vida mejor, y precisamente aquellosafectados por estas enfermedades desatendidasmerecen, si cabe, un mayor esfuerzo poraquéllos que disfrutamos de las ventajas de viviren el ―primer mundo‖. Es por ello que, unido anuestro interés investigador, encontramos lagratificación de poder ayudar a aquéllos quemás lo necesitan. En este cambio de época queestamos viviendo, los avances en la ciencia y latecnología deben disminuir la distancia entreambos mundos acercando a los países endesarrollo y haciendo posible su incorporaciónal progreso científico, económico y social.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 412. ¿Qué problemas se han abordado en lasesión de proteómica de microorganismos yparásitos?Tras despertar nuestras conciencias, lasesión continuó con una comunicación en la quese introdujo uno de los problemas más comunesen el estudio proteómico de estosmicroorganismos y parásitos huérfanos. Ésta fueseguida de tres grandes bloques decomunicaciones en los que se abordaron losprincipales problemas relacionados con elanálisis proteómico de bacterias, hongos yparásitos. Todos ellos se detallan a continuacióny se resumen en la Tabla 1.Tema Problemas proteómicos abordados Posibles soluciones o sugerencias propuestasAspectos generalesProteómica debacteriasProteómicade hongosProteómicade parásitosdeplantasdehumanosdeprotozoos- Escasez de secuencias en las bases dedatos para microorganismos y parásitos.- Espectros de fragmentación de pésimacalidad y mala asignación de los mismos asecuencias peptídicas.- Identificación de glicoproteínas desuperficie bacterianas.- Eliminación de contaminantes (azúcares,ADN,…) que puedan interferir en lacaptura selectiva de glicoproteínas.- Enfoque deficiente de proteínas en zonabásica de pH.- Herramientas bioinformáticas que aumenten elnumero de secuencias (ej. ESTs).- Guanidación de los residuos de lisina y sulfonaciónN-terminal de péptidos.- Empleo de resinas de afinidad específicas para lacaptura de las mismas a través de sus residuossacarídicos.- Diálisis, ultrafiltración (para azúcares y ADN),precipitación selectiva de ADN y/o digestión connucleasas.- Empapar los papeles que se colocan sobre loselectrodos con tampón urea/tiourea- Empleo de DeStreak como reductor en elisoelectroenfoque.- Baja presencia de proteínas de - Uso de ASB-14 en el tampón de rehidratación.membrana en los geles bidimensionales.- Fenómeno de ―lágrimas‖ en- Debido a la eliminación del SDS en la segundadeterminadas zonas del gel.dimensión.- Contaminación por ADN. - Aumento del tiempo e intensidad de sonicación parala extracción de proteínas.- Variabilidad analítica y biológica entreréplicas independientes.- Extracción de la relevancia biológica apartir de listas de proteínas.- Obtención de extractos proteicos dehongos filamentosos.- Normalización de muestras con diferentecantidad de proteína en el control y en elproblema para analizar mediante iTRAQ.- Contaminación con proteínas de la líneacelular hospedadora en estudios deinteracción parásito-hospedador.- Contaminación con proteínas de otrasorganelas en estudios de fraccionamientosubcelular.- Contaminación con proteínas de otrosestadios invasivos del parásito(especialmente con taquizoítos).- Extrapolación de manchas proteicasentre geles bidimensionales al variarcondiciones (ej., geles analíticos vs.preparativos, IPGs de rango amplio vs.estrecho,…).- Valor estadístico de la abundanciarelativa de una proteína al comparardiferentes condiciones mediante 2D-- Bases de datos cuyas anotaciones sonincompletas o se actualizan cada pocotiempo.- Escasez de información en las bases dededatos.nematodos- Uso de técnicas microbiológicas más reproducibles, yde cepas monoconidiales y/o de la misma generación.- Transformación raíz cúbica de los datos.- Empleo de diferentes herramientas bioinformáticas.- Modificación de protocolos de extracción deproteínas.- Igualar el número de células de partida en todos loscasos y resuspender en el mismo volumen final antesde marcar con iTRAQ.- Igualar la concentración de las muestras antes demarcar con iTRAQ.NombreMaría Luz ValeroAlfonso OlayaMario FerrerNavarroFrancisco JavierFernández Acero- Uso de columnas desaladoras. Virginia MarugánHernández- Empleo de gradientes de sacarosa yultracentrifugación.- Uso de otros protocolos de fraccionamiento.- Realizar estudios posteriores de validación de lossubproteomas obtenidos.- Desarrollo de una nueva metodología para purificar yaislar los bradizoítos de los taquizoítos de N. caninum.- Comparar el (sub)proteoma de la mezcla de zoítos(taquizoíto y bradizoíto) con el de los taquizoítos solos.- Identificar solamente aquellas manchas que secorrelacionen correctamente (mediante asignaciónautomática y posterior revisión manual).- Optimizar la técnica.- Utilizar una relación constante con significadobiológico para comparar abundancia proteica.- Revisar cada cierto tiempo las identificacionesobtenidas para determinar si han variado lasanotaciones previas debido a la actualización de lasmismas.- Buscar en la Web el mayor número posible de basesde datos con información útil y volcar en ellas losresultados.PonenteAfiliaciónLaboratorio de Proteómica,Centro de InvestigaciónPríncipe Felipe, Valencia.Dpto. de Bioquímica yBiología Molecular,Universidad de Córdoba.Institut de Biotecnología i deBiomedicina (IBB),Universitat Autònoma deBarcelona.Laboratorio de Microbiología,Facultad de Ciencias del Mary Ambientales, Universidad deCádiz.Jose Antonio Reales Dpto. Microbiología II,Calderón Facultad de Farmacia,Universidad Complutense deMadrid.Javier GonzálezMiguelSALUVET, Dpto. SanidadAnimal, Facultad deVeterinaria, UniversidadComplutense de Madrid.Laboratorio de Parasitología,Facultad de Farmacia,Universidad de Salamanca.Tabla 1. Resumen de los principales problemas proteómicos abordados en la sesión de microorganismos y parásitos,así como de las posibles soluciones o sugerencias propuestas.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 422.1. Aspectos generales.María Luz Valero nos introdujo en laproblemática de los estudios proteómicos conorganismos ―raros‖, como ella misma lesdenominó. María Luz nos expuso que losmétodos actuales de identificación de proteínasse basan generalmente en la comparación de lainformación de MS (o MS/MS) obtenida con lainformación de secuencias de proteínas queexiste en diferentes bases de datos.Precisamente, éstas son uno de los ―cuellos debotella‖ de dichos estudios. Así por ejemplo,aunque la base de datos del NCBI cuenta conaproximadamente 8.500.000 secuencias, notodos los organismos están representados porigual. Así, de ellas, 508.911 son de proteínashumanas y 110.313 de rata. Pero el número esconsiderablemente menor para otros organismosde gran interés como parásitos (como ejemplo54.542 entradas para helmintos trematodos). Espor ello necesario en muchos casos recurrir a lasecuenciación de novo, la cual requiere deespectros de MS/MS de gran calidad, siendoademás costosa tanto en cantidad de muestracomo en el tiempo de análisis, por lo que suaplicabilidad es limitada.2.2. Proteómica de bacterias.Alfonso Olaya nos mostró su trabajoacerca de los problemas para identificarglicoproteínas en bacterias. Hasta hace muypoco, se pensaba que los procariotas nopresentaban este tipo de modificaciónpostraduccional. Sin embargo, se ha demostradola existencia de proteínas glicosiladas tanto enarqueas como en bacterias Gram-negativas yGram-positivas. En los procariotas, lasglicoproteínas son casi sin excepción proteínasligadas a la superficie o secretadas al exterior,por lo que, en el estudio de organismospatógenos, a priori son buenos candidatos paranuevas vacunas. Alfonso nos mostró el abordajeplanteado para la identificación proteómica deestas moléculas, consistente en el empleo de trestipos de cromatografía de afinidad: (i) la basadaen la química de la hidrazida, mediante la cuallos grupos cis-diol de los residuos de azúcaresde las glicoproteínas, tras ser oxidadosirreversiblemente con peryodato, reaccionan condicho grupo hidrazida formando un enlacecovalente hidrazona; (ii) la de las lectinas,proteínas que reconocen específicamenteresiduos monosacarídicos u oligosacarídicosunidos a proteínas; y (iii) la del ácidoaminofenilborónico (APBA), mediante la cualdicho grupo forma un enlace covalentereversible de tipo diéster con los cis-dioles delos azúcares (Figura 1). Dicho enlace se puederevertir, liberando por tanto el ligando, yaumentando el pH. Los dos primeros tipospueden usarse asimismo para la detección engeles. Los resultados preliminares en loseluidos, tras digerir en solución con tripsina,evidenciaron una gran cantidad de proteínascitoplasmáticas identificadas por LC-MS/MS, locual en principio no era lo esperado, indicandoasí una posible inespecificidad de las técnicastal y como habían sido usadas. La presentaciónde Mario Ferrer Navarro recibió el premio a lamejor comunicación oral individual, haciendoque sobre esta sesión recayeran todos loshonores de la presente edición de las Jornadas.Mario nos habló acerca de la utilidad de laproteómica para diferenciar entre distintosaislados clínicos de una bacteria Gram-negativa,Stenotrophomonas maltophilia, asociada a unaincidencia creciente de infeccionesnosocomiales en pacientes inmunodeprimidos.La caracterización y diferenciación de estirpesde una determinada especie puede llevarse acabo mediante pruebas microbiológicas ybioquímicas, tales como ensayos de motilidad,sensibilidad a sueros humanos, capacidad deformación de biofilms o de adhesión celular. Sinembargo, estas pruebas no siempre danresultados claramente diferenciadores. Ladistinción entre estirpes puede abordarsetambién desde el punto de vista proteómico,caracterizando el proteoma de la bacteria. Paraello, realizó una extracción de proteína total(con presencia de ASB-14 en el tampón derehidratación, para maximizar la presencia deproteínas de membrana) con el fin de resolverlamediante DIGE. En los primeros intentos, setopó con el problema de un enfoque nodemasiado eficiente tras realizar la primeradimensión en tiras de intervalo de pH 3-10: lazona de pH básico estaba mal enfocada ycontaba en general con pocas proteínas.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 43Figura 1. Diferentes aproximaciones para identificar glicoproteínas de superficie celular o secretadas al exterior enprocariotas mediante cromatografía de afinidad. APBA, ácido aminofenilborónico.Además, la eliminación del SDS en lasegunda dimensión conllevó que endeterminadas zonas del gel, apareciera elfenómeno de ―lágrimas‖. Sugirió que estotambién podría estar ligado a la presencia dedemasiado ADN como contaminante. Laspruebas fueron entonces encaminadas a resolverestos problemas.2.3. Proteómica de hongos.Tras la exposición de algunos de losprincipales escollos encontrados en laproteómica bacteriana, Francisco JavierFernández Acero nos introdujo en el estudioproteómico de hongos fitopatógenos,especialmente el del hongo filamentoso Botrytiscinerea, indicando los problemas más relevantesque se pueden hallar. Destacó entre ellos (i) lagran variabilidad analítica y biológica existenteentre replicas independientes; (ii) la extracciónde la relevancia biológica a partir de la graninformación generada en estudios de abundanciadiferencial (donde se forjan grandes listas deproteínas) sin aplicar un prisma sesgado, puestoque se puede correr el riesgo de perder lainformación relativa a otros procesos biológicosy/o funciones moleculares paralelos yposiblemente de gran importancia; (iii) la faltade bases de datos de proteínas para hongosfilamentosos, a pesar de que en la actualidad seestán concluyendo unos 25 proyectos desecuenciación de genomas fúngicos, y (iv) ladificultad de obtener extractos proteicos dehongos filamentosos, debido principalmente alas características fisicoquímicas de la paredcelular (alto porcentaje de polisacáridos yelevada resistencia mecánica, entre otros).

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 44Jose Antonio Reales Calderón nosmostró su trabajo sobre el análisis deabundancia diferencial de proteínas delcitoesqueleto del macrófago tras su interaccióncon Candida albicans, el principal agenteetiológico de las candidiasis humanas. Suestudio es de gran interés ya que la fagocitosisconlleva alteraciones substanciales en elcitoesqueleto de actina, tubulina y miosina y delas proteínas asociadas a ellas. Jose Antonio nospresentó un método específico para extraerdicho subproteoma y los problemas asociados almismo. Destacó entre ellos el aumentosignificativo de la cantidad de proteína tras lainteracción en comparación con el control(Figura 2).Figura 2. Gel de poliacrilamida de muestrasenriquecidas en proteínas de citoesqueleto de macrófago.Cnt: macrófagos control; Int: macrófagos tras suinteracción con el hongo C.albican.Indicó que esta peculiaridad dificultaconsiderablemente la normalización de lasmuestras a analizar mediante la técnicacuantitativa sin gel ―iTRAQ‖ (isobaric tag forrelative and absolute quantitation), donde seiguala la concentración de las muestras antes demarcar. Nos planteó que si las muestras seigualasen de este modo, podría acarrear unproblema serio, o al menos cierta incertidumbre,ya que se aumentaría las concentraciones de lasproteínas de la muestra de macrófagos control,modificando los resultados del análisis deabundancia diferencial, y por tanto la fiabilidady consistencia del experimento proteómico.2.4. Proteómica de parásitos.Virginia Marugán Hernández nospresentó varios problemas proteómicosrelacionados con la identificación de proteínasde Neospora caninum implicadas en invasión yvirulencia como posibles nuevas dianasdiagnósticas y/o vacunales. N.caninum, unprotozoo intracelular obligado, es el agenteetiológico de la neosporosis bovina, una de lasprincipales causas de fallo reproductivo (aborto)en el ganado bovino. Entre los problemas queplanteó, asociados a la obtención de muestra,despuntan principalmente posiblescontaminaciones: (i) con proteínas de la líneacelular hospedadora en estudios de interacciónparásito-hospedador; (ii) con proteínas de otrasorganelas en experimentos de fraccionamientosubcelular (para el estudio de organelasimplicadas en invasión-proliferación) y (iii) conproteínas de diferentes estadios invasivos delparásito en el ganado bovino, el de taquizoíto(forma de la fase aguda de la infección y derápida multiplicación) y el de bradizoíto (formade persistencia, acantonamiento y evasión delsistema inmunitario) (Figura 3). Por otro lado,entre los problemas relacionados con laidentificación de proteínas que expuso,destacan: (i) la dificultad de extrapolar manchasproteicas entre geles bidimensionales analíticosy preparativos o entre aquéllos que utilizan tirasde gradiente de pH inmovilizado de rangoamplio y estrecho; (ii) el conflicto de determinarcuál es la relación que se debería establecer paraconsiderar la abundancia de una proteínasignificativamente diferencial cuando secomparan distintas condiciones mediante 2D-DIGE y (iii) el problema asociado a las bases dedatos cuyas anotaciones no son completas y quese van actualizando cada muy poco tiempo,modificándose en ciertas ocasiones lasanotaciones previas.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 45Figura 3. Diferentes estadios de invasión del protozoo N.caninum en el ganado bovino.Javier González Miguel nos expuso sutrabajo sobre el estudio de las relacionesparásito-hospedador en la dirofilariosis animal yhumana. Dirofilaria immitis es un nematodoparásito causante de la dirofilariosiscardiopulmonar canina y felina y de ladirofilariosis pulmonar humana. Señala que lainmunoproteómica clásica (la combinación deelectroforesis bidimensional, western blot yespectrometría de masas) es una herramientamuy útil para poder conocer las basesmoleculares de los procesos patológicos quecausa este parásito en cada uno de loshospedadores (Figura 4).Señaló las siguientes ventajas de lastécnicas empleadas: (i)proporcionan una ampliainformación en, relativamente, poco tiempo, (ii)son técnicas reproducibles y (iii) no han sidomuy utilizadas en el campo de las filarias. Losinconvenientes o problemas que encuentra son:(i) poca información en las bases de datos sobrelas proteínas de D. immitis, (ii) alto coste delproceso de identificación proteica porespectrometría de masas, y (iii) se genera unagran cantidad de información que precisa demucho tiempo para ser correctamenterelacionada.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 46Figura 4. Distintos patrones bidimensionales de proteínas inmunogénicas del nematodo D.immitis reconocidos por susdiferentes hospedadores (perro, gato y ser humano).3. ¿Qué posibles soluciones o sugerencias sehan propuesto durante esta sesión?En todas las comunicaciones que se hanseñalado anteriormente se propusieronsoluciones o sugerencias durante nuestra sesión,bien por parte de los mismos ponentes o bienpor parte de los más instruidos presentes en lamisma, que a continuación se detallanbrevemente y se recopilan en la Tabla 1.3.1. Aspectos generales.María Luz no quiso pecar de pesimista,aun a sabiendas que hay pocas estrategias que seestán aplicando en la actualidad en el caso dedisponer sólo de información parcial de MS yMS/MS. Nos señaló que en algunos casospueden utilizarse herramientas químicas para lamejora de los espectros de MS/MS. En estecontexto presentó como ejemplo el resultado deprocesos de guanidación y sulfonación quelogran aumentar la señal de los péptidos ymejorar los espectros de fragmentaciónobtenidos consiguiéndose una mejor asignacióna secuencia, respectivamente (Figura 5).

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 47Figura 5. Herramientas químicas para la mejora de losespectros de masas (MS y MS/MS). Análisis MALDI-TOF/TOF (MS-MS/MS) de un digerido de BSA encondiciones estándar (arriba) y con guanidación ysulfonación (SPITC) (abajo). La guanidación de losresiduos de lisina aumenta la intensidad de señal de estospéptidos. La sulfonación N-terminal de los péptidosmejora los espectros de fragmentación obtenidos,consiguiéndose una mejor asignación a secuencia.Asimismo, y como posibles soluciones,también se están desarrollando herramientasbioinformáticas, citando como ejemplo la quepresentó en las jornadas y que puede ayudar atraducir información de ESTs en secuenciasaminoacídicas (http:scsie.uv.es/bio/fastamgr).Información acerca de dicha herramienta se lepuede solicitar a ella misma (lvalero@cipf.es).3.2. Proteómica de bacterias.Alfonso respondió por sí mismo aalgunos de los problemas por él planteados. Conrespecto a la presencia de proteínascitoplasmáticas en las fracciones de elución delas cromatografías de afinidad, se lanzó lahipótesis de la competencia con otros azúcares(libres o asociados a otras estructuras) de lamisma muestra, por lo que se sugirió laconveniencia de eliminarlos. Para ello, sepueden usar métodos de diálisis o ultrafiltración.Con respecto a la aproximación basada en geles,la gran cantidad de ADN presente en muestrasbacterianas suele dificultar una óptimafocalización de las muestras en electroforesisbidimensional, por lo que se sugirió laeliminación de dicho material. Una formasimple es precipitar con ácido tricloroacético ocon kits comerciales de limpieza de muestras,pero la pérdida de proteínas es importante. Otraforma consiste en la digestión del ADN connucleasas, un método cómodo y rápido, peroque requiere la obtención de la muestra en untampón no desnaturalizante. Otra forma puedeconsistir en precipitar selectivamente el ADN,por ejemplo con espermina. Pero ésta, al ser unapoliamina, por tanto con carga, seríaincompatible para la separación medianteisoelectroenfoque, por lo que habría queeliminarla previamente (por ejemplo, dializandoo ultrafiltrando muy bien), añadiendo porconsiguiente un paso adicional en el proceso.Mario planteó las siguientes solucionesal problema de la menor calidad del enfoque endeterminadas zonas de los geles, principalmenteen la de pH básico: empapar los trocitos depapel que se colocan sobre los electrodos (en ellado básico) en tampón urea/tiourea; por otrolado, para mejorar el enfoque en la zona básica,usar DeStreak como agente reductor en elisoelectroenfoque (Figura 6). Para contribuir areducir la cantidad de ADN en la muestra,propuso aumentar la intensidad y el tiempo en lasonicación cuando se lleva a cabo la roturamecánica de las células para la extracción de lasproteínas. Con todo esto, logró aumentar lacalidad de los geles y por tanto el número deproteínas bien enfocadas en gelesbidimensionales en los que el intervalo de pH dela primera dimensión fue de 3 a 10. Tras llevar acabo un análisis DIGE entre la estirpe dereferencia ATCC 13637 y el aislado clínicoM30, logró determinar diferencias a nivel deabundancia de proteínas, concluyendo que laproteómica puede ser útil para la diferenciaciónde estirpes bacterianas. En su grupo, hanobtenido los mutantes para algunas de lasproteínas identificadas que se expresandiferencialmente, y están llevando a cabo lacaracterización de dichos mutantes.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 48Figura 6. Posibles soluciones y/o propuestas para la mejora de la resolución de los geles bidimensionales.3.3. Proteómica de hongos.Francisco Javier propuso algunassoluciones a los problemas que presentó.Sugirió que para disminuir la variabilidadanalítica y biológica entre replicasindependientes se podrían usar protocolos y/otécnicas microbiológicas más reproducibles asícomo cepas monoconidiales y/o de la mismageneración, entre otras. También se planteóposteriormente, como un posible recurso, latransformación raíz cúbica de los datos paradisminuir la variabilidad entre las intensidadesobtenidas con manchas proteicas de grantamaño. Respecto a la relevancia biológica delas proteínas identificadas en estudiosproteómicos, Francisco Javier nos comentó quePANTHER (―Protein ANalysis THroughEvolutionary Relationships”, disponible enwww.pantherdb.org) es una herramienta útilpara clasificarlas en función de los procesosbiológicos y funciones moleculares en las queestán implicadas siguiendo las anotaciones de―Gene Ontology‖ (Figura 7). Además indicó queexisten algunos algoritmos disponibles paraidentificar posibles dianas terapéuticas a partirde estos datos proteómicos.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 49Figura 7. Extracción de relevancia biológica de una listade proteínas en base a las anotaciones de “GeneOntology”.El problema, o más bien elrompecabezas, que planteó Jose Antoniorecibió, como era de esperar, una respuestaactiva y esmerada por parte de los más versadospresentes en la sesión, creando una granpolémica al florecer dos tendencias bastantediferenciadas. Una de éstas se basóprincipalmente en igualar el número de célulasde partida en todos los casos y resuspender en elmismo volumen final antes de marcar con losreactivos de iTRAQ. En cambio, la otra sedecantó en igualar la concentración de lasmuestras antes de marcar, como es propio dedicha técnica. Ante esta dualidad y sin llegar aun consenso definitivo, se comentó finalmenteque para determinar cuál de ellas era más viable,se debería abordar el problema con ambasopciones, y decidir posteriormente con losresultados obtenidos la fiabilidad de ambas.3.4. Proteómica de parásitos.Respecto a los problemas que expusoVirginia, se indicó que para eliminar posiblescontaminaciones con proteínas propias de lascélulas hospedadoras se podían emplearcolumnas desaladoras. Este abordaje da buenosresultados, ya que se identifican muy pocasproteínas de la línea hospedadora. También seseñaló que los gradientes de sacarosa seguidosde ultracentrifugación son una buenaherramienta para el enriquecimiento deorganelas, pero que son necesarios poner apunto otros protocolos de fraccionamiento asícomo realizar apropiados estudios de validaciónde los subproteomas obtenidos. Aunque sepropuso desarrollar una nueva metodología paraaislar o purificar los bradizoítos de lostaquizoítos de N.caninum, también se barajó laposibilidad de trabajar con mezclas de zoítos ycomparar el (sub)proteoma de éstas con el delos taquizoítos solos. En cuanto a los problemasen la identificación de proteínas difíciles deextrapolar entre geles, se sugirió que se deberíanidentificar solamente aquéllas que fuesenseguras o, más bien, optimizar la técnica.También se insinuó que se debería utilizar unarelación constante con significado biológicopara comparar abundancia proteica mediante latécnica de 2D-DIGE con el fin de alcanzarresultados consistentes. Por último, se apuntóque se debería revisar cada cierto tiempo lasidentificaciones llevadas a cabo con bases dedatos cuyas anotaciones no son completas, conel objetivo de determinar si se han variado lasanotaciones previas debido a la actualización delas mismas.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 50En relación con los problemas queseñaló Javier se le comentó que parte de ellosson problemas inherentes a la propia técnica.Con respecto a la escasez de información en lasbases de datos (tema abordado por María Luz),se volvió a matizar que es un problema muycomún en los parásitos ya que la mayor parte desus genomas no están secuenciados. Otroaspecto que se comentó es que la información segenera a una gran velocidad, pero sin embargola capacidad para organizarla es mucho máslenta. Puede estar dispersa por lo que esimportante seleccionar adecuadamente las basesde datos en las que se vuelcan los resultados.4. Una sesión innovadora pero susceptible demejoras.Aunque durante el transcurso de nuestrasesión se abordaron varios problemasproteómicos y posibles soluciones que podríanser de interés para cualquier joven (o no tanjoven) investigador, una apuesta un tantoinnovadora en este tipo de jornadas, siempreeste tipo de eventos es susceptible, sin lugar adudas, de mejoras. Algo que se podría enmendarpara futuros eventos sería disponer de mástiempo para que se pudiesen dar más propuestasa los problemas que se presenten, lo cualprevisiblemente haría aún más dinámica, útil ypráctica la sesión. Nuevos formatos no tendríansentido si no se promoviese el debate así comola búsqueda de nuevas ideas o soluciones a losproblemas proteómicos que se pudiesenplantear, que al fin y al cabo, son a los que losjóvenes investigadores (a quienes vanprincipalmente, pero no únicamente, dirigidasestas jornadas) se enfrentan día a día en supoyata de trabajo.Agradecimientos.Nuestra especial gratitud a ThermoScientific y al jurado por otorgarnos el premio ala mejor sesión de estas II Jornadas Bienales deJóvenes Investigadores en Proteómica. Tambiénagradecemos a los 23 jóvenes investigadoresque participaron en nuestra sesión, en especial aaquéllos que tuvieron la valentía de presentarsus problemas proteómicos durante esta sesión(M.L. Valero, A. Olaya, M. Ferrer Navarro, F.J.Fernández Acero, J.A. Reales Calderón, V.Marugán Hernández y J. González Miguel), asícomo a todos los que estuvieron presentes en lamisma por aportar soluciones y sugerencias, o almenos debatir los problemas que se presentaron.Además extendemos nuestra gratitud a estossiete ponentes por proporcionarnos materialpara la elaboración de las figuras de la presentecomunicación. Por último, pero no por esomenos importante, también expresamos nuestromás sincero agradecimiento a las organizadorasde estas jornadas, A.M. Maldonado Alconada, S.Echevarría Zomeño, R. González Fernández e I.Redondo, por su excelente labor realizada, asícomo a J. Vázquez, el catalizador de dichoevento.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 51Sesión de proteómica vegetal y animal1 Luis Valledor y 2 Federico Valverde1 EPIPHYSAGE. Área de Fisiología Vegetal. Universidad de Oviedo. Dirección actual: MolecularSystems Biology, Universidad de Viena, Viena, Austria2 Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. Consejo Superior de Investigaciones Científicas yUniversidad de Sevilla. Sevilla, EspañaResumenEl pasado mes de febrero se realizó enCórdoba la II Reunión Bianual de JóvenesInvestigadores en Proteómica a nivel nacional.La organización, encabezada por Ana M.Maldonado, acompañada de Sira Echevarría yRaquel González, nos encomendó la complicadatarea de recoger las propuestas de proteómicavegetal y animal y seleccionar las que mejor seadaptaran a una presentación oral. La tarea nofue fácil porque el nivel científico, como vienesiendo común en las dos reuniones celebradashasta ahora (la primera en Sitges, Barcelona), hasido muy alto. Este artículo de introducciónsirve por un lado como resumen explicativo deaquella sesión, que fue del todo satisfactoria encuanto a las presentaciones y la discusión, ytambién como muestra de lo que se estáinvestigando genéricamente en proteómicavegetal y animal en España en la actualidad.1. ¿Cómo planteamos la sesión?Cuando se analiza el título de la sesión,Proteómica Vegetal y Animal, puede llegarse apensar que se trata de un cajón de sastre. Nadamás lejano de la realidad, como podráobservarse a lo largo de este resumen. En estasesión se recogieron las comunicaciones de lostrabajos de Proteómica Vegetal y ProteómicaAnimal, incluyendo un gran número de especiesno modelo. Desde finales de diciembre loscoordinadores de la sesión empezaron a recibirprogresivamente los resúmenescorrespondientes a la sesión. La primera dudaque se planteó fue la organización de la sesión,dado lo heterogéneo de las propuestas. Trasmucho meditar y teniendo en cuenta el grannúmero de comunicaciones presentadas sedecidió plantear un formato consistente en 5exposiciones orales de 15 minutos, dejandosuficiente tiempo al final de cada presentaciónpara permitir una discusión fluida.La selección de trabajos para suexposición oral pretendió abarcar las distintasespecies animales y vegetales, recogiendodistintas aproximaciones experimentales ytécnicas empleadas para dar una visión deconjunto de lo que es hoy por hoy la ProteómicaAnimal y Vegetal en nuestro país. Seseleccionaron tres trabajos de ProteómicaVegetal y dos de Proteómica Animal para supresentación como comunicaciones orales,siendo estos números en cierto modoproporcionales a las comunicaciones recibidas.En la tabla 1 puede verse un resumen de lascomunicaciones presentadas en esta sesión. Lagran mayoría de las mismas tienen un nexocomún agronómico, tanto en su vertiente agrariacomo pecuaria. ¿Podríamos rebautizar estasesión como Proteómica de nuestros recursos decampo?Para respetar el espíritu de la Reunión,tras las presentaciones, al final de la sesión, seplanificó un tiempo abierto al intercambio deideas, planteamiento de dudas, etc., en la partefinal de la misma. Desde aquí queremosagradecer a todos la participación en la misma,puesto que se consiguió crear un ambienteameno a la discusión, pese al cansancioacumulado tras un intenso congreso.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 522. Desarrollo de la SesiónComunicaciones oralesLa sesión se desarrolló de formadistendida, aunque siempre atendiendo a larigurosidad de la reunión, gracias al buen hacerde todos los oradores, que no sólo brindaronunas magníficas presentaciones, sino queademás se ciñeron estrictamente al tiempoestablecido. ¡Gracias y enhorabuena a todos porel gran trabajo realizado!Marina Trigueros, del CNB-CSIC,inauguró la sesión mostrando la importancia quetienen ciertas ubiquitín ligasas en la homeostasisdel fosfato mediada por la ruta de ubiquitinacióny degradación del proteosoma [1]. Laubiquitinación no solo es una señal de marcajepara la degradación de proteínas vía proteosomasino que también está relacionada con laregulación de la actividad enzimática. Marinamostró los últimos resultados del grupo alanalizar el efecto que tiene el ayuno de fosfatoempleando una estrategia dirigida (análisis deubiquitín ligasas nucleares) como genérica(identificando proteínas reguladorasdependientes de la concentración de fosfato enel medio).Daniel Pérez-Hernández, CBMSO y delCNIC, nos presentó la investigación de su grupoacerca de las proteínas asociadas a tetraspaninaen los linfocitos T, empleando técnicasproteómicas de segunda generación [2]. Una delas ventajas de estas técnicas es la cantidad dedatos que se generan, pero a menudo resultandifíciles de explicar sin ser arduos en lapresentación. Daniel realizó una presentaciónclara, en la cual fue desgranando los distintospasos del desarrollo experimental así como delprocesamiento de los datos basándose en unaaproximación de biología de sistemas, paramostrarnos las proteínas asociadas atetraspanina en los linfocitos T y las rutas en lasque se encuentran implicadas.Luis Valledor, de la Universidad deOviedo, mostró un trabajo sobre la expresióndiferencial de genes y proteínas durante lamaduración de las acículas del Pinus radiata[3]. El análisis cuantitativo realizado hapermitido definir cambios en los patrones deexpresión de genes y proteínas relacionadas condistintas rutas metabólicas y procesos (i.e.resistencia a estrés) que varían durante eldesarrollo de las acículas. Además estos datos secomplementaron con un primer estudio sobre laregulación epigenética de los genes quecodifican para algunas de las proteínasdiferencialmente acumuladas en acículas endistintos estados de desarrollo.Volviendo a la Proteómica Animal,Elizabeth Escudero, del Instituto deAgroquímica y Tecnología de los Alimentos(CSIC), presentó cómo el potencialantihipertensivo de la carne de cerdo puedeusarse como fuente de péptidos inhibidores de laEnzima Convertidora de Angiotensina I [4].Tras la simulación in vitro de la digestión decarne proveniente del músculo del cerdo lospéptidos generados se estudiaron mediante LC-ESI-MS/MS, seleccionando los más adecuadospara su síntesis y posterior estudio de sucapacidad inhibidora de la ECAI. Los resultadosmostrados acerca de la inhibición in vitro sonprometedores, a falta de trabajos in vivo que losconfirmen.La última presentación de la sesióncorrió a cargo de María José Martínez-Esteso,de la Universidad de Alicante, y su trabajodescribiendo el efecto del tratamiento foliar conTerra-Sorb® (un bio-estimulador comercial delcrecimiento) sobre las hojas en estado dedesarrollo de bandera en trigo [5]. Tras realizarun estudio de expresión diferencial de proteínasmediante metodología DIGE, María Josédestacó que los efectos fisiológicos descritospara este tratamiento se explicaban por cambiosespecíficos en el proteoma, sobre acumulándoseproteínas relacionadas con un aumento en lafijación de CO 2 , biosíntesis de proteínas ydisminuyendo las rutas de estrés oxidativo.Pese a ser la última sesión del congresocabe destacar el interés despertado por todas lascomunicaciones de la sesión, hecho que se vioreflejado en la activa participación de laaudiencia en los turnos de preguntas tras lasdistintas comunicaciones.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 53Discusión generalEn los últimos minutos de la sesión, trasla presentación de las comunicaciones en formade panel (Tabla 1) y la resolución de laspreguntas que habían surgido tras las distintaspresentaciones, que fueron numerosas, seplantearon algunos de los principales problemascon los que se encuentra todo investigador queempiece a trabajar en especies no modelo. Lapoca representación en las bases de datos, ladificultad en la puesta a punto de protocolos, enmuchos casos imposibilidad de obteneranticuerpos específicos, arrays, chips, etc.comerciales… La dificultad de dar el salto al―high throughput‖ debido a la falta deherramientas comerciales y poca profundidad delas bases de datos fueron los temas ―estrella‖.Pocas soluciones se pudieron aportar alrespecto, si bien se presentaron algunasalternativas menos potentes pero accesibles a lamayoría de los investigadores (i.e. arrays debaja densidad) y alguna otra basada en losnuevos desarrollos de las ómicas (i.e.realización de pirosecuenciaciones de ADN dela especie problema y anotación por homologíascomo base para la posterior identificación deproteínas). Esto resulta probablementeinaccesible, tanto en términos técnicos yhumanos como económicos, para la mayoría delos investigadores de las sesión.La presentación de estos problemascomunes animó a la sesión y sirvió para plantearproblemas e inquietudes particulares. Laspersonas más experimentadas aportaron sugranito de arena, contando experienciaspersonales, tanto de éxitos como de fracasos,propiciando que numerosos jóvenesinvestigadores pudieran volver a la poyata detrabajo con nuevas ideas y puntos de vista. ¡Esuna experiencia enriquecedora ver a todo unauditorio aportando experiencia e ideas paraayudar a un colega!congresistas fue muy fluida y agradable,planteándose (y resolviéndose) muchas dudas einquietudes. Como ya se comentó la calidad delos trabajos recibidos fue muy alta y resultaríainjusto no mostrar en este resumen algunos deellos:Cabe destacar el trabajo presentado porMarina Ribeiro-Pedro, del Instituto deBioquímica Vegetal y Fotosíntesis (CSIC-Univ.Sevilla), en el cual combinando transcriptómicay Proteómica nuclear de factores detranscripción inducidos por la presencia deazúcares se describió la relación existente entreel metabolismo y el desarrollo floral enArabidopsis [6]. Estos estudios han desveladocómo proteínas que tienen que ver con procesosde desarrollo como la floración, están reguladastambién mediante una señal dependiente de lapresencia de sacarosa. Como gran parte de estaregulación ocurre a nivel postranscripcional [7]este tipo de aproximaciones proteómicas tienenun gran potencial para aportar datos inéditos a lafloración. Virginia Menéndez (Universidad deOviedo), presentó un estudio del desarrollosexual mediado por anteridiógeno en elgametófito de Blechnum spicant [8], siendo estalínea de trabajo pionera dentro del estudio de loshelechos.En el campo de la proteómica aplicadaMiguel Ángel Sentandréu (IATA-CSIC) nospresentó la aplicación de las técnicasproteómicas para determinar los distintosorígenes animales de los productos cárnicos [9].Por su parte, María Ángeles Castillejo (IAS-CSIC) presentó un trabajo sobre la expresióndiferencial de proteínas en hojas de alfalfa comorespuesta al fitopatógeno Uromyces striatus[10], mientras que José Valero (Universidad deCórdoba) presentó un estudio de respuesta alestrés hídrico comparando distintas poblacionesde encinas [11]. Ambos trabajos muestran ungran potencial en ayudar a mejorar la gestiónagronómica de nuestro campo.Los panelesNo debe olvidarse que además de lascomunicaciones orales la sesión contó con untiempo para la visita de los paneles. Duranteeste tiempo la comunicación entre los distintos

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 543. ConclusionesEl gran número y la calidad de lostrabajos de Proteómica Vegetal y Animal enespecies ―no modelo‖ presentados en estecongreso (recogidos no sólo en esta sesión),pone de manifiesto el gran potencial que tieneeste área en nuestro país. Existe un gran númerode investigadores trabajando en proteómicatanto desde una perspectiva básica comoaplicada. Los habituales de los Congresos de lasdistintas Sociedades Científicas Españolasrelacionadas con esta sesión (de FisiologíaVegetal, de Medicina Interna Veterinaria,…)sabrán que el número de trabajos científicosdesarrollados en España por jóvenes, y no tanjóvenes, investigadores en los que la proteómicaes una pieza clave es cada vez mayor. Desdeaquí estamos convencidos que a medida que laSEPROT vaya creciendo, y las bondades deestas Jornadas de Jóvenes Investigadores sedifundan entre las distintas SociedadesCientíficas (cosa que desde aquí animamos!), elnúmero de comunicaciones recibidas para estasesión aumentará significativamente. Estehecho, junto con el progresivo aumento delnivel científico de nuestros jóvenes,garantizarán sin duda la continuidad de estasesión de Proteómica Vegetal y Animal.4. Referencias[1] Trigueros M, et al. Ubiquitinación deproteínas nucleares en la señalización delayuno de fosfato en plantas. Proteómica2010; 5: 149.[2] Pérez-Hernández D, et al. High-throughputbiological and functional analisys ofinteractions among tetraspaninassociated proteins in T Limphocytesusing second generation proteomicstechniques. Proteómica 2010, 5: 167.[3] Valledor L, et al. Proteome regulation andepigenetic code during Pinus radiataneedle maturation. Proteómica 2010, 5:153.[4] Escudero E, et al. Péptidos inhibidores de laEnzima Convertidora de Angiotensina Igenerados en la digestión in vitro de lacarne de cerdo. Proteómica 2010, 5:172.[5] Martínez-Esteso M-J, et al. A DIGEproteomic analysis of wheat flag leaftreated with TERRA-SORB® foliar, afree amino acid-based biostimulatior.Proteómica 2010, 5: 164.[6] Ribeiro-Pedro M., et al. El estudiocomparativo, proteómico ytranscriptómico, de la respuesta aazúcares en Arabidosis thaliana muestrauna relación entre el metabolismo y eldesarrollo floral. Proteómica 2010 5:162.[7] Valverde F et al. Photoreceptor regulation ofCONSTANS protein in photoperiodicflowering. Science 2004, 303: 1003-1006.[8] Menendez V, et al. Análisis proteómico deldesarrollo sexual mediado poranteridiógeno en el gametofito delhelecho Blechnum spicant. Proteómica2010, 152.[9] Sentandreu, MA, et al. La Proteómica comovía para determinar el origen animal delos productos cárnicos, Proteómica 2010,170.[10] Castillejo MA, et al. Proteome profileanalysis of Medicago truncatula leavesin response to Uromyces striatus-Proteómica 2010, 150.[11] Valero-Galván, J, et al. Estudio de larespuesta al estrés hídrico en dospoblaciones de encina (Quercus ilexsubsp. ballota (Desf.) Samp.) medianteuna aproximación de proteómicacomparativa basada en electroforesisbidimensional. Proteómica 2010, 156.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 55Tabla 1: Resumen de las comunicaciones presentadas a la sesión Proteómica Vegetal y AnimalTítulo Autores AfiliaciónUbiquitinación de proteínasnucleares en la señalización delayuno de fosfato en plantasHigh-throughput biological andfunctional analisys of interactionsamong tetraspanin associatedproteins in T Limphocytes usingsecond generation proteomicstechniquesMarina Trigueros, M. Rojas-Triana,M L Irigoyen, J Paz-Ares y V RubioDaniel Pérez-Hernández 1,2 , EBonzón-Kulichenko 1 , P Martínez-Acedo 1 , P J. Navarro 1 , E Núñez 1 , MTrevisan-Herraz 1 , et al.Departamento de Genética Molecularde Plantas. Centro Nacional deBiotecnología-CSIC.1 Laboratorio de Química deProteínas y Proteómica, CBMSO2 Hospital Univ. La Princesa y CentroNacional de InvestigacionesCardiovasculares CNICProteome profile analysis ofMedicago truncatula leaves inresponse to Uromyces striatusAnálisis proteómico del desarrollosexual mediado por anteridiógenoen el gametofito del helechoBlechnum spicantMª Ángeles Castillejo 1 , J V Jorrín 2 & 1 Departamento de Agronomía yD Rubiales 1 Mejora, IAS (CSIC), Córdoba2 Departamento de Bioquímica yBiología Molecular, ETSIAM,Universidad de CórdobaVirginia Menéndez 1 , L Valledor 1 , ARevilla 1 , H Fernández 1 1 Area de Fisiología Vegetal,Departamento B.O.S. Facultad deBiología. Universidad de OviedoProteome regulation and epigeneticcode during Pinus radiata needlematurationLuis Valledor 1 , M J Cañal 1 , C Lenz 3 ,R Rodríguez 1 , J Jorrín 31 Plant Physiology. University ofOviedo. 2 Applied BiosystemsDeutschland. 3 Biochemistry andMolecular Biology. University ofCórdoba.La Proteómica como vía paradeterminar el origen animal de losproductos cárnicosMiguel Ángel Sentandreu 1 , P D. 1 Instituto de Agroquímica yFraser 2 , E Sentandreu 1 , L Mora 1 y P Tecnología de Alimentos (CSIC).M. Bramley 2 2 Center for Systems and SyntheticBiology, School of BiologicalSciences, University of London.Estudio de la respuesta al estréshídrico en dos poblaciones deencina (Quercus ilex subsp. ballota(Desf.) Samp.) mediante unaaproximación de proteómicacomparativa basada enelectroforesis bidimensionalUse of ProteoMiner in VeterinaryResearchJosé Valero Galván 1 , R M NavarroCerrillo 2 , M C Romero Rodríguez 1 ,D Ariza 2 , J Jorrín Novo 1Anna Marco, G Rovira, A Bassols1 Grupo de Bioquímica, ProteómicaVegetal y Agrícola. Departamento deBioquímica y Biología Molecular.Universidad de Córdoba.2 Departamento de IngenieríaForestal. ETSIAM, Universidad deCórdoba.Dpto. de Bioquímica i BiologiaMolecular. Facultat de Veterinària.Universitat Autònoma de Barcelona.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 56Desarrollo y optimización delproceso de extracción de proteínasy electroforesis bidimensional enfruta de huesoPéptidos inhibidores de la EnzimaConvertidora de Angiotensina Igenerados en la digestión in vitrode la carne de cerdoEsther Giraldo Ramos 1 , A Díaz 1 Departamento de Vegetales II.Méndez, A García Sánchez 2 InstitutoTecnológicoAgroalimentario (INTAEX). 2 Centrode Investigación ―Finca La Orden-Valdesequera‖Elizabeth Escudero 1 , M A 1 Instituto de Agroquímica ySentandreu 1 , K Arihara 2 , F Toldrá 1 Tecnología de Alimentos (CSIC).2 Faculty of Animal Sciences, Schoolof Veterinary Medicine and AnimalSciences, Univ. of KitasatoPéptidos derivados de la troponinaT generados en jamón curadoEl estudio comparativo, proteómicoy transcriptómico, de la respuesta aazúcares en Arabidosis thalianamuestra una relación entre elmetabolismo y el desarrollo floralLeticia Mora, M A Sentandreu y FToldráMarina Ribeiro-Pedro, F EzzahraSaid, M T Ruiz, J M Romero y FValverdeInstituto de Agroquímica yTecnología de Alimentos (CSIC).Instituto de Bioquímica Vegetal yFotosíntesis. CSIC-Universidad deSevilla.A DIGE proteomic analysis ofwheat flag leaf treated withTERRA-SORB® foliar, a freeamino acid-based biostimulatorMaría José Martinez-Esteso 1 , MVilella-Antón 1 , S Sellés-Marchart 2 ,A Botta-Català 3 , R Piñol-Dastis 3 , RBru-Martinez 11 Grupo de Proteómica y GenómicaFuncional de Plantas. Dpto.Agroquimica y Bioquímica andIMEM Ramón Margalef, Univ. deAlicante. 2 Unidad de Genómica yProteómica 1 Grupo de Proteómica yGenómica Funcional de Plantas.Dpto. Agroquimica y Bioquímica andIMEM Ramón Margalef, Univ. deAlicante. 2 Unidad de Genómica yProteómica, SSTTI, Univ. deAlicante. 3 Dpto.I+D FisiologíaVegetal, BIOIBERICA, S.A.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 57ARTÍCULOS ORIGINALESLa membrana vitelina de embriones bovinos, un modelo experimental de interéspara estudios proteómicos. Análisis del perfil proteico mediante electroforesisbidimensional1,2* Álvaro Carlos Galdos-Riveros; 3 Ana Rita Toledo-Piza; 2 Durvanei Augusto Maria; 3 RonaldoZucatelli Mendonça; 1 Maria Angélica Miglino1 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de São Paulo. Universidade de São Paulo Brasil2 Laboratório de Bioquímica e Biofísica do Instituto Butantan, São Paulo Brasil3 Laboratório de Parasitologia e Entomologia do Instituto Butantan, São Paulo Brasil[1] Autor para correspondencia. E-mail: alvarogaldos@usp.brResumenEl saco vitelino es una de las membranasque desempeñan un papel importante en lasupervivencia inicial del embrión en muchasespecies de mamíferos, además de producirproteínas necesarias para su desarrollo. Sufunción es compleja, participando, entre otros,en la hematopoyesis y en la transferencia delmaterial materno como aminoácidos, vitaminasy proteínas. Estas proteínas controlan la mayoríade los procesos celulares que ocurren en grandiversidad durante el desarrollo embrionario,actuando como enzimas, anticuerpos, hormonas,componentes estructurales, receptores celularesy factores de crecimiento embrionario, En elpresente trabajo se aborda la puesta a punto deun protocolo de extracción de proteínas de lamembrana vitelina de embriones bovinos parasu posterior análisis por electroforesisbidimensional. Se han obtenido gelesbidimensionales de buena resolución, lo quefacilitará el posterior análisis por espectrometríade masas e identificación de proteínas, comoetapa previa a la caracterización biológica delsistema.Palabras clave: perfil proteico de membranavitelina, saco vitelino.IntroducciónEl saco vitelino está presente en todoslos mamíferos y desempeña un importante papelen el desarrollo embrionario. Sus funcionesestán siendo estudiadas y se ha demostrado queel saco vitelino o membrana vitelina es uno delos lugares iniciales de la hematopoyesisdurante el desarrollo embrionario [1-3]. Enroedores, el saco vitelino envuelve el sacogestacional y sirve como principal membranapara los intercambios materno-fetales durante lagestación [4]. Es capaz de sintetizar proteínasque son secretadas en los compartimientos intery extra embrionario y es utilizado confrecuencia como modelo experimental paraestudios en el área de embriología y toxicologíareproductiva [5-6].La expresión de los patrones de proteínaen células y tejidos es característica de sudesarrollo, fisiología o estado patológico. Deesta manera, es muy importante determinar losperfiles de expresión de estas proteínas y lasalteraciones que ocurren cuando se pasa de unestadio no-patológico a un estadio específico dela enfermedad.Existen evidencias considerables de queel papel funcional de una determinada proteínapuede depender fuertemente del tipo de célulaen la cual es expresa y en el estado de esa célula[7]. Las proteínas controlan la mayoría deprocesos celulares, los cuales ocurren en grandiversidad, pudiendo actuar como enzimas,anticuerpos, hormonas, componentesestructurales y receptores celulares [8].

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 58La identificación de las diferencias en laexpresión proteica es una de las áreas másimportantes de la proteómica. En los últimosaños, grandes esfuerzos han sido realizados enel desarrollo de nuevas metodologías para unmejor estudio y entendimiento de la química deproteínas de las diferentes muestras biológicasen estudio.El estudio de proteínas en amplia escalaes conocido como proteómica, asociadatradicionalmente con la exposición de un grannúmero de proteínas de un linaje celular uorganismo en geles bidimensionales depoliacrilamida [9-11].En el presente trabajo estudiaremos elestablecimiento de un protocolo de extracciónde proteínas de la membrana vitelina deembriones bovinos durante el primer trimestrede gestación. Teniendo conocimientos de lasfunciones vitelinas, podremos inferir que dichatécnica podrá ser determinante para definir a lasproteínas existentes en esta membrana,comparándolas con aquellas descritas en otrasespecies. Además, la presencia de proteínasdesconocidas podrá sugerir nuevas funcionespara la membrana vitelina y otros anejosembrionarios en órganos que son influenciadospor factores de crecimiento específicos deldesarrollo embrionario.1,5mL, suspendiéndose, para su lavado, entampón Tris-Cl 1.5 M, pH 8.8. Tras lacentrifugación a 12000 x g por 2 minutos, elpellet se eliminó y el sobrenadante se utilizópara el análisis electroforético.Material y métodosMaterial biológicoEl método utilizado esta descritoresumidamente en la figura 1. La recogida delos úteros bovinos normales fue realizada en losmataderos de la ciudad de São Jose dosCampos-SP y Poços de Caldas-MG. El embriónjunto con el saco vitelino (Figura 2), fueronretirados tras la incisión del útero y congeladosinmediatamente en nitrógeno líquido (N 2 ). Lossacos vitelinos de 23 y 37 días de gestaciónfueron homogeneizados mecánicamente deforma separada en tubos Eppendorf de 2mL enpresencia de nitrógeno liquido (N 2 ), y elhomogeneizado se pasó a tubos Eppendorf deFigura 1. Protocolo de separación de proteínas del sacovitelino de embriones bovinos por electroforesisbidimensional. Se detallan los pasos utilizados. Aquellospasos esenciales se encuentran en los cuadros de colornegro como moler en nitrógeno líquido y el uso deinhibidores de proteasas.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 59Figura 2. Desenvolvimiento embrionario y formación del saco vitelino de embriones bovinos, con edad gestacionalestimada de: A – 23 días, B – 29 días, C y D – 37 días, Em, embrión; sv, saco vitelino.Diseño experimentalElectroforesis bidimensionalLos lisados de saco vitelino fueronmantenidos a -20°C en 250µL de tampón derehidratación (Urea 7M, tiourea 2M, CHAPS4%, anfolitos 0.5%, DTT 0.3%, e inhibidor deproteasa 5µg/g) y sometidos a centrifugación a12000 x g por 5 minutos, el pellet se eliminó yel sobrenadante se pasó a un tubo Eppendorf de1,5mL. Se realizaron las cuantificaciones deproteínas totales de las muestras en losdiferentes estadios de gestación a fin deestandarizar la cantidad de proteínas totales parala aplicación en la electroforesis bidimensional.La determinación de la concentración proteicafue realizada por el método de Bradford [12].El isoelectroenfoque se realizo en elequipo Ettan IPGphor III (AmershamBiosciences), de acuerdo con las instruccionesdel fabricante, utilizando tiras con gradiente nolineal de pH inmovilizado 3-10 de 13cm (IPGstrips). Las tiras fueron rehidratadas con tampónde rehidratación por 12 horas conteniendo 60µgde proteína Las condiciones para laelectroforesis fueron: 500V, 1h, 1000V,1h,8000V, 4h. Tras el isoelectroenfoque, las tirasfueron retiradas y guardadas a -80ºC.La SDS-PAGE fue realizada con elmétodo de Laemmli [13] con pequeñasmodificaciones. Tras el isoelectroenfoque, lastiras fueron equilibradas en 15mL de tampón deequilibrado (0.05M de tampón Tris-HCL 1.5MpH 8.8, urea 6M, 30% de glicerol (99%) (v/v),2% de SDS (p/v)), individualmente en un tubo yse adiciono DTT (100mg/15mL) por 15 minutoscon agitación constante. Después se lava la tiracon tampón de electroforesis (Tris base 0.025M,glicina 0.192M, SDS 0.1% w/v) y se vuelve acolocar en un tubo adicionando iodoacetamida(375mg/15mL) por 15 minutos con agitaciónconstante. La tira fue lavada con tampón deelectroforesis, colocada en la parte superior delgel (12.5%), sellada con agarosa al 0.5%, y seañade tampón de electroforesis. La segundadimensión se realizó en el sistema

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 60electroforético Ruby SE600 (AmershamBiosciences/GE Healthcare), con una corrienteconstante de 15mA/gel por 15 minutos ydespués de 30mA/gel hasta que el frente de lamuestra llegue al final de gel.Los geles se tiñeron con Azul Brillantede Coomassie G-250 (Sigma-Aldrich). Losgeles fueron fijados en una soluciónconteniendo 3%(v/v) de acido fosfórico y50%(v/v) etanol durante toda la noche, despuésfueron lavados 3 veces con agua milli-Q por 5minutos y mantenidos por 1 día en la soluciónde tinción (0.1% p/v Azul Brillante deCoomassie G-250, 17% p/v de sulfato deamonio, 34% v/v de metanol, 3% v/v de acidofosfórico). Después fueron lavados con unadisolución al 1%(v/v) de acido acético hasta laeliminación del fondo.Tras la tinción de los geles, estos seescanearon en un sistema Image Scanner TM II(Amersham Biosciences) GE Healthcare enmodo de transferencia con una resolución de300 dpi y en formato bmp. Después fueronanalizadas las imágenes de los geles utilizandoel software Image Master TM II 2D Platinumversión 6.0 (Amersham Bioscience /GEHealthcare).de una muestra a otras y debe ser establecidopara cada caso en particular [14].El método descrito parece adecuado,tanto desde el punto de vista del rendimiento deproteínas (60µg), como del número de spotsdetectados en el gel (970 spots de proteína en elsaco vitelino bovino de edad estimada de 23días de gestación y 1230 spots de proteína en elsaco vitelino bovino de edad estimada de 37días de gestación, resolución y bajo ―streaking‖(Figura 3). Para ello la maceración connitrógeno líquido y la adición de inhibidores deproteasas fue clave (datos no mostrados) [14-16]. Las degradaciones de proteínas a través dela acción de proteasas darían un perfil proteicoen el que predominan péptidos de bajo pesomolecular, que no es el caso de nuestros geles(Figura 3).Resultados y discusiónEn este trabajo se presenta un protocolopara la realización de la electroforesisbidimensional de muestras proteicas obtenidasdel saco vitelino de embriones bovinos endiferentes periodos gestacionales. Los extractos,conteniendo 60µg de proteína se separaron entiras IPG de 3-10 como rango de pH. Tambiénse analizan las diferencias en abundancia a losdiferentes estadios, entre cada condición y seidentifican de proteínas diferencialmenteexpresas en las muestras.El establecimiento de un protocolo paraelectroforesis bidimensional 2D-PAGE esesencial para obtener buenos resultados enproteómica. El mejor método de extracción,precipitación y solubilización de proteínas variaFigura 3. Geles bidimensionales del saco vitelino deembriones bovinos. Proteínas fueron separadas en losdos periodos gestantes. A: gel bidimensional de sacovitelino de edad estimada de 23 días, B: gel bidimensionalde saco vitelino de edad estimada de 37 días, los dosteñidos con Azul de Coomassie G-250.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 61Figura 4. Geles bidimensionales del saco vitelino de embriones bovinos de edad estimada de 23 (G) y 37 (F) días. Ala derecha están representadas en 3D las regiones G y F que contienen los spots que presentaron expresión diferencialde proteínas.El número de spots detectados estuvocomprendido entre 970 y 1200, pararespectivamente muestras obtenidas a los dosestadios gestacionales analizados, 23 y 37 días.El gel bidimensional del saco vitelino deembrión bovino de edad estimada de 23 díaspresento un grupo de proteínas diferencialmenteexpresas (Figura 4) que no están presentes en elgrupo de edad gestacional estimada de 37 días.ConclusiónSe ha evaluado y optimizado unprotocolo de extracción de proteínas de sacovitelino de embrión bovino para su posteriorseparación por electroforesis bidimensional. Sedetectaron entre 900 y 1200 spots, dependiendodel estado de desarrollo, con un buen número dediferencias encontradas. El trabajo se estácontinuando con el análisis por espectrometríade masas de los spots diferenciales, lo quepermitirá, por una parte, profundizar en elconocimiento del desarrollo embrionario, y, porotra, identificar biomarcadores potencialmenteútiles en el diagnóstico preimplantacionalembrionario, con el objetivo de prevenir latransmisión de enfermedades genéticas en elembrión producidas por la manipulación en ellaboratorio.AgradecimientosEste trabajo fue financiado por la CNPq(Conselho Nacional de DesenvolvimentoCientífico e Tecnológico. Un agradecimientoespecial a la Dra. Miryan Lança Vilia Albertopor su colaboración en este trabajo.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 62Referencias[1] Medvinsky AL, Samoylina NL, Muller, AM.A early pre-liver intraembrionic sourceof CFU-S in the developming mouse.Nature 1993; 364: 64-67.[2] Auerbach R, Huang H, Lisheng L.Hematopoietic Stem Cells in the MouseEmbryonic Yolk Sac. Stem Cells 1996;14: 269-280.[3] Palis J, Yoder MC. Yolk-sac hematopoiesis:The first blood cells of mouse and man.Experimental Hematology 2001; 29:927-936.[4] Thomas T, Southwell BR, Schreiber G.Plasma protein synthesis and secretion inthe visceral yolk sac of the fetal rat: geneexpression, protein synthesis andsecretion. Placenta 1990; 11: 413-430.[5] Dunton A, Al-Alousi A, Pratten MK. Thegiant yolk sac: A model for studyingearly placental transport. J. Anat 1986;145: 189-206.[6] Brent RL, Beckman DA, Jensen M.Experimental yolk sac dysfunction as amodel for studying nutricionaldisturbances in embryo during earlyorganogenesis.Teratology 1990;.41: 405-413.[7] Godovac-Zimmermann J, Brown LR.Perspectives for mass spectrometry andfunctional proteomics. MassSpectrometry Reviews 2001; 20:.1-57.[8] Aebersold R, Mann M. Mass spectrometrybasedproteomics. Nature 2003; 402:198-207.[9] Wilkins MR, Pasquali C, Appel RD, Ou K,Golaz O, Sanchez JC, Jan JX, GooleyAA, Hughes E, Humphery-Smith I,Willians KL, Hochstrasser DF. Fromproteins to proteomes: large scale proteinidentification by two-dimensionalelectrophoresis and amino acid analysis.Nature Bio Technology 1996; 14: 61-65.[10] Amderson NG y Anderson NL. Twentyyears of Two-dimensionalelectrophoresis: past, present and future.Electrophoresis 1996; 17: 443-453.[11] Wilkins MR, Willians KL, Appel RD,Hochstrasser D. Proteome research: newfrontiers in functional genomics.(Editores: Springer-Verlag, Germany1997 pp 243.[12] Bradford MM. A rapid and sensitivemethod for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizingthe principle of protein-dye binding.Analitycal Biochemistry 1976, 72: 248-254.[13] Laemmli UK. Cleavage of structuralproteins during the assembly of the headof bacteriophage T4. Nature 1970, 227:680-685.[14] Görg A.; Klaus A.; Lück C.; Weiland F.Two-dimensional electrophoresis withimmobilized pH gradients for proteomeanalysis: A laboratory manual.Disponivelem:.Acesso em: 3 março 2007.[15] Herbert BR. Advances in proteinsolubilization for two-dimensionalelectrophoresis. Electrophoresis 1999.20: 660-663.[16] Usami M, Mitsunaga K, Nakazawa K.Two-dimensional electrophoresis ofprotein from cultured posimplantationtrat embryos for developmental toxicitystudies. Toxicol In vitro 2007, 3: 521-526.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 63SAIDE: A Semi-Automated Interface for Hydrogen/Deuterium Exchange MassSpectrometryMaria T. Villar, Danny E. Miller, Aron W. Fenton and Antonio ArtiguesDepartment of Biochemistry and Molecular Biology. School of Medicine, University of KansasMedical Center, Kansas City, KS, United States. MS 3030, 3901 Rainbow Boulevard. Kansas City,Kansas 66160, USAAbstractDeuterium/hydrogen exchange incombination with mass spectrometry (DH MS)is a sensitive technique for detection of changesin protein conformation and dynamics. Sincetemperature, pH and timing control are the keyelements for reliable and efficient measurementof hydrogen/deuterium content in proteins andpeptides, we have developed a small,semiautomatic interface for deuterium exchangethat interfaces the HPLC pumps with a massspectrometer. This interface is relativelyinexpensive to build, and provides efficienttemperature and timing control in all stages ofenzyme digestion, HPLC separation and massanalysis of the resulting peptides. We havetested this system with a series of standardtryptic peptides reconstituted in a solventcontaining increasing concentration ofdeuterium. Our results demonstrate the use ofthis interface results in minimal loss ofdeuterium due to back exchange during HPLCdesalting and separation. For peptidesreconstituted in a buffer containing 100%deuterium, and assuming that all amide linkageshave exchanged hydrogen with deuterium, themaximum loss of deuterium content is only 17%of the label, indicating the loss of only onedeuterium molecule per peptide.IntroductionDynamics of proteins in solution are ofgreat interest because knowledge of types,locations, and rates of movements lead to abetter understanding of how proteins carry outtheir functions in vivo. Deuterium/hydrogenexchange in combination with massspectrometry (DH MS) is a sensitive techniquefor detection of changes in protein conformationand dynamics. This technology has severaladvantages over more conventional methods,such as crystallography and multidimensionalNMR; among them are the possibility to studynative proteins in solution, the requirement forreduced protein concentrations and the potentialto discriminate multiple coexistingconformations. In addition, DH MS has noupper limit to the size of protein or proteincomplex that can be analyzed. DH MSapproaches rely on the fact that hydrogen atomson the amide linkages of the protein backbonecan exchange with solvent deuterium at ratesthat reflect the dynamics of particular regions ofthe protein. The associated relative masschanges can be measured with a massspectrometer.The theory and methodology used tostudy protein conformation and dynamics hasbeen described in several recent reviews [1-7].The first experimental setup to measure rates ofdeuterium/hydrogen exchange by massspectrometry and to map them to specificregions of the polypeptide sequence wasdescribed by Smith [8]. The procedure is basedon the greatly reduced rate of exchange at lowpH and temperature and on the activity ofpepsin at pH 2.3. Thus, the typical exchangeexperiment is performed as follows: 1) Isotopicexchange is initiated by incubating the proteinsample in a deuterated buffer at the desired pHand temperature. 2) At different time periods analiquot is removed and deuterium/hydrogenexchange is quenched by reducing the pH of thesolution to pD 2.4 and the temperature islowered to 0 o C or below. 3) The globalexchange rate is measured on the intact proteinfollowing fast desalting on a reverse phaseHPLC column. Alternatively, to obtain detailedstructural information, the protein is fragmentedinto small peptides by hydrolysis with pepsin

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 64and the deuterium content in these peptides isanalyzed by reverse phase HPLC connected onlineto an electrospray mass spectrometer. DHMS has been utilized successfully in the studyof protein structure and dynamics [3], includingprotein folding [9], protein dynamics duringcatalysis and allosteric regulation [10-12]. Inaddition, DH MS has been used to mapsubstrate binding sites on the primary structureof the protein [13].In order to minimize loss of deuterium,mass measurement must be taken quickly,usually within the first few minutes followingquenching. However, there is no standardequipment to interface the different stages ofanalysis described above. Initially, temperaturecontrol during the quench and massmeasurement stages was provided by an icebath, and control of pH by a manual dilution ofthe protein sample with a highly concentratedacidic buffer (for example 200 mM ammoniumphosphate, pH 2.3) [8, 14-19]. This is still themost common experimental procedure. Toreduce back exchange and increase insensitivity, the use of capillary columns and fastflow chromatography have been included inmany instrumental configurations [16]. Also,multiple proteases have been used to enhancepeptide coverage and, therefore, sequenceresolution [2, 20].Wide application of DH MS continues tobe hindered by the lack of instrumentation tohandle sample exchange. To the best of ourknowledge, there is only one fully automaticsystem capable of performing automaticmeasurements in the millisecond to 24 hr timerange [4]. This system was built around a seriesof individual components: 1) two auto samplersequipped with Peltier-cooled sample stacks, 2) amechanical micro syringe and 3) a three valveunit build into a custom built thermal chamber.These components were in addition to astandard HPLC and high resolution massspectrometer. This is a complex system thatrequires the assembly of different parts into aunit that works as a single instrument, and theentire system is under computer control bydedicated software. This instrument has beenused successfully to study protein-ligandinteractions [4] and protein dynamics [2].Alternative approaches by quench flow methodshave been used to investigate fast proteinfolding reactions [21]. In this approach, theprotein sample was mixed rapidly with theprotein-free solvent to initiate exchange. Atvarious time periods after the initiation ofexchange, the reaction was quenched by anadditional mixing at low pH and temperature.Samples were then flash frozen and stored at -80 o C until they could be analyzed by massspectrometry. The main advantage of thisautomated system is that quench flowinstruments are robust and standard pieces ofequipment. However, thawing of the samplesfor peptic digestion and mass spectrometryanalysis could be problematic; considerable lossof deuterium content is likely if not performedunder strict conditions and, therefore,reproducibility can be compromised. Theseautomatic setups are complex and expensive.Here we describe a simple but efficient Semi-Automated Interface for Deuterium Exchange(SAIDE). This interface allows stricttemperature and timing control during proteindigestion, HPLC peptide desalting andseparation and direct injection for mass analysis.This system is not complex as compared tothose described above. However, on the basis ofour preliminary studies our system is aseffective and can be applied to most DH MSexperimental procedures without modification.Materials and methodsReagents.Cytosolic aspartate aminotransferase(cAAT) was purified as previously described[22]. Protein concentration was estimated fromthe absorbance of the pyridoxal-phosphatebound to its active site, using the molarabsorption coefficient of 8500 M -1 cm -1 and aM = 46,399. TCPK treated trypsin was fromWorthington. D 2 O was from ACROS Organics.All other reagents were of the highest purityavailable.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 65parent ion tolerance of 0.30 Da. Peptideidentifications were accepted if they could beestablished at Xcorr score of at least 1.5, 2.0 or2.5 for peptides with 1, 2 or 3 charges,respectively and a Delta Correlation score largerthan 0.08.Trypsin digestion of cAAT.A stock solution of cAAT at 1 mg/ml in2mM Tris HCl, pH 7.5 was denatured in 6 Mguanidine hydrochloride (Gnd HCl). The samplewas sequentially reduced and alkylated andfinally diluted with 50 mM ammoniumbicarbonate to 0.6 M Gnd HCl and incubatedwith trypsin, at 1:100 trypsin:cAAT subunitmolar ratio, overnight at room temperature. Theresulting peptides were desalted on a reversephase guard column (Zorbax C18SB Wide poreguard Column, MicroTech Scientific, 1 cm x0.32 mm), and were eluted using 200 μl 0.01 %TFA in 60% acetonitrile, and 10 μl aliquots wereevaporated to dryness and stored at -20 o C.Mass spectrometry.The tryptic cAAT peptides wereanalyzed by on-line HPLC mass spectrometry,using SAIDE as the injection interface, asdescribed in Results. Mass analysis was done ona LTQ FT mass spectrometer (ThermoFinnigan)under automatic control to perform MSfollowed by tandem mass scans of the four mostintense ions, using an exclusion list of 2 min.Data in the m/z range 600–2000 was collected.Tandem mass spectra were analyzed using theSequest algorithm [23] included in the Xcaliburversion software package (ThermoFinnigan).Sequest was set up to search a protein databasecontaining a cAAT FASTA formatted data fileand assuming full tryptic digestion, using afragment ion mass tolerance of 20 ppm Da and aMeasurement of deuterium content.Peptide masses were calculated from thecentroid of the isotopic envelope using in-housedeveloped software and were verified manuallyusing the MagTran software. The extent ofdeuterium content was determined from themass shift of labeled peptides relative tounlabeled peptides. The percentage of deuteriumlabel was calculated as D(%) = 100*(M D -M H )/(n-2); were M D and M H are the neutralmasses of the labeled and unlabeled peptide,respectively, n is the total number of amino acidresidues of the peptide and 2 is a factordescribed by Englander [24]Results and discussionSAIDE interface.Central to D/H exchange studies is thatexchange is temperature and pH sensitive.Therefore, exchange reactions are performed atnear neutral pH at controlled temperature. Then,the exchange is quenched using low pH and lowtemperature. However, quenching slows, butdoes not eliminate further exchange and/orback-exchange. For this reason, analysis ofquenched samples must be performed quickly(within 30 minutes) and quenching conditions(low temperature/low pH) must be maintainedduring this analysis. Most instrumental designsused in D/H studies immerse solvents, columnsand HPLC injection valves in an ice bath. Sincetemperature, pH and timing control are the keyelements for reliable and efficient measurementof deuterium content in protein and peptides, wehave developed a small, semiautomatic systemthat is easy to interface with a massspectrometer and provides efficient temperatureand timing control in all stages of HPLCseparation and mass analysis.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 66To minimize changes in temperature duringtransfer of the sample from the reaction vial tothe interface, an independent cooling line isused to maintain a 25 μl micro syringe(Hamilton) at the same temperature as thecooling box.The designed interface, SAIDE, is usedto perform timed protein digestion followed byautomatic peptide desalting and fast HPLCpeptide separation under controlled conditionsof pH and temperature. A schematic of theinterface is shown on Figure 1. This interface isinstalled between the HPLC and the massspectrometer. It consists of a temperaturecontrolled chamber that holds two valves and areverse phase column. Valve 1 is a six port valve(VALCO Cheminert) with an additional frontendport for sample introduction. This valve isequipped with an electric contact closure thattriggers simultaneously the start of the gradientformation on the HPLC and the acquisition ofdata on the mass spectrometer. Port 2 of thisvalve is connected to the in-line gradient formedby the HPLC, ports 1 and 4 hold a 20 μl loop,port 3 is connected to the reverse column andports 5 and 6 are waste lines. The outlet of thereverse phase column is connected to a 4 wayvalve (VALCO Cheminert), which acts as aswitch valve to direct the eluent from thecolumn to either the mass spectrometer or to thewaste. The temperature of the box is connectedto a cooling bath (Polyscience). For theprocedures described in this report, thetemperature of the thermostatic box wasmeasured on the outside of the sample loop andwas adjusted to -2 o C. The entire assembly wasbuilt by Mecour (Groveland, MA) according toour specifications. A thermo sensor (Digisense)was added to measure the temperature at thesample loop. The cooling line for this interfaceis connected to a 96 well cooling sample tray.Optimization of reverse phasechromatography.The first step in the analysis of DH MSexperiments involves the fast separation ofpeptides at low temperature. Thus, it wasdesirable to determine conditions for optimalseparation of a peptide mixture at the lowestoperational temperature of the SAIDE. Threeparameters had to be measured or optimized: 1)the minimum operative temperature of thecooling chamber, 2) the chromatographicgradient and 3) the degree of back exchange ofdeuterium present in labeled peptides. With thatpurpose, a set of tryptic peptides derived fromcAAT was prepared as indicated in Materialsand Methods and analyzed under variouschromatographic gradient profiles andtemperatures. An independent probe was used tocheck the effectiveness of the cooling chamberand temperature readings were taken inside thechamber (air), the beginning and end of thecooling line as well as at the sample loop of theinjection valve. As expected, a temperaturegradient was observed between the air and thesample loop, but it was only 1 o C. Thetemperature gradient on the sample loop andcooling line was also minimal, with a differenceof only 0.2 o C. Thus, the cooling line is able toeffectively decrease the temperature of thesolvents. This is particularly important since allof the chromatographic equipment and solventreservoirs were at room temperature.Subsequently only the temperature at the sampleloop was monitored. The minimum operationaltemperature of the thermostatic box wasdetermined to be -2 o C at the sample loop, andthis was used for all experiments involvingdeuterium measurements. Under thistemperature condition the solvent in thecapillary solvent lines will not freeze providedthat there is at least a flow of 5 μl/min.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 67The resulting protein coverage was 98%, andpeptides lengths ranged from 8 to 23 residues.Next, to optimize a chromatographicprofile the test mixture was analyzed utilizingseveral chromatographic gradients; changesinclude the flow of the mobile phase, and theslope and shape of the gradient. For all theseexperiments, the temperature of the coolingchamber was maintained at -2 o C. A trace of atypical optimized gradient is shown on Figure 2.Peptides were loaded on the loop and followinga 2 min. desalting step at 200 μl/min of 0.05%TFA, were eluted using a 5 min 10% to 80%gradient of acetonitrile in 0.05% TFA at a flowrate of either 25 or 100 μl/min. Most peptideseluted within 15 minutes from injection, yet thechromatographic trace maintains the highdegree of chromatographic resolution requiredfor the detection of a large number of peptides.Deuterium recovery on tryptic peptides.To determine the effectiveness of theSAIDE interface in the retention of deuteriumincorporated into these peptides, six aliquots ofcAAT tryptic peptides were subjected to threecycles of lyophilization/solubilization indeuterium ammonium phosphate, pH 7.5,containing 0, 5, 10, 25, 50 and 100% deuteriumoxide. Each aliquot was analyzed in duplicateand the deuterium content was determined asdescribed in Materials and Methods. A set of 43well characterized semi tryptic peptides wasselected (Table 1). The length and retention timeof these peptides ranged from 8 to 23 aminoacid residues and 10 to 15 min, respectively.Thus, providing a wide range of peptide lengthand retention times to measure deuterium backexchangeduring their chromatographicseparation. Figure 3 shows the isotopicenvelopes for the doubly charged ion of thepeptide TDDSQPWVLPVVR obtained atdifferent D 2 O content in the reconstitutionbuffer. The recovery of deuterium label for eachpeptide was measured as described in Materialsand Methods. The deuterium content for eachexperimental condition was averaged among allpeptides independently of its length or retentiontime. The results are shown in Figure 4, whichshows the average recovery of deuterium labelas a function of the content on deuterated waterin the reconstitution step. There is a clear linearcorrelation between the amount of deuteriumpresent in the sample and the amount ofdeuterium label recovered on the peptides, witha correlation score of 0.998. For peptidesreconstituted in a buffer containing 100%deuterium oxide we recovered 83% of the labelin the resulting peptide ions (assuming that allamide linkages have exchanged hydrogen withdeuterium), this is equivalent or better than thedeuterium recovery obtained by other methods[16] including more complex systems [4]. Morespecifically, this represents a loss of only 17%of the label incorporated in peptides, or about 1deuterium atom from a 100% labeleddecapeptide.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 68instrument, thus the digestion time in the loop,desalting, elution of peptides and dataacquisition on the mass spectrometer will beevents automatically controlled by a computerstarted by the injection of a sample into theloop.Acknowledgements. This work wassupported by University of Kansas MedicalCenter Institutional ROV10525 to A. Artigues.Research in the Fenton laboratory is supportedby NIH grant DK 78076References[1]. Hoofnagle, A.N., K.A. Resing, and N.G.Ahn, Protein analysis by hydrogenexchange mass spectrometry. Annu RevBiophys Biomol Struct, 2003. 32: p. 1-25.[2]. Hamuro, Y., et al., Rapid analysis of proteinstructure and dynamics byhydrogen/deuterium exchange massspectrometry. J Biomol Tech, 2003.14(3): p. 171-82.ConclusionsThe use of SAIDE, a semiautomaticinterface device, has been described and itsefficiency for the elucidation of deuteriumcontent in proteins has been demonstrated. Thisinterface provides efficient temperature andtime control for most basic DH MSexperimental procedures. Reduction of D/Hback- exchange has been achieved not only bythe operational low temperature, but also by thefact that this small box is located immediately infront of the mass spectrometer. This designreduces the length of the solvent lines andquickly delivers the peptide mixture directlyonto the ESI source. Back-exchange is kept to aminimum as demonstrated by the detection ofdeuterium content in peptides. The simplicity ofthe SAIDE design will make it easy to interfacewith other instruments, such as an autosampleror stopped or quench flow instrument, for avariety of workflows, including the use of nanocolumnsoperating at low flow rates. Currently,our SAIDE is being retrofitted with automatedvalves to convert it to a fully automatic[3]. Busenlehner, L.S. and R.N. Armstrong,Insights into enzyme structure anddynamics elucidated by amide H/Dexchange mass spectrometry. ArchBiochem Biophys, 2005. 433(1): p. 34-46.[4]. Chalmers, M.J., et al., Probing proteinligand interactions by automatedhydrogen/deuterium exchange massspectrometry. Anal Chem, 2006. 78(4):p. 1005-14.[5]. Chalmers, M.J., et al., A two-stagedifferential hydrogen deuteriumexchange method for the rapidcharacterization of protein/ligandinteractions. J Biomol Tech, 2007. 18(4):p. 194-204.[6]. Englander, S.W., Hydrogen exchange andmass spectrometry: A historicalperspective. J Am Soc Mass Spectrom,2006. 17(11): p. 1481-9.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 69[7]. Wales, T.E. and J.R. Engen, Hydrogenexchange mass spectrometry for theanalysis of protein dynamics. MassSpectrom Rev, 2006. 25(1): p. 158-70.[8]. Smith, D.L., Y. Deng, and Z. Zhang,Probing the non-covalent structure ofproteins by amide hydrogen exchangeand mass spectrometry. J MassSpectrom, 1997. 32(2): p. 135-46.[9]. Konermann, L. and D.A. Simmons, Proteinfoldingkinetics and mechanisms studiedby pulse-labeling and mass spectrometry.Mass Spectrom Rev, 2003. 22(1): p. 1-26.[10]. Shi, Z., K.A. Resing, and N.G. Ahn,Networks for the allosteric control ofprotein kinases. Curr Opin Struct Biol,2006. 16(6): p. 686-92.[11]. Tsutsui, Y. and P.L. Wintrode,Hydrogen/deuterium exchange-massspectrometry: a powerful tool forprobing protein structure, dynamics andinteractions. Curr Med Chem, 2007.14(22): p. 2344-58.[12]. Tsutsui, Y., et al., The conformationaldynamics of a metastable serpin studiedby hydrogen exchange and massspectrometry. Biochemistry, 2006.45(21): p. 6561-9.[13]. Sinz, A., Investigation of protein-ligandinteractions by mass spectrometry.ChemMedChem, 2007. 2(4): p. 425-31.[14]. Englander, S.W., N.W. Downer, and H.Teitelbaum, Hydrogen exchange. AnnuRev Biochem, 1972. 41: p. 903-24.[15]. Englander, S.W., et al., Hydrogenexchange: the modern legacy ofLinderstrom-Lang. Protein Sci, 1997.6(5): p. 1101-9.[16]. Wang, L. and D.L. Smith, Downsizingimproves sensitivity 100-fold forhydrogen exchange-mass spectrometry.Anal Biochem, 2003. 314(1): p. 46-53.[17]. Thevenon-Emeric, G., et al., Determinationof amide hydrogen exchange rates inpeptides by mass spectrometry. AnalChem, 1992. 64(20): p. 2456-8.[18]. Yan, X., et al., Mass spectrometricapproaches using electrospray ionizationcharge states and hydrogen-deuteriumexchange for determining proteinstructures and their conformationalchanges. Mol Cell Proteomics, 2004.3(1): p. 10-23.[19]. Pan, J., D.J. Wilson, and L. Konermann,Pulsed hydrogen exchange andelectrospray charge-state distribution ascomplementary probes of proteinstructure in kinetic experiments.Biochemistry, 2005. 44(24): p. 8627-33.[20]. Zhang, H.M., et al., Enhanced DigestionEfficiency, Peptide Ionization Efficiency,and Sequence Resolution for ProteinHydrogen/Deuterium ExchangeMonitored by Fourier Transform IonCyclotron Resonance MassSpectrometry. Anal Chem, 2008.[21]. Tsui, V., et al., Quench-flow experimentscombined with mass spectrometry showapomyoglobin folds through andobligatory intermediate. Protein Sci,1999. 8(1): p. 45-9.[22]. Mattingly, J.R., Jr., A. Iriarte, and M.Martinez-Carrion, Homologous proteinswith different affinities for groEL. Therefolding of the aspartateaminotransferase isozymes at varyingtemperatures. J Biol Chem, 1995.270(3): p. 1138-48.[23]. Eng, J.K., A.L. McCormack, and I. Yates,J.R, An Approach to Correlate TandemMass Spectral Data of Peptides withAmino Acid Sequences in a ProteinDatabase. American Society for MassSpectrometry, 1994. 5.[24]. Bai, Y., et al., Primary structure effects onpeptide group hydrogen exchange.Proteins, 1993. 17(1): p. 75-8.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 70GRUPOS DE INVESTIGACIÓNCiencia de la Carne y ProteómicaMiguel Ángel Sentandreu VicenteLaboratorio de Ciencia de la Carne. Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC).Avenida Agustín Escardino, 7. 46980 Paterna (Valencia)De izquierda a derecha: Miguel Ángel Sentandreu (Científico Titular), Fidel Toldrá (Profesor deInvestigación), María Concepción Aristoy (Investigador Titular de OPIS), Mónica Flores(Investigador Científico), José Luis Navarro (Profesor de Investigación)Aprovecho la oportunidad de escribirunas líneas en este número de la revista para dara conocer nuestro grupo de trabajo, ellaboratorio de Ciencia de la Carne del Institutode Agroquímica y Tecnología (CSIC), y cómoha sido hasta ahora nuestra relación con elapasionante mundo de la Proteómica. En líneasgenerales, el grupo ha centrado tradicionalmentesu interés en el estudio de la calidad ypropiedades de la carne y los productoscárnicos, en especial el estudio de los productoscárnicos crudos curados como embutidos yjamón curado. Hay que destacar los esfuerzosrealizados en el estudio de los mecanismos degeneración del aroma y sabor y la percepción delos mismos por parte del consumidor. Tambiénse ha trabajado en el desarrollo de métodos quepermitan asegurar un control rápido y objetivotanto de las materias primas como delprocesamiento de la carne. Asimismo, se hatrabajado en tratar de mejorar el valor nutritivode la carne y los productos cárnicosmodificando el perfil lipídico de los mismos odisminuyendo el contenido en sal, por poneralgunos ejemplos.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 71Nuestras primeras incursiones en elmundo de la Proteómica se remontan al año1998, cuando decidí realizar una estancia en elPhysiologich-Chemisches Institut de Tübingen(Alemania) para tratar de identificar lospéptidos responsables del sabor típico de jamóncurado. Aquello no fue fácil; hubo primero quefraccionar el extracto de jamón en una columnade exclusión molecular, probar literalmente lasfracciones para determinar dónde eludía elinconfundible sabor a jamón y posteriormentedesarrollar una buena separación de los péptidosen HPLC para poder identificarlos con unclásico secuenciador de péptidos en fase líquida(AB). De este modo, se pudieron identificar 11péptidos dentro de la fracción del sabor a jamónserrano.Durante el periodo 2000 – 2002 tuve laoportunidad de realizar una estancia posdoctoralen el Institut National de la RechercheAgronomique (INRA) en Francia con el Dr.Ahmed Ouali, una de las figuras más destacadasen la bioquímica del músculo postmortem.Durante ese periodo se montó la ―Plate FormeProtéomique‖ con la puesta en marcha de unMALDI-TOF (AB) y un LC-ESI-MS/MS(Thermo), lo que supuso una revolución en elcentro y la entrada en la era proteómica tal ycomo se entiende hoy en día. Recuerdo que enesa época allí todo esto era muy novedoso,costaba hacerse una idea de lo que laProteómica podía aportar en nuestras líneas detrabajo en Ciencia de la Carne. Se consiguió noobstante realizar un trabajo interesanteempleando el MALDI-TOF y la técnica de lahuella peptídica en la caracterización de lasdiferentes isoformas de las catepsinas B y L quepueden existir en el músculo esquelético.Después de esta etapa, de nuevo enValencia, nos planteamos continuar con lasposibles aportaciones que la Proteómica podíadeparar en el estudio de la carne y los productoscárnicos. De este modo, desde el laboratorio deCarnes del IATA nos pusimos en contacto conJuanjo Calvete para trabajar juntos en lo quepodíamos denominar la ―Peptidómica delCurado‖. Básicamente, lo que se pretendía eraemplear la espectrometría de masas en laidentificación de los fragmentos de proteínasgenerados durante el procesado del jamónserrano. Durante este periodo se produce unaintensa degradación de las proteínas delmúsculo, debido a que las propias enzimasproteolíticas del músculo continúan siendoactivas a pesar de la muerte del animal. Esto dalugar a la generación de una gran cantidad deaminoácidos libres y péptidos de pequeñotamaño, lo que contribuye directamente aldesarrollo de las características organolépticastípicas del jamón. Desarrollando distintas etapasde fraccionamiento del extracto de jamón ycontinuando con el análisis posterior que Juanjorealizó de las fracciones mediante laespectrometría de masas en tándem seconsiguieron identificar varios fragmentos deproteínas musculares como la actina y lamiosina. Era la primera vez que se identificabanfragmentos de degradación de estas proteínas enel jamón, de modo que el trabajo tuvo buenaacogida en la comunidad científica,publicándose una reseña de este trabajo(Sentandreu et al. 2007. J. Agric. Food Chem.55, 3613) en el numero de mayo de 2007 de larevista Journal of Proteome Reseach con foto dejamón incluida. He de hacer no obstante unacrítica a esta reseña ya que el autor del textoconfundía de manera imperdonable un posciuttoitaliano con un jamón serrano. Este trabajo se hacontinuado posteriormente con la identificaciónde un gran número de fragmentos de proteínasmusculares de distintos tipos y tamaños, lo queha puesto en evidencia la enorme y complejamaquinaria proteolítica que está actuandodurante todo el proceso de curado. Todo esto hasupuesto un paso importante para poderentender mejor las complejas reaccionesbioquímicas que tienen lugar en la elaboraciónde un producto como el jamón curado.Otra de las líneas de trabajo de interés delos últimos años es el proyecto que se realizóconjuntamente con la School of BiologicalSicences (Royal Holloway) de la Universidadde Londres. El proyecto fue financiado por laUK Food Standards Agency y tenía comoobjetivo el emplear la tecnología proteómica enel desarrollo de una metodología robusta ysensible capaz de identificar péptidosbiomarcadores específicos de las distintasespecies de carne que se pueden encontrar en los

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 72productos cárnicos, con objeto de evitarprácticas fraudulentas en la elaboración y eletiquetado de los mismos. El desarrollo de estametodología se presentó recientemente en las IIJornadas Bienales de Jóvenes Investigadores enProteómica, publicándose posteriormente en larevista Journal of Proteome Research(Sentandreu et al. 2010. J. Prot. Res. 9, 3374).Recientemente también hemos llevado a caboun trabajo en colaboración con el laboratorio deProteómica del Centro de Investigación PríncipeFelipe en Valencia, con objeto de caracterizarlos péptidos que se pueden originar después dela digestión de la carne de cerdo por acción delas enzimas gastrointestinales. Uno de losaspectos más interesantes de este trabajo,también presentado en las II Jornadas Bienalesde Jóvenes Investigadores en Proteómica, hasido el identificar, después del proceso dedigestión, péptidos procedentes de lasprincipales proteínas musculares con unapotencial actividad antihipertensiva.De todo lo comentado en estas líneas sepuede ver fácilmente el gran impacto que lametodología proteómica ha tenido, y supongoque seguirá teniendo, en el desarrollo denuestras investigaciones dentro del área deCiencia de la Carne. Independientemente detodo lo que nuestro grupo haya podido aportar,todo esto no hubiera sido posible sin los apoyosy las colaboraciones de personas con las quehemos tenido el placer de contar. En Valencia,tenemos mucho que agradecer tanto a JuanjoCalvete como a Manolo Pino y Luz Valero porel interés y apoyo que siempre han mostrado pornuestra investigación, que no siempre sigue losprotocolos más estándares de trabajo. EnInglaterra también hay de agradecerpersonalmente al Prof. Peter Bramley y al Dr.Paul Fraser la confianza depositada en eldesarrollo del proyecto de los marcadorespeptídicos que tan buena acogida tuvo en lasjornadas de Córdoba. Ojala que el futuro y laProteómica nos deparen momentos tanagradables como los que hemos vivido hastaahora en buena compañía.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 73TESIS DOCTORALESCaracterización de marcadores peptídicos específicos para la identificación deespecies de langostinos de interés comercialRealizada por Ignacio Ortea García en el grupo de Química de Productos Marinos del Instituto deInvestigaciones Marinas (IIM-CSIC), bajo la dirección del Profesor de Investigación José ManuelGallardo (IIM-CSIC) y los doctores Benito Cañas (Universidad Complutense de Madrid) y PilarCalo-Mata (Universidad de Santiago de Compostela).La defensa de la Tesis tuvo lugar el 20 de noviembre de 2009, en la Facultad de Farmacia de laUniversidad de Santiago de Compostela.La Tesis completa se puede consultar en la dirección:https://www.educacion.es/teseo/imprimirFicheroTesis.do?fichero=116391. ResumenLa autenticidad alimentaria tiene en laactualidad gran relevancia en el sector pesquero,debido a la sustitución, inadvertida omalintencionada, de unas especies por otras demenor calidad. Además, la correctaidentificación de los ingredientes de unproducto es importante no sólo por razoneseconómicas, sino también por razonessanitarias, debido a la introducción de algúncomponente alergénico o tóxico para algúnsector de la población. Por todo ello, esnecesario disponer de metodologías adecuadaspara identificar los componentes de losalimentos. Dentro del mercado internacional deproductos pesqueros, los langostinos y gambas,crustáceos del orden Decapoda, son el productomás importante en valor económico(aproximadamente el 18% del total). Lascaracterísticas morfológicas son complicadas deutilizar en la diferenciación de especies dedecápodos, debido a su similitud fenotípica y aque en su procesado se elimina generalmente elcaparazón externo. Por ello, se necesitanherramientas analíticas fiables y rápidas paradistinguir entre estas especies. Las metodologíasutilizadas en la autentificación de productos dela pesca han estado basadas en técnicaselectroforéticas, cromatográficas, einmunológicas, y más recientemente en análisisgenéticos, utilizando técnicas como la reacciónen cadena de la polimerasa (PCR) y lospolimorfismos de longitud de los fragmentos derestricción (RFLPs).El trabajo realizado propone lautilización de técnicas proteómicas para laidentificación y autentificación de especies delangostinos de interés comercial, siendo elobjetivo principal la descripción demetodologías que nos permitan distinguir entreestas especies.Como primer resultado se describió unametodología que nos permite distinguir entre 14especies de langostinos, camarones y gambas deinterés comercial, utilizando isoelectroenfoque[1]. Las proteínas que nos permiten diferenciarentre estas especies utilizando esta metodologíafueron identificadas como distintas formas de laSarcoplasmic Calcium-binding Protein (SCP).Por otra parte, mediante electroforesisbidimensional se encontró variabilidad interespecíficaen la movilidad electroforética de otraproteína, la arginina quinasa (AK), que seseleccionó para el posterior análisis porespectrometría de masas. A partir de losespectros de huella peptídica de la AK de lassiete especies más comerciales, obtenidos porMALDI-TOF, se desarrolló una metodologíapara su comparación matemática, obteniendo undendrograma con utilidad tanto para identificarlas especies como para estudios taxonómicos yfilogenéticos [2]. Por otra parte, los picosespecie-específicos o diferenciadores de las

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 74huellas peptídicas se caracterizaron por mediode espectrometría de masas de tipo ESI-ITacoplada a HPLC, o bien directamente pornanoESI-IT. Así se obtuvo la secuencia devarios péptidos diferenciadores [3]. Estospéptidos caracterizados nos permiten distinguirentre las siete especies. Una vez caracterizadosestos péptidos, se desarrolló una metodologíasencilla y rápida que, acelerando la digestiónproteica mediante ultrasonidos focalizados dealta intensidad, y utilizando un espectrómetro demasas en modo Selected MS/MS IonMonitoring (SMIM) para la detección ymonitorización de los péptidos, logra laidentificación de la especie presente en unamuestra en 90 minutos [4]. Dicha metodologíamejora la rapidez en el diagnóstico y la sencillezdel análisis respecto a cualquier otro métododescrito, ya sea genético o electroforético. Elaumento de la población alérgica al marisco,confiere a los estudios sobre la SCP y la AK,debido al carácter alergénico de ambasproteínas, un interés biosanitario adicional.Bibliografía:[1] Ortea, I., Cañas, B., Calo-Mata, P. Barros-Velázquez, J., Gallardo, J.M.Identification of commercial prawn andshrimp species of food interest by nativeisoelectric focusing. Food Chemistry2010; 121:569-74.[2] Ortea, I., Cañas, B., Calo-Mata, P., Barros-Velázquez, J., Gallardo, J.M.. Argininekinase peptide mass fingerprinting as aproteomic approach for speciesidentification and taxonomic analysis ofcommercially-relevant shrimp species.Journal of Agricultural and FoodChemistry 2009; 57:5665-72.[3] Ortea, I., Cañas, B., Gallardo, J.M. MassSpectrometry characterization ofspecies-specific peptides from argininekinase for the identification ofcommercially relevant shrimp species.Journal of Proteome Research 2009;8:5356-62.[4] Ortea, I., Gallardo, J.M., Medina, I., Barros,L. Procedimiento y kit para laidentificación de las principales especiescomerciales de langostinos y camarones.Patente de invención (nº P200930424),Consejo Superior de InvestigacionesCientíficas, 2009.2. Reseña del Grupo de InvestigaciónIPs: Dr. José Manuel Gallardo, Dr. SantiagoAubourg y Dra. Isabel Medina.Química de Productos Marinos, departamentode Tecnología de Alimentos del Instituto deInvestigaciones Marinas (Vigo) del ConsejoSuperior de Investigaciones Científicas.Se ha consolidado como grupo dedicadoprincipalmente al estudio de diferentesproblemas directamente relacionados con elpescado como alimento (calidad, funcionalidad,transformación y conservación, uso integral delas capturas, identificación de especies),participando en numerosos proyectos nacionalese internacionales dentro de este campo, asícomo en contratos suscritos con empresas delsector. Es uno de los grupos pioneros en laaplicación de las técnicas proteómicas al área detecnología de alimentos de origen marino,destacando entre sus logros el desarrollo demetodologías para la autentificación de distintasespecies de peces, además de decápodos.En la actualidad, las líneas principalesdel grupo son: métodos de evaluación de lacalidad de los productos pesqueros; aplicaciónde antioxidantes para prevenir la oxidación de lafracción lipídica de los productos pesqueros;nuevos procesos tecnológicos de conservaciónde productos marinos; y autentificación dealimentos de origen marino. Una especialsignificación tienen los proyectos actuales delgrupo enfocados hacia el estudio de los efectossaludables de los ácidos grasos poliinsaturadosomega-3 de origen marino, EPA, DPA y DHA,sobre el estrés oxidativo, diabetes yenfermedades cardiovasculares.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 75Instrucciones a los autoreshttp:/www.cbm.uam.es/seprot/Envío de manuscritos: Mediante correo electrónico bf1jonoj@uco.esProteómica es la revista oficial de la Sociedad Española de Proteómica. Su periodicidad serásemestral y será publicada online en la web de la SEProt.Esta revista publicará artículos originales ycomunicaciones breves de contenido científico otécnico, así como artículos de revisión, tutoriales yopiniones, notas, resúmenes de tesis doctorales ocomentarios sobre cualquier aspecto relacionado conla proteómica. Incluirá información sobre nuestraSociedad y sobre los socios, grupos e institucionesque la componen. El idioma será el castellano,aunque se admitirán contribuciones en otras lenguas,preferentemente el inglés.Aunque Proteómica se distribuirápreferentemente en España y Latinoamérica,pretende tener un carácter internacional, extendiendosu distribución a otros países. Esta revista se envía,sin coste alguno, a los socios de la SEProt, aUnidades y Servicios que trabajen en este campo, ya instituciones y organizaciones públicas o privadasvinculadas a la sociedad o con actividad relevante enel campo de la proteómica. Existirá una versiónimpresa, editada por el Servicio de Publicaciones dela UCO, y una versión "on-line" que aparecerá en lapágina web de la SEProt y de la Universidad deCórdoba.Todas las contribuciones serán revisadas porel comité editorial, y su formato deberá ajustarse alas instrucciones que se adjuntan. Los artículosoriginales, las comunicaciones breves, las revisionesy los tutoriales serán evaluados científicamente poruno o dos revisores elegidos por el comité editorial.Todas las contribuciones reflejan la opinión de susautores y no necesariamente la opinión del ComitéEditorial ni de la Junta Directiva de la SEProt.Los manuscritos se enviarán por correoelectrónico, a la dirección bfljonoj@uco.esLos artículos originales, las revisiones y lostutoriales deberán ir acompañados de una carta depresentación del trabajo (cover letter) y tendrán unaextensión máxima de 15 páginas A4; lascomunicaciones breves también deberán incluir unacarta de presentación y tendrán una extensiónmáxima de 8 páginas A4. Los resúmenes de las TesisDoctorales pretenden ser una forma de comunicar eltrabajo realizado durante el periodo doctoral, a lavez que os ayudará a daros a conocer, por lo que elresumen debe de ir acompañado de una pequeñareseña bibliográfica del grupo de investigación. Laextensión no debe de ser superior a 4 páginas. Elresto de las contribuciones tendrá una extensiónmáxima de 4 páginas. Para el cálculo de la extensiónse tendrán en cuenta, además del texto, las figuras,las tablas, las ilustraciones y las referencias. No seconsidera la publicación en color en la versiónimpresa, por lo que las ilustraciones, fotografías ygráficos aparecerán en blanco y negro. Deberánenviarse, en archivos separados, por una parte eltexto y las tablas (preferentemente en Word) y porotra las figuras (en formato pdf, a 250-300 dpi deresolución y al tamaño de impresión final). Losautores deberán verificar que los detalles de lasfiguras se imprimen a partir de los ficheros con lacalidad requerida y que el texto que incluyan lasfiguras sea legible al tamaño de reproducción final.Las tablas y leyendas de figuras deben ir al final deltexto. El texto debe ajustarse al siguiente formato:letra Times New Roman, tamaño 12, doble espacio,páginas y líneas numeradas, justificación total.Los artículos originales deben tener lassiguientes secciones:Portada. Incluirá el título, la lista de autores(nombre y apellido(s)) y su filiación, y losdatos completos del autor con el que semantendrá la correspondencia. La filiaciónde los autores, en el caso de que exista másde una, se indicará mediante un símbolo enformato superíndice detrás del nombre decada autor.Resumen (máximo de 250 palabras) ypalabras clave (máximo de 6, separadas porcomas).Introducción. Deberá evitarse una revisióndemasiado extensa del tema y deberájustificar adecuadamente el contenido deltrabajo.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 76Materiales y métodos. Esta sección deberáser breve, limitándose a describir losprocedimientos que sean novedosos yreferenciando aquellos ya descritos. Lasdescripciones tendrán el suficiente detallepara permitir la repetición de losexperimentos.Resultados.Discusión. Los Resultados y la Discusiónpodrán agruparse en una única sección.Referencias.Agradecimientos.Las abreviaturas se incluirán como nota alpié de página la primera vez que aparezcan en eltexto. Como norma general, no deben incluirseabreviaturas ni en el título ni en el resumen.El sistema de citas bibliográficas yreferencias, a partir del número 3 de la revista, seráun formato basado en la revista Journal ofProteomics. Las referencias se citarán en el textomediante números entre corchetes cuadrados deacuerdo a su orden de citación: cita simple[1], citade varias referencias[2-4], cita de referenciasalternadas[l, 3-5]. Todas las referencias deben sernumeradas de forma consecutiva. Las referencias atrabajos que no hayan sido publicados no seincluirán en la sección de Referencias; dichostrabajos deberán citarse, en el texto y entreparéntesis de acuerdo al siguiente formato: (CorralesF, Jorrín J, resultados no publicados), (Corrales F,Jorrín J, manuscrito enviado), (Jorrín J, Corrales F,comunicación personal).Las publicaciones serán citadas en la secciónde Referencias según su orden de aparición y deacuerdo a los siguientes ejemplos:[1] Storey JD y Tibshirani R. Statistical significancefor genomewide studies. Proc Natl Acad SciU S A 2003;100:9440-5.[2] Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, KristensenDB, Steen H, Pandey A, et al. Stable isotopelabeling by amino acids incell culture,SILAC, as a simple and accurate approachto expression proteomics. Mol CellProteomics 2002; I:376-86.[3] Stults JT, Henzel WJ, Wong SC y Watanabe C,Identification of Electroblotted Proteins byPeptide Mass Searching of a SequenceDatabase en Mass Spectrometry in theBiological Sciences (editores: BurlingameA.L. y Carr S.A.), Humana Press, Totowa,New Jersey 1996, pp. 151-70.[4] Kyte J. Mechanism in Protein Chemistry,Ciarland Publishing, Inc., 1995.[5] Castillejo MA. Análisis de los cambios deexpresión producidos por un inhibidor dequinasas en células endoteliales. TesisDoctoral, Universidad de Córdoba, 2005.Las tablas y figuras llevarán numeraciónarábica y se citarán en el texto en el siguienteformato: tabla 3, figura 2. Las tablas deberán llevarun título y podrán incluir notas a pie de tabla, que sereferirán al contenido de la tabla usando símbolos enformato superíndice. Todas las figuras deberán llevaruna leyenda conteniendo un titulo lo másrepresentativo posible del contenido de la figura, ennegrita, y un texto explicativo lo más concisoposible; la descripción detallada o la interpretaciónde la figura, en su caso, deberá hacerse en el textodel manuscrito.Las comunicaciones breves deben ajustarseal mismo formato que los artículos originales, ycontendrán un resumen (máximo 250 palabras), unalista de palabras clave (máximo de 6, separadas porcomas), una única sección conteniendo el textoprincipal, y las referencias y agradecimientos,además de las tablas y figuras. El texto principaldeberá introducir adecuadamente el tema, explicar lametodología utilizada, y comentar y discutir losresultados.Los artículos de revisión y los tutorialestendrán un formato libre pero deberán incluir unResumen (máximo 250 palabras) y una lista depalabras clave (máximo de 6, separadas por comas).El resto de las contribuciones tendrá un formatolibre. Todas las contribuciones deberán respetar elformato de los artículos originales en cuanto atablas, figuras, abreviaturas y referencias.Los resúmenes de las Tesis Doctoralesincluirán los siguientes apartados: título de la tesis,autor, director(es) y afiliación, fecha y lugar delectura, dirección web donde se puede consultar latesis completa, si existe, resumen del trabajo (esteapartado puede organizarse según el criterio delautor), una figura o esquema que ilustre los datosaportados en la tesis, bibliografía, reseña del grupode investigación en el que se ha realizado el trabajo(máximo 200 palabras). Se puede incluir una fotodel grupo.

Proteómica – Número 6 – Diciembre 2010 77PoetómicaGlosa Redox¿Oh cómo atrapar ese sulfuro,Esa antena, ese imán con su aureolaDe oxígeno y protón, su larga colaDe glutatión, su nitro azul oscuro?¿Oh cómo desvelar este conjuroQue la edad, la asfixia, el mar sin olaDe la sangre convierte en barcarolaDe electrones cambiando su futuro?Imposible. No hay rastro. Está escondida,Más sutil que el fosfato y la lisina,Escurridiza y ágil, la cisteína.Es ella quien lo siente, quien se oxida,El corazón que late en la proteína,La que tiende los puentes de la vida.Jesús Vázquez