RVCTA Volumen 5 - Número 1

RVCTA
Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología de Alimentos. 5 (1): 001-017. Enero-Junio, 2014
http://www.rvcta.org
ISSN: 2218-4384 (versión en línea)
© Asociación RVCTA, 2014. RIF: J-29910863-4. Depósito Legal: ppi201002CA3536.
Artículo
Cuantificación de plaguicidas residuales en granos de maíz
(Zea mays L.) aplicando técnicas de evaluación residual
Determination of residual pesticides in corn (Zea mays L.) kernels using residual
evaluation techniques
Dante Rojas 1 *, Valeria Messina 2,3 , Ana María Sancho 1 , Natalia Pesquera 1 , Diego Cristos 1 ,
Mariana Galicio 4 , Alejandra Ricca 1
1 Instituto de Tecnología de Alimentos, Centro de Investigación de Agroindustria, Instituto Nacional de
Tecnología Agropecuaria (INTA). B1708WAB, Morón, Buenos Aires, Argentina.
2 Centro de Investigaciones en Sólidos (CINSO), Instituto de Investigaciones Científicas y Técnicas
para la Defensa (CITEDEF) / Unidad de Investigación y Desarrollo Estratégicos para la Defensa
(UNIDEF), Ministerio de Defensa (MINDEF) - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y
Técnicas (CONICET). Juan Bautista de la Salle 4970 (B1603ALO), Buenos Aires, Argentina.
3 Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Avenida Rivadavia 1917
(C1033AAJ), Buenos Aires, Argentina.
4 Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires (UBA). Avenida Chorroarín 280
(C1427CWO), Buenos Aires, Argentina.
*Autor para correspondencia: drojas@cnia.inta.gov.ar
Aceptado 18-Abril-2014
Resumen
El empleo de plaguicidas en la producción agrícola ha tomado marcada importancia para
muchos sectores de la sociedad. Los productores agropecuarios necesitan realizar un tratamiento
fitoterapeútico efectivo y la utilización de estos agroquímicos es una alternativa rentable. Sin embargo,
la toxicidad de estas sustancias presenta un riesgo para la salud humana durante su fabricación y

002 Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(1):001-017.
empleo. El objetivo del presente trabajo fue obtener información de los niveles y frecuencia de los
principales residuos de pesticidas presentes en granos de maíz aplicando técnicas de evaluación
multiresidual. El muestreo (basado en la Norma ISO 950:1979) fue realizado en cintas de embarque y
terminales portuarias del Río Paraná y del sur de la Provincia de Buenos Aires (Argentina), dado que
manejan más del 80 % de las exportaciones del país (Ingeniero White, Rosario/General San Martín/San
Lorenzo, Villa Constitución y Quequén). Sobre un total de 192 muestras, 94 presentaron residuos de
plaguicidas, siendo el orden de frecuencia de aparición de los mismos: fenitrotión (n = 40) >
cipermetrina (n = 31) > pirimifós metil (n = 27) > deltametrina (n = 24) > clorpirifós metil (n = 23) >
diclorvós (n = 18) > permetrina (n = 15) > clorpirifós etil (n = 12) > fenvalerato (n = 3) > malatión (n =
2) > endosulfán (n = 0; suma de alfa endosulfán, beta endosulfán y endosulfán sulfato). No se hallaron
organoclorados. Considerando la legislación Argentina, solo 4 muestras presentaron niveles superiores
a los Límites Máximos de Residuos (LMR), siendo cipermetrina el plaguicida involucrado. Sin
embargo, según los LMR del Codex Alimentarius, todas las muestras presentaron niveles permitidos.
Palabras claves: granos de maíz, evaluación multiresidual, límites residuales, plaguicidas, técnicas
residuales.
Abstract
The use of pesticides in agricultural production, has taken strong importance to many sectors of
society. Agricultural producers need to make effective phytotherapeutic treatment and the use of these
agrochemicals is an economical alternative. However, the toxicity of these substances presents a risk to
human health during manufacture and use. The aim of this study was to obtain information on the level
and frequency of major pesticide residues present in Argentina in corn kernels applying multiresidual
evaluation techniques. Sampling (based on ISO 950:1979 standard) was performed on tape loading and
port terminals of the Parana river and south of the Province of Buenos Aires, due that these locations
manage over 80 % of the country‟s exports (Ingeniero White, Rosario/General San Martín/San
Lorenzo, Villa Constitución and Quequén). Of a total of 192 samples, 94 samples contained at least one
pesticide residue. The frequency of appearance of pesticide were: fenitrothion (n = 40) > cypermethrin
(n = 31) > pirimiphos methyl (n = 27) > deltamethrin (n = 24) > chlorpyrifos methyl (n = 23) >
dichlorvos (n = 18) > permethrin (n = 15) > chlorpyrifos ethyl (n = 12) > fenvalerate (n = 3) >
malathion (n = 2) > endosulfan (n = 0; sum of alpha endosulfan, beta endosulfan and endosulfan
sulphate). Organochlorines were not detected. According to Argentine legislation, only 4 samples had
levels above Maximum Residue Levels (MRLs). Cypermethrin presented levels above MRL. Besides,
according to Codex Alimentarius, all samples were below the levels allowed.
Keywords: corn kernels, multiresidual evaluation, pesticides, residual limits, residual techniques.
INTRODUCCIÓN
La producción Argentina de maíz (Zea
mays L.) mostró una tendencia al crecimiento
desde las primeras campañas de la década del
90. La producción anual de maíz fue alrededor
de 20 millones de toneladas para el 2005 (Fig.
1), para consumo interno solo se destinaron 5
millones de toneladas, el resto fue el saldo
exportable (Pouiller, 2005; Ricca, 2006;

Rojas, Dante et al. 003
Figura 1.- Producción de maíz en Argentina. Período 1990-2012.
FAOSTAT, 2013). La producción de maíz de
Argentina para 2013/2014 se estima en 25
millones de toneladas (USDA/FAS, 2014).
En el mundo el 14,2 % de los pesticidas
son utilizados para la producción de maíz
(Racke, 2003). Históricamente, en Estados
Unidos el 41 % del área cultivada de maíz ha
sido tratada con insecticidas y raramente con
fungicidas y las pérdidas de rendimiento
ocasionadas por malezas, insectos y patógenos
han sido estimadas en 10 %, 12 % y 10 %,
respectivamente (Clark et al., 1998).
Los productores agropecuarios necesitan
realizar un tratamiento fitoterapéutico efectivo
y una alternativa rentable es la utilización de
estos agroquímicos. Sin embargo, la toxicidad y
el uso incorrecto de estas sustancias presentan
un riesgo para la salud humana durante su
fabricación y empleo (Coscollá, 1993; Souza-
Casadinho y Bocero, 2008; FAO/WHO, 2014).
Los residuos de plaguicidas también
pueden afectar a la población en forma indirecta
consumiendo alimentos y directamente por la
contaminación ambiental. Sin embargo, la
capacidad de los individuos para evitar su
exposición es limitada. Como consecuencia, las
autoridades nacionales redactan legislaciones
con el fin de generar conductas que disminuyan
el riesgo para la salud y favorezcan la
producción cuidando el medio ambiente (FAO,
2006).
Modelos matemáticos han proyectado
incrementos en el número de casos de
envenenamiento a causa de plaguicidas en el
mundo, de 500 mil casos por año en 1972 a 25
millones de casos por año estimados en 1990
(Levine y Doull, 1992; Teixeira et al., 2004).
Según datos oficiales publicados por el
Ministerio de Salud de la Nación, en los
Centros de Información, Asesoramiento y
Asistencia Toxicológica (CIAAT‟s) en
Argentina, en el año 2000 correspondiente al
Informe I se registraron 12976 consultas para
plaguicidas de uso doméstico y 2185 consultas
para plaguicidas de uso agrícola, a su vez, dicho
centro informó que las consultas relacionadas a
plaguicidas de uso doméstico correspondieron
al 12 % (MSAL, 2000). En el año 2002 en el
Informe III se registraron 9781 casos probables
y confirmados para plaguicidas. A su vez, como
plaguicidas de uso veterinario se registraron
algunos productos veterinarios, donde
aparecieron 589 casos en el Informe II y 765
casos en el Informe III, pero en esos informes
no especificaron cuantos productos veterinarios
correspondieron a plaguicidas (MSAL, 2001;
MSAL, 2002).
Algunos plaguicidas están totalmente
prohibidos o restringidos debido a su elevada
toxicidad, y otros están autorizados para el

004
empleo en la producción agropecuaria. No
obstante, la presencia de residuos de este último
grupo de pesticidas en cultivos y alimentos,
tiene fijado un Límite Máximo de Residuo
(LMR) (Coscollá, 1993; Krieger et al., 2010;
PNUMA, 2010).
El uso extensivo de productos
fitosanitarios y su toxicidad, condiciona a los
gobiernos a regular su empleo, poniendo en
práctica programas de control de residuos con
diferentes objetivos como la evaluación
toxicológica, la eficacia, la naturaleza y
cantidad de residuos derivados de la aplicación
de las distintas formulaciones comerciales.
El análisis químico de productos
fitosanitarios en matrices alimenticias y
medioambientales tiene una posición destacada
para llevar a cabo estos controles (Lehotay y
Hajšlová, 2002; Racke, 2003).
La validez de los resultados analíticos y
las exigencias de los países compradores son
consideraciones importantes a tener en cuenta
en un laboratorio que realiza análisis de
residuos de pesticidas en productos
agroalimentarios. Además, una forma de
ahorrar tiempo, trabajo y dinero en el
laboratorio es utilizar el menor número de
métodos para la mayor cantidad de analitos.
El objetivo del presente trabajo fue
obtener información de los niveles y frecuencia
de los principales residuos de pesticidas
presentes en granos de maíz aplicando técnicas
de evaluación multiresidual de plaguicidas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras
El muestreo, basado en la Norma ISO
950 (ISO, 1979), fue realizado durante 2
periodos de cosecha (2012 y 2013). Se
obtuvieron un total de 192 muestras de granos
de maíz, 165 muestras fueron obtenidas de las
cintas de embarque y 27 de terminales
portuarias del Río Paraná y del sur de la
Provincia de Buenos Aires (Ingeniero White,
Rosario/General San Martín/San Lorenzo, Villa
Constitución y Quequén), dado que manejan
más del 80 % de las exportaciones del país.
Previo a su análisis, se realizó en los
laboratorios portuarios la molienda de los
granos bajo la supervisión de personal
proveniente del Servicio Nacional de Sanidad y
Calidad Agroalimentaria (SENASA),
organismo responsable de garantizar y certificar
la sanidad y calidad de la producción
agropecuaria, pesquera y forestal. Las muestras
fueron empaquetadas, selladas, rotuladas y
remitidas al laboratorio INTA (Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria,
Laboratorio de Plaguicidas) donde fueron
almacenadas en refrigeración a -18 ± 1 ºC hasta
su análisis.
Tratamiento de las muestras para su
análisis
El método empleado se basó en el
procedimiento QuEChERS („quick, easy,
cheap, effective, rugged, and safe‟) (Lehotay et
al., 2007).
Se colocaron 5 g de granos molidos en
un tubo de polipropileno con tapa a rosca de 50
mL. Se agregó 1 mL de hexaclorobenceno
(Sigma-Aldrich®), agua desionizada y se agitó.
Se agregó ácido acético glacial (Sintorgan®) (1
% en acetonitrilo), acetato de sodio anhidro
(Sigma-Aldrich®) y sulfato de magnesio
anhidro (Sigma-Aldrich®). Inmediatamente se
agitó manualmente durante 1 minuto y se
centrifugó a 5000 rpm (Gelec®, modelo G-
130D) durante 3 minutos para separar el
extracto límpido. Se transfirió el extracto a un
tubo de polipropileno con tapa de 2,5 mL con
amina primaria-secundaria (PSA) (Sigma-
Aldrich®), C18 y sulfato de magnesio anhidro.
Inmediatamente se agitó manualmente durante
5 minutos y se centrifugó a 5000 rpm para
obtener un sobrenadante. Luego se colocó 500
µL del sobrenadante en viales de vidrio y se
añadió solución de trifenilfosfato (Sigma-
Aldrich®).

Rojas, Dante et al. 005
La optimización de la técnica analítica
se realizó con muestras blanco. Las mismas no
presentaron tratamiento con los plaguicidas
investigados.
Preparación de patrones para evaluar
pesticidas en las muestras
Disoluciones y diluciones se realizaron
corrigiendo los volúmenes de forma
gravimétrica, a fin de disminuir la
incertidumbre del método (Ávila et al., 2004;
Štěpán et al., 2004; Herrera de Pablo et al.,
2007; Pihlström et al., 2009). Se utilizó
material volumétrico de vidrio calibrado con
certificado de trazabilidad al Sistema
Internacional de Unidades.
Se prepararon soluciones patrones (10
mg/mL tolueno) de clorpirifós metil, clorpirifós
etil, pirimifós metil, fenitrotión, malatión, alfa
endosulfán, beta endosulfán, endosulfán
sulfato, permetrina, cipermetrina, fenvalerato,
esfenvalerato, deltametrina (Sigma-Aldrich®),
diclorvós (AccuStandard®) y soluciones
patrones (2 mg/mL tolueno) para
hexaclorobenceno (HCB) y trifenilfosfato
(TPP) (Sigma-Aldrich®). A su vez se utilizaron
soluciones mezclas de pesticidas de diferentes
concentraciones para determinar los parámetros
analíticos del método (exactitud, precisión,
sensibilidad, entre otros). Se utilizaron HCB y
TPP como estándares internos (Lehotay, 2006).
Curva de calibración
La respuesta de los analitos se
comprobó trabajando con extractos de muestras
blanco contaminadas a distintos niveles de
concentración: 0,005 mg/kg; 0,01 mg/kg; 0,02
mg/kg; 0,03 mg/kg; 0,05 mg/kg; 0,1 mg/kg; 0,2
mg/kg; 0,3 mg/kg; 0,6 mg/kg y una muestra
blanco. Se realizó el ensayo por triplicado, con
al menos 2 inyecciones para cada nivel. La
muestra blanco fue incluida para investigar la
aparición de sustancias co-extraídas del maíz
que produzcan interferencias o actúen como
contaminación.
Para su análisis se aplicó Análisis de
Regresión y se calculó el coeficiente de
correlación de Pearson (r) (Ec. 1).
Ecuación (1)
r
Donde:
c : es la concentración
s : es la señal correspondiente a c
c : es el promedio de c
c
cs
s
2
c
c s
s
s : es el promedio de s (Di Rienzo et al., 2008)
El criterio de aceptación utilizado fue R
≥ 0,98 (Herrmann y Poulsen, 2007; 2008;
2009).
Ensayos de recuperación
Se contaminaron muestras blanco
artificialmente a distintos niveles: 0,01 mg/kg;
0,02 mg/kg; 0,03 mg/kg; 0,04 mg/kg; 0,07
mg/kg; 0,15 mg/kg; 0,35 mg/kg y 0,60 mg/kg.
Una muestra blanco sin contaminación fue
incluida como “cero”. Se realizó el ensayo por
triplicado, con al menos 2 inyecciones para
cada nivel.
Exactitud: fue evaluada a través del
cálculo de Recuperación porcentual (R %). La
R % se calculó según Ec. 2.
(CF CU)
Ecuación (2) R % x 100
CN
Donde:
CF : es la concentración de analito medido en la
muestra fortificada
CU : es la concentración de analito medido en
la muestra sin fortificar
CN : es la concentración de analito agregado
(valor nominal o teórico) en la muestra
fortificada
2

006
El criterio de aceptación fue 70 ≤ R % ≤
120 % para cada analito en todos los niveles
(Pihlström et al., 2009).
Precisión: fue evaluada como
reproducibilidad. Se determinó para todos los
analitos en cada uno de los niveles y fue
expresada como Desviación Estándar Relativa
porcentual („Relative Standard Deviation‟, RSD
%) del ensayo de recuperación. La
reproducibilidad para cada nivel de
concentración, se calculó en base a todos los
valores de concentración obtenidos (Ec. 3).
SD
Ecuación (3) RSD % x 100
X
Donde:
SD : es la desviación estándar de las
determinaciones
X : es el promedio de la concentración
calculada de cada nivel.
El criterio de aceptación utilizado fue el
valor de RSD % observado para cada nivel
investigado ≤ RSD % calculado según la
ecuación de Horwitz (Horwitz, 1982; Herrmann
y Poulsen, 2007; 2008; 2009) (Ec. 4).
Ecuación (4)
(1-0,5 logC)
RSD % 2
Donde:
C : es la concentración expresada como una
fracción de masa
Sensibilidad: Límite de Detección (LD):
fue expresado como 3 veces la Desviación
Estándar („Standard Deviation‟, SD) de la
recuperación del menor nivel que cumple con
los criterios de aceptación de precisión y
exactitud. Límite de Cuantificación (LC): fue
expresado como 6 veces el SD de la
recuperación del menor nivel que cumple con
los criterios de aceptación de precisión y
exactitud.
Incertidumbre del método: La
estimación de la Incertidumbre del método se
realizó con los datos obtenidos del ensayo de
recuperación, según:
Ecuación (5)
Ecuación (6)
SD
RSD
R %
R %
media
U RSD · k · C
Donde:
RSD : es la desviación estándar relativa
SD R % : es la desviación estándar de
recuperación
R % media : es la recuperación promedio
C : es la concentración
k : es un factor de cobertura
U : es la incertidumbre expandida del método.
El valor de k es 2 para un nivel de
confianza de 95 %.
Detección y cuantificación de
pesticidas
Se utilizó un cromatógrafo de gases
marca PerkinElmer, modelo Clarus 600
(PerkinElmer, Inc., Shelton, Connecticut, USA)
con muestreador automático, puerto de
inyección con vaporizador de temperatura
programable (PTV, „programmed temperature
vaporization‟), control programable del sistema
neumático, usados para inyección de grandes
volúmenes (LVI, „large volume injection‟).
Guarda columna de sílice fundida de 5 m x 0,25
mm (Supelco), columna capilar marca Varian,
modelo Factor Four VF-5ms, de 30 m x 0,25
mm (0,25 µm) de fase estacionaria 95 %
dimetil-5 % difenil polisiloxano de bajo
sangrado. El gas portador („carrier‟) fue helio
con grado de pureza 99,999 %. Acoplado a un
espectrómetro de masas PerkinElmer, modelo
Clarus 600 (PerkinElmer, Inc.). Se utilizó una
fuente de ionización por impacto electrónico a
290 ºC. El mismo constó de un analizador

Rojas, Dante et al. 007
cuadrupolar, con un prefiltro también
cuadrupolar con detector dínodo de conversión,
una placa de fósforo y un tubo
fotomultiplicador.
Se inyectaron 10 µL de muestras y el
programa de temperatura del horno fue: 70 ºC
(6 min); a 25 ºC/min hasta 170 ºC; a 5 ºC/min
hasta 230 ºC; a 20 ºC/min hasta 290 ºC (10
min).
Los datos cromatográficos se obtuvieron
monitoreando iones específicos (SIM, „selected
ion monitoring‟) usando un ión de
cuantificación y al menos 2 iones calificadores,
para cada analito. Para la selección de los iones
se escogieron candidatos consultando la Base
de Datos de Laboratorios de Referencia de la
Unión Europea para Residuos de Plaguicidas
(„DataPool of the EU Reference Laboratories
for Residues of Pesticides‟). Los parámetros
finales fueron determinados por inyección de
soluciones patrones de los analitos en las
mismas condiciones en que se analizaron las
muestras (Albero et al., 2005).
Los residuos de plaguicidas se
identificaron de acuerdo a 2 parámetros: tiempo
de retención relativo al HCB y relación de
abundancias relativas de iones.
Se analizaron los siguientes plaguicidas:
diclorvós, clorpirifós metil, clorpirifós etil,
pirimifós metil, fenitrotión, malatión, alfa
endosulfán, beta endosulfán, endosulfán
sulfato, permetrina, cipermetrina, fenvalerato,
esfenvalerato y deltametrina.
Criterio de calidad de las muestras
Las muestras se analizaron por
duplicado y el desempeño analítico (GC-MS) se
trabajó con doble estándar interno TPP y HCB
en cada muestra. El criterio de aceptación fue
que la relación TPP/HCB (área de picos) se
mantuviera en todas las muestras (RSD < 10 %)
(Lehotay, 2006).
En cada tanda de 10 análisis se incluyó
un control de calidad (muestra blanco
contaminada) y un blanco de reactivos. Los
criterios utilizados fueron: a) Recuperación
porcentual (70 ≤ R % ≤ 120) para todos los
plaguicidas investigados; b) ausencia de
interferentes y contaminaciones en el blanco de
reactivos (Hill et al., 1999; Lehotay, 2006;
Pihlström et al., 2009).
Identificación de analitos
Para cada analito se determinó el tiempo
de retención relativo al HCB y la relación de
abundancias relativas entre el ión cuantificador
y al menos 2 iones calificadores. Siendo los
tiempos de retención relativos al HCB con una
tolerancia de ± 0,5 % (Pihlström et al., 2009).
Las curvas de calibración fueron construidas
teniendo en cuenta el efecto matriz. El
endosulfán se expresó como la suma de alfa
endosulfán, beta endosulfán y endosulfán
sulfato. Permetrina, cipermetrina, fenvalerato y
deltametrina representa cada uno la suma de sus
isómeros (SAGPyA, 2008; Pihlström et al.,
2009).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Curvas de calibración
Los coeficientes de correlación
estudiados presentaron valores R ≥ 0,992.
Herrmann y Poulsen (2007; 2008; 2009)
presentaron coeficientes para validación (GC-
ITD y GC-MS/MS) con valores de R ≥ 0,98
para sus curvas de calibración trabajando con la
metodología QuEChERS en harinas de cereales
(avena, arroz, centeno y trigo).
Ensayos de recuperación del método
El ensayo de recuperación fue utilizado
para evaluar la precisión, exactitud, estimar la
incertidumbre y calcular el límite de
cuantificación del método.
Exactitud: la exactitud del método fue
evaluada para cada analito en los diferentes
niveles de concentración calculando la

008
Recuperación porcentual (R %) obtenida
durante el ensayo.
La Fig. 2 muestra la frecuencia relativa
porcentual (f %) para distintos rangos de R %.
Se observó que ≈ el 65 % de las recuperaciones
se hallaron entre 90 - 109 %, 21 % para R %
< 90 % y solo 14 % para R % > 110.
En la Fig. 3 se pueden observar los R %
promedio de cada analito, donde esfenvalerato
presentó la menor R % media (91,5 %) y
malatión la mayor R % media (103,9 %).
En el Documento No. SANCO
Figura 2.- Recuperación porcentual (R %) en función de la frecuencia
relativa porcentual (f %).
Figura 3.- Recuperación porcentual (R %) promedio agrupadas por analito.

Rojas, Dante et al. 009
10684/2009 se recomienda un intervalo de
aceptación de 70 - 120 %. Aunque, sugiere
considerar recuperaciones menores, en forma
excepcional, cuando se demuestre una buena
precisión y se conozca la causa de la baja
recuperación.
Lehotay et al. (2007) han señalado que
en residuos de plaguicidas, cuando se aplica el
método QuEChERS, el criterio de aceptación
para la recuperación porcentual debería estar
entre 70 - 120 %. La recuperación porcentual
en cada nivel de fortificación para el presente
ensayo fue de 70 - 120 %. La exactitud
aceptable se logró optimizando el tiempo de
retención, la relación masa/carga de los iones y
la abundancia de los mismos (SENASA, 2002;
FAO/OMS, 2005; Pihlström et al., 2009).
Precisión: La precisión de la
metodología fue evaluada como
reproducibilidad para cada analito en los
diferentes niveles de concentración estudiados
durante el ensayo de recuperación. La
reproducibilidad se calculó como RSD % (Fig.
4). Los mayores valores de RSD % promedio
correspondieron a deltametrina (23,4 %),
endosulfàn sulfato (20,3 %), cipermetrina (17,6
%), diclorvós (16,7 %).
En la Fig. 5 se puede observar la RSD %
en función de los niveles de concentración
estudiados. Las variaciones de RSD % en
función de los niveles de concentración
estudiados mostraron que los niveles de
concentración más bajos (0,01 - 0,02 mg/kg)
presentaron valores de RSD % promedio más
altos (24 % y 19 %, respectivamente) y el nivel
más alto (0,60 mg/kg) mostró el menor RSD %
promedio (11 %), lo cual es esperable al
analizar la ecuación de Horwitz (Alder et al.,
2001).
El Documento SANCO No. 10684/2009
recomienda un RSD % de reproducibilidad ≤ 20
%. Sin embargo, laboratorios oficiales de la
Unión Europea publican resultados de
validación de metodología QuEChERS,
aceptando valores de RSD % menores o iguales
a los obtenidos de la Ec. Horwitz (Herrmann et
al., 2007; 2008; 2009). El criterio de aceptación
establecido en el presente trabajo fue el valor de
RSD % observado para cada nivel investigado ≤
RSD % calculado según la ecuación de
Horwitz.
Figura 4.- Desviación estándar relativa porcentual (RSD %) promedio para cada analito estudiado.

010
Figura 5.- Reproducibilidad (RSD %) promedio en función de las distintos niveles de concentración.
Como conclusión se pudo comprobar
que con la metodología propuesta se logró
precisión aceptable para diclorvós, clorpirifós
metil, pirimifós metil, fenitrotión, malatión,
clorpirifós etil, cipermetrina, fenvalerato y
esfenvalerato en el intervalo de 0,01 a 0,60
mg/kg; para permetrina y deltametrina entre
0,02 a 0,60 mg/kg, para alfa endosulfán entre
0,03 a 0,60 mg/kg, beta endosulfán entre 0,04 a
0,60 mg/kg y para endosulfán sulfato entre 0,07
a 0,60 mg/kg.
Sensibilidad: Para evaluar la
sensibilidad del método se calcularon los
Límites de Detección (LD) y Límites de
Cuantificación (LC) del método para cada
residuo investigado. Con el fin de determinar
los LD y LC se calculó el desvío estándar del
menor nivel de concentración que cumplió con
los criterios de aceptación establecidos para
precisión y exactitud. Los valores de LD y LC
se establecieron como múltiplos del desvío
estándar (Cuadro 1).
Los analitos presentaron LC entre 0,008
mg/kg (fenitrotión y malatión) y 0,084 mg/kg
(endosulfán sulfato). Los mayores LC
correspondieron a beta endosulfán, alfa
endosulfán y endosulfán sulfato; 0,041 mg/kg;
0,045 mg/kg y 0,084 mg/kg, respectivamente.
El elevado LC de estos 3 analitos pudo deberse
a que durante la ionización generan gran
cantidad de iones con mucha abundancia y solo
una fracción de este analito inyectado origina el
ión de cuantificación, dando LC y variabilidad
elevados (Štěpán et al., 2004).
Los LC obtenidos en el presente trabajo
fueron menores que los Límites Máximos de
Residuos (LMR) de la legislación de Argentina
(SAGPyA, 2008) y los recomendados por el
Codex Alimentarius (FAO/OMS, 2013). Solo
los LC de diclorvós y endosulfán sulfato se
encontraron por encima de los LMR
establecidos por la Unión Europea (PE/CUE,
2005; DG SANCO, 2014). El método aplicado
proporcionó una adecuada sensibilidad para la
legislación nacional, recomendaciones del
Codex y la Unión Europea (excepto para
diclorvós y endosulfán sulfato) (Cuadro 2).

Rojas, Dante et al. 011
Cuadro 1.- Límite de Detección (LD), Límite de Cuantificación (LC) e Incertidumbre expandida (U)
del método.
Compuesto LD (mg/kg) LC (mg/kg) U (%)
Diclorvós 0,007 0,014 34
Clorpirifós metil 0,005 0,010 26
Clorpirifós etil 0,006 0,013 21
Pirimifós metil 0,005 0,010 26
Fenitrotión 0,004 0,008 27
Malatión 0,004 0,008 23
Alfa endosulfán 0,022 0,045 26
Beta endosulfán 0,021 0,041 28
Endosulfán sulfato 0,042 0,084 22
Permetrina 0,009 0,019 27
Cipermetrina 0,007 0,013 24
Cuadro 2.- Límites Máximos de Residuos (LMR) establecidos en diversas normativas, relacionados
con maíz (grano consumo) o cereales en grano.
Compuesto
LMR-Unión Europea*
(mg/kg)
LMR-Codex Alimentarius**
(mg/kg)
LMR-Argentina***
(mg/kg)
Diclorvós 0,01 5 5
Clorpirifós metil 3 - 5
Clorpirifós etil - - 0,05
Pirimifós metil 5 7 10
Fenitrotión 0,05 6 10
Malatión 8 0,05 8
Alfa endosulfán 0,05 - 0,2
Beta endosulfán 0,05 - 0,2
Endosulfán sulfato 0,05 - 0,2
Permetrina 0,05 2 2
Cipermetrina 0,3 0,3 0,1
Fenvalerato 0,02 2 0,1
Esfenvalerato 0,02 - 0,1
Deltametrina 2 2 1
* Reglamento (CE) Nº 396/2005 (PE/CUE, 2005; DG SANCO, 2014).
** Base de Datos en línea del Codex sobre los residuos de plaguicidas en los alimentos (FAO/OMS, 2013).
*** Resolución 507/2008 (SAGPyA, 2008).

012
Incertidumbre: Los valores estimados
para la incertidumbre expandida (U) del método
estuvieron entre 21 % y 34 % (Cuadro 1) y el
valor más alto correspondió a diclorvós.
Existen numerosos trabajos que
presentan distintas formas de estimar la
incertidumbre expandida de un método
obteniendo resultados que van desde < 10 %
hasta 50 % y luego asumen una incertidumbre
expandida para el método de 50 % por
recomendación del Documento No. SANCO
10684/2009 (Štajnbaher y Zupančič-Kralj,
2003; Kmellár et al., 2008; Banerjee et al.,
2009; Economou et al., 2009; Walorczyk y
Gnusowski, 2009; Chung y Chan, 2010).
Se comprobó que todos los valores
estimados de incertidumbre de medición fueron
aceptables para su empleo en el análisis de
residuos de plaguicidas en alimentos según las
recomendaciones del Documento No. SANCO
10684/2009 (Pihlström et al., 2009).
Detección y cuantificación de pesticidas
En aproximadamente el 52 % de las
muestras procedentes de cintas de embarque se
encontraron residuos de plaguicidas mientras
que para las terminales portuarias cerca del 33
% de las muestras analizadas presentaron al
menos 1 residuo de pesticida.
En el Cuadro 3 se puede observar los
diferentes agentes fitosanitarios y su posible
relación con las zonas. No se detectaron
residuos de plaguicidas en 98 muestras (n =
192) siendo 80 muestras en cintas de embarque
y 18 en terminales portuarias. En las muestras
en las cuales se detectaron (n = 94), 85
correspondieron a cintas de embarque y 9 a
terminales portuarias. Los residuos de
plaguicidas más frecuentemente detectados
fueron fenitrotión (n = 40) seguido por
cipermetrina (n = 31). También se destacaron la
escasa aparición de fenvalerato (n = 3),
malatión (n = 2) y la ausencia de endosulfán (n
= 0, asumido como la suma de alfa endosulfán,
beta endosulfán y endosulfán sulfato). Para
todos los analitos el resultado más frecuente
fue: no detectado. Los organofosforados
aparecieron en 122 determinaciones, los
piretroides en 73 y no se detectaron
organoclorados.
Analizando solo los casos detectados en
cintas de embarque, nuevamente fenitrotión (n
= 38) fue el más frecuente, seguido por
Cuadro 3.- Distribución de muestras detectadas y no detectadas (ND), según número de residuos
de plaguicidas hallados.
Nº residuos detectados
Número
de muestras totales
Cintas de
embarque
Terminales
portuarias
ND 98 80 18
1 44 40 4
2 23 22 1
3 12 11 1
4 8 7 1
5 5 4 1
6 2 1 1
Total 192 165 27

Rojas, Dante et al. 013
pirimifós metil (n = 26), cipermetrina (n = 24) y
clorpirifós metil (n = 23).
Para muestras de cintas de embarque,
fenitrotión presentó el promedio más alto (0,21
mg/kg) seguido por diclorvós (0,11 mg/kg) y
permetrina (0,11 mg/kg). El mayor valor
también lo presentó fenitrotión (1,4 mg/kg),
luego permetrina (0,46 mg/kg) y pirimifós metil
(0,37 mg/kg).
En el Cuadro 4 se observan los casos en
los cuales los LMR se excedieron. De acuerdo a
los LMR establecidos por la Unión Europea
(PE/CUE, 2005; DG SANCO, 2014) los
residuos de plaguicidas que presentaron valores
superiores fueron diclorvós (n = 14), fenitrotión
(n = 13), permetrina (n = 5), clorpirifós etil (n =
1), cipermetrina (n = 1) y fenvalerato (n = 1).
Por ende, el orden de frecuencia de
aparición de los plaguicidas fue: fenitrotión (n
= 40) > cipermetrina (n = 31) > pirimifós metil
(n = 27) > deltametrina (n = 24) > clorpirifós
metil (n = 23) > diclorvós (n = 18) > permetrina
(n = 15) > clorpirifós etil (n = 12) > fenvalerato
(n = 3) > malatión (n = 2) > endosulfán (n = 0;
suma de alfa endosulfán, beta endosulfán y
endosulfán sulfato).
Los LMR recomendados por el Codex
Alimentarius no fueron superados en ningún
caso. Tomando la legislación Argentina, solo
cipermetrina (n = 4) presentó valores mayores
al LMR.
Cuadro 4.- Número de determinaciones superiores a los Límites Máximos de Residuos (LMR)
analizados.
Compuesto > LMR-Unión Europea* > LMR-Codex Alimentarius** > LMR-Argentina***
Diclorvós 14 0 0
Fenitrotión 13 0 0
Clorpirifós etil 1 0 0
Permetrina 5 0 0
Cipermetrina 1 0 4
Fenvalerato 1 0 0
* Reglamento (CE) Nº 396/2005 (PE/CUE, 2005; DG SANCO, 2014).
** Base de Datos en línea del Codex sobre los residuos de plaguicidas en los alimentos (FAO/OMS, 2013).
*** Resolución 507/2008 (SAGPyA, 2008).
CONCLUSIONES
El método utilizado proporcionó una
adecuada selectividad, linealidad, precisión,
exactitud y la estimación de la incertidumbre
fue realizada para los residuos de pesticidas
estudiados. La metodología es sencilla y de
bajo costo (pequeños volúmenes de solvente y
rápida), adecuada para organismos de control y
evaluación rutinaria del cumplimiento de
legislación nacional y del Codex Alimentarius.
Sobre un total de 192 muestras de
granos maíz, 94 presentaron residuos de
plaguicidas, siendo 85 muestras pertenecientes
a las cintas de embarque y el resto a terminales
portuarias. A su vez se observó que el orden de
frecuencia de aparición de los plaguicidas fue:
fenitrotión (n = 40) > cipermetrina (n = 31) >

014
pirimifós metil (n = 27) > deltametrina (n = 24)
> clorpirifós metil (n = 23) > diclorvós (n = 18)
> permetrina (n = 15) > clorpirifós etil (n = 12)
> fenvalerato (n = 3) > malatión (n = 2) >
endosulfán (n = 0; suma de alfa endosulfán,
beta endosulfán y endosulfán sulfato).
Considerando la legislación de
Argentina, solo 4 muestras presentaron niveles
superiores al LMR, siendo cipermetrina el
plaguicida involucrado. Sin embargo, todas las
muestras presentaron niveles permitidos según
los LMR del Codex Alimentarius.
RECOMENDACIÓN
Es de suma importancia que se controle
en las cintas de embarque y terminales
portuarias los niveles residuales de pesticidas,
dado que pueden ocasionar daños a la salud
humana.
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ISSN: 2218-4384 (versión en línea)
© Asociación RVCTA, 2014. RIF: J-29910863-4. Depósito Legal: ppi201002CA3536.
Nota Técnica
Metodología para diseñar un producto alimenticio por medio de la
identificación de los factores que influyen en la decisión de compra
Food product methodology design using purchase decision factors identification
Pedro Vargas Aguilar*, Elba Cubero Castillo, Arie Lang Gutowski
Universidad de Costa Rica, Facultad de Ciencias Agroalimentarias, Escuela de Tecnología de
Alimentos. San Pedro de Montes de Oca, San José, Costa Rica.
*Autor para correspondencia: pedro.vargas@ucr.ac.cr
Aceptado 01-Mayo-2014
Resumen
Se desarrolló una metodología para identificar los factores que influyen en la decisión de
compra de un producto alimenticio con la cual la información obtenida se utiliza para diseñar y
reproducir productos de alta gama de consumo. Inicialmente se definieron los parámetros que se
evaluarán para establecer la metodología, y se estudió su efectividad en una salsa de tomate de corte
popular. Por medio de encuestas, en los restaurantes de comida rápida se determinó la relación
existente entre el volumen de consumo contra el tamaño del establecimiento, así como el producto más
consumido. También, se determinaron los factores de decisión de compra y las características
sensoriales de mayor importancia para el consumidor en el producto en estudio. Se demostró que no
existe relación directa entre el tamaño del local donde se consume el producto, el número de
empleados, la cantidad de bocadillos consumidos y el consumo por semana de salsa de tomate. Para los
dueños de los establecimientos los atributos sensoriales de mayor importancia en una salsa fueron el
sabor dulce, la consistencia y el sabor ácido; asimismo, definieron que los factores sabor, precio y
consistencia fueron los más importantes para decidir la compra de un producto. De las salsas
comerciales se encontró una salsa que fue la que presentó las características de sabor y consistencia
más cercanas al ideal. Esta salsa de tomate se utilizó como salsa patrón. Se evaluaron 3 prototipos y
cada uno fue sometido a una prueba de discriminación con consumidores para encontrar el prototipo
ideal, ya que no difirió del patrón en ninguna de las características fisicoquímicas evaluadas ni se

Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(1):018-030. Vargas-Aguilar, Pedro et al. 019
encontró diferencia significativa en la prueba discriminatoria. Con este análisis, se logró reproducir la
salsa de mayor venta y consumo en restaurantes.
Palabras claves: aceptación, comidas rápidas, decisión de compra, formulaciones, productos
alimenticios, prototipos.
Abstract
A methodology was developed to identify factors that influence a food product buying decision
and its related information to design and reproduce highly accepted consumer brands. Initially popular
ketchup brands parameters were evaluated for establishing this methodology and its effectiveness.
Through surveys, in fast food restaurants, the relationship between consumption volume against facility
size as well as the most consumed brands were determined. Purchase decision factors and most
important sensory characteristics to consumers were also determined. It was showed that there is no
direct relationship between facility size and employees’ number, amount of snacks consumed per week
and consumption of ketchup. From commercial sauces evaluated in this study, it was found the ketchup
brand that had flavor characteristics closer to the ideal one. This ketchup was used as a pattern. Three
prototypes were tested using discrimination tests with consumers and it was found a prototype as ideal
which does not differ from the pattern and it did not differ in any of the physical and chemical
characteristics evaluated. With this analysis, a ketchup can be reproduced.
Key words: acceptance, fast food, food products, formulations, prototypes, purchase decision.
INTRODUCCIÓN
El desarrollo de un nuevo producto se
lleva a cabo en el ámbito de los negocios e
ingeniería y consiste en el proceso completo de
crearlo y llevarlo al mercado. Existen 2
aspectos paralelos que se involucran en este
proceso: uno implica la ingeniería del producto;
el otro, el análisis del mercado. Los
responsables de la mercadotecnia consideran el
desarrollo del nuevo producto como el primer
paso en la gestión de su ciclo de vida (Czinkota
y Ronkainen, 2007).
El motor principal del desarrollo de
productos es la competencia. El objetivo
primordial del desarrollo es en consecuencia el
brindar una respuesta a las necesidades del
cliente, de modo tal que se ofrezca la mejor
opción en calidad y precio para el segmento
abordado. Cuando se desarrolla un nuevo
producto pasa de la etapa de idea a las etapas de
producción de mercadotecnia. En general el
proceso de desarrollo sigue los pasos señalados
en seguida:
1. Generación de ideas de nuevos productos
2. Selección de ideas para determinar cuáles
ameritan más estudio
3. Análisis de negocios
4. Desarrollo del producto
5. Prueba de mercado
6. Comercialización (Stanton et al., 1994)
Este tipo de metodología se emplea para
identificar las necesidades, tanto conscientes
como inconscientes (latentes), para aprender
cómo los consumidores perciben productos,
marcas y tiendas; para conocer cuáles son sus
actitudes antes y después de campañas
promocionales, y cómo y por qué toman sus
decisiones de consumo. Proporciona la base
para el desarrollo de conceptos nuevos de
productos y servicios diseñados para satisfacer

020
aquellas necesidades del consumidor que se han
convertido en objetivos a llenar (Schiffman y
Kanuk, 1997). Por lo tanto, a medida que
nuevos productos son introducidos, los
productores necesitan saber si pueden capturar
una parte significante del fragmentado del
mercado del consumidor, con el fin de justificar
los gastos de introducción del nuevo producto.
El concepto de mercadotecnia está
constituido sobre la premisa de que los
mercadólogos primero identifican las
necesidades del consumidor, y luego
desarrollan productos y servicios que las
satisfagan. La investigación con el consumidor
ofrece una serie de métodos diversos para
comprender el comportamiento que presentan
los productos, así, los estudios de investigación
con consumidores, se utilizan para identificar y
localizar mercados que sean apropiados como
objetivos, y para aprender sus hábitos
(Schiffman y Kanuk, 1997) .
Hay 3 formas básicas para reunir los
datos primarios en una investigación
cuantitativa: observación del comportamiento,
experimentación o por la aplicación de
encuestas (entrevistas y programas). Dentro de
un estudio de este tipo, hay que considerar que
el tamaño de la muestra depende tanto de las
disponibilidades presupuestales como del grado
de confianza que el mercadólogo tenga en las
conclusiones del estudio. Mientras mayor sea el
número de muestra, es más probable que las
respuestas reflejen el universo total en estudio
(Schiffman y Kanuk, 1997).
La evaluación sensorial de los alimentos
constituye hoy en día un pilar fundamental para
el diseño y desarrollo de nuevos productos
alimenticios. La prueba de comparación
pareada es una prueba de 2 productos, en la
cual el panelista debe indicar cuál de los
productos contiene más de alguna
característica, por ejemplo el dulzor o el brillo
(Stone et al., 2012), y la prueba afectiva o de
aceptación se emplea para determinar el grado
de aceptación de un producto por parte de los
consumidores (Earle et al., 2001). Se selecciona
una muestra aleatoria numerosa compuesta de
personas representativas de la población de
posibles usuarios, con el fin de obtener
información sobre las actitudes de los
consumidores (Stone et al., 2012).
También, la estadística es una
herramienta para tomar decisiones, y dentro de
la gama de análisis se encuentra el análisis de
conglomerados (‘Cluster Analysis’), que es una
técnica desarrollada para clasificar los datos e
identificar similitudes y diferencias entre ellos,
y formar grupos dentro de estos. Por ello se ha
convertido en una práctica muy valiosa para
identificar segmentos de consumidores con
gustos y patrones similares. La formación de
‘clusters’ con este método está diseñada para
minimizar la varianza entre los conglomerados
y se basa en la unión de aquellas observaciones
que den como resultado el menor incremento en
el error de la suma de cuadrados (Næs et al.,
2010).
Poco o nada se sabía del gusto del
costarricense en relación con la salsa de tomate,
las características que busca en ella y qué
factores hacen que se decida por una marca u
otra en el momento de la compra. Por lo tanto,
mediante la aplicación de una metodología
basada en encuestas y estudios de análisis
sensorial, se realizó este trabajo con el fin de
identificar los atributos que el consumidor
busca en este producto. Con este estudio, se
busca desarrollar una salsa de tomate basada en
los factores que inciden en la decisión de
compra y en la percepción de los atributos de
calidad deseada por los dueños de los servicios
de alimentación de comidas rápidas, y de las
características sensoriales deseadas por los
consumidores en bocadillos que se aderezan
con la salsa de tomate como lo son los tacos,
hamburguesas o perros calientes.
MATERIALES Y MÉTODOS
La metodología utilizada responde a una
matriz en la cual se va incorporando

Vargas-Aguilar, Pedro et al. 021
información con el fin de tomar una decisión,
que será estadísticamente analizada.
Implementación de la metodología
para reproducir una salsa de tomate de
mayor venta y consumo en los restaurantes
de comida rápida (RCR)
Caracterización de los servicios de
alimentación e identificación de las marcas
de salsa de tomate para el estudio
La población de RCR se obtuvo a partir
de las listas dadas por el Instituto Nacional de
Estadística y Censos (INEC, 2004) de Costa
Rica; de ahí se escogieron los establecimientos
aleatoriamente.
Se aplicaron encuestas a los dueños de
100 restaurantes en el Gran Área Metropolitana
(GAM) de Costa Rica (San José, Heredia,
Alajuela y Cartago). Con este instrumento se
caracterizaron los RCR por tamaño, la cantidad
de productos que venden y por el consumo de
salsa de tomate. Se realizó una correlación entre
el tamaño de los establecimientos (por número
de sillas, por número de empleados y cantidad
de bocadillos) y el consumo del producto por
semana, utilizando el programa Microsoft®
Office Excel, versión 2007 (Microsoft®
Corporation, Redmond, WA, USA).
A partir de los resultados obtenidos, se
identificaron las marcas de las salsas de tomate
de mayor consumo por semana como aderezo
en bocadillos populares y por número de
establecimientos donde se consumen. Esto se
llevó a cabo por medio de análisis de
distribuciones de frecuencias de la información
generada.
Determinación de los factores de
decisión de compra y características
deseadas en la salsa de tomate por parte de
los compradores
En la misma encuesta se les preguntó a
los 100 compradores de salsa de tomate, los
factores por los cuales deciden comprar un
producto y los atributos del mismo, con el fin
de determinar cuáles fueron los de mayor
importancia y posteriormente evaluarlos
sensorialmente. Primeramente se les pidió que
ordenaran de mayor a menor importancia
(siendo el factor 1 el de mayor importancia y el
factor 5 el de menor) los atributos sabor a
tomate, sabor ácido, sabor dulce, color y
consistencia. Luego ordenaron por orden de
importancia los factores precio, sabor,
consistencia, color, empaque y servicio, donde
el primer factor era el más importante y el sexto
el menos importante.
Selección de la salsa de tomate de
mayor agrado
A las salsas de tomate de mayor
consumo se les realizó un estudio de aceptación
con 100 consumidores. Las pruebas se llevaron
a cabo en los RCR del GAM bajo condiciones
controladas del lugar (aislado, suficiente luz,
libre de olores), específicamente, se colocaron
mesas individuales en zonas donde las personas
no fueron interrumpidas. Se escogieron 4
establecimientos y se evaluaron 25 personas por
establecimiento.
La elección de los consumidores se basó
únicamente en el hecho de que fueran personas
que frecuentan este tipo de establecimiento de
comidas y fuesen consumidores de salsa de
tomate. Las muestras se presentaron de forma
balanceada y aleatorizada, y codificadas con
números de 3 dígitos. Las salsas de tomate se
sirvieron sobre tortillas tostadas de maíz sin sal
y se les dio agua para enjugarse entre muestras.
Los consumidores evaluaron el agrado
por los siguientes atributos (escogidos por los
compradores de la salsa de tomate): el sabor
dulce, la consistencia y el sabor ácido
utilizando una escala ideal (‘just right’ en
inglés) de 5 puntos, en donde el valor 3 de la
escala corresponde al valor ideal. Los valores 1
y 2 significan que no les gusta porque tiene
poco de la característica y los valores 4 y 5 no

022
les gusta porque tiene mucho de la
característica evaluada.
Los resultados se analizaron por medio
del análisis de ‘cluster’ o grupos, con el fin de
buscar si existían segmentos de mercado. Cada
segmento se analizó mediante un análisis de
varianza y una comparación de medias de
Fisher LSD (‘Least Significant Difference’) con
un nivel de significancia de 5 %. La salsa de
mayor agrado fue la que obtuvo el valor más
cercano a 3 en la escala, para todos los atributos
medidos. Se utilizó el programa de estadística
Statistical Analysis System, versión 9.2 (SAS
Institute Inc., Cary, NC, USA).
Elaboración de los prototipos de las
salsas de tomate
A la salsa de tomate de mayor agrado se
le realizó una serie de análisis fisicoquímicos
con el fin de caracterizarla y utilizarla como
patrón. Se determinaron los sólidos solubles
como grados Brix (AOAC, 2002), pH (AOAC,
1999) y consistencia (con consistómetro de
Bostwick).
Se buscó una formulación de una salsa
de tomate (Echarrys y Ramírez-M., 2002) y se
ajustó con base a las características
fisicoquímicas del patrón para hacer 3
prototipos. Se realizaron los ajustes necesarios
a la fórmula en cuanto a cantidad de pasta de
tomate, ácido acético, azúcar y almidón de
manera que los análisis fisicoquímicos fueran
similares a la salsa patrón.
Comparación de los prototipos con el
producto comercial de mayor aceptación
(salsa patrón)
Prueba de discriminación con
consumidores
Para evaluar si existía o no diferencia
entre cada uno de los prototipos de salsa de
tomate y la salsa patrón, se realizó una
comparación pareada con 27 personas. El
número de personas se determinó con una
potencia del 90 % (β = 0,10) y un d’ de 1
(Meilgaard et al., 2007), es decir que se pueda
captar una pequeña diferencia entre los
productos.
La selección de los panelistas se basó
únicamente en el hecho de que fueran personas
que frecuentaran este tipo de restaurantes y que
consumieran salsa de tomate. Los panelistas
evaluaron los productos en un área adecuada
para tal fin en un establecimiento de comida
rápida.
Se les presentaron 3 pares donde una de
las muestras era la salsa patrón y la otra
muestra uno de los 3 prototipos. Se les preguntó
cuál de las 2 muestras era más dulce. Luego se
volvió a presentar el mismo par (con códigos
diferentes para evitar sesgos) y se les preguntó
cuál era la más ácida y se les volvió a presentar
el mismo par (con códigos diferentes) y se les
preguntó cuál era la más consistente. Este
procedimiento se repitió con los otros 2
prototipos.
Los datos se analizaron con las tablas
binomiales (Roessler et al., 1978) para
determinar si encontraron diferencias entre cada
prototipo y la salsa patrón para cada uno de los
3 atributos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización de los restaurantes de
comida rápida (RCR) del Gran Área
Metropolitana (GAM)
En el Cuadro 1, se observa una muestra
de los RCR del GAM, que comercializan
bocadillos populares, y sus características por
tamaño, cantidad de productos expendidos y
consumo de salsa de tomate.
En la caracterización de los
establecimientos que consumen salsa de tomate,
no se encontró una relación entre número de
sillas que había en el local y el consumo en
litros de salsa por semana (r 2 = 0,64). Por
ejemplo, algunos establecimientos con mayor

Vargas-Aguilar, Pedro et al. 023
Cuadro 1.- Caracterización de los RCR de la GAM por tamaño, cantidad de venta y consumo de salsa
de tomate.
Establecimiento
Número*
Ubicación
por Provincia
Sillas
por local
Empleados
por local
Cantidad de bocadillos
expendidos
(por semana)
Consumo de salsa
de tomate
(litros/semana)
1 San José 50 5 1500 189,0
2 Heredia 50 7 900 302,0
3 San José 43 4 350 19,0
4 San José 40 7 20 11,5
5 Alajuela 36 2 15 4,0
6 Cartago 35 2 150 11,5
7 San José 30 2 15 11,5
8 San José 30 2 400 30,0
9 Heredia 30 2 44 4,0
10 San José 28 1 24 7,5
11 Heredia 25 5 50 212,0
12 Cartago 25 20 12 378,0
n = 100 establecimientos.
RCR: restaurantes de comida rápida. GAM: Gran Área Metropolitana.
* Cada número es un local diferente.
número de sillas, como los establecimientos Nº
4 y Nº 6, consumen poca salsa de tomate (11,5
litros) y otros como el Nº 1 y el Nº 2 consumen
189 y 302 litros, respectivamente. Tampoco se
encontró una tendencia entre el número de
empleados y el consumo de salsa, y no existió
una relación directa entre ellos (r 2 = 0,0084).
Un resultado muy importante de este
estudio es que tampoco se evidenció una
relación entre la cantidad de bocadillos
populares que se expenden en el
establecimiento y el consumo de litros por
semana (r 2 = 0,13). En algunos locales, se
expenden otras comidas que al consumidor le
gusta acompañar con salsa de tomate, tal es el
caso del arroz con pollo y emparedados entre
otros productos.
Por lo tanto, al no existir una relación
entre el tamaño del establecimiento y el
consumo semanal de salsa de tomate, se puede
deducir que la utilización de la salsa de tomate
en alimentos que no son bocadillos era muy
importante y se recomienda que se incluyan en
la encuesta. La pregunta debe identificar tanto
el uso que le da el cocinero, así como en los
alimentos en los que el cliente adiciona el
producto. También que se identifiquen las
marcas del producto por volumen y la
presentación en cada local.
Identificación de las marcas de salsa de
tomate utilizadas en los RCR del GAM y de
las marcas de mayor consumo
Las salsas de tomate que se identificaron
en los RCR del GAM para acompañar o
aderezar bocadillos populares se muestran en la
Fig. 1; en litros por semana (Fig. 1A) y por

024
Litros de salsa de tomate consumidos por semana
400
350
300
250
200
150
100
50
0
A H B G E C F K T L D I Ñ Q J N S M O P
A
Número de establecimientos
30
25
20
15
10
5
0
A B C D E F G H I
B
J K L M N Ñ O P Q S T
Marcas de salsa de tomate
n = 100 establecimientos.
Las letras representan diferentes marcas de salsa de tomate.
Marcas de salsa de tomate
Figura 1.- Distribución de consumo en litros de las marcas de salsa de tomate por semana (A) y del
número de establecimientos que consumen las marcas de salsa de tomate (B).
número de establecimientos donde se consumen
(Fig. 1B). Se puede observar que en los 100
establecimientos encuestados se identificaron
20 marcas de salsas de tomate compitiendo por
el mismo mercado.
La metodología propuesta no solo debe
considerar el volumen de ventas de cada marca
sino también el número de establecimientos
donde se consumen, ya que puede ser tan
importante que la marca tenga una buena
presencia en el mercado como un alto volumen
de ventas en un solo local.
Las marcas que se seleccionaron por
tener mayor presencia, es decir, se encontraron
en un mayor número de establecimientos de los
RCR, fueron las salsas denominadas como A,
B, C (Cuadro 2); y la salsa G se eligió porque
se consume en un solo establecimiento una gran
cantidad de litros por semana de esta salsa de
tomate.
Cuadro 2.- Marcas de salsa de tomate con mayor presencia y consumo en los RCR del GAM.
Salsa de tomate
Número de establecimientos
Consumo estimado de salsa de tomate
(litros/semana)*
A 27 364,8
B 20 311,6
C 13 125,4
G 1 212,8
RCR: restaurantes de comida rápida. GAM: Gran Área Metropolitana.
* Valor indicado por los dueños de los establecimientos.

Vargas-Aguilar, Pedro et al. 025
Estas 4 salsas de tomate comerciales
fueron sometidas a un estudio de aceptación
para identificar cuál de estas marcas era
considerada la de mayor agrado. Para hacer este
estudio de aceptación era necesario conocer las
características más valoradas por los
compradores, o dueños de los establecimientos,
para evaluar estas características con los
consumidores.
Determinación de los factores de decisión de
compra por parte de los compradores
El ordenamiento por parte de 100
dueños de locales de las características
sensoriales se aprecia en la Fig. 2. Se puede
observar la frecuencia de los compradores de
acuerdo al nivel de importancia de los
parámetros de calidad del producto (sabor a
tomate, sabor ácido, sabor dulce, color y
consistencia).
Se encontró que el sabor dulce,
Cantidad de encuestados (Frecuencia)
60
50
40
30
20
10
0
Sabor a tomate Sabor ácido Sabor dulce Color Consistencia
Características de la salsa de tomate
1
2
3
4
5
(n = 100 establecimientos).
Figura 2.- Frecuencia de importancia para los compradores de salsa de tomate del sabor a
tomate, sabor ácido, sabor dulce, color y consistencia de una salsa de tomate. El
factor de mayor importancia es el primero y el de menos importancia el último o
número 5.
la consistencia y el sabor ácido fueron los más
importantes para los compradores de la salsa.
Los menos importantes fueron el sabor a tomate
y el color.
La Fig. 3 muestra los factores
sensoriales y no sensoriales que eran más
importantes para los dueños de los RCR en el
momento de tomar la decisión de comprar una

026
Cantidad de encuestados (Frcuencia)
80
70
60
50
40
30
20
10
1
2
3
4
5
6
0
Precio Sabor Consistencia Color Empaque Servicio
Factores de decisión de compra
(n = 100 establecimientos).
Figura 3.- Frecuencia de compra de salsa de tomate por precio, sabor, consistencia, color,
empaque y servicio. La escala utilizada fue de 6 puntos, donde 1 es el más
importante y 6 el menos importante.
salsa de tomate. El sabor fue el que mostró la
mayor importancia seguido por el precio y por
último la consistencia. Los factores que
tuvieron menos importancia fueron el empaque,
el servicio y el color.
Guercioni-Sterlecchini (1985) indica
que las características de mayor importancia en
una salsa de tomate son el sabor dulce, la
consistencia, el color y el sabor ácido, lo cual
concuerda con los resultados encontrados en la
encuesta, que este tipo de consumidor está
acostumbrado a comer salsa de tomate y espera
un producto con tales características.
Estudio de aceptación: selección de la salsa
de mayor agrado por parte del consumidor
Para identificar el agrado hacia las 4
salsas (A, B, C y G) los 3 atributos evaluados
fueron el sabor dulce, la consistencia y el sabor
ácido. Los resultados se presentan en la Fig. 4.
La salsa de mayor agrado fue la que
obtuvo el valor más cercano a 3 en la escala,
para todos los atributos medidos.
Por medio del análisis de ‘cluster’, se
encontraron dos grupos o segmentos de
consumidores, uno con 67 consumidores y el
otro con 32.
Los dos grupos de consumidores
encontraron que el dulzor de la salsa C estuvo
cerca del valor ideal, y el grupo 2 también
encontró que la salsa de tomate B tenía un
dulzor cercano al ideal. En los dos grupos, las 4
salsas de tomate presentaron una consistencia
cercana a la ideal. La acidez ideal también
correspondió a la salsa de tomate C para el
grupo 1 y para las salsas B, C y G para el grupo
2.

Vargas-Aguilar, Pedro et al. 027
Letras minúsculas iguales en el mismo bloque indican que no hay diferencias significativas (p > 0,05).
Figura 4.- Promedio de agrado para el sabor dulce, la consistencia y el sabor ácido de 4 salsas de
tomate comerciales (A, B, C y G) utilizando una escala de 5 puntos donde el valor 3
representa el ideal y los valores por debajo o por encima representan desagrado, para dos
segmentos o grupos de consumidores.
La salsa C fue la que presentó
características de sabor y consistencia más
cercanas al ideal. Esta salsa de tomate se utilizó
como salsa patrón, a ser imitada.
Elaboración de 3 prototipos de salsas de
tomate
La formulación de la salsa de tomate se
ajustó con base en las características
fisicoquímicas de la salsa de tomate C y se
obtuvieron 3 prototipos a los cuales se les midió
los grados Brix, pH y la consistencia.
El Cuadro 3 muestra las mediciones
realizadas a la salsa C y a los prototipos. La
medición de pH indicó que todas las salsas
cumplieron con la especificación de la norma
mexicana NMX-F-346-S-1980 (NM, 1980)
donde el pH máximo es de 4,3 y la consistencia
máxima en cm es de 12. La norma especifica
sólidos totales mínimo 27, los cuales se pueden
comparar con los grados Brix que fueron
mayores a 30 para los 3 prototipos y el patrón.
Cuadro 3.- Caracterización fisicoquímica de la salsa de tomate C y los 3 prototipos.
Salsa de tomate
Características físicas y químicas de las salsas de tomate
Grados Brix pH Consistencia (cm/30 s)
Patrón (salsa C) 31,8 4,0 5,4
Prototipo 1 32,5 3,8 5,8
Prototipo 2 30,0 4,0 6,0
Prototipo 3 32,6 4,0 6,5

028
De los 3 prototipos desarrollados se
observó que el prototipo 1 obtuvo el valor más
próximo a la salsa de tomate C en cuanto a los
grados Brix y la consistencia. Mientras que el
pH de los prototipos 2 y 3 fueron similares al
patrón.
El prototipo 1 presentó las
características fisicoquímicas más cercanas al
patrón, sin embargo, los otros 2 prototipos no se
encontraron muy alejados de las características
del patrón, por lo tanto no se hizo ningún ajuste
a los prototipos para presentarlos en la siguiente
etapa de estudio (prueba de discriminación).
Prueba de discriminación para determinar
cuáles formulaciones presentaron diferencia
significativa con respecto a la salsa comercial
de mayor agrado
En el Cuadro 4 se muestra el número de
respuestas obtenidas en la prueba de
comparación pareada con 27 consumidores para
los 3 prototipos y 3 características sensoriales.
Cuadro 4.- Número de personas que escogieron la muestra con mayor intensidad de sabor dulce, sabor
ácido y consistencia en cada uno de los pares evaluados (α = 0,05; d’ = 1 y β = 0,10;
n = 27).
Característica
evaluada
2-AFC 2-AFC 2-AFC
Patrón* Prototipo 1 Patrón* Prototipo 2 Patrón* Prototipo 3
Sabor dulce 12 15 18 9 21 6
Sabor ácido 9 18 3 24 9 18
Consistencia 15 12 15 12 9 18
* Salsa de tomate C.
El número mínimo de respuestas
correctas es de 20 para que exista diferencias
significativas entre los 2 productos que se
comparan en una prueba 2-AFC (‘2-alternative
forced choice’) con un α = 0,05 (Ennis y
Jesionka, 2011), por lo tanto, se encontró que
entre el patrón y el prototipo 1 no se
presentaron diferencias significativas (p > 0,05)
para ninguna de las características evaluadas.
En cuanto a la comparación entre el
patrón y el prototipo 2, se encontró que existían
diferencias significativas (p ≤ 0,05) en el sabor
ácido y que se sentía más intenso en el
prototipo 2.
Cuando se comparó el prototipo 3 y la
salsa de tomate C (patrón), los panelistas
encontraron más dulce el patrón (p ≤ 0,05), lo
cual podría deberse a que, a pesar de que los
grados Brix del patrón y del prototipo fueron
similares, la consistencia instrumental del
prototipo fue mucho mayor. Se ha encontrado
que un aumento en la viscosidad aumenta los
umbrales de percepción de sal y azúcar, lo que
puede estar relacionado con una reducción en la
velocidad de llegada de sabores a los receptores
de la lengua reduciendo la sensación (Gady et
al., 2008).
A partir de este análisis, se concluyó que
la fórmula del prototipo 1 era la más cercana a
la salsa patrón en cuanto al dulzor, acidez y
consistencia, lo que significa que presentó las
características ideales deseadas por los
consumidores.
Las pruebas de discriminación
normalmente se utilizan en proyectos donde se
reducen costos de producción y se usan poco en

Vargas-Aguilar, Pedro et al. 029
proyectos de desarrollo de productos. Esto se
puede considerar un error especialmente en los
estadios finales del proceso cuando los cambios
a los prototipos son muy pequeños (Heyhoe,
2002).
Esta metodología sensorial tendrá éxito
en la medida en que las características
fisicoquímicas de los prototipos se acerquen
suficientes a las del producto patrón, tal y como
se observa en el Cuadro 3, donde estando cerca
los prototipos 2 y 3, las pequeñas diferencias
fueron detectadas por el consumidor. Por lo que
se recomienda trabajar con metodologías
sensoriales que maximicen la sensibilidad del
consumidor para que pueda encontrar pequeñas
diferencias (Ennis y Jesionka, 2011), y así, el
producto desarrollado será réplica del producto
patrón.
CONCLUSIONES
Por medio de las encuestas se
comprendió que no solamente era importante el
volumen de ventas si no el número de
establecimientos donde se consumía una marca
dada. De ahí se encontraron los productos
(salsas de tomate) de mayor presencia, es decir,
que se encontraron en mayor número de
establecimientos, y los de mayor volumen de
venta.
En el caso específico de las salsas de
tomate, de 20 marcas se encontraron 4 (A, B, C
y G) con mayores ventas. También, de la
metodología sugerida se concluye que se debe
incorporar en las encuestas el tipo de comida en
que se utiliza la salsa de tomate y de forma
general para cualquier otro producto se puede
preguntar los usos o aplicaciones del producto
que se reproducirá.
Se pudieron establecer las características
sensoriales y no sensoriales más importantes
para los dueños de los establecimientos, las
cuales ayudaron a formular los prototipos en
forma precisa. Se concluye que es importante
tomar en cuenta la opinión de los dueños de los
establecimientos donde se consume el producto
meta para lograrlo reproducir.
Los principales factores por los cuales
los dueños de los establecimientos compran la
salsa de tomate fueron el sabor, el precio y la
consistencia del producto. El empaque, el
servicio y el color no afectaron la decisión de
compra de este producto.
En cuanto a las características de calidad
del producto, el sabor dulce, la consistencia y el
sabor ácido constituyeron las características
sensoriales que los dueños de los
establecimientos consideraron de mayor
importancia en la salsa de tomate.
Con la metodología aplicada se logró
encontrar un prototipo que fue muy cercano a
una salsa comercial escogida como la de mayor
agrado. En el estudio del consumidor,
utilizando las características sensoriales de
mayor importancia, se encontró que la salsa de
tomate C fue la de mayor preferencia. Luego de
analizar los prototipos elaborados y evaluarlos
por los consumidores, se concluye que el
prototipo 1 no fue diferente al patrón en
ninguna de las características evaluadas.
La metodología propuesta, con unos
pequeños cambios, cumplió el propósito de
reproducir un producto de alta venta y
presencia en un mercado específico.
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California, USA: Elsevier Inc.

RVCTA
Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología de Alimentos. 5 (1): 031-042. Enero-Junio, 2014
http://www.rvcta.org
ISSN: 2218-4384 (versión en línea)
© Asociación RVCTA, 2014. RIF: J-29910863-4. Depósito Legal: ppi201002CA3536.
Comunicación
Efectos del gas ozono sobre cepas de Fusarium verticillioides y
F. proliferatum productoras de fumonisinas
Effects of ozone gas on Fusarium verticillioides and F. proliferatum strains
producers of fumonisin
Laura Frisón 1 *, Priscila Bourilhon 1 , Horacio Ocampo 2 , Darío Ponisio 2 , Juan Basílico 1
1 Cátedra de Microbiología, Departamento de Ingeniería en Alimentos, Facultad de Ingeniería Química,
Universidad Nacional del Litoral. Santiago del Estero 2829 (3000), Santa Fe, Argentina.
2 Empresa Agua Ozonizada Santo Tomé (3016), Santa Fe, Argentina.
*Autora para correspondencia: lfrison@fiq.unl.edu.ar
Aceptado 18-Mayo-2014
Resumen
Las fumonisinas son producidas por especies de Fusarium, esencialmente por Fusarium
verticillioides y F. proliferatum que se encuentran como contaminantes naturales en maíz y
subproductos de maíz. Su consumo, se asocia con ciertas enfermedades en animales y humanos. La
industria alimentaria apunta sus investigaciones al desarrollo de nuevas tecnologías y la aplicación de
gas ozono, dado su elevado poder germicida y su descomposición espontánea a oxígeno, se ha
convertido en un agente potencial para garantizar la seguridad microbiológica y la calidad de los
alimentos. Debido a la importancia del consumo de maíz en Argentina y a la contaminación de este
grano por cepas productoras de fumonisinas, se estudió la posibilidad de detoxificar maíz contaminado
con esta toxina con gas ozono. Se aislaron cepas de Fusarium verticillioides y F. proliferatum de
granos de maíz y de silaje. Se estudió la capacidad de producción de toxina de dichas cepas. La
cuantificación de esta toxina se realizó mediante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
(ELISA) con el kit para fumonisinas RIDASCREEN®FAST Fumonisin siguiendo las instrucciones del
fabricante. Se utilizó gas ozono a concentraciones de: 4500, 7500 y 25000 ppm v , por tiempos de
exposición de 10 y 20 minutos. Todas las cepas de Fusarium estudiadas fueron buenas productoras de

032 Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(1):031-042.
fumonisinas. A las concentraciones y tiempos evaluados, no se observó la eliminación o disminución
de la concentración de toxina. Prevenir la contaminación con estos mohos es la mejor solución para el
problema de las micotoxinas, debido a que una vez producida la toxina es difícil de erradicar.
Palabras claves: capacidad toxicogénica, fumonisinas, Fusarium, gas ozono, micotoxinas en maíz.
Abstract
Fumonisins are produced by Fusarium species, essentially Fusarium verticillioides and F.
proliferatum that occur as natural contaminant of corn and corn products. Consumption is associated
with certain diseases in animals and humans. The food industry aims its research to develop new
technologies and the application of ozone gas, given its high germicidal power and spontaneous
decomposition to oxygen, has become a potential agent to ensure microbiological safety and food
quality. Because of the importance of maize consumption in Argentina and contamination of the grain
by fumonisin-producing strains, the possibility to detoxify corn contaminated with this toxin with
ozone gas was studied. Strains of Fusarium verticillioides and F. proliferatum were isolated from
maize grain and silage. The toxin production capacity of these strains was studied. The quantification
of the toxin was performed by Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) kit for fumonisin
RIDASCREEN®FAST Fumonisin following manufacturer’s instructions. Ozone gas concentrations:
4500, 7500 and 25000 ppm v , for exposure times of 10 and 20 minutes was used. All strains of
Fusarium studied were good producers of fumonisin. At the concentrations and times studied,
eliminating or decreasing the concentration of toxin was not observed. Prevent contamination with
these molds is the best solution to the problem of mycotoxins, because once produced the toxin is
difficult to eradicate.
Keywords: fumonisin, Fusarium, mycotoxin in corn, ozone gas, toxicogenic capacity.
INTRODUCCIÓN
El género Fusarium está ampliamente
distribuido tanto en suelos como en sustratos
orgánicos. Presenta especies fitopatógenas que
causan graves enfermedades principalmente en
los cereales. Bajo condiciones ambientales
favorables, colonizan sintomáticamente o
asintomáticamente un sustrato como maíz
pudiendo conducir esta interacción a la
producción de micotoxinas. Su importancia no
se debe solo a la pérdida de las cosechas, sino
también a la biosíntesis de micotoxinas que
pueden estar presentes en los cereales y sus
productos, produciendo síndromes de
intoxicación en animales y llegando a la cadena
alimentaria de los humanos (Cabañes et al.,
2007). Las micotoxinas asociadas a este género
son las fumonisinas (FB), zearalenona (ZEA) y
los tricotecenos, incluyendo es este grupo el
diacetoxiscirpenol (DAS), la toxina T-2,
deoxinivalenol (DON) y el nivalenol (NIV). Se
asocian a cuadros de toxicidad celular, efectos
sobre el crecimiento y el desarrollo de los
animales, e incluso al cáncer en humanos y
animales, por lo que son de gran interés en el
sector agrícola y alimentario (Valle, 2011).
Fusarium verticillioides se encuentra
usualmente en zonas tropicales, y zonas
templadas y húmedas del mundo (Leslie y
Summerell, 2006). Esta especie es un patógeno
endémico de maíz, que causa pudrición del tallo
durante todas las etapas de desarrollo de la
planta. También se ha documentado como
contaminante de las semillas oleaginosas:
girasol, amaranto y soya, también especias,

Frisón, Laura et al. 033
como el cilantro, fenogreco, cardamomo y
pimienta (Pitt y Hocking, 2009).
La especie F. proliferatum, al igual que
F. verticillioides, es un problema significativo
en la contaminación de plantas de maíz en toda
Latinoamérica y el resto del mundo, siendo
cada vez más importante en países de Europa
(Bacon y Nelson, 1994; Desjardins, 2006;
Leslie y Summerell, 2006). F. proliferatum
también fue encontrado como contaminante de
sorgo, nueces de pino, arroz y frijoles (Marín et
al., 1999).
Las FB son neurotóxicas, nefrotóxicas y
hepatotóxicas. Causan edema pulmonar y
cerebral, y lesiones cardíacas. Los órganos
afectados son cerebro, pulmones, hígado,
riñones y corazón. Los animales más sensibles
son los equinos y los cerdos, aunque algunos
autores informan de síntomas en ovejas,
carneros y primates no humanos (Afsah-Hejri et
al., 2013).
El cultivo del maíz ocupa un lugar
importante en la agricultura de Argentina. Los
principales hongos toxicogénicos
contaminantes de este cereal y alimentos
formulados a base del mismo pertenecen a los
géneros Fusarium (F. verticillioides, F.
graminearum, F. proliferatum, F. oxysporum),
Penicillium (P. rubrum, P. purpurogenum),
Alternaria (A. alternata) y Aspergillus (A.
flavus) (FAO/WHO, 2001; WHO/FAO, 2002;
Aziz et al., 2006; Zhang et al., 2007; García-
Aguirre y Martínez-Flores, 2010).
La industria alimentaria apunta sus
investigaciones al desarrollo de nuevas
tecnologías y la aplicación de gas ozono, dado
su elevado poder germicida y su
descomposición espontánea a oxígeno, se ha
convertido en un agente potencial para
garantizar la seguridad microbiológica y la
calidad de los alimentos. Se considera que es un
sanitizante de buena eficiencia que requiere
tiempos de contacto bastante cortos. Inactiva
enzimas respiratorias y destruye la membrana
celular. Por su capacidad para dar reacciones de
adición sobre los dobles enlaces y por su
tendencia a transformarse de nuevo en oxígeno
molecular, esta tecnología es limpia, segura y
eficiente y no agrede al medio ambiente ya que
deja como residuo moléculas de oxígeno. Estos
aspectos favorecen su empleo en la industria
alimentaria (Kadre et al., 2001). El potencial
del ozono en la industria de alimentos incluye
la reducción de microorganismos, extensión de
la vida útil de productos como pescado, carne,
frutas y reducción de niveles de contaminación
de ambientes de envasado de alimentos.
Varios autores coinciden en que el
ozono, tanto en fase acuosa como gaseosa, es
un potente germicida capaz de eliminar
bacterias, virus, hongos y quistes de parásitos,
sin provocar la formación de compuestos
tóxicos ni dejar residuos, ya que se descompone
en oxígeno, aspecto ventajoso frente a otros
sanitizantes comúnmente empleados para estos
fines (Kim et al., 1999; Rice, 1999; Ricaurte-
Galindo, 2006).
Debido a que la contaminación con
micotoxinas es un problema de grandes
repercusiones económicas y de la salud, y que
el cultivo de maíz ocupa un lugar importante en
la agricultura de Argentina, se propuso como
objetivo de este trabajo la posibilidad de
detoxificar con gas ozono maíz contaminado
con fumonisinas, ya que es una tecnología
limpia y que no agrede al medio ambiente.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento e identificación de cepas
de Fusarium verticillioides y F. proliferatum
Se aislaron cepas de Fusarium
verticillioides y F. proliferatum durante el
período de Marzo-Abril del año 2012 a partir de
40 muestras de granos de maíz y 40 de silajes.
Las muestras fueron provistas por el Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA),
Estación Experimental Agropecuaria Rafaela de
la Provincia de Santa Fe, Argentina. Las
mismas fueron conservadas en freezer (-20 ºC),
por su alto contenido de humedad, hasta el

034
momento de su análisis. Se colocaron granos de
maíz y trozos del ensilado sobre placas con
medio Agar Extracto de Malta (‘Malt Extract
Agar’, MEA), al cual se le agregó cloranfenicol
(100 mg/L) para inhibir el crecimiento
bacteriano (Beuchat y Cousin, 2001). Estas
placas se incubaron a 28 ºC por 7 días. Luego
se realizó el aislamiento y purificación de las
colonias que presentaron características propias
del género Fusarium y se procedió a su
identificación a partir de características macro y
microscópicas, según las claves de Nelson et al.
(1983).
Mediante una inspección microscópica
con un microscopio Leica, modelo CM E
(Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y un
aumento de 40 X, se determinaron cuales
aislados pertenecían al género Fusarium por la
presencia de macroconidios. Las colonias
coincidentes con este género (flocosas, color
rosa a morado, naranja pálido o blanco) se
repicaron a medio Agar Spezieller
Nährstoffarmer (SNA) y Agar Papa Dextrosa
(PDA). Se incubaron por 7 días a temperatura
ambiental bajo acción de luz para favorecer la
esporulación del moho y así confirmar la
identidad del género. Luego se realizó la
identificación de cada especie aislada. Todos
los cultivos utilizados fueron iniciados desde un
conidio simple (cultivo monospórico) (Zapata-
Basílico et al., 2010).
Para la identificación se observaron las
características microscópicas propias de las
especies F. verticillioides y F. proliferatum
pertenecientes a la sección 10, llamada sección
Liseola (Nelson et al., 1983). Los caracteres
para determinar las secciones y las especies se
basan en las características del cultivo
(velocidad de crecimiento, color del micelio
aéreo, color del reverso, presencia de pigmentos
solubles, color de masas de conidios); en las
características de los macroconidios a partir de
los esporodoquios (tamaños, forma del conidio,
forma de las células pie y apical); en las
características de los microconidios a partir del
micelio aéreo (presencia, forma, agrupación);
en los conidióforos (monofialides, polifialides)
y en los clamidoconidios (presencia, ausencia).
Todas las cepas de Fusarium aisladas se
conservaron a 4 ºC en crioviales conteniendo
agar-agua al 0,2 % (m/v) hasta su posterior
análisis.
Capacidad toxicogénica de las cepas
aisladas
Se siguió la metodología de Liu et al.
(1996), sustituyendo el arroz por granos de
maíz. Se colocaron 100 gramos de este sustrato
en matraz Erlenmeyer de 250 mL, uno para
cada cepa en estudio. Los granos se hidrataron
con 30 mL de agua destilada y se esterilizaron
en autoclave portátil de acero inoxidable
Labklass, YXQ-280MD a 121 ºC durante 30
minutos. Posteriormente se inoculó el maíz
esterilizado con 1 mL de la suspensión de la
cepa en estudio. Se incubaron 30 días a 28 ºC
agitando una vez al día para favorecer el
desarrollo uniforme. Cada análisis se realizó
por duplicado.
La determinación de FB se realizó
mediante ensayo por inmunoabsorción ligado a
enzimas (Enzyme-Linked ImmunoSorbent
Assay, ELISA) con el kit para fumonisinas
RIDASCREEN®FAST Fumonisin (R-
Biopharm AG, Darmstadt, Alemania). Este es
un inmunoensayo enzimático competitivo para
el análisis cuantitativo de FB en cereales y
piensos.
Preparación de las muestras de maíz
para la cuantificación de las fumonisinas
Para la preparación de las muestras se
siguieron las instrucciones del fabricante del kit
comercial. Para ello se pesaron 25 gramos de
muestra de maíz (inoculado con las cepas en
estudio e incubado durante 30 días a 28 ºC) y se
trituraron en un molinillo a cuchillas eléctrico
Dalvo, modelo MC/I (Tecno Dalvo, Santa Fe,
Argentina), luego se realizó la extracción de la

Frisón, Laura et al. 035
toxina con 125 mL de metanol:agua (70:30) y
se agitó vigorosamente durante 3 minutos en
mesa rotativa, marca BOECO, modelo OS-10
(Boeckel + Co (GmbH + Co), Alemania). Se
procedió al filtrado de la misma a través de
papel de filtro Wathman TM Nº 1 (Whatman
International Limited, UK). Se diluyó el filtrado
1:14 y se procedió a la cuantificación de FB.
Equipo generador de gas ozono
El equipo que se utilizó en este trabajo
para la generación del gas ozono fue
proporcionado y operado por personal de la
firma Agua Ozonizada Santo Tomé (Santa Fe,
Argentina). El gas fue producido mediante la
técnica de descarga eléctrica tipo corona
(Frisón et al., 2013). Las cantidades de ozono
generadas dependen de las condiciones de
trabajo, cantidad de oxígeno que ingresa al
equipo, temperatura ambiental, caudal y
radiación ultravioleta. Para la medición de la
concentración de ozono en fase gas se utilizó
Iodometría. Se hizo burbujear un volumen
conocido de un gas con ozono dentro de una
solución de yoduro de potasio (KI). La
medición de ozono residual en fase líquida, se
realizó mezclando una muestra del líquido a
medir con la solución de KI. La reacción
produce yodo (I 2 ), el cual se tituló
inmediatamente con tiosulfato de sodio
(Na 2 S 2 O 3 ) hasta color amarillo pálido,
utilizando almidón como indicador. La
concentración de ozono (mg O 3 /min) que
produjo el equipo se calculó por el consumo de
Na 2 S 2 O 3 (Beutelspacher-Santiago y Calderón-
Ancona, 2005).
Con un caudal de 2 L/min, los mg de O 3
se convierten en microlitros (µL) aplicando la
ecuación de los gases: P·V = n·R·T y dividiendo
por el caudal, para obtener las concentraciones
en partes por millón volumétricas (ppm v ).
Las concentraciones de gas ozono
utilizadas en los ensayos fueron 4500 ppm v ,
7500 ppm v y 25000 ppm v y los tiempos de
exposición fueron 10 y 20 minutos. Así, 4500
ppm v equivalen a una producción de gas ozono
de 18 mg/min, 7500 ppm v a 30 mg/min y 25000
ppm v a 100 mg/min.
Cuantificación de la concentración de
la toxina luego de la detoxificación con gas
ozono
Se trabajó de la misma manera que para
el estudio de la capacidad de producción de FB
por parte de los aislados. Posteriormente se
expuso el maíz al gas ozono a concentraciones
y tiempos determinados, en la cámara
hermética del equipo. Luego se procesaron las
muestras y se procedió a la cuantificación de las
FB.
Tratamiento estadístico de los datos
Para analizar el efecto de los diferentes
tratamientos se realizó Análisis de la Varianza
(ANOVA) y Contraste de Rangos Múltiple, con
un nivel de confianza de 95,0 %, utilizando el
software Statgraphics® Plus, versión 5.1
(Statistical Graphics Corporation,
Warrenton,VA, USA).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento e identificación de cepas de
Fusarium proliferatum y F. verticillioides
Se obtuvieron 15 aislados del género
Fusarium, 5 pertenecieron a la especie F.
proliferatum var. proliferatum (Nirenberg y
O’Donnell, 1998) (A1, A2, A3, A8 y A9) y 10
a F. verticillioides (Seifert et al., 2003) (A4,
A5, A6, A7, A10, A11, A12, A13, A14, A15).
Capacidad toxicogénica de las cepas aisladas
Al realizar el ELISA con el kit para FB
RIDASCREEN®FAST Fumonisin (R-
Biopharm AG), se observó que de los 15
aislados obtenidos, solo 7 resultaron ser
productores de FB; 3 pertenecientes a la especie

036
F. proliferatum (A1, A2 y A3) y 4 a la especie
F. verticillioides (A4, A5, A6 y A7), indicando
la gran incidencia de estos mohos en maíz y
silajes en la zona del litoral argentino (ciudad
de Santa Fe).
En el Cuadro 1 se pueden observar los
resultados obtenidos de los promedios de las 2
repeticiones realizadas (cada una por
duplicado). Los aislados Nº 8 al 15 no
produjeron FB por lo que no figuran en el
cuadro.
Cuadro1.- Concentración de fumonisinas (FB)
por el método de ELISA.
Aislado
Concentración FB (ppm)
A1 10,42
A2 12,68
A3 10,80
A4 20,00
A5 15,95
A6 12,06
A7 16,69
Las concentraciones de FB producidas
por estos aislados se encontraron entre 10,42 y
20,00 ppm (mg/kg). Estos resultados
concuerdan parcialmente con datos publicados
por Mallmann y Dilkin (2007) en su libro,
sobre diferentes países como Argentina,
Uruguay, Estados Unidos, Brasil y del
continente africano. Ellos observaron que de 64
muestras de alimentos y 50 de híbridos de maíz
analizadas en Uruguay y Argentina,
respectivamente, el 50 % de las muestras de
alimentos estaban contaminadas con FB en
concentraciones de 0,005 a 6,34 ppm, mientras
que el 100 % de las muestras de híbridos de
maíz tenían entre 0,18 a 27,05 ppm. Además,
en el maíz de Argentina encontraron
contaminaciones con FB en el orden de 0,04 a
9,95 ppm. También el maíz proveniente del sur
de África presentaba concentraciones de FB
entre 44 y 83 ppm e incluso hasta 117 ppm. En
Estados Unidos las concentraciones de FB
estaban entre 7,20 y 8,85 ppm, y la presencia de
esta micotoxina en alimentos para cerdos y
caballos había sido detectada en
concentraciones de 0,2 a 330 ppm. En Brasil la
mayor incidencia de contaminación con FB en
cereales y otros alimentos se encontró en los
estados del sur. El porcentaje de muestras
positivas oscilaron entre el 50 y 90 %, y las
contaminaciones variaron entre 0,005 y 15
ppm, sin embargo, el valor medio fue inferior a
1 ppm, a pesar de que también se puedan
encontrar valores de contaminación superiores
a 50 ppm de fumonisina B1.
Cuantificación de la concentración de la
toxina luego de la detoxificación con gas
ozono
En las Figs. 1, 2, 3, 4, 5 y 6 se muestran
los resultados obtenidos en la cuantificación de
la toxina para los aislados de F. proliferatum y
F. verticillioides luego de la exposición a las
diferentes condiciones de gas ozono estudiadas.
El ANOVA pudo establecer que no
existieron diferencias significativas (p =
0,1268) para las concentraciones de ozono y los
tiempos ensayados, con un nivel de confianza
del 95,0 %.
El Contraste de Rangos Múltiples
permitió identificar 2 grupos homogéneos. Los
aislados correspondientes a F. proliferatum
(A1, A2 y A3) formaron un grupo con medias
homogéneas y F. verticillioides (A4, A5, A6 y
A7) constituyeron el otro grupo.
Al aumentar la concentración de gas
ozono de 4500 ppm v a 25000 ppm v , no se
produjo una disminución o eliminación de la
toxina.
Al analizar los valores obtenidos de
concentración de FB se pudo observar que hubo
pequeñas variaciones en la concentración de FB
a medida que se incrementó la concentración de
gas ozono y el tiempo de exposición al mismo

Frisón, Laura et al. 037
24,00
21,00
Concentración FB (ppm)
18,00
15,00
12,00
9,00
6,00
Control
4500 ppmv 10 min.
4500 ppmv 20 min.
3,00
0,00
A1 A2 A3
Aislados
Figura 1.- Concentración de fumonisinas (FB) en aislados de F. proliferatum luego de exposición a
gas ozono 4500 ppm v (10 y 20 minutos) y comparación con el control.
24,00
21,00
Concentración FB (ppm)
18,00
15,00
12,00
9,00
6,00
Control
4500 ppmv 10 min.
4500 ppmv 20 min.
3,00
0,00
A4 A5 A6 A7
Aislados
Figura 2.- Concentración de fumonisinas (FB) en aislados de F. verticillioides luego de exposición a
gas ozono 4500 ppm v (10 y 20 minutos) y comparación con el control.

038
18,00
Concentración de FB (ppm)
15,00
12,00
9,00
6,00
3,00
Control
7500 ppmv 10 min.
7500 ppmv 20 min.
0,00
A1 A2 A3
Aislados
Figura 3.- Concentración de fumonisinas (FB) en aislados de F. proliferatum luego de exposición a
gas ozono 7500 ppm v (10 y 20 minutos) y comparación con el control.
24,00
21,00
Concentración FB (ppm)
18,00
15,00
12,00
9,00
6,00
3,00
Control
7500 ppmv 10 min.
7500 ppmv 20 min.
0,00
A4 A5 A6 A7
Aislados
Figura 4.- Concentración de fumonisinas (FB) en aislados de F. verticillioides luego de exposición a
gas ozono 7500 ppm v (10 y 20 minutos) y comparación con el control.

Frisón, Laura et al. 039
21,00
Concentración de FB (ppm)
18,00
15,00
12,00
9,00
6,00
3,00
Control
25000 ppmv 10 min.
25000 ppmv 20 min
0,00
A1 A2 A3
Aislados
Figura 5.- Concentración de fumonisinas (FB) en aislados de F. proliferatum luego de exposición a
gas ozono 25000 ppm v (10 y 20 minutos) y comparación con el control.
24,00
21,00
Concentración de FB (ppm)
18,00
15,00
12,00
9,00
6,00
3,00
Control
25000 ppmv 10 min.
25000 ppmv 20 min.
0,00
A4 A5 A6 A7
Aislados
Figura 6.- Concentración de fumonisinas (FB) en aislados de F. verticillioides luego de exposición a
gas ozono 25000 ppm v (10 y 20 minutos) y comparación con el control.

040
(entre 10 y 20 min). Debido a que no existió
producción espontánea de FB por parte de los
aislados, estos pequeños aumentos podrían
deberse al hecho de que el gas ozono es un
potente oxidante, y podría haber producido
interferencias con el kit comercial utilizado
para cuantificar las FB.
Existen estudios realizados para
aflatoxinas (AFLA); como los de Prudente y
King (2001), quienes mostraron que maíz
contaminado (10-12 % en peso) y tratado con
ozono gas, a un caudal de 2 L/min durante 96 h,
redujo los niveles de AFLA de 0,586 ppb a
0,047 ppb. Akbas y Ozdemir (2006) lograron
disminuir las concentraciones de AFLA en
granos de pistachos en un 23-24 % utilizando
concentraciones de gas ozono de 9 ppm a
tiempos de exposición de 420 min (a 20 ºC y 70
% de humedad relativa). Una reducción en las
concentraciones de AFLA aproximadamente de
un 25-30 %, en maní contaminado, luego de la
exposición a ozono gas a concentraciones de 21
ppm (mg/L) durante un tiempo de exposición
de 96 h, fue alcanzada por de Alencar et al.
(2012). Inan et al. (2007) observaron una
reducción del 80 y 93 % de AFLA en pimientos
rojos (Capsicum annuum), con concentraciones
de ozono gas de 33 y 66 ppm (mg/L),
respectivamente, durante 60 minutos de
exposición.
McKenzie et. al. (1997) estudiaron la
degradación y detoxificación de soluciones
acuosas de micotoxinas (aflatoxinas B1, B2, G1
y G2, ácido ciclopiazónico, fumonisina B1,
ocratoxina A, patulina, ácido secalónico y
zearalenona) en presencia de altas
concentraciones de O 3 (2 , 10 y 20 % en peso)
durante un período de 5 minutos y observaron
mediante la cuantificación por HPLC que
aflatoxina B1 y G1 fueron degradadas
rápidamente usando 2 % de O 3 ; mientras que
aflatoxina B2 y G2 eran más resistentes a la
oxidación requiriendo niveles mayores de O 3
(20 %). Para el estudio de fumonisina B1
(después de la reacción con O 3 ), observaron que
esta toxina se degradaba rápidamente (15 s) con
la formación de nuevos productos y destacaron
que la degradación de fumonisina B1 no se
correlacionaba con la detoxificación, ya que las
soluciones de esta toxina tratadas con O 3
presentaron valores positivos para 2 bioensayos
diferentes realizados.
Prevenir la contaminación con estos
mohos en granos de maíz y ensilados es la
mejor solución para el problema de las
micotoxinas, ya que una vez que se produjo la
toxina es difícil de erradicar (Marín et al.,
2008).
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIÓN
Se aislaron 15 cepas de las especies
Fusarium proliferatum y F.
verticillioides a partir de 40 muestras de
maíz y 40 de ensilados.
De los 15 aislados estudiados, 7
resultaron ser productores de
fumonisinas; 3 pertenecientes a F.
proliferatum y 4 a F. verticillioides.
La concentración de fumonisinas para
todos los aislados productores, luego de
30 días a 28 ºC, se encontraba entre
10,42 y 20,00 ppm.
A las concentraciones y tiempos
ensayados de gas ozono, no se observó
la disminución o eliminación de la
concentración de fumonisinas.
Prevenir la contaminación con estos
mohos en granos de maíz y ensilados es
la mejor solución para el problema de
las micotoxinas, ya que una vez que se
produjo la toxina es difícil erradicarla.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la financiación de
este trabajo a la Universidad Nacional del
Litoral, Santa Fe, Argentina, a través del
Programa PICT Bicentenario y a su Director
Dr. Juan Carlos Basílico.

Frisón, Laura et al. 041
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Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología de Alimentos. 5 (1): 043-056. Enero-Junio, 2014
http://www.rvcta.org
ISSN: 2218-4384 (versión en línea)
© Asociación RVCTA, 2014. RIF: J-29910863-4. Depósito Legal: ppi201002CA3536.
Comunicación
Efectos del pH, NaCl, CaCl 2 y la temperatura sobre la fuerza de cuajo de
tres coagulantes/cuajos
Effects of pH, NaCl, CaCl 2 and temperature on the rennet strength of three types of
coagulant/rennet
Osmar Thomas Morillo Piña 1 *, Pablo José García Lugo 2 , Balmore Ruizdael Guerrero 2 ,
Carmen Amelia Borregales Torres 3 , José Gonzalo Barrios 3
1 Fundación Centro de Investigaciones del Estado para la Producción Experimental Agroindustrial
(Fundación CIEPE). Av. Principal, Zona Industrial “Agustín Rivero”, Municipio Independencia, San
Felipe, Estado Yaracuy, Venezuela.
2 Universidad de Los Andes (ULA), Facultad de Ciencias, Departamento de Biología, Laboratorio de
Biotecnología de Microorganismos “Sixto David Rojo”. Sector La Hechicera, Estado Mérida,
Venezuela.
3 Productora de Alimentos Universitaria Lácteos Santa Rosa de la Universidad de Los Andes (ULA).
Mérida, Estado Mérida, Venezuela.
*Autor para correspondencia: omorillo@ciepe.gob.ve, osmthom@yahoo.com
Aceptado 29-Mayo-2014
Resumen
El cuajo y los coagulantes juegan un papel fundamental en el proceso de elaboración de queso y
su actividad se ve afectada por diversos parámetros tecnológicos. En este sentido se determinó el efecto
del pH, concentración de NaCl, CaCl 2 y de la temperatura sobre la fuerza de cuajo de un coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13), una quimosina recombinante comercial (Maxiren®) y un cuajo
comercial de origen animal (BIOVEN), preparados a concentraciones de 0,05 g/mL; 0,0004 g/mL y

044 Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(1):043-056.
0,0008 g/mL, respectivamente. El efecto del pH fue evaluado en un intervalo de 5,0 a 7,5 y la
concentración de NaCl y CaCl 2 en la leche entre 0,02 y 0,16 M. El efecto de los iones de Na y Ca en las
soluciones enzimáticas fue evaluado entre 0,04 y 0,80 M y la temperatura de incubación entre 20 y 70
ºC. Se determinó que los cambios de pH tienen un efecto inversamente proporcional sobre la actividad
coagulante de la leche y la máxima actividad fue a pH 5 para los tres coagulantes evaluados. La
concentración de NaCl en la leche tuvo un efecto adverso sobre la actividad coagulante, mientras que el
incremento de la [CaCl 2 ] aumentó la actividad alcanzando valores máximos a 0,04 M. La presencia
iones de Na en las soluciones enzimáticas tuvo el mismo efecto observado en las pruebas de
concentración de NaCl en la leche y se observó un aumento de la actividad relativa conforme se
incrementó la concentración de iones de Ca en la solución. Los tres coagulantes/cuajos evaluados
exhibieron la máxima fuerza de cuajo a 45 ºC y tuvieron una acción catalítica muy específica sobre la
leche con una marcada dependencia a los parámetros evaluados, presentando algunas diferencias entre
ellos debido posiblemente a la fuente y forma de obtención.
Palabras claves: aspártico proteasas, actividad catalítica, actividad coagulante de la leche, fuerza de
cuajo, quimosina.
Abstract
Rennet and coagulants play a fundamental role in the process of cheese making and its activity
is affected by various technological parameters. In this sense, the effect of pH, NaCl and CaCl 2
concentration and temperature on the rennet strength of an experimental microbial coagulant (BIOMI-
13), a commercial recombinant chymosin (Maxiren®) and commercial animal rennet (BIOVEN) was
determined, prepared at concentrations of 0.05 g/mL; 0.0004 g/mL and 0.0008 g/mL, respectively. The
effect of the pH was tested in a range from 5.0 to 7.5 and concentration of NaCl and CaCl 2 in milk was
evaluated between 0.02 and 0.16 M. The effect of the Na and Ca ions in the enzyme solutions was
evaluated between from 0.04 and 0.80 M and incubation temperature between 20 and 70 ºC. It was
determined that changes in pH have an inverse effect on milk-clotting activity and maximum rennet
strength at pH 5 for the three coagulants evaluated. The concentration of NaCl in milk had an adverse
effect on milk-clotting activity, while increasing [CaCl 2 ] increased relative activity peaking at
concentration of 0.04 M. The Na ions present in the enzyme solutions had the same effect observed in
the tests of NaCl concentration in milk and also was observed that increasing the Ca ions resulted in an
increase in relative activity. The three tested coagulant/rennet exhibited high rennet strength at 45 ºC
and had a very specific catalytic action on milk with a strong dependence on the parameters evaluated,
showing some differences between them possibly due to the source and method of production.
Keywords: aspartic proteases, catalytic activity, chymosin, milk-clotting activity, rennet strength.
INTRODUCCIÓN
El cuajo juega un papel fundamental en
el proceso de elaboración de queso,
tradicionalmente es extraído del cuarto
estómago de los terneros entre 10 y 30 días de
nacidos, como mezclas de quimosina (88 a 94
%) y pepsina (6 a 12 %) (Ruiz-Rojas, 2005).
Está compuesto principalmente por la enzima
quimosina (EC 3.4.23.4), organizada por el
Comité de Nomenclatura de la Unión
Internacional de Bioquímica y Biología

Morillo-Piña, Osmar et al. 045
Molecular en la clase hidrolasa (EC 3.),
subclase que actúa sobre enlaces peptídicos
(peptidasa) (EC 3.4), sub-subclase aspártico
endopeptidasa (EC 3.4.23); la cual cataliza la
hidrólisis específica de la κ-caseína de la leche
en el enlace Ser-Phe 105 ┼Met-Ala (NC-IUBMB,
2013), tiene un peso molecular de 35,6 kDa y
un punto isoeléctrico de 4,65 (Mohanty et al.,
2003; Kaewphuak, 2011). Su acción hidrolítica
es responsable de la desestabilización de los
agregados solubles dentro de la leche, dando
inicio a la agregación de las micelas
desestabilizadas que forman una red
tridimensional que va endureciéndose hasta dar
lugar al gel definitivo denominada cuajada
(Castillo-Zambudio, 2001).
La limitada disponibilidad de estómagos
de terneros para la fabricación del cuajo, los
problemas asociados con el sacrificio de
animales (Jacob et al., 2011) y los altos precios
de este producto en el mercado (Merheb-Dini et
al., 2012), son algunas de las razones que han
generado problemas para satisfacer esta
demanda; por lo que ha sido necesaria la
introducción de otros coagulantes como
sustitutos del tradicional cuajo de ternero,
específicamente aspártico proteasas similares a
la quimosina de ternero. Un adecuado sustituto
debe garantizar altos rendimientos en quesería y
productos con características sensoriales
aceptables, es decir, debe tener alta capacidad
de atacar el enlace peptídico Phe 105 ┼Met 106 de
κ-caseína y una baja actividad proteolítica a pH
y temperatura de fabricación del queso, además
de poseer una termoestabilidad suficientemente
baja para asegurar productos de suero de leche
sin restos de coagulante activo. Se ha hecho
mucho énfasis en introducir coagulantes
provenientes de otros rumiantes extraídas de
tejido del estómago de cordero (Moschopoulou
et al., 2007; Jacob et al., 2011), cabra, búfalo
(Kumar et al., 2006; Jacob et al., 2011), cerdo
(Houen et al., 1996), entre otros. Pero estos son
poco comercializados debido a que su uso está
dirigido a la elaboración de variedades de
quesos típicos como el Provolone o Valpadana
(Jacob et al., 2011); también están los
coagulantes de origen vegetal (Ruiz-Rojas,
2005; Jacob et al., 2011), estos son menos
comercializados que los de origen animal,
debido a que la relación entre la actividad
coagulante y la actividad proteolítica no es lo
suficientemente alta para su comercialización,
además de exhibir alta especificidad hacia la
caseína caprina y ovina, limitando su uso a solo
aquellos quesos de regiones específicas del
mundo (Raposo y Domingos, 2008) como el
Serra da Estrela (Portugal) y Manchego
(España) elaborados con coagulantes
provenientes de especies de Cynara (Prados et
al., 2007; Jacob et al., 2011). Otros tipos de
coagulantes de leche utilizados como sustitutos
del cuajo, son aquellos provenientes de
microorganismos. Esto ha generado la
evaluación de especies de hongos como el
Aspergillus versicolor (Abdel-Fattah y Saleh,
1988), Penicillium oxalicum (Hashem, 1999),
Rhizophus oryzae (Kumar et al., 2005), Mucor
circinelloides (Sathya et al., 2009), Mucor
mucedo DSM 809 (Yegin et al., 2010),
Thermomucor indicae-seudaticae N31
(Merheb-Dini et al., 2012) y Rhizomucor
nainitalensis (Khademi et al., 2013), entre
otros. La especies de bacterias del género
Bacillus también han sido objeto de estudios
(El-Bendary et al., 2007; Shieh et al., 2009; Wu
et al., 2013), su aptitud para quesería, acorde a
Ruiz-Rojas (2005), es mejor que la de las
enzimas vegetales, pero sensiblemente menos
satisfactoria que la de las enzimas producidas
por los hongos. Este autor afirma que dentro de
todos los microorganismos evaluados destacan
el Rhizomucor miehei, Rhizomucor pusillus y
Cryphonectria parasitica, de los que son
extraídas proteasas comercializadas por
distintas firmas a nivel mundial. La proteasas
de R. miehei son las más utilizadas, dando
resultados satisfactorios. Fox y McSweeney
(1997) y Mistry (2012) han señalado que los
coagulantes provenientes de organismos

046
modificados genéticamente también son
utilizados, dado que su uso permite obtener
productos similares a la quimosina de ternero,
estos han sido comercializados bajo las marcas:
Maxiren, secretada por Kluyveromyces
marxianus var. lactis (Gist-Brocades, Países
Bajos); Chymogen (Chr. Hansen, Dinamarca) y
Chymostar (Rhône-Poulenc; ahora por
Danisco), secretadas por Aspergillus niger var.
awamori; y Chy-max, secretada por
Escherichia coli K-12 (Pfizer, USA; ahora por
Chr. Hansen). El producto registrado bajo la
marca Marzyme GM por Novo Nordisk A/S
(Dinamarca), fue el resultado de expresar el gen
de proteasas de Rhizomucor miehei en
Aspergillus oryzae.
Las enzimas coagulantes de la leche
tienen una acción catalítica que varía entre los
tipos de coagulantes, en gran medida por la
fuente de obtención, por lo que se han
propuesto diversos métodos donde varían
fundamentalmente las condiciones de pH de la
leche y temperatura en que se realizan los
ensayos, sin embargo, todos ellos se basan en
determinar el tiempo que tarda la fase de
desestabilización de las micelas de caseína, es
decir, tiempo desde el contacto de los
coagulantes con la leche hasta la aparición de
los primeros coágulos de leche (inicio de la fase
de agregación y formación del gel o cuajada),
esto es lo que se conoce como fuerza de cuajo
(FC), es la medida indirecta de la acción
hidrolítica de las aspártico proteasas sobre las
moléculas de κ-caseína. Independientemente
del origen, la FC se ve afectada por diversos
factores, tales como, la composición química de
la leche principalmente por el contenido de
proteína, esta varía entre las especies de
animales de origen. La fracción de las proteínas
que intervienen en la elaboración de los quesos
pertenece al grupo de proteínas insolubles
llamadas caseína entera, formadas por α-
caseína, β-caseína, υ-caseína y κ-caseína, esta
última es la responsable de la formación de
agregados solubles dentro de la leche, tiene la
forma de una partícula coloidal conformada por
caseína agregada envuelta en una molécula de
κ-caseína soluble (Park et al., 2007). Otras
características de la leche que afectan la acción
catalítica son la concentración de fosfato
cálcico coloidal (CCP), relación Ca/(fosfato +
citrato), relación Ca/nitrógeno, concentración
de caseína, dimensión de las micelas,
presencia/ausencia de mastitis y
presencia/ausencia de calostros (Castillo-
Zambudio, 2001). Además de las características
físico-químicas de la leche, existen otros
factores que afectan la actividad catalítica de las
enzimas coagulantes, denominadas factores
tecnológicos asociados al proceso de
elaboración de queso: temperatura,
concentración, tipo de enzima, adición de
cloruro de calcio (CaCl 2 ), pH de la leche y la
concentración de NaCl (Castillo-Zambudio,
2001; Awad, 2007). Estos factores pueden
modificar la cinética de la hidrolisis de las
enzimas coagulantes de la leche provocando
cambios en la firmeza del gel (textura de la
cuajada), bajos rendimientos, pueden
intensificar la actividad proteolítica y disminuir
la especificidad originando la aparición de
sabores extraños y en general características
sensoriales no deseadas en los quesos
(Cavalcanti et al., 2004; Kumar et al., 2006;
Awad, 2007). En este sentido es imprescindible
conocer el efecto de estos parámetros sobre la
fuerza de los cuajos y coagulantes empleados
en la elaboración de quesos. Bajo esta premisa,
se presenta la evaluación del efecto del pH,
concentración de iones de Na + y Ca 2+ y de la
temperatura, sobre la fuerza de cuajo de los
coagulantes: BIOMI-13, microbiano
experimental producido por una cepa de
Rhizomucor spp.; Maxiren®, microbiano
comercial proveniente de organismos
modificados; y BIOVEN, un cuajo comercial
de origen animal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se utilizaron tubos de ensayo de
capacidad 12 mL, marca PYREX® (Corning
Incorporated, Corning, NY, USA) y las
incubaciones se realizaron en un baño

Morillo-Piña, Osmar et al. 047
termostatizado con agitación marca Grant,
modelo GLS400 (Grant Instruments Ltd,
Shepreth, Cambridgeshire, UK).
Cuajo y coagulantes
Se utilizó un coagulante de leche
microbiano liofilizado producido por cultivo
sumergido de una cepa de Rhizomucor spp.
(BIOMI-13) de la colección de cultivos del
Laboratorio de Biotecnología de
Microorganismos “Sixto David Rojo” de la
Universidad de Los Andes (Estado Mérida,
Venezuela). Una quimosina recombinante
(coagulante de organismo modificado)
comercial marca Maxiren®, producida por
Kluyveromyces lactis (DSM Food Specialties
B.V. - Gist-Brocades) y un cuajo de origen
animal marca BIOVEN provisto por la
Productora de Alimentos Universitaria Lácteos
Santa Rosa de la Universidad de Los Andes
(Estado Mérida, Venezuela).
Se utilizó como sustrato leche
descremada Difco TM Skim Milk (Becton,
Dickinson and Company, New Jersey, USA -
Difco TM Laboratories, Inc., Michigan, USA) y
para la incorporación de iones, cloruro de sodio
(NaCl) y cloruro de calcio (CaCl 2 ) grado
analítico.
Preparación de las soluciones de
cuajo y coagulantes
Se prepararon 3 soluciones enzimáticas,
una a partir del coagulante microbiano
experimental BIOMI-13 a concentración de
0,05 g/mL, una con el coagulante microbiano
comercial Maxiren® a 0,0004 g/mL y otra con
el cuajo comercial de origen animal BIOVEN a
0,0008 g/mL, preparadas con agua destilada.
Las 3 concentraciones fueron seleccionadas en
función al tiempo de coagulación, comprendido
entre 60 y 120 segundos, esto permitió obtener
registros precisos del tiempo de aparición de los
primeros coágulos durante la determinación de
la FC.
Determinación de la fuerza de cuajo
La actividad coagulante de la leche, se
midió por el método comentado por Osorio et
al. (2008); consistió en tomar el tiempo que
tarda en coagular una muestra de 5,0 mL de leche
descremada (al 10 % en CaCl 2 0,01 M) al
adicionarle 0,5 mL de sobrenadante del cultivo
proveniente de la fermentación. Esta
determinación se logra haciendo rotar de
manera manual las muestras en un baño de
maría a temperatura de 37 ºC. La lectura del
tiempo de coagulación se hace justo cuando el
aspecto de la película de leche sobre la pared
interna del tubo de ensayo cambia de fluido
laminar a viscoso formándose pequeños
grumos. La actividad enzimática se expresó
como la fuerza de cuajo (FC) definida como la
cantidad de leche cuajada en mililitros por
gramo o mililitro de sobrenadante del cultivo en
40 minutos a 37 ºC y se calculó mediante la Ec.
1:
Ecuación (1)
Donde:
FC : fuerza de cuajo
V : cantidad de leche, mL
2400: tiempo en que normalmente cuaja la
leche a 37 ºC con un cuajo estándar, s.
C : cantidad de sobrenadante del cultivo, mL
t : tiempo de coagulación de la muestra, s
Determinación del efecto del pH,
concentraciones de iones de Na, Ca y la
temperatura
A cada solución enzimática se le
determinó la fuerza de cuajo (FC) bajo
condiciones estándar del método comentado
por Osorio et al. (2008) y bajo diferentes
valores de pH, concentraciones de iones de Na,
Ca y de temperatura en la leche. A continuación
se describen las pruebas realizadas:
t

048
El efecto del pH de la leche fue
evaluado en un intervalo de 5,0 a 7,5. La leche
descremada fue preparada al 10 % y CaCl 2 0,01
M en buffer de fosfato de sodio a 20 mM para
el intervalo de pH 5,0 - 5,5 y en buffer Tris-
HCL a 20 mM para el intervalo de pH 6 - 7,5.
Para evaluar el efecto de la
concentración de iones de Na y Ca en la leche,
se preparó leche descremada al 10 % y CaCl 2
0,01 M en agua destilada y adicionalmente se
agregó NaCl para obtener concentraciones de
0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12; 0,16 M y una
muestra sin Na. El CaCl 2 fue agregado en las
mismas proporciones descritas para las pruebas
con Na; adicionalmente se preparó una muestra
sin Ca y otra con 0,01 M de concentración.
Para determinar el efecto de los iones de
Na y Ca en las soluciones enzimáticas, a cada
una de ellas se agregó NaCl para obtener
concentraciones de 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,24;
0,40 y 0,80 M. Para el CaCl 2 , las soluciones
fueron preparadas en el mismo orden de
concentraciones descritas para el Na.
Posteriormente, a cada solución enzimática
preparada se le determinó la fuerza de cuajo.
En el caso de la temperatura, el efecto
fue determinado preparando muestras de leche
descremada al 10 % en una solución de CaCl 2
0,01 M. Cada determinación de fuerza de cuajo
se realizó a diferentes temperaturas de
incubación de la reacción: 20, 25, 30, 37, 40,
45, 50, 60 y 70 ºC.
Expresión de los resultados
Los resultados fueron expresados en
términos de la actividad relativa (AR), la cual
se estima según la Ec. 2, tomando como
referencia la fuerza de cuajo determinada a 37
ºC según el método comentado por Osorio et al.
(2008).
Ecuación (2):
AR
par etro odificado
todo sorio
x
Donde:
AR : actividad relativa expresada en porcentaje
FC parámetro modificado : fuerza de cuajo determinada
a la condición a evaluar
FC método Osorio : fuerza de cuajo determinada
según el método estándar comentado por
Osorio et al. (2008)
Cada determinación de AR fue estimada
por triplicado y promediada para graficarla por
separado en función a las variables pH,
concentraciones de NaCl, CaCl 2 y temperatura,
según fue el caso.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fuerza de cuajo (FC) bajo condiciones
estándar
En el Cuadro 1 se muestran los valores
de la fuerza de cuajo de cada solución
enzimática preparada a las concentraciones
descritas en la metodología. Fueron
determinadas bajo las condiciones estándar del
método seleccionado y servirán de referencia
para el cálculo de la actividad relativa (AR)
bajo las demás condiciones de estudio.
Cuadro 1.- Actividad coagulante de las
soluciones enzimáticas evaluadas.
Solución enzimática
cuajo/coagulante
FC ± D. S.
BIOMI-13 260,87 ± 0,23
Maxiren® 213,34 ± 0,91
BIOVEN 195,95 ± 0,50
FC: fuerza de cuajo. D. S.: desviación estándar.
La actividad registrada por cada
solución enzimática está asociada a las
concentraciones a las que fueron preparadas,
debido a que permite tiempos de lectura
promedio de 122, 112,5 y 92 segundos de

Morillo-Piña, Osmar et al. 049
tiempo de coagulación para BIOVEN,
Maxiren® y BIOMI-13, respectivamente.
Tiempo suficiente para las determinaciones de
la FC en las evaluaciones que se discuten a
continuación.
Factores que afectan la actividad coagulante
de la leche en los cuajos
Efectos del pH
Se determinó que los cambios de pH
tienen un efecto inversamente proporcional
sobre la actividad coagulante de la leche del
cuajo y coagulantes evaluados, tal como se
observa en la Fig. 1. La mayor sensibilidad a
los cambios de pH fue para el cuajo comercial
de origen animal (BIOVEN), que registró una
AR de 225 % a pH 5 y de 36,1 % a pH 7,5.
Mientras que el menor efecto se observó sobre
el coagulante microbiano experimental BIOMI-
13, alcanzando 165,79 % a pH 5,0;
descendiendo proporcionalmente hasta registrar
54,99 % de la AR a pH 7,5. El coagulante
microbiano comercial Maxiren®, registró
valores similares al microbiano experimental
(BIOMI-13).
Foda et al. (2012) observaron que a pH
mayores a 5, la actividad de coagulación de la
leche expresada como actividad relativa (AR)
de enzimas producidas por Rhizomucor miehei
NRRL 2034 bajo fermentación en estado
sólido, disminuyó hasta alcanzar 40 % a pH 7.
En la coagulación de la leche, entre tipos de
cuajos y coagulantes, la dependencia del pH de
las enzimas empleadas es diferente (Harboe et
al., 2010).
Figura 1.- Efectos del pH sobre la fuerza de cuajo de los coagulantes ▲Maxiren®, ■BIOVEN y
●BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al 10 % y [CaCl 2 ] de 0,01 M, incubadas a
37 ºC.
Efectos de la concentración de NaCl y
CaCl 2 en la leche
La concentración de iones de sodio en la
leche tuvo un efecto adverso sobre la actividad
coagulante de la leche (Fig. 2), fue
inversamente proporcional a la concentración
de NaCl en la leche, disminuyendo hasta
valores de ≈ 60 % de AR para el coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13) y ≈ 40 %

050
Figura 2.- Efectos de la [NaCl] en la leche sobre la fuerza de cuajo de los coagulantes ▲Maxiren®,
■BIOVEN y ●BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al 10 % y [CaCl 2 ] de 0,01
M, incubadas a 37 ºC.
para los comerciales (Maxiren® y BIOVEN) a
concentración de 0,16 M.
Inhibición progresiva de la AR por
incremento de la concentración de NaCl, desde
≈ % (a concentración de ≈ 3 % de NaCl)
hasta ≈ % (a concentraciones de 9 hasta 12
% de NaCl) fue estimada por Foda et al. (2012)
para enzimas producidas por R. miehei NRRL
2034. Harboe et al. (2010) sostienen que la
adición de NaCl se limita a < 0,5 g/100 g; ya
que aumenta la formación de cuajada, mientras
que a concentraciones mayores tiene un efecto
contrario. Por otra parte, la sensibilidad de las
enzimas de coagulación de la leche de varias
fuentes al NaCl no es la misma (Foda et al.,
2012). Ramet (2001) describe que el efecto del
NaCl en leche de vaca no es el mismo en
presencia de diferentes tipos de enzimas de
coagulación de la leche y agrega que, en leche
de Camelus dromedarius, la pepsina bovina
parece ser menos sensible al NaCl que el cuajo
de ternera, particularmente a altas
concentraciones de la sal.
En la Fig. 3 se observa el aumento en la
FC al incrementar el contenido CaCl 2 en la
leche, alcanzando valores máximos de AR de
310 % para BIOVEN y 264 % para Maxiren® a
concentración de 0,04 M. El coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13) solo
alcanzó una actividad relativa máxima de 140
%, a la misma concentración, mostrando menor
sensibilidad al incremento de las
concentraciones de Ca en la leche. En las
muestras de leche sin adición de calcio, se
observó una baja significativa en la FC de
ambos coagulantes comerciales (Maxiren® y
BIOVEN), mientras que el coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13) no
mostró una dependencia tan marcada.
Similar comportamiento al de la Fig. 3
fue apreciado por Foda et al. (2012), quienes
mostraron que la AR fue mayor con la adición
de CaCl 2 a concentración de 0,05 M; y que,
mayores concentraciones resultaron en una
marcada disminución en la actividad de
coagulación de la leche, la cual se redujo a 37,5
% a concentración 0,2 M de CaCl 2 . Asimismo,
incrementos de las concentraciones de CaCl 2 de

Morillo-Piña, Osmar et al. 051
Figura 3.- Efectos de la [CaCl 2 ] en la leche sobre la fuerza de cuajo de los coagulantes ▲Maxiren®,
■BIOVEN y ●BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al 10 % e incubadas a 37 ºC.
10 a 50 mM produjeron incrementos de la
actividad de coagulación de la leche, cuando
fue utilizada una proteasa extraída de flores de
Scolymus maculatus en leche descremada
(Benchiheub et al., 2014).
Es conocido que el Ca +2 combinado con
la ρ-caseína forma firmes coágulos durante la
segunda fase del proceso de coagulación. La
adición de CaCl 2 durante la coagulación de la
leche reduce el tiempo e incrementa la tasa de
coagulación (El-Bendary et al., 2007;
Mohamed et al., 1988 y Balcones et al., 1996
cp Ahmed y Helmy, 2012).
Efectos de la concentración de NaCl y
CaCl 2 en las soluciones enzimáticas
La presencia iones de sodio en las
soluciones enzimáticas tuvo el mismo efecto
adverso sobre la actividad coagulante de la
leche (Fig. 4) describiendo la misma tendencia
que la observada en las pruebas de
concentración de Na en la leche; sin embargo,
el coagulante microbiano comercial Maxiren®
presentó menor sensibilidad a los niveles de Na
en las solución enzimática en comparación con
el cuajo comercial de origen animal BIOVEN,
contrario a lo ocurrido en las pruebas de leche.
En la Fig. 5 se observa el aumento de la
actividad relativa conforme se incrementó la
concentración de CaCl 2 en las soluciones
enzimáticas, sin embargo, los valores máximos
alcanzados por los coagulantes comerciales
(Maxiren® y BIOVEN) estuvieron por debajo
de los obtenidos en las prueba de Ca en leche,
en especial para el Maxiren® que solo alcanzó
≈ 5 % de AR, ientras que a concentraciones
de 0,80 M, la AR del cuajo comercial BIOVEN
fue inhibida casi en totalidad.
En el caso del coagulante microbiano
experimental (BIOMI-13), mostró un aumento
de la actividad por encima de los comerciales y
mayor que el registrado en las pruebas de Ca en
leche, alcanzando aproximadamente una AR de
250 % a concentraciones en el intervalo 0,40 M
- 0,80 M.
Estos resultados podrían sugerir que la
presencia de Ca en las soluciones enzimáticas
induce algún tipo de modificaciones en las
enzimas coagulantes contenidas en el cuajo
microbiano que podría ser de tipo estructural o
de modificaciones en el sitio activo.

052
Figura 4.- Efectos de la [NaCl] en las soluciones enzimáticas sobre la fuerza de cuajo de los
coagulantes ▲Maxiren®, ■BIOVEN y ●BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al
10 % y [CaCl 2 ] de 0,01 M, incubadas a 37 ºC.
Figura 5.- Efectos de la [CaCl 2 ] en las soluciones enzimáticas sobre la fuerza de cuajo de los
coagulantes ▲Maxiren®, ■BIOVEN y ●BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al
10 % y [CaCl 2 ] de 0,01 M, incubadas a 37 ºC.

Morillo-Piña, Osmar et al. 053
Ahmed y Helmy (2012) evaluaron el
efecto de los iones Mn +2 , Ca +2 , Mg +2 , Zn +2 , Fe +2
y Cu +2 , en las preparaciones enzimáticas de
coagulantes provenientes de Bacillus
licheniformis y Aloe variegata, demostrando
que el Mn +2 , Ca +2 , Zn +2 y el Fe +2 tuvieron un
efecto activador sobre ambos coagulantes. Un
estudio similar fue publicado por El-Tanboly et
al. (2013), donde demostraron que al aumentar
las concentraciones de iones de Ca durante la
coagulación de la leche (mezcla de reacción)
con una enzima de Mucor pusillus QM 436
incrementó la actividad coagulante, al igual que
el Mg +2 y el Fe +3 , mientras los iones Mn +2 y
Zn +2 no tuvieron un efecto significativo sobre el
mencionado coagulante.
Efectos de la temperatura de
incubación (coagulación)
De acuerdo al gráfico de la Fig. 6, los 3
coagulantes evaluados exhibieron la máxima
AR a 45 ºC (160 % para Maxiren® y BIOVEN
y 200 % para BIOMI-13). El coagulante
microbiano experimental BIOMI-13 conservó
más del 50 % de la actividad a temperatura de
70 ºC y los 2 comerciales fueron casi
totalmente inhibidos.
Foda et al. (2012) para un coagulante
producido por Rhizomucor miehei, observaron
incremento progresivo de la actividad
coagulante de la leche al aumentar la
temperatura de incubación, alcanzando la
máxima AR a 60 ºC, resultado mayor a los
obtenidos para los coagulantes evaluados en
este trabajo. Entre tipos de coagulantes, algunos
no influyen significativamente en la proteólisis
secundaria (Sheehan et al., 2004), coagulantes
en la producción de quesos donde la
gelificación tiene lugar a baja temperatura,
mientras que a temperaturas más altas puede
ocurrir proteólisis excesiva afectando
negativamente la textura y el sabor de los
quesos (Esteves et al., 2003). La
termoestabilidad del coagulante microbiano
experimental (BIOMI-13) implica posibles
problemas por efecto de proteólisis secundarias
en quesos en etapa de maduración.
Figura 6.- Efectos de la temperatura de incubación sobre la fuerza de cuajo de los coagulantes
▲Maxiren®, ■BIOVEN y ●BIOMI-13, determinados en muestras de leche descremada al 10 % y
[CaCl 2 ] de 0,01 M.

054
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIÓN
El cuajo y coagulantes evaluados
tuvieron una acción catalítica muy
específica sobre la leche con una
marcada dependencia al pH,
concentraciones de iones de Na, Ca y
temperaturas como era de esperarse,
presentando algunas diferencias entre
ellos debido posiblemente a la fuente y
forma de obtención.
El cuajo comercial de origen animal
(BIOVEN) y el coagulante microbiano
comercial (Maxiren®) mostraron mayor
sensibilidad a los cambios de los
parámetros evaluados y similitud entre
ellos, excepto en el pH, donde
Maxiren® registró valores similares al
coagulante microbiano experimental
(BIOMI-13) y ambos menor
sensibilidad.
El coagulante microbiano experimental
(BIOMI-13) presentó mayor
sensibilidad a la presencia de Ca en
solución y mayor estabilidad térmica.
Es necesario evaluar con ensayos de
mayor amplitud para el coagulante
microbiano experimental (BIOMI-13),
los efectos del Ca en la solución
enzimática y de estabilidad térmica
observados.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Fundación
CIEPE (Estado Yaracuy, Venezuela), al
Laboratorio de Biotecnología de
Microorganismos “Sixto David Rojo” de la
Universidad de Los Andes (ULA) y a la
Productora de Alimentos Universitaria Lácteos
Santa Rosa de la ULA (Estado Mérida,
Venezuela) por el apoyo brindado durante la
ejecución de este trabajo.
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Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología de Alimentos. 5 (1): 057-069. Enero-Junio, 2014
http://www.rvcta.org
ISSN: 2218-4384 (versión en línea)
© Asociación RVCTA, 2014. RIF: J-29910863-4. Depósito Legal: ppi201002CA3536.
Comunicación
Efecto del sistema glucosa oxidasa/glucosa sobre el crecimiento de
Escherichia coli ATCC 25922 en leche
Effect of glucose oxidase/glucose system on the growth of
Escherichia coli ATCC 25922 in milk
Nirza Noguera 1 *, Ana Hernández 2 , Aldair Jiménez 2 , Dayana Requena 1 ,
Ninoska Ramírez 1 , Luis Ojeda 1
1 Instituto de Investigaciones Biomédicas “Dr. Francisco J. Triana Alonso”, Universidad de Carabobo.
Avenida Las Delicias, Maracay, Estado Aragua, Venezuela.
2 Universidad de Carabobo, Facultad de Ciencias de la Salud, Sede Aragua, Escuela de Bioanálisis
“Omaira Figueroa”. Estado Aragua, Venezuela.
*Autora para correspondencia: nnoguera1@uc.edu.ve
Aceptado 13-Julio-2014
Resumen
La leche es uno de los alimentos de mayor importancia por ser rico en nutrientes y porque
constituye la materia prima para la elaboración de una amplia gama de productos. Se ha demostrado
que en leches pasteurizadas de marcas comerciales, pueden ocurrir contaminaciones postproceso, lo
que representa un riesgo para la salud pública. Es por ello que en las últimas décadas, ha ganado
importancia el uso de aditivos sintéticos u orgánicos como técnica complementaria durante el
procesamiento de alimentos. La enzima glucosa oxidasa (GOX) tiene amplio uso en la industria de
alimentos gracias a sus propiedades antioxidante y antimicrobiana. Adicionalmente, se ha demostrado
su capacidad de inhibir el crecimiento de diferentes enterobacterias. Por tal motivo, en el presente
trabajo se planteó adicionar la enzima GOX en la leche y evaluar su efecto sobre el crecimiento de una
cepa de Escherichia coli ATCC 25922. Se estandarizó la concentración de GOX y glucosa que
ocasionaba la inhibición del crecimiento bacteriano en medio Luria-Bertani y en función de los

058 Rev. Venez. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(1):057-069.
resultados, se decidió utilizar la combinación de 2 U de GOX y 2,0 % de glucosa para agregarlos como
aditivos en la leche y se establecieron dos sistemas: GOX/G sin pasteurizar y GOX/G pasteurizado. El
crecimiento fue monitoreado por la técnica de contaje de colonias en placa-agar, a partir de 1 mL de
cultivo a las 4, 6 y 24 h de incubación. Se encontró que los sistemas con GOX hasta las 6 horas
presentaron efectos similares, inhibiendo significativamente el crecimiento de la bacteria, mientras que
a las 24 h ya no se observó dicha inhibición, pero sí que el sistema con GOX pasteurizada exhibió una
población menor que el sistema GOX sin pasteurizar. Estos hallazgos proyectan a la enzima GOX
como una alternativa para la conservación de la leche, tanto cruda como pasteurizada.
Palabras claves: Escherichia coli, glucosa oxidasa, leche, pasteurización.
Abstract
Milk is one of the most important foods to be rich in nutrients and that is the raw material for
the manufacture of a wide range of products. It has been shown that pasteurized milks trademarks, may
have post-processing contamination, which poses a risk to public health. That is why in recent decades
has gained importance the use of synthetic or organic additives as a complementary technique during
food processing. Glucose oxidase (GOX) enzyme has wide application in the food industry due to its
antioxidant and antimicrobial properties. Additionally, it has demonstrated its ability to inhibit the
growth of different enterobacteria. Therefore, this work proposed adding the enzyme GOX in milk and
evaluates its effect on the growth of a strain of Escherichia coli ATCC 25922. The GOX and glucose
concentration that caused inhibition of bacterial growth in Luria-Bertani medium was standardized and
depending on the results, it was decided to use the combination of 2 U of GOX and 2.0 % glucose as
additives to add in the milk and two systems were developed: GOX/G unpasteurized and pasteurized
GOX/G. Growth was monitored by the technique of colony counting on agar plate, starting from 1 mL
of culture at 4, 6 and 24 h of incubation. It was found that systems with GOX to 6 hours had similar
effects, significantly inhibit the growth of bacteria, while at 24 hours, this inhibition was not observed,
but the system pasteurized GOX exhibited a smaller population than the GOX system unpasteurized.
These findings GOX enzyme projected as an alternative to the preservation of milk, both raw and
pasteurized.
Key words: Escherichia coli, glucose oxidase, milk, pasteurization.
INTRODUCCIÓN
Por su aporte nutricional, la leche es uno
de los alimentos de mayor importancia en
muchos países del mundo (Celis y Juárez,
2009). Además de ser un alimento rico en
nutrientes, constituye la materia prima para la
elaboración de una amplia gama de productos
(Díaz, 2000). No obstante, es un alimento
altamente perecedero, por lo que debe ser
manejado de manera adecuada. Las condiciones
de higiene y sanidad de las explotaciones
lecheras, así como a nivel de las industrias
procesadoras, deben ser óptimas para garantizar
la calidad microbiológica de este alimento
(Valbuena et al., 2004; Celis y Juárez, 2009).
En Venezuela, la norma 798:1994 de la
Comisión Venezolana de Normas Industriales
(COVENIN), define la leche pasteurizada como
“…la leche cruda homogeneizada o no, que ha

Noguera, Nirza et al. 059
sido sometida a un proceso térmico aprobado
por la autoridad competente, en condiciones
tales que garanticen la destrucción de
microorganismos patógenos y la casi totalidad
de los microorganismos banales que pudiesen
estar presentes, sin que se alteren sensiblemente
las características organolépticas y físicoquímicas
de la misma.” (COVENIN, 1994).
Esto implica que el proceso de pasteurización
debería mejorar la calidad microbiológica de la
leche cruda, lo que contribuiría a alargar su vida
de anaquel y minimizar riesgos de
enfermedades de transmisión alimentarias. Sin
embargo, hallazgos como los realizados por
Valbuena et al. (2004) y Luigi et al. (2013), en
leches pasteurizadas de marcas comerciales,
demostraron que pueden ocurrir
contaminaciones postproceso, probablemente
por aplicación deficiente de buenas prácticas de
procesamiento, limpieza y saneamiento de las
plantas procesadoras. En el estudio conducido
por Valbuena et al. (2004) en Maracaibo
(Estado Zulia, Venezuela), se encontró que el
50,93 % de las muestras analizadas de 5 marcas
de leche pasteurizada tenían niveles de
coliformes totales mayores al valor máximo de
1,0x10 2 UFC/mL, utilizado como referencia
para comparación en el estudio. En la
investigación realizada por Luigi et al. (2013)
en el Municipio Valencia del Estado Carabobo
(Venezuela), se obtuvo que el 45 % de las
muestras analizadas presentaron contajes de
coliformes totales elevados que superaron el
recuento de 1,0x10 2 UFC/mL. Además,
realizaron la determinación de coliformes
fecales y encontraron que el 72 % de las
muestras estaban por encima de lo permitido (3
UFC/mL). Dentro de las enterobacterias
aisladas en algunas muestras destacan:
Enterobacter cloacae (38 %), Escherichia coli
(45 %), Klebsiella pneumoniae (27 %),
Pseudomonas aeruginosa (10 %) y
Pseudomonas putida (7 %).
Estos problemas de contaminación a
nivel de la industria alimentaria representan no
solo un riesgo importante para la salud, sino
también un riesgo significativo desde el punto
de vista económico. La producción industrial de
alimentos es un proceso que se desarrolla a gran
escala, razón por la cual las consecuencias de
pérdidas por contaminación microbiana son
altamente costosas (Orberá-Ratón, 2004). Es
por ello, que en las últimas décadas la
alternativa de combinar técnicas de
conservación durante el procesamiento de
muchos alimentos, ha ganado importancia. En
este sentido, los aditivos sintéticos y orgánicos
con actividad antimicrobiana se están
implementando como técnica complementaria
para extender la vida útil de los alimentos. En
especial, los aditivos orgánicos o de origen
natural, dadas las ventajas que tienen frente a
los sintéticos, tal como lo destaca Rodríguez-
Sauceda (2011).
Dentro de este grupo de aditivos
orgánicos, las enzimas han tenido una gran
aceptación. La enzima peroxidasa (EC
1.11.1.7), también llamada lactoperoxidasa
(NC-IUBMB, 2011), es empleada a nivel de la
leche cruda, como un conservante natural
recomendado por la Organización de las
Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación (FAO), considerado seguro
cuando se usa en correspondencia con las
directrices del Codex (FAO/WHO, 2006). La
enzima cataliza la oxidación de los iones de
tiocianato en presencia del peróxido de
hidrógeno. Esta reacción convierte el tiocianato
en ácido hipotiocianoso (HOSCN) que al pH de
la leche, se disocia en forma de iones de
hipotiocionato (OSCN - ) los cuales reaccionan
con los grupos de sulfhidrilos libres,
inactivando así varias enzimas vitales para el
metabolismo de la célula bacteriana, lo que a su
vez imposibilita su reproducción. Como las
proteínas de la leche contienen muy pocos
grupos de sulfhidrilos y los que se hallan
presentes son relativamente inaccesibles al
OSCN - (enmascarado), la reacción de este
compuesto en la leche es bastante específica y

060
combate las bacterias presentes en la leche. El
efecto antibacteriano del sistema
lactoperoxidasa/tiocianato/peróxido de
hidrógeno depende de la especie y la cepa.
Cuando la leche cruda tiene una flora mixta en
la que predominan las bacterias mesófilas, el
efecto es bacteriostático, (es decir,
principalmente inhibidor). En presencia de
algunas bacterias Gram-negativas, por ejemplo,
Pseudomonas o Escherichia coli, el efecto es
bactericida (FAO/OMS, 1991). Este sistema es
recomendado cuando no existe posibilidad de
refrigerar la leche cruda previo a su
procesamiento, ya que puede mantener la
calidad microbiológica inicial de la misma por
8 horas sin refrigeración. La activación de este
sistema previo al proceso de pasteurización es
beneficioso, puesto que incrementa la eficiencia
del tratamiento térmico, eliminando la
contaminación por bacterias coliformes y
termorresistentes post-tratamiento (Ponce,
2010).
La glucosa oxidasa (GOX) (EC 1.1.3.4)
es una flavoproteína (NC-IUBMB, 1961) que
cataliza la oxidación de la β-D-glucosa hacia
ácido glucónico y peróxido de hidrógeno,
usando el oxígeno molecular como aceptor final
de electrones (Hatzinikolaou et al., 1996;
Pluschkell et al., 1996; Fiedurek y Gromada,
2000). Es producida comercialmente a partir de
los géneros Aspergillus y Penicillium, siendo A.
niger la especie usada con mayor frecuencia
para este fin (Hatzinikolaou y Macris, 1995;
Wong et al., 2008). La enzima GOX ha
demostrado su capacidad de suprimir o inhibir
el crecimiento de especies como Pseudomonas
fragi en caldo nutritivo y medio de extracto de
pescado (Yoo y Rand, 1995); Staphylococcus
aureus, Salmonella infantis, Clostridium
perfringens, Bacillus cereus, Campylobacter
jejuni, Listeria monocytogenes y Yersinia
enterocolitica en medio de carne cruda y
desnaturalizada con calor (Tiina y Sandholm,
1989); Escherichia coli y Salmonella derby en
caldo nutritivo (Massa et al., 2001). Este efecto
antimicrobiano, ha sido asociado a los
productos de la reacción que la enzima cataliza.
Específicamente, el peróxido de hidrógeno es
capaz de oxidar los grupos sulfhidrilos de las
enzimas bacterianas, formando puentes
disulfuro lo que genera cambios
conformacionales, pérdida de funcionalidad y
muerte celular (Rojas-Valencia et al., 2008;
Tormo-Maicas y Julián-Rochina, 2009).
En consecuencia, como los principales
microorganismos responsables de la
contaminación de la leche son enterobacterias y
está demostrado el potencial que tiene la GOX
para inhibir su crecimiento, se planteó en el
presente trabajo adicionar la enzima en la leche
y evaluar su efecto sobre el crecimiento de una
población bacteriana definida de Escherichia
coli ATCC 25922.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales biológicos
Microorganismo y medio de cultivo
Se trabajó con la cepa Escherichia coli
ATCC 25922, certificada por el Instituto
Nacional de Higiene “Rafael Rangel” (Caracas,
Venezuela).
El medio Luria-Bertani (LB) se usó
como medio estándar para el cultivo de la cepa,
compuesto por: triptona 10 g/L, extracto de
levadura 5 g/L y NaCl 10 g/L; para ajustar el
pH a 7,0 se utilizó NaOH 1,0 N. Los
componentes fueron mezclados en solución y
sometidos a esterilización húmeda en un
autoclave Market Forge, Sterilmatic (Market
Forge Industries, Inc., Burlington, VT, USA) a
121 ºC, 15 psi, previo a su uso.
Enzima glucosa oxidasa (GOX)
Se utilizó GOX comercial Sigma®
G6641, de 10.000 U, lote 070K38131 (Sigma-
Aldrich® Co. LLC., Saint Louis, MO, USA), a

Noguera, Nirza et al. 061
partir de la cual se preparó una solución madre
de 1000 U/mL, almacenada a -20 ºC en un
congelador horizontal marca FRIGIDAIRE.
Leche
Se trabajó con leche completa
pasteurizada de marca comercial, producida por
Lácteos Los Andes, C. A. (Venezuela).
Muestras de 250 mL de esta leche fueron
sometidas a esterilización húmeda a 121 ºC, 15
psi, en autoclave Market Forge, Sterilmatic
(Market Forge Industries, Inc., USA); para
garantizar una población bacteriana definida
durante la ejecución de los experimentos.
Procedimientos
Estandarización de la concentración
de glucosa oxidasa (GOX) y glucosa que
afectan el crecimiento de la cepa E. coli
ATCC 25922 en medio Luria-Bertani (LB)
El primer experimento consistió en
estandarizar la concentración de enzima GOX y
de glucosa, capaces de ejercer el mayor retraso
en el crecimiento de la cepa E. coli ATCC
25922. Para ello, se hizo crecer el mencionado
microorganismo en medio LB con adición de
diferentes concentraciones de la enzima y de su
sustrato, siguiendo un procedimiento similar al
realizado por Tiina y Sandholm (1989), Yoo y
Rand (1995) y Massa et al. (2001). Se escogió
el medio LB como medio de referencia para el
crecimiento de la bacteria, puesto que estudios
previos han demostrado que es óptimo para el
crecimiento de muchas especies bacterianas,
entre ellas E. coli (Sezonov et al., 2007); por lo
que la incorporación de algún aditivo que afecte
negativamente su crecimiento resultaría
evidente. La enzima GOX se usó en
concentraciones de 0,5; 1 y 2 U/mL similares a
las utilizadas por Yoo y Rand (1995) y Massa
et al. (2001). Las unidades de actividad
enzimática del extracto se determinaron por el
método colorimétrico descrito por Trinder
(1969), con la sustitución de la o-dianisidina
por 3,3‟,5,5‟-tetrametilbenzidina (TMB), tal
como lo describió Ojeda et al. (2011). En el
caso de la glucosa a razón de 0,5; 1,0 y 2,0 %;
tomando como referencia los valores a los
cuales Yoo y Rand (1995) y Massa et al. (2001)
encontraron la mejor respuesta de inhibición o
retardo del crecimiento, correspondientes a 8,0
y 16,0 mg/mL (equivalentes a 0,8 y 1,6 %) para
P. fragi y 4,0 mg/mL (equivalente a 0,4 %) para
E. coli, respectivamente. Sobre esta base, se
diseñaron 9 tratamientos (Cuadro 1) y fueron
comparados con un control (bacteria inoculada
en medio LB estándar sin aditivos).
Para el desarrollo del ensayo se usaron
10 fiolas de 125 mL de capacidad, con 25 mL
de medio correspondientes a los tratamientos y
control, las cuales fueron inoculados con 400
µL de un pre-inóculo equivalente a una carga
promedio de 4,5x10 4 UFC/mL ± 0,5x10 4
UFC/mL. Se incubaron a 37 ºC bajo agitación
continua a 200 rpm durante 300 min, en un
incubador New Brunswick Scientific,
Controlled Environment Incubator Shaker
(New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison,
New Jersey, USA). El crecimiento fue
monitoreado por el cambio de turbidez a 600
nm, en un espectrofotómetro BECKMAN,
modelo DU® 650 (Beckman Instruments, Inc.
Fullerton, CA, USA), mediante la toma de
muestras de 1 mL a intervalos de tiempo de 60
min y transformados a UFC/mL. El ensayo se
repitió 3 veces, bajo un arreglo completamente
al azar.
Efecto del sistema glucosa
oxidasa/glucosa (GOX/G) sobre el
crecimiento de la cepa E. coli ATCC 25922
en leche
El segundo experimento se diseñó para
evaluar el efecto que el sistema GOX/G tuvo
sobre una población definida de la cepa E. coli
ATCC 25922 crecida en leche, antes y después

062
Cuadro 1.- Tratamientos formulados para la estandarización de las concentraciones de glucosa
oxidasa (GOX) y glucosa capaces de incidir sobre el crecimiento de la cepa E. coli
ATCC 25922 en medio Luria-Bertani (LB).
Tratamientos
Volumen de solución enzimática y cantidad
de glucosa adicionada a 25 mL de medio LB
1. GOX 0,5 U/glucosa 0,5 % 12,5 µL de enzima y 0,125 g de glucosa
2. GOX 0,5 U/glucosa 1,0 % 12,5 µL de enzima y 0,25 g de glucosa
3. GOX 0,5 U/glucosa 2,0 % 12,5 µL de enzima y 0,50 g de glucosa
4. GOX 1 U/glucosa 0,5 % 25 µL de enzima y 0,125 g de glucosa
5. GOX 1 U/glucosa 1,0 % 25 µL de enzima y 0,25 g de glucosa
6. GOX 1 U/glucosa 2,0 % 25 µL de enzima y 0,50 g de glucosa
7. GOX 2 U/glucosa 0,5 % 50 µL de enzima y 0,125 g de glucosa
8. GOX 2 U/glucosa 1,0 % 50 µL de enzima y 0,25 g de glucosa
9. GOX 2 U/glucosa 2,0 % 50 µL de enzima y 0,50 g de glucosa
de ser sometido a un proceso térmico típico
usado en la industria láctea. Para establecer las
condiciones de pasteurización, se tomaron en
consideración los hallazgos obtenidos por
Noguera et al. (2013), quienes encontraron que
la menor pérdida de actividad ocurría en el
proceso con la menor temperatura y el mayor
tiempo, específicamente a 63 ºC por 30 min,
también conocida como pasteurización lenta
(LTLT, „low temperatura long time‟).
El primer paso fue someter la leche
pasteurizada comercial a un proceso de
esterilización en autoclave Market Forge,
Sterilmatic (Market Forge Industries, Inc.,
USA) a 121 ºC, 15 psi, previo a su uso, a fin de
garantizar que los resultados correspondieran a
la población y especie bacteriana en estudio. La
enzima fue pasteurizada en un incubador de
bloque seco (Dry-block Thermostat, Cat. #
SLTDB-120) de Seoulin Bioscience (Seoulin
Bioscience Co., Ltd., Corea del Sur) a 63 ºC por
30 min. Las unidades de muestra se
constituyeron en fiolas con 25 mL de leche
estéril. Se establecieron 2 tratamientos: 1)
L/GOX/G, constituido de leche inoculada con
la bacteria, GOX y glucosa como aditivos; 2)
L/GOXp/G, constituido de leche inoculada con
la bacteria, GOX pasteurizada y glucosa como
aditivos. Los controles del ensayo fueron:
Control I, leche inoculada con la bacteria;
Control II, leche inoculada y glucosa como
aditivo.
Para la inoculación, similar a lo
explicado en el ensayo anterior, se realizó un
pre-inóculo de la bacteria en medio LB durante
24 h y a partir de este se tomaron volúmenes de
400 ± 50 µL para incorporarlos en las unidades
de muestra. La incubación se hizo a 37 ºC bajo
agitación continua a 200 rpm durante 24 h, en
incubador New Brunswick Scientific,
Controlled Environment Incubator Shaker
(New Brunswick Scientific Co., Inc., USA). El
crecimiento fue monitoreado por la técnica de
contaje de colonia en placa-agar. Para ello, se
tomaron muestras de 1 mL a las 4, 6 y 24 h de
incubación, las cuales fueron diluidas de
manera seriada e inoculadas en placas de agar
medio LB y colocadas en estufa Labnet, modelo

Noguera, Nirza et al. 063
211DS (Labnet International, Inc., Edison, NJ,
USA) a 37 ºC durante 24 h, para luego realizar
el contaje de las colonias. También se midió el
pH de las muestras en un pHmetro dual de IQ
Scientific Instruments, Inc. (Carlsbad, CA,
USA), con el fin de determinar la acidificación
del alimento. Este ensayo se hizo bajo un
diseño completamente al azar con 4
repeticiones.
Los resultados se expresaron en función
de un índice de crecimiento calculado como la
expresión matemática que cuantifica el número
de veces que E. coli fue capaz de multiplicarse
en el tiempo, con respecto a su población
inicial. Para determinarlo se dividió el número
de colonias cuantificadas para un tiempo
determinado (4, 6 y 24 h) entre el número de
colonias cuantificadas para el tiempo cero. Este
índice se utilizó con la finalidad de
homogeneizar los resultados de las repeticiones
realizadas del ensayo y poder analizar con
mayor objetividad y exactitud el
comportamiento observado.
Análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos se
hizo con el programa Microsoft® Office Excel,
versión 2007 (Microsoft® Corporation,
Redmond, WA, USA) para calcular medias,
desviaciones estándares, índices de crecimiento,
construir curvas de crecimiento y realizar el
análisis de varianza.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Concentraciones de glucosa oxidasa (GOX) y
glucosa capaces de retardar el crecimiento
de la cepa en estudio
Las células de E. coli ATCC 25922
inoculadas en medio LB con adición del
sistema GOX/G, exhibieron crecimientos y
poblaciones finales distintas dependiendo de la
concentración de enzima y glucosa incorporadas.
En la Fig. 1, se puede observar que la adición
de 0,5 y 1 U de enzima por mL de medio, en la
mayoría de los casos, no afectó el crecimiento
de la bacteria, alcanzando un número de células
totales similares o superiores a las crecidas en
el medio control (LB sin aditivos), entre 1,5 y
1,7x10 6 UFC/mL. Solamente la combinación de
1 U y 2,0 % de glucosa, ocasionó un
crecimiento ligeramente inferior al control
(1,4x10 6 UFC/mL). Cuando se aumentó la
concentración de la enzima a 2 U/mL, el
crecimiento resultó significativamente menor al
control (p < 0,05), disminuyendo el número
total de células a medida que se adicionó mayor
cantidad de glucosa (1,2x10 6 a 9,2x10 5 y
7,4x10 5 UFC/mL, respectivamente).
Estos resultados tienen cierta similitud
con las curvas de crecimiento publicadas por
Massa et al. (2001), para la cepa E. coli
expuesta a combinaciones de 0,5 y 1 U/mL de
GOX con 1,0 y 2,0 mg/mL de glucosa, durante
las primeras 12 h de cultivo. En esas curvas no
se observaron diferencias entre el valor en log
UFC/mL alcanzado por el control y el de los
tratamientos; solo el incremento de la
concentración de glucosa a 4,0 mg/mL, generó
un retardo sobre el crecimiento hasta lograr la
completa inhibición a las 48 h.
Por otra parte, como la GOX cumple
con una cinética tipo Michaelis-Menten
(Bankar et al., 2009), existe una dependencia
entre la velocidad de reacción y la
concentración de sustrato cuando la enzima no
está saturada, comportándose como una
reacción de primer orden. Esto explica los
resultados observados al combinar 2 U/mL de
GOX con diferentes cantidades de glucosa, a
medida que se incrementó la concentración del
sustrato fue mayor el retardo en el crecimiento
de la cepa en estudio. La velocidad de
formación de los productos generados por la
oxidación de la glucosa con actividad
antimicrobiana, tales como el ácido glucónico y
el peróxido de hidrógeno (Fresl et al., 1984;
Field et al., 1986; Massa et al., 2001), aumentó

064
2,0
Número de células (UFC/mL) x10 6
1,6
1,2
0,8
0,4
0,0
0 60 120 180 240 300
GOX 0,5 U/glucosa 0,5 %
GOX 0,5 U/glucosa 1,0 %
GOX 0,5 U/glucosa 2,0 %
GOX 1 U/glucosa 0,5 %
GOX 1 U/glucosa 1,0 %
GOX 1 U/glucosa 2,0 %
GOX 2 U/glucosa 0,5 %
GOX 2 U/glucosa 1,0 %
GOX 2 U/glucosa 2,0 %
Control
Tiempo (min)
n = 30.
Los puntos de coordenadas representan el valor promedio de 3 repeticiones.
Figura 1.- Curvas de crecimiento de la cepa de E. coli ATCC 25922 en medio Luria-Bertani, en
presencia de glucosa oxidasa (GOX) y glucosa en diferentes concentraciones.
a medida que se adicionó mayor cantidad de
glucosa. Esto también demostró que, aun
cuando se establecieron concentraciones
superiores a las informadas por otros autores
(Tiina y Sandholm, 1989; Yoo y Rand, 1995;
Massa et al., 2001), ninguna alcanzó la
saturación de la enzima. Estudios como el
conducido por Zoghbi et al. (2008),
determinaron que la velocidad máxima de una
GOX producida a partir de una cepa de A.
niger, fue de 150 mM equivalente a una
concentración de 27 mg/mL o 2,7 % de
glucosa.
A partir de estos resultados se decidió
utilizar la combinación de 2 U de GOX y 2,0 %
de glucosa para agregarlos como aditivos en la
leche.
Efecto del sistema glucosa oxidasa/glucosa
(GOX/G) sobre el crecimiento de la cepa E.
coli ATCC 25922 en leche
Al comparar los índices de crecimiento
de la bacteria en presencia de los sistemas
ensayados versus los controles, se evidenció el
efecto negativo que tiene el sistema GOX/G
para la proliferación de la población bacteriana,
durante las primeras 6 horas de cultivo,
independientemente del tratamiento térmico
(Fig. 2). A las 4 horas se observó una pequeña
diferencia en el crecimiento de las muestras que
contenían los sistemas enzimáticos con respecto
a los controles. Esta diferencia que se hizo
significativa a las 6 horas (p < 0,05), tiempo en
que el índice de crecimiento de las muestras
con el sistema GOX/G sin pasteurizar y

Noguera, Nirza et al. 065
Índice de crecimiento
35
30
25
20
15
10
5
Control I
Control II
L/GOX/G
L/GOXp/G
0
4 6 24
Tiempo (h)
n = 16.
Los valores son el promedio de 4 repeticiones.
■Control I: leche inoculada con la bacteria.
■Control II: leche inoculada y glucosa como aditivo.
■L/GOX/G: leche inoculada con la bacteria, GOX y glucosa como aditivos.
■L/GOXp/G: leche inoculada con la bacteria, GOX pasteurizada y glucosa como aditivos.
Figura 2.- Índices de crecimiento de E. coli ATCC 25922 en leche.
pasteurizado, alcanzaron valores promedios
alrededor de 2, mientras que los índices de los
controles superaron las 5 unidades. Este efecto
no se prolongó para las 24 h, los índices
resultaron superiores a 15 unidades y no hubo
diferencias estadísticamente significativas (p >
0,05) entre los tratamientos. Sin embargo, se
observó que el índice promedio de las células
crecidas en el sistema con la GOX pasteurizada
resultó menor que el de las crecidas con la
enzima sin pasteurizar, aunque esta diferencia
no fue significativa (p > 0,05), debido a la
variabilidad de los datos para este tiempo.
En lo que respecta al pH, se observó que
las muestras a las cuales se les incorporó el
sistema GOX/G mantuvieron valores por
encima de 6 durante las primeras 6 h, mientras
que en los controles se encontraron pH menores
a 6, más bajos que el pH inicial. Para las 24 h,
todas las muestras exhibieron pH bajos
inferiores a 5, demostrando la acidificación de
la leche (Cuadro 2). En general, la reducción
del pH en todas las muestras se asoció con el
crecimiento celular, a medida que se
incrementó la actividad metabólica de las
células bacterianas la leche se fue acidificando.
Por ello, en el caso de los controles, donde el
índice de crecimiento fue mayor durante las
primeras 6 h, la reducción del pH fue más
evidente.

066
Cuadro 2.- Variación del pH de las muestras de leche inoculadas con la bacteria E. coli ATCC 25922,
con y sin adición del sistema GOX/G.
Tratamiento
Tiempo
pH
0 h 4 h 6 h 24 h
Control I 6,53 ± 0,12 5,87 ± 0,13 5,16 ± 0,11 4,27 ± 0,15
Control II 6,55 ± 0,13 5,63 ± 0,15 5,13 ± 0,09 4,22 ± 0,18
L/GOX/G 6,48 ± 0,16 6,40 ± 0,12 6,19 ± 0,15 4,78 ± 0,17
L/GOXp/G 6,58 ± 0,10 6,48 ± 0,15 6,25 ± 0,12 4,86 ± 0,16
Control I: leche inoculada con la bacteria.
Control II: leche inoculada y glucosa como aditivo.
L/GOX/G: leche inoculada con la bacteria, GOX y glucosa como aditivos.
L/GOXp/G: leche inoculada con la bacteria, GOX pasteurizada y glucosa como aditivos.
En función de estos resultados, se
presume que el retardo en el crecimiento de la
cepa E. coli ATCC 25922 en leche con el
sistema GOX/G y GOXp/G, durante las
primeras horas, fue ocasionado por la acción
del peróxido de hidrógeno producido por el
sistema y no por el ácido glucónico, a
diferencia de lo descrito por Massa et al.
(2001). Las razones de esta discrepancia
radican en que, en primer lugar, el tiempo de
incubación fue menor al descrito por los
autores, con mediciones a las 0, 4, 6 y 24 h. En
segundo lugar, el pH de las muestras de leche
se mantuvo entre ≈ 6,5 y ≈ 6,2 durante las
primeras 6 h, por lo que no hubo un descenso
importante que se pudiera asociar a una alta
producción de ácido capaz de afectar el
crecimiento celular.
En cuanto a la diferencia observada a las
24 h, entre los índices promedios de
crecimiento de las bacterias en presencia de
GOX pasteurizada y GOX sin tratamiento
térmico, se consideró pudo estar asociada a la
presencia de trazas de la enzima catalasa (CAT)
en el extracto de GOX, tal como lo indica el
fabricante. La catalasa (EC 1.11.1.6) es una
hemoproteína que cataliza la descomposición
del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno
(NC-IUBMB, 2013). Cuando GOX actúa en
presencia de CAT, el peróxido de hidrógeno
producido es descompuesto, lo que disminuye
el efecto antimicrobiano tal como lo
demostraron (Massa et al., 2001). La enzima
GOX es termorresistente y mantiene buenos
niveles de actividad catalítica y antimicrobiana,
después de una pasteurización a 63 ºC por 30
min (Noguera et al., 2013). A diferencia, se ha
documentado que la enzima CAT, pierde un
alto porcentaje de su poder catalítico al ser
expuesta a una temperatura de 60 ºC,
exhibiendo una actividad remanente de 20 % tal
como lo demostraron Castro-Rivero et al.
(2006), en un extracto enzimático aislado de
una fuente vegetal (Acanthocereus pitajaya).
En consecuencia, se presume que el tratamiento
térmico pudo eliminar la actividad de las trazas
de CAT, lo que permitió prolongar el efecto del
peróxido producido por el sistema GOX
pasteurizada/glucosa por mayor tiempo. Sin
embargo, no se puede precisar este lapso de
tiempo, ya que no se hicieron mediciones
intermedias entre los tiempos de 6 y las 24 h.
Adicionalmente, la alta variabilidad de
los datos tampoco permitió establecer de
manera concluyente si la enzima pasteurizada
fue capaz de retrasar por mayor tiempo el
crecimiento celular.

Noguera, Nirza et al. 067
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
El sistema glucosa oxidasa/glucosa
(GOX/G) incorporado en leche a razón de 2
U/mL de la enzima y 2,0 % de glucosa,
ocasionó un retraso en el crecimiento de la cepa
E. coli ATCC 25922 durante las primeras horas
de incubación, más no ocasionó su total
inhibición. Este resultado proyecta a la enzima
glucosa oxidasa (GOX) como un aditivo natural
que pudiese mantener la calidad microbiológica
de la leche, durante las primeras horas
postproceso de pasteurización.
También podría utilizarse como aditivo
natural en leche cruda y potenciar la acción del
sistema lactoperoxidasa. La incorporación de
GOX y glucosa en la leche cruda favorecería la
producción del peróxido de hidrógeno, el cual
cumpliría una doble función, primero como
agente antimicrobiano per se y en segundo
lugar, serviría como sustrato para el sistema
lactoperoxidasa y formar así el ácido
hipotiocianoso, el cual a su vez también tienen
efecto antimicrobiano. Esto le brindaría una
mayor protección a la leche cruda durante
etapas como la de transporte desde las fincas
productoras y las fábricas, o en ocasiones
cuando las condiciones de refrigeración no
estén garantizadas para el almacenamiento,
previo al procesamiento. Futuras
investigaciones pueden enfocarse en evaluar
este potencial sobre bacterias nativas de la leche
y cepas asociadas a enfermedades de
transmisión alimentaria.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue desarrollado gracias al
financiamiento del Consejo de Desarrollo
Científico y Humanístico de la Universidad de
Carabobo (CDCH-UC). Los hallazgos aquí
descritos son parte de los resultados del
proyecto 2011-003 aprobado y financiado por
este organismo.
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