Les techniques de purification des immunoglobulines

Deuxième Partie:
LES TECHNIQUES DE PURIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES
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INTRODUCTION
La purification et la caractérisation sont un préalable à l’étude de toute molécule biologique et les
anticorps ne font pas exception à cette règle. La première étape dans la caractérisation d’un anticorps est son
isolement de la molécule à l’état pure. En plus, en fonction de l'usage prévu, on emploiera des préparations
plus ou moins purifiées d'anticorps. D'où, la connaissance de la destinée (l’usage) finale de l’anticorps
étudiée est importante avant sa purification à partir de n’importe quel milieu. Dans certaines applications
(par exemple la saturation des antigènes de surface cellulaire, les essais de cytométrie de flux indirects, la
plupart des ELISA, les études de cytotoxicité et de séroneutralisation, etc.) et surtout quand la concentration
n’est pas importante, les anticorps peuvent être utilisés sous la forme non purifiée (les anticorps
monoclonaux sous forme de liquide d’ascites ou de surnageant de milieux de culture et les anticorps
polyclonaux sous forme d’antisérum). D'autres applications nécessiteront, au contraire, des anticorps
hautement purifiés. C'est le cas par exemple lorsqu’on a besoin d’une concentration précise ou lorsque des
modifications chimiques (tels que les marquages) ou des modifications structurales (telle que la production
de F(ab’)2 ou de Fab) sont nécessaires. Cependant, la plupart des applications auront des exigences entre ces
deux extrêmes.
Les immunoglobulines sont très hétérogènes; elles ont néanmoins en commun un certain nombre de
caractéristiques structurales et physico-chimiques et de propriétés fonctionnelles qui permettent leur
purification et leur individualisation. Ainsi, de nombreuses méthodes ont été utilisées pour purifier des
anticorps spécifiques d'un antigène ou bien pour séparer des immunoglobulines à partir d'un mélange
protéique complexe. Le choix de la méthode se fera en fonction du contexte expérimental ainsi que du degré
de pureté exigée. Dans certains cas il faudra associer deux voire trois techniques. La technique de
purification des anticorps la plus souvent employée est la chromatographie d'affinité. Mais, avant, on peut
procéder à une séparation brute des immunoglobulines des autres protéines sériques (albumine, transferrine,
etc.) par précipitation différentielle au sulfate d'ammonium. Une chromatographie d'échange ionique est
aussi possible, quoique moins employée. La précipitation au sulfate d’ammonium couplée à une
chromatographie d’exclusion moléculaire est la méthode de purification des protéines de différents types et
pourrait être la procédure de choix et la moins chère pour purifier certains anticorps. Suivie d’une
chromatographie échangeuse d’ions, cette technique peut être appliquée à la purification de n’importe quel
type d’anticorps. La chromatographie échangeuse d’ions peut aussi être utilisée pour purifier les anticorps
(monoclonaux ou polyclonaux) intacts et leurs fragments (Fab, Fc, F(ab’)2). De plus en plus, on procède par
chromatographie d'affinité avec la protéine A ou la protéine G comme ligand pour Fc. Ce sont des protéines
de source bactérienne ayant la capacité de se fixer sur la région Fc des anticorps. C'est une méthode de
purification rapide, mais elle n’est pas efficace pour toutes les sous-classes d’anticorps (essentiellement
celles de rat). La chromatographie d’affinité utilisant un immuno-adsorbant spécifique peut dans ce cas être
une alternative. L’utilisation de la chromatographie échangeuse d’ions en plus de la précipitation au sulfate
d’ammonium et de la chromatographie d’affinité permet d’obtenir un produit possédant un degré de pureté
élevé. Cependant, la technique de chromatographie d’affinité est plus efficace et moins fastidieuse. Une
protéine récemment découverte, la protéine L, se lie aux chaînes k de certaines classes d'anticorps.
Ensuite, pour purifier l'anticorps spécifique, on peut procéder à une chromatographie d'affinité avec
l'antigène comme ligand. Seul l'anticorps contre cette protéine devrait s'attacher sur la colonne, toutes les
autres protéines (et les anticorps) du sérum étant lavées dans l'éluat. On peut aussi utiliser des "peptides
artificiels" ressemblant à certains épitopes particulièrement antigéniques de l'antigène (ligands
peptidomimétiques). On élue ensuite l'anticorps qui est pratiquement pur. Les colonnes de chromatographie
classiques sont aussi en voie d'être remplacées par des billes magnétisées de résine sur lesquelles est lié le
ligand choisi. Le gros avantage de cette approche est la rapidité de séparation. Plutôt que de laisser percoler
divers tampons à travers une colonne, on peut facilement récupérer les billes magnétisées (et ce qui est lié
dessus) avec un aimant.
Le principe, le protocole générale, les avantages et les inconvénients de certaines de ces techniques
seront traités ci-dessous.
Chapitre A: LES TECHNIQUES DE PURIFICATION DES IgG
I- LES TECHNIQUES DE PRECIPITATION SELECTIVE
La précipitation sélective (relargage) est souvent utilisée pour purifier partiellement ou totalement
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une substance. Un ion peut ainsi être précipité sous forme de sel insoluble. Pour les protéines, la précipitation
constitue souvent une méthode analytique, mais elle est parfois utilisée dans un but préparatif. La
précipitation sélective des protéines comme une première étape d’une purification est obtenue par addition
de solvants organiques (notamment l'éthanol selon les méthodes de Cohn), des sels neutres (notamment le
sulfate d'ammonium ou de sodium), des acides gras à chaînes courtes (tel que l'acide caprylique), etc. Ces
techniques peuvent être utilisées pour séparer les immunoglobulines des autres constituants du plasma. Selon
la technique utilisée, les immunoglobulines peuvent se trouver soit dans le précipitât soit dans le surnageant.
I.1- Relargage par des sels: précipitation au sulfate d'ammonium
a- Principe de base
Des concentrations élevées, proches de la saturation, de sels neutres (notamment le sulfate
d'ammonium ou de sodium) déshydratent les groupements hydrophiles des protéines qui deviennent
insolubles et précipitent. Chaque protéine précipite dans un intervalle de concentration en sels. Ainsi, par
gradient de concentration, on peut sélectivement précipiter certaines protéines. Ce type de précipitation est
souvent utilisé pour la purification de certaines protéines, car il est réversible et les protéines insolubilisées à
une certaine concentration en sels peuvent être resolubilisées avec une solution dont la concentration est plus
faible. En se basant sur ce principe, la précipitation au sulfate d'ammonium a été l'une des méthodes les plus
anciennes et les plus utiles pour purifier les immunoglobulines. Ces dernières précipitent normalement à des
concentrations de sulfate d'ammonium relativement faibles en comparaison à la majorité des autres protéines
plasmatiques.
b- Procédure générale
A l’échantillon étudié (sérum, liquide d’ascite, surnageant de culture cellulaire, etc.) on ajoute la
quantité nécessaire (correctement calculée) de sulfate d’ammonium qui permet une précipitation sélective
des immunoglobulines. L'utilisation du sulfate d'ammonium sous forme d'une solution saturée est préférable
à son utilisation sous forme de cristaux. La solution saturée de sulfate d'ammonium (à 100 %) est définie par
la dissolution (sous agitation magnétique pendant 1 - 2 jours) des cristaux de sulfate d'ammonium dans l’eau
distillée jusqu’à saturation c’est-à-dire jusqu’à ce que des cristaux du sel restent dans la solution sans pouvoir
s’y dissoudre même sous chauffage. La présence au fond du bêcher de gros cristaux de sulfate qu'on n'arrive
pas à solubiliser est le témoin de la saturation de la solution. La solution ainsi préparée pourrait être gardée
4°C, mais avant elle doit être agitée avant son utilisation et son pH ajusté à 7 avec de l’ammoniaque.
Cette technique est simple à réaliser, mais il y a un grand nombre de points techniques que s’ils ne
sont pas respectés pourraient influencer grandement le degré de pureté obtenue. En effet, il est préférable de
travailler à 4°C, car la réaction est exergonique et le pourcentage de saturation change légèrement avec la
température (bien que la majorité des immunoglobulines ait été fractionnée à la température du laboratoire
sans beaucoup d'effets indésirables). La solution saturée de sulfate d'ammonium doit être ajoutée lentement,
goutte à goutte en laissant le temps à chaque goutte de se disperser totalement avant l'addition d'une
nouvelle. Ceci permet d'éviter les fortes concentrations locales de sulfate d'ammonium (autour du lieu du
dépôt) qui provoquent la précipitation indésirable (non spécifiques) d'autres protéines plasmatiques qui
abaisse le degré de pureté. L'agitation doit être douce car le frottement peut dénaturer certaines protéines.
Le procédé habituel de précipitation des immunoglobulines se déroule comme suit: le sérum à
fractionner est dilué au 1/10 puis placé sur un agitateur magnétique. La solution saturée de sulfate
d'ammonium est ajoutée goutte à goutte, sous agitation magnétique douce, en laissant le temps à chaque
goutte de se disperser totalement avant l'addition d'une nouvelle. La concentration de sulfate d'ammonium
nécessaire à la précipitation sélective des immunoglobulines est habituellement exprimée en pourcentage de
saturation. Celui-ci est obtenu en divisant 100 (la saturation) par le facteur de dilution de la solution saturée
de sulfate d'ammonium dans le mélange sérum plus solution saturée de sulfate d'ammonium. Quand la
concentration de sulfate d'ammonium atteint 20 % (v/v) de saturation, l'aspect du sérum devient laiteux. Pour
obtenir une fraction d'IgG pure à plus de 98 %, on travaille à 33 % (v/v) de saturation en sulfate
d'ammonium, mais pour précipiter la totalité des immunoglobulines il est préférable d'utiliser une
concentration de 40 % (v/v) de saturation (la plupart des immunoglobulines précipitent entre 35 et 40 % de
saturation). Dans ce cas, elles seront contaminées par d'autres protéines sériques essentiellement par les α et
β globulines, l'albumine et la transferrine. Des saturations plus élevées n'augmentent pas le rendement de la
technique; au contraire elles augmentent la contamination. On ajuste si nécessaire le pH du mélange, puis on
incube 2 à 4 h à 4°C. Le précipité est ensuite récupéré par centrifugation (2000-10000 x g) puis lavé deux à
trois fois avec une solution de sulfate d'ammonium au même pourcentage de saturation, afin d'éliminer les
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protéines contaminatrices non précipitées. Afin d'éliminer les ions ammonium et sulfate, le précipité obtenu
est redissout dans de l'eau distillée puis dialyser contre le tampon de conservation définitif de
l'immunoglobuline purifiée (PBS, tampon borate, solution de NaCl 0,15 M, etc.). La dialyse est effectuée à
4°C et sous agitation douce contre un volume de tampon largement supérieur à celui de la solution
d'immunoglobuline. Le liquide de dialyse doit être changé plusieurs fois durant la dialyse. Après étude de sa
qualité (pureté, activité, spécificité, etc.), l’anticorps ainsi purifié peut être concentré (0,1 à 30 mg/ml) dans
un tampon PBS ou borate contenant 0,02 % d’azide de sodium (m/v), ce qui permet sa bonne conservation à
4°C ou congelé.
c- Interprétations et commentaires
Le sulfate d’ammonium est le plus couramment utilisé, mais d'autres sels comme le sulfate de
sodium peuvent aussi servir pour cet usage. La précipitation au sulfate d'ammonium permet la purification de
toutes les sous-classes d’anticorps de souris ainsi que les IgM, IgG et IgA de toutes les espèces. C’est une
méthode simple, moins onéreuse, exigeant un équipement minimum et permettant de traiter des volumes
importants de sérum. Cependant, son rendement est faible et les immunoglobulines précipitées sont souvent
contaminées par d'autres protéines du sérum et une partie d'entre elles dénaturée. Dans ce cas, le passage de
la solution d’immunoglobulines (dialysée et concentrée) sur une colonne de chromatographie d’exclusion
moléculaire (gel filtration) permet d'améliorer la pureté. Des anticorps purifiés par précipitation au sulfate
d’ammonium suivie d’une chromatographie d’exclusion moléculaire auront une pureté suffisante pour
n’importe quelle manipulation (fragmentation, ELISA, couplage à un marqueur fluorescent ou à la biotine,
etc.).
I.2- Précipitation à l'aide de l'acide caprylique
a- Principe de base
En milieu légèrement acide l'addition d'acides gras à chaînes courtes, tel que l'acide caprylique,
provoque la précipitation de la plupart des protéines contenues dans le sérum à l'exception des IgG qui
restent dans le surnageant.
b- Procédure générale
- Mesurer le volume du sérum, d'ascite ou de surnageant de culture (volume initial) à traiter.
- Transférer dans un bêcher (ou dans un autre récipient) et placer le sur un agitateur magnétique
- Ajouter, sous agitation magnétique douce, deux volumes d'une solution d'acétate de sodium 60 mM (pH 4).
- Mesurer le pH et l'ajuster à 4,8 si nécessaire.
- Ajouter lentement (goutte à goutte) et sous agitation magnétique adéquate l'acide caprylique (acide
octanoïque) dans les rapports suivants: 0,7 ml d'acide caprylique pour 10 ml de volume initial dans le cas
d'un sérum humain ou de mouton; 0,75 ml pour 10 ml de volume initial dans le cas d'un sérum de lapin et 0,4
ml pour 10 ml de volume initial dans le cas d'un sérum de souris.
- Agiter pendant 30 mn à la température ambiante.
- Centrifuger à 5000 x g pendant 10 mn et récupérer soigneusement le surnageant.
- Transférer le surnageant dans un boyau de dialyse et dialyser contre le tampon PBS sous agitation et en
changeant fréquemment le tampon de dialyse.
c- Interprétations et commentaires
La combinaison de cette technique avec d'autres méthodes de purification, par exemple l'utilisation
d'une colonne échangeuse d’ions (colonne de DEAE), permet d'obtenir une solution d'anticorps relativement
pure. Si besoin est, on peut améliorer la purification et concentrer l'anticorps par précipitation au sulfate
d'ammonium.
I.3- Précipitation à faible force ionique
a- Principe de base
Certains anticorps monoclonaux sont insolubles à faible force ionique, alors que d'autres ne le sont
pas. Les euglobulines (constituées majoritairement par des IgM et certaines IgG) précipitent lorsque la force
ionique du milieu est très faible. L'IgM et la fraction C1q du complément peuvent être isolées par cette
méthode.
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