Les techniques de fragmentation des immunoglobulines

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Chapitre A: PREPARATION DE FRAGMENTS D'IgG I- INTRODUCTION Pour étudier les caractéristiques structurales et fonctionnelles des différentes régions d’une molécule d’immunoglobuline, il intéressant de la cliver à l’aide d’enzymes protéolytiques en plusieurs fragments. Classiquement la digestion des IgG à la papaïne et à la pepsine génère, en plus du fragment Fc, des fragments monovalents: les Fab est des fragments bivalents: les F(ab’)2, respectivement (Figure 2). Cependant, si la digestion à la papaïne produit des fragments Fab à partir de toutes les sous-classes d’IgG des différentes espèces; celle avec la pepsine n’est pas aussi universellement utile. Des méthodes alternatives de préparation de F(ab’)2 incluent l’utilisation la papaïne pré-activée avec la cystéine et l’utilisation de l’enzyme ficine. Ces méthodes alternatives sont particulièrement utiles pour préparer des F(ab’)2 à partir des IgG1 de souris; surtout que les anticorps monoclonaux généralement utilisés dans des expériences in vivo ou in vitro sont généralement d’origine murine. L’ordre de sensibilité des sous-classes d’IgG à la protéolyse enzymatique semble être le suivant: IgG2b > IgG3 > IgG2a > IgG1. Cependant, l’IgG2a peut être extrêmement sensible à l’action de la papaïne en présence de cystéine. Il est important de noter que les différentes techniques présentées ci-dessous ont été réalisées avec des IgG de souris. D’autres part les anticorps monoclonaux sont tous différents et pour cette raison les conditions standards de leur fragmentation à la pepsine et à la papaïne ne sont pas données. Des expériences pilotes doivent toujours être réalisées pour déterminer les conditions optimales d’une digestion à une plus -33-
grande échelle des IgG monoclonaux de souris et pour adapter ces techniques aux IgG des autres espèces. Il est probablement plus prudent de choisir un temps de digestion qui pourrait laisser une petite quantité d’IgG non digérée que de courir le risque de provoquer la dénaturation (l’altération) des sites de fixation des anticorps par une exposition excessive aux enzymes protéolytiques. Les anticorps non digérés peuvent être facilement séparés des fragments par passage à travers une colonne de protéine A-Sepharose. La protéine G- Sepharose et la chromatographie échangeuse d’ions peuvent être une alternative pour les anticorps qui ne se fixent pas bien à la protéine A. La séparation des fragments d’anticorps peut être réalisée de façon efficace par une chromatographie d’échange ionique sur DE52. D’autres méthodes de séparation seront décrites dans les protocoles de fragmentation. II- LA FRAGMENTATION D’IgG EN Fab EN UTILISANT LA PAPAINE La préparation des fragments Fab (monovalents) se fait par une protéolyse de la molécule d’IgG à l'aide de la papaïne en présence de l’agent réducteur: la cystéine. Les sous-classes d’IgG (par exemple IgG1 et IgG2) ont des sensibilités différentes à l’action de la papaïne. La technique de préparation de grandes quantités de fragments Fab nécessite une mise au point préalable à l’échelle pilote. II.1- La fragmentation d’IgG en Fab à une échelle pilote à l’aide de la papaïne Ce protocole se propose de déterminer les conditions optimales pour préparer des fragments Fab à grande échelle à partir des IgG humaines et de plusieurs espèces (souris, rat, cobaye, poule, chèvre, mouton, cheval et vache). Ainsi, les effets de la variation de la concentration de la papaïne et du temps d’incubation sur le rendement de la digestion ont été étudiés. Une fois la digestion terminée, les fragments Fab obtenus sont dialysés et analysés à l’aide d’une SDS-PAGE. Les résultats de l’électrophorèse permettent de déterminer les conditions optimales à retenir. Une fois la méthode est mise au point avec l’IgG d’une espèce donnée, elle peut être appliquée avec succès avec les IgG des autres espèces. Le protocole peut être résumé comme suit: - Distribuer dans une série de 24 microtubes, 100 µl d’une solution purifiée d’IgG à 2 mg/ml dans du PBS. - A partir d’une suspension de papaïne (crystallisée), préparer deux solutions de travail (une à 0,1 mg/ml et une autre à 0,02 mg/ml) dans 5 ml de tampon de digestion (du PBS contenant de l’EDTA 0,02 M et de la cystéine 0,02M) fraîchement préparé et conservé dans la glace. La papaïne étant une suspension, mélanger correctement (sans vortexer) avant de pipeter. - Ajouter 100 µl de la solution de papaïne à 0,1 mg/ml dans 8 microtubes contenant la solution d’IgG, ce qui représente un rapport enzyme substrat de 1/20. Ajouter aussi 100 µl de la solution de papaïne à 0,02 mg/ml dans 8 autres microtubes contenant la solution d’IgG (soit un rapport enzyme anticorps de 1/100). Enfin, ajouter dans les 8 microtubes restants 100 µl de tampon de digestion (sans papaïne). - Fermer les bouchons de tous les microtubes et les mettre à incuber dans un bain-marie à 37°C. - Préparer une courbe de digestion en fonction du temps en faisant sortir les microtubes du bain-marie à différents temps d’incubation (1, 2, 4, 6, 12, 18, 24 et 48 h) par groupes de trois (un microtubes de chaque série). Dès qu’on fait sortir les tubes du bain-marie, on arrête la réaction de digestion en ajoutant, 20 µl d’iodoacétamide 0,3 M dans du PBS. Une fois vortexée, la concentration finale de l’iodoacétamide (0,03 M) inactive de façon irréversible la papaïne. - Dialyser et analyser les produits de digestion de chaque mélange réactionnel par SDS-PAGE à 10 % dans des conditions non réductrices. Si la digestion des anticorps est bien menée, on obtient une bande majeure autour de 50 kDa qui correspond aux Fragments Fab et une seconde bande autour de 27 kDa qui correspond au fragment Fc. On observe généralement deux autres bandes mineures autour de 24 et 15 kDa qui sont des produits de digestions. La bande des IgG qui n’ont pas été digérées apparaît autour de 150 kDa. La digestion est considérée complète quand on n’observe plus de bande correspondant aux IgG dans les gels. Ceci est généralement obtenu au-delà de 4 h d’incubation enzyme anticorps. En fonction des résultats obtenus, choisir les conditions optimales qui permettent d’obtenir le meilleur rendement en Fab à partir de la digestion des IgG par la papaïne et utiliser ces conditions pour la fragmentation à large échelle des IgG avec cette enzyme. II.2- La fragmentation d’IgG en Fab à grande échelle à l’aide de la papaïne Les conditions de fragmentation à grande échelle des IgG (de différentes espèces) permettant d’obtenir un rendement optimal en Fab sont adaptées à partir des expériences de fragmentation à l’échelle pilote (décrites ci-dessus). Une fois la digestion est terminée et son produit est dialysé, les fragments Fab sont purifiés par une chromatographie d’affinité en les faisant passer à travers une colonne de protéine -34-
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