Les techniques de fragmentation des immunoglobulines

Troisième Partie:
LES TECHNIQUES DE FRAGMENTATION DES IMMUNOGLOBULINES
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Chapitre A: PREPARATION DE FRAGMENTS D'IgG
I- INTRODUCTION
Pour étudier les caractéristiques structurales et fonctionnelles des différentes régions d’une molécule
d’immunoglobuline, il intéressant de la cliver à l’aide d’enzymes protéolytiques en plusieurs fragments.
Classiquement la digestion des IgG à la papaïne et à la pepsine génère, en plus du fragment Fc, des
fragments monovalents: les Fab est des fragments bivalents: les F(ab’)2, respectivement (Figure 2).
Cependant, si la digestion à la papaïne produit des fragments Fab à partir de toutes les sous-classes d’IgG des
différentes espèces; celle avec la pepsine n’est pas aussi universellement utile. Des méthodes alternatives de
préparation de F(ab’)2 incluent l’utilisation la papaïne pré-activée avec la cystéine et l’utilisation de l’enzyme
ficine. Ces méthodes alternatives sont particulièrement utiles pour préparer des F(ab’)2 à partir des IgG1 de
souris; surtout que les anticorps monoclonaux généralement utilisés dans des expériences in vivo ou in vitro
sont généralement d’origine murine. L’ordre de sensibilité des sous-classes d’IgG à la protéolyse
enzymatique semble être le suivant: IgG2b > IgG3 > IgG2a > IgG1. Cependant, l’IgG2a peut être extrêmement
sensible à l’action de la papaïne en présence de cystéine.
Il est important de noter que les différentes techniques présentées ci-dessous ont été réalisées avec
des IgG de souris. D’autres part les anticorps monoclonaux sont tous différents et pour cette raison les
conditions standards de leur fragmentation à la pepsine et à la papaïne ne sont pas données. Des expériences
pilotes doivent toujours être réalisées pour déterminer les conditions optimales d’une digestion à une plus
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grande échelle des IgG monoclonaux de souris et pour adapter ces techniques aux IgG des autres espèces. Il
est probablement plus prudent de choisir un temps de digestion qui pourrait laisser une petite quantité d’IgG
non digérée que de courir le risque de provoquer la dénaturation (l’altération) des sites de fixation des
anticorps par une exposition excessive aux enzymes protéolytiques. Les anticorps non digérés peuvent être
facilement séparés des fragments par passage à travers une colonne de protéine A-Sepharose. La protéine G-
Sepharose et la chromatographie échangeuse d’ions peuvent être une alternative pour les anticorps qui ne se
fixent pas bien à la protéine A. La séparation des fragments d’anticorps peut être réalisée de façon efficace
par une chromatographie d’échange ionique sur DE52. D’autres méthodes de séparation seront décrites dans
les protocoles de fragmentation.
II- LA FRAGMENTATION D’IgG EN Fab EN UTILISANT LA PAPAINE
La préparation des fragments Fab (monovalents) se fait par une protéolyse de la molécule d’IgG à
l'aide de la papaïne en présence de l’agent réducteur: la cystéine. Les sous-classes d’IgG (par exemple IgG1
et IgG2) ont des sensibilités différentes à l’action de la papaïne. La technique de préparation de grandes
quantités de fragments Fab nécessite une mise au point préalable à l’échelle pilote.
II.1- La fragmentation d’IgG en Fab à une échelle pilote à l’aide de la papaïne
Ce protocole se propose de déterminer les conditions optimales pour préparer des fragments Fab à
grande échelle à partir des IgG humaines et de plusieurs espèces (souris, rat, cobaye, poule, chèvre, mouton,
cheval et vache). Ainsi, les effets de la variation de la concentration de la papaïne et du temps d’incubation
sur le rendement de la digestion ont été étudiés. Une fois la digestion terminée, les fragments Fab obtenus
sont dialysés et analysés à l’aide d’une SDS-PAGE. Les résultats de l’électrophorèse permettent de
déterminer les conditions optimales à retenir. Une fois la méthode est mise au point avec l’IgG d’une espèce
donnée, elle peut être appliquée avec succès avec les IgG des autres espèces. Le protocole peut être résumé
comme suit:
- Distribuer dans une série de 24 microtubes, 100 µl d’une solution purifiée d’IgG à 2 mg/ml dans du PBS.
- A partir d’une suspension de papaïne (crystallisée), préparer deux solutions de travail (une à 0,1 mg/ml et
une autre à 0,02 mg/ml) dans 5 ml de tampon de digestion (du PBS contenant de l’EDTA 0,02 M et de la
cystéine 0,02M) fraîchement préparé et conservé dans la glace. La papaïne étant une suspension, mélanger
correctement (sans vortexer) avant de pipeter.
- Ajouter 100 µl de la solution de papaïne à 0,1 mg/ml dans 8 microtubes contenant la solution d’IgG, ce qui
représente un rapport enzyme substrat de 1/20. Ajouter aussi 100 µl de la solution de papaïne à 0,02 mg/ml
dans 8 autres microtubes contenant la solution d’IgG (soit un rapport enzyme anticorps de 1/100). Enfin,
ajouter dans les 8 microtubes restants 100 µl de tampon de digestion (sans papaïne).
- Fermer les bouchons de tous les microtubes et les mettre à incuber dans un bain-marie à 37°C.
- Préparer une courbe de digestion en fonction du temps en faisant sortir les microtubes du bain-marie à
différents temps d’incubation (1, 2, 4, 6, 12, 18, 24 et 48 h) par groupes de trois (un microtubes de chaque
série). Dès qu’on fait sortir les tubes du bain-marie, on arrête la réaction de digestion en ajoutant, 20 µl
d’iodoacétamide 0,3 M dans du PBS. Une fois vortexée, la concentration finale de l’iodoacétamide (0,03 M)
inactive de façon irréversible la papaïne.
- Dialyser et analyser les produits de digestion de chaque mélange réactionnel par SDS-PAGE à 10 % dans
des conditions non réductrices.
Si la digestion des anticorps est bien menée, on obtient une bande majeure autour de 50 kDa qui
correspond aux Fragments Fab et une seconde bande autour de 27 kDa qui correspond au fragment Fc. On
observe généralement deux autres bandes mineures autour de 24 et 15 kDa qui sont des produits de
digestions. La bande des IgG qui n’ont pas été digérées apparaît autour de 150 kDa. La digestion est
considérée complète quand on n’observe plus de bande correspondant aux IgG dans les gels. Ceci est
généralement obtenu au-delà de 4 h d’incubation enzyme anticorps. En fonction des résultats obtenus, choisir
les conditions optimales qui permettent d’obtenir le meilleur rendement en Fab à partir de la digestion des
IgG par la papaïne et utiliser ces conditions pour la fragmentation à large échelle des IgG avec cette enzyme.
II.2- La fragmentation d’IgG en Fab à grande échelle à l’aide de la papaïne
Les conditions de fragmentation à grande échelle des IgG (de différentes espèces) permettant
d’obtenir un rendement optimal en Fab sont adaptées à partir des expériences de fragmentation à l’échelle
pilote (décrites ci-dessus). Une fois la digestion est terminée et son produit est dialysé, les fragments Fab
sont purifiés par une chromatographie d’affinité en les faisant passer à travers une colonne de protéine
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A-Sepharose. On peut même pousser la purification en ajoutant une étape de chromatographie d’exclusion
moléculaire (Figure 2). La pureté finale des fragments Fab est vérifiée par SDS-PAGE. Ce protocole peut
être brièvement décrit comme suit:
- Faire dissoudre la quantité nécessaire de la papaïne dans un volume de tampon de digestion égal à celui de
la solution d’IgG à faire digérer. Utiliser les quantités optimales d’enzymes et d’anticorps ainsi que les temps
d’incubation préalablement déterminés à l’échelle pilote.
- Ajouter la solution de la papaïne ainsi préparée à la solution d’IgG dont la concentration est supérieure ou
égale à 1 mg/ml de PBS. Mélanger et incuber dans un bain-marie à 37°C pendant le temps requis.
- Arrêter la réaction en ajoutant de l’iodoacétamide à une concentration finale 0,03 M. Mélanger
soigneusement pour dissoudre totalement l’iodoacétamide.
- Dialyser le produit de la digestion contre le PBS (pH 8), à 4°C et pendant 12 à 24 h.
- Charger le mélange dialysé dans une colonne de protéine A-Sepharose CL-4B et collecter la fraction non
retenue qui contient les fragments Fab et l’enzyme. Si nécessaire, laver la colonne avec du PBS pour récolter
la totalité des Fab. Les IgG non digérés restent accrocher à la colonne.
- Concentrer la solution contenant les fragments Fab à un volume inférieur ou égal à 5 ml
- Charger cette solution dans une colonne de Sephacryl S-200 superfine (26 x 900 mm) et collecter les
fractions d’éluat correspondant aux protéines ayant un poids moléculaire de 50 kDa. Avant d’être mélangées
ensemble, ces fractions peuvent être analysées par SDS-PAGE.
- Déterminer la pureté finale et la concentration des fragments Fab, respectivement par SDS-PAGE à 10 %
dans des conditions non réductrices et par mesure de l’absorbance à 280 nm.
- Conserver les fragments Fab dans un tampon borate à 4°C ou dans du PBS contenant 0,02 % de NaN3 à -
70°C.
III- LA FRAGMENTATION D’IgG EN F(ab’)2 EN UTILISANT LA PEPSINE
La préparation des fragments F(ab’)2 (bivalents) se fait par une protéolyse de la molécule d’IgG à
l'aide de la pepsine. Les sous-classes d’IgG de souris possèdent deux sites sensibles au clivage pepsique
situés de chaque côté des ponts disulfures inter-chaînes lourdes. Un premier clivage peut se passer au niveau
du site situé du côté COOH-terminal des ponts disulfures donnant des F(ab’)2, c’est le cas des IgG1, IgG2a et
IgG3. Ce premier clivage peut être suivi par un deuxième au niveau du site situé du côté NH2-terminal des
ponts disulfures donnant des Fab’. Les IgG2b ne sont généralement pas digérées en F(ab’)2, mais en Fab et
Fab/c qui a un poids moléculaire proche de celui des F(ab’)2. Ceci est expliqué par le fait que les chaînes
lourdes de cette sous-classe sont glycosylées de façon asymétrique ce qui inverse la sensibilité relative des
deux sites de clivage à l’action de la pepsine. D’autre part, bien que l’IgG1 soit sensible à la pepsine, une
digestion plus stable de cette sous classe en F(ab’)2 peut être obtenue par la papaïne en absence de cystéine.
La ficine est aussi utile pour digérer les IgG1 en F(ab’)2.
Comme pour la technique de préparation des fragments Fab, celle de préparation de grandes
quantités de fragments F(ab’)2 nécessite une mise au point préalable à l’échelle pilote.
III.1- La fragmentation d’IgG en F(ab’)2 à l’échelle pilote en utilisant la pepsine
Ce protocole de fragmentation des IgG pour préparer des F(ab’)2 est identique à celui de la
fragmentation pilote avec la papaïne à l’exception du pH et du temps de la digestion qui varient. Le pH
optimum pour une digestion pepsique est autour de 2. Cependant, à ce faible pH les anticorps pourrait être
dénaturés ou être fragmentés en Fab ou en fragments encore plus petits et par conséquent un pH autour de 4
est recommandé. D’autres part, il est possible que la pepsine provoque une altération des sites de liaison des
molécules d’anticorps et pour cette raison un rapport enzyme / anticorps ne dépassant pas 1/20 est
recommandé. Deux niveaux de pH (4 et 4,5) ont été testés dans ces expériences pilote de mise au point. Le
protocole peut être résumé comme suit:
- Dialyser, pendant 4h et à 4°C, deux échantillons de 2 ml d’une solution à 3 mg/ml d’IgG purifiée contre
200 ml de tampon acétate pH 4,5 et pH 4, respectivement.
- Déterminer la concentration des deux solutions dialysées d’IgG en mesurant l’absorbance à 280 nm.
- Ajuster la concentration de chaque solution dialysée d’IgG à 2 mg/ml avec le tampon acétate
correspondant.
- Distribuer dans une première série de 16 microtubes, 100 µl de la solution d’IgG à 2 mg/ml, pH 4. Dans
une deuxième série de 16 microtubes, procéder de la même façon avec la solution d’IgG à 2 mg/ml, pH 4,5.
- Ajouter 100 µl d’une solution de pepsine à 0,1 mg/ml dans du tampon acétate pH 4 dans 8 microtubes
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contenant la solution d’IgG à pH 4 et dans 8 microtubes restants on ajoute 100 µl de tampon au même pH
mais sans pepsine.
- Utiliser une deuxième solution de pepsine à 0,1 mg/ml (préparée dans le tampon acétate à pH 4,5) et
procéder de la même façon avec la deuxième série. Ici aussi on ajoute dans les 8 microtubes témoins 100 µl
de tampon acétate pH 4,5 sans pepsine. Ainsi, dans les microtubes réactionnels des deux séries le rapport
enzyme substrat est de 1/20 mais ils sont à deux niveaux de pH différents.
- Mettre à incuber les 32 microtubes dans un bain-marie à 37°C et faire sortir du bain-marie un microtube de
chaque groupe de 8 tubes après 1, 2, 4, 6, 12, 24 et 48 h d’incubation. Dès qu’on fait sortir le tube du bainmarie,
on arrête la réaction de digestion en ajoutant, 40 µl de Tris base 2 M.
- Dialyser les produits de digestion de chaque mélange réactionnel contre 1 litre de PBS pendant 4 h à 4°C et
puis analyser chaque mélange réactionnel dialysé par SDS-PAGE à 10 % dans des conditions non
réductrices.
Si la digestion des anticorps est bien menée, on obtient une bande majeure autour de 110 kDa qui
correspond aux Fragments F(ab’)2. Des bandes de plus faibles poids moléculaires (autour de 50 kDa)
correspondent probablement à des fragments Fab’. Les quantités de F(ab’)2 et de Fab’ produites varient avec
les anticorps et les conditions de digestion. En fonction des résultats obtenus, choisir les conditions optimales
qui permettent d’obtenir le meilleur rendement en F(ab’)2 et utiliser ces conditions pour la fragmentation à
large échelle des IgG avec la pepsine.
III.2- La fragmentation d’IgG en F(ab’)2 à grande échelle en utilisant la pepsine
Comme pour la papaïne, les conditions de digestion de grandes quantités d’IgG (de différentes
espèces) permettant d’obtenir un rendement optimal en F(ab’)2 sont adaptées à partir des expériences de
fragmentation à l’échelle pilote (décrites ci-dessus).
a- Digestion des IgG
- Dialyser une solution d’IgG purifiée (> 1 mg/ml) contre le tampon acétate à un pH approprié.
- Déterminer la concentration de la solution d’IgG dialysée en mesurant son absorbance à 280 nm.
- Ajouter de la pepsine à 0,1 mg/ml dans du tampon acétate à un pH approprié jusqu’à ce qu’on obtient un
rapport enzyme / substrat de 1/20.
- Mélanger et incuber dans un bain-marie à 37°C pendant le temps requis.
- Arrêter la réaction de digestion en ajoutant en ajoutant 50 µl (environ) de Tris base 2 M par 2 ml de volume
réactionnel. A l’aide de papier pH, vérifier que ce dernier est égal à 8 et si nécessaire ajouter un peu plus de
Tris base.
- Dialyser le produit de digestion contre 1 litre de PBS, pH 8 à 4°C .
b- Purification des F(ab’)2
Une fois le produit de la digestion pepsique des IgG est dialysé, les fragments F(ab’)2 peuvent être
purifiés par une chromatographie d’affinité. On peut même pousser la purification en ajoutant une étape de
chromatographie d’exclusion moléculaire. La pureté finale des fragments F(ab’)2 est vérifiée par SDS-
PAGE. Ce protocole peut être brièvement décrit comme suit:
- Charger le mélange dialysé dans une colonne de protéine A-Sepharose CL-4B et collecter la fraction non
retenue qui contient les fragments F(ab’)2 et l’enzyme. Si nécessaire, laver la colonne avec du PBS pour
récolter la totalité des F(ab’)2. Les IgG non digérés restent accrocher à la colonne. A cette étape, les
fragments F(ab’)2 peuvent être réduits en Fab’ (si nécessaire). Ajouter de la cystéine à une concentration
finale 0,01 M, mélanger correctement et incuber pendant 2h à 37°C. La cystéine provoquent une réduction et
une et alkylation des ponts disulfures inter-chaînes lourdes.
- Concentrer la solution contenant les fragments F(ab’)2 à un volume inférieur ou égal à 5 ml
- Charger cette solution dans une colonne chromatographie d’exclusion moléculaire (Sephacryl S-200
superfine: 26 x 900 mm) et collecter les fractions d’éluat correspondant aux protéines ayant un poids
moléculaire de 110 kDa.
- Déterminer la pureté et la concentration des fragments F(ab’)2, respectivement par SDS-PAGE à 10 % dans
des conditions non réductrices et par mesure de l’absorbance à 280 nm. L’analyse électrophorétique des
F(ab’)2 montre une seule bande autour de 110 kDa dans les conditions non réductrices et une seule bande ou
une double bande autour de 25 kDa dans les conditions réductrices
- Conserver les fragments F(ab’)2 dans un tampon borate à 4°C ou dans du PBS contenant 0,02 % de NaN3 à
-70°C.
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