Enzymes de restriction - Promega

• Evitez d'introduire des nucléases qui sont
susceptibles de dégrader les bouts collants
T de votre vecteur. Utilisez de l'eau
stérile, dépourvue de nucléases, dans
vos réactions de ligation.
• Utilisez une ADN polymérase qui ne soit
pas de haute fidélité uniquement durant
la PCR afin de garantir la présence d'une
extrémité cohésive A sur votre fragment
de PCR.
• Si vous utilisez une ADN polymérase de
haute fidélité, ajoutez une extrémité
cohésive. Purifiez le fragment de PCR et
préparez une réaction d’adénylation (voir
"Clonage des produits de PCR ou A tailing
à bouts francs" dans le manuel technique
des vecteurs pGEM®-T).
• Optimisez le rapport insert/vecteur. La
ligature de l'insert d'ADN témoin peut
s'effectuer avec un rapport 1/1, alors
qu'un autre insert peut s’insérer plus
efficacement avec un rapport 3/1.
• Utilisez des cellules dont le rendement
de transformation est d'au moins 1 ×
10 8 cfu/μg d'ADN afin d'obtenir un
nombre suffisant de colonies, car la ligation
de fragments dont les extrémités
cohésives ne comprennent qu'une seule
base peut s'avérer inefficace.
• Eviter d'exposer les produits de PCR à un
rayonnement UV de courte longueur
d'onde, lequel génère des dimères de
pyrimidines. Placez une plaque en verre
entre le gel et la source d'UV. Idéalement,
le produit de PCR sera observé sous une
lumière UV de grande longueur d'onde.
• Purifiez le fragment de PCR sur gel
de façon à minimiser les inserts
concurrents et éliminer les inhibiteurs
éventuels de la réaction de ligation.
• Evitez les températures élevées (>28°C)
durant la ligation, et laissez la réaction
se dérouler pendant la nuit de manière
à améliorer le rendement de la transformation.
Pour plus d’aide, consultez le guide
de résolution des problèmes techniques
pGEM-T et pGEM-T easy.
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