Alineamiento de secuencias biológicas (pdf).

Alineamiento de SecuenciasINTRODUCCIÓN A LA BIOINFORMÁTICA2012Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

¿ Por qué comparar secuencias ?¿ Cómo comparar secuencias ?Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

¿ Por qué comparar secuencias ?Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

¿ Por qué comparar secuencias ?ATPsubunitMolecular chaperoninGroELheptamer(Dr Jianpeng Ma, Harvard Univ.)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

¿ Por qué comparar secuencias ?Cambios en lassecuencias :GAT GCATAGATG GAC CCA CGT TCG GAGMDPRSE…DA *• Reemplazo puntual– Sinónimos/No-Sinónimos• Inserción y Delección(InDels)– Afecta pautas delectura• Traslocación• DuplicaciónThe Standard CodeAAA K ACA T AGA R ATA IAAC N ACC T AGC S ATC IAAG K ACG T AGG R ATG MAAT N ACT T AGT S ATT ICAA Q CCA P CGA R CTA LCAC H CCC P CGC R CTC LCAG Q CCG P CGG R CTG LCAT H CCT P CGT R CTT LGAA E GCA A GGA G GTA VGAC D GCC A GGC G GTG VGAG E GCG A GGG G GTG VGAT D GCT A GGT G GTT VTAA . TCA S TGA . TTA LTAC Y TCC S TGC C TTC FTAG . TCG S TGG W TTG LTAT Y TCT S TGT C TTT FPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

¿ Por qué comparar secuencias ?Hace mucho tiempo…ACCGTACGGTTAAACGGTACGGTTAAACCGTCCGGTTAAACCGT-CGGTTAACCCGTACGGTTAAACCCGTACGGTTAAACCG-CCGGTTAAACCCTCCGGTTAAACCGTCCGGTTCCCAATCCGTCCGGTTAAACCGTCCGCTTAAEtc, etc…tiempoxn especiesACCGTCCGGTTGAACCGTCGTAAACCTCTAGTTAAGGAGTACGGTTAAACCGTTCCGAACCGTCCCGTTAAACCGTACGGTTATAAACCGTACGGTTAAACCTGCAATTAGCCGTACCGTGGTCCAACCGTACCCCGGTTAAModelo evolutivo: cambio al azar + selección natural(F. Abascal, 2008)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

¿ Por qué comparar secuencias ?Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Cambio al azar + selección natural + duplicaciones génicasSuperfamilia: grupo de proteínascon un origen común.Familia / Subfamilia: grupo deproteínas con una función común(jerarquía subjetiva).familia rasproteínas ATP/GTP binding(superfamilia)factores deelongaciónproteínas GTPbindingrasrab(F. Abascal, 2008)ras (H. sapiens)ras2 (H. sapiens)ras (M. musculus)ras (C. elegans)Subfamilia rasproteínas ATPbindingrab (H. sapiens)rab (M. musculus)rab (C. elegans)Subfamilia rabDos formas derepresentarloPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Homólogos: ortólogos y parálogos.Ortólogos: genes que comparten elúltimo ancestro común y cuyadivergencia se debe a laespeciación.Los mismos genes en distintasespecies.Parálogos: genes que debido a unaduplicación, ya no comparten elúltimo ancestro. Frecuentementetienen funciones distintas.Paulino Gomez-Puertas(F. Abascal, 2008)Bioinformática.

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DnaKActinHsc70FtsAHexokinaseMreBPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Structural alignmentPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

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¿ Cómo comparar secuencias ?http://www.ebi.ac.uk/dali/FSSP DaliDD CATH SCOPStructure comparisonPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

EMBLPDBPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación de secuenciasPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Conceptos GeneralesSecuencia. Cadena lineal finita y ordenada de símbolospertenecientes a un alfabetoAlfabeto. Conjunto de símbolos básicos de las secuenciasADN: A= {a,c,g,t|u}Proteinas= A={a,c,d,e,f,g,h,I,k,l,m,n,p,q,r,s,t,v,w,y}ADN y Proteinas son cadenas co-linealesExisten otros diversos alfabetosComparación. Encontrar la posición relativa entre dossecuencias que maximice su parecidoPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación por IdentidadesSeq X = TCA GAC GAT TG (n=11)Seq Y = ATC GGA GCT G (m=10)Algoritmo: Desplazar una secuencia debajo de la otra anotando elnúmero de coincidencias que ocurren, seleccionando como resultadola posición de mayor valorPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación por IdentidadesATCGGAGCTGTCAGACGATTG (r=0)TCAGACGATTG (r=2)ATCGGAGCTGTCAGACGATTG (r=1)ATCGGAGCTGTCAGACGATTG (r=0)ATCGGAGCTGTCAGACGATTG (r=0)ATCGGAGCTGTCAGACGATTG (r=4)ATCGGAGCTGTCAGACGATTG (r=0)ATCGGAGCTGResultado: Posición con mayor número de coincidenciasPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación por IdentidadesTCAGACGATTG (r=4)|| ||ATCGGAGCTGh 12345sH ACCGTsV CAGTv 1234D= h – vSi x halínea con y vDiagonal = desplazamientorelativo entre secuencias0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11┌───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┐0 │ │ T │ C │ A │ G │ A │ C │ G │ A │ T │ T │ G │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-1 │ A │ │ │ 1 │ │ 1 │ │ │ 1 │ │ │ │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-2 │ T │ 1 │ │ │ │ │ │ │ │ 2 │ 1 │ │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-3 │ C │ │ 2 │ │ │ │ 1 │ │ │ │ │ │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-4 │ G │ │ │ │ 1 │ │ │ 2 │ │ │ │ 3 │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-5 │ G │ │ │ │ 3 │ │ │ 1 │ │ │ │ 1 │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-6 │ A │ │ │ 1 │ │ 4 │ │ │ 2 │ │ │ │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-7 │ G │ │ │ │ 2 │ │ │ 2 │ │ │ │ 2 │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-8 │ C │ │ 1 │ │ │ │ 1 │ │ │ │ │ │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-9 │ T │ 1 │ │ │ │ │ │ │ │ 3 │ 1 │ │├───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤-10│ G │ │ │ │ 2 │ │ │ 3 │ │ │ │ 2 │└───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┘Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación por IdentidadesACCGTCAGTACCGTCAGTACCGTCAGTACCGTCAGTACCGTCAGTACCGTCAGTACCGTCAGTACCGTCAGTCAGTA C C G TDesplazar una secuencia bajo la otra equivale a recorrer unamatriz por sus diagonales.Complejidad algorítmica O(N * M) O(N ) 2Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación por IdentidadesLos fragmentosalineados aparecencomo diagonales en lamatrizPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación por IdentidadesPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Reducción de la Complejidad AlgorítmicaOptimización para reducir tiempos de cálculoTabla de Dispersión (Hash)Lista con las posiciones de lossímbolos de la secuenciapos : 1234 5678 901seqX : TCAG ACGA TTG n=11Tabla Hash (seqX)A 3, 5, 8C 2, 6G 4, 7, 11T 1, 9, 10Secuencia a compararpos : 1234567890seqY: ATCGGAGCTG m=10Acumular identidades en cada diagonal(d= h - v, si x halínea con y v)y 1(A) en d 2(3-1), d 4(5-1) y d 7(8-1)y 2(T) en d -1(1-2), d 7(9-2) y d 8(10-2)Complejidad : Cada elemento de sY vs el número de elementos hash para ese símboloO(N*media) media=M / LongTabla (N, M long de SeqX y SeqY)k-tuplas : [+] entradas (L=lAlf k ) -> [-] elementos por entradaProteinas : lAlf=20, Si k=2 => L= 20 2 = 400 entradas.Long. Proteina N=400 -> 1 valor por entrada => complejidad O(N+M)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación por SemejanzasMejoras en la SensibilidadLimitaciones de los Métodosbasados en Identidad•Código genético redundante•Sustituciones sin influencia sobre la función global•Inserción y pérdida de residuos.•Cantidad de información (frecuencia) de cada símbolo•Conocimiento biológico en la valoraciónDistancia: El coste de transformar una secuencia en otra por medio de laaplicación de una serie de operaciones (sustitución, inserción, borrado),cada una con un coste asociado.Para cada pareja de símbolos (a i ,a j ) A 2 un esquema de costes w(a i ,a j )establece la relación entre ellosAQUIPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Esquemas de PuntuaciónCapturar el significado biológico de las semejanzasMatrices PAM. Dayhoff (1972)Considerar los reemplazos conservativosy las diferencias en las frecuencias observadasEvolutivo, proporcional a log(f AB /f ' AB) para alinear el residuo A con el Bf AB frecuencia AB en alineamientos relacionadosf ' AB frecuencia en los alineamientos no relacionados (f ' AB=f A xf B )f ABDepende de la semejanza entre las proteinas[Pequeña]para secuencias muy relacionadas[Crece]a mayores distancias evolutivas[Azar]a distancias evolutivas muy grandesFuente:Alineamientos múltiples con no más de un 15% de diferencias por identidad.Tablas de las frecuencias de sustitución entre residuosNormalizar (en 100 residuos 1 mutación) => PAM, 1% Percent Accepted MutationExtrapolar a diferentes distancias (120, 250, 320, etc) PAMs.vPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Esquemas de PuntuaciónCapturar el significado biológico de las semejanzasMatrices BLOSUM. Altschul (1991) No se conoce a priori lo semejante que son las secuencias a buscar PAM extrapola las relaciones lejanas a partir de relaciones cercanas(Hipótesis que favorece las posiciones más mutables)Fuente: Alineamientos de bloques de secuencias.Bloque Matriz cuyas filas representansegmentos de secuenciasalineadas sin interrupcionesEKPRKVMLMVRAGDVVDQFIEALLPHLEEGEKPRKIFLMVTAGKPVDSVIQSLKPLLEEGETPRKILLMVKAGTATDATIQSLLPHLEKDETPRKILLMVKAGTATDATIQSLLPHLEKDETPRRILLMVKAGAGTDAAIDSLKPYLDKGETPRRILLMVKAGSGTDSAIDSLKPYLDKGBLOSUMnn (BLOcks SUbstitution Matrices)(nn : umbral de identidad utilizado para la seleccionar bloques)Un blosum bajo (umbral bajo de identidad) se corresponde conun número alto de PAM (distancia evolutiva grande).Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

AsxGlxPaulino Gomez-PuertasEsquemas de PuntuaciónCapturar el significado biológico de las semejanzaspam250 (inferior) y BLOSUM62 (superior)Asx GlxA R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X *--+-------------------------------------------------------------------------+---| 4 -1 -2 -2 0 -1 -1 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 0 -3 -2 0 -2 -1 0 -4 | A| 5 0 -2 -3 1 0 -2 0 -3 -2 2 -1 -3 -2 -1 -1 -3 -2 -3 -1 0 -1 -4 | RA | 2 6 1 -3 0 0 0 1 -3 -3 0 -2 -3 -2 1 0 -4 -2 -3 3 0 -1 -4 | NR | -2 6 6 -3 0 2 -1 -1 -3 -4 -1 -3 -3 -1 0 -1 -4 -3 -3 4 1 -1 -4 | DN | 0 0 2 9 -3 -4 -3 -3 -1 -1 -3 -1 -2 -3 -1 -1 -2 -2 -1 -3 -3 -2 -4 | CD | 0 -1 2 4 5 2 -2 0 -3 -2 1 0 -3 -1 0 -1 -2 -1 -2 0 3 -1 -4 | QC | -2 -4 -4 -5 12 5 -2 0 -3 -3 1 -2 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 1 4 -1 -4 | EQ | 0 1 1 2 -5 4 6 -2 -4 -4 -2 -3 -3 -2 0 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -1 -4 | GE | 0 -1 1 3 -5 2 4 8 -3 -3 -1 -2 -1 -2 -1 -2 -2 2 -3 0 0 -1 -4 | HG | 1 -3 0 1 -3 -1 0 5 4 2 -3 1 0 -3 -2 -1 -3 -1 3 -3 -3 -1 -4 | IH | -1 2 2 1 -3 3 1 -2 6 4 -2 2 0 -3 -2 -1 -2 -1 1 -4 -3 -1 -4 | LI | -1 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -3 -2 5 5 -1 -3 -1 0 -1 -3 -2 -2 0 1 -1 -4 | KL | -2 -3 -3 -4 -6 -2 -3 -4 -2 2 6 5 0 -2 -1 -1 -1 -1 1 -3 -1 -1 -4 | MK | -1 3 1 0 -5 1 0 -2 0 -2 -3 5 6 -4 -2 -2 1 3 -1 -3 -3 -1 -4 | FM | -1 0 -2 -3 -5 -1 -2 -3 -2 2 4 0 6 7 -1 -1 -4 -3 -2 -2 -1 -2 -4 | PF | -4 -4 -4 -6 -4 -5 -5 -5 -2 1 2 -5 0 9 4 1 -3 -2 -2 0 0 0 -4 | SP | 1 0 -1 -1 -3 0 -1 -1 0 -2 -3 -1 -2 -5 6 5 -2 -2 0 -1 -1 0 -4 | TS | 1 0 1 0 0 -1 0 1 -1 -1 -3 0 -2 -3 1 2 11 2 -3 -4 -3 -2 -4 | WT | 1 -1 0 0 -2 -1 0 0 -1 0 -2 0 -1 -3 0 1 3 7 -1 -3 -2 -1 -4 | YW | -6 2 -4 -7 -8 -5 -7 -7 -3 -5 -2 -3 -4 0 -6 -2 -5 17 4 -3 -2 -1 -4 | VY | -3 -4 -2 -4 0 -4 -4 -5 0 -1 -1 -4 -2 7 -5 -3 -3 0 10 4 1 -1 -4 | BV | 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -1 -2 4 2 -2 2 -1 -1 -1 0 -6 -2 4 4 -1 -4 | ZB | 0 -1 2 3 -4 1 2 0 1 -2 -3 1 -2 -5 -1 0 0 -5 -3 -2 2 -1 -4 | XZ | 0 0 1 3 -5 3 3 -1 2 -2 -3 0 -2 -5 0 0 -1 -6 -4 -2 2 3 1 | *X | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 |--+-------------------------------------------------------------------------+---A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V B Z X *Bioinformática.

Esquemas de PuntuaciónCapturar el significado biológico de las semejanzasAsx GlxPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación por Semejanzas (Global)Esquema de Pesos┌───┬───┬───┬───┬───┐│ │ A │ C │ G │ T │├───┼───┼───┼───┼───┤│ A │ 4 │-3 │ 1 │-3 │├───┼───┼───┼───┼───┤│ C │-3 │ 4 │-3 │ 1 │├───┼───┼───┼───┼───┤│ G │ 1 │-3 │ 4 │-3 │├───┼───┼───┼───┼───┤│ T │-3 │ 1 │-3 │ 4 │└───┴───┴───┴───┴───┘4: Residuos iguales1: Residuos del mismo tipopurinas (AG), pirimidinas (CT)-3: Combinaciones restantes.Score 1 4 4-3 4 4-3 1-3 4SeqH G T C C G A C T A G T GSeqV C A T C G G A G C T GAcum 1 5 9 6 1 1 1 1 9 10 4 1 2 3G T C C G A C T A GC -3 1 4 4 -3 -3 4 1 -3 -3A 1 -3 -3 -3 1 4 -3 -3 4 1T -3 4 1 1 -3 -3 1 4 -3 -3C -3 1 4 4 -3 -3 4 1 -3 -3G 4 -3 -3 -3 4 1 -3 -3 1 4G 4 -3 -3 -3 4 1 -3 -3 1 4A 1 -3 -3 -3 1 4 -3 -3 4 1G 4 -3 -3 -3 4 1 -3 -3 1 4C -3 1 4 4 -3 -3 4 1 -3 -3T -3 4 1 1 -3 -3 1 4 -3 -3G 4 -3 -3 -3 4 1 -3 -3 1 44 -6 -2 3 7 0 -14 -13 13Needleman-WunschPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Comparación por Semejanzas(LOCAL)Fragmento con puntuación acumulada máximaNo se puede incrementar estirando ni recortando por los extremosG T C C G A C T A G T GC -1 -4 (4 -4 (1 (1A (1 1 (4 4 (1 1)=2T 4 (1 -1 -3 1 (4 -3 4)=5C -1 4 4 4)=6 1 -3 1G -4 -3 4 -1 1 4)=5 4)=7G -4 4 1)=10 (1 4 -4A -1 (1 4)=14 (4 1)=2 -3 -1G (4 -4 1 -1 4 4­)=12C 1 (4 -4 4 -1 1)=9T -4 1)=6 1 -1 4 (4G -4 4)=9 -1 1)=11 -4 4)8Inicia en Celda positivaAvanza acumulando valores(mientras acum>0)Fin: Fin de diagonalAcumulado < 0-> regresar al máximoNo incorpora zonas no-conservadas┌───┬───┬───┬───┬───┐│ │ A │ C │ G │ T │├───┼───┼───┼───┼───┤│ A │ 4 │-3 │ 1 │-3 │├───┼───┼───┼───┼───┤│ C │-3 │ 4 │-3 │ 1 │├───┼───┼───┼───┼───┤│ G │ 1 │-3 │ 4 │-3 │├───┼───┼───┼───┼───┤│ T │-3 │ 1 │-3 │ 4 │└───┴───┴───┴───┴───┘Recorrido Exhaustivo de DiagonalesSmith-WatermanPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Global vs localNeedleman-Wunsch / Smith-WatermanPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Una Heurística para Comparar por SemejanzaVelocidad a cambio de PrecisiónNo asegura un resultado óptimo, pero en ocasiones es la única soluciónExhaustivo : Recorrer todas las diagonales O(NM)Heurístico : Limitar las diagonales a recorrer (aquellas con más identidades)Posic: 123456789012Seq.H: GTCCGACTAGTGTabla A : 6, 9Hash C : 3, 4, 7G : 1, 5,10,12T : 2, 8,11Secuencia a compararPosic: 12345678901Seq.V: CATCGGAGCTGDiag = (h - v)si x halínea con y vPaulino Gomez-PuertasLipman & PearsonDiag. 0: 2 [n+m-1 diags]D. -1: 5 D.1: 2-2: 2 D.2: 3-3: 1 D.3: 2-4: 1 D.4: 3Sensibilidadvs.recursos-5: 2 D.5: 2-6: 2 D.6: 2-7: 1 D.7: 2-8: 1 D.8: 1-9: 0 D.9: 0-10: 1 D10: 0D11: 0Bioinformática.

Las Interrupciones (Gaps)Aumentar el parecido deformando losobjetosX: TCAG-ACG-ATTG TCAGACGATTG|| | | | | | || || | | |Y: ATC-GGA-GC-T-G ATCGGA-GCT-GLa ideaFrg {TT, CC, AG, GG, AA} (Sc=18) puede:(a) Extender en diagonal (C y G) sin gaps(pierde 3 puntos, hasta 15).(b) Emparejar C (sX) con alguno (CTG) sY(gaps en sY)(c) Emparejar G (sY) con alguno (GATTG) sX(gaps en la sec.X)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Programación DinámicaEsquema de Pesos[ 4] residuos iguales[ 2] residuos del mismo tipo[-3] Resto.iGap: -5eGap: -2Mejor alineamiento:TCAGACGATTG||.|| ..||ATCGGA--GCTGPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Clasificación de las aplicacionesN=1, M=1Pairwise comparison (lo visto hasta ahora).N=1, M>>1Búsquedas en bases de datos : FASTA, BLAST, PSI-BLASTN>1, M>1Alineamiento múltiple : PILEUP, CLUSTAL-W, T-COFFEE, HMMsPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Búsquedas Rápidas: FASTA(Lipman & Pearson, 1985, Pearson & Lipman 1988)Reducir el espacio de búsqueda¿ En qué diagonales es más probable que se encuentre el mejor alineamiento ?Etapa I : Búsqueda de Regiones (diagonales) porIdentidad y sin GapsUso de k-tuplas para acelerarResultado : Las mejores diagonales (10)Complejidad O(N+M)Etapa II:Re-evaluación de las regiones por semejanzaUnión de regiones con GapsEtapa III:Evaluación exhaustiva de las mejores secuenciasReducciones de hasta 2 órdenes de magnitud en los tiempos de búsqueda.Velocidad a cambio de sensibilidad y selectividad(pierde reemplazos conservativos y palabras más pequeñas que k)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)Altschul, S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., and Lipman D.J.J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10.Identificación de las mejores diagonales utilizando criterios de semejanzaUso de k-tuplas por semejanza (amplía el espacio de búsqueda de FASTA)Corte estadístico (baja probabilidad de ocurrencia)(a)(b)- Artículo más citado en la década de los 90 -Identificación rápida de segmentos (MSP: maximal segment pair.Segmento: sub-secuencia continua de cualquier longitud.Puntaje: Suma de la semejanza de cada parAnálisis detallado de MSPs con mas probabilidad de formar el alineamiento finalPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

e-value (E)Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)A partir de un modelo en el que estudiaron qué “scores” alcanzaban los alineamientos de secuenciasgeneradas al azar (según las frecuencias observadas de aminoácidos), Karlin & Altschul desarrollaron lasiguiente fórmula para el cálculo del e-value:E = -KMn e -lSEl e-value (E) de un determinado score indica cuántos alineamientos esperamos que por azar alcancenun score igual o mayor (no confundir con el p-value, que indica la probabilidad de que un score se hayaalcanzado por azar al menos en una ocasión). E-value y p-value se relacionan mediante la siguientefórmula:P = 1 – e -E(P y E tienen un valor prácticamenteidéntico en la escala de 0 a 0.01)En una búsqueda en bases de datos de secuencia, K y l son dos parámetros que se determinanempíricamente a partir del máximo y la anchura de la distribución de “scores” tras la comparación desecuencias “random”, N es la longitud de la secuencia y S es el “score” del alineamiento. M es el tamañode la base de datos (número total de aminoácidos o nucleótidos; tras aplicar una cierta corrección).Más información:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/tutorial/Altschul-1.htmlLesk, AM. Introduction to Bioinformatics. 2nd Ed. p183Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)Probability valuesP-value0 < P = 1 – e -E < 10

Gapped BLAST and PSI-BLAST. A new Generation of Protein DB search Programs.Altschul, S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhanng J., Zhang Z., Miller W., and LipmanD.J. Nucleid Acids Research (1997) 25: 3389-3402PSI-BLAST: Búsqueda iterativaConstrucción de una matriz de pesos específica por posición.Uso de la matriz para realizar una nueva búsqueda.Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Intermediate sequence searches:PROTOMAP databasePaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Alineamientos múltiplesSi alinear 2 secuencias de 300 residuos tardase 1 segundo:Entonces:alinear 3 secuencias tardaría 300 segundosalinear 10 secuencias aprox 300 8 segs (+ que la edad del universo)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

CLUSTAL-W:Clustal-W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting position specific gap penalties and weight matrix choice.Thomson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994)Nucleid Acids Research 22, 4673-4680.T-COFFEE:T-Coffee: a novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.Notredame C, Higgins DG & Heringa J. (2000)Journal of Molecular Biology. 302, 205-217.Formación de clusters de secuencias (Clustal-W):La pareja más parecida se alinea para formar un único cluster.Este cluster se toma ahora como una sola secuencia y el procesose repite hasta tener un solo cluster con todas las secuenciasalineadas.Paulino Gomez-PuertasLos alineamientos múltiples permiten:Inferir filogenias.Construir perfiles.Bioinformática.

Motivos, perfiles y dominiosPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

¿A qué llamamos motivos?Observación: En proteínas de la misma familia podemosdetectar pequeñas regiones conservadas, a menudo asociadasa su función.Ej. Sitios de unión, centros activos de enzimas, etc.Características: La conservación no es perfecta. No sondetectables mediante técnicas de homología de secuencia(BLAST, FASTA, etc).Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Y… ¿para qué se usan?Los motivos se conservan incluso a grandes distanciasevolutivas debido a restricciones estructurales o funcionalesluego...Están relacionadoscon la funciónSe conservanPredicciónDetección dehomólogosremotosPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Motivos: descripción•Expresiones regulares•Perfiles•HMMsPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Expresiones regularesALRDFATHDDFSMTAEATHDSIECDQAATHEASA-T-H-[DE]Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Expresiones regulares•Cualquier aminoácido: x•Ambigüedad: [A,B…] A, o B... o {A,B..} cualquieramenos A, B…•Repetición: A(2,4) A-A o A-A-A o A-A-A-A•N terminal: [AC]-x-V-x(4)-{E,D}.[Ala or Cys]-any-Val-any-anyany-any-{anybut Glu or Asp}Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

PerfilesF K L L S H C L L VF K A F G Q T M F QY P I V G Q E L L GF P V V K E A I L KF K V L A A V I A DL E F I S E C I I QF K L L G N V L V CA -18 -10 -1 -8 8 -3 3 -10 -2 -8C -22 -33 -18 -18 -22 -26 22 -24 -19 -7D -35 0 -32 -33 -7 6 -17 -34 -31 0E -27 15 -25 -26 -9 23 -9 -24 -23 -1F 60 -30 12 14 -26 -29 -15 4 12 -29G -30 -20 -28 -32 28 -14 -23 -33 -27 -5H -13 -12 -25 -25 -16 14 -22 -22 -23 -10I 3 -27 21 25 -29 -23 -8 33 19 -23K -26 25 -25 -27 -6 4 -15 -27 -26 0L 14 -28 19 27 -27 -20 -9 33 26 -21M 3 -15 10 14 -17 -10 -9 25 12 -11N -22 -6 -24 -27 1 8 -15 -24 -24 -4P -30 24 -26 -28 -14 -10 -22 -24 -26 -18Q -32 5 -25 -26 -9 24 -16 -17 -23 7R -18 9 -22 -22 -10 0 -18 -23 -22 -4S -22 -8 -16 -21 11 2 -1 -24 -19 -4T -10 -10 -6 -7 -5 -8 2 -10 -7 -11V 0 -25 22 25 -19 -26 6 19 16 -16W 9 -25 -18 -19 -25 -27 -34 -20 -17 -28Usa pesos discriminatorios no solopara los AAs que aparecen. Para losque no aparecen se basan en lasfrecuencias observadas y en laprobabilidad de que el AA seasustituidoA tiene más baja probabilidad que Mque, aunque no aparece, sabemosque M es fisicoquímicamente mássimilar a L, I, V y F.Más sensibles que lasexpresiones regularesY 34 -18 -1 1 -23 -12 -19 0 0 -18Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

HMMsHidden Markov models (HMMs) son modelos estadísticosde la estructura primaria de las secuencias.Se supone que lo que vemos es resultado de un procesooculto (hidden) del que tenemos un modelo.Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

HMMs y motivosEste es el más usado. Corresponde a un alineamiento contres estados (m 1 , m 2 , m 3 ) con 20 probabilidades de ser unresiduo (barras) cuatro estados de inserción (i 0 , i 1 , i 2 , i 3 ) ytres estados de delección (d 1 , d 2 , d 3 ). Las flechas representanlas probabilidades de transición entre estadosTodos o algunosde los parámetrospueden serestimados de losdatosPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Bases de datosPROSITE:BLOCKS:PRINTS:Pfam:Expresiones regulares y perfiles.Basada en motivos conocidos (SwissProt)Perfiles. Basada en PROSITE.Perfiles. Basada en motivos conocidosPerfiles HMM.Generación automática de motivos.SwissProt + SP-TrEMBLPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

ComparaciónInformaciónSP-TrEMBLPfamSwissProtPROSITE BLOCKSExpresionesregularesPRINTSPerfilessimples múltiplesHMMsPrecisiónPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

PfamProtein families databaseof alignments and HMMshttp://www.sanger.ac.uk/Pfampfam-A & pfam-B(UniProt)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

PfamProtein families database of alignments and HMMsPKRPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

ATPsubunitMolecular chaperonin GroELheptamer(Dr Jianpeng Ma, Harvard Univ.)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Extracción de información evolutiva apartir de alineamientos múltiples deproteína.Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Integration of Evolutive Informationconservedtree-determinantscorrelated mutationsInformation extracted from multiple sequence alignmentsPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Integration of Evolutive InformationconservedInformation extracted from multiple sequence alignmentsPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Hydroxymethylglutaryl-CoA lyase (HMGL)b1 a1b2 a2b3a3b4a4b5a5b6a6b7a7b8a8Paulino Gomez-PuertasF.G. HEGARDT. UBJ. PIE. Univ. Zar.N . CASALS. UIC.Bioinformática.

S75a3a2D42 R41a1Hydroxymethylglutaryl-CoA lyase (HMGL)L263D42S75L263E279a4CNa8S201a5a6a7D204H233D204H233V70CS201S75D42 R41L263E279H233D204FG. HegardtJ. PieN. CasalsPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Integration of Evolutive Informationcorrelated mutationsInformation extracted from multiple sequence alignmentsPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Correlated MutationsPazos et al.J. Mol. Biol., 1997SINGLEMUTATIONDECREASEDSTABILITY"RESTORED"STABILITYSECOND COMPENSATORYMUTATIONPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Correlated mutationsPhenylalanine hydroxylase (PAH)homotetramer.inter-protein contactsR297 (monomer B)D415 (monomer A)intra-protein contactsPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Integration of Evolutive Informationtree-determinantsInformation extracted from multiple sequence alignmentsPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

carnitine/choline acyl transferasesF.G. HegardtChATCrATcholinecarnitineCPT IImalonyl-CoA insensitivemalonyl-CoA regulatedCOTM-CPT IL-CPT IPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Carnitine-Choline: Thr/Glu/Thr vs. Val/Asp/AsnMalonyl-CoA regulation: Met vs. SerShort vs. Long substrate: Gly vs. MetPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

carnitineH473E14G711G710V481G709Model (Cordente et al, 2004; JBC)palmitoyl-CoAG482W485V706V488M489A490H12Crystal structure (Hsiao et al, 2004; JBC)Paulino Gomez-PuertasBioinformática.

Gracias a:Federico AbascalOswaldo TrellesJoaquín DopazoMuseo Nacional de CienciasNaturales. MadridDto. Arquitectura de ComputadoresUniversidad de MálagaCSAT - Príncipe FelipeValenciaPaulino Gomez-PuertasBioinformática.

Cuestiones…Paulino Gomez-PuertasBioinformática.